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ES2816009T3 - Administración de agentes terapéuticos mediante una proteína de unión a colágeno - Google Patents

Administración de agentes terapéuticos mediante una proteína de unión a colágeno Download PDF

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ES2816009T3
ES2816009T3 ES18173596T ES18173596T ES2816009T3 ES 2816009 T3 ES2816009 T3 ES 2816009T3 ES 18173596 T ES18173596 T ES 18173596T ES 18173596 T ES18173596 T ES 18173596T ES 2816009 T3 ES2816009 T3 ES 2816009T3
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ES
Spain
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collagen
cbd
pth
seq
pog
Prior art date
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Active
Application number
ES18173596T
Other languages
English (en)
Inventor
Joshua Sakon
Sagaya Philominathan
Ranjitha Katikaneni
Osamu Matsushita
Tulasi Ponnapakkam
Takaki Koide
Robert Gensure
Nozomu Nishi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kitasato Institute
Kagawa University NUC
Montefiore Medical Center
University of Arkansas at Fayetteville
University of Arkansas at Little Rock
Original Assignee
Kitasato Institute
Kagawa University NUC
Montefiore Medical Center
University of Arkansas at Fayetteville
University of Arkansas at Little Rock
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Kitasato Institute, Kagawa University NUC, Montefiore Medical Center, University of Arkansas at Fayetteville, University of Arkansas at Little Rock filed Critical Kitasato Institute
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Abstract

Una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agente terapéutico, para su uso en el tratamiento de una colagenopatía en un sujeto que necesite tratamiento con el agente terapéutico, en donde el agente terapéutico no es un antagonista del receptor PTH/PTHrP, en donde el segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano administra el agente a sitios que comprenden colágeno parcialmente desenrollados o poco enrollados, y en donde la colagenopatía se caracteriza por sitios de colágeno parcialmente desenrollados o poco enrollados.

Description

DESCRIPCIÓN
Administración de agentes terapéuticos mediante una proteína de unión a colágeno
Introducción
La administración de agentes terapéuticos a sitios del organismo de un sujeto donde se necesita un agente terapéutico concreto para que sea eficaz, es un campo en desarrollo. Dichos sistemas de administración permitirán un uso más eficaz de los agentes terapéuticos, con menos toxicidad derivada de algunos agentes terapéuticos. El uso de liposomas o polipéptidos dirigidos, como los anticuerpos, para dirigir agentes terapéuticos a sitios concretos del organismo ha mostrado tener éxito, pero se necesitan agentes adicionales.
La alopecia (pérdida de cabello) es un evento perturbador tanto fisiológica como emocionalmente con múltiples causas. La alopecia se produce con mayor frecuencia en la calvicie de patrón masculino, que afecta a aproximadamente dos tercios de los varones de aproximadamente 35 años de edad; se observa un patrón de pérdida de cabello similar en mujeres con síndrome de ovarios poliquísticos. En ambos trastornos, la pérdida de cabello está mediada por andrógenos. La alopecia también se puede producir como enfermedad autoinmunitaria, denominada alopecia areata; un trastorno que afecta al 1,7 % de la población. Puede producirse como efecto secundario de tratamientos médicos, especialmente en la quimioterapia, donde un 65-85 % de los pacientes de quimioterapia experimentan algún grado de alopecia. Las consecuencias psicológicas de la pérdida de cabello se han estudiado bien en el escenario de la quimioterapia. La alopecia inducida por quimioterapia (AIQ) puede producir ansiedad, depresión, una imagen corporal negativa, una menor autoestima y una menor sensación de bienestar. De hecho, 47-58 % de las mujeres pacientes de cáncer consideran la pérdida de cabello el aspecto más traumático de la quimioterapia, y un 8 % declinaría el tratamiento por temor a la pérdida de cabello. Además de estos estudios en pacientes de quimioterapia, existen evidencias de otras formas de alopecia que respaldan la terapia para reducir las consecuencias psicológicas de la pérdida de cabello. De esta forma, sería beneficioso disponer de un nuevo tratamiento para detener la pérdida de cabello o acelerar el recrecimiento del cabello.
Aunque se han utilizado fármacos con efectos antiandrogénicos suaves (es decir, espironolactona) con un éxito limitado como terapia para la alopecia, la primera medicación eficaz para la alopecia fue minoxidil (Rogaine). Este antihipertensivo tiene un efecto secundario adverso de producir el crecimiento del cabello, y en la actualidad se utiliza como una terapia tópica para muchas formas de alopecia. Sin embargo, las respuestas son incompletas, donde algunos sujetos solamente muestran una ralentización de la pérdida de cabello en lugar de un recrecimiento real. Finasteride (Propecia) es un agente novedoso que bloquea conversión de testosterona en dihidrotestosterona, dando como resultado una mejora de la alopecia androgénica a costa de un bloqueo parcial del sistema de los andrógenos. Sin embargo, las tasas de respuesta a largo plazo (10 años) son solo de aproximadamente un 50 %. En su conjunto, a pesar de una importante investigación en este campo, sigue sin haber una terapia adecuada para la pérdida de cabello.
Además, el crecimiento del vello indeseado es una cuestión estética que muchas personas afrontar de forma regular. El vello no deseado en la cara, piernas, brazos, torso o espalda es un creciente problema cosmético. Muchas personas utilizan terapia con láser, cera u otras terapias para eliminar el vello no deseado. En la actualidad no existe ningún principio farmacéutico que limite el crecimiento del vello.
Las colagenopatías representan una gran cantidad de enfermedades en las que la formación o la estructura del colágeno no son normales. Este grupo de enfermedades da como resultado una amplia gama de síntomas entre los que se incluyen defectos óseos, defectos vasculares, y defectos en la piel. Muchas de estas enfermedades no tienen tratamiento, o los tratamientos disponibles son ineficaces.
Por ejemplo, la osteogénesis imperfecta (OI), también conocida como enfermedad de los huesos de cristal, está producida por una mutación congénita en el colágeno de tipo I. Aproximadamente de 25.000 a 50.000 estadounidenses están afectados y los efectos de la enfermedad van de leves, en los que muchas personas no son conscientes de la enfermedad, a graves, en los que las personas no pueden llevar una vida normal debido a las fracturas óseas recurrentes. La mayoría de pacientes de OI tienen una mutación que produce un cambio de aminoácido en el colágeno, que cambia una glicina por un aminoácido más voluminoso, lo que da como resultado una perturbación en la estructura de triple hélice del colágeno y una torsión deficiente. El organismo puede responder hidrolizando el colágeno, y esto puede dar como resultado una reducción en la resistencia ósea. En la actualidad no existe cura y pocos tratamientos para la OI.
Sumario
La invención proporciona una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de una colagenopatía en un sujeto que necesite tratamiento con el agente terapéutico, en donde el agente terapéutico no es un antagonista del receptor PTH/PTHrP y en donde la colagenopatía se caracteriza por sitios de colágeno parcialmente desenrollados o poco enrollados.
En el presente documento se divulgan métodos para administrar agentes terapéuticos, mediante la administración de composiciones que incluyen segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido al agente terapéutico a los sujetos que necesitan tratamiento con el agente terapéutico. En estos métodos, el agente terapéutico no es un agonista o antagonista del receptor PTH/PTHrP, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento epidérmico (EGF), y el segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano suministra el agente a los sitios donde el colágeno está parcialmente desenrollado o poco enrollado. También se divulgan en el presente documento métodos para tratar un sujeto con una colagenopatía, tal como osteogénesis imperfecta, mediante la administración de una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar la colagenopatía, que se proporciona. El segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano suministra el agente a los sitios donde el colágeno está parcialmente desenrollado o poco enrollado.
En otro aspecto más de la presente divulgación, se proporcionan métodos para tratar el hiperparatiroidismo mediante la administración de una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto.
En otro aspecto adicional de la presente divulgación, se proporcionan métodos para ralentizar el crecimiento o el recrecimiento del vello tras la depilación mediante la administración de una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto.
En un aspecto más de la presente divulgación, se proporcionan métodos para aumentar el crecimiento del cabello o la velocidad del recrecimiento del cabello después de la pérdida o la depilación mediante la administración de una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un alineamiento de secuencias que muestra el alineamiento de varias colagenasas bacterianas M9B procedentes de las familias de Bacillus y Clostridium. Los restos mostrados en azul son importantes para la actividad de unión del colágeno, los mostrados en verde son importantes para mantener la arquitectura o el plegado de proteína. Ambos grupos también están subrayados para las secuencias superior e inferior. Los restos mostrados en rojo son fundamentales para la unión a Ca2+ y los de color naranja son fundamentales para colocar los residuos de unión a Ca2+ .
La Figura 2 es un conjunto de dibujos que muestran las estructuras químicas de los péptidos sintetizados.
La Figura 3A es un gráfico que muestra el espectro de dicroísmo circular, de los péptidos colagenosos medidos a 4°C.
La Figura 3B es un gráfico que muestra el perfil de desnaturalización térmica de varios péptidos colagenosos. La temperatura se aumentó a una velocidad de 0,3°C/min.
La Figura 4A es un gráfico que muestra el perfil de dispersión con la intensidad I(Q) representado gráficamente contra el vector de dispersión Q.
La Figura 4B es un gráfico que muestra la función de distribución par-distancia P(r) en el espacio real obtenido usando GNOM para el complejo [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3:CBD (Rojo), complejo [PROXYL-(POG)4POA(POG)5]3:CBD (Azul), complejo [PROXYL-(POG)5 POA(POG)4]3 :CBD (Verde), complejo [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3:CBD (Naranja) y complejo [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3:CBD (Cian).
La Figura 5 es un conjunto de gráficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones entre el dominio de unión a colágeno (CBD) - péptido colagenoso. La Figura 5A muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1ü]3:CBD (verde) en una relación 1:1. La resonancia de amida de V973, G975 y S979 están presentes en esta titulación. La Figura 5B muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL-(POG)6POA(POG)3]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de V973, G975 y S979 desaparecieron debido a su proximidad con el grupo de espín marcado. La Figura 5C es un diseño que muestra la estructura de y de los restos CBD que tienen la línea engrosada después de la titulación con [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3.
La Figura 6 es un conjunto de gráficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones CBD -péptido colagenoso. La Figura 6A muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1ü]3:CBD (verde) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de Q972, V973, G975 y S979 están presentes en esta titulación. La Figura 6B muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de Q972, V973, G975 y S979 tienen la línea engrosada debido al resto PROXYL. La Figura 6C es un diseño de la estructura de c Bd que muestra los restos CBD que tienen la línea engrosada de forma única después de la titulación con [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3. La Figura 6D muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1ü]3:CBD (verde) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de L946, Q972, V973, G975 y S979 están presentes en esta titulación. La Figura 6E muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL (POG)4POA(POG)5]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de L946, Q972, V973, G975 y S979 desaparecieron debido a la marca de espín. La Figura 6F muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N de [(POG)4POA(POG)5]3:CBD (cian) en una relación 1:1. En ausencia de la marca de espín, las resonancias de la amida de L946, Q972, V973, G975 y S979 no tienen la línea engrosada. La Figura 6G muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1ü]3:CBD (verde) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de L946, G953, Q972, V973, D974, G975, N976, V978, S979 están presentes durante esta titulación. La Figura 6H muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de L946, G953, Q972, V973, D974, G975, N976, V978, S979 tienen la línea engrosada debido al resto PROXYL. La Figura 6I es un diseño de la estructura de CBD que muestra los restos CBD que tienen la línea engrosada por la marca de espín de [PROXYL-(POG)3POA(POG)a]3.
La Figura 7 es un conjunto de gráficas que muestran la disminución en la intensidad de (A) Q972, (B) G975, (C) S979 y (D) L924 en CBD en función de concentraciones crecientes de minicolágeno es decir [(POG)1ü]3 (negro), [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3(rojo), [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3(azul), [PROXYL-(POG)4POA(POG)5]3(verde), y [PROXYL-(POG)3POA(POG)a]3(clan).
La Figura 8 es un conjunto de gráficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones CBD -péptido colagenoso. La Figura 8A muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1ü]3:CBD (verde) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 están presentes en esta titulación. La Figura 8B muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)4POA(POG)5C-PROXYL]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 tienen la línea engrosada debido al resto PROXYL. La Figura 8C muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N de [(POG)4POA(POG)5C-carbamidometil]3:CBD (cian) en una relación 1:1. En ausencia de la marca de espín, las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 no tienen la línea engrosada. La Figura 8D es un diseño de la estructura de CBD que muestra los restos CBD que tienen la línea engrosada debido a la marca de espín de [(POG)4POA(POG)5C-PrOXYL]3. Las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 (rojo) desaparecieron tras titulación con [(POG)4POA(POG)5-PROXYL]3. La Figura 8E muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1ü]3:CBD (verde) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de S906, Q972, V973, G975, S979, S997 y G998 están presentes en esta titulación. La Figura 8F muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. Las resonancias de la amida de S906, Q972, V973, G975, S979, S997 y G998 desaparecieron debido a la marca de espín. Figure 8G muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N de [(POG)3PCG(POG)4]3:CBD (cian) en una relación 1:1. Las resonancias de S906, Q972, V973, G975, S979, S997 y G998 están intactas en ausencia de la marca de espín. La Figura 8H es un diseño de la estructura de CBD que muestra los restos que tienen la línea engrosada de forma única después de la titulación con [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3. Solamente las resonancias de amida de S906, r929, S997, y G998 (rojo) desaparecieron en la relación 0,2:1. Cuando la relación del péptido aumentó hasta 0,3:1, las resonancias adicionales de V973, G975, S979 (azul) desaparecieron.
La Figura 9 es un conjunto de dibujos de estructura derivados de los perfiles de dispersión SAXS usando cálculos de hibridación simulada ab initio para (A) complejo [PROXYL-(pOg )3POA(POG)6]3:CBD, (B) complejo [PROXYL-(POG)4POA(POG)5]3:CBD, (C) complejo [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3:CBD y (D) complejo [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3:CBD, (E) complejo [(POG)4POA(POG)5C-PROXYL]3:CBD, (F) [(POG)4POA(POG)5C-carbarnidometil]3:CBD. Los sitios de la mutación Gly^Ala están destacados. Las Figuras 9G y 9H muestran dos modos de unión probables del complejo [11PROXy L-(POG)3PCG(POG)4]3:CBD.
La Figura 10 es un conjunto de gráficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones CBD -péptido colagenoso. Figure 10A es una superposición del espectro HSQC 1H-15N de [POGPO-15N-G-(POG)s]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N HSQC del complejo [pOg PO-15N-G-(POG)b]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. La Figura 10B muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de [POGpO-15N-G-(POG)2-POA-(POG)5]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N HSQC del complejo [POGPO-15N-G-(POG)2-POA-(POG)5]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. La Figura 10C muestra una superposición del espectro HSQC 1H-15N de [(POG)s-PO-15N-G-POG]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)s-PO-15N-G-POG]3:CBD (rojo) en una relación 1:1. La Figura 10D muestra una superposición del espectro Hs Qc 1H-15N de [(pOg )4-POA-pO-15N-G-POG]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)4-POA-PO-15N-G-pOg ]3:CBD (rojo) en una relación 1:1.
La Figura 11 muestra la distribución en el tejido de S35 -PTH-CBD 1 hora y 12 horas después de la inyección subcutánea. Destacar el perfilado de la piel.
La Figura 12 es un conjunto de fotografías que documentan el crecimiento del cabello en la espalda de ratones en el día 36 después de la depilación, grupos de tratamiento como se indica (Antagonista = PTH(7-33)-CBD, Agonista = PTH-CBD).
La Figura 13 es un conjunto de fotografías que muestran la histología en el Día 36 después del tratamiento indicado. Se tomaron muestras de piel de la región dorsal, que se procesaron para su tinción mediante hematoxilina y eosina (H&E). Se muestran secciones representativas de cada grupo de tratamiento como se indica. (Antagonista = PTH(7-33)-CBD, Agonista = PTH-CBD).
La Figura 14 es un gráfico que muestra el recuento de folículos pilosos según campo alto potenciado. Los folículos pilosos en fase anágena VI se contaron por dos observadores independientes de manera enmascarada. Los resultados se expresan como promedio /- desviación estándar. **=p<0,01 vs. sin quimio ANOVA seguido por la prueba de Dunnett. (Antagonista = PTH(7-33)-CBD, Agonista = PTH-CBD).
La Figura 15 es un conjunto de fotografías que muestran el crecimiento del pelo en la espalda de los ratones después de cada uno de los tratamientos indicados y un gráfico que muestra los resultados de un análisis mediante escala de grises del cabello en el sitio de inyección con el tiempo después de la inyección.
La Figura 16 es un conjunto de fotografías que muestran el pelo de la espalda de los ratones después del tratamiento indicado sin depilación anterior.
La Figura 17 es un conjunto de fotografías y un gráfico que muestran el análisis en escala de grises del crecimiento de pelo en la espalda de los ratones que comparan los tratamientos indicados con el PTH-CBD administrado antes de la quimioterapia en contraposición a después de comenzar la quimioterapia.
La Figura 18 es una fotografía de tres ratones 13 días después de la aplicación de cera para eliminar el pelo y el tratamiento con PTH-CBD, PTH antagonista-CBD o vehículo solo.
La Figura 19 es un conjunto de fotografías de ratones que muestran recrecimiento del cabello en un modelo de alopecia areata después del tratamiento con un control o con PTH-CBD.
La Figura 20 es un gráfico que muestra los niveles de hormona paratiroidea en ratas envejecidas ovariectomizadas que recibieron una inyección con una sola dosis de PTH-CBD humano 6 meses antes del sacrificio.
Descripción detallada
Se proporcionan en el presente documento métodos para suministrar un agente terapéutico mediante la administración de una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agente terapéutico a un sujeto que necesita tratamiento con el agente terapéutico. En esta realización, el agente terapéutico no es un agonista o antagonista del receptor PTH/PTHrP, u no es un polipéptido bFGF o EGF. El segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano suministra el agente terapéutico a los sitios donde el colágeno está parcialmente desenrollado o poco enrollado. La presente invención se define en las reivindicaciones.
Además, se proporcionan métodos para tratar colagenopatías, tales como la osteogénesis imperfecta (OI), mediante la administración de una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto que necesita tratamiento para la colagenopatía. Las colagenopatías incluyen aunque no de forma limitativa osteogénesis imperfecta, síndrome de Stickler, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Alport, enfermedad de Caffey, y daños localizados en el colágeno o en el cartílago. Muchas de estas enfermedades están causadas por defectos genéticos que dan como resultado que el colágeno de algunos tejidos quede poco enrollado o parcialmente enrollado.
Por ejemplo, los individuos con OI tienen una mutación que produce un cambio de aminoácido en el colágeno, que cambia una glicina por un aminoácido más voluminoso, lo que da como resultado una perturbación en la estructura de triple hélice del colágeno y una torsión deficiente del colágeno. En los Ejemplos, los inventores demuestran que los polipéptidos bacterianos de unión a colágeno descritos en el presente documento se dirigen y se unen a estas zonas de colágeno poco enrollado. Por lo tanto, el uso de los polipéptidos de unión a colágeno descritos en el presente documento para administrar un agente terapéutico capaz de tratar la OI a los sitios del colágeno poco enrollado puede permitir un tratamiento más eficaz.
El segmento de polipéptido de unión a colágeno y el agente terapéutico pueden reticularse químicamente entre sí o pueden ser porciones polipeptídicas de una proteína de fusión. Las expresiones "proteína de fusión" y "polipéptido de fusión" se pueden utilizar para referirse a un único polipéptido que comprende dos segmentos funcionales, por ejemplo, un segmento de polipéptido de unión a colágeno y un agente terapéutico de tipo polipéptido, tal como un segmento polipeptídico de un receptor PTH/PTHrP. Las proteínas de fusión pueden tener cualquier tamaño, y el único polipéptido de la proteína de fusión puede encontrarse en una forma multimérica en su estado funcional, por ejemplo, mediante una conexión de disulfuro de cisteína de dos monómeros del polipéptido único. Un segmento polipeptídico puede ser un polipéptido sintético o un polipéptido de origen natural. Dichos polipéptidos pueden ser una porción de un polipéptido o pueden comprender una o más mutaciones. Los dos segmentos polipeptídicos de las proteínas de fusión pueden unirse directa o indirectamente. Por ejemplo, los dos segmentos pueden unirse directamente mediante, por ejemplo, un enlace peptídico o reticulación química, o indirectamente, a través de, por ejemplo, un segmento enlazador o polipéptido enlazador. El enlazador peptídico puede tener cualquier longitud y puede incluir aminoácidos tradicionales y no tradicionales. Por ejemplo, el enlazador peptídico puede tener 1-100 aminoácidos de longitud, de forma adecuada tiene 5, 10, 15, 20, 25 o más aminoácidos de longitud de tal forma que la porción de unión a colágeno del polipéptido de fusión puede mediar en la unión de colágeno y el agente terapéutico puede tener su efecto terapéutico. Los enlazadores peptídicos pueden incluir aunque no de forma limitativa un dominio PKD (enfermedad del riñón poliquístico) procedente de una colagenasa u otra proteína tal como en la SEQ ID NO: 2, una etiqueta de GST o de His, o un enlazador de Ser o Gly.
El segmento polipeptídico de unión a colágeno es un polipéptido que se une al colágeno y puede ser parte de una proteína de fusión más grande, agente bioactivo, o agente farmacéutico. La determinación de si una composición, segmento polipeptídico, proteína de fusión, o agente farmacéutico o bioactivo, se une al colágeno, se puede llevar a cabo como se describe en la publicación de patente estadounidense n.° 2010/0129341. Brevemente, Se incuba con colágeno en tampón de unión, y la mezcla se filtra a continuación a través de un filtro que permitiría que pasara a su través, pero que bloquea el colágeno y por lo tanto retiene los materiales que se unan al colágeno. A continuación, el filtrado se analiza para determinar la presencia de la composición, segmento polipeptídico, proteína de fusión, o agente farmacéutico o bioactivo. De manera adecuada, al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o de forma más adecuada al menos un 99 % de la composición de unión a colágeno, segmento polipeptídico, proteína de fusión, o agente farmacéutico o bioactivo queda retenido por el filtro en este ensayo, en comparación a cuando la filtración se realiza sin colágeno.
El segmento polipeptídico de unión a colágeno puede ser un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano. Puede ser un segmento polipeptídico de unión a colágeno de Clostridium. El segmento polipeptídico de unión a colágeno puede ser un segmento de una colagenasa, o una colagenasa bacteriana, o una colagenasa de Clostridium. De forma adecuada, el segmento polipeptídico es solamente una parte de la colagenasa y el segmento polipeptídico de unión a colágeno no tiene actividad colagenasa. El polipéptido de unión a colágeno puede ser una proteína de unión a colágeno M9B bacteriana (incluidas las derivadas de Bacillus spp. y Clostridium spp.) o una M9A (incluidas las derivadas de Vibrio spp.), o un péptido de unión a colágeno derivado de dicha proteína. Por "derivada de", los autores entienden que el péptido es un fragmento de la proteína de longitud completa, un péptido que tiene cambios en los aminoácidos con respecto a la proteína natural o una combinación de los mismos. La clave es que el péptido retiene la capacidad de unirse al colágeno. Por ejemplo, un péptido se puede derivar de una proteína seleccionando una región de la proteína capaz de unirse al colágeno. Las composiciones que incluyen una colagenasa bacteriana como péptido de unión al colágeno se describen en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010/0129341.
La Figura 1 muestra un alineamiento de secuencias de la región de unión al colágeno de varias proteína de unión a colágeno M9B de origen bacteriano como las SEQ ID NO: 13-34. Como se puede observar en el alineamiento de secuencias, estas proteínas tienen una cantidad relativamente pequeña de identidad de secuencia (aproximadamente un 30 %), pero todas ellas se unen al colágeno de una forma similar y se cree que tienen similar conformación como se analiza en los Ejemplos. Así, cualesquiera de los péptidos mostrados en la Figura 1 o fragmentos de unión a colágeno de los mismos se pueden usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento. En la Figura 1, los restos de aminoácidos fundamentales para la conformación del péptido y para la actividad de unión a colágeno están subrayados y se muestran en color verde y azul, respectivamente. Los restos de aminoácidos clave para la unión al colágeno son una tirosina o fenilalanina en la posición 970 de ColG, la posición 977 de la secuencia ColH de la SEQ ID NO: 1 (posición 937 en la Figura 1) o una posición similar en una de las secuencias mostradas en la Figura 1; una tirosina en la posición 994 de ColG, la posición 1000 de la secuencia ColH de la SEQ ID NO:1 (posición 962 de la Figura 1) o una posición similar en una de las secuencias mostradas en la Figura 1; una tirosina, fenilalanina o histidina en la posición 996 de ColG, posición 1002 de la secuencia ColH de la SEQ ID NO:1 (posición 964 de la Figura 1) o una posición similar en una de las secuencias mostradas en la Figura 1. Así, un péptido con una identidad de secuencia relativamente baja, que comparte la estructura y función de la proteína ColG también se puede usar como dominio de unión al colágeno (CBD) del presente documento.
En una realización, la colagenasa es ColH, SEQ ID NO: 6. El segmento polipeptídico de unión a colágeno puede ser o puede incluir los restos 901-1021 de la SEQ ID NO:6 (restos 34-158 de la SEQ ID NO:1), o un fragmento de los restos 34-158 de la SEQ ID NO:1 de al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 aminoácidos de longitud. El segmento polipeptídico de unión a colágeno es al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o al menos un 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos 98 %, o al menos un 99 % idéntico a los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1. El segmento polipeptídico de unión a colágeno puede ser o puede incluir los restos 807-1021 de la SEQ ID NO:6 (restos 37-251 de la SEQ ID NO:2), o un fragmento de los restos 807­ 1021 de la SEQ ID NO:6 de al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 aminoácidos de longitud. Los restos 807-901 comprenden el dominio de la enfermedad del riñón poliquístico (PKD) de la proteína de unión a colágeno. Los expertos en la materia apreciarán que se podrían utilizar otros enlazadores para unir el péptido de unión al colágeno a un agente terapéutico, como se resalta anteriormente. El segmento polipeptídico de unión a colágeno puede ser o puede comprender un fragmento de los restos 901-1021 de la SEQ ID NO:6, por ejemplo, un fragmento de al menos 8, al menos 10, al menos 20, a menos 30, al menos 40, o al menos 50 restos de aminoácidos consecutivos de los restos 901-1021 de la SEQ ID NO:6. De forma adecuada, el polipéptido de unión a colágeno consiste en los restos 894-1008, 894-1021, 901-1021, o 901-1008 de la SEQ ID NO: 6 o un homólogo de la misma como se muestra mediante el alineamiento de secuencias de la Figura 9.
Entre otras proteínas, el segmento de unión a colágeno se puede derivar de ColG (Matsushita et al., (1999) J. Bacteriol. 181:923-933), una colagenasa de clase I procedente de Clostridium histolyticum. ColH es una colagenasa de clase II (Yoshihara et al., (1994) J. Bacteriol. 176: 6489- 6496). El segmento polipeptídico de unión a colágeno también puede ser un fragmento polipeptídico procedente de una cualquiera de las secuencias de proteínas proporcionadas en la Figura 1 que se alinea con los péptidos de unión al colágeno de Clostridium y Bacillus. Los expertos en la técnica apreciarán que otros miembros de esta familia de proteínas de unión al colágeno puede ser de utilidad en los métodos descritos en el presente documento.
Los agentes terapéuticos unidos al polipéptido de unión a colágeno pueden ser cualquier principio farmacéutico o cualquier otro principio activo adecuado, incluidos, aunque no de forma limitativa, promotores osteogénicos, antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, polipéptidos tales como proteínas recombinantes, citoquinas o anticuerpos, sustancias químicas de molécula pequeña, o cualquier combinación de los mismos. De manera adecuada, los agentes terapéuticos son capaces de promover el crecimiento del hueso, disminuir la inflamación, promover la estabilidad del colágeno. De manera adecuada, el agente terapéutico es uno de aquellos que tienen efecto terapéutico en la región del colágeno o del colágeno dañado. El agente terapéutico puede incluir, aunque no de forma limitativa, proteína morfogénica ósea (BMP), G-CSF, FGF, BMP-2, b M p - 3 , f G f - 2 , FGF-4, anticuerpo contra esclerostina, hormona de crecimiento, IGF-1, v E g F , TGF-p, KGF, FGF-10, TGF-a, TGF-p1, receptor TGF-p, CT, GH, GM-CSF, EGF, PDGF, celiprolol, activinas, y factores de crecimiento del tejido conectivo. En realizaciones alternativas, el principio activo puede ser un agonista o antagonista del receptor PTH/PTHrP.
La pérdida de hueso debido a una colagenopatía tal como osteogénesis imperfecta, síndrome de Stickler u otros, que ponen a una persona en riesgo elevado de una fractura de hueso debido a un defecto en el colágeno se podría tratar mediante la administración de un péptido anabólico del hueso. El CBD puede dirigir los agentes anabólicos del hueso a los sitios donde el colágeno está incorrectamente formado y, de esta forma, puede prevenir la fractura. La fragilidad vascular debido a defectos tal como el síndrome de Ehlers-Danlos de tipo IV, síndrome de Alport, u otras enfermedades donde la rotura de los vasos sanguíneos es más probable debido a un defecto en la formación de colágeno, se pueden administrar péptidos que estimulan el crecimiento o la reparación vascular. El CBD dirigirá el péptido a las zonas con el colágeno dañado y es probable que estas áreas tengan vasos dañados. Los agentes terapéuticos estimularán el crecimiento y la reparación en el sitio del daño y evitarán la rotura de los vasos.
La fragilidad de la piel debida a trastornos tales como el síndrome de Ehlers-Danlos, enfermedad de Caffey u otras enfermedades donde el debilitamiento de la piel debido a un defecto del colágeno produce hiperelasticidad, formación rápida de hematomas o mala cicatrización de heridas. Los factores de crecimiento dérmicos y epidérmicos pueden servir como agentes terapéuticos que cuando se unen al CBD y se administran a las zonas con el colágeno dañado estimularán el crecimiento y la reparación de la piel, evitando las estrías y mejorando la cicatrización.
Los defectos del colágeno también pueden producir malformación o insuficiencia del cartílago. Los factores de crecimiento del cartílago se podrían administrar localmente a los sitios con el cartílago dañado para ayudar en la reparación y restaurar la función.
El segmento polipeptídico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser un polipéptido sintético o un polipéptido de origen natural. Dichos polipéptidos pueden ser una porción de un polipéptido o pueden comprender una o más mutaciones. Las mutaciones pueden convertir el agonista del receptor PTH/PTHrP en un agonista mejor o peor, en comparación con el PTH/PTHrP natural. La actividad agonista con el receptor PTH/PTHrP se puede someter a ensayo como se describe en el Ejemplo 3, más adelante, mediante un ensayo de estimulación de AMPc. Un agonista estimulará la síntesis de AMPc en el ensayo descrito. De manera adecuada, un agonista puede activar la actividad del receptor en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 1o0 % o incluso un 110 % o 120 % de lo que haría el PTH(1-34) natural.
El segmento polipeptídico agonista del receptor PTH/PTHrP es un segmento polipeptídico PTH o PTHrP. Una isoforma humana de PTH es la SEQ ID NO:7. Una isoforma humana de PTHrP es la SEQ ID NO:8. Aunque se proporcionan isoformas humanas, los expertos en la materia apreciarán que también se pueden utilizar otras isoformas no derivadas de seres humanos. Dichas isoformas no derivadas de seres humanos pueden ser capaces de interactuar con el receptor PTH/PTHrP y viceversa. El segmento polipeptídico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-33 de la SEQ ID NO:1 (restos 1- 33 de PTH (SEQ ID NO:7)). El segmento polipeptídico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-34 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, es un fragmento de los restos 1-34 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, el segmento polipeptídico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-84 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, el segmento polipeptídico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-14 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones adicionales, el agonista del receptor PTH/PTHrP es un segmento polipeptídico de PTH o PTHrP de cualquier otra especie.
El antagonista del receptor PTH/PTHrP puede incluir en una realización PTH(7-34), es decir, los restos 7-34 de PTH (SEQ ID NO:7). En otra realización, es, o incluye, los restos 7-33 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, es un fragmento o los restos 7-34 de la SEQ ID NO: 8. En otra realización, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye PTH(7-14), es decir, los restos 7-14 de PTH (SEQ ID NO:7). En otra realización, los antagonistas del receptor PTH/PTHrP incluyen ((-1)-33) de PTH/PTHrP. En otra realización, los antagonistas del receptor PTH/PTHrP incluyen los restos 1-14 de PTH con una extensión en el extremo N. La adición de una extensión en el extremo N a PTH o fragmentos activos en el extremo N de PTH convierte los péptidos PTH en antagonistas. La extensión en el extremo N puede tener 1,2, 3, 4, 5, o más aminoácidos de longitud. La identidad de los aminoácidos de la extensión del extremo N no suele ser importante. En una realización, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye los restos 1-33 de PTH con una extensión Gly-Ser en el extremo N (SEQ ID NO:11). En otra realización, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye PTHrP(7-34), es decir, los restos 7-34 de la SEQ ID NO:8, o un fragmento de los restos 7-34 de la SEQ ID NO:8. En otra realización, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye TIP(7-39) de ratón (véase Hoare S R, Usdin T B. 2002. Specificity and stability of a new PTH1 receptor antagonist, mouse TIP(7-39). Peptides 23:989-98.). Otros antagonistas del receptor PTH/PTHrP que se pueden utilizar en las proteínas de fusión también se divulgan en Hoare et al. El antagonista del receptor PTH/PTHrP puede ser un fragmento de al menos 8, 10, 12 o más aminoácidos procedentes de los restos 1-34 de la SEQ ID NO:7. En otras realizaciones, el antagonista del receptor PTH/PTHrP puede ser el polipéptido antagonista del receptor PTH/PTHrP procedente de otra especie.
En una realización, el agente terapéutico o el antagonista del receptor PTH/PTHrP o el segmento polipeptídico antagonista está en el extremo N con respecto al segmento polipeptídico de unión a colágeno de la proteína de fusión. Es decir, cada uno de los dos segmentos polipeptídicos tiene un extremo N y un extremo C, y el extremo N del segmento polipeptídico de unión a colágeno está unido directa o indirectamente, por ejemplo, mediante un segmento polipeptídico enlazador (tal como un enlazador de PKD, glicina o serina) con el extremo C del agente terapéutico o segmento polipeptídico agonista o antagonista de PTH/PTHrP.
Las proteínas de fusión anteriormente descritas que comprenden (a) un segmento polipeptídico de unión a colágeno unido a (b) un agente terapéutico o un segmento polipeptídico agonista o antagonista de PTH/PTHrP se pueden sustituir por agentes farmacéuticos que comprenden (a) un segmento polipeptídico de unión a colágeno unido a (b) un agente terapéutico o agonista del receptor PTH/PTHrP o un agonista del receptor PTH/PTHrP no peptidílico. Un ejemplo de un agonista del receptor PTH/PTHrP no peptidílico es el compuesto AH3960 (Rickard et al., (2007) Bone 39:1361-1372).
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AH3960 contiene dos grupos amino. Los grupos amino de moléculas químicas pequeñas, tales como AH3960, se pueden usar para reticular el agente terapéutico a los grupos amino del segmento polipeptídico de unión a colágeno mediante un reticulante tal como DSG (glutarato de disuccinimidilo) o mediante una combinación de SANH (succinimidil-4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona) y SFB (benzoato de succinimidil-4-formilo). Los agentes terapéuticos se pueden reticular por su grupo amino a un grupo carboxilo del segmento polipeptídico de unión a colágeno mediante EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) o viceversa. Estos productos de reticulación están disponibles de Pierce (piercenet.com, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, III.). Los protocolos y las condiciones de reacción también están disponibles en la bibliografía del producto de Pierce (piercenet.com).
En otra realización de los agentes farmacéuticos que comprenden (a) un segmento polipeptídico de unión a colágeno; unido a (b) un agente terapéutico polipeptídico o un segmento polipeptídico agonista o antagonista de PTH/PTHrP, el segmento (a) y el segmento (b) son polipéptidos independientes, y los dos polipéptidos están unidos mediante reticulación química. Los dos polipéptidos pueden estar reticulados mediante grupos amino por reactivos que incluyen DSG (glutarato de disuccinimidilo) o glutaraldehído. También se pueden reticular mediante grupos amino mediante derivatización de un polipéptido con SANH (succinimidil-4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona) y el otro con SFB (benzoato de succinimidil-4-formilo), y mezclando después ambos polipéptidos derivatizados para su reticulación. Los dos polipéptidos se pueden reticular entre un grupo amino de un polipéptido y un carboxilo del otro mediante reacción con EDC (clorhidrato de (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida). Los polipéptidos también se pueden reticular (por ejemplo, acoplarse covalentemente) mediante cualquier otro método adecuado conocido de una persona normalmente experta en la materia. Estos reactivos de reticulación están disponibles de Pierce (piercenet.com, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, III.). Los protocolos y las condiciones de reacción también están disponibles en la bibliografía del producto de Pierce (piercenet.com). Estos y otros métodos de reticulación aplicables se describen en las solicitudes publicadas de patente de Estados Unidos 2006/0258569 y 2007/0224119.
En el presente documento también se proporcionan métodos para tratar el hiperparatiroidismo mediante la administración de PTH-CBD a un sujeto que necesita tratamiento para el hiperparatiroidismo. En una realización, la PTH administrada a un sujeto puede ser una PTH de una especie diferente. Como se muestra en los Ejemplos, una única administración de CBD-PTH a ratas envejecidas ovariectomizadas puede reducir la cantidad de PTH endógena producida por el animal. Por lo tanto, la administración de PTH-CBD a personas que padecen hiperparatiroidismo puede producir una disminución de los síntomas asociados con el hiperparatiroidismo y tener niveles menores de PTH después de la administración de PTH-CBD.
Los efectos de los agonistas y antagonistas de PTH sobre el crecimiento del cabello se han estudiado durante al menos 15 años. La PTH tiene un receptor común con el péptido relacionado con PTH (PTHrP), que normalmente está producido por los fibroblastos dérmicos. PTHrP afecta la proliferación y diferenciación de los queratinocitos, y modula el ciclo del cabello. La mayoría de los ensayos realizados sobre los efectos de crecimiento del cabello se han realizado con antagonistas de PTH, donde las indicaciones de los ensayos iniciales eran que estos eran los agentes más eficaces. Las formulaciones tanto inyectadas como tópicas se han sometido a ensayo en modelos animales de alopecia inducida por quimioterapia y en el ratón SKH-1 sin pelo. Parte del efecto de los antagonistas de PTH sobre el crecimiento del cabello es la transición de los folículos pilosos a un estado catágeno distrófico, que los protege de daños derivados de la quimioterapia. Sin embargo, los ensayos clínicos con antagonistas de PTH por vía tópica para la alopecia inducida por quimioterapia realizados por IGI Pharmaceuticals se interrumpieron en la Fase 2 debido a su eficacia limitada. Por tanto, se necesitan nuevas composiciones contra la alopecia.
Los problemas de administración y retención de PTH a la piel se pueden superar usando análogos de PTH dirigidos al colágeno. Para conseguir esto, los inventores sintetizaron varias proteínas de fusión con diferentes agonistas y antagonistas de PTH enlazados a un dominio de unión a colágeno derivado de la colagenasa ColH1 de Clostridium histolyticum. En los estudios descritos en los Ejemplos, los inventores descubrieron que el compuesto agonista PTH-CBD fomenta la transición de los folículos pilosos a la fase anágena, y tiene efectos potentes sobre el crecimiento del cabello. El compuesto antagonista PTH(7-33)-CBD tiene poco efecto sobre el crecimiento del cabello en modelos de quimioterapia, y tiene un efecto perjudicial sobre el recrecimiento del vello después de la depilación. Compuestos tales como pTH-CBD, que fomentan la transición de los folículos pilosos a la fase anágena, han sido muy deseados debido a su potencial para tratar una gran variedad de trastornos de pérdida de cabello. PTH-CBD parece tener un mecanismo de acción similar a la ciclosporina, que también fomenta la transición de los folículos pilosos a la fase anágena, aunque es menor probable que el mecanismo sea el resultado de efectos directos sobre la señalización de WNT. Aunque el uso clínico de la ciclosporina con este fin está limitado por toxicidad sistémica, PTH-CBD no ha mostrado efectos tóxicos, incluso con administración sistémica.
Por tanto, en otro aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para aumentar el crecimiento del cabello. Los métodos incluyen, administrar un CBD unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto que necesita tratamiento para inducir el crecimiento del cabello o detener la caída del cabello. El método es aplicable a personas con alopecia, incluida la alopecia inducida por quimioterapia, pero también alopecia areata, alopecia causada por calvicie de patrón masculino, síndrome de ovario poliquístico y otras pérdidas del cabello. Las composiciones pueden administrarse de forma local o tópica para tratar la pérdida de cabello.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para ralentizar el crecimiento o el recrecimiento del vello después de un procedimiento de eliminación mediante la administración de un CBD unido a un antagonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto. En una realización, la composición antagonista de PTH se aplica de forma local, por vía tópica. El antagonista de PTH se puede aplicar después de un procedimiento de eliminación del vello para evitar o ralentizar el crecimiento del vello. Tal como se describe en los Ejemplos, los inventores han demostrado que el recrecimiento del pelo se ralentiza después de aplicar depilación con cera a animales tratados con antagonistas de CBD-PTH en comparación con los animales de control tratados con PTH-CBD o vehículo solo. Las composiciones pueden administrarse de forma local o tópica para bloquear el crecimiento del vello.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse por medios conocidos por el experto en la materia, que incluyen, aunque no de forma limitativa, vías oral, tópica, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea. De esta manera, las composiciones pueden formularse como una formulación ingerible, inyectable, tópica o de supositorio. La composición se puede formular para su administración por inyección para dar como resultado una administración sistémica o una administración local. Las composiciones pueden administrarse también mediante un liposoma o vehículo de liberación temporalizada. Las composiciones pueden administrarse también mediante un vehículo de administración dirigida al sitio, tales como, aunque no de forma limitativa, un liposoma dirigido o un transportador de esponja de colágeno absorbible u otro implante.
Los inventores han descubierto que cuando se administran composiciones que incluyen un CBD por vía subcutánea, este se une localmente al sitio de la inyección si la composición está disuelta en un tampón de pH neutro. Pero si la composición está disuelta en un tampón de pH bajo, por ejemplo, un tampón que tiene pH 5,0 o pH 4,5 o inferior, el dominio de unión a colágeno no se une al colágeno, y la composición tiene tiempo para dispersarse sistémicamente antes de unirse al colágeno en otra parte del cuerpo a pH neutro. Por tanto, la administración sistémica de las composiciones implica administrar la composición disuelta en un tampón o solución acuosa a un pH menor de aproximadamente 5,0 o a pH 4,5 o inferior. En otra realización, la administración sistémica de las composiciones implica administrar las proteínas de fusión disueltas en una solución acuosa con un pH inferior a aproximadamente 6,0. Como alternativa, si la dolencia cutánea está localizada, las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar en un tampón con un pH de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 o superior para permitir la administración localizada de las composiciones en la zona afectada de la piel.
Las composiciones farmacéuticas para administración tópica también se pueden formular usando métodos y composiciones tales como las disponibles para los expertos en la técnica. Por ejemplo, geles, cremas o preparaciones de liposomas pueden ser adecuados para la administración tópica. Estos vehículos de administración se pueden formular para mediar la administración en las capas inferiores de la piel o para permitir una liberación prolongada en el sitio de aplicación.
Las composiciones se pueden administrar como una sola dosis o en forma de dosis divididas. Por ejemplo, la composición se puede administrar dos o más veces separadas por 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, un día, dos días, tres días, cuatro días, una semana, una semana o hasta tres o más semanas. Opcionalmente, dicho tratamiento se puede repetir, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses. Se espera que la composición sea más eficaz que una composición comparable o de control que comprende el agente Terapéutico o un agonista del receptor PTH/PTHrP que no esté enlazado a una proteína de unión a colágeno. En una realización, se puede usar una cantidad más pequeña de la composición o la composición puede administrarse menos frecuentemente que una composición comparable que comprende el agente terapéutico o un agonista del receptor PTH/PTHrP que no esté enlazado a una proteína de unión a colágeno. Las cantidades de dosificación y las frecuencias de administración proporcionadas en el presente documento están abarcadas por los términos terapéuticamente eficaz y profilácticamente eficaz. Las dosis individuales de los agentes farmacéuticos que comprenden un segmento polipeptídico de unión a colágeno enlazado a un agente terapéutico pueden ser aproximadamente las mismas en base molar que las dosis usadas para el agente terapéutico en solitario. Se espera que los agentes farmacéuticos que comprenden un segmento polipeptídico de unión a colágeno enlazado a un agente terapéutico se puedan administrar con menos frecuencia, porque la unión del agente al segmento polipeptídico de unión a colágeno le proporciona una actividad in vivo mucho más prolongada.
La administración de las composiciones al sujeto de acuerdo con la invención parece presentar efectos beneficiosos de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, en amplios límites, se espera que la administración de mayores cantidades de las composiciones consiga mejores efectos biológicos beneficiosos que la administración de una cantidad más pequeña. Además, también se contempla la eficacia a dosificaciones por debajo del nivel al cual se observa toxicidad.
Se apreciará que la dosificación específica administrada en cualquier caso dado se ajustará de acuerdo con las composiciones que se están administrando, la enfermedad que se va a tratar o inhibir, el estado del sujeto, y otros factores médicos relevantes que puedan modificar la actividad del agente o la respuesta del sujeto, como saben bien los expertos en la materia. Por ejemplo, la dosis específica para un sujeto concreto depende de la edad, peso corporal, el estado de salud general, la dieta, el calendario y el modo de administración, la tasa de excreción, los medicamentos usados en combinación, y la gravedad del trastorno particular para el que se aplica la terapia. Las dosificaciones para un paciente dado pueden determinarse usando consideraciones convencionales, por ejemplo, por comparación personalizada de las diferentes actividades de las composiciones de la invención y del agente terapéutico administrado en solitario, tal como mediante un protocolo farmacológico o profiláctico convencional adecuado.
La dosificación máxima para un sujeto es la dosificación más elevada que no produce efectos secundarios indeseables o intolerables. El número de variables con respecto a un régimen profiláctico o de tratamiento. individual es amplio, y se espera un considerable intervalo de dosis. La ruta de administración afectará los requerimientos de dosificación. Se anticipa que las dosis de las composiciones reducirán los síntomas de la patología en tratamiento en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % en comparación con los síntomas antes del tratamiento o los síntomas si no se aplica tratamiento. Se contempla específicamente que las preparaciones y composiciones farmacéuticas pueden paliar o aliviar los síntomas de la enfermedad sin proporcionar una cura o, en algunas realizaciones, se pueden utilizar para curar la enfermedad o trastorno.
Las cantidades de dosificación eficaces adecuadas para administrar las composiciones pueden determinarse por los expertos en la materia, pero normalmente varían desde aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 10.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente, aunque son normalmente de aproximadamente 1.000 microgramos o menos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En algunas realizaciones, la cantidad de dosis eficaz está comprendida en un intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En otra realización, la cantidad de dosis eficaz está comprendida en un intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 5.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En otra realización, la cantidad de dosis eficaz está comprendida en un intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 1000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. Las cantidades de dosis eficaz descritas en el presente documento se refieren a las cantidades totales administradas, es decir, si se administra más de un compuesto, las cantidades de dosis eficaz corresponden a la cantidad total administrada.
La eficacia de las composiciones descritas en el presente documento se puede potenciar en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 100 % con respecto a un control. tratado con el agente terapéutico en solitario. Se apreciará que la eficacia del tratamiento en cualquier caso dado se potenciará de forma variable según la composición específica que se use, el tipo de enfermedad a tratar, el estado del sujeto, las formulaciones específicas de los compuestos, y otros factores médicos relevantes que pueden modificar la actividad de las composiciones o la respuesta del sujeto, según apreciará el experto en la materia.
Se pretende que los siguientes ejemplos sean meramente ilustrativos y en ningún caso deben tomarse como limitantes del alcance de la invención o de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: CBD se dirige a regiones parcialmente desenrolladas o poco enrolladas del colágeno
La colagenasa de Clostridium histolyticum produce una amplia la degradación del colágeno del tejido conectivo dando como resultado gangrena gaseosa. El dominio de unión a colágeno (CBD) del extremo C de estas enzimas es el segmento mínimo necesario para unirse a las fibrillas de colágeno. CBD se une unidireccionalmente al extremo C parcialmente desenrollado de la tripe hélice del colágeno. También se estudió si el CBD también podría dirigirse a las regiones poco enrolladas incluso en la parte central de la triple hélice del colágeno. Los péptidos colagenosos parcialmente desenrollados se sintetizaron introduciendo sustituciones Gly^Ala en el colágeno ([(POG)xPOA(POG)y]3 donde x+y=9 y x>3). Los estudios de titulación realizados con resonancia magnética nuclear 1H-15N heteronuclear de coherencia de cuanto único (RMN HSQC) con CBD marcado con 15N demostraron que el minicolágeno desenrollado se une a una brecha de 10 A de anchura y 25 A de longitud. Seis péptidos colagenosos desenrollados, marcados cada uno de ellos con un radical nitróxido, se titularon con CBD marcado con 15N. Los efectos de relajación del espín nuclear paramagnético mostraron que el CBD se une cerca bien del sitio de sustitución Gly^Ala o bien al extremo C de cada minicolágeno. Las mediciones de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) revelaron que CBD prefiere unirse al sitio Gly^Ala que al extremo C. Los espectros de RMN HSQC de minicolágeno marcado con 15N y de minicolágeno desenrollado no se vieron afectados por la titulación del CBD no marcado. Los resultados implican que el CDB se une a la región parcialmente desenrollada del CBD del minicolágeno, pero no desenrolla activamente la triple hélice.
Materiales y métodos:
Producción de proteínas marcadas con 15N: El péptido s3b (Gly893-Lys1008) derivado de la colagenasa de clase I de Clostridium histolyticum (ColG) se expresó como una glutatión S-transferasa (GST)-proteína de fusión. La GST marcada se escindió mediante trombina, y el CBD se purificó tal como se ha descrito anteriormente. Matsushita, et al., (2001) J Biol Chem 276, 8761-8770. El marcado uniforme con el isótopo 15N se consiguió usando medio mínimo de Tanaka que contiene 15NH4Cl 40 mM. Se estimó que la eficacia de marcado era de un 99,6 %, según espectrometría de masas mediante desorción/ionización láser asistida por matriz con detector de iones por tiempo de vuelo (MALDI-TOF-EM).
Péptidos: (POG)10 (SEQ ID NO: 35) se adquirió al Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japón). Otros péptidos se construyeron mediante una estrategia normalizada basada en N-(9-fluorenil) metoxicarbonil (Fmoc) en resinas Rinkamida (Novabiochem, Darmstadt, Alemania). El marcado de espín del extremo N se llevó a cabo sobre la resina por tratamiento con 5 equivalentes de 3-carboxi-PROXYL (Aldrich), 1-hidroxibenzotriazol, diisopropilcarbodiimida en N,N-dimetilformamida a temperatura ambiente durante 2 horas. Las etapas de escisión del péptido y desprotección se llevaron a cabo por tratamiento con un cóctel secuestrante de ácido trifluoroacético (TFA) convencional (TFA: mcresol: tioanisol: agua: triisopropilsilano = 82,5: 5: 5: 5: 2,5, v/v). El marcado de espín en los restos Cys se llevó a cabo con 3-(2-yodoacetamido)-PROXYL (IPSL, Sigma-Aldrich). Brevemente, un exceso de 10 molar de IPSL disuelto en etanol se añadió al mismo volumen de 10 mg/ml de péptido en Tris-HCl 0,1 M (pH 8.8), ácido etilendiaminotetraacético 5 mM. Tras hacer reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h, la reacción se inactivó añadiendo un exceso de ditiotreitol. Todos los péptidos se purificaron mediante HPLC en fase invertida en una columna Cosmosil 5C-ia AR-II (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) y se caracterizó mediante MALDI-TOF-EM. Todas las masas medidas concordaron con los valores esperados. Las estructuras químicas de los péptidos sintetizados se muestran en la Fig. 2.
Espectroscopia de dicroísm o circular: La conformación de la triple hélice y la estabilidad de los péptidos colagenosos se comprobaron mediante espectroscopia DC (véase la Fig. 3 y la Fig. 4). Los espectros D c se registraron con un espectropolarímetro J-820 CD (JASCO Co., Hachioji, Japón) provisto de un termocontrolador Peltier, usando una cubeta de cuarzo de 0,5 mm y conectado a una estación de datos para promediado de la señal. Todas las muestras de péptidos se disolvieron en agua (1 mg/ml), y se almacenaron a 4 °C durante 24 h. Los espectros se notifican en términos de unidades de elipticidad por mol de restos peptídicos [0]mrw. La termoestabilidad de la triple hélice se vigiló mediante los valores de [0]225 de cada péptido al aumentar la temperatura a una velocidad de 0,3 °C/min.
Espectroscopia de RMN: Los experimentos de RMN se realizaron en un espectrómetro Bruker 700 MHz provisto de cryoprobe™. Todos los experimentos de titulación por RMN se realizaron a 16 ± 0,5 °C. La temperatura de trabajo es menor que las temperaturas de fusión (Tm) de todos los péptidos colagenosos marcados con espín paramagnético utilizados (Tabla 1). La concentración de la proteína fue 0,1 mM en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 100 mM y CaCh 20 mM. El efecto de dilución durante la titulación se minimizó por titulación de una solución madre muy concentra (4 mM) de péptido. Las alícuotas de péptido colagenoso se añadieron a la proteína y se equilibraron durante 5 min antes de adquirir los espectros 1H-15N HSQC. El pH de las muestras de RMN analizadas durante la titulación no presentaron un desplazamiento del pH significativo (en ± 0,2 unidades).
Tabla 1: Temperaturas de fusión (Tm) de varios péptidos de minicolágeno que se usaron en la titulación por RMN y
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Experimentos de dispersión de luz dinámica: Los datos de dispersión de luz dinámica (DLS) se recogieron en un DynaPro-E provisto de un micromuestreador con control de la temperatura sobre las muestras de CBD, péptidos colagenosos y complejos CBD:minicolágeno en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía cloruro de sodio 100 mM y CaCl2 20 mM. Las muestras de proteínas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 min y se filtraron por una jeringuilla Whatman de 0,02 pm directamente a una cubeta de cuarzo de 50 pl. Para cada experimento, se realizaron 20 mediciones. El radio hidrodinámico medio (RH), desviación estándar, polidispersidad, y porcentaje de área de picos se analizaron usando Dynamics V6 (Protein Solutions). Las estimaciones de radio hidrodinámico y peso molecular se calcularon a partir de fluctuaciones dependientes del tiempo inducidas por movimiento browniano, como se ha descrito. Proteau, et al. (2010) Curr Protoc Protein Sci Capítulo 17, Unidad 1710.
Experimentos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño en solución: Los datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño en solución (SAXS) se recogieron en soluciones de CBD, péptidos colagenosos y complejos CBD-minicolágeno en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM y CaCh 20 mM en configuración SAXS/WAXS situada en la línea del haz 5-ID-D del centro de investigación de sincrotrón DND-CAT, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory (Argonne, IL). La ventaja principal de la dispersión de rayos X es que se puede llevar a cabo en solución en condiciones casi fisiológicas. Petoukhov et al., (2007) Curr Opin Struct Biol 17, 562-571. La radiación de 1,2398 A (10 keV) se seleccionó desde el dispositivo de inserción APS Undulator A usando un monocromador Si-111, con enfoque horizontal 1:1 y mayor rechazo de armónicos procedentes de un espejo revestido Rh y ranuras de definición de haz configuradas de 0,3 en vertical por 0,25 mm en horizontal. Se usó una celda de flujo capilar de 1,6 mm de diámetro con un caudal de 4 pl/s para recoger cuatro marcos con un tiempo de exposición de 10 s. El detector SAXS usado fue un detector de centelleo Mar165 CCD acoplado a fibra óptica y que funcionaba en el intervalo de transferencia de momento de 0,005<q<0.198 A-1, donde q = 4n sin9/A (20 es el ángulo de dispersión). El detector WAXS era un detector de centelleo Roper CCD acoplado a fibra óptica personalizado y que funcionaba en el intervalo de transferencia de momento de 0,191<q<1,8 A' 1 S. Weigand, et al. (2009) Advances in X-ray Analysis 52, 58-68.
Todos los datos de dispersión se adquirieron a una temperatura de la muestra de 10 °C. Los cuatro patrones de dispersión de cada detector se promediaron y se combinaron con el rechazo de las exploraciones fuera de rango. Para análisis adicional, se usó el programa IGOR Pro 5.5 A (WaveMetrics). Los perfiles de dispersión de la proteína, péptido y sus complejos se obtuvieron después de restar los perfiles del tampón. Los datos de dispersión reducidos se representaron gráficamente como intensidad de dispersión I(Q) vs. Q (Fig. 4A). El radio de girado, Rg, se obtuvo con la aproximación Guinier por ajuste de mínimos cuadrados en la región QRg < 1, donde la intensidad de dispersión hacia adelante I(0) es proporcional al peso molecular del complejo de proteína. Una transformación de Fourier indirecta de los datos I(Q) mediante GNOM proporcionó la función de distribución de partículas P(r) en el espacio real (Fig. 4B). Svergun, D. (1992) J Appl Crystallogr 25, 495-503. Donde P(r) intersecta con el eje x, representa el diámetro máximo Dmáx promediado en todas las orientaciones. Las envolturas químicas se construyeron para todas las muestras en función de los datos de SAXS después de un cálculo ab initio con el programa GASBOR. Svergun, et al. (2001) Biophys J 80, 2946-2953. Una minimización de la hibridación simulada de átomos señuelo distribuidos aleatoriamente convergió en la estructura de la proteína después de ensayar el mejor ajuste para los datos de dispersión I(Q). No se aplicaron restricciones de simetría a ninguna de las reconstrucciones de forma. Para cada uno de los complejos, se calcularon diez modelos ab initio con GASBOR y se promediaron con DAMAVER. Svergun, D. (2003) J Appl Crystallog 36. Los modelos atómicos representados como una configuración compacta interconectada de esferas de diámetro Dmáx se ajustaron a los datos experimentales Iexp(s) para minimizar el error. Los modelos atómicos se acoplaron a envolventes ab initio con el programa SUBCOMB. Kozin, M. B., y Svergun, D. (2000) J Appl Crystallogr 33, 775-777.
Modelo de acoplamiento: El complejo CBD-péptido colagenoso se generó a partir de entradas del banco de datos de proteínas de ColG s3b (1NQD) y péptido colagenoso parcialmente desenrollado 1CAG (mutación Ala en la posición 15a). Se generaron otras moléculas de minicolágeno desenrolladas por modificación de 1CAG usando fragmentos derivados de la estructura [(POG)iü]3 (1K6F). Para obtener el complejo, se usó el algoritmo de acoplamiento BiGGER. Palma, et al. (2000) Proteins 39, 372- 384. Las soluciones se filtraron usando datos de titulación por RMN y se seleccionó el modelo de mayor puntuación que se ajustó a los resultados de RMN y SAXS. Los ajustes manuales se complementaron con el uso de MIFit. McRee. (1999) J Struct Biol 125, 156-165.
Resultados y discusión:
Titulación mediante RMN HSQC de CBD dirigido los sitios poco enrollados del colágeno: Se sintetizó el péptido colagenoso desenrollado [(POG)6POA(POG)3]3 (SEQ ID NO: 36) que tiene Ala en la posición 21a a contar desde el extremo N. Este péptido se modificó adicionalmente para acomodar una etiqueta de espín paramagnético en el extremo N. Las titulaciones de RMN HSQC 1H-15N se realizaron con [PROXYL-(POG)6POA(POG)3]3 (SEQ ID NO: 36) y CBD marcado con 15N en relaciones de 0,02:1 a 1,5:1. Como se ha demostrado anteriormente, un total de once restos de la interfase de unión a colágeno (S928, W956, G971, K995, Y996, L924, T957, Q972, D974, L991 y V993) bien desaparecieron del espectro HSQC o presentaron una perturbación de su desplazamiento químico significativa desde la posición original durante la titulación. Philominathan,et al. (2009) J Biol Chem 284, 10868­ 10876. El grupo PROXYL en el extremo N de los péptidos colagenosos puede causar un engrosamiento de la línea dependiente de la distancia en las señales RMN de CBD durante la titulación. Además de los once restos, tres restos más, V973, G975 y S979 mostraron un engrosamiento de la línea apreciable, y estos restos desaparecieron en su caso del espectro HSQC 1H-15N de CBD (Fig. 5A y 5B). Cuando el complejo [PROXYL-(POG)6POA(POG)3]3(SEQ ID NO: 36):CBd se redujo con ácido ascórbico, estos tres restos reaparecieron en el espectro HSQC 1H-15N. La desaparición de estos tres restos fue coherente con la titulación de [PROXYL-G(POG)7]3 (SEQ ID NO: 42) (el extremo C está en la posición 22 desde el extremo N del PROXYL) según una publicación anterior de los inventores. La comparación de los dos resultados de la titulación demuestra que el CDB se dirige al sitio sustituido Gly^Ala. Si CBD solo se hubiera unido al extremo C del [PROXYL-(POG)6PoA(POG)3]3 (SEQ ID NO: 36) (el extremo C está en la posición 30 desde el extremo N del PROXYL), los inventores esperarían observar la desaparición solo del resto (v 973), como máximo, como en la titulación publicada del [p Ro XYL-G(POG)7(PRG)]3(SeQ ID NO: 43). La desaparición de los restos (V973, G975 y S979) situados en un lados distal del sitio de unión a Ca2+ (Fig. 5C) confirmó que el CDB se une unidireccionalmente al colágeno desenrollado análogamente. La superficie de unión al colágeno en el CBD es una hendidura de 10 A de anchura y 25 A de longitud. La anchura de la hendidura de unión del CBD se corresponde con el diámetro de la triple hélice y su longitud podría dar cabida al [(POG)3]3 (SEQ ID NO: 44) . Los resultados de la RMN implican que el CBD se une a la región poco enrollada [(Po G)2PoA]3 (SEQ ID NO: 45) del colágeno.
Puesto que la mejora en la relajación paramagnética es un fenómeno dependiente de la distancia, la sustitución Gly^Ala realizada muy cerca del grupo PROXYL del extremo N debería dar como resultado la desaparición de más restos en el CBD. Los péptidos colagenosos que contienen PROXYL, [PROXYL-(POG)sPOA(POG)4]3 (SEQ ID NO: 37) (Ala en la posición 18a desde el extremo N del PROXYL), [PROXYL-(POG)4POA(POG)s]3 (SEQ ID NO: 38) (Ala en la posición 15a desde el extremo N del PROXYL), y [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3 (SEQ ID NO: 39) (Ala en la posición 12a desde el extremo N del PROXYL) se sintetizaron. Análogamente a las titulaciones posteriores, los efectos de engrosamiento de línea de los restos del CBD se analizaron a partir de los cambios en el espectro HSQC 1H-15N. Cuanto menor sea la distancia entre el sitio de sustitución Gly^Ala y el PROXYL del extremo N, más restos del CBD desaparecen (Fig. 6 y Tabla 2). La magnitud de la caída de intensidad para cuatro resonancias de la amida (Q972, G975, S979 y L924) de cuatro moléculas de minicolágeno diferentes) también era función de la distancia (Fig. 7). Los resultados de la RMN son coherentes con la unión del CBD a la región [(POG)2POA]3 (SEQ ID NO: 45) de cada uno de los cuatro minicolágenos poco enrollados. Las constantes de unión obtenidas para todas las titulaciones mediante RMN fueron <100 pM lo que indica una afinidad de unión moderada entre el CBD y el minicolágeno poco enrollado.
Tabla 2: Restos que desaparecen debido a la presencia de PROXYL bien en el extremo N, en el extremo C o en el nr l n i i l n
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continuación
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La conformación helicoidal tanto de [(POG)2POA]3 (SEQ ID NO: 45)y el extremo C [(POG)3]3 (SEQ ID NO: 44) está poco enrollada de forma análoga. El grado de rotación alrededor del eje de simetría del husillo que describe el enrollamiento en forma de triple hélice interna se define por un valor de enrollamiento helicoidal k. El valor de k oscila alrededor de un valor medio de -103° para [(POG)io]3 (SEQ ID NO: 35). Bella (2010) J Struct Biol 170, 377-391. El extremo C de un minicolágeno está poco enrollado (desplazamiento del valor k de -103° a -110°) pro habitualmente el extremo N está demasiado enrollado. Los péptidos del colágeno con sustitución Gly^Ala en el centro de la secuencia peptídica siguen formando triples hélices, pero con un brusco enrollamiento bajo (desplazamiento del valor k de -103° a -115°) en el sitio de sustitución seguido por un enrollamiento superior a la norma. Como la región [(POG)2POA]3. (SEQ ID NO: 45) está algo menos enrollada que el extremo C [(POG)3]3 (SEQ ID NO: 44), la primera podría ser una diana más preferente para CBD que la otra. Sin embargo, CBD se podría seguir uniendo al extremo C.
CBD también se dirige al extremo C del minicolágeno poco enrollado: Para demostrar que el extremo CBD se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) también, se sintetizó un péptido colagenoso [(POG)4POA(POG)5-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 38). [(POG)4POA(POG)5C-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 41) se tituló con CBD marcado con 15N en relaciones de 0,02:1 a 1,5:1 en incrementos de 0,02, y se realizó seguimiento de los cambios en el espectro HSQC del CBD. Cuando el minicolágeno está unido a la hendidura, un total de once restos de la interfase de unión a colágeno mostraron bien un engrosamiento de la línea o bien una perturbación en el desplazamiento químico, como se ha descrito anteriormente. Philominathan,et al. (2009) J Biol Chem 284, 10868-10876. Cuatro restos adicionales S906, R929, S997 y G998 desaparecieron del espectro HSQC debido al PROXYL (Figs. 6 A, B y D). Estos picos reaparecidos tras adición de ácido ascórbico. Este fenómeno es idéntico al de la titulación anterior de los inventores del [GPRG(POG)7C-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 46) cuando el extremo CBD es el extremo C. Si el CBD se fuera a unir solamente al sitio de Ala parcialmente enrollado, los inventores habrían observado la desaparición de menos restos. Así, además del direccionamiento a la región (POG)2 POA (SEQ ID NO: 45) del péptido colagenoso, CBD también se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44). Como se describe, la conformación helicoidal tanto de la región (POG)2 POA (SEQ iD NO: 45) como del extremo (POG)3 (SEQ ID NO: 44) están análogamente poco enrollados en comparación con la norma. Bella. (2010) J Struct Biol 170, 377-391. La explicación actual de los autores sobre el motivo de que CBD se dirija a las regiones poco enrolladas es que las posiciones parcialmente desenrolladas de los grupos carbonilo de la cadena principal favorecen las interacciones de enlaces de hidrógeno con el grupo hidroxilo de Tyr994. La mutación Tyr994 en Phe dio como resultado la reducción de 12 veces en la unión al minicolágeno, y la mutación en ala pierde capacidad de unión Ala. Wilson, et al. (2003) EMBO J 22, 1743-1752.
Para demostrar la capacidad del CBD para unirse tanto a la región (POG)2 POA (SEQ ID NO: 45) como a la región del extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44), se sintetizó un péptido colagenoso [11p Ro XYL-(POG)3PCG(POG)4]3 (SEQ ID NO: 40) modificado para insertar un grupo PROXYL en el centro (posición 11). El grupo PROXYL está unido covalentemente a un resto cisteína. Debido a la presencia del grupo PROXYL voluminoso, se espera que este péptido esté parcialmente desenrollado. El grado preciso de bajo enrollamiento no es conocido para el péptido, pero un minicolágeno con repeticiones GPX muestra un bajo enrollamiento (k = -105°). Bella. (2010) J Struct Biol 170, 377-391. El voluminoso grupo PROXYL inducirá probablemente un desenrollado mayor de k = -105°. Además de las resonancias de los once aminoácidos bien con línea engrosada o desplazada, las titulaciones de RMN HSQC 1H-15N revelaron dos fenómenos diferentes. A la relación menor (0,2:1) las resonancias de la amida correspondientes a S906, R929, S997, y G998 desaparecieron del espectro Hs QC del CBD (Figs. 8E, F y H). Después, a relación mayor (0,3:1), resonancias de la amida adicionales correspondientes a V973, G975 y S979 desaparecieron del espectro HSQC del CBD (Figs. 8E, F y H). Para ocasionar la desaparición de cuatros restos (S906, R929, S997 y G998), CBD se debe unir inicialmente al extremo N (POG)3 (SEQ ID NO: 44). La desaparición de las resonancias V973, G975 y S979 se puede explicar si el CBD se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID nO: 44) del minicolágeno. Sin embargo, el fenómeno inicial significa que el CBD se une preferentemente a la sección central poco enrollada del extremo C.
Para demostrar que el PROXYL produce engrasamiento de la línea, y que los restos Ala o Cys no lo hacen, tres péptidos de control más, [(POG)4POA(POG)5]3 (SEQ ID NO: 38), [(POG)4POA(POG)5C-carbamidometil]3 (SEQ ID nO: 41), y [(POG)3 PCG(POG)4]3 (SEQ ID No : 40) que carecen de los grupos PROXYL se sintetizaron, y se repitieron las titulaciones mediante RMN (Figs. 6F, 8C y 8G, respectivamente). Los resultados de la titulación fueron casi idénticos a los de [(POG)1ü]3 (SEQ ID NO: 35). Solamente las once resonancias de la amida experimentaron bien engrosamiento de la línea o desplazamiento incluso a una relación 1:1 (minicolágeno:CBD). Estos péptidos de control se unieron a la misma hendidura, y PROXYL hizo que los demás restos mostraran engrosamiento de la línea.
Para ilustrar si el CBD se une solamente al sitio parcialmente enrollado en el centro del péptido de colágeno, y/o el extremo C del minicolágeno, se realizaron experimentos de dispersión de luz dinámica (DLS). Los experimentos DLS proporcionaron las estequiometrías de los complejos colágeno:CBD. El radio hidrodinámico de [(POG)4POA(POG)5-PROXYL]3(SEQ ID NO: 38):CBD y [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3(SEQ ID NO: 40):CBD fue de 3 nm y el peso molecular aparente del complejo fue de 42±1 kDa, que es similar a lo observado para el complejo [(POG)1ü]3(SEQ ID NO: 35):CBd (Tabla 3). Otros complejos también presentaron valores similares. Hasta ahora, todos los minicolágenos y el CBD siempre formaron complejos 1:1. CBD se une a uno cualquiera de los sitios disponibles del minicolágeno pero no ocupa ambos sitios para formar un complejo 1:2.
Tabla 3: Radio hidrodinámico (RH), peso molecular aparente (Mw), radio de giro (Rg) y diámetro máximo de partícula (Dmáx) calculados según dispersión de luz dinámica (DLS) y dispersión de rayos X de ángulo pequeño SAXS ara diferentes com leos CBD: é tidos cola enosos.
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Experimentos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS): Las formas tridimensionales de los complejos CBD-péptido colagenoso se construyeron con mediciones SAXS. La ventaja principal de las mediciones SAXS es que los experimentos se llevan a cabo en solución en condiciones casi fisiológicas. En el trabajo anterior de los inventores, estas envolturas tridimensionales se utilizaron para demostrar la unión asimétrica del CBD al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) del minicolágeno. Las formas moleculares se construyeron para los complejos de CBD y seis moléculas de minicolágeno no enrolladas diferentes. En todos los casos, el CBD se une a la región (POG)2POA (SEQ ID NO: 45) preferentemente al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) (Figs. 9A-F). Por ejemplo, el modelo de acoplamiento para el CBD:[(POG)4POA(POG)5]3 (SEQ ID NO: 38) construido usando la estructura cristalina del CBD (n.° de registro pdb 1n Qd ) interactúa con la región (POG)2Po A (SEQ ID NO: 45) del colágeno no enrollado (n.° de registro pdb iCAG) se ajusta bien a la envoltura (Fig 9B). Aunque los resultados de RMN demostraron que el CBD también se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) de [(POG)4POA(POG)5-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 38), CBD se une predominantemente a la región (POG)2 POA (SeQ ID No : 45) del péptido (Figs. 9E y 9F).
Las estructuras derivadas de los perfiles SAXS usando cálculos de hibridación simulada para [11PROXYL-(POG)3 PCG(POG)4]3 (SEQ ID NO: 4o) (Figs. 9G y 9H) indicaron una densidad adicional que podría atribuirse al grupo PROXYL. La forma tridimensional derivada de SAXS del complejo [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3(SEQ ID NO: 40):CBD se superpone bien con cualquiera de los complejos derivados por RMN es decir, la unión del CBD al extremo N (POG)3 (SEQ ID NO: 44) o al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) (Figs. 9G y 9H).
Poco cambio estructural del 15N-minicolágeno tras la unión al CBD: Los estudios hasta el momento sugieren que el CDB analiza las fibrillas de colágeno para detectar las regiones poco enrolladas. Tras la unión a las regiones menos estructuradas, ¿desenrolla el colágeno de forma activa? Activar el desenrollado mediante el CBD facilitaría la colagenolisis. Para la investigación, se sintetizaron dos péptidos colagenosos marcados selectivamente con 15N cerca del extremo N o C de [(POG)io ]3 (SEQ ID NO: 35) (Tabla 4, péptidos A,B), y se realizó seguimiento de los cambios estructurales debido a la unión del CBD no marcado mediante titulación con HSQC 1H-15N.
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Los péptidos marcados con 15N-Gly mostraron dos picos de cruce diferentes en el espectro HSQC 1H-15N (Figs. 10A y 10B). Estos picos de cruce corresponden a las conformaciones de monómero desenrollado y triple hélice asignadas en estudios anteriores con RMN. Liu, et al.(1996) Biochemistry 35, 4306- 4313 y Li, et al. (1993) Biochemistry 32, 7377-7387. El resto Gly más cercano a los tripletes del extremo presenta picos tanto de monómero como de trímero en el espectro HSQC, mientras que el resto Gly en el centro de la triple hélice muestra un pico de cruce del trímero más intenso. Si el CBD va a flexar o producir cualquier desenrollado de la triple hélice tras la unión, los inventores esperan que el pico de cruce correspondiente a la triple hélice experimente engrosamiento de línea y desaparezca durante la titulación, y que el pico de cruce correspondiente al monocatenario se intensifique. Sin embargo, durante la titulación, CBD no instigó ningún cambio en los espectros HSQC 1H-15N de los péptidos colagenosos. Por tanto, el CBD unido al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 35) impuso pocos cambios estructurales en la triple hélice.
Una molécula de minicolágeno no enrollada marcada selectivamente con 15N-Gly cerca de los extremos N o C (Tabla 4C y D) se tituló con CBD no marcado CBD. Los picos de cruce correspondiente al monómero y a la triple hélice se identificaron en los espectros HSQC (Figs 10C y 10D). La titulación del CBD no marcado indujo pocos cambios en la intensidad del pico de cruce del monómero o del trímero. Incluso después de la unión al minicolágeno parcialmente desenrollado, CBD no inicia ningún desenrollado adicional.
El CBD se une unidireccionalmente al sitio poco enrollado de la triple hélice del colágeno. El CBD puede ayudar a disolver las fibrillas de colágeno, pero no desenrolla la triple hélice. El direccionamiento a regiones poco enrolladas del tropocolágeno podría evitar la barrera de energía necesaria para desenrollar las triples hélices. Cuando el CBD se utiliza como molécula de administración de fármaco, la molécula inyectada se distribuye rápidamente a las placas finales de los discos vertebrales, cerca de las placas de crecimiento de la tibia y la fíbula, y también a la piel. Podría descargar su carga hacia el colágeno en sangre más accesible que está experimentando remodelación, por tanto rico en regiones poco enrolladas.
Ejemplo 2: Comparación estructural entre los dominios de unión a colágeno ColH y ColG
El dominio de unión a colágeno (CBD) del extremo C de la colagenasa es necesario para la unión a las fibrillas de colágeno insolubles y para la posterior colagenolisis. En las estructuras cristalinas de alta resolución de ColG-CBD (s3b) y ColH-CBD (s3) se parecen mucho entre sí (r.m.s.d. Ca = 1,5 A), a pesar de compartir solamente el 30 % de identidad de secuencia. Cinco de los seis restos quelantes del Ca2+ se conservan. Los sitios de unión dobles a Ca2+ de s3 se completan con un aspartato equivalente funcionalmente. Los tres restos más críticos para la interacción con el colágeno en s3b están conservados en s3. La forma general del bolsillo de unión se retiene mediante estructuras de bucle alteradas y posiciones en la cadena lateral. Los datos de dispersión de rayos x de ángulo pequeño revelaron que s3 también se une asimétricamente al minicolágeno. Además de los sitios de unión al calcio y del bolsillo de unión al colágeno, los restos hidrófobos arquitectónicamente importantes y la red de enlaces de hidrógeno alrededor del péptido unión en cis están bien conservadas en la subfamilia de la metalopeptidasa M9B.
Los rasgos estructurales comunes descritos anteriormente y en Bauer et al. (2012) J Bacteriol November, permitieron a los inventores actualizar el alineamiento de secuencias del CBD en la subfamilia M9B (Fig. 1). Los restos conservados son importantes para uno de los cuatro motivos: quelación del calcio (rojo), isomerización cistrans del enlazador (amarillo), unión a colágeno (azul) o plegado de la proteína (verde). La Fig. 1 también indica las hebras de la estructura a lo largo de la parte superior de la figura.
El sitio doble de unión a calcio se forma mediante cuatro restos quelantes (Glu899, Glu901, Asn903, y Asp904) dentro del extremo N del enlazador, dos restos quelantes (Asp927 y Asp930) de C de la hebra p y los enlaces de hidrógeno invariantes Tyr1002 y que orientan Asp930. Los números de resto usados en este párrafo son del s3b. Análogamente, otras estructuras de soporte como Gly921 están conservadas en el centro de la hebra p estratégicamente situadas para dejar sitio a Glu899. El sitio doble de quelación del calcio está formado a veces por restos funcionalmente equivalentes. Como se menciona anteriormente, Asp897 de s3 actúa equivalente a Asp927 de s3b. Se realizó un intento de identificar Asp897 equivalentes en s3a y s3b de B. brevis, A3 s3a de C. botulinum y ColG s3a de C. histolyticum. Los restos Asp y Glu tridentados y divalentes están conservados, con la única excepción de s3a de C. sordellii. El resto Asp904 monodentado está sustituido a veces por Asn. Para las moléculas sustituidas, la carga neta del sitio del calcio doble es neutra, en lugar de -1.
El péptido entre los restos 901-902 tiene conformación cis en el estado holo para s3b y s3. La posición 902 de otras moléculas CBD es Pro, Asp o Asn. Pro tiene frecuentemente éxito en la unión del péptido para facilitar la isomerización trans-cis. La molécula s3 tiene Pro. En s3b, OD de Asn902 tiende un enlace de hidrógeno al N de la cadena principal de Asp904. El enlace de hidrógeno es fundamental para la isomerización del péptido. Spiriti y van der Vaart. (2010) Biochemistry 49:5314-5320. Para el resto de las moléculas de CBD que tienen Asp en la posición, OD de Asp podría tener el mismo papel que Asn902. Otros enlaces de hidrógeno identificados mediante estudios de simulación importantes para estabilizar los estados de transición están bien conservados. Estos pares de donanteaceptor en s3 y s3b están tabulados (Tabla 5). Los iones de calcio podrían catalizar la isomerización de todas las moléculas de CBD y sus estados de transición y su mecanismo catalítico pueden parecer muy similares.
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Los restos no funcionales que son importantes para el plegado o para la estabilidad arquitectónica están conservados. Los restos hidrófobos empaquetados entre las p-láminas se conservan mejor si están situados cerca de restos funcionalmente críticos. Por ejemplo, el Trp956 invariante de la hebra E está empaquetado entre plaminas. Los restos flanqueantes (Thr955 y Thr957) interactúan con el minicolágeno. Tyr932 está empaquetado entre las láminas y ayuda a colocar Tyr1002. Los restos de curvas cerradas también se han conservado. Gly975 está bien conservado para permitir un giro IF en s3b. Gly942 (equivalente de Gly975) en s3 permite que la cadena secundaria de Asp941 estabilice el giro inverso. Un tramo de seis restos bien conservado, entre los restos 986 y 991, adopta una curva cerrada y antecede la hebra H funcionalmente importante. La región está bien ordenada en las estructuras cristalinas con pocos factores B, y es la menos dinámica según los estudios de RMN y proteólisis limitada con MALDI-TOF MS (25). Philominathan, et al. (2009) J Biol Chem 284:10868-10876 y Sides et al. J Am Soc Mass Spectrom. (2012) 23(3):505-19. Los grupos carbonilo y amino de la cadena principal de Arg985 tienden un enlace de hidrógeno a OH de Tyr989 para estabilizar el giro. Solo Gly987 puede hacer sitio a la voluminosa cadena secundaria de Tyr989. Tyr990 se empaqueta contra el Ala909 invariante y la hélice 310 conservada. Ala909 está en la base del enlazador que experimenta la transformación a-hélice^ p-hebra. La curva cerrada puede garantizar que los restos interactuantes del colágeno Leu992, Tyr994, y Tyr996 estén correctamente colocados. Tyr994 es el resto más importante para la interacción con los péptidos colagenosos. Wilson, et al. (2003) EMBO J 22:1743-1752. Las hebras adyacentes a la hebra H, es decir, las hebras C y E, están muy bien conservadas. Las tres hebras antiparalelas moldean el bolsillo de unión a colágeno. Las hebras F apilan las p-láminas por interacción con ambas láminas. El p-hebra interactúa en primer lugar en orientación antiparalela con la hebra E, después rompe su dirección en Gly971 para interactuar con la hebra G. En lugar de Gly971, Ala o Pro se encuentra en la situación donde la hebra cambia su sentido. La doble interacción de la hebra ayuda a colocar Tyr970 para que interactúe con el minicolágeno.
Se ha mostrado que tres restos que interactúan fuertemente con el minicolágeno están conservados. El Tyr994 invariante y los restos Tyr970 y Tyr996 bien conservados constituyen el "punto caliente". La mutación Y994A pierde capacidad de unión. Como Y994F da como resultado una reducción de 12 veces en la unión al minicolágeno, el grupo hidroxilo de Tyr994 puede interactuar con el colágeno mediante un enlace de hidrógeno. Tyr996, que es un resto crítico para la unión al minicolágeno, no está tan bien conservado. Y996A produjo una reducción de 40 veces en la unión al minicolágeno. Y996 en s3b está sustituido por Phe en s3, mediante lo cual ambas cadenas tienen idéntica orientación. En otras moléculas de CBD, un resto aromático, tal como Phe o His, se encuentra a veces en el sitio. Y970A da como resultado una reducción de 12 veces en la unión al minicolágeno. Mediante titulación RMN HSQC 15N, se ha descubierto que Thr957 interactúa con el minicolágeno. Los restos de aminoácidos p-ramificados o Leu se encuentran en las posiciones equivalentes a Thr957 en la mayoría de los CBD. En la titulación con RMN HSQC 15N se identificó que seis restos más que interactuaban con el minicolágeno no están bien conservados. Puesto que CBS divergentes (s3 y s3b) adoptan un bolsillo de unión en forma de paleta similar, otros CBD podrían adoptar también una estrategia de unión al colágeno similar.
Los CBD divergentes podrían dirigirse a diferentes secuencias de colágeno, y posiblemente se podrían dirigir a diferentes tipos de colágeno; sin embargo, este estudio estructural sugiere otra cosa. Más bien, todos los dominios CBD se unen de forma similar a una región poco enrollada tal como el extremo C de una fibrilla de colágeno. El extremo C del colágeno tipo I queda expuesto en la superficie de la fibrilla, según los experimentos de difracción de rayos x en fibras, y este es el sitio más accesible para que la colagenasa bacteriana inicie los asaltos. Sin embargo, no se ha descubierto aún un CBD unido al extremo C del tropocolágeno. Un tándem ColG-CBD (s3a-s3b) marcado con partículas de oro donde las partículas de oro están unidas a fibrillas de colágeno de tipo I no mostró periodicidad. En las fibrillas de colágeno, las moléculas están escalonadas entre sí por aproximadamente 67 nm. Por tanto, un CBD podría dirigirse a las regiones parcialmente poco enrolladas en el centro de un tropocolágeno que también sería vulnerable a asaltos.
Muy similar a s3b, s3 es al mismo tiempo compacto y extremadamente estable en presencia de Ca2+ fisiológico. Por lo tanto, la enzima podría degradar la matriz extracelular durante un tiempo prolongado. El enlazador que induce una transformación estructural es un rasgo común de la colagenasa M9B. Puede actuar como un sensor de Ca2+ para disparar reordenamientos del dominio como medio de activación enzimática. La concentración de Ca2+ en la matriz extracelular es superior a la del interior de una bacteria. Tanto s3 como s3b se unen de forma similar a un minicolágeno, así, las moléculas de colagenasa M9B podrían iniciar la colagenolisis a partir de rasgos estructurales análogos en diferentes fibrillas de colágeno. La proteína de fusión de cualquier CBD derivado de la colagenasa M9B y un factor de crecimiento daría como resultado un resultado clínico comparable.
Ejemplo 3: Un agonista de CBD-PTH fomenta el crecimiento del cabello y un agonista de CBD-PTH inhibe el crecimiento del cabello
Caracterización in vitro de compuestos PTH unido a CBD: La unión a colágeno de cada péptido se comprobó en ensayos de unión a colágeno de flujo pistón como se ha descrito anteriormente en la Publicación de Patente de Estados Unidos n.° 2010/0129341. PTH-CBD, que consiste en los 33 primeros aminoácidos de PTH unido directamente al dominio de unión a colágeno (SEQ ID NO: 1) fue el agonista más potente, que tiene un efecto similar al de PTH(1-34) (SEQ ID NO: 7) sobre la acumulación de a Mpc. Ponnapakkam et al. (2011) Calcif 88:511-520. Epub 2011 Abr 2022. Entre los antagonistas, PTH(7-33)-CBD (SEQ ID NO: 10) mostró la mejor combinación de baja actividad intrínseca y elevado bloqueo del receptor (no se muestra), similar a lo observado para otros antagonistas de PTH, incluidos los utilizados en los estudios de crecimiento del cabello. Peters, et al. (2001) J Invest Dermatol 117:173-178.
Distribución de PTH-CBD in vivo: La distribución en los tejidos se evaluó administrando PTH-CBD marcado con 35S mediante inyección subcutánea, seguido por autorradiografía de preparación completa congelada y del cuerpo completo. PTH-CBD con un sitio de fosforilación entre PTH(1-33) y el CBD se purificó, activó y marcó con [gamma-35] ATP, como se ha descrito anteriormente. Tamai et al. (2003) Infect Immun. 71:5371-5375. Aproximadamente 10,8 mcg de 35S-PTH-CBD (122 kcm/mcg) se inyectaron por vía subcutánea a ratones de 7 semanas de edad (32-35g). Los ratones se sacrificaron 1 hora o 12 horas después de la inyección, y a continuación se congelaron en hielo seco-acetona. Se prepararon secciones congeladas (50 pm) con un autocriotomo, se secaron a -20°C, y se expusieron a una placa de imagen durante 4 semanas. Parece que la distribución inicial de 35S-PTH-CBD se realiza en una amplia zona de la piel alrededor del sitio de inyección, seguido por una rápida redistribución en la piel de todo el animal, así como a otros tejidos diferentes (es decir hueso, intestino, vejiga) (Fig. 11). Por tanto, PTH-CBD muestra las propiedades deseadas de distribución y retención en la piel con administración subcutánea.
PTH-CBD invierte la pérdida de pelo en alopecia inducida por quimioterapia en ratones: Los inventores compararon la eficacia de agonistas y antagonistas unidos a PTH en alopecia inducida por quimioterapia, utilizando un diseño experimental publicado por Peters, et al., para compuestos PTH no unidos a CBD. Peters, et al. (2001) J Invest Dermatol 117:173-178. Ratones C57BL/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) se depilaron para sincronizar los folículos pilosos, y se administró ciclofosfamida (CYP, 150 mg/kg) el día 9 para maximizar el daño inducido por quimioterapia. El agonista (PTH-CBD) y el antagonista (PTH(7-33)-CBD) se administraron 2 días antes de la quimioterapia, y dada la retención a largo plazo de los compuestos sobre la piel, los inventores administraron solo una única dosis para cubrir el calendario de múltiples inyecciones del agonista y el antagonista de PTH en el estudio de Peters, et. al. La dosis administrada de compuestos unidos a CBD (320 mcg/kg) se toleró bien en ratones. Ponnapakkam et al. (2011) Calcif 88:511-520. Epub 2011 Abr 2022.
Los resultados del registro fotodocumental indicaron que el agonista, PTH-CBD, era bastante más eficaz para estimular el crecimiento del pelo de lo que era el antagonista (Fig. 12). El examen histológico reveló cambios morfológicos en los folículos pilosos después de la terapia con CYP, que estaban localizados más superficialmente y mostraban melanocitos agrupados alrededor del bulbo, característicos de la fase distrófica anágena y de la fase catágena (Fig. 13). Aunque el antagonista PTH(7-33)-CBD no tuvo efecto beneficioso, el tratamiento con el agonista PTH-CBD condujo a un enraizamiento más profundo y menor agregación de monocitos, invirtiendo de esta forma los cambios distróficos. Los recuentos de folículos pilosos en fase anágena VI mediante campo muy intenso (HPF) se compararon entre los grupos; los animales tratados con PTH-CBD tuvieron mayor número de folículos pilosos, acercándose a los de los animales que no recibieron quimioterapia (Fig. 14), mientras que el antagonista PTH(7-33)-CBD no tuvo efecto beneficioso.
Es importante destacar que, los inventores no observaron evidencias de efectos adversos derivados de la administración de PTH-CBD. Aunque se sabe que las inyecciones de PTH elevan el calcio sanguíneo y pueden producir cálculos renales, PTH-CBD no tuvo efectos sobre el calcio sérico. Además, no hubo evidencia de una longitud excesiva del pelo en el cuerpo o un exceso de crecimiento de pelo en las orejas y la cola, donde normalmente no está presente una cobertura completa. Los efectos del PTH-CBD sobre el crecimiento del pelo se confirmaron en modelos de alopecia inducida por quimioterapia sin depilación, que son mucho más parecidos a los protocolos clínicos.
Cuantificación de los efectos de PTH-CBD en la alopecia inducida por quimioterapia: Los inventores continuaron estos estudios comparando los efectos de diferentes dosis de PTH-CBD sobre la alopecia inducida por quimioterapia. En estos estudios, los inventores aplicaron inyecciones más distalmente en la espalda y aplicaron un análisis por escala de grises para cuantificar la cantidad de crecimiento del pelo. La inyección más distal en la espalda permitió a los inventores comparar el recrecimiento del pelo después de un tratamiento con PTH-CBD con menos interferencia derivada del recrecimiento de pelo normal que, en los ratones, suele suceder desde la cabeza hasta la cola. Los resultados se muestran en la Fig. 15, lo que indica un efecto dependiente de la dosis sobre el recrecimiento del pelo tanto cualitativamente como cuantitativamente.
Alopecia inducida por quimioterapia sin depilación: Aunque el modelo depilado de la alopecia inducida por quimioterapia ofrece un modelo uniforme para la comparación de los efectos del fármaco, se sabe que el proceso de depilación produce daños en el folículo, y puede alterar la respuesta de los animales a la administración de PTH-CBD. Por tanto, los inventores sometieron a ensayo los efectos de PTH-CBD en otro modelo de la alopecia inducida por quimioterapia, donde los animales recibieron 3 ciclos de tratamiento con una terapia con ciclofosfamida (50 mg/kg/semana), similar a la forma habitual en la que se tratarían los pacientes con cáncer. En este modelo, la alopecia tarda mucho más tiempo (4-6 meses) en desarrollarse. Los animales que recibieron una sola dosis de PTH-CBD (320 mcg/kg por vía subcutánea) antes del primer ciclo no desarrollaron pérdida de pelo, como se muestra en la Figura 16.
En un segundo estudio, los inventores compararon los efectos de PTH-CBD cuando se administra con fines profilácticos, en el momento del primer ciclo de quimioterapia, vs. con fines terapéuticos, una vez que aparece la pérdida de pelo. Aunque PTH-CBD fue eficaz en ambos casos, los efectos fueron más evidentes cuando se administró con fines profilácticos. Esto es evidente, tanto de forma visual como cuantitativamente en la Fig. 17, usando el mismo análisis con escala de grises que los inventores utilizaron en el estudio de respuesta a la dosis.
Alopecia por depilación: El agonista PTH-CBD parece aumentar el crecimiento del cabello al aumentar el número de folículos pilosos en fase anágena. Por tanto, no hay motivos para creer que los efectos sobre el crecimiento del cabello solo deberían limitarse al modelo de quimioterapia. Por tanto, los inventores sometieron a ensayo tanto PTH-CBD como el compuesto antagonista, PTH(7-33)-CBD, después de retirar el pelo de ratones C57/BL6J por tratamiento con cera (Fig. 18). Los resultados fueron bastante interesantes; los animales tratados con agonista (PTH-CBD) tuvieron una erupción anágena anterior (día 7 vs. día 9 para los controles del vehículo) y mostraron un recrecimiento del pelo más completo hacia el final del estudio (día 18). Los animales tratados con el antagonista (PTH(7-33)-CBD) también tuvieron una erupción anágena temprana, pero el crecimiento del cabello que siguió estuvo notablemente recortada, y el ciclo piloso se detuvo después de ese punto, no observándose crecimiento de pelo adicional. Por lo tanto, parece que la terapia con el agonista actúa estimulando un recrecimiento más rápido del pelo estimulando una transición más rápida a la fase anágena, mientras que el antagonista inhibió el recrecimiento del pelo bloqueando esta transición.
PTH-CBD es una proteína de fusión de los primeros 33 aminoácidos de la hormona paratiroidea (PTH), y un dominio de unión a colágeno de origen bacteriano. La actividad de unión a colágeno hace que PTH-CBD quede retenido en su sitio de acción en el colágeno dérmico, maximizando la eficacia y dando como resultado efectos secundarios sistémicos. PTH-CBD estimula el crecimiento del cabello haciendo que los folículos pilosos entren en una fase anágena VI o fase de crecimiento, supuestamente, activando la señalización WNT y aumentando la producción de beta-catenina. Por tanto, los inventores planificaron los siguientes estudios adicionales para confirmar este

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agente terapéutico, para su uso en el tratamiento de una colagenopatía en un sujeto que necesite tratamiento con el agente terapéutico, en donde el agente terapéutico no es un antagonista del receptor PTH/PTHrP, en donde el segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano administra el agente a sitios que comprenden colágeno parcialmente desenrollados o poco enrollados, y en donde la colagenopatía se caracteriza por sitios de colágeno parcialmente desenrollados o poco enrollados.
2. La composición para el uso según la reivindicación 1, en donde el agente terapéutico es un agente capaz de promover el crecimiento del hueso, disminuir la inflamación o promover la estabilidad del colágeno
3. La composición para el uso según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que comprende BMP-2, BMP-3, FGF-2, FGF-4, anticuerpo contra esclerostina, hormona de crecimiento, IGF-1, VEGF, TGF-b, KGF, FGF-10, TGF-a, TGF-b1, receptor de TGF-b, GM-CSF, EGF, PDGF y factores de crecimiento del tejido conectivo.
4. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano y el agente terapéutico están químicamente reticulados entre sí o son porciones polipeptídicas de una proteína de fusión.
5. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el agente terapéutico es un agonista del receptor PTH/PTHrP.
6. La composición para el uso según la reivindicación 5, en donde el agonista del receptor PTH/PTHrP comprende los restos 1-33 de la SEQ ID NO:1, PTH (SEQ ID NO:7), los restos 1-14 de la SEQ ID NO:1, los restos 1-34 de la SEQ ID NO:7 o un fragmento de al menos 8 aminoácidos consecutivos de los restos 1-34 de la SEQ ID NO: 7.
7. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la colagenopatía se selecciona del grupo que consiste en osteogénesis imperfecta, síndrome de Stickler, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Alport, enfermedad de Caffey, y daños localizados en el colágeno o en el cartílago.
8. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano comprende un polipéptido de unión a colágeno derivado de una peptidasa M9 seleccionada del grupo que consiste en Clostridium, Bacillus y Vibrio, una de las SEQ ID NO: 13-34 o un fragmento de las mismas, los residuos 34-158 de la SEQ ID NO: 1, un fragmento de al menos 8 aminoácidos consecutivos de los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1, o un péptido que es al menos un 90 % idéntico a los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1 o de las SEQ ID NO: 13-34.
9. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el agente terapéutico o el agonista del receptor de PTH/PTHrP es un polipéptido y el extremo N del segmento polipeptídico de unión a colágeno está unido directamente o mediante un segmento polipeptídico enlazador al extremo C del polipéptido de agente terapéutico o del agonista del receptor de PTH/PTHrP.
10. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el segmento polipeptídico de unión a colágeno y el agente terapéutico están químicamente reticulados entre sí o son porciones polipeptídicas de una proteína de fusión.
11. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la composición está formulada para su administración por vía intramuscular, intradérmica, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, tópica, oral, parenteral o intranasal.
12. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el sujeto es un ser humano.
13. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la composición está formulada para administración en una solución acuosa a un pH inferior a aproximadamente 5,0.
14. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la composición está formulada para administración en una solución acuosa a un pH superior a aproximadamente 6,0.
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