ES2856855T3

ES2856855T3 - Método de detección de enteritis necrótica aviar

Info

Publication number: ES2856855T3
Application number: ES16709297T
Authority: ES
Inventors: Emeka-Ignatius Igwe; Holger Wallmeier; Stefan Pelzer; Monika Flügel; Thomas Bekel
Original assignee: Evonik Operations GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2015-03-06
Filing date: 2016-02-19
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2036-02-19
Also published as: JP2018508204A; US20180312905A1; WO2016142146A3; DK3412779T3; RU2017134856A; KR102518565B1; JP6878284B2; EP3412779B1; KR20170120099A; DK3265583T3; WO2016142146A2; EP3265583A2; RU2712505C2; PL3265583T3; RU2017134856A3; EP3412779A3; HUE053199T2; CA2971825A1; MX384077B; MX2017011191A

Abstract

Un método de detección de enteritis necrótica aviar, en particular enteritis necrótica aviar subclínica, en donde la detección de enteritis necrótica se lleva a cabo detectando la cantidad de al menos una de las siguientes secuencias en una muestra aviar: a) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 40, preferentemente al menos 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 1, b) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 3, c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 4; d) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 7; e) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 9; f) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40, 60 u 80, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 10; g) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 11; h) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 12; i) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 13; j) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (a) a (i); k) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (j); l) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (k).

Description

DESCRIPCIÓN

Método de detección de enteritis necrótica aviar

La invención se refiere a un método de detección de enteritis necrótica aviar, en el que se usan nuevos marcadores que se han identificado como adecuados para la detección de enteritis necrótica aviar.

Clostridium perfringens es el principal agente causal de la enteritis necrótica (EN) aviar, una enfermedad entérica de las aves de corral que fue descrita por primera vez en 1961. La EN en pollos se manifiesta como una enterotoxemia aguda o crónica. La enfermedad aguda produce niveles significativos de mortalidad debido al desarrollo de lesiones necróticas en la pared del intestino, mientras que la enfermedad crónica conduce a una pérdida significativa de productividad y bienestar. Se ha estimado que la enfermedad causa daños de varios billones de dólares estadounidenses al año a la industria de las aves de corral.

C. perfringens se encuentra comúnmente en el tubo gastrointestinal de las aves de corral, sin embargo, la aparición de la enteritis necrótica es esporádica. C. perfringens es un anaerobio Gram-positivo, en forma de bacilo, formador de esporas, tolerante al oxígeno. Las cepas de C. perfringens se clasifican en cinco tipos de toxina (A, B, C, D y E), basándose en la producción de cuatro presuntas toxinas principales (alfa, beta, épsilon e iota). Mientras que el tipo A se recupera sistemáticamente de los intestinos de pollo, los otros tipos son menos comunes.

Estudios previos sobre la EN sugirieron que el principal factor de virulencia implicado en la enfermedad era secretado por las bacterias, que condujo a la propuesta de que una enzima fosfolipasa C, denominada alfa-toxina, era la principal toxina implicada en la patogénesis. Pero estudios recientes mostraron que la alfa-toxina no parece ser un factor de virulencia esencial, puesto que las cepas mutantes de alfa-toxina fueron capaces de causar EN, que cuestiona la función de la alfa-toxina en la enfermedad en general. En estudios más recientes, se ha sugerido que la novedosa toxina formadora de poros, netB, desempeña una función clave importante en el desarrollo de esta enfermedad.

Aparte de la mera asociación de los factores de virulencia en sí con la incidencia de EN, todavía existe una gran carga para mostrar la conexión mecanística entre estos factores y el establecimiento de la enfermedad en aves o animales de granja. Además, es extremadamente difícil relacionar la infección subclínica por EN con cualquiera de estos factores de virulencia, puesto que las aves carecen de signos que garanticen su examen antes del sacrificio. Por tanto, sigue siendo imprescindible la necesidad de un método de detección precoz de EN y, lo que es más importante, de las formas subclínicas de EN.

Tradicionalmente, el descubrimiento y la validación de biomarcadores de enfermedad requería el uso de tejido, ya fuera recién congelado, o más comúnmente, fijado en formol, incorporado en parafina. Esto ha sido especialmente cierto para los biomarcadores basados en ARNm, debido a que la degradación por RNasa del ARN libre hace que sea altamente problemática la traducción de biomarcadores basados en tejido en líquidos biológicos, tales como sangre o muestras fecales/cecales. Sin embargo, la monitorización de biomarcadores de tejido es, debido a su naturaleza invasiva, lenta y poco práctica, cuando participan grandes números de muestras como para animales de granja.

Se han descrito métodos no invasivos, tales como la medición de los parámetros de la sangre para la detección de enfermedades en las aves (Chuku et al., 2012; Aade et al., 2012; Saleem, 2012). Gulbeena Saleem (2012) sugiere como un enfoque alternativo para la determinación de EN subclínica la medición de los niveles de proteínas de la fase aguda como ceruplasmina, PIT54 y ovotransferrina en respuesta a la exposición a C. perfringens en suero sanguíneo de los pollos. Resultó que solo pareció que la ceruplasmina era una proteína de la fase aguda adecuada que se correlacionaba con la aparición de EN subclínica. A pesar de esto, esto también puede ser visto como un problema, puesto que la ceruplasmina no es un marcador específico de EN, sino de enfermedades provocadas por otros patógenos bacterianos (colibacilosis en pollo, Piercy, 1979; infección por salmonella en gallinas ponedoras comerciales, Garcia et al., 2009).

El documento de patente WO2008/148166 desvela un método que se relaciona con la determinación de si un sujeto aviar se ha expuesto o no a Clostridium perfringens detectando un polinucleótido que codifica NetB en una muestra del sujeto.

Sin embargo, se descubrió recientemente que los exosomas y otras vesículas de la membrana encontradas en biomateriales contienen ARN estable de células de donante humano, que incluye ARNm, miARN y otro ARN no codificante, con alta especificidad por las patologías (Skog et al., 2008; Nilsson et al., 2009; Li et al., 2009; Shao et al., 2012).

Así, los inventores de la presente solicitud se preguntaron si las vesículas de la membrana aisladas de líquidos corporales o excrementos de aves de corral se podrían usar para determinar aves de corral que presentaban enteritis necrótica subclínica. Esto podría ser en particular cierto debido a una acumulación de miARN de hospedador específico que muestra correlación con la enfermedad.

Se encontró sorprendentemente que las microvesículas aisladas de líquidos corporales aviares o excrementos aviares presentaban de hecho una alteración en el contenido de ARN detectable en función de la presencia de enteritis necrótica. Además de un aumento de miARN de hospedador específicos en las microvesículas debido a la infección por C. perfringens, sorprendentemente también se pudieron detectar secuencias de ARNm de C. perfringens en la fracción de microvesículas, que se clasifican, por tanto, como factores de virulencia específicos de la enfermedad y, por consiguiente, como biomarcadores adecuados indicativos de enteritis necrótica.

La aparición de ARNm de C. perfringens en la fracción de microvesículas se podría explicar por el hecho de que el procedimiento de aislamiento aplicado no solo conduce a un enriquecimiento de microvesículas de aves de corral, sino también a un enriquecimiento de microvesículas de la bacteria infecciosa. Sorprendentemente, además de supuestos factores de virulencia conocidos como netB, también se pudieron identificar secuencias de ARN previamente no sospechosas como correlativas a la enteritis necrótica.

Así, fue un primer objeto de la presente invención proporcionar un método rápido y fiable, preferentemente no invasivo, de determinación de enteritis necrótica aviar, en particular enteritis necrótica aviar subclínica, preferentemente en aves de corral, más preferentemente en pollo, y/o identificar sujetos aviares que padecen enteritis necrótica.

Fue un objeto adicional de la presente invención identificar marcadores adecuados, preferentemente marcadores específicos de enfermedad, que se pueden emplear en dicho método.

La invención se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Los marcadores indicativos de enteritis necrótica que se identificaron según la invención se seleccionan de las siguientes secuencias de Clostridium perfringens y homólogos y fragmentos de las mismas: la región SAM (SEQ ID NO: 1), la región de dedos de cinc SWIM (SEQ ID NO: 3), el ARNcp (SEQ ID NO: 4), la región de cola (SEQ ID NO: 5), la región CPE0956 (SEQ ID NO: 7, que comprende la secuencia de ARN-v R) y la región virX (SEQ ID NO: 9); así como de las siguientes secuencias aviares y homólogos y fragmentos de las mismas: mir-16 (SEQ ID NO: 10), mir-24 (SEQ ID NO: 11), mir-155 (SEQ ID NO: 12), mir-206 (SEQ ID NO: 13).

Como es sorprendente que la región SAM (SEQ ID NO: 1), la región de dedos de cinc SWIM (SEQ ID NO: 3), el ARNcp (SEQ ID NO: 4), la región CPE0956 (s Eq ID NO: 7, que comprende la secuencia de ARN-VR), la región virX (SEQ ID NO: 9), así como mir-16 (SEQ ID NO: 10), mir-24 (SEQ ID NO: 11), mir-155 (SEQ ID NO: 12) y mir-206 (SEQ ID NO: 13), se puedan usar como marcadores para determinar enteritis necrótica aviar, en absoluto, así el objeto de la invención es un método de detección de enteritis necrótica aviar, en particular enteritis necrótica aviar subclínica, en donde la detección de la enteritis necrótica se lleva a cabo detectando la cantidad de al menos una de las siguientes secuencias en una muestra aviar, preferentemente en microvesículas de una muestra aviar, en particular en comparación con una muestra de control de un aviar no infectado, en donde un aumento del nivel de al menos una de las secuencias en comparación con un control no infectado es indicativo de enteritis necrótica:

a) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 40, preferentemente al menos 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 1,

b) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 3,

c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que comprende al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 4;

d) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 7;

e) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 9;

f) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40, 60 u 80, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 10;

g) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 11;

h) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 12;

i) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 13;

j) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (a) a (i);

k) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (j);

l) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (k).

En este método, las secuencias se seleccionan preferentemente del siguiente grupo:

a) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 40, preferentemente al menos 60, 100, 150, 180 o 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 1 a 630, en particular 420 a 630, preferentemente 460 a 560, de SEQ ID NO: 1,

b) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 600 a 1000, en particular 670 a 760, de SEQ ID NO: 3,

c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 60 a 240, en particular 80 a 220, de SEQ ID NO: 4;

d) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 1 a 591, en particular 100 a 280 de SEQ ID NO: 7;

e) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 12 a 418, en particular 240 a 400 de SEQ ID NO: 9;

f) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 14 a 25 de SEQ ID NO: 10;

g) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 44 a 65 de SEQ ID NO: 11;

h) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 3 a 24 de SEQ ID NO: 12;

i) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 45 a 66 de SEQ ID NO: 13,

l) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (k).

Más preferentemente, las secuencias se seleccionan del siguiente grupo:

a) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 40 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 460 a 560 de SEQ ID NO: 1,

b) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 30 o 40, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 670 a 760 de SEQ ID NO: 3,

c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 30 o 40, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 80 a 220 de SEQ ID NO: 4;

d) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 30 o 40, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 100 a 280 de SEQ ID NO: 7;

e) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 30 o 40, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 240 a 400 de SEQ ID NO: 9;

f) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 14 a 25 de SEQ ID NO: 10; g) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 44 a 65 de SEQ ID NO: 11;

h) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 3 a 24 de SEQ ID NO: 12;

i) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente al menos 98 o 99 %, lo más preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 45 a 66 de SEQ ID NO: 13,

l) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (k).

En una realización preferida de la invención se usan combinaciones de dichos polinucleótidos, preferentemente combinaciones de al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de dicho polinucleótidos, para detectar enteritis necrótica.

La muestra aviar según la invención puede ser una muestra de tejido, preferentemente una muestra intestinal, en particular una muestra duodenal o yeyunal.

Preferentemente, la muestra aviar se selecciona de líquidos corporales aviares y excrementos aviares y disoluciones y suspensiones de los mismos.

El líquido corporal aviar según la invención es preferentemente sangre, suero sanguíneo o plasma sanguíneo.

El excremento aviar según la invención se selecciona preferentemente de excrementos fecales y cecales.

Los volúmenes de muestra adecuados son, por ejemplo, 0,1 a 20 mL, en particular 0,2 a 10 mL, preferentemente 0,5 a 5 mL. Las masas de muestra adecuadas son, por ejemplo 0,1 a 20 g, en particular 0,2 a 10 g, preferentemente 0,5 a 5 g.

El sujeto aviar según la invención es preferentemente aves de corral.

Las aves de corral preferidas según la invención son pollos, pavos, patos y gansos. Las aves de corral se pueden optimizar para producir ejemplares jóvenes. Este tipo de aves de corral también se denomina animales progenitores. Los animales progenitores preferidos son, por consiguiente, pollos de engorde progenitores, patos progenitores, pavos progenitores y gansos progenitores.

Las aves de corral según la invención también se pueden seleccionar de aves de corral exóticas y aves salvajes. Las aves de corral exóticas preferidas o aves salvajes son pavos reales, faisanes, perdices, gallina de Guinea, codornices, urogallos, gallo lira, palomas y cisnes.

Las aves de corral preferidas adicionales según la invención son avestruces y loros.

Las aves de corral más preferidas según la invención son pollos.

Como se usa en el presente documento, el término ''polinucleótidos'' o "ácidos nucleicos" se refiere a ADN y ARN. Los polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

Resultó que la aparición de marcadores indicativos de enteritis necrótica es específica de la muestra, es decir, la cantidad detectable de los diferentes marcadores depende del tipo de muestra.

Así, se encontró que en excrementos fecales el mejor marcador es la región SAM, seguido por ARNcp, región virX, región de cola, región de dedos de cinc SWIM y la región CPE0956, que incluye la secuencia de ARN-VR.

Al contrario, en excrementos cecales, el mejor marcador también es la región SAM, pero va seguido por la región de dedos de cinc SWIM, ARNcp, mir206, la región virX, la región CPE0956, que incluye la secuencia de ARN-VR, y la región de cola.

Además, en muestras de sangre, el mejor marcador es mir16, seguido por mir155 y mir24.

Así, una realización preferida de la solicitud es un método de detección de enteritis necrótica aviar, en particular enteritis necrótica aviar subclínica, comprendiendo el método determinar el nivel de al menos un marcador indicativo de enteritis necrótica en excrementos fecales aviares, preferentemente en microvesículas aisladas de excrementos fecales aviares, en donde un aumento del nivel de este al menos un marcador en comparación con un control no infectado es indicativo de enteritis necrótica y en donde el marcador se selecciona de

c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 4;

d) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 5;

e) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 7;

f) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 9;

g) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (a) a (f);

h) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (g);

i) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (h).

a) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 40, preferentemente al menos 60 o 100, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 1 a 630, en particular 420 a 630, preferentemente 460 a 560, de SEQ ID NO: 1,

b) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60 o 90, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 600 a 1000, en particular 670 a 760, de SEQ ID NO: 3, c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100 o 140, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 60 a 240, en particular 80 a 220, de SEQ ID NO: 4; d) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150, 180 o 200, nucleótidos consecutivos según la posición 1300 a 1800, en particular 1400 a 1700, de SEQ ID NO: 5; e) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150 o 180, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 1 a 591, en particular 100 a 280 de SEQ ID NO: 7; f) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 20, preferentemente al menos 25, 40, 60, 100, 150 o 160, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 12 a 418, en particular 240 a 400 de SEQ ID NO: 9;

i) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (h).

Así, otra realización preferida de la solicitud es un método de detección de enteritis necrótica aviar, en particular enteritis necrótica aviar subclínica, comprendiendo el método determinar el nivel de al menos un marcador indicativo de enteritis necrótica en excrementos cecales aviares, en particular en microvesículas aisladas de excrementos cecales aviares, en donde un aumento del nivel de este al menos un marcador en comparación con un control no infectado es indicativo de enteritis necrótica y en donde el marcador se selecciona de

g) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 13;

h) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (a) a (g);

i) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (h);

j) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (i).

g) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 45 a 66 de SEQ ID NO: 13,

j) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (i).

Así, otra realización preferida de la solicitud es un método de detección de enteritis necrótica aviar, en particular enteritis necrótica subclínica, comprendiendo el método determinar el nivel de al menos un marcador indicativo de enteritis necrótica en sangre aviar, en particular en microvesículas aisladas de sangre aviar, en donde un aumento del nivel de este al menos un marcador en comparación con un control no infectado es indicativo de enteritis necrótica y en donde el al menos un marcador se selecciona de

a) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40, 60 u 80, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 10;

b) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 11;

c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 o 60, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos como se representa en SEQ ID NO: 12;

d) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (a) a (c);

e) polinucleótidos (ADN y ARN) que son complementarios a las secuencias según (d);

f) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (e).

a) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 14 a 25 de SEQ ID NO: 10;

b) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 44 a 65 de SEQ ID NO: 11;

c) polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 95 %, preferentemente 100 %, con un polinucleótido que consiste en al menos 8 o 10, preferentemente al menos 12, 14, 16, 18 o 20, nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos según la posición 3 a 24 de SEQ ID NO: 12;

f) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (e).

ColA representa colagenasa A de Clostridium perfringens; este gen se podría asociar a la patogénesis de EN debido a su similitud con la denominada kappa-toxina, una de las supuestas principales toxinas de esta bacteria (Obana et al., 2013).

Sin embargo, no era de esperar la aparición, así como la desregulación, de estos genes en microvesículas.

Se conoce que el gen virX regula los genes plx, colA y pfoA en C. perfringens (Ohtani et al., 2002), pero no se ha informado antes de su participación en la patogénesis de EN.

Tampoco se informó previamente que el ARN citoplásmico pequeño (ARNcp), un miembro de una familia de ARN de tipo partícula de reconocimiento de señales evolutivamente conservada, participó en el mecanismo de esporulación de Clostridium perfringens (Nakamura et al., 1995) estuviera en asociación directa con EN en pollos.

Además, no se ha desvelado antes la participación del dominio SAM, el dominio de dedos de cinc SWIM y la región CPE0956, que incluye el ARN-VR, en la patogénesis de la enteritis necrótica y tampoco se hubiera esperado ya que estas secuencias son secuencias con funciones previamente desconocidas.

La versión eucariota de vesículas de membrana también se denomina exosomas. Los exosomas tienen normalmente un diámetro de 30-200 nm. Se derraman en todos los líquidos biológicos y llevan muchas proteínas y oligonucleótidos intactos, ya que se protegen de la degradación por RNAsas (Koga et al., 2011). Los exosomas se han estudiado en particular en cáncer y células inmunitarias.

Las microvesículas de bacterias también se denominan vesículas de la membrana extracelular (VM) o vesículas de la membrana externa (VME). Son estructuras bicapa esféricas con diámetro promedio de normalmente 20-500 nm. Las microvesículas bacterianas se describieron por primera vez para bacterias Gram-negativas, pero después también para algunas bacterias Gram-positivas. En un estudio reciente, se informó que las microvesículas también se producían y liberaban por cepas de tipo A de C. perfringens, desencadenando respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Se encontró además en el transcurso de este estudio que los factores de virulencia importantes como la alfa-toxina y NetB no estaban presentes en las vesículas de membrana, aunque se encontró la beta2-toxina en las vesículas de membrana (Jiang et al., (2014)).

Los microARN (miARN) son ARN pequeños no codificantes que tienen normalmente 18-23 nucleótidos de tamaño y se ha sugerido que desempeñan una función crítica en la regulación de la expresión génica. En particular, se ha informado que los genes asociados a las respuestas inmunitarias son altamente silenciados por miARN. En pollos, se ha estudiado la expresión de miARN en procesos de desarrollo del embrión, desarrollo de células germinativas, órganos inmunitarios y enfermedades.

En estudios recientes, se investigó el perfil de miARN de dos líneas de pollo White Leghorn diferentes altamente endogámicas infectadas por C. perfringens (Dinh et al., 2014; Hong et al., 2014). Se llevó a cabo análisis de ARN con tejido de bazo y mucosa intestinal. Los resultados sugieren que algunos miARN están diferencialmente alterados en la respuesta a la enteritis necrótica y que modulan la expresión de sus genes diana. Las microvesículas no se investigaron en estos estudios.

Los miARN que se ha encontrado que son correlativos a enteritis necrótica según la presente invención se investigaron antes por Wang et al. a propósito de pollos de engorde infectados por el virus de la gripe aviar (Wang et al., 2012). Wang et al. encontraron que los miARN miR-155, miR-16-1 y miR-24 se expresan más fuertemente en los pulmones de pollos de engorde infectados que en los de los no infectados, pero encontraron además que miR-206, al contrario, se expresa más fuertemente en los no infectados que en los infectados. Así, el uso de miR-206 como marcador para una infección bacteriana se desvela en la presente solicitud por primera vez. Además, a diferencia de Wang et al. según la presente invención, todos los miARN se detectaron en microvesículas, no en tejido.

Las aplicaciones de los métodos según la invención son, por ejemplo, (i) ayudar en el diagnóstico y/o el pronóstico de enteritis necrótica aviar, (ii) monitorizar el progreso o la remanifestación de enteritis necrótica aviar, o (iii) ayudar en la evaluación de la eficacia del tratamiento para un sujeto aviar que recibe o que contempla un tratamiento para enteritis necrótica; en donde se determina la presencia o ausencia de uno o más de los biomarcadores mencionados antes en la extracción de ácidos nucleicos obtenida del método, y el uno o más biomarcadores se asocian con el diagnóstico, progreso o remanifestación, o eficacia del tratamiento, respectivamente, de la enteritis necrótica.

Las aplicaciones de la invención ayudan en particular a evitar la pérdida en el rendimiento aviar, como el aumento de peso y la conversión de pienso.

Aislamiento de microvesículas

El aislamiento de microvesículas de una muestra biológica antes de la extracción de ácidos nucleicos es ventajosa, debido a que las microvesículas que contienen ácido nucleico producen rendimientos significativamente mayores de especies de ácido nucleico con mayor integridad en comparación con el rendimiento/la integridad obtenido extrayendo ácidos nucleicos directamente de la muestra de líquido o excremento sin aislar primero las microvesículas. Además, también es posible detectar ácidos nucleicos que se expresan a bajos niveles. El aislamiento de microvesículas también permite la exclusión de proteínas, lípidos, residuo celular, células y otros posibles contaminantes e inhibidores de PCR que se encuentran naturalmente dentro de muestras biológicas.

El aislamiento de vesículas de membrana de las muestras biológicas y la posterior extracción de los ácidos nucleicos se puede hacer, por ejemplo, por ultracentrifugación, por ejemplo, centrifugando a más de 10.000 g durante 1 -3 horas, seguido por retirada del sobrenadante, lavado del sedimento, lisado del sedimento y purificación de los ácidos nucleicos sobre una columna. Los métodos alternativos son ultrafiltración, por ejemplo, usando filtros de 100 kD, técnicas de precipitación de polímeros y/o filtración basada en el tamaño.

Los métodos alternativos adicionales son la centrifugación diferencial como se describe por Raposo et al. (1996), Skog et al. (2008) y Nilsson et al. (2009); intercambio iónico y/o cromatografía de exclusión molecular como se describe en las patentes de EE. UU. N° 6.899.863 y 6.812.023; gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de orgánulos como se describe en la patente de EE. UU. N° 7.198.923; clasificación celular activada magnéticamente (MACS) como se describe por Taylor y Gercel-Taylor (2008); concentración por ultrafiltración en nanomembrana como se describe por Cheruvanky et al. (2007); aislamiento en gradiente de Percoll como se describe por Miranda et al. (2010); y, aislamiento por un dispositivo microfluídico, Chen et al. (2010).

Aislamiento de microvesículas basado en la superficie de captura según el documento de patente WO 2014/107571.

En una realización preferida, la fracción de microvesículas se une a una superficie de captura, en particular a una membrana, un filtro o a una perla modificada en la superficie como se desvela en el documento de patente WO 2014/107571.

La muestra biológica se disuelve preferentemente en un tampón de carga, que tiene preferentemente un pH de 4-8, más preferentemente 5-7. Así, la unión a la superficie de captura tiene lugar preferentemente a un pH de 4-8, más preferentemente 5-7. Preferentemente, después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura, se realizan una o más etapas de lavado.

Los tampones de carga y de lavado que se pueden emplear según la invención pueden ser de alta o baja fuerza iónica. Así, la concentración de sales, por ejemplo, la concentración de NaCl, puede ser desde 0 hasta 2,4 M. Preferentemente, los tampones incluyen uno o más de los siguientes componentes: Tris, Bis-Tris, Bis-Tris-propano, imidazol, citrato, ácido metilmalónico, ácido acético, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina (TEA) y fosfato de sodio.

El lavado tiene lugar preferentemente usando tampón de lavado que comprende Bis-Tris-propano 250 mM y que presenta un pH de 6,5-7,0.

Añadiendo detergentes al tampón de lavado se suprime la unión no específica. Los detergentes adecuados para su uso incluyen, pero no se limitan a, dodecilsulfato de sodio (SDS), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Brij-35, Brij-58, octilglucósido, octiltioglucósido, CHAPS o CHAPSO.

Después de lavar la superficie de captura, se puede liberar el ácido nucleico lisando las microvesículas fijadas. Para lisar las microvesículas fijadas se usa preferentemente un tampón de lisis basado en fenol, como el reactivo de lisis QIAzol® (Qiagen, Alemania). La purificación del ácido nucleico se puede hacer entonces por extracción con cloroformo usando tubos de PLG, seguido por acondicionamiento con etanol. Entonces se puede unir el ácido nucleico a una columna de sílice antes del lavado y la elución.

También se puede lograr la lisis de microvesículas y la extracción de ácidos nucleicos usando un kit Qiagen R easy Plus comercialmente disponible, un kit Qiagen miR easy comercialmente disponible o usando fenol-cloroformo según procedimientos convencionales y técnicas conocidas en la técnica. Dichos métodos también pueden utilizar una columna de unión a ácido nucleico para capturar los ácidos nucleicos contenidos dentro de las microvesículas. Una vez unidos, los ácidos nucleicos se pueden eluir entonces usando un tampón o disolución adecuado para romper la interacción entre los ácidos nucleicos y la columna de unión.

Los métodos de extracción de ácido nucleico también pueden incluir el uso de agentes adicionales como un inhibidor de la RNasa, tal como Superase-In (comercialmente disponible de Ambion Inc.) o RNaseINplus (comercialmente disponible de Promega Corp.); una proteasa (que también puede servir de un inhibidor de RNasa); DNasa; un agente reductor; un sustrato señuelo tal como un ARN sintético y/o ARN portador; un receptor soluble que se puede unir a RNasa; un ARN interferente pequeño (ARNip); una molécula de unión a ARN, tal como un anticuerpo anti-ARN, una proteína básica o una proteína chaperona; una sustancia desnaturalizante de RNasa, tal como una disolución de alta osmolaridad, un detergente, o una combinación de los mismos. Los inhibidores de RNAsa, así como los agentes adicionales, se pueden añadir a la muestra biológica, y/o a la fracción de microvesículas aisladas, antes de extraer los ácidos nucleicos.

Estos agentes adicionales pueden ejercer sus funciones de diversas formas, por ejemplo, mediante la inhibición de la actividad de RNasa (por ejemplo, inhibidores de RNasa), mediante una degradación ubicua de proteínas (por ejemplo, proteasas), o mediante una proteína chaperona (por ejemplo, una proteína de unión a ARN) que se une y protege ARN. En todos los casos, dicho agente de mejora de la extracción retira o al menos mitiga alguno o todos los factores adversos en la muestra biológica o asociados a las partículas aisladas que prevendrían o interferirían de otro modo con la extracción de alta calidad de los ácidos nucleicos de las partículas aisladas.

Se puede usar la cuantificación de ARNr 18S y 28S extraídos para determinar la calidad de la extracción del ácido nucleico.

La superficie de captura puede ser neutra, negativamente cargada o positivamente cargada. Esto significa que, en principio, se puede usar cualquier tipo de superficie de captura. Dependiendo del material de membrana, los tamaños de poro de la membrana pueden variar de 20 nm a 5 gm.

En particular, la superficie de captura puede ser una membrana comercialmente disponible como la membrana de intercambio iónico Mustang® de PALL Corporation; Vivapure ® Q, Vivapure® Q Maxi H; Sartobind ® D, Sartobind (S), Sartobind ® Q, Sartobind ® IDA o Sartobind® Aldehyde de Sartorius AG; Whatman® DE81 de Sigma; columna de purificación de virus Fast Trap de EMD Millipore; o columnas de centrifugación de intercambio catiónico y aniónico fuerte de Thermo Scientific* Pierce.

Cuando se usa una membrana para fijar los ácidos nucleicos, entonces la membrana se puede preparar de una variedad de materiales adecuados, por ejemplo, puede ser una poliétersulfona (PES) (por ejemplo, de Millipore o PALL Corp.) o celulosa regenerada (RC) (por ejemplo, de Sartorius o Pierce).

Cuando se usa una membrana negativamente cargada, entonces la superficie de captura es preferentemente una membrana S, que es una membrana negativamente cargada y es un intercambiador catiónico con grupos ácido sulfónico. Preferentemente, la membrana S se funcionaliza con ácido sulfónico, R-CH2-SO3". Alternativamente, la superficie de captura negativamente cargada es una membrana D, que es un intercambiador aniónico básico débil con grupos dietilamina, R-CH2-NFT(C2Hs)2. Alternativamente, la superficie de captura es una membrana de quelato metálico. Por ejemplo, la membrana es una membrana IDA, funcionalizada con ácido minodiacético -N(CH2COOH")2. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana microporosa, funcionalizada con grupos aldehído, -CHO. En otras realizaciones, la membrana es un intercambiador aniónico básico débil, con dietilaminoetil (DEAE)-celulosa.

Cuando se usa una superficie de captura neutra, entonces la superficie de captura es preferentemente un filtro seleccionado del grupo que consiste en una filtración en jeringa de PES neutro de 20 nm (Tisch y Exomir), filtración en jeringa de PES neutro de 30 nm (Sterlitech), filtración en jeringa de PES neutro de 50 nm (Sterlitech), filtración en columna de centrifugación fabricada internamente de PES neutro de 0,2 um (Pall), filtración en columna de centrifugación fabricada internamente de PES neutro de 0,8 um (Pall) y filtración en jeringa de PES neutro de 0,8 um (Pall). En realizaciones donde la superficie de captura es neutra, la superficie de captura neutra no se aloja preferentemente en un filtro de jeringa.

La superficie cargada se selecciona preferentemente del grupo que consiste en filtración a vacío Q PES positivamente cargada de 0,65 um, filtración en columna de centrifugación Q RC positivamente cargada de 3-5 um, filtración en columna de centrifugación fabricada internamente Q PES positivamente cargada de 0,8 um, filtración en jeringa Q PES positivamente cargada de 0,8 um, filtración en columna de centrifugación casera S PES negativamente cargada de 0,8 um, filtración en jeringa S PES negativamente cargada de 0,8 um y filtración en jeringa de nailon negativamente cargada de 50 nm.

En la realización preferida, cuando la superficie es una membrana positivamente cargada, se puede usar una membrana Q, que es una membrana positivamente cargada y es un intercambiador aniónico con aminas cuaternarias. En una realización preferida, la membrana Q está funcionalizada con amonio cuaternario, R-CH²-N+(CH³)³.

En una realización muy preferida, la membrana positivamente cargada es una celulosa regenerada, membrana intercambiadora aniónica básica fuerte ("RC/SBAE"), que es un intercambiador aniónico con aminas cuaternarias. En una realización preferida, la membrana RC/SBAE está funcionalizada con amonio cuaternario, R-CH²-N+(CH³)³. El tamaño de poro de la membrana es preferentemente al menos 3 gm.

La superficie de captura, por ejemplo, membrana, puede estar alojada dentro de un dispositivo usado para la centrifugación; por ejemplo, columnas de centrifugación, o para aplicación de vacío, por ejemplo, portafiltros de vacío, o para la filtración con presión, por ejemplo, filtros de jeringa.

En un proceso de purificación basado en columna de centrifugación se usa preferentemente más de 1 membrana, preferentemente 2 a 5 membranas, en paralelo en un tubo, en donde las membranas son todas preferentemente directamente adyacentes entre sí en un extremo de la columna. El tubo de recogida puede estar comercialmente disponible, como un tubo Falcon de 50 mL. La columna es preferentemente adecuada para centrifugación, es decir, el tamaño es compatible con las máquinas centrifugadoras y microcentrifugadoras habituales.

En lugar de una membrana también se puede usar una perla con la misma modificación superficial para capturar el ácido nucleico. Si se usa una perla, puede ser magnética o no magnética.

Si se usa sangre como muestra, la sangre se puede recoger, por ejemplo, en tubos de EDTA K2 y mezclar bien con inversiones completas. Entonces se centrifugan los tubos a 1300 x g durante 10 min para separar los glóbulos sanguíneos y el plasma. Entonces se retira el plasma y se filtra a través de un filtro de 0,8 pm para retirar el residuo celular y las plaquetas. Entonces se toman todas las muestras de plasma en alícuotas en crioviales de 1 mL y se conservan a -80 °C hasta su uso.

Antes del aislamiento de ARN, la membrana se acondiciona preferentemente pasando a través de tampón de equilibrio. La muestra de plasma descongelada se diluye con tampón de carga. La muestra de plasma diluida se pasa lentamente a través de la membrana que adsorbe las microvesículas. Entonces se lava la membrana con un tampón de lavado para retirar cualquier componente del plasma débilmente unido. Entonces se pasa un reactivo de lisis a través de la membrana para lisar las microvesículas. Se aísla ARN usando el kit miRNeasy kit (Qiagen).

Se pueden evaluar el ARN para la calidad y concentración con el bioanalizador 2100 (Agilent) usando un RNA 6000 Pico Chip. Se mide la cantidad relativa de ARN extraído por RT-qPCR usando ensayos de expresión génica humana seleccionada de Applied Biosystems (ensayo Taqman).

En realizaciones preferidas, en particular cuando se usan muestras fecales o cecales solubilizadas, se realiza una etapa previa al procesamiento antes del aislamiento, la purificación o el enriquecimiento de las microvesículas para retirar partículas grandes no deseadas, células y/o residuo celular y otros contaminantes presentes en la muestra biológica. Las etapas de procesamiento previo se pueden lograr mediante una o más etapas de centrifugación (por ejemplo, centrifugación diferencial) o una o más etapas de filtración (por ejemplo, ultrafiltración), o una combinación de las mismas. Donde se realiza más de una etapa de centrifugación previa al procesamiento, la muestra biológica se puede centrifugar primero a una velocidad más baja y luego a una velocidad más alta. Si se desea, se pueden llevar a cabo etapas de centrifugación previas al procesamiento adecuadas adicionales. Alternativamente o además de la una o más etapas de centrifugación previas al procesamiento, la muestra biológica se puede filtrar. Por ejemplo, primero se puede centrifugar una muestra biológica a una velocidad baja de aproximadamente 100-500 g, preferentemente 250-300 g, y después de eso a una velocidad más alta de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 200.000 g, preferentemente a aproximadamente 20.000 g, durante 10 minutos a aproximadamente 1 hora, preferentemente a una temperatura de 0-10 °C, para retirar partículas grandes no deseadas; entonces se puede filtrar la muestra, por ejemplo, usando un filtro con un tamaño de exclusión de 0,1 a 1,0 pm.

Las microvesículas en el sedimento obtenido por centrifugación a mayores velocidades se pueden reconstituir con un volumen más pequeño de un tampón adecuado para las etapas posteriores del proceso. La etapa de concentración también se puede realizar por ultrafiltración. En realidad, esta ultrafiltración tanto concentra la muestra biológica como realiza una purificación adicional de la fracción de microvesículas. En otra realización, la filtración es una ultrafiltración, preferentemente una ultrafiltración tangencial. La ultrafiltración tangencial consiste en concentrar y fraccionar una disolución entre dos compartimentos (filtrado y concentrado), separaos por membranas de determinados umbrales de corte. La separación se lleva a cabo aplicando un flujo en el compartimento concentrado y una presión transmembranaria entre este compartimento y el compartimento de filtrado. Se pueden usar diferentes sistemas para realizar la ultrafiltración, tales como membranas en espiral (Millipore, Amicon), membranas planas o fibras huecas (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). Dentro del alcance de la invención es ventajoso el uso de membranas con un umbral de corte inferior a 1000 kDa, preferentemente entre 100 kDa y 1000 kDa, o incluso más preferentemente entre 100 kDa y 600 kDa.

Como etapas de procesamiento adicionales o alternativas se podría llevar a cabo cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de afinidad antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura.

Para realizar la etapa de cromatografía de exclusión molecular, se usa preferentemente un soporte seleccionado de sílice, acrilamida, agarosa, dextrano, copolímero de etilenglicol-metacrilato o mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de agarosa-dextrano. Por ejemplo, dichos soportes incluyen, pero no se limitan a: SUPERDEX® 200HR (Pharmacia), TSK G6000 (TosoHaas) o SEPHACRYL® S (Pharmacia).

La cromatografía de afinidad se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando diferentes soportes, resinas, perlas, anticuerpos, aptámeros, análogos de aptámeros, polímeros molecularmente impresos, u otras moléculas conocidas en la técnica que se dirigen específicamente a las moléculas de superficie deseadas sobre las microvesículas.

Opcionalmente, se pueden añadir partículas de control a la muestra antes del aislamiento de las microvesículas o la extracción de ácidos nucleicos para servir de control interno para evaluar la eficiencia o calidad de la purificación de microvesículas y/o la extracción de ácidos nucleicos. Estas partículas de control incluyen bacteriófago Q-beta, partículas de virus, o cualquier otra partícula que contenga ácidos nucleicos de control (por ejemplo, al menos un gen diana de control) que pueda existir de forma natural o esté manipulada por técnicas de ADN recombinante. El gen diana de control se puede cuantificar usando análisis de PCR tiempo real.

Preferentemente, la partícula de control es un bacteriófago Q-beta, denominado en el presente documento "partícula Q-beta". La partícula Q-beta puede ser una partícula de virus que existe de forma natural o puede ser un virus recombinante o manipulado, en el que al menos un componente de la partícula de virus (por ejemplo, una porción del genoma o proteína de la envoltura) se sintetiza por ADN recombinante o técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Q-beta es un miembro de la familia leviviridae, caracterizado por un genoma de ARN monocatenario lineal que consiste en 3 genes que codifican cuatro proteínas virales: una proteína de la envoltura, una proteína de maduración, una proteína de lisis y ARN replicasa. Debido a su tamaño similar con respecto a las microvesículas promedio, Q-beta se puede purificar fácilmente de una muestra biológica usando los mismos métodos de purificación usados para aislar microvesículas, como se describe en el presente documento. Además, es ventajosa la baja complejidad de la estructura del gen monocatenario viral Q-beta para su uso como control en ensayos de ácidos nucleicos basados en amplificación. La partícula Q-beta contiene un gen diana de control o secuencia diana de control que se va a detectar o medir para la cuantificación de la cantidad de partícula Q-beta en una muestra. Por ejemplo, el gen diana de control es el gen de la proteína de la envoltura Q-beta. Después de la adición de las partículas Q-beta a la muestra biológica, los ácidos nucleicos de la partícula Q-beta se extraen junto con los ácidos nucleicos de la muestra biológica usando los métodos y/o kits de extracción descritos en el presente documento. La detección del gen diana de control Q-beta se puede determinar por análisis por RT-PCR, por ejemplo, simultáneamente con los biomarcadores de interés (es decir, BRAF). Se puede usar una curva patrón de al menos 2, 3 o 4 concentraciones conocidas en dilución al 10 % de un gen diana de control para determinar el número de copias. Se puede comparar el número de copias detectado y la cantidad de partícula Q-beta añadida para determinar la calidad del proceso de aislamiento y/o de extracción.

Así, se añadieron 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1.000 o 5.000 copias de partículas Q-beta a una muestra de líquido corporal. En una realización preferida, se añaden 100 copias de partículas Q-beta a una muestra de líquido corporal. Se puede calcular el número de copias de partículas Q-beta basándose en la capacidad del bacteriófago Q-beta de infectar células diana. Así, el número de copias de partículas Q-beta se correlaciona con las unidades formadoras de colonias del bacteriófago Q-beta.

Detección de biomarcadores de ácido nucleico

Para la detección de ARN, el ARN se retrotranscribe preferentemente en ADN complementario (ADNc) antes de la amplificación adicional. Dicha retrotranscripción se puede realizar sola o en combinación con una etapa de amplificación. Un ejemplo de un método que combina etapas de retrotranscripción y de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCT), que se puede modificar aún más para ser cuantitativa, por ejemplo RT-PCT cuantitativa como se describe en la patente de EE. UU. N° 5.639606. Otro ejemplo del método comprende dos etapas separadas: una primera de retrotranscripción para convertir ARN en ADNc y una segunda etapa de cuantificación de la cantidad de ADNc usando PCR cuantitativa.

El análisis por RT-PCR determina un valor Ct (ciclo umbral) para cada reacción. En RT-PCR, se detecta una reacción positiva por la acumulación de una señal de fluorescencia. El valor de Ct se define como el número de ciclos requeridos para la señal fluorescente para cruzar el umbral (es decir, supera el nivel de fondo). Los niveles de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana, o ácido nucleico de control, en la muestra (es decir, cuanto más bajo es el nivel de Ct, mayor es la cantidad de ácido nucleico de control en la muestra). Alternativamente, el número de copias del ácido nucleico de control se puede medir usando otras técnicas reconocidas en la técnica.

El análisis de ácidos nucleicos presente en las partículas aisladas es cuantitativo y/o cualitativo. Para el análisis cuantitativo, las cantidades (niveles de expresión), ya sea relativas o absolutas, de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las partículas aisladas se miden con métodos conocidos en la técnica. Para el análisis cualitativo, las especies de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las microvesículas aisladas se identifican con métodos conocidos en la técnica.

Ejemplos de trabajo

Preparación de la inoculación

Se sacó del almacenamiento a -80 °C cepa aislada de Clostridium perfringens que era positiva para netB y tpeL y se sembró en estrías asépticamente sobre placas de agar con triptona y soja que contenía 5 % de sangre de oveja (TSA II). Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche en condiciones anaerobias. Quince horas antes del comienzo del cultivo del inóculo, se inoculó una colonia aislada de la placa durante la noche en 50 mL de caldo BHI previamente reducido y se incubó a 37 °C en condiciones anaerobias durante aproximadamente 15 horas. Entonces se añadieron 50 pL del cultivo a 2 x 100 mL de BHI previamente reducido. Se escalonaron los cultivos de caldo resultantes de manera que la alta dosis y la baja dosis alcanzaran sus concentraciones finales al mismo tiempo (109 UFC/mL y 106 UFC/mL, respectivamente). Se tomaron alícuotas de cada cultivo al final del periodo de crecimiento y se sembraron sucesivamente sobre agar TSA II 5 % de sangre de oveja para verificar la concentración bacteriana.

Experimento animal

Se criaron setecientos veinte (720) pollos de engorde macho en 36 jaulas en batería durante 30 días. Las aves se asignaron igualmente y aleatoriamente (9 jaulas a cada uno) a uno de los cuatro grupos de tratamiento (control negativo, simulación, sonda nasogástrica de baja dosis y sonda nasogástrica de alta dosis). Las aves se alimentaron con pienso común de maíz/soja sin antimicrobianos. En el día 13 de cría, se sacaron las aves con sobrepeso o con bajo peso de todas las jaulas y se excluyeron del experimento. Entonces, el ave con intervalo de peso normal se expuso por vía oral sucesivamente en los días 14,15 y 16 a 1 mL de cepa de C. perfringens que alojaba el plásmido netB y que era positiva para el gen Tpel. El grupo de simulación se expuso a 1 mL de PBS, mientras que el grupo de control negativo no se sometió a ningún estrés o exposición a patógenos. Antes de la primera inoculación (día 14), se seleccionaron aleatoriamente 3 aves de cada jaula, se sacrificaron para la recogida de sangre y muestras de digesto. Doce horas después de la segunda exposición, en el día 15, se sacrificaron nuevamente 3 aves de cada jaula para el muestreo de sangre y digestos. Se cultivó durante la noche el contenido del intestino de todas las aves sacrificadas para determinar la relación entre C. perfringens esporulado y las células vegetativas, como se describe previamente (Heikinheimo et al., 2004). Para evaluar si la exposición fue satisfactoria, se realizó la PCR de los genes NetB y TpeL del contenido del intestino. Se dejaron al menos 10 aves en cada una de las jaulas hasta el final del ensayo. Se recogieron muestras de excrementos en intervalos hasta que se terminó estudio en el día 20 cuando se sacrificaron todas las aves y se obtuvieron tres muestras de mezclas de sangre de cada grupo. Se examinaron los GIT de las aves para signos/lesiones típicos de EN y se tomaron necropsias del tubo gastrodigestivo del duodeno y el yeyuno para el análisis histopatológico. Se determinaron los indicadores del rendimiento de pollos de engorde como la tasa de mortalidad, el consumo de pienso y la patología de grupo (Tabla 3).

Recogida de muestras

1. Recogidas de muestras de excrementos fecales y cecales

Se colocaron hojas de papel en las jaulas para recoger muestras reunidas fecales y reunidas cecales cada 2 horas después de la primera exposición hasta 12 horas después de la segunda inoculación (día 15). Posteriormente, las muestras se recogieron cada 4 horas hasta el día 17. Al final del ensayo en el día 20, también se recogieron muestras fecales y cecales. Durante cualquiera de los acontecimientos de recogida, se obtuvo al menos 1 gramo de fecal y cecal por jaula, y las muestras se conservaron a -80 °C.

2. Extracción de sangre

Se recogió sangre directamente del corazón usando una aguja de calibre 18. Se recogieron aproximadamente 5-6 mL de sangre completa de 3 aves seleccionadas al azar por jaula y se transfirieron a tubos de recogida que contenían EDTA. Se retiraron las células del plasma por centrifugación durante 10 minutos a 1.000-2.000 x g usando una centrifugadora refrigerada. Después de la centrifugación, el componente líquido (plasma) se transfirió inmediatamente a un tubo de polipropileno limpio y se conservó a -20 °C.

3. Recogida del contenido del intestino

Se recogió el contenido del intestino de un intestino de aproximadamente 20 cm de longitud. Se expulsó el contenido del intestino y se cortó en PBS 20 % de glicerol e inmediatamente se congeló a -20 °C. Entonces se usaron muestras para la cuantificación de C. perfringens vegetativo frente a esporulado y detección por PCR de netB y tpeL.

Histología del intestino del pollo

1. Recogida y procesamiento de tejido

Se retiró de cada ave una sección de 5 cm siguiendo el bucle duodenal y se puso en 10 % de formol, y el recipiente se agitó suavemente para sacar el pienso para permitir que el formol entrara en el intestino. Después de la fijación, los tejidos se lavaron bien en varios cambios de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se pusieron en etanol al 70 % para el almacenamiento. Para el procesamiento de tejidos y la infiltración de tejidos con parafina antes de hacer secciones de 5 uM, los tejidos se deshidrataron lavando 1x durante 2 min en disoluciones al 70 % y 95 % de etanol sucesivamente, y luego 2x durante 2 min en disolución al 100 % de etanol. Finalmente, los tejidos se aclararon 2x durante 1 minuto en xileno antes ser incorporados en parafina. Entonces se orientó el tejido procesado en un molde, se incorporó en un bloque de parafina y se cortó en un microtomo para generar secciones de 5 pM. Se flotan los cortes de tejido sobre portaobjetos modificados con poli-L-lisina (PLL). Los portaobjetos se secan y se disponen en un horno para "hornear" la parafina.

2. Tinción de secciones de tejido con hematoxilina y eosina de Harris

En resumen, se hidrataron las secciones disminuyendo sucesivamente la concentración de etanol: 2x durante 3 min cada vez en 100 % de etanol, 2x durante 3 min cada vez en 95 % de etanol y 1x durante 3 minutos en etanol al 70 %. Entonces se aclararon los portaobjetos durante 5 minutos en agua destilada y luego se tiñeron durante 6 minutos con disolución de hematoxilina (hematoxilina de Harris, Sigma, HHS-32). Los portaobjetos se aclararon en agua de grifo corriente durante aproximadamente 20 minutos y se decoloraron en alcohol ácido (etanol al 95 %, 2578 mL de dH2Ü, 950 mL de HCL, 9 mL) durante 1-3 segundos. Se aclararon nuevamente los portaobjetos con agua de grifo corriente durante 5 minutos, luego se sumergieron en carbonato de litio durante 3 segundos y luego se aclararon con agua de grifo durante 5 minutos. Se contratiñeron los tejidos con disolución de trabajo de eosina (100 mL de eosina de reserva (1 % de eosina-Y acuosa y 1 % de floxina B acuosa), 10 mL de floxina B de reserva, 780 mL de etanol al 95 %, 4 mL de ácido acético glacial) durante 15 segundos y se rehidrataron por incubación sucesiva en disoluciones de etanol (2x durante 3 minutos cada vez en disolución al 95 % de etanol y 2x durante 3 minutos cada vez en disolución al 100 % de etanol). Finalmente, los tejidos se incubaron en disolución de xileno durante 5 minutos y luego se montaron con Cytoseal para el análisis.

Detección de genes netB y tpeL de Clostridium perfringens por PCR

Tabla 1. Pares de cebadores usados para la detección de genes netB y tpeL en cepas aisladas de Clostridium perfringens de intestino de pollo

1. Extracción de ADN y cuantificación de la concentración de ADN

Se realizó la extracción de ADN de cepas aisladas de C. perfringens del contenido intestinal con kits de extracción de ADN comerciales de Qiagen, Hilden, Alemania, según las instrucciones del fabricante.

2. Amplificación de ADN

Se realizó la amplificación por PCR en un volumen final de 25 gL que contenía 1 ng de molde de ADN, 0,2 gM de cada uno de los cebadores para el gen a amplificar o detectar y 12 gL de 1x mezcla maestra de PCR que consistía en 1,2 unidades/25 gL de ADN polimerasa Taq. La amplificación se llevó a cabo en un sistema de PCR de amplificación génica, 9600 Thermocycler (Mastercycler de Eppendorf, Alemania). La desnaturalización inicial fue a 95 °C durante 5 min, seguido por 40 ciclos a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s, con una extensión final a 72 °C durante 7 minutos y mantenimiento a 40 °C.

Procesamiento de muestras

Se procesó un total de 36 muestras de plasma, 96 muestras fecales y 87 muestras cecales para el aislamiento y la extracción de ARN total de microvesículas. Los volúmenes de plasma de los diferentes animales variaron entre 0,5 mL y 3 mL.

Preparación de plasma

Brevemente, se recogió sangre en tubos K2 EDTA y se mezcló bien con inversiones completas. Entonces se centrifugaron los tubos a 1300 x g durante 10 min para separar los glóbulos sanguíneos y el plasma. Entonces se retiró el plasma y se filtró a través de un filtro de 0,8 gm para retirar el residuo celular y las plaquetas. Entonces se tomaron todas las muestras de plasma en alícuotas en crioviales de 1 mL y se conservaron -80 °C hasta su uso.

Aislamiento de microvesículas y extracción de ARN

Se han descrito previamente métodos del estado de la técnica de extracción de microvesículas y purificación adicional del contenido de microvesículas (MV) de biomateriales tales como sangre, LCR, tejidos y cultivos celulares en los documentos de patente US6899863B1 (Dhellin et al., 2005), EP 2495025 A1, WO 2014107571 A y 20140178885A1. Los métodos incluyen el uso de ultracentrifugación de alta velocidad, o el uso de centrifugación de baja velocidad para separar residuo celular, seguido por exclusión de tamaño o unión por afinidad a membranas específicas o filtración (véase la revisión por Witwer y colaboradores, 2013). También se han descrito varios métodos inmunológicos de purificación de microvesículas (Thery, et al., 2016; Clayton et al., 2001; Wubbolts et al., 2003). Las microvesículas se pueden purificar usando matrices, perlas o partículas magnéticas funcionalizadas con anticuerpos que se unen a proteínas de la superficie de microvesículas para seleccionar positivamente una población deseada o con anticuerpos que se unen a proteínas de la superficie de otros componentes celulares para su reducción (Kim et al., 2012 y Mathivanan et al., 2010). Los métodos rápidos de aislamiento de microvesículas disponibles para investigación incluyen el uso de dispositivos de microfluídica (2010, Chen, et al., 2010; documento de patente EP 2740536 A2) y kits comerciales (por ejemplo, SeraMir™ (System Biosciences), ExoSpin™ (Cell Guidance), ExoMir™ (Bioo Scientifics), miRCURY™ (Exiqon), que requieren poco o ningún equipo de laboratorio especializado.

En el presente documento, se realizó la extracción de microvesículas de muestras de plasma, fecales y cecales por los métodos descritos en el documento de patente WO2014/107571A1 (Enderle, et al., 2014). El método implicó el aislamiento de microvesículas de un líquido biológico capturándolas sobre la superficie de un filtro de membrana funcionalizada Q (Exo50, Exosome Diagnostics). Se liberó por lisis con Qiazol el contenido de ARN de las microvesículas capturadas, y entonces se purificó el ARN por extracción con cloroformo o con el kit comercial RNAesay de Qiagen. En resumen, se dejó que la muestra de plasma se descongelara lentamente sobre hielo y se diluyó 1:1 con PBS o 0,9 % de NaOH; se centrifugó la disolución de plasma a 300 g durante 10 minutos para retirar las células y los residuos. El sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,8 gm y luego el flujo continuo se centrifugó a 20.000 g a 4 °C durante 30 minutos para retirar cualquier residuo celular restante. Se preacondicionó la columna Exo50 con membrana de afinidad que se une a microvesículas dejando que pasaran a través de ella 5 mL de tampón de carga (2X) tampón fosfato 100 mM, NaCl 370 mM. Entonces, el sobrenadante que contenía las microvesículas obtenidas de la segunda etapa de centrifugación se enriqueció con 1000 copias de partícula Q-beta para examinar la eficiencia de extracción y de recuperación tras la carga sobre la columna de centrifugación previamente acondicionada. La columna se centrifugó brevemente y se desechó el flujo continuo. La columna se lavó dos veces con 2 mL de tampón de lavado (Bis-Tris-propano 250 mM, pH 6,5-7 y (1X) tampón fosfato 50 mM, NaCl 185 mM) y después del segundo lavado, la columna se centrifugó brevemente y se desechó el flujo continuo. Se lisaron las microvesículas unidas a la membrana para liberar el contenido mediante la adición de 5 mL (2,25 mL) de tampón de lisis (Qiazol) y se centrifugaron para recoger el lisado. Se extrajo ARN del lisado con el kit RNeasy, Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se reunió el ARN eluido con agua libre de RNasa para muestras duplicadas para obtener un volumen total de 46 gL por muestra. Se aplicó 1 gL de ARN en el kit Agilent RNA 6000 Nano para evaluar la calidad y la concentración del ARN, mientras que el ARN restante se almacenó a -80 °C para su uso adicional aguas abajo (Q-PCR o secuenciación). Se evaluó la eficiencia de extracción y la cantidad de extracción de ARN comparando la expresión del gen diana de control Q-beta (gen de la proteína de la envuelta Q-beta) en el ARN extraído por análisis por RT-PCR con la de los genes diana de interés. Se usó una curva patrón de al menos 2, 3 o 4 concentraciones conocidas en dilución al 10 % de un gen diana de control para determinar el número de copias. Se comparó el número de copias detectadas y la cantidad de partícula Q-beta añadida para determinar la calidad del proceso de aislamiento y/o de extracción.

Muestras fecales y cecales

Puesto que las muestras de plasma y cecales contienen materiales gruesos grandes, se aplican etapas de procesamiento previo adicionales antes de realizar el aislamiento de microvesículas y la extracción de ARN usando el kit Exo50 y métodos asociados como se ha descrito anteriormente para muestras de plasma. Por ejemplo, se dejó descongelar lentamente una muestra fecal de 200 mg; entonces se añadió 1 mL de PBS frío o 0,9 % de NaOH estéril para homogeneizar la muestra fecal / cecal, seguido por mezcla en vórtex durante aproximadamente 1 minuto. La suspensión resultante se diluye 1:1 con PBS y luego se centrifuga a 20.000 g durante 30 min a 4 °C para retirar las partes grandes no deseadas. Se filtró el sobrenadante a través de un filtro de éster de celulosa mixto de 0,8 gm (por ejemplo, filtro Millipore) y el filtrado se conservó a 4 °C hasta uso adicional o se procesó como se describe para la muestra de plasma anteriormente.

Tabla 2. Lista de cebadores y sonda usados para la qPCR para cuantificar niveles de expresión de dianas. Se compraron el miARN de Life Technologies y se sintetizaron cebadores y sonda diseñados internamente por IDT (Integrated DNA Technologies, EE. UU.)

QRT-PCR de ARN derivado de heces / ciego

Se realizó retrotranscripción del ARN fecal y cecal con el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO siguiendo las instrucciones del fabricante y las siguientes modificaciones: la reacción de RT consistió en 11 gL (5x mezcla de reacción VILO), 5,5 gL (10x mezcla de enzimas SS), 5,5 gL (H2O libre de nucleasa) y 33 gL (ARN). Mientras que el perfil del ciclo de RT consistió en 4 ciclos secuenciales de incubación / mantenimiento a 25 °C durante 10 min, 42 °C durante 60 min, 85 °C durante 5 min y un etapa de mantenimiento final a 4 °C.

Q RT-PCR para plasma y miARN derivado de heces / ciego:

Se realizó por triplicado la retrotranscripción del miARN para cada muestra usando retrotranscripción de ARN usando el kit de retrotranscripción de microARN TaqMan con la siguiente formulación de mezcla maestra para RT y perfil de ciclos: la reacción de RT consistió en 6 gL (conjunto de cebadores de RT), 0,3 gL (dNTP de 100 mM), 1,5 gL (10x tampón de RT), 0,2 gL de inhibidor de RNasa, 3,0 gL de RT MultiScribe y 4 gL (4 gL de ARN para muestras fecales y cecales, y 2 gL de ARN 2 gL de tampón TE para muestras de plasma). Mientras que el perfil del ciclo de RT consistió en 4 ciclos secuenciales de incubación / mantenimiento a 16 °C durante 30 min, 42 °C durante 30 min, 85 °C durante 5 min y una etapa de mantenimiento final a 4 °C. Se reunió el conjunto de cebadores de RT obtenido por 10 microlitros de cada cebador de RT y se diluyó hasta 1 mL con tampón TE, haciendo que la concentración final de cada cebador de RT 0,05X. Se añadieron cinco veces (5x) del ensayo de miARN personalizado (miR-16, miR-21, miR-24, miR- 155 y miR-206) al conjunto de cebadores de RT respectivo.

QPCR de ARN fecal / cecal

Se realizó qPCR para los ensayos basados en sonda para genes de ARN usando el Rotor-Gene Q de Qiagen, según las instrucciones del fabricante. La temperatura de hibridación de los ensayos de virX, colA y netB fue 57 °C, mientras que la temperatura de hibridación para el análisis de ARNr 16s de Clostridium perfringens fue 60 °C. Las reacciones de la mezcla maestra para los ensayos consistieron en 5,5 gL (agua libre de nucleasa), 10 gL (mezcla maestra de PCR TaqMan Fast Universal sin UNG AmpErase), 0,5 gL de cebador directo (20 uM), 1,5 gL de cebador inverso (20 gM), 0,25 gL de sonda (20 gM), 0,25 gL de UNG (uracil-N-glucosilasa) y 2 gL de ADNc. Para la amplificación de ARN 16s, se usó 1 gL de cada uno de directo e inverso.

Se realizó el kit de PCR Rotor-Gene SYBR Green para ARN no codificante pequeño ARN-VR, e45nt y ARNcp. Las reacciones de mezcla maestra para los ensayos consistieron en 5,75 gL (agua libre de nucleasa), 10 gL (mezcla maestra Rotor Gene SYBR 2x), 0,5 gL de cebador directo (20 uM), 1,5 gL de cebador inverso (20 gM), 0,25 gL de sonda (20 gM), 0,25 gL de UNG (uracil-N-glucosilasa) y 2 gL de ADNc. La amplificación se realizó con la siguiente condición: Primera etapa de mantenimiento a 50 °C durante 2 min, seguido por otro mantenimiento a 95 °C durante 10 y luego 40 ciclos que consisten en 95 °C durante 2 segundos, 60 ° durante 15 s, 72 °C durante 20 s.

Análisis estadístico

Todos los cálculos estadísticos se realizaron usando el software estadístico R. Como resultado de la estequiometría del ensayo y la eficiencia global de los protocolos analíticos, se imputó con 40 la sustitución de los valores ausentes (sin señal) antes de la normalización, que es el valor de CT posible más alto en una qPCR con 40 ciclos de amplificación. Se calcularon estadísticas moderadas para la comparación por parejas de los grupos de tratamiento con la función ImFit en el paquete limma (limma: modelos lineales para datos de micromatriz, Smyth G.K. en: Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, Springer, New York, pp 397-420, versión del paquete R 2.16.5) y se ajustaron los valores de p resultantes según el método de Benjamini y Hochberg (1995) para obtener los valores de q (tasa de falsos descubrimientos)

Análisis multivariante (ANOVA)

Se examinó cualitativamente la dependencia entre el tiempo, el tratamiento y el tipo de muestra. Se realizó una evaluación cuantitativa formal de posibles asociaciones realizando pruebas de ANOVA bilateral y de Kruskal-Wallis no paramétricas. Ambos métodos se han aplicado independientemente a datos de miARN y ARN bacteriano. Se usó ANOVA bilateral para probar dos efectos principales y una interacción. El primer efecto principal fue el tiempo después del tratamiento (en horas), el segundo efecto principal fue el tipo de tratamiento (control, simulación, dosis alta, dosis baja). Se aplicó por separado la prueba de Kruskal-Wallis al tiempo y al tratamiento, para probar una asociación de estos factores con la expresión génica. No se evaluó interacción multivariable por este método. Se analizaron tres tipos de muestras (cecal, excrementos y plasma) para 4 miARN (miR-16, miR-24, miR-155 y miR-206) y estuvieron disponibles un total de 216 datos duplicados. También se analizaron seis dianas bacterianas en dos tipos de muestra (cecal y excrementos) y estuvieron disponible un total de 108 datos duplicados. Se usaron las medias de los datos duplicados (valor de Ct medio de cada muestra) para análisis estadísticos adicionales. El análisis se realizó en tanto los datos sin procesar como los datos normalizados. Se usó miR-191 como normalizados para el análisis de microARN, mientras que los valores de Ct de 16S ARNr de C. perfringens se usaron como normalizador para las dianas bacterianas. El modelo lineal de ANOVA (Anova (lm(expresión~tiempo+tratamiento+tiempo*tratamiento)) generó valores de p para tres factores (tiempo-efecto, tratamiento-efecto, interacción) para los datos normalizados y sin procesar, mientras que los 2 valores de p (tiempo-efecto y tratamiento-efecto) se generaron a partir de los análisis de Kruskal-Wallis para los datos normalizados y sin procesar.

Resultados:

Tabla 3. Número de aves muertas por grupo después de la exposición a C. perfringens. Murió un ave en cada uno de los grupos: grupo de sonda nasogástrica de baja dosis, grupo de simulación y grupo de control negativo. Murieron 4 aves en el grupo de aves expuestas a alta dosis de Clostridium perfringens.

Tabla 4: Marcadores con manifestación significativamente elevada

en las vesículas de membrana de excrementos cecales

Tabla 5: Marcadores con manifestación significativamente elevada

en vesículas de membrana de excrementos fecales

Tabla 6: Marcadores con manifestación significativamente elevada

en vesículas de membrana de muestras de sangre

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de detección de enteritis necrótica aviar, en particular enteritis necrótica aviar subclínica, en donde la detección de enteritis necrótica se lleva a cabo detectando la cantidad de al menos una de las siguientes secuencias en una muestra aviar:

l) polinucleótidos que comprenden los polinucleótidos según (a) a (k).

2. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra aviar es un líquido corporal, preferentemente sangre, en particular plasma sanguíneo o suero sanguíneo, o un excremento corporal, preferentemente un excremento fecal o cecal.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra aviar es una muestra de ave de corral, preferentemente una muestra de pollos, pavos, patos, gansos, pavos reales, faisanes, perdices, gallina de Guinea, codornices, urogallos, gallo lira, palomas, cisnes, avestruces y loros, lo más preferentemente pollos.