ES2847151T3

ES2847151T3 - Composiciones y métodos que usan cápsidas resistentes a las hidrolasas

Info

Publication number: ES2847151T3
Application number: ES17170226T
Authority: ES
Inventors: Juan Pedro Humberto Arhancet; Juan P Arhancet; Kimberly Delaney; Kathleen B Hall; Neena Summers; Edward Oates
Original assignee: Apse Inc
Current assignee: Apse Inc
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2021-08-02
Anticipated expiration: 2034-06-05
Also published as: US20180030445A1; DK3222274T3; BR112015029559A2; EP3222274A1; SG11201510181YA; US20160177299A1; AU2014281061A1; EP3010494B1; CA2912131A1; MX2019005298A; MX394708B; WO2014204667A1; MX2015017593A; CA2912131C; EP3010494A1; US9822361B2; JP6636418B2; EP3789017A1; MX364809B; EP3010494A4

Abstract

Partícula similar a un virus (VLP) que comprende: - una cápsida, que muestra resistencia a la hidrólisis catalizada por al menos una hidrolasa que actúa en los enlaces peptídicos cuando la cápsida se pone en contacto con la hidrolasa, - una molécula de carga heteróloga, donde dicha molécula comprende una molécula de ARN bicatenario de más de 100 pares de bases de nucleótidos y una secuencia de empaquetamiento de cápsida, donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende además más de una región complementaria, donde cada una de dichas regiones complementarias comprenden: (a) una única secuencia de ARN corto de cadena sentido o múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas, inmediatamente seguidas de (b) una secuencia de ARN no complementaria capaz de formar un bucle, inmediatamente seguida de (c) una única secuencia de ARN corto de cadena antisentido complementaria a la secuencia de ARN corto de cadena sentido o múltiples secuencias de ARN corto de cadena antisentido complementarias a las múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas donde las regiones complementarias están dispuestas de manera contigua, donde, si la región complementaria comprende múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas, las múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas se enlazan por 1 a 3 nucleótidos no complementarios para formar ARN abultado, y donde si la región complementaria comprende una única secuencia de ARN corto de cadena sentido, la única secuencia de ARN corto de cadena sentido se modifica de modo que 1 a 3 nucleótidos consecutivos no complementarios se añaden cada 19 a 28 nucleótidos para formar ARN abultado.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos que usan cápsidas resistentes a las hidrolasas

Campo técnico

[0001] La divulgación se refiere a partículas similares a virus, y en particular a métodos y composiciones que usan cápsidas virales como nanocontenedores para la producción, el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos heterólogos con características y funciones particulares.

Antecedentes de la invención

[0002] Las partículas similares a virus (VLP) son partículas en parte derivadas de virus a través de la expresión de determinadas proteínas estructurales virales que componen la envoltura viral y/o la cápsida, pero las VLP no contienen el genoma viral y no son infecciosas. Las VLP han sido derivadas, por ejemplo, del virus de la hepatitis B y determinados otros virus, y han sido usadas para estudiar el ensamblaje viral y en el desarrollo de vacunas.

[0003] Las cápsidas virales están compuestas por al menos una proteína, varias copias de la cual se ensamblan para formar la cápsida. En algunos virus, la cápsida viral está cubierta por la envoltura viral. Tales envolturas virales están compuestas de glicoproteínas virales y partes de las membranas celulares del huésped infectado, y protegen las cápsidas virales de moléculas grandes que de otro modo interactuarían con ellas. Se dice típicamente que la cápsida encapsida los ácidos nucleicos que codifican el genoma viral y a veces también proteínas necesarias para la persistencia del virus en el entorno natural. Para que el genoma viral de un virus entre en un nuevo huésped, la cápsida debe ser desmontada. Tal desmontaje ocurre bajo condiciones normalmente usadas por el huésped para degradar sus propios componentes al igual que los exógenos, y muy a menudo implica proteólisis. Los virus se aprovechan de procesos normales del huésped tales como la degradación proteolítica para permitir esa parte crítica de su ciclo, es decir, el desmontaje de la cápsida y la liberación del genoma.

[0004] Por lo tanto, no es sorprendente que la literatura no haya descrito previamente cápsidas resistentes a las hidrolasas que actúan sobre los enlaces peptídicos. Un número muy limitado de determinadas secuencias peptídicas específicas que son parte de proteínas más grandes se conocen por ser en cierto grado resistentes a determinadas proteasas, pero la gran mayoría de las secuencias peptídicas no lo son. Se ha informado de virus que resisten la proteólisis, pero estos son todos virus envueltos, donde la cápsida está protegida por la envoltura viral. En tales virus las cápsidas no están en contacto con las proteasas descritas, es decir, están protegidas de estas. Así, el papel, si lo hay, de la estabilidad proteolítica de la cápsida del virus se desconoce en tales casos.

[0005] En la producción a gran escala de moléculas recombinantes tales como proteínas, la ultrafiltración se usa a menudo para eliminar moléculas más pequeñas que la proteína diana en los pasos de purificación que conducen a su aislamiento. Los métodos de purificación también implican a menudo técnicas de precipitación, extracción de solvente y cristalización. Estas técnicas de separación son intrínsecamente simples y económicas porque, a diferencia de la cromatografía, no se basan en interacciones de las superficies sino en masa. Sin embargo, estas técnicas están limitadas típicamente a aplicaciones en sistemas simples, y por la necesidad de especificar un conjunto diferente de condiciones para cada proteína y sistema de expresión. Aún así, cada proteína recombinante diana presenta un conjunto único de interacciones de unión, haciendo así su proceso de aislamiento único y complejo. La eficiencia de separación para proteínas recombinantes usando estos procesos de aislamiento simples es, por lo tanto, baja.

[0006] Los ácidos nucleicos, incluidos ARNip y miARN, han sido fabricados en su mayoría usando métodos de síntesis química. Estos métodos son generalmente complejos y de alto coste debido al gran número de pasos necesesarios y la complejidad de las reacciones que predisponen a dificultades técnicas, y el coste de los sistemas de fabricación. Además, los reactivos sintéticos implicados son costosos y, por lo tanto, la economía de escala no se obtiene fácilmente con el simple aumento del tamaño de lote.

[0007] El ARN sintetizado química y enzimáticamente se usa comúnmente para aplicaciones de ARNi, en su mayoría para la regulación por reducción o la represión de la expresión de proteínas. Los ejemplos de ARN administrados a organismos para la regulación por aumento de la expresión de proteínas endógenas o la expresión de proteínas exógenas son muy limitados. Un método previamente descrito para administrar ARNm al cuerpo se limita a ARN con cap 5' que es difícil de sintetizar.

[0008] Sigue habiendo una necesidad de métodos de administración de ARN mejorados y rentables y métodos para aplicaciones tanto de ARNi como de ARNm.

[0009] Las VLP a base de proteína de revestimiento del fago MS2 que encapsulan un conjugado de un ARNip con una señal de ensamblaje de cápsida se conoce a partir de Galaway et al, Molecular Pharmaceutics, 10, 2013, 59 68 (published 30-10-2012).

Breve resumen de la invención

[0010] La invención a la que esta especificación pertenece se establece en las reivindicaciones adjuntas a esta descripción.

[0011] En un aspecto, en la presente descripción se proporciona una VLP que comprende una cápsida que encierra al menos una molécula de carga heteróloga y una secuencia de empaquetamiento. Una VLP puede comprender además al menos una ribozima encerrada por la cápsida. La molécula de carga heteróloga puede comprender un oligonucleótido, o un oligorribonucleótido. Una VLP puede comprender una o más ribozimas, y una ribozima puede estar flanqueada por la secuencia de empaquetamiento y el oligorribonucleótido para formar un constructo de ácido nucleico. Una VLP puede comprender una pluralidad de los constructos de ácido nucleico. En una VLP que incluye un oligorribonucleótido, el oligorribonucleótido puede ser un ARN corto seleccionado de entre ARNip, ARNhc, ARNhcc, ARNhcl y miARN. Una VLP puede comprender dos o más ribozimas, donde cada ribozima se selecciona para cortar un extremo del ARN corto. Las ribozimas se pueden seleccionar, por ejemplo, de entre una ribozima cabeza de martillo y una ribozima del virus de la hepatitis delta. Una ribozima cabeza de martillo puede ser una variante de una ribozima cabeza de martillo con un conjunto contiguo de nucleótidos complementarios al menos a 6 nucleótidos contiguos del oligorribonucleótido. Alternativamente, la ribozima puede ser una ribozima del virus de la hepatitis delta mutante capaz de escindir su conexión con el oligorribonucleótido con una velocidad de, como mucho, aproximadamente un 50 % de la velocidad de una ribozima del virus de la hepatitis delta de tipo salvaje.

[0012] Las VLP según la presente descripción pueden comprender una cápsida que comprende una cápsida viral de tipo salvaje que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4, o una proteína de cápsida con al menos 15 %, al menos 16 %, al menos 21 %, al menos 40 %, al menos 41 %, al menos 45 %, al menos 52 %, al menos 53 %, al menos 56 %, al menos 59 % o al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). La cápsida puede comprender una proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 3.

[0013] Las VLP según la presente descripción pueden comprender una molécula de carga heteróloga que comprende un péptido o polipéptido. Una VLP puede comprender además un conector oligonucleótido que acopla el péptido o molécula de polipéptido de carga heterólogo y la cápsida viral. El conector oligonucleótido puede ser un oligorribonucleótido que comprende una secuencia de ribozima. Alternativamente, la molécula de carga heteróloga puede comprender una molécula de carga bimolecular que comprende un polinucleótido bifuncional que comprende una primera secuencia de aptámero que específicamente se une a una molécula pequeña bioactiva que tiene un peso molecular de aproximadamente 1,500 Da o menos y una segunda secuencia de aptámero para unirse a una secuencia de empaquetamiento de la cápsida. La VLP puede comprender además la molécula pequeña bioactiva unida a la primera secuencia aptamérica. La molécula pequeña bioactiva puede comprender un herbicida o un pesticida, que puede seleccionarse, por ejemplo, de entre atrazina, acetamipridforato, profenofos, isocarbofos y ometoatos.

[0014] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN corto, una ribozima y una secuencia de empaquetamiento. El ARN corto puede ser, por ejemplo, un ARNip o un ARNhc. El constructo de ácido nucleico puede comprender además una secuencia de nucleótidos de conexión de 4 a 100 nucleótidos, donde la secuencia de nucleótidos de conexión está flanqueada por la secuencia de empaquetamiento y por la secuencia de ARN corto. El constructo de ácido nucleico puede comprender además una secuencia de nucleótidos de conexión de 4 a 100 nucleótidos, donde la secuencia de nucleótidos de conexión está flanqueada por la ribozima y la secuencia de ARN corto. La secuencia de ribozima puede estar flanqueada por el ARN corto y la secuencia de empaquetamiento. La presente descripción abarca también un vector que comprende cualquiera de tales constructos de ácido nucleico, y células huésped que comprenden tal vector, al igual que una célula huésped transformada de forma estable con tal vector. Las células huésped pueden ser una célula bacteriana, tal como, pero de forma no limitativa, una célula de Escherichia coli, una célula vegetal, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula fúngica o una célula de levadura. Una célula huésped puede transfectarse además de forma estable con un segundo vector que comprende una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cápsida viral que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La segunda secuencia de ácidos nucleicos puede codificar, por ejemplo, una proteína viral que codifica una cápsida viral que tiene al menos 40 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). Un constructo de ácido nucleico como se describe en este caso también puede codificar una proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). La ribozima en tal constructo de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una ribozima cabeza de martillo, una variante de ribozima cabeza de martillo con un conjunto contiguo de nucleótidos complementarios al menos a 6 nucleótidos contiguos del ARN corto, una ribozima del virus de la hepatitis delta, o una ribozima del virus de la hepatitis delta mutante capaz de escindir su conexión con el ARN corto con una velocidad como mucho un 50 % de la velocidad de una ribozima del virus de la hepatitis delta de tipo salvaje. La presente descripción abarca también una planta o tejido vegetal transformada para que contenga un constructo de ácido nucleico descrito en la presente, y una semilla o progenie de tal planta o tejido vegetal, donde la semilla o progenie comprende el constructo de ácido nucleico.

[0015] En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición que comprende: a) una pluralidad de VLP donde cada una comprende una cápsida viral que encierra al menos una molécula de carga heteróloga; y b) uno o más productos de lisis celular presentes en una cantidad de menos de 4 gramos por cada 100 gramos de cápsida presente en la composición, donde los productos de lisis celular se seleccionan de entre proteínas, polipéptidos, péptidos y cualquier combinación de los mismos. En la composición, la cápsida es resistente, por ejemplo, a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una proteína de cápsida que tiene al menos 15 %, al menos 16 %, al menos 21 %, al menos 40 %, al menos 41 %, al menos 45 %, al menos 52 %, al menos 53 %, al menos 56 %, al menos 59 % o al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3) y es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprende una proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). En la composición, la molécula de carga heteróloga puede comprender un oligonucleótido que puede ser un oligorribonucleótido. Un oligorribonucleótido se puede seleccionar, por ejemplo, de entre ARNip, ARNhc, ARNhcc, ARNhcl, miARN y ARNm. En la composición, cada VLP puede comprender además al menos una ribozima, donde la ribozima está flanqueada por la secuencia de empaquetamiento y el oligorribonucleótido para formar un constructo de ácido nucleico, y cada VLP puede comprender una pluralidad de los constructos de ácido nucleico. En las VLP de tal composición, la ribozima puede ser, por ejemplo, una ribozima cabeza de martillo, una variante de una ribozima cabeza de martillo que tiene un conjunto contiguo de nucleótidos complementario a al menos 6 nucleótidos contiguos del ARN corto, una ribozima del virus de la Hepatitis Delta, o una ribozima del virus de la Hepatitis Delta mutante capaz de escindir su conexión con el ARN corto con una velocidad como mucho un 50 % de la velocidad de una ribozima del virus de la Hepatitis Delta de tipo salvaje. Las VLP en tal composición pueden comprender además una secuencia de nucleótidos de conexión de 4 a 100 nucleótidos, donde la secuencia de nucleótidos de conexión está flanqueada por la secuencia codificante del empaquetamiento y por la secuencia codificante de ARN corto, o una secuencia de nucleótidos de conexión de 4 a 100 nucleótidos, donde la secuencia de nucleótidos de conexión está flanqueada por la ribozima y la secuencia codificante de ARN corto. La secuencia de la ribozima puede estar flanqueada por el ARN corto y la secuencia de empaquetamiento. Las VLP en tal composición pueden comprender una molécula de carga heteróloga que comprende un péptido o un polipéptido. Tales VLP en una composición pueden comprender además un conector oligonucleótido que acopla la molécula de carga heteróloga y la cápsida viral. El conector oligonucleótido puede ser un oligorribonucleótido que comprende una secuencia de ribozima. En tal composición, los productos de lisis celular pueden estar presentes en una cantidad inferior a 0,5 gramos, inferior a 0,2 gramos o inferior a 0,1 gramos.

[0016] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para aislar y purificar una molécula de carga diana, donde el método comprende: (a) obtener un lisado de células enteras que comprende una pluralidad de VLP donde cada una comprende una cápsida que encierra al menos una molécula de carga diana, donde las cápsidas son resistentes a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4; (b) someter las VLP a hidrólisis usando una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para al menos 60, al menos 70, al menos 80 o al menos 90 de cada 100 polipéptidos individuales presentes en el lisado de células enteras pero no encerrados por las cápsidas que se van a escindir, mientras al menos 60, al menos 70, al menos 80 o al menos 90 de cada 100 cápsidas presentes en el lisado de células enteras antes de tal hidrólisis permanecen intactas después de la hidrólisis. En el método, las cápsidas pueden comprender una proteína de cápsida viral que tiene al menos 15 %, al menos 16 %, al menos 21 %, al menos 40 %, al menos 41 %, al menos 45 %, al menos 52 %, al menos 53 %, al menos 56 %, al menos 59 % o al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). Las cápsidas pueden comprender una proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). En el método, la molécula de carga heteróloga puede comprender un oligonucleótido que puede ser un oligorribonucleótido, o un péptido o un polipéptido. Un oligorribonucleótido se puede seleccionar, por ejemplo, de entre ARNip, ARNhc, ARNhcc, ARNhcl, miARN y ARNm. En el método, cada VLP puede comprender además una ribozima, donde la ribozima está flanqueada por la secuencia de empaquetamiento y el oligorribonucleótido para formar un constructo de ácido nucleico. El método puede comprender además la purificación de las cápsidas después de la hidrólisis. La purificación puede incluir al menos uno de entre un paso de extracción líquido-líquido, un paso de cristalización, un paso de precipitación fraccionada y un paso de ultrafiltración. La presente descripción abarca también una composición producida por tal método.

[0017] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para proteger una molécula diana de la hidrólisis en un lisado de células enteras después de la producción intracelular de la molécula diana en una célula huésped, donde el método comprende: (a) seleccionar una cápsida viral que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4; (b) transfectar de forma estable la célula huésped con un primer vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína viral que forma la cápsida viral, y un segundo vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una ribozima flanqueada por una secuencia de empaquetamiento y una secuencia de ARNip; y (c) mantener las células durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que las células transformadas expresen y ensamblen las cápsidas que encapsidan la ribozima flanqueada por la secuencia de empaquetamiento y la secuencia de ARNip. En el proceso, las cápsidas pueden comprender cada una una proteína de cápsida viral con al menos 15 %, al menos 16 %, al menos 21 %, al menos 40 %, al menos 41 %, al menos 45 %, al menos 52 %, al menos 53 %, al menos 56 %, al menos 59 % o al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3).

[0018] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un proceso para purificar las VLP que encierran al menos una molécula de carga heteróloga, donde el proceso comprende: (a) obtener un lisado celular que comprende una pluralidad de las VLP; (b) poner en contacto el lisado celular con una proteasa durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para hidrolizar productos de lisis celular diferentes a las VLP para formar un hidrolizado; y (c) aislar las VLP del hidrolizado. El paso (c) puede comprender (i) realizar una primera precipitación con sulfato amónico seguida de una primera centrifugación para obtener un primer precipitado y un primer sobrenadante; y (ii) realizar una segunda precipitación sobre el primer sobrenadante con sulfato amónico seguida de una segunda centrifugación para obtener un segundo precipitado, donde el segundo precipitado comprende al menos aproximadamente 70 %, 80 % o 90 % en peso de las VLP. El paso (c) puede comprender (i) realizar una primera precipitación con etanol seguida de una primera centrifugación para obtener un primer precipitado y un primer sobrenadante; y (ii) realizar una segunda precipitación sobre el primer sobrenadante con sulfato amónico seguida de una segunda centrifugación para obtener un segundo precipitado, donde el segundo precipitado comprende al menos aproximadamente 70 %, 80 % o 90 % en peso de las VLP. El paso (c) puede comprender ultracentrifugar el hidrolizado para obtener un precipitado que comprende al menos aproximadamente 70 %, 80 % o 90 % en peso de las VLP. En el proceso, cada una de las VLP puede comprender una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4., que puede comprender una proteína de cápsida con al menos 15 %, al menos 16 %, al menos 21 %, al menos 40 %, al menos 41 %, al menos 45 %, al menos 52 %, al menos 53 %, al menos 56 %, al menos 59 % o al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). Cada una de las VLP puede comprender una proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). En el proceso, el paso (b) se puede realizar durante al menos aproximadamente 30 minutos a alrededor de 37 °C. El proceso puede comprender además, antes del paso (b), poner en contacto el lisado celular con al menos una de entre una nucleasa, una amilasa y una lipasa durante al menos aproximadamente 30 minutos a alrededor de 37 °C. En el proceso, la proteasa puede ser, por ejemplo, una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4, que se puede seleccionar, por ejemplo, de entre proteinasa K, proteasa de Streptomyces griseus, proteasa de Bacillus licheniformis, pepsina y papaína. En el proceso, la molécula de carga heteróloga encerrada por las VLP puede comprender un oligonucleótido que puede ser un oligorribonucleótido, o un péptido o un polipéptido. Un oligorribonucleótido se puede seleccionar, por ejemplo, de entre ARNip, ARNhc, ARNhcc, ARNhcl, miARN y ARNm. En el proceso, cada una de las VLP puede además comprender una ribozima como se describe en este caso, flanqueada por una secuencia de empaquetamiento y el oligorribonucleótido para formar un constructo de ácido nucleico. El oligorribonucleótido y la secuencia de empaquetamiento se pueden enlazar por una secuencia conectora de al menos 1 a 100 nucleótidos. El proceso puede comprender además preparar el lisado celular antes del paso (a) centrifugando las células después de la expresión de las VLP en las células; resuspender las células; lisar las células y centrifugar el lisado celular para obtener un sobrenadante, donde el sobrenadante se usa como el lisado celular para el paso (a).

[0019] En otro aspecto, la presente descripción proporciona VLP que comprenden una cápsida que encierra al menos una molécula de carga heteróloga y una secuencia de empaquetamiento donde la cápsida comprende una proteína de cápsida que es una variante de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3) excepto em que el residuo A en la posición 1 se elimina. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID NO:3) excepto en que el residuo A en la posición 1 se elimina y el residuo S en la posición 2 se elimina. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3) excepto en que el residuo A en la posición 1 se elimina, el residuo S en la posición 2 se elimina y el residuo N en la posición 3 se elimina. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3) excepto en que el residuo Y en la posición 129 se elimina. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEq ID NO:3) pero que tiene una única (1) deleción de aminoácidos en el segmento 112-117. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEq ID NO:3) pero que tiene una única (1) deleción de aminoácidos en el segmento 112-117. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID NO:3) pero que tiene una inserción de 1-2 residuos en el segmento 65-83. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID NO:3) pero que tiene una inserción de 1-2 residuos en el segmento 44-55. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID NO:3) pero que tiene una única (1) inserción de residuos en el segmento 33-43. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID NO:3) pero que tiene una inserción de 1-2 residuos en el segmento 24-30. La proteína de cápsida puede ser una que tiene la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.° :3) pero que tiene una única (1) inserción de residuos en el segmento 10-18. La cápsida puede comprender una secuencia monomérica de proteína de cápsida concatenada con una segunda secuencia monomérica de cápsida que se ensambla en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una secuencia monomérica de proteína de cápsida cuyo extremo C-terminal se extiende con un segmento conector de 0-6 residuos cuyo extremo C-terminal se concatena con una segunda secuencia monomérica de cápsida, todo lo cual se ensambla en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. Un segmento conector puede tener una secuencia tal como, por ejemplo, -(Gly)x, donde x = 0-6, incluidas -Gly-; -Gly-Gly-; y - Gly-Gly-Gly-. Un segmento conector puede ser un conector Gly-Ser seleccionado de entre -Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-, -Gly-Gly-Ser y -Gly-Ser-Gly-. La cápsida puede comprender la proteína de cápsida concatenada con una tercera secuencia monomérica de cápsida que se ensambla en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una proteína de cápsida donde el extremo C-terminal se extiende con un segmento conector de 0-6 residuos cuyo extremo C-terminal se concatena con una tercera secuencia monomérica de cápsida, todo lo cual se ensambla en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una proteína de cápsida donde la cápsida comprende una proteína de cápsida donde una o ambas secuencias conectoras es -(Gly)x, donde x = 0-6, incluidas Gly-; -Gly-Gly-; y -Gly-Gly-Gly-. Un segmento conector puede ser un conector Gly-Ser seleccionado de entre -Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-, -Gli-Gli-Ser y -Gly-Ser-Gly-.

[0020] Tal proteína de cápsida se ensambla, por ejemplo, en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. Por ejemplo, la cápsida puede comprender una proteína de cápsida donde una o ambas secuencias conectoras es -(Gly)x-, x = 1, que se ensambla en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una proteína de cápsida donde una o ambas secuencias conectoras es -(Gly)x-, x = 2, que se ensambla en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una proteína de cápsida donde una o ambas secuencias conectoras es -(Gly)x-, x = 3, que se ensambla en una cápsida que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una o más secuencias de proteína de cápsida que están truncadas en el extremo N-terminal por 1-3 residuos y un segmento conector como se describe en este caso se alarga por el número de residuos eliminados, y que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una o más secuencias de proteína de cápsida que está truncada en el extremo C-terminal por 1 residuo, y segmentos conectores como se describen en este caso se alargan por el un residuo, donde la cápsida es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una primera secuencia de proteína de cápsida en un dímero concatenado que se trunca en el extremo C-terminal por 1 residuo y los segmentos conectores alargados dicho residuo o donde la primera y/o la segunda secuencia de proteína de cápsida en un trímero concatenado se trunca en el extremo C-terminal por 1 residuo y que es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4. La cápsida puede comprender una proteína de cápsida que tiene truncamientos N- y C-terminales.

[0021] En otro aspecto, la presente descripción proporciona también métodos para la administración de ARNm asequible a organismos que usan las VLP como se describe en este caso. Por consiguiente, en tales métodos la molécula de carga es un ARNm. Los métodos superan la necesidad de ARNm 5' cubierto. Los métodos descritos se pueden usar, por ejemplo, para aumentar la expresión de proteínas endógenas o inducir la expresión de proteínas exógenas, a la vez que usan ARN asequible fabricado y purificado usando las composiciones y los métodos de purificación también descritos en la presente. El aumento en la expresión de proteína(s) endógena(s) o la inducción de la expresión de proteínas exógenas en un huésped se pueden realizar de una de varias maneras alternativas, usando diferente(s) molécula(s) de carga de ARNm, dependiendo del huésped.

[0022] Por ejemplo, para aumentar la expresión de una proteína endógena, o inducir la expresión de una proteína exógena (una proteína de interés), en un huésped bacteriano donde no se requiere ARN 5' cubierto para la traducción, el ARNm de la proteína de interés se introduce en el huésped bacteriano como una molécula de carga en una VLP como se describe en este caso. El ARNm se puede purificar usando los métodos de purificación que usan VLP como se describe en este caso. Para aumentar la expresión en bacterias, la molécula de ARNm de carga puede incluir además ARN que codifica una replicasa de bacteriófago, que opcionalmente también codifica proteínas auxiliares de replicasa, para aumentar la concentración de ARNm dentro del huésped bacteriano.

[0023] Alternativamente, los métodos de administración de ARNm se pueden aplicar a un huésped vegetal donde se requiere ARN 5' cubierto para la traducción. El ARNm de la proteína de interés se introduce en una planta o una célula vegetal, donde el ARNm está flanqueado por un adaptador 5' viral y su corresponiende estimulador de la traducción independiente de cap 3' ("3' CITE").

[0024] En otro ejemplo más, los métodos de administración de ARNm quizá sean aplicados a animales, incluidos mamíferos, donde ARN 5' cubierto se requiere para la traducción. El ARNm de la proteína de interés se introduce en un animal o una célula animal, tal como, por ejemplo, un mamífero o una célula de mamífero, donde el ARNm de la proteína de interés está flanqueado por sitios de entrada al ribosoma internos (IRES) virales o celulares y una señal poli(A). Para promover adicionalmente o aumentar la expresión en el animal o la célula animal, la molécula de ARNm de carga puede incluir además ARN que codifica una replicasa viral, que opcionalmente también codifica proteínas auxiliares de replicasa, para aumentar la concentración de ARNm dentro del animal o la célula animal.

[0025] Alternativamente, en cualquiera de los métodos anteriormente mencionados donde el huésped es transfectado también con una replicasa viral, y opcionalmente sus proteínas auxiliares, el ARNm que codifica la replicasa (y opcionalmente las proteínas auxiliares), se puede incluir en una VLP como una segunda molécula de carga distinta del ARNm de la proteína de interés, o se puede incluir en una VLP separada que se introduce entonces en el organismo o célula huésped en combinación con una VLP que contiene solo el ARNm de la proteína de interés.

Breve descripción de los dibujos

[0026]

La Figura 1 es un gráfico de la densidad óptica (OD; rombos coloreados) y el pH (cuadrados abiertos) a lo largo el tiempo, que muestra la propagación del bacteriófago MS2 de tipo salvaje (ATCC n° 15597-B1, de la American Type Culture Collection, Rockville, MD) en el huésped E. coli (ATCC No.15669).

La Figura 2 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de bacteriófago MS2 obtenidas tras la propagación en E. coli y purificadas usando proteinasa K y ultrafiltración, que muestran que la purificación de proteinasa K produce fago purificado a más de un 99 % de proteína total (la banda a 14 kDa corresponde a proteína de cápsida de bacteriófago MS2).

La Figura 3 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de MS2 parcialmente purificado, que muestra la degradación completa del fago y los resultados obtenidos después de ultrafiltración 1x o 2x del lisado (carriles 4 y 6).

La Figura 4 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de MS2 purificadas usando ultrafiltración y tratamiento con proteinasa K.

La Figura 5 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de MS2 purificadas usando tratamiento de proteinasa K, precipitación en condiciones ácidas, precipitación usando etanol en condiciones básicas y ácidas, y ultrafiltración.

La Figura 6 es un gráfico que muestra el espectro UV de muestras de MS2 purificadas usando tratamiento de proteinasa K, precipitación en condiciones ácidas, precipitación usando etanol en condiciones básicas y ácidas, y ultrafiltración.

La Figura 7 es un gráfico de densidad óptica (OD; rombos coloreados) sobre el tiempo, obtenido con una muestra de control (rombos abiertos) y una muestra de MS2 tras la purificación descrita para las figuras 5 y 6 (cuadrados coloreados), que muestra que la muestra purificada contiene fago con alta infectividad.

La Figura 8 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de VLP tras la expresión de cápsidas de MS2 que encapsidan ARN codificante para la proteína de cápsida unida a una horquilla de ARN de longitud 19 específica para la cápsida de MS2.

La Figura 9 es una cromatografía de productos de la PCR obtenidos de una muestra de MS2 tras la purificación descrita para las figuras 5 y 6, cromatografiada en gel de agarosa 1,5 % teñido con bromuro de etidio (1,2 kpb para los cebadores F1201_1223-R1979_2001 en el carril 1, 800 pb para los cebadores F1201_1223-R1979_2001 en el carril 2, y 304 pb para los cebadores F1401_1426-R1680_1705 en el carril 3), consistente con la presencia de un genoma de bacteriófago MS2 intacto.

La Figura 10 es una cromatografía de productos de la PCR del examen por PCR de una muestra de MS2 de la presencia o la ausencia de una sección de la cápsida de MS2 tras la purificación, cromatografiada en gel de agarosa 2 % teñido con bromuro de etidio (304 pb en el carril 1; el carril más a la izquierda corresponde a la escalera 1 kb Plus Ladder de Life Technologies), consistente con un gen de cápsida de MS2 intacto.

La Figura 11 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de VLP tras la precipitación simple con etanol para la purificación de VLP y tras el uso de proteinasa K (PK).

La Figura 12 es un gráfico de proteína resistente al tratamiento de proteasa después de la precipitación simple con etanol (sin tratamiento previo con proteinasa K) para la purificación de VLP.

La Figura 13 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de VLP tras el uso de hidrolasas constitutivas (CH) o proteinasa K (PK), la precipitación fraccionada con etanol y la ultrafiltración para la purificación de VLP.

La Figura 14 es un gel que muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de VLP tras el uso de varias hidrolasas, y la precipitación fraccionada con sulfato amónico para la purificación de VLP.

La Figura 15 es un gel que muestra los resultados del análisis PAGE de ARN obtenido de ARN encapsidado en las VLP purificadas en la FIG. 14.

La Figura 16 es un gel que muestra los resultados del análisis PAGE de la autoescisión de T7-Rz3 (carril 1) y T7-Rz2 (carril 3) transcritos in vitro.

La Figura 17 es un gel que muestra los resultados del análisis PAGE de productos de ARNhc obtenidos durante transcripciones in vitro usando ribozimas HDV flanqueadas por ARNhc y una secuencia de empaquetamiento de MS2. El carril 1 es un marcador de tamaño de ARN. El carril 2 es un control de ARNhc. Las muestras de los carriles 3 y 4 son los ARN producidos por transcripción in vitro. La muestra en el carril 3 se incubó durante una hora a 37 °C y se colocó en hielo durante una hora adicional antes de la electroforesis. La muestra en el carril 4 se incubó a 37 °C y luego se incubó a 42 °C durante una hora adicional antes de la electroforesis en gel.

La Figura 18 es un gel que muestra los resultados del análisis PAGE de productos de ARN in vitro obtenidos de ARN T7-Rzl y T7-Rz4.

La Figura 19 es un gel que muestra ARN transcrito in vivo y T7-Rz4 empaquetado. El carril 1 es una serie de patrones moleculares. El carril 2 muestra un ARNhc químicamente sintetizado de 49 nucleótidos de largo y el carril 3 es el ARN recuperados de las VLP.

La Figura 20 es una serie de geles que muestran los resultados de los análisis SDS-PAGE de productos de ARN obtenidos de ARN encapsidado en VLP, tras la purificación de las VLP y el aislamiento del ARN de la VLP.

Descripción detallada de la invención

[0027] Los encabezamientos de sección como se usan en esta sección y en toda la divulgación en la presente no pretenden ser excluyentes.

A. Definiciones

[0028] Como se utiliza en este caso, las formas singulares "una", "un", "la" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Para la enumeración de rangos numéricos en la presente, se contempla explícitamente cada número que interviene entre ellos con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el rango 6-9, los números 7 y 8 se contemplan además del 6 y el 9, y para el rango 6,0-7,0, los números 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0 se contemplano explícitamente.

[0029] El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluido(s)", al igual que otras formas, tal como "incluye(n)" e "incluida(s)", no es limitante.

[0030] A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente divulgación tendrá los significados que se entienden comúnmente por aquellas personas expertas en la técnica. Por ejemplo, cualquier nomeclatura usada en conexión con, y técnicas de, anatomía animal y celular, cultivo de células y tejidos, bioquímica, biología molecular, inmunología y microbiología descritas en la presente son las que son ampliamente conocidas y se usan comúnmente en la técnica. El significado y el alcance de los términos debería estar claro; sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones provistas en la presente tienen precedencia sobre cualquier diccionario o definición extrínseca. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

[0031] Una amplia variedad de técnicas convencionales y herramientas en química, bioquímica, biología molecular e inmunología se emplean y están disponibles para poner en práctica los métodos y las composiciones descritas en la presente, están incluidas en las capacidades de una persona de tecnico en la materia y bien descritas en la literatura. Tales técnicas y herramientas incluyen aquellas para generar y purificar VLP, incluidas aquellas con una cápsida de tipo salvaje o recombinante junto con las molécula(s) de carga, y para transformar organismos huésped y expresar proteínas recombinantes y ácidos nucleicos como se describe en este caso. Véase, por ejemplo, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL 2nd ed. 1989 (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press); y protocolos CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Eds. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) 1995.

[0032] Como se utiliza en este caso, el término "molécula de carga" se refiere a una molécula de oligonucleótido, polipéptido o péptido, que está encerrada o se puede encerrar por una cápsida.

[0033] Un oligonucleótido puede ser un oligodesoxirribonucleótido (ADN) o un oligorribonucleótido (ARN), y abarca moléculas de ARN tales como, pero no de forma no limitativa, ARNip, ARNhc, ARNhcc, miARN y ARNm. También se puede hacer referencia a determinadas moléculas de ARN como "ARN activos", un término destinado a indicar cualquier ARN con una actividad funcional, incluidas actividades de ARNi, ribozima o empaquetamiento.

[0034] Como se utiliza en este caso, el término "péptido" se refiere a una molécula polimérica que incluye mínimamente al menos dos monómeros de aminoácidos enlazados por un enlace peptídico, y tiene preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 monómeros de aminoácidos, y no más de aproximadamente 60 monómeros de aminoácidos, preferiblemente no más de aproximadamente 50 monómeros de aminoácidod enlazados por enlaces peptídicos. Por ejemplo, el término abarca polímeros que tienen aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, o aproximadamente 60 residuos de aminoácidos.

[0035] Como se utiliza en este caso, el término "polipéptido" se refiere a una molécula polimérica que incluye al menos una cadena de monómeros de aminoácido enlazados por enlaces peptídicos, donde la cadena incluye al menos aproximadamente 70 residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 80, más preferiblemente al menos aproximadamente 90, y todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos. Como se utiliza en este caso el término abarca proteínas, que pueden incluir una o más cadenas de polipéptido enlazadas, que pueden o pueden no estar unidas además a cofactores u otras proteínas. El término "proteína" como se utiliza en este caso se usa de forma intercambiable con el término "polipéptido."

[0036] Como se utiliza en este caso, el término "variante" con referencia a una molécula es una secuencia que es sustancialmente similar a la secuencia de una molécula nativa o de tipo salvaje. Con respecto a las secuencias de nucleótidos, las variantes incluyen aquellas secuencias que pueden variar en cuanto a una o más bases, pero debido a la degeneración del código genético, todavía codifican la secuencia de aminoácidos idéntica de la proteína nativa. Las variantes incluyen alelos de origen natural, y secuencias de nucleótidos que se diseñan usando técnicas conocidas en biología molecular, tal como, por ejemplo, la mutagénesis dirigida, y que codifican la proteína nativa, al igual que aquellas que codifican un polipéptido con sustituciones de aminoácidos. Generalmente, las variantes de secuencia de nucleótidos de la divulgación tienen al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 % o al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos (endógena) nativa. La presente descripción abarca también variantes de secuencia de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %.

[0037] La identidad de secuencia de las secuencias de aminoácidos o las secuencias de nucleótidos, dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia en toda su longitud, puede ser fácilmente determinada usando herramientas convencionales y métodos conocidos en la técnica y como se describe en este caso. Por ejemplo, el grado de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de nucleótidos, se determina fácilmente usando herramientas de alineamiento como la herramienta de búsqueda de alineamientos locales básicos (BLAST) del NCBI (Altschul et al., 1990), que está fácilmente disponible en múltiples fuentes en línea. Se conocen y se han descrito en la técnica algoritmos para el alineamiento óptimo de secuencias, incluidos, por ejemplo, en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 85: 2444 (1988). También hay disponibles fácilmente algoritmos para el análisis de secuencias en programas tales como blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. A efectos de la presente descripción, dos secuencias de nucleótidos pueden considerarse también "sustancialmente idénticas" cuando hibridan entre sí bajo condiciones estrictas. Las condiciones estrictas incluyen alta temperatura de hibridación y tampones de hibridación con poca sal que permiten la hibridación solo entre las secuencias de ácido nucleico que son altamente similares. Las condiciones estrictas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes, pero incluyen típicamente una temperatura de al menos aproximadamente 60°, que es aproximadamente de 10 °C a aproximadamente 15 °C inferior al punto de fusión térmico (T m) para la secuencia específica con una fuerza iónica y un pH definidos. La concentración de sal es típicamente aproximadamente 0,02 molar a pH 7.

[0038] Como se utiliza en este caso con respecto a una secuencia de nucleótidos dada, el término "variante conservadora" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica o esencialmente idéntica a la de una secuencia de referencia. Debido a la degeneración del código genético, por lo cual casi siempre más de un codón puede codificar para cada aminoácido, las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas muy estrechamente relacionadas pueden no compartir un alto nivel de identidad de secuencia. Además, diferentes organismos tienen codones preferidos para muchos aminoácidos, y diferentes organismos o incluso diferentes cepas del mismo organismo, por ejemplo, cepas de E. coli, pueden tener codones preferidos diferentes para el mismo aminoácido. Así, una primera secuencia de nucleótidos del ácido que codifica esencialmente el mismo polipéptido que una segunda secuencia de nucleótidos del ácido se considera sustancialmente idéntica a la segunda secuencia de nucleótidos, incluso si no comparten un porcentaje mínimo de identidad de secuencia, o no hibridarían entre sí bajo condiciones estrictas. Adicionalmente, se debe entender que, con la excepción limitada del ATG, que es normalmente el único codón para la metionina, cualquier secuencia se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica por técnicas estándar, y tales modificaciones están abarcadas por la presente divulgación. Como se describe en este caso a continuación, la presente divulgación contempla específicamente variantes de proteína de una proteína nativa, que tiene secuencias de aminoácidos que tienen al menos 15 %, al menos 16 %, al menos 21 %, al menos 40 %, al menos 41 %, al menos 52 %, al menos 53 %, al menos 56 %, al menos 59 % o al menos 86 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos nativa.

[0039] El grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo BLASTp de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:2264-2268, 1993). El porcentaje de identidad de secuencia se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje es calculado determinando el número de posiciones en las cuales un aminoácido idéntico ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

[0040] Una persona experta en la técnica reconocerá que los polipéptidos pueden ser "sustancialmente similares" porque un aminoácido se puede sustituir con un residuo de aminoácido similar sin afectar a la función de la proteína madura. Las secuencias polipeptídicas que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se ha indicado anteriormente excepto en que las posiciones de los residuos, que no son idénticas, pueden tener cambios de aminoácidos conservadores. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos con cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas alifáticas laterales es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales hidroxilo-alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen sulfuro es cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidos incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.

[0041] Un ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína puede ser obtenido cribando bibliotecas de ADNc o genómicas seleccionadas usando una secuencia de aminoácidos deducida para una proteína dada. Procedimientos convencionales usando procedimientos de extensión del cebador, como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., se puede usar para detectar precursores y productos intermedios de procesamiento.

B. VLP compuestas por una cápsida que encierra una molécula de carga

[0042] Los métodos y composiciones descritos en la presente son el resultado en parte de la apreciación de que determinadas cápsidas virales se pueden preparar y/o usar en nuevos métodos de fabricación y de purificación para mejorar los procedimientos de comercialización para ácidos nucleicos. Los métodos descritos descritos en la presente usan cápsidas virales recombinantes que son resistentes a hidrolasas fácilmente disponibles, para encerrar moléculas de carga heterólogas tales como ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos, incluidas proteínas.

[0043] La cápsida puede ser una cápsida de tipo salvaje o una cápsida mutante derivada a partir de una cápsida de tipo salvaje, siempre que la cápsida presente resistencia a la hidrólisis catalizada por al menos una hidrolasa que actúa en enlaces peptídicos cuando las cápsidas se ponen en contacto con la hidrolasa. Como se usa de forma intercambiable en la presente, las expresiones "resistencia a la hidrólisis" y "resistente a hidrolasas" se refieren a cualquier cápsida que, en caso de estar presente en un lisado de células enteras que contiene también polipéptidos que son productos de la lisis celular y no encerrados o incorporados en las cápsidas, y sometidos a la hidrólisis usando un enlace peptídico categoría de hidrolasa EC 3.4 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para escindir al menos 60, al menos 70, al menos 80, o al menos 90 de cada 100 polipéptidos individuales presentes en el lisado (que son productos de lisis celular y no están encerrados en las cápsidas) (es decir, se escinden al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, o al menos 90 % de todos los polipéptidos individuales no encerrados), aún al menos 60, al menos 70, al menos 80, o al menos 90 de cada 100 cápsidas presentes antes de tal hidrólisis permanecen intactas después de la hidrólisis. La hidrólisis se puede realizar durante un periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para que el peso molecular medio de las proteínas celulares restantes de la línea celular tras la hidrólisis sea menor de aproximadamente dos tercios, menor de aproximadamente una mitad, menor de aproximadamente un tercio, menor de aproximadamente un cuarto, o menor de aproximadamente un quinto, del peso molecular medio de las proteínas celulares antes de que se realice la hidrólisis. Los métodos pueden comprender además purificar la cápsida intacta restante después de la hidrólisis, y medir el peso de las cápsidas y el peso del material celular seco total antes y después de la hidrólisis y la purificación, donde el peso de las cápsidas dividido entre el peso del material celular seco total después de la hidrólisis y la purificación es al menos dos veces el peso de las cápsidas dividido entre el peso del material celular seco total medido antes de la hidrólisis y la purificación. El peso de las cápsidas dividido entre el peso del material celular seco total después de la hidrólisis y la purificación puede ser al menos 10 veces mayor que, preferiblemente 100 veces mayor que, más preferiblemente 1,000 veces mayor que, y más preferiblemente 10,000 veces mayor que el peso de las cápsidas dividido entre el peso del material celular seco total medido antes de tal hidrólisis y purificación.

[0044] Las hidrolasas son enzimas que catalizan reacciones de hidrólisis clasificadas bajo el número de identidad E.C. 3 por la Comisión de Enzimas. Por ejemplo, las enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces estéricos tienen números de identidad que empiezan con E.C. 3.1. Las enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos tienen números de identidad que empiezan con E.C. 3.2. Las enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos tienen números de identidad que empiezan con E.C. 3.4. Las proteasas, que son enzimas que catalizan la hidrólisis de proteínas, se clasifican usando números de identidad que empiezan con E.C. 3.4, incluidas pero de forma no limitativa la proteinasa K y la subtilisina. Por ejemplo, la proteinasa K tiene un número de identidad E.C.

3.4.21.64. La presente descripción abarca VLP que son resistentes a, en un ejemplo no limitativo, proteinasa K, proteasa de Streptomyces griseus, proteasa de Bacillus licheniformis, pepsina y papaína, y métodos y procesos que usan tales VLP.

[0045] El comité de nomenclatura de la unión internacional de bioquímica y biología molecular (IUBBM) recomienda también la denominación y la clasificación de enzimas por las reacciones que catalizan. Sus recomendaciones completas están disponibles libre y ampliamente, y, por ejemplo, se puede acceder en línea en http:// enzyme.expasy.org y www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/, entre otros. El IUBBM desarrolló abreviaturas para describir contra qué sitios es activa cada enzima. Las enzimas que cortan indiscriminadamente se describen como ampliamente específicas. Algunas enzimas tienen requisitos de unión más extensos, así que la descripción puede volverse más complicada. Para una enzima que cataliza una reacción muy específica, por ejemplo, una enzima que procesa protrombina en trombina activa, entonces esa actividad es la base de la descripción de escisión. En determinados casos la actividad precisa de una enzima puede no estar clara y, en tales casos, se informa de resultados de escisión contra proteínas de prueba estándar como la insulina de cadena B.

[0046] El uso de procesos de purificación simples y eficaces utilizando las cápsidas es posible por la elección de determinadas cápsidas de tipo salvaje, o modificaciones en la secuencia de aminoácidos de proteínas que comprenden las cápsidas de tipo salvaje, de manera que la cápsida presenta resistencia a la hidrólisis catalizada por al menos una hidrolasa que actúa en enlaces peptídicos como se ha descrito en este caso anteriormente. Tales cápsidas de tipo salvaje, tal como la cápsida de MS2 tipo salvaje, se pueden usar en un proceso de purificación donde se usan determinadas enzimas económicas tales como la proteinasa K o la subtilisina para la proteólisis. Un ejemplo no limitativo es el genoma del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 1); secuencia de a Dn de proteína de cápsida de MS2 tipo salvaje (SEQ ID N.°: 2); y secuencia de aminoácidos de proteína de cápsida tipo salvaje MS2 (SEQ ID N.°: 3).

[0047] Sorprendentemente, la cápsida de MS2 tipo salvaje no modificada, aunque carece de una envoltura, es resistente a una variedad de hidrolasas de categoría EC 3.4, incluidas, pero de forma no limitative, la proteinasa K y la subtilisina, de manera que una composición altamente purificada de la cápsida, que puede contener una molécula de carga, se puede preparar a partir de un lisado de células enteras. Por consiguiente, la presente descripción proporciona VLP que comprenden cápsidas virales que comprenden el tipo salvaje proteína de cápsida de MS2, y/o proteínas que comparten homología con proteínas de la cápsida de MS2 tipo salvaje, donde dichas cápsidas virales encapsidan la molécula de carga. La molécula de carga puede comprender uno o más ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos o proteínas heterólogos. Estas VLP pueden entonces aislarse y purificarse a partir de un lisado de células enteras después de un paso de hidrólisis usando una hidrolasa de categoría E.C. 3.4, para producir una composición de VLP de alta pureza, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, o al menos 85 % en peso de VLP. Las composiciones con una pureza de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, y 98 % en peso de VLP están expresamente contempladas.

[0048] La presente descripción abarca una composición que comprende: a) una pluralidad de VLP donde cada una comprende una cápsida viral de tipo salvaje y al menos una molécula de carga heteróloga diana encerrada en la cápsida viral de tipo salvaje; y b) uno o más productos de lisis celular presentes en una cantidad inferior a 40 gramos, inferior a 30 gramos, inferior a 20 gramos, inferior a 15 gramos, inferior a 10 gramos y preferiblemente inferior a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, más preferiblemente inferior a 2 gramos, y todavía más preferiblemente inferior a 1 gramo, por cada 100 gramos de cápsida presente en la composición, donde los productos de lisis celular se seleccionan de entre proteínas, polipéptidos, péptidos y cualquier combinación de los mismos. Posteriormente las moléculas de carga pueden ser fácilmente recogidas de las cápsidas. Por consiguiente, tales composiciones son altamente deseables para todas las aplicaciones donde se requiere una alta pureza y/o alta eficiencia de producción.

[0049] Se pueden usar cápsidas resistentes a hidrolasas como se describe en este caso para encerrar diferentes tipos de moléculas de carga para formar una VLP. La molécula de carga puede ser pero no está limitada a cualquier uno o más oligonucleótido u oligorribonucleótido (ADN, ARN, ANB, ANP, ARNip, ARNhc, ARNhcc, ARNhcl, miARN o ARNm, o cualquier oligonucleótido que comprenda cualquier tipo de ácido nucleico de origen no natural), cualquier péptido, polipéptido o proteína. Una molécula de carga que es un oligonucleótido u oligorribonucleótido se puede encerrar en una cápsida con o sin el uso de un conector. Se puede desencadenar, por ejemplo, que una cápsida se autoensamble a partir de proteína de cápsida en presencia de carga de nucleótido, tal como un oligorribonucleótido. En un ejemplo no limitativo, una cápsida como se describe en este caso puede encerrar una cadena de ARN heteróloga diana, tal como, por ejemplo, una cadena de ARN heteróloga diana con un total de entre 1,800 y 2,248 ribonucleótidos, incluida la secuencia de empaquetamiento de longitud 19 del fago MS2 de Enterobacteria, tal cadena de ARN transcrita a partir de un plásmido separado de un plásmido codificante para las proteínas de cápsida, como se describe por Wei, Y., et al., (2008) J. Clin. Microbiol. 46:1734-1740.

[0050] La interferencia de ARN (ARNi) es un fenómeno mediado por moléculas de ARN cortas tales como moléculas de ARNip, que se pueden usar para la supresión selectiva de un gen diana de interés, y tiene múltiples aplicaciones en biotecnología y medicina. Por ejemplo, se pueden emplear moléculas de ARN corto para dirigirse a un gen específico de interés en un organismo para obtener un fenotipo deseable. Sin embargo, las moléculas de ARN corto, incluido ARNip, se degradan fácilmente por enzimas ubicuas llamadas RNasas. Las cápsidas, tales como las descritas en la presente, protegen el ARN encapsidado de la degradación enzimática. Una cápsida como se describe en este caso puede, sin embargo, encerrar una cadena de ARN que contiene una o más ribozimas, o ribozimas autoescindibles (de actuación cis) o, en determinados casos, capaces de escindir enlaces en otro ARN (de actuación trans). Se pueden incluir una o más ribozimas, por ejemplo, para cortar específicamente secuencia(s) de ARN para producir una molécula de ARN específicamente confeccionada, tal como por ejemplo, pero de forma no limitativa, una molécula de ARNip. Por ejemplo, variantes de ribozimas cabeza de martillo y del virus de la hepatitis delta se conocen y se pueden usar para cortar secuencias de ARN largo. La presente divulgación describe VLP nuevas que comprenden una cápsida que encapsida una o más ribozimas unidas a unas secuencias de empaquetamiento como se ha descrito anteriormente (es decir, secuencias de ARN con fuerte afinidad por la pared interior de una cápsida), y las ribozimas usadas para cortar secuencias de ARN corto de secuencias de empaquetamiento unidas a las ribozimas.

[0051] La presente divulgación abarca así también el uso nuevo de ribozimas para aislar secuencias de ARN corto o pequeño tales como secuencias de ARNip, ARNhc, ARNhcc, ARNhcl y miARN de la(s) secuencia(s) de empaquetamiento usadas para encapsidarlas. Se debe entender que, a menos que se indique expresamente lo contrario, el término ARN corto abarca secuencias de ARN monocatenario corto y en horquilla (tallo-lazo) corto que tienen un tallo bicatenario y un bucle monocatenario u horquilla. Un ARN corto es cualquier cadena única de ARN que no tiene más de 30 nucleótidos, preferiblemente no más de 25 nucleótidos, y más preferiblemente no más de 22 nucleótidos; o un ARN en horquilla con un tallo de no más de 30 pares de bases de nucleótidos, preferiblemente de no más de 25 pares de bases de nucleótidos y más preferiblemente de no más de 22 pares de bases de nucleótidos en el tallo.

[0052] Un desafío al usar una ribozima que es altamente activa para aislar tales secuencias de ARN corto de secuencias de empaquetamiento es que la ribozima puede funcionar tan rápido como para liberar el ARN corto de la secuencia de empaquetamiento antes de conseguir la encapsidación del ARN. Adicionalmente, se ha descubierto que las estructuras tridimensionales de ARN corto tal como un ARNip, o las secuencias de empaquetamiento en horquilla, pueden interferir con el funcionamiento apropiado de la ribozima. Estos problemas se pueden superar 1) usando mutantes de la ribozima que demuestran un índice más lento de actividad, para evitar la liberación del ARN corto de la secuencia de empaquetamiento antes de conseguir la encapsidación del ARN corto, y/o 2) aumentando el número de nucleótidos en la ribozima que forman pares de Watson-Crick con el ARN corto. Adicionalmente, se pueden usar ventajosamente ribozimas de actuación trans para aumentar el porcentaje de ARN encapsidado en VLP como ARN corto, si la(s) secuencia(s) de ARN corto están flanqueadas no por ribozimas completas sino por secuencias más cortas que son dianas de las ribozimas de actuación trans, encapsidadas también en la misma VLP.

[0053] Una o más secuencias de ARN corto también pueden encapsidarse en una cápsida viral, o tipo salvaje o genéticamente modificada, que se ha modificado para insertar una etiqueta de péptido externa, para administrar una proteína o molécula farmacológica a una clase específica de célula. Las cápsidas de tipo salvaje también se pueden modificar genéticamente para insertar secuencias peptídicas externas que actúan como ligandos para ciertos receptores celulares proteínicos de superficie se pueden usar ventajosamente para encapsidar secuencias de ARN corto dirigidas a inducir ARNi en células diana específicas. Tales composiciones son mucho más simples, menos costosas y se fabrican de una forma más fiable que las alternativas actuales para la administración de ARN corto.

[0054] Los ejemplos no limitativos de VLP útiles que se pueden preparar incluyen una cápsida que encierra una cadena de ARN que comprende:

(i) al menos una secuencia de empaquetamiento y de 1 a 100 ARNpi idénticos o diferentes flanqueados por un separador de ARN monocatenario (no hibridante), donde cada separador de ARN monocatenario tiene entre 4 y 40 nucleótidos;

(ii) una (1) ribozima y un separador de ARN monocatenario (no hibridante) por ARNip, donde cada separador de ARN monocatenario tiene entre 4 y 40 nucleótidos;

(iii) dos (2) ribozimas por ARNip;

(iv) un (1) sitio de inicio T7, una (1) ribozima, un (1) sitio de empaquetamiento y un (1) sitio de terminación de transcripción; o

(v) un (1) sitio de inicio T7, un (1) sitio de empaquetamiento y un (1) sitio de terminación de transcripción. (vi) cuatro (4) ribozimas por ARNip.

[0055] En las VLP que incluyen una o más ribozimas, la divulgación contempla además VLP que contienen los productos resultantes después de que las ribozimas hayan cortado el ARN.

[0056] La presente divulgación abarca también el uso nuevo de cápsidas para abarcar secuencias de ARN largo tales como ARNm y el uso de ribozimas para separar la(s) secuencias de ARNm de la(s) secuencia(s) de empaquetamiento usadas para encapsidarlas. Se debe entender que, a menos que se indique expresamente lo contrario, el término ARN largo abarca secuencias de ARN monocatenario largo que pueden tener un tallo bicatenario y unos lazos u horquillas monocatenarios dispuestos a lo largo del mismo. Un ARN largo es cualquier ARN monocatenario con más de 30 nucleótidos, preferiblemente más de 40 nucleótidos, y más preferiblemente más de 50 nucleótidos; y más preferiblemente más de 100 pares de bases de nucleótidos. En la forma de realización más preferible, el ARNm incluirá las señales traduccionales y protectores necesarias requeridas para producir una proteína que codifica en la célula huésped a la que se dirige. Una cápsida como se describe en este caso puede incluir un ARNm etiquetado terminalmente con una secuencia de empaquetamiento de cápsida y puede incluir opcionalmente una ribozima diseñada para escindir el ARNm de la secuencia de empaquetamiento.

[0057] Las VLP como se describe en este caso pueden incluir alternativamente al menos un péptido, polipéptido o proteína diana. Cuando la molécula de carga heteróloga diana es un péptido, polipéptido o proteína, se puede usar un conector oligonucleótido para acoplar la molécula de carga heteróloga diana y la cápsida viral. Una molécula de carga que es un péptido, polipéptido o proteína preferiblemente se empaqueta en una cápsida usando un conector. El proceso de empaquetamiento se promueve por el conector, consistente en una secuencia aptamérica de ARN corto, que forma una conexión entre la proteína de cápsida y una etiqueta de péptido fusionada a la molécula de carga diana. (Ver Fiedler, J. et al., RNA-Directed Packaging of Enzymes within Virus-like Particles, Angew. Chem. Int. Ed. 49: 9648 -9651 (2010)). El conector oligonucleótido puede consistir en ADN, ARN, ANB, ANP y similares. El conector es, por ejemplo, de longitud de 50 a 100 con una secuencia corta, por ejemplo, de aproximadamente 20 nt de longitud, en un primer extremo con especificidad de unión para el interior de la cápsida de cápsida, y otra secuencia, por ejemplo, de aproximadamente 70 nt de longitud, en el segundo extremo opuesto que tiene una especificidad de unión para el péptido, polipéptido o proteína de carga. Adicionalmente, se puede incorporar una ribozima lenta a un conector consistente en ARN. Por ejemplo, una ribozima lenta se puede incorporar entre la secuencia de empaquetamiento (uniéndose a la proteína de cápsida) y el aptámero (uniéndose a la etiqueta de proteína diana). Tras la activación, la ribozima separará la proteína de cápsida de la proteína diana. Alternativamente, una cápsida como se describe en este caso puede incluir al menos una proteína diana etiquetada en el N-terminal con un péptido capaz de unirse de manera no covalente a un aptámero- y una cadena de ARN que contiene una secuencia de empaquetamiento de cápsida, por ejemplo, un ARNm etiquetado en el N-terminal y una cadena de ARN que contiene un aptámero y una secuencia de empaquetamiento como se describe por Fiedler, J. et al. (2010).

[0058] Una molécula de carga puede ser una molécula de carga bimolecular, y cápsidas descritas en este documento también pueden encapsidar una molécula de carga bimolecular, que puede o puede no incluir una o más ribozimas. Una molécula de carga bimolecular puede comprender un aptámero enlazado a un polinucleótido bifuncional. El aptámero puede tener una secuencia específicamente seleccionada usando SELEX para presentar una unión específica a una molécula pequeña bioactiva, es decir, una molécula con un peso molecular bajo, preferiblemente inferior a 1,500 Da. El polinucleótido bifuncional tiene tanto una primera actividad aptamérica para unirse a la molécula de carga bioactiva de bajo peso molecular, como una segunda actividad aptamérica para unirse a una secuencia de empaquetamiento de una cápsida. El polinucleótido bifuncional enlazado a la molécula de carga bioactiva forma la molécula de carga bimolecular que puede entonces enlazarse a la cápsida. Tal molécula de carga se puede usar para unirse a la molécula pequeña bioactiva, y así cargar la VLP con la molécula pequeña. La presente divulgación abarca así también una VLP que comprende una cápsida enlazada a tal molécula de carga bimolecular sintética. Los ejemplos de agentes bioactivos de bajo peso molecular que se pueden cargar en una VLP por unión a un aptámero de ARN incluyen: atrazina (herbicida), acetamipridforato, profenofos, isocarbofos y ometoatos (insecticidas), como se describe por Sett et al. (2012) Open Journal of Applied Biosensor, 1:p. 9-19.

[0059] Los ejemplos de agentes bioactivos de bajo peso molecular que se pueden cargar en una VLP por unión a un aptámero de ARN incluyen herbicidas tales como 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacetic), December ((ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico), Paraquat (dicloruro de N,N'-dimetil-4,4'-bipiridinio), Oryzalin (4-(dipropilamino)-3,5 dinitrobenzenosulfonamida), DCMU (3-(3,4-didorofenil)-1,1-dimetilurea), Trifluralin (2,6-dinitro-N,N-dipropil-4-(trifluorometil)anilina), Imazapic (ácido -metil-2-[4-metil-5-oxo-4-(propan-2-il)-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]piridina-3-carboxílico), Aminopyralid (ácido 4-amino-3,6-dicloropiridina-2-carboxílico), Clopyralid (ácido 3,6-dicloro-2-piridinocarboxílico), Metolachlor ((RS)-2-cloro-N-(2-etil-6-metil-fenil)-N-(1-metoxipropan-2-il)acetamida), Pendimethalin (3,4-dimethil-2,6-dinitro-N-pentan-3-il-anilina), Picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloro-2-piridinocarboxílico), Propanil N-(3,4-diclorofenil)propanamida), Triclopyr (ácido [(3,5,6-tricloro-2-piridinil)oxi]acético), y Atrazine (2-cloro-4-(ethilamino)-6-(isopropilamino)-s-triazina), entre otros enumerados, por ejemplo, por Roberts et al. (1998) Metabolic Pathways of Agrochemicals: Part 1: Herbicides and Plant Growth Regulators. Publicado por la Royal Society of Chemistry (Gran Bretaña) ISBN 978-1-84755-138-2. Por ejemplo, un aptámero de ARN que se une a atrazina se describe por Sinha et al. (2010) Nature Chemical Biology, 6:p.464-470.

[0060] También pueden usarse aptámeros de ARN para unirse a insecticidas tales como, Propargite (prop-2-ino-1-sulfonato de 2-(4-tert-butilfenoxi)cyclohexilp), Chlorpyrifos (fosforotioato de , O-3,5,6-tricloropiridin-2-il O-dietílico), Cypermethrin, Phosmet (2-dimetoxifosfinotioiltiomethil)isoindolin-1,3-diona), Permethrin ( (lRS)-cis,trans-3-(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxilato de 3-fenoxibencilo), Diazinon (fosforotioato de O,O-dietil O-[4-metil-6-(propan-2-il)pirimidin-2-ilo]), Methylpatahion (fosforotioato de O,O-dimetil O-(4-nitrofenilo)) y Acetamiprid (N-[(6-cloro-3-piridil)metil]-N'-ciano-N-metil-acetamidine), y fungicidas tales como Chlorothalonil (2,4,5,6-tetracloroisoftalonitrilo), Captan ((3aR,7aS)-2-[(triclorometil)sulfanil]-3a,4,7,7a-tetrahidro-1H-isoindol-1,3(2H)-diona), Boscalid (2-cloro-N-(4'-clorobifenil-2-il)nicotinamida), Iprodione (3-(3,5-diclorofenil)-N-isopropil-2,4-dioxoimidazolidine-1-carboxamida), Azoxistrobin (metil (2E)-2-(2-{[6-(2-cianofenoxi)pirimidin-4-il]oxi}fenil)-3-metoxiacrilato), Pyrachlostrobin, (metil 2-[1-(4-clorofenil)pirazol-3-iloximetil]-N-metoxicarbanilato), Cyprodinil (4-cyclopropil-6-metil-N-fenilpirimidin-2-amina), entre otros enumerados, por ejemplo, por Roberts et al. (1999) Metabolic Pathways of Agrochemicals: Part 2: Insecticides and Fungicides. Publicado por la Royal Society of Chemistry (Gran Bretaña) ISBN 978-1-84755-137-5. Por ejemplo, se han descrito aptámeros para unirse a acetamiprid, forato, profenofos, isocarbofos y ometoato, como se ejemplifica por Sett et al. (2012), Open Journal of Applied Biosensor, 1:p. 9-19, usando aptámeros de ADN construidos de una manera similar a como se construyen los aptámeros de ARN usando SELEX.

[0061] Estos herbicidas, insecticidas o fungicidas son moléculas pequeñas bioactivas, es decir, moléculas con un peso molecular bajo, preferiblemente inferior a 1,500 Da. Debido a su pequeño tamaño, pueden permear cápsidas que forman VLP de la presente divulgación, como se ejemplifica por Wu et al. (2005) Delivery of antisense oligonucleotides to leukemia cells by RNA bacteriophage capsids, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 1:p.67-76. Estas pequeñas moléculas bioactivas se añaden a las VLP de la presente divulgación que encapsidan aptámeros diseñados usando SELEX para unirse a las moléculas bioactivas pequeñas, después de que tales VLP se hayan formado, o antes o después de la purificación. La adición de estas pequeñas moléculas bioactivas se hace, por ejemplo, añadiéndolas a una solución de las VLP e incubándolas, por ejemplo, a temperatura ambiente durante un tiempo entre 30 minutos y 10 horas. Estas pequeñas moléculas bioactivas entran en las VLP por difusión a través de los poros en los ejes de simetría de las partículas y son retenidas dentro debido a su unión a los aptámeros encerrados. Los solventes adecuados usados para cargar las moléculas bioactivas pequeñas en las VLP varían desde polares tales como agua y mezclas agua-etanol hasta no polares tales como, por ejemplo, isooctano, tolueno, diclorometano o cloroformo. El uso de solventes no polares para la disolución de las VLP se hace, por ejemplo, como se describe por Johnson et al. (2006), Solubilization and stabilization of bacteriophage MS2 in organic solvents, Biotechnology and bioengineering, 2007. 97(2): p. 224-34, con la ayuda de surfactantes como Aerosol OT. Se prefiere el uso de solventes no polares para cargar moléculas bioactivas pequeñas, ya que su solubilidad en solventes polares es, en la mayoría de los casos, pobre.

[0062] Las VLP que encapsidan tanto ARNip como moléculas bioactivas pequeñas se prefieren en aplicaciones donde se consigue un efecto sinérgico entre los dos ingredientes bioactivos, por ejemplo, en aquellos casos donde la planta, insecto u hongo al que se dirige es resistente a la molécula bioactiva pequeña. En tales casos, el ARNip se diseña para dirigirse a la vía biológica que confiere a la planta, insecto u hongo resistencia a la molécula bioactiva pequeña, como se ejemplifica por Sammons et al., Polynucleotide molecules for gene regulation in plants, US 2011/0296556.

[0063] Alternativamente, el polinucleótido bifuncional puede codificar al menos un ARNip, ARNhc, ARNhcc, ARNhcl, miARN o ARNm, y la molécula de carga puede ser una proteína pequeña (de bajo peso molecular) o péptido. Por consiguiente, una molécula de carga bimolecular puede ser capaz de unirse a una proteína bioactiva de bajo peso molecular o péptido. Tal molécula de carga bimolecular puede comprender una proteína o péptido biológicamente activo, acoplado a un polinucleótido codificante de al menos un ARNip o ARNhc o ARNhcc o ARNhcl o miARN o ARNm, y que tiene una primera actividad aptamérica para unirse a la molécula de carga de proteína o péptido bioactivo y una segunda actividad aptamérica para unirse a una secuencia de empaquetamiento de una cápsida. El polinucleótido se enlaza a la molécula de carga de proteína o péptido y es capaz de enlazarse a la secuencia de empaquetamiento de una cápsida.

[0064] Un polinucleótido bifuncional como se ha descrito anteriormente puede incluir opcionalmente una o más secuencias de una ribozima. Una VLP que incluye una molécula de carga bimolecular que incluye un polinucleótido bifuncional como se ha descrito anteriormente puede incluir opcionalmente una o más ribozimas. La presente divulgación abarca también una VLP que comprende una cápsida y productos reactivos de la molécula de carga bimolecular después de que al menos una ribozima haya reaccionado con una molécula de carga bimolecular para cortar la molécula de carga en partes constituyentes, incluido el aptámero.

[0065] Las VLP como se describe en este caso se pueden ensamblar por cualquier método(s) disponible(s) que produzca una VLP con una cápsida resistente a hidrolasas ensamblada que encapside una o más molécula(s) de carga, y opcionalmente cualquier conector, secuencia de empaquetamiento, una o más ribozimas, o etiquetas. Por ejemplo, las cápsidas y las moléculas de carga se pueden coexpresar en cualquier sistema de expresión. ADN recombinante codificante de una o más proteínas de cápsida, una o más molécula(s) de carga y opcionalmente cualquier conector, secuencia de empaquetamiento, ribozima(s) o etiquetas se pueden introducir fácilmente en las células huésped, por ejemplo, células bacterianas, células vegetales, células de levadura, células fúngicas y células animales (incluidas de insectos y mamíferos) por transfección con uno o más vectores de expresión por cualquier procedimiento útil para introducir tal vector en una célula particular, y transfectar de forma estable la célula para producir una célula que exprese la(s) secuencia(s) recombinante(s).

[0066] La célula huésped es preferiblemente de origen eucariota, por ejemplo, fuentes vegetales, de mamíferos, insectos, levaduras o fúngicas, pero también pueden usarse células huésped no eucarióticas. Los sistemas de expresión adecuados incluyen pero de forma no limitativa microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli,), transformados con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contenga las secuencias codificantes para los elementos VLP. En el ejemplo no limitativo, para las VLP que usan la proteína de cápsida de MS2, la expresión en E. coli es un sistema de expresión adecuado.

[0067] La presente descripción contempla expresamente células vegetales que se han transformado usando un constructo de ácido nucleico como se describe en este caso, y que expresa una proteína de cápsida, molécula de carga y un y opcionalmente cualquier conector, secuencia de empaquetamiento, una o más ribozimas, o etiquetas. Los medios para transfomar células, incluidas células vegetales, y preparar células transgénicas son ampliamente conocidos en la técnica. Vectores, plásmidos, cósmidos, YACs (cromosomas artificiales de levadura) y segmentos de ADN se pueden usar para transformar células e incluirán, como se reconoce generalmente, promotores, potenciadores y/o policonectores. Las células transgénicas específicamente contempladas incluyen células vegetales transgénicas, incluidas pero no limitadas a células obtenidas de maíz, soja, trigo, verduras, granos, leguminosas, árboles frutales, etcétera, o cualquier planta que se beneficiaría de la introducción de una VLP como se describe en este caso. También se contemplan plantas, tejido vegetal obtenido de células transformadas como se describe en este caso, y la semilla o la descendencia de la planta o el tejido vegetal.

[0068] La expresión de las VLP ensambladas se puede obtener, por ejemplo, construyendo al menos un vector de expresión que incluya las secuencias codificantes de todos los elementos de la VLP. A veces se utilizan dos vectores, un primer vector que incluye una secuencia que codifica la(s) molécula(s) de carga y opcionalmente cualquier conector, secuencia de empaquetamiento, una o más ribozimas, o etiquetas; y un segundo vector que incluye una secuencia que codifica la proteína de cápsida. En un proceso ejemplar para generar VLP ejemplares, dos vectores se pueden coexpresar en la célula huésped para la generación de la VLP, como se detalla adicionalmente en los ejemplos. Métodos y herramientas para construir tales vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes y las secuencias de control transcripcional y traduccional son ampliamente conocidos en la técnica. El/los vector(es), una vez construido(s), se transfieren a las células huésped usando también técnicas ampliamente conocidas en la técnica, y las células se mantienen entonces bajo condiciones de cultivo durante un tiempo suficiente para que ocurra la expresión y el ensamblaje de las VLP, todo usando técnicas convencionales. La presente descripción abarca así células huésped que contienen cualquiera de tales vectores, y las células que han sido transformadas por tales vectores, al igual que células con las VLP.

[0069] Cuando las VLP han sido expresadas y ensambladas en las células huésped, se pueden aislar y purificar usando cualquier método conocido en la técnica para la purificación de virus. Por ejemplo, las células se pueden lisar usando técnicas y agentes de lisis celular convencionales, y el lisado celular sometido a la hidrólisis usando al menos una hidrolasa de enlace peptídico de categoría E.C. 3.4 tal como pero no limitada a proteinasa K o subtilisina. Las cápsidas intactas que quedan en el lisado celular tras la hidrólisis se puede eliminar y purificar usando técnicas de aislamiento de proteínas convencionales.

[0070] La purificación de cápsidas, VLP o proteínas también pueden incluir métodos conocidos generalmente en la técnica. Por ejemplo, después de la expresión de la cápsida y la lisis celular, el lisado resultante se puede someter a uno o más pasos de aislamiento o purificación. Tales pasos pueden incluir, por ejemplo, pasos de lipólisis enzimática, hidrólisis de ADN y proteólisis. Un paso de proteólisis se puede realizar, por ejemplo, usando una mezcla de endo y exoproteasas. Por ejemplo, después de la lisis celular y el desmontaje hidrolítico de la mayoría de los componentes celulares, tales cápsidas con sus moléculas de carga se pueden separar de la matriz circundante por extracción, por ejemplo, en un solvente inmiscible en agua no polar adecuado, o por cristalización a partir de un solvente adecuado. Por ejemplo, pasos de hidrólisis y/o proteólisis transforman contaminantes de la cápsida que están contenidos en la matriz de lisado en moléculas pequeñas hidrosolubles. Las cápsidas hidrófobas pueden entonces ser extraídas en una fase orgánica tal como 1,3-bis(trifluorometil)benceno. La purificación de cápsidas, VLP o proteínas puede incluir, por ejemplo, al menos un paso de extracción líquido-líquido, al menos un paso de precipitación fraccionada, al menos un paso de ultrafiltración o al menos un paso de cristalización. Una extracción líquido-líquido puede comprender, por ejemplo, el uso de un solvente no polar no acuoso inmiscible, tal como pero no limitado a benceno, tolueno, hexano, heptano, octano, cloroformo, diclorometano o tetracloruro de carbono. La purificación puede incluir al menos un paso de cristalización. El uso de uno o más pasos hidrolíticos, y especialmente de uno o más pasos proteolíticos, elimina determinados problemas observados con los procesos de separación actuales usados para moléculas de carga, que son principalmente el resultado del gran número y grado variable de interacciones de unión que ocurren entre las moléculas de carga y los componentes derivados del cultivo celular donde se producen. Las cápsidas descritas en la presente resisten pasos hidrolíticos de manera que la matriz que resulta después de la hidrólisis incluye cápsidas intactas que dividen de forma segura cualquier molécula de carga de la matriz circundante, interrumpiendo así las interacciones de unión problemáticas que interfieren con procesos de purificación actuales.

[0071] Tras la purificación, la cápsida puede abrirse para obtener la molécula de carga, que puede ser una proteína o polipéptido, un péptido o una molécula de ácido nucleico como se describe en este caso. Las cápsidas se pueden abrir usando cualquiera de varios posibles procedimientos conocidos en la técnica, incluidos, por ejemplo, calentamiento en una solución acuosa por encima de 50 °C; congelación-descongelación repetidas; incubación con agentes desnaturalizantes tal como formamida; incubación con una o más proteasas; o por una combinación de cualquiera de estos procedimientos.

[0072] Las proteínas de cápsida que son resistentes a hidrolasas y útiles en las VLP y los métodos según la presente descripción también pueden ser variantes de, o derivados de la proteína de cápsida de MS2 de tipo salvaje. Las proteínas de cápsida pueden comprender, por ejemplo, al menos una sustitución, deleción o inserción de un residuo de aminoácido respecto a la secuencia de aminoácidos de la cápsida de MS2 de tipo salvaje. Tales proteínas de cápsida pueden ser variantes de origen natural o se pueden obtener modificando genéticamente una proteína de cápsida de MS2 usando técnicas convencionales, siempre que la variante o proteína de cápsida modificada forme una cápsida sin envoltura que sea resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría E.C. 3.4 como se describe en este caso.

[0073] Las proteínas de cápsida de MS2 genéticamente modificadas que se pueden ensamblar en cápsidas que son resistentes a la hidrólisis, como se describe en este caso, se pueden diseñar haciendo modificaciones seleccionadas en la secuencia de aminoácidos según principios convencionales y ampliamente conocidos en la fisicoquímica y la bioquímica para producir una proteína que retiene la resistencia a la hidrólisis como se describe en este caso y en los ejemplos que aparecen a continuación.

[0074] Es conocimiento común, por ejemplo, que la forma o pliegue global de una proteína funcional se determina por la secuencia de aminoácidos de la proteína, y que el pliegue define la función de la proteína. El pliegue global está compuesto de uno o más dominios de plegamiento. Cuando más de un dominio de plegamiento existe en el pliegue global, los dominios generalmente se unen entre sí, holgada o apretadamente a lo largo de una interfaz de dominio. El pliegue de dominio se puede descomponer en un núcleo de plegamiento de elementos de estructura secundaria bien definidos y apretadamente empaquetados que es responsable principalmente de la forma del dominio y una capa externa más móvil compuesta típicamente de giros y bucles cuyas conformaciones están influenciadas por interacciones con el núcleo de plegamiento al igual que interacciones con dominios cercanos y otras moléculas, incluidos el solvente y otras proteínas.

Una extensa base de datos de dominio público de pliegues de proteínas, la base de datos Structural Classification of Proteins (SCOP) (Alexey G Murzin, Curr Opin Struct Biol (1996) 6, 386-394) de estructuras de proteínas resueltas en el dominio público se mantiene en línea en http://scop.berkeley.edu y se expande regularmente a medida que estructuras resueltas nuevas entran en la base de datos de dominio público (Protein Data Bank (F.C.Bernstein, T.F.Koetzle, G.J.Williams, E.E.Meyer Jr., M.D.Brice, J.R.Rodgers, O.Kennard, T.Shimanouchi, M.Tasumi, "The Protein Data Bank: A Computer-based Archival File For Macromolecular Structures," J. of. Mol. Biol., 112 (1977): 535), http://www.rcsb.org). Los miembros de una familia que son evolutivamente distantes, pero tienen no obstante la misma forma y una función muy similar, retienen comúnmente tan solo un 30 % de residuos idénticos en posiciones equivalentes topológica y/o funcionalmente. En algunas familias, secuencias de miembros distantes tienen tan solo un 20 % de sus residuos invariados uno respecto al otro, por ejemplo, proteínas de cápsida de levi- y alloleviviridae. Además, el pliegue y la función de una proteína es notablemente tolerante al cambio a través de la mutación dirigida o aleatoria, incluso de residuos del núcleo (Peter O. OlinsJ, S. Christopher Bauer, Sarah Braford-Goldberg, Kris Sterbenz, Joseph O. Polazzi, Maire H. Caparon, Barbara K. Klein, Alan M. Easton, Kumnan Paik, Jon A. Klover, Barrett R. Thiele y John P. McKearn (1995) J Biol Chem 270, 23754-23760; Yiqing Feng, Barbara K. Klein y Charles A. McWherter (1996), J Mol Biol 259, 524-541; Dale Rennell, Suzanne E. Bouvier, Larry W. Hardy y Anthony R. Poteetel (1991) J Mol Biol 222, 67-87), inserción/deleción de uno o más residuos (Yiqing Feng, Barbara K. Klein y Charles A. McWherter (1996), J Mol Biol 259, 524-541), permutación de la secuencia (Multi-functional chimeric hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged c-mpl receptor agonists and other hematopoietic factors, US 6066318), concatenación a través del extremo N- o C-terminal o ambos (a copias de sí misma u otros péptidos o proteínas) (Multi-functional chimeric hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged g-csf receptor agonists and other hematopoietic factors , US20040171115; Plevka, P., Tars, K., Liljas, L. (2008) Protein Sci. 17: 173) o modificación covalente, por ejemplo, glicosilación, pegilación, sumoilación o la adición de etiquetas de afinidad peptídicas o no peptídicas siempre y cuando se conserven residuos críticos para mantener el pliegue y/o la función.

[0075] Las VLP según la presente divulgación y como se usan en cualquiera de los métodos y procesos, abarcan aquellas que comprenden una proteína de cápsida que tiene al menos 15 %, 16 %, 21 %, 40 %, 41 %, 52 %, 53 %, 56 %, 59 % o al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID N.°: 3). Tales VLP incluyen, por ejemplo, una VLP que comprende una proteína de cápsida que tiene al menos 52 % de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 3) como se ha descrito anteriormente. También está incluida una VLP que comprende una proteína de cápsida que tiene al menos 53 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3, que puede ser obtenida sustancialmente como se ha descrito anteriormente pero sin ignorar la secuencia de cápsida FR, que representa un 53 % de identidad de secuencia con el fago de enterobacteria de tipo salvaje proteína de cápsida de MS2 (SEQ ID NO:3). También se incluye una VLP que comprende una proteína de cápsida que tiene al menos 56 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3, cuando se considera que, cuando las estructuras identificadas como 1AQ3 (van den Worm, S.H., Stonehouse, N.J.,Valegard, K., Murray, J.B., Walton, C., Fridborg, K., Stockley, P.G., Liljas, L. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 1345-1351), 1GAV (Tars, K., Bundule, M., Fridborg, K., Liljas, L. (1997) J.Mol.Biol. 271: 759-773), 1FRS (Liljas, L., Fridborg, K., Valegard, K., Bundule, M., Pumpens, P. (1994) J.Mol.Biol. 244: 279-290) y 2VTU (Plevka, P., Tars, K., Liljas, L. (2008) Protein Sci. 17: 1731) (identificadores del banco de datos de proteínas anteriormente descritos), solo 56 % de las posiciones de secuencia tienen una secuencia idéntica y posiciones topológicamente equivalentes con respecto a las superposiciones del esqueleto cuando las tres secuencias se consideran juntas. También está incluida una VLP que comprende una proteína de cápsida que tiene al menos 59 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3, cuando se considera que la secuencia de la proteína de cápsida de MS2 viral en comparación con la de la proteína de cápsida viral GA es un 59 %. También está incluida una VLP que comprende una proteína de cápsida que tiene al menos 86 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3, cuando se considera que la secuencia de la proteína de cápsida de MS2 viral en comparación con la de la proteína de cápsida FR es un 86 %. Las VLP según la presente divulgación abarcan así aquellas que comprenden una proteína de cápsida que tiene al menos 15 %, 16 % o 21 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cápsida del fago MS2 de Enterobacteria tipo salvaje (SEQ ID NO:3) basado en un alineamiento anclado de una estructura válida y es resistente a la hidrólisis catalizada por una hidrolasa de enlace peptídico de categoría EC 3.4.

[0076] Una VLP puede comprender así cualquiera de las variantes de proteína de cápsida de MS2 como se describe en este caso. Las proteínas de cápsida genéticamente modificadas de acuerdo con aquellas descritas en la presente se pueden producir, por ejemplo, construyendo al menos un plásmido de ADN codificante de al menos una proteína de cápsida que tiene al menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácido respecto a la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje proteína de cápsida de MS2, haciendo múltiples copias de cada plásmido, transformando una línea celular con los plásmidos; manteniendo las células durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que las células transformadas expresen y ensamblen cápsidas que encapsidan ácidos nucleicos; lisando las células para formar un lisado celular; sometiendo el lisado celular a una hidrólisis usando al menos una hidrolasa de enlace peptídico, categoría EC 3.4; y eliminando las cápsidas intactas restantes en el lisado celular tras la hidrólisis para obtener cápsidas con una resistencia aumentada al menos a una hidrolasa respecto a la proteína de cápsida tipo salvaje. Tras la purificación de las cápsidas intactas resultantes, se puede determinar una secuencia de aminoácidos para cada proteína de cápsida según métodos conocidos en la técnica.

[0077] Las cápsidas especializadas descritas en la presente se pueden usar en investigación y desarrollo y en instalaciones de fabricación industrial para proporcionar rendimientos mejorados, ya que los procesos de purificación usados en ambos ámbitos tienen la misma composición matricial. El hecho de tener dicha misma composición depende principalmente del uso de la misma línea celular tanto en procesos de investigación como de desarrollo y fabricación. Sin embargo, las diferencias en la composición matricial debido al uso de diferentes líneas celulares se reducen inmensamente después de los pasos proteolíticos usados tanto en fases de investigación como de desarrollo y fabricación. Esta característica permite el uso de diferentes líneas celulares en ambas fases con una penalización de rendimiento de fabricación mínima.

EJEMPLOS

[0078] Los siguientes ejemplos no limitativos se incluyen para ilustrar varios aspectos de la presente descripción. Será apreciado por los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por los solicitantes para funcionar bien en la práctica de la invención, y así se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en los ejemplos específicos descritos, obteniendo aún así resultados parecidos o similares, sin apartarse del ámbito de la invención. Así, los ejemplos son ejemplares solo y no deberían interpretarse de modo que limiten la invención de ninguna manera.

[0079] El ejemplo Y ilustra la invención.

Ejemplo A

Propagación del bacteriófago MS2

[0080] El bacteriófago MS2 (ATCC No.15597-B1, de la American Type Culture Collection, Rockville, MD) y su huésped E. coli (ATCC No.15669) se obtuvieron de la ATCC y se propagaron usando el procedimiento descrito por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54 J. Mol. Biol 7:43-54. Los resultados se representan en la figura 1. Se siguieron la densidad óptica (OD) a 600 nm y el pH durante la reacción. La ODi representa la OD inmediatamente después de la inoculación con el huésped. La infección se hizo a las 2,3 horas. Ln(OD/ODi) se representó en el eje izquierdo (rombos coloreados) y el pH se representó en el eje derecho (cuadrados abiertos). Este experimento se terminó 5,3 horas después de la inoculación con el huésped. El lisado obtenido se centrifugó a 2,000 g y se filtró a través de una membrana de 0,2 pm para eliminar las bacterias restantes y los restos bacterianos.

Ejemplo B

Purificación del bacteriófago MS2 usando proteinasa K y ultrafiltración

[0081] La purificación del bacteriófago MS2 se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 2. Ocho mililitros de lisado obtenido al final del ejemplo A (muestra en el carril 1, FIG. 2) se filtraron a través de una membrana de 300 kDa (Vivaspin 2, de Sartorius Stedim, Bohemia, NY) y el filtrado se filtró a través de una membrana de 100 kDa, de la que se obtuvo 1 mL de fracción retenida (muestra en el carril 2, FIG. 2). Esta fracción retenida se dividió en dos partes iguales. A una mitad (control) se le añadieron 206 pL de solución acuosa de CaCh 20 mM a pH 7,5. A la segunda mitad (proteinasa) se le añadió 0,15 mg de proteinasa K (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) disuelta en 206 pL de solución acuosa de CaCl²20 mM a pH 7,5. Ambos tubos se incubaron a 37 °C y después de 1 hora se colocaron en un baño de agua helada. Entonces se tomaron muestras y se analizaron: la muestra de control en el carril 3, FIG. 2, y la muestra de proteinasa en el carril 5, FIG. 2. Cada producto se diluyó luego a 2 mL con agua desionizada (DI) y se filtró a través de una membrana de 100 kDa. Cada fracción retenida (150 pL) se diluyó a 2 mL con agua DI y se filtró nuevamente a través de la misma membrana. La dilución y la ultrafiltración se repitió una vez más para cada producto. Entonces se tomaron muestras de cada fracción retenida y se analizaron: la muestra de control en el carril 4, FIG. 2, y la muestra de proteinasa en el carril 6, FIG. 2. La banda a 14 kDa corresponde a la proteína de cápsida del bacteriófago MS2. La banda a 30 kDa corresponde a la proteinasa K. El producto del experimento de control produce un fago altamente impuro. El producto del experimento con proteinasa produce un producto que contiene fago con una pureza superior al 99 %.

Ejemplo C

Degradación del bacteriófago MS2

[0082] El tratamiento del bacteriófago MS2 se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante el tratamiento y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 3. Cuatro mililitros del lisado obtenido al final del ejemplo A se purificaron parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. Se tomó una muestra de la solución acuosa después de la extracción con freón 11 y se analizó (muestra en el carril 1, FIG. 3). A la solución de fago parcialmente purificado (130 pL) se le añadieron 370 pL de solución acuosa de CaCl²20 mM. La mezcla se incubó a 37 °C y después de 1 hora se colocó en un baño de agua helada. Luego se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 2, FIG. 3. El producto de incubación se diluyó a 2 mL con agua desionizada (DI) y se filtró a través de una membrana de 100 kDa. La fracción retenida (150 pL) se diluyó a 2 mL con agua DI y se filtró nuevamente a través de la misma membrana. La dilución y ultrafiltración de la fracción retenida se repitió una vez más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó: muestra en el carril 3, FIG. 3. Solo se observaron bandas débiles a menos de 10 kDa, lo que indica una degradación completa del fago.

Ejemplo D

Purificación del bacteriófago MS2 usando ultrafiltración.

[0083] La purificación del bacteriófago MS2 se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 3. Cuatro mililitros del lisado obtenido al final del ejemplo A se purificaron parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. La solución acuosa que contiene fago parcialmente purificado se diluyó a 2 mL con agua desionizada, y se filtró a través de una membrana de 300 kDa y el filtrado se filtró a través de una membrana de 100 kDa, de la que se obtuvieron 150 pl de fracción retenida. La fracción retenida se diluyó luego a 2 mL con agua desionizada (DI) y se filtró a través de la misma membrana de 100 kDa. La dilución y la ultrafiltración de la fracción retenida (150 pL) se repitió una vez más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó: muestra en el carril 4, FIG. 3. Se añadieron 370 pL de solución acuosa de CaCl²20 mM a la fracción retenida (130 pL). La mezcla se incubó a 37 °C y después de 1 hora se colocó en un baño de agua helada. Luego se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 5, FIG. 3. El producto se diluyó luego a 2 mL con agua desionizada (DI) y se filtró a través de una membrana de 100 kDa. La fracción retenida (150 pL) se diluyó a 2 mL con agua DI y se filtró nuevamente a través de la misma membrana. La dilución y ultrafiltración de la fracción retenida se repitió una vez más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó: muestra en el carril 6, FIG. 3. La proteína de cápsida del MS2, de 14 kDa, retenida por una membrana a través de la cual permean proteínas con menos de 100 kDa de peso molecular es claramente visible, lo que indica la presencia de cápsidas de MS2 intactas. El producto obtenido contenía fago con una pureza superior al 99 %.

Ejemplo E

Purificación del bacteriófago MS2 usando proteinasa K, y ultrafiltración.

[0084] La purificación del bacteriófago MS2 se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la Fig 4. Cuatro mililitros del lisado obtenido al final del ejemplo A se purificaron parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. La solución acuosa que contiene fago parcialmente purificado se diluyó a 2 mL con agua desionizada, se filtró a través de una membrana de 100 kDa, de la que se obtuvieron 150 pl de fracción retenida. La fracción retenida se diluyó luego a 2 mL con agua desionizada (DI) y se filtró a través de la misma membrana de 100 kDa. La dilución y la ultrafiltración de la fracción retenida (150 pL) se repitió una vez más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó: muestra en el carril 1, FIG. 4. Se añadieron 0,15 mg de proteinasa K disuelta en 370 pL de solución acuosa de CaCl²20 mM a la fracción retenida (130 pL). La mezcla se incubó a 37 °C y después de 1 hora se colocó en un baño de agua helada. Luego se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 2, FIG. 4. El producto se diluyó luego a 2 mL con agua desionizada (DI) y se filtró a través de una membrana de 100 kDa. La fracción retenida (150 pL) se diluyó a 2 mL con agua DI y se filtró nuevamente a través de la misma membrana. La dilución y ultrafiltración de la fracción retenida se repitió una vez más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó: muestra en el carril 3, FIG. 4. El producto obtenido contenía fago con una pureza superior al 99 %.

Ejemplo F

Purificación del bacteriófago MS2 usando proteinasa K, precipitación en condiciones ácidas, precipitación usando etanol en condiciones básicas y ácidas, y ultrafiltración.

[0085] La purificación del bacteriófago MS2 se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 5. Cincuenta mililitros del lisado obtenido al final del ejemplo A se purificaron parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. Se tomó una muestra de la solución acuosa después de la extracción con freón 11 y se analizó (muestra en el carril 1, FIG. 5). A la solución de fago parcialmente purificado (1,2 mL) se le añadieron 0,9 mg de proteinasa K disuelta en 1,24 mL de solución acuosa de CaCl²20 mM. La mezcla se incubó a 37 °C y después de 1 hora se añadieron 60 pL de solución 0,2M de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) en etanol para inactivar la proteinasa K. La mezcla se colocó luego en un baño de agua helada. Se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 2, FIG. 5,0. Seiscientos ochenta microlitros de solución acuosa de ácido fosfórico al 0,1 % se añadieron lentamente con agitación vigorosa en un baño de hielo/agua para llevar el pH del líquido a 4. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó 16000 g a 4 °C durante 30 min. Se dejó que el sobrenadante alcanzara la temperatura ambiente y 130 pL de NaOH al 1 % se añadieron para llevar el pH del líquido a 8. Se añadieron lentamente 0,81 ml de etanol a temperatura ambiente con agitación vigorosa para llevar la concentración de etanol en el líquido al 20 %. El líquido se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min y se centrifugó a 16 000 g a temperatura ambiente durante 30 min. El sobrenadante se colocó en un baño de hielo/agua durante 15 min y se añadieron lentamente 1,3 mL de ácido acético al 1 % a 0 °C con agitación vigorosa para llevar el pH del líquido a 4.

Se añadieron lentamente 1,5 ml de etanol a 0 °C con agitación vigorosa para llevar la concentración de etanol en el líquido al 34 %. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 30 min. El sedimento se resuspendió en 200 pL de agua DI y se tomó una muestra de 20 pl y se analizó: carril 3, FIG.

5. El resto (180 pL) se diluyó con agua DI a 2 mL y se filtró a través de una membrana de 100 kDa. La fracción retenida (150 pL) se diluyó a 2 mL con agua DI y se filtró nuevamente a través de la misma membrana. La dilución y ultrafiltración de la fracción retenida se repitió una vez más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 4, FIG. 5. La proteína de cápsida del MS2, de 14 kDa, retenida por una membrana a través de la cual son capaces de permear proteínas con menos de 100 kDa de peso molecular, es claramente visible, consistente con la presencia de cápsidas de MS2 intactas. Un espectro UV en la misma fracción retenida se muestra en la figura 6, que es consistente con los resultados publicados por G. F. Rohrmann y R. G. Krueger, (1970) J. Virol, 6(3):26 para fago MS2 puro. Una cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) se realizó sobre la misma fracción retenida usando una solución salina tamponada con tris a pH 7,4 y 150 mM de NaCl. Mostró absorbancia a 280 nm solo en el volumen vacío de la columna. No hubo ninguna absorbancia en el volumen de elución para las proteínas de 600 kDa a 2 kDa. Esta prueba es consistente con partículas de fago intactas. El ARN se aisló de otra muestra de la misma fracción retenida usando un QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) y un kit DNA-free (Life Technologies, Grand Island, NY), y se sometió a transcrición inversa usando un High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). La presencia o la ausencia de tres secciones diferentes del genoma del MS2 se examinó luego en experimentos PCR. Se usaron los pares siguientes de cebadores, cada cebador nombrado por la posición de su primera y última base en el genoma del MS2, directo (F) e inverso (R), respectivamente: F1001_1021-R2180_2201, F1201_1223-R1979_2001, F1401_1426-R1680_1705. Se usó la Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Life Technologies) para la amplificación. Los productos de la PCR, analizados en un gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio, como se muestra en la figura 9 (1,2 kpb para los cebadores F1201_1223-R1979_2001 en el carril 1, 800 pb para los cebadores F1201_1223-R1979_2001 en el carril 2, y 304 pb para los cebadores F1401_1426-R1680_1705 en el carril 3), fueron consistentes con un genoma del bacteriófago MS2 intacto. También se realizó una prueba de infectividad sobre la misma fracción retenida como sigue. Cinco microlitros de fracción retenida se usaron para infectar 1 mL de cultivo bacteriano como se describe en el ejemplo A en el punto que alcanzó una OD(600nm) de 0,22. La OD(600nm) fue 0,82 1 hora después de la infección y disminuyó a 0,21 después de 2 horas adicionales, mientras que, durante el mismo tiempo, una muestra de control logró una OD(600nm) de 0,82 1 hora después de la infección y 1,2 después de 2 horas adicionales, como se muestra en la figura 7. Esta prueba mostró un fago altamente infeccioso en la fracción retenida y por lo tanto demostró que los procesos de purificación usados para aislar no han comprometido su integridad. En conclusión, el producto obtenido contenía bacteriófago MS2 con una pureza superior al 99 %.

Ejemplo G

Purificación del bacteriófago MS2 usando diferentes proteasas exógenas, y ultrafiltración.

[0086] Se intentó la purificación del bacteriófago MS2 usando diferentes proteasas exógenas sustancialmente como se describe en el ejemplo E, con la excepción de que se usaron proteasas diferentes a la proteinasa K. El bacteriófago MS2 se purificó exitosamente después de la proteólisis promovida por la proteasa de Bacillus licheniformis (P5380, Sigma Aldrich). Sin embargo, se descubrió que una reacción de proteólisis usando pepsina de mucosa gástrica porcina (P6887, Sigma Aldrich) a un pH de 6 degrada significativamente el bacteriófago MS2. Por otro lado, las reacciones de proteólisis usando papaína de látex de papaya (P3125, Sigma Aldrich) a pH 6 no degradaron extensamente el bacteriófago MS2.

Ejemplo H

Producción de cápsidas de MS2 que encapsidan ARN codificante para su proteína de cápsida unido a su horquilla de ARN de longitud 19 específica.

[0087] La producción de cápsidas de MS2 se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante el curso de la expresión y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras para controlar la producción de cápsida. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 8. Una secuencia de ADN, SEQ ID N.°: 4, que codifica la proteína de cápsida del MS2 y su secuencia de empaquetamiento de longitud 19 de ARN específica se clonó en un plásmido de entrada como un fragmento de restricción Sfil y luego se subclonó por recombinación Gateway en pDEST14 (Life Technologies).

[0088] Se transformaron células de E. coli químicamente competentes One Shot BL21/DE3 (Life Technologies) usando tal plásmido. BL21/DE3 que contenían el plásmido se cultivaron en 750 mL de medio LB con ampicilina a 37 °C, a una OD(600nm) igual a 0,8. Luego se tomó una muestra de preinducción y se analizó: muestra en el carril 1, FIG. 8. Entonces se añadió isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (Sigma- Aldrich) (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Se recogieron células cuatro horas tras la inducción por centrifugación a 3,000 g y 4 °C durante 40 min. Luego se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 2, FIG. 8.

Ejemplo I

Purificación y caracterización de cápsidas de MS2 que encapsidan ARN codificante para su proteína de cápsida unida a su horquilla de ARN de longitud 19 específica.

[0089] La purificación de cápsidas de MS2 se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizaró un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 8. Una fracción del sedimento del Ejemplo H equivalente a 115 mL de cultivo se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía MgCl²10 mM y se sonicó para lisar las células. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 16000 g. El lisado celular obtenido se purificó parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. A la solución de cápsida de MS2 parcialmente purificada (1,05 mL) se le añadió 0,3 mg de proteinasa K disuelta en 1,05 mL de solución acuosa de CaCl²20 mM. La mezcla se incubó a 37 °C y después de 2,5 horas se colocó en un baño de agua helada. Entonces se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 3, FIG. 8. Quince minutos después, se añadieron lentamente 0,14 mL de solución acuosa de ácido fosfórico al 1 % con agitación vigorosa en un baño de hielo/agua para llevar el pH del líquido a 4,1. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 20 min. Al sobrenadante, mantenido a 0 °C, se le añadieron 100 pL de NaOH al 1 % para llevar el pH del líquido a 7,9. Quinientos microlitros de etanol a 0 °C se le añadieron luego lentamente con agitación vigorosa para llevar la concentración de etanol en el líquido al 20 %. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 20 min. Después de añadir ácido acético al 1 % para ajustar el pH de la solución a 7, el sobrenadante se filtró a través de una membrana de 300 kDa Vivaspin 2 (Sartorius) y el filtrado se filtró a través de una membrana de 100 kDa, donde se obtuvieron 150 pL de fracción retenida. La fracción retenida se diluyó luego a 2 mL con suero salino tamponado con fosfato y se filtró a través de la misma membrana de 100 kDa. La dilución y la ultrafiltración de la fracción retenida (150 pL) se repitió cuatro veces más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 4, FIG. 8. La proteína de cápsida del MS2, de 14 kDa, retenida por una membrana a través de la cual son capaces de permear las proteínas con menos de 100 kDa de peso molecular, es claramente visible, consistente con la presencia de cápsidas de MS2 intactas. El ARN se aisló de otra muestra de la misma fracción retenida usando un QlAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) y un kit DNA-free (Life Technologies, Grand Island, NY), y se sometió a transcrición inversa usando un High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). La presencia o la ausencia de una sección de la cápsida de MS2 se examinó luego en experimentos PCR. Se usaron los pares siguientes de cebadores, cada cebador nombrado por la posición de su primera y última base en el genoma del MS2, directo (F) e inverso (R), respectivamente: F1401_1426-R1680_1705. Se usó la Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Life Technologies) para la amplificación. El producto de la PCR, analizado en un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio, como se muestra en la figura 10 (304 pb en el carril 1; el carril más a la izquierda corresponde a 1 kb plus ladder de Life Technologies), fue consistente con un gen intacto de cápsida de MS2. En conclusión, el producto obtenido contenía cápsidas de MS2 con una pureza superior al 99 %.

Ejemplo J

Precipitación simple con etanol para la purificación de las VLP.

[0090] La purificación de las VLP se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 11. Una sexta parte del sedimento obtenido a partir de un experimento idéntico al ejemplo H se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía MgCl²10 mM y se sonicó para lisar las células. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 16000 g. El lisado celular obtenido se purificó parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. Se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 1, FIG. 11. Se halló una banda fuerte a alrededor de 14 kDa, consistente con la proteína de cápsida del fago MS2. Otras bandas, impurezas de mayor peso molecular, representan aproximadamente un 27 % del peso de la muestra. A la solución de VLP parcialmente purificada (1,35 mL) se le añadieron 1,36 mL de solución acuosa de CaCl²20 mM y se colocó en un baño de agua helada. Quince minutos después, se añadieron 50 pL de solución acuosa de ácido acético al 10 % para llevar el pH del líquido a 4,1. Entonces, a la misma temperatura y con agitación vigorosa, se añadieron lentamente 1,44 mL de etanol. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 20 min. El sedimento se suspendió en 2 mL de un tampón acuoso consistente en Tris-HCl 20 mM y MgCl²10 mM ajustado a pH 7,5. Se tomó una muestra y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 2, FIG. 11. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 24 % del peso de la muestra. La muestra diluida se filtró a través de una membrana de 100 kDa Vivaspin 2 (Sartorius) de la cual se obtuvieron 200 pL de fracción retenida. La fracción retenida se diluyó luego a 2 mL con el mismo tampón y se filtró a través de la misma membrana de 100 kDa. La dilución y la ultrafiltración de la fracción retenida (200 pL) se repitió cuatro veces más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 3, FIG. 11. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 9,7 % del peso de la muestra. En conclusión, el producto obtenido contenía VLP con una pureza superior al 90 %.

Ejemplo K

Uso de proteinasa K (PK) y precipitación simple con etanol para la purificación de VLP de MS2.

[0091] La purificación de las VLP se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 11. Una sexta parte del sedimento obtenido a partir de un experimento idéntico al ejemplo H se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía MgCl²10 mM y se sonicó para lisar las células. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 16000 g. El lisado celular obtenido se purificó parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. Se tomó una muestra y se analizó: muestra en el carril 1, FIG. 11. Se halló una banda fuerte a alrededor de 14 kDa, consistente con la proteína de cápsida de fago MS2. Otras bandas, impurezas de mayor peso molecular, representan aproximadamente un 26 % del peso de la muestra. A la solución de VLP parcialmente purificada (1,35 mL) se le añadieron 0,6 mg de proteinasa K disuelta en 1,36 mL de solución acuosa de CaCl²20 mM. La mezcla se incubó a 37 °C y después de 2,5 horas se colocó en un baño de agua helada. Se tomó una muestra y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 2, FIG. 12. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 14 % del peso de la muestra. Quince minutos después, se añadieron aproximadamente 50 I_iL de solución acuosa de ácido acético al 10 % en un baño de hielo/agua para llevar el pH del líquido a 4,1. Entonces, a la misma temperatura y con agitación vigorosa, se añadieron lentamente 1,54 mL de etanol. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 20 min. El sedimento se suspendió en 2 mL de un tampón acuoso consistente en Tris-HCl 20 mM y MgCl²10 mM ajustado a pH 7,5. Se tomó una muestra y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 3, FIG. 12. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 10 % del peso de la muestra. La muestra diluida se filtró a través de una membrana de 100 kDa Vivaspin 2 (Sartorius) de la cual se obtuvieron 200 pL de fracción retenida. La fracción retenida se diluyó luego a 2 mL con el mismo tampón y se filtró a través de la misma membrana de 100 kDa. La dilución y la ultrafiltración de la fracción retenida (200 pL) se repitió cuatro veces más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 4, FIG. 12. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 5,1 % del peso de la muestra. En conclusión, el producto obtenido contenía VLP con una pureza de aproximadamente el 95 %.

Ejemplo L

Degradación de VLP de MS2 usando proteasa selectiva

[0092] Una parte alícuota de VLP purificadas obtenidas en el ejemplo K, que alcanzana 1,17 mL de suspensión con 1,9 mg de proteína de cápsida, se diluyó con 1,83 mL de una solución acuosa de acetato sódico 10 mM y acetato de calcio 5 mM. El pH de la solución fue ajustado a 7,5 usando 0,1 % hidróxido sódico. Se añadieron 0,6 mg de proteasa de Streptomyces griseus (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y luego se tomó una muestra de 0,7 mL. La mezcla restante se incubó a 37 °C durante 2 horas y se tomó una segunda muestra de 0,7 mL. Se tomaron dos muestras más, después de 6 horas de incubación y 23 horas de incubación. Cada una de las cuatro muestras de 0,7 mL fue filtrada a través de una membrana de ultrafiltración de 100 kDa (Vivaspin 2, de Sartorius Stedim, Bohemia, NY) y fue lavada con tampón acuoso consistente en Tris-HCl 20 mM y MgCl²10 mM ajustado a pH 7,5. La proteína total recuperada (concentración medida usando Pierce® BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) en cada una de las 4 fracciones retenidas obtenidas después de una ultrafiltración estaba relacionada con una proteína presente antes de la ultrafiltración. Se calculó un 105 % de recuperación para la primera muestra (antes de iniciar la incubación). Se calculó un 37 % de recuperación después de 2 horas de incubación. Se calculó un 30 % de recuperación después de 6 horas de incubación. Se calculó un 28 % de recuperación después de 23 horas de incubación. La concentración de proteína frente al tiempo se representa en la figura 12.

[0093] Estos resultados indican que la proteína recuperada por precipitación directa de un lisado celular sin tratamiento de proteasa heteróloga previo, incluye proteína de cápsida no ensamblada o cápsidas parcialmente ensambladas que, a diferencia de las cápsidas completamente ensambladas, siguen siendo sensibles a las proteasas heterólogas. Así, el pretratamiento de lisados celulares con una proteasa heteróloga puede eliminar todas las formas de la proteína de cápsida excepto aquellas incorporadas en cápsidas completamente ensambladas.

Ejemplo M

Uso de hidrolasas constitutivas (CH), precipitación fraccionada con etanol y ultrafiltración para la purificación de MS2 VLP.

[0094] La purificación de las VLP se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 13. Una sexta parte del sedimento obtenido a partir de un experimento idéntico al ejemplo H se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía MgCl²10 mM y se sonicó para lisar las células. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 16000 g. El lisado celular obtenido se purificó parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54. A la solución de VLP MS2 parcialmente purificada (1,35 mL) se le añadieron 1,36 mL de solución acuosa de CaCl2 20 mM. La mezcla se incubó a 37 °C durante 2,5 horas (para permitir que las hidrolasas constitutivas actuén) y después se colocó en un baño de agua helada. Se tomó una muestra y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 1, FIG. 13. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 12 % del peso de la muestra. Quince minutos después, se añadieron aproximadamente 120 pL de solución acuosa de hidróxido sódico al 1 % en un baño de hielo/agua para llevar el pH del líquido a 7,86. Luego, a la misma temperatura y con agitación vigorosa, se añadieron lentamente 0,81 mL de etanol. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 20 min. Se añadieron lentamente aproximadamente 100 de solución acuosa de ácido acético al 10 % al sobrenadante con agitación vigorosa en un baño de hielo/agua para llevar el pH del líquido a 4,0. Luego, a la misma temperatura y con agitación vigorosa, se añadieron lentamente 1,3 mL de etanol. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 20 min.

El sedimento se suspendió en 2 mL de un tampón acuoso consistente en Tris-HCl 20 mM y MgCl²10 mM ajustado a pH 7,5. La muestra diluida se filtró a través de una membrana de 100 kDa Vivaspin 2 (Sartorius) de la cual se obtuvieron 200 pL de fracción retenida. La fracción retenida se diluyó luego a 2 mL con el mismo tampón y se filtró a través de la misma membrana de 100 kDa. La dilución y la ultrafiltración de la fracción retenida (200 pL) se repitió cuatro veces más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 3, FIG. 13. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 4,7 % del peso de la muestra.

En conclusión, el producto obtenido contenía MS2 VLP con una pureza superior a aproximadamente el 95 %.

Ejemplo N

Uso de proteinasa K (PK), precipitación fraccionada con etanol y ultrafiltración para la purificación de MS2 VLP.

[0095] La purificación de las VLP se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran también en la figura 13.

Una sexta parte del sedimento obtenido a partir de un experimento idéntico al ejemplo H se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía MgCl²10 mM y se sonicó para lisar las células. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 16000 g. El lisado celular obtenido se purificó parcialmente por precipitación usando sulfato amónico y extracción usando triclorofluorometano (freón 11) como se describe por Strauss y Sinsheimer (1963) J.

Mol. Biol 7:43-54. A la solución de VLP parcialmente purificada (1,35 mL) se le añadieron 0,3 mg de proteinasa K disuelta en 1,36 mL de solución acuosa de CaCl²20 mM. La mezcla se incubó a 37 °C durante 2,5 horas y después se colocó en un baño de agua helada. Se tomó una muestra y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 2, FIG. 13. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 8,1 % del peso de la muestra. Quince minutos después, se añadieron aproximadamente 120 pL de solución acuosa de hidróxido sódico al 1 % en un baño de hielo/agua para llevar el pH del líquido a 7,86. Luego, a la misma temperatura y con agitación vigorosa, se añadieron lentamente 0,81 mL de etanol. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16 000 g a 4 °C durante 20 min. Se añadieron aproximadamente 100 pL de solución acuosa de ácido acético al 10 % al sobrenadante en un baño de hielo/agua para llevar el pH del líquido a 4,0. Luego, a la misma temperatura y con agitación vigorosa, se añadieron lentamente1,3 mL de etanol. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 30 minutos y se centrifugó a 16 000 g a 4 °C durante 20 min. El sedimento se suspendió en 2 mL de un tampón acuoso consistente en Tris-HCl 20 mM y MgCl²10 mM ajustado a pH 7,5. La muestra diluida se filtró a través de una membrana de 100 kDa Vivaspin 2 (Sartorius) de la cual se obtuvieron 200 pL de fracción retenida. La fracción retenida se diluyó luego a 2 mL con el mismo tampón y se filtró a través de la misma membrana de 100 kDa. La dilución y la ultrafiltración de la fracción retenida (200 pL) se repitió cuatro veces más. Luego se tomó una muestra de la fracción retenida y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 4, FIG. 13. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 0,9 % del peso de la muestra. En conclusión, el producto obtenido contenía VLP con una pureza superior a aproximadamente el 99 %.

Ejemplo O

Uso de varias hidrolasas y precipitación fraccionada con sulfato amónico para la purificación de VLP.

[0096] La purificación de las VLP se realizó de la siguiente manera. Se tomaron muestras durante la purificación y se realizó un análisis SDS PAGE de las muestras. Los resultados obtenidos se muestran también en la figura 14.

Una sexta parte del sedimento obtenido a partir del método del ejemplo H se resuspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía MgCl²10 mM y se sonicó para lisar las células. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 16000 g. Se tomó una muestra del sobrenadante y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 1, FIG. 14. Las impurezas en esta muestra representaban aproximadamente el 70 % del peso de la muestra. Otras cuatro fracciones idénticas del sedimento obtenido de tal experimento idéntico al ejemplo H se procesaron de la misma manera.

[0097] Los cinco lisados celulares centrifugados obtenidos, cada uno de 3,7 mL en volumen, fueron procesados adicionalmente de cinco maneras diferentes, de la siguiente manera. El primer lisado celular centrifugado se colocó en un baño de agua helada durante 15 minutos y se añadieron 0,1 gramos de sulfato amónico. La mezcla se agitó en vórtex hasta que se consiguió la disolución completa del sulfato amónico. El líquido se mantuvo a 0 ° durante 2 horas y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 30 min. Se añadieron 0,4 gramos de sulfato amónico al sobrenadante y se agitó en vórtex hasta que se consiguió la disolución completa del sulfato amónico. El líquido se mantuvo a 0 °C durante 2 horas y se centrifugó a 16000 g a 4 °C durante 30 min. El sedimento de VLP purificadas se suspendió en 0,2 mL de un tampón acuoso consistente en Tris-HCl 20 mM y MgCl²10 mM ajustado a pH 7,5.

El segundo lisado celular centrifugado se incubó a 37 °C durante cinco horas, se colocó en un baño de agua helada durante la misma cantidad de tiempo que el primer lisado celular centrifugado y se procesó posteriormente de manera idéntica al primer lisado celular centrifugado. Ciento cincuenta microgramos de proteinasa K (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) fue añadieron al tercer lisado celular centrifugado que se incubó entonces a 37 °C durante cinco horas, se colocó en un baño de agua helada durante la misma cantidad de tiempo que el primer lisado celular centrifugado y se procesó posteriormente de manera idéntica al primer lisado celular centrifugado. El cuarto lisado celular centrifugado se incubó a 37 °C durante dos horas. Luego se añadieron 0,15 mg de proteinasa K. La muestra se incubó a 37 °C durante unas tres horas adicionales, se colocó en un baño de agua helada durante la misma cantidad de tiempo que el primer lisado celular centrifugado y se procesó posteriormente de manera idéntica al primer lisado celular centrifugado.

[0098] Se añadieron quinientas unidades de nucleasa Benzonase® (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y 35 unidades de lipasa de Candida rugosa (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) al quinto lisado celular centrifugado y se incubó a 37 °C durante una hora. Luego se añadieron 15 unidades de a-amilasa de Bacillus sp. (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y se incubó a 37 °C durante una hora adicional. Luego se añadieron 0,15 mg de proteinasa K. La mezcla se incubó a 37 °C durante unas tres horas adicionales, se colocó en un baño de agua helada durante la misma cantidad de tiempo que el primer lisado celular centrifugado y se procesó posteriormente de manera idéntica al primer lisado celular centrifugado.

[0099] Se tomó una muestra del segundo lisado celular centrifugado después de sus 5 horas de incubación y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 2, FIG. 14. Se tomó una muestra del tercer lisado celular centrifugado después de sus 5 horas de incubación y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 3, FIG. 14. Se tomó una muestra del cuarto lisado celular centrifugado después de sus 5 horas de incubación y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 4, FIG. 14. Se tomó una muestra del quinto lisado celular centrifugado después de sus 5 horas de incubación y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 5, FIG. 14.

[0100] Se tomó una muestra de la suspensión de las VLP purificadas para el primer lisado celular centrifugado y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 6, FIG. 14. El producto obtenido contenía VLP con una pureza de aproximadamente el 88 %. La concentración de proteína (Pierce® BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) de esta muestra fue 18,5 mg/mL. La densidad óptica medida en una celda de 1 cm a 260 nm (OD-260nm) de una dilución 200:1 de esta muestra fue 0,553 y la OD-280nm fue 0,303. Estas mediciones son consistentes con el rendimiento de ARN de aproximadamente 9 mg por litro de cultivo.

[0101] Se tomó una muestra de la suspensión de las VLP purificadas para el segundo lisado celular centrifugado y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 7, FIG. 14. El producto obtenido contenía VLP con una pureza de aproximadamente el 75 %. La concentración de proteína de esta muestra fue 25,4 mg/mL. La OD-260nm de una dilución 200:1 de esta muestra fue 0,784 y la OD-280nm fue 0,453. Estas mediciones son consistentes con el rendimiento de ARN de aproximadamente 11 mg por litro de cultivo.

[0102] Se tomó una muestra de la suspensión de las VLP purificadas para el tercer lisado celular centrifugado y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 8, FIG. 14. El producto obtenido contenía VLP con una pureza de aproximadamente el 94,3 %. La concentración de proteína de esta muestra fue 21,0 mg/mL. La OD-260nm de una dilución 200:1 de esta muestra fue 0,632 y la OD-280nm fue 0,321. Estas mediciones son consistentes con el rendimiento de ARN de aproximadamente 10 mg por litro de cultivo.

[0103] Se tomó una muestra de la suspensión de las VLP purificadas para el cuarto lisado celular centrifugado y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 9, FIG. 14. El producto obtenido contenía VLP con una pureza de aproximadamente el 95,6 %. La concentración de proteína de esta muestra fue 19,4 mg/mL. La OD-260nm de una dilución 200:1 de esta muestra fue 0,666 y la OD-280nm fue 0,353. Estas mediciones son consistentes con el rendimiento de ARN de aproximadamente 11 mg por litro de cultivo.

[0104] Se tomó una muestra de la suspensión de las VLP purificadas para el quinto lisado celular centrifugado y se analizó por SDS PAGE: muestra en el carril 10, FIG. 14. El producto obtenido contenía VLP con una pureza de aproximadamente el 96 %. La concentración de proteína de esta muestra fue 19,8 mg/mL. La OD-260nm de una dilución 200:1 de esta muestra fue 0,661 y la OD-280nm fue 0,354. Estas mediciones son consistentes con el rendimiento de ARN de aproximadamente 11 mg por litro de cultivo.

Ejemplo P

Aislamiento de ARN encapsidado en las VLP del ejemplo O

[0105] Se extrajo el ARN encapsidado en cápsidas de MS2 purificadas como se describe en el ejemplo O de cada experimento usando el reactivo de TRIzol® según el protocolo suministrado por el fabricante (Life Technologies, Grand Island, NY). El ARN obtenido fue desnaturalizado calentando durante 5 min a 95 °C en formamida y se analizó por electroforesis en geles de 17,6 cm x 38 cm x 0,04 cm (W, L, T) compuestos por 8 % poliacrilamida, urea 8 molar, 1,08 % base Tris, 0,55 % ácido bórico y 0,093 % EDTA. El tampón de desplazamiento tenía las mismas concentraciones de base Tris, ácido bórico y EDTA que el gel. La potencia se suministró a aproximadamente 40W. Los geles fueron teñidos usando una solución 0,025 % de Stains-All dye (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en una mezcla acuosa que contiene 25 % formamida, 19 % isopropanol y 15 mM Tris a pH 8. Los resultados se muestran en la figura 15. Los números de carril para la electroforesis de ARN en la figura 15 se referen a los mismos números de carril para la electroforesis de proteína en la figura 14. Una única banda de ARN se puede observar en cada carril, consistente con el ARN con alta pureza recuperado en cada caso, lo que demuestra que se pueden empaquetar moléculas de ARN intactas específicas en VLP y purificar eficazmente a partir de lisados celulares tratados con proteasa.

Ejemplo Q

La ribozima HDV produjo ARNhc por transcripciones in vitro

[0106] Para probar si especies de ARN activas, tales como las ribozimas, se pueden empaquetar eficazmente en VLP y purificar por tratamiento con proteasa y precipitación simple, se diseñaron y se evaluaron in vitro una serie de constructos de prueba adecuados para empaquetar en virtud de contener una secuencia de empaquetamiento de MS2 asociada a ribozimas y ARNhc. Idealmente, un ARN activo sería generado por escisión del ARN activo de la secuencia de empaquetamiento y cualquier otra secuencia tal como unos espaciadores o terminadores de la transcripción por una ribozima contenida en la molécula de ARN empaquetada misma. Los constructos T7-Rz2 (SEQ ID N.°: 5) y T7-Rz3 (SEQ ID N.°: 6), que representan tal disposición, fueron producidos por transcripción in vitro y se evaluó su capacidad para producir un ARNip por autoescisión. Las secuencias de ADN de estos constructos codifican un promotor T7 seguido de una ribozima cabeza de martillo diseñada para escindir el extremo 5' de una horquilla ARNhc (en T7-Rz3 pero no en Tz-Rz2), la horquilla ARNhc, la ribozima del virus de la Hepatitis Delta (HDV) diseñada para escindir el extremo 3' de la horquilla ARNhc, un separador AT, un ARN específico de MS2 de longitud 19 que codifica la secuencia de empaquetamiento necesaria para la incorporación del constructo en una VLP, y un sitio de restricción Ncol. T7-Rz3 y T7-Rz2 diferen el uno del otro solo por la presencia o ausencia de la ribozima cabeza de martillo 5', respectivamente.

[0107] Ambos de estos constructos se clonaron como fragmentos de restricción BamHI-PacI en plásmidos pMA (ampR) (Life Technologies). Las células de E. Coli químicamente competentes One Shot BL21/DE3(Life Technologies) fueron transformadas usando cada plásmido. Se cultivaron por separado células BL21(DE3) con cada plásmido en medio LB que contiene ampicilina a 37 °C, para OD(600nm) igual a 0,8. Los plásmidos se aislaron usando el QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Ncol (New England Biolabs) se usó para cortar los plásmidos aislados en los sitios de restricción después de la secuencia de empaquetamiento de MS2. Después de la digestión, se purificaron moldes de ADN lineales por electroforesis en 1,5 % geles de agarosa y se aislaron usando un PureLink™ Quick Gel Extraction Kit (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la transcripción inversa se usó el MAXIscript® T7 Kit según las instrucciones del fabricante. Los productos de ARN fueron sometidos a electroforesis en 8 % geles de poliacrilamida con 8M urea, 1,08 % base Tris, 0,55 % ácido bórico y 0,093 % EDTA. Los geles tenían 0,4 mm de espesor, 18 cm de ancho y 38 cm de largo. Las bandas de ARN fueron visualizadas usando Stains-All (Sigma-Aldrich). La obtención de imágenes del gel y la cuantificación de las bandas se realizaron utilizando el software Image Lab 4,0.1(Bio-Rad).

Modelo T7-Rz2:

[0108] El modelo tiene un total de 165 nt. Los primeros 18 nucleótidos en la secuencia son el promotor T7 y los últimos 5 se eliminan en la digestión con NcoI cuando se prepara el modelo lineal. El transcrito de longitud completa para T7-Rz2 tiene 165 nts - 18 nts - 5 nts = 142 nts. El transcrito comienza en el nucleótido 19 con la secuencia 5'GCTTGT (este es el inicio del ARNhc). Cuando la ribozima HDV corta, ya que el ARNip tiene 49 nucleótidos de largo, la longitud esperada del segundo fragmento es 93 nt.

[0109] Los resultados se muestran en la figura 16, carril 3. La banda más grande (142 nts) es el transcrito sin cortar. La segunda banda es el fragmento con la ribozima HDV, el conector AT y la secuencia de empaquetamiento de MS2 (93 nts) y la tercera banda es el ARNip (49 nt).

Modelo T7-Rz3:

[0110] El modelo tenía un total de 221 nucleótidos (nts), donde los primeros 18 nucleótidos son el promotor T7. La transcripción comienza en el nucleótido 19. Ya que la digestión con Nco I elimina los últimos 5 nucleótidos del modelo, el transcrito de longitud completa tiene 221 nts - 18 nts - 5 nts = 198 nts. La ribozima cabeza de martillo (la primera ribozima del extremo 5' del transcrito) se diseñó para cortar entre el 3r y el 4° nucleótido en la secuencia 5'-GTCGCT-3', así se espera que el primer fragmento tenga 56 nucleótidos de largo. La ribozima HDV (la primera ribozima del extremo 3' del transcrito) está diseñada para liberar el clon de ARNhc del resto del transcrito, produciendo un ARNhc de 49 nucleótidos de largo. Así, si el transcrito de longitud total tiene 198 nucleótidos y el primer fragmento (que contiene la ribozima cabeza de martillo extirpada) tiene 56 nucleótidos y el ARNhc tiene 49 nucleótidos, el tercer fragmento consistente en la ribozima HDV, el conector AT y secuencia de empaquetamiento de MS2 deberían tener 93 nucleótidos. Se espera este resultado cuando cortan ambas ribozimas. Si solo corta la ribozima cabeza de martillo, el resultado esperado es un fragmento de 56 nucleótidos de largo y un segundo fragmento de 142 nucleótidos de largo. Si solo corta la ribozima HDV 3', el resultado esperado es un fragmento de 104 nucleótidos de largo y un segundo fragmento de 94 nucleótidos de largo.

[0111] Los resultados se muestran en la figura 16, Carril 1. La ribozima cabeza de martillo 5' corta eficazmente el transcrito, pero la ribozima HDV 3' corta de manera mucho menos eficaz. La primera banda (198 nucleótidos) es el transcrito sin cortar. La segunda banda (142 nucleótidos) es el fragmento de transcrito que contiene el ARNip, la ribozima HDV 3', el conector AT y la secuencia de empaquetamiento de MS2. El fragmento de ribozima cabeza de martillo 5' (56 nt) está presente pero no se tiñó bien.

[0112] Estos resultados indican que la ribozima cabeza de martillo 5' en el constructo T7-Rz3 corta el modelo como se esperaba, sin embargo la ribozima HDV 3' en el transcrito T7-Rz3 no estaba activa, o solo poco activa con respecto a la ribozima cabeza de martillo. En cambio, en ausencia de la ribozima cabeza de martillo 5', la ribozima HDV presente en el constructo T7-Rz2 produjo un fragmento de ARNip debidamente extirpado. Así, el diseño básico de T7-Rz2 es capaz de producir ARNip a partir de una molécula de ARN más grande que lleva una secuencia de empaquetamiento. La presencia de la secuencia de empaquetamiento en tal transcrito significa que el constructo se puede empaquetar eficazmente y purificar en VLP como se describe en los ejemplos precedentes.

Ejemplo R

Producción de cápsidas de MS2 que encapsidan ARNhc dirigidos a proteína verde fluorescente (GFP) y ribozima HDV unida a horquilla de ARN de longitud 19 MS2.

[0113] Para probar si un ARN activo similar a los descritos en el ejemplo Q está en realidad empaquetado en una VLP in vivo se realizó el experimento siguiente.

[0114] Constructo T7-Rz6 (SEQ ID N.°: 7) que codifica un sitio de restricción BamHI, un promotor T7 que impulsa la expresión de una horquilla de ARNhc dirigida contra la GFP, seguido de ribozima del virus de la Hepatitis Delta (HDV) diseñada para escindir el extremo 3' de la horquilla de ARNip, y un de longitud 19 de ARN específico de MS2 que codifica la secuencia de empaquetamiento necesaria para incorporar el constructo en una VLP seguido de un sitio de restricción Ncol se clonó como un fragmento de restricción BamHI-Bspl9I en el plásmido pACYC184.

[0115] La proteína de cápsida requerida para la producción de cápsidas de MS2 se expresa a partir de un plásmido que comprende una secuencia de ADN (SEQ iD N.°: 2), que codifica el MS2 gen de proteína de cápsida clonado en pDEST14 a través de métodos de recombinación Gateway (Life Technologies).

[0116] Células de E. Coli químicamente competentes One Shot BL21/DE3(Life Technologies) fueron transformadas con los 2 plásmidos que seleccionan transformantes resistentes al cloranfenicol y la ampicilina. Para la producción de VLP estos transformantes fueron cultivados a 37 °C en 32 mL de medio LB que contiene tanto ampicilina como cloranfenicol. Cuando la densidad de cultivo alcanzó una OD (600 nm) de 0,8, se añadió entonces IPTG (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 1 mM. Las células fueron recogidas 4 horas después de la inducción por centrifugación a 3,000 g y 4 °C durante 40 min. El ARN fue extraído de VLP purificadas como se describe en el ejemplo P, y se analizó como se describe en el ejemplo Q. Se observó una banda del mismo peso molecular que se esperaba para el ARNhc codificado, como se observa en el carril ARNhc en la figura 17.

[0117] El transcrito T7-Rz6 empaquetado intacto tiene aproximadamente 150 bases de largo. La molécula escindida está diseñada para producir dos fragmentos, uno de aproximadamente 100 bases que comprende las secuencias de ribozima y de empaquetamiento y el otro el ARNhc intacto de aproximadamente 50 bases. FIG. 17 ilustra que la molécula de ARN sin cortar parece tener casi 300 bases de longitud. Sin embargo, hay una estructura secundaria potencial considerable en esta molécula, y el mayor peso molecular aparente es posiblemente debido a tales estructuras.

Ejemplo S

Producción de tránscritos codificante para ARNhc y ribozimas cabeza de martillo largas unidas a horquilla de ARN de longitud 19 de MS2

[0118] Varios experimentos de producción de cápsidas de MS2, donde cada una encapsida cargas diferentes, se realizan como se describe en el ejemplo O. La intención de estos experimentos es determinar si ribozimas cabeza de martillo modificadas se pueden modificar para escindir eficazmente moléculas de carga, a diferencia de la ribozima cabeza de martillo de T7-Rz3 en el ejemplo Q. Los resultados (no mostrados) indican que mejorar la estabilidad termodinámica de la ribozima debidamente plegada respecto al plegamiento del ARNhc diana mejora la eficacia de escisión de la ribozima. Una manera potencial de mejorar la estabilidad de la ribozima es aumentar la región de la ribozima que hibrida con la porción diana de la molécula de carga, tales constructos son denominados cabezas de martillo largas. Secuencias ejemplares de ribozimas cabeza de martillo largas se presentan en los ejemplos posteriores.

Ejemplo T

Producción de cápsidas de MS2 con un transcrito codificante de las dos cadenas de un ARNip dirigido a la GFP cada una flanqueada por una ribozima cabeza de martillo larga localizada en sus extremos 5’ y ribozimas HDV en sus extremos 3’, unidas a una horquilla de ARN de longitud 19 de MS2.

[0119] La cápsida de MS2 puede contener moléculas de ARN al menos tan largas como de 3600 bases, el tamaño del genoma del bacteriófago MS2. Así, moléculas de carga heterólogas mucho más largas se pueden empaquetar siempre y cuando contengan la secuencia de empaquetamiento necesaria para la encapsidación. Los ejemplos precedentes descritos aquí indican que los ARN activos con una combinación de una horquilla de ARNhc y ribozimas diseñadas para cortar precisamente la secuencia de ARNhc libre de la molécula de carga total se pueden producir a partir de un único transcrito de ARN corto. Estos experimentos prueban si las cadenas individuales de ARNip se pueden escindir independientemente a partir de un único transcrito por múltiples ribozimas específicas.

[0120] Las cápsidas de MS2 son producidas in vivo a partir de un plásmido que codifica una proteína de cápsida de MS2 clonada en un plásmido pDEST14 (tecnologías vitales):

La secuencia de ADN T7-Rz8 (SEQ ID N.°: 8) codifica un sitio de restricción de BamHI, seguido de un promotor T7, seguido de una ribozima cabeza de martillo diseñada para escindir el extremo 5' de la cadena sentido de un ARNip dirigido contra la EFGP (donde EGFP es proteína verde fluorescente mejorada), seguido de la cadena sentido de un ARNip dirigido contra la EGFP, seguido de una ribozima HDV diseñada para escindir el extremo 3' de la cadena sentido del ARNip, seguido de un separador AT y luego una ribozima cabeza de martillo diseñada para disociar el extremo 5' de la cadena antisentido de un ARNip dirigida contra la EGFP, seguido de la cadena antisentido del ARNip, seguido de una ribozima HDV diseñada para escindir el extremo 3' del ARNip antisentido, seguido de un separador de 7 bases y la secuencia de empaquetamiento de MS2 y un sitio de restricción Ncol. T7-Rz8 fue clonado en el plásmido pACYC 184 como un fragmento de restricción BamHI-Ncol y un terminador de la transcripción posteriormente insertado en el extremo 3' de T7-Rz8.

[0121] Se transformaron células de E. Coli químicamente competentes One Shot BL21/DE3(Life Technologies) con los 2 plásmidos, uno que expresa la proteína de cápsida y el otro que contiene T7-Rz8 y se seleccionan los transformantes resistentes al cloranfenicol y la ampicilina. Para la producción de la cápsida estos transformantes se cultivaron a 37 °C en 750 mL de medio l B que contenía tanto ampicilina como cloranfenicol. Cuando la densidad del cultivo alcanzó una OD (600 nm) de 0,8, se añadió IPTG (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 1 mM. Las células fueron recogidas 4 horas después de la inducción por centrifugación a 3,000 g y se mantuvieron a 4 °C durante 40 min. Las células se lisan y las VLP se recuperan por los procedimientos descritos en los ejemplos precedentes y el ARN se analiza como en los ejemplos Q y R. Tal análisis indica que el ARN activo es producido a partir del a Rn empaquetado eficazmente por combinaciones de las ribozimas cabeza de martillo larga y HDV.

Ejemplo U

Las ribozimas cabeza de martillo flanqueantes largas cortan en una extensión significativamente mayor durante las transcripciones in vitro que las ribozimas cabeza de martillo flanqueantes cortas

[0122] Los constructos T7-Rzl (SEQ ID N.°: 9) y T7-Rz4 (SEQ ID N.°: 10) fueron usados como modelos para la transcripción in vitro. T7-Rzl comprende ribozimas comunes, es decir, con tallos que hibridan la diana de ARNip de menos de 6 nucleótidos de hibridación. T7-Rz4 comprende ribozimas flanqueantes con tallos de larga longitud que hibridan el ARNip que se va a cortar, es decir, tallos con más de 6 nucleótidos de hibridación.

[0123] El constructo T7-Rzl codifica un promotor T7, una ribozima cabeza de martillo (HH) diseñada para escindir el extremo 5' de una horquilla de ARNip con 5 nucleótidos complementarios a la diana de ARNip, una horquilla de ARNip, una ribozima h H diseñada para escindir el extremo 3' de la horquilla de ARNip con 5 nucleótidos complementarios a la diana de ARNip, y un sitio de restricción Ncol:

El constructo T7-Rz4 codifica un promotor T7, una ribozima HH diseñada para escindir el extremo 5' de una horquilla de ARNip con 12 nucleótidos complementarios a la diana de ARNip, una horquilla de ARNip, una ribozima HH diseñada para cortar su extremo 3' de la horquilla de ARNip con 23 nucleótidos complementarios a la diana de ARNip:

Se realizaron experimentos y análisis de transcripción in vitro con estos constructos de una manera similar a los descritos en el ejemplo Q. Como se muestra en la figura 18, los resultados obtenidos con el constructo T7-Rzl fueron consistentes con la observación de que las ribozimas con secuencias complementarias cortas cortan mal, mientras que los resultados obtenidos con el constructo T7-Rz4 son consistentes con la hipótesis de que las ribozimas con secuencias complementarias más largas cortan la diana más eficazmente.

Ejemplo V

Producción de VLP usando un transcrito que codifica para el ARNhc contra la EGFP flanqueada por una ribozima cabeza de martillo larga en su extremo 5’ y otra ribozima cabeza de martillo larga unida a la horquilla de ARN de longitud 19 de MS2 en su extremo 3.

[0124] La producción de cápsidas de MS2 se realizó de la siguiente manera. La SEQ ID N.°: 2, que codifica la proteína de cápsida de MS2, se clonó en el plásmido pDEST14 (tecnologías vitales):

La secuencia de ADN para T7-Rz4 se clonó en el plásmido pACYC184 como un fragmento BamHI-HindIII. Un terminador de la transcripción se clonó posteriormente en el extremo 3' del constructo T7-Rz4.

[0125] Se transformaron células de E. Coli químicamente competentes One Shot BL21/DE3(Life Technologies) con los 2 plásmidos, uno capaz de expresar cápsida proteína y el otro que contiene T7-Rz4 y seleccionando los transformantes resistentes al cloranfenicol y la ampicilina. Para la producción de VLP estos transformantes fueron cultivados a 37 °C en 750 mL de medio LB que contiene tanto ampicilina como cloranfenicol. Cuando la densidad de cultivo alcanzó una OD (600 nm) de 0,8, se añadió IPTG (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 1 mM. Las células se recogieron 4 horas después de la inducción por centrifugación a 3,000 g y 4 °C durante 40 min. Se tomó una muestra antes de la inducción y en el momento de la recogida para el análisis. Se lisaron las muestras y las VLP se purificaron como se describe en el ejemplo O.

[0126] El ARN encapsidado en las VLP purificadas se extrajo utilizando el reactivo TRIzol® según el protocolo suministrado por el fabricante (Life Technologies, Grand Island, NY). El ARN obtenido se desnaturalizó calentando durante 5 min a 95 °C en formamida y se analizó por electroforesis en geles de TBE-Urea de poliacrilamida al 15 % desnaturalizante de Novex® (tecnologías vitales) se corren a 70 °C. Las bandas de ARN se visualizaron usando 0,5 |jg de bromuro de etidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por mL de solución acuosa. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 19, el carril 1 es una serie de patrones moleculares. El carril 2 muestra un ARNhc químicamente sintetizado de 49 nucleótidos de largo y el carril 3 es el ARN recuperado de las VLP.

Ejemplo W

Las VLP que comprenden cápsidas de MS2 obtenidas en el ejemplo V son resistentes a la proteasa de Engyodontium album, Bacillus licheniformis, la pepsina de la mucosa gástrica porcina y la papaína del látex de la papaya.

[0127] Las VLP que comprenden cápsidas de MS2 obtenidas de 250 mL de cultivo y purificadas como se ha descrito en el ejemplo V se suspendieron en 400 jL de solución acuosa de CaCl220mM a pH 7,5.

[0128] Una alícuota de 66 jL de esta suspensión se diluyó a 0,25 mL con solución acuosa de CaCl²20 mM a pH 7.5 y se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína (Pierce® BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 3086 y 4656 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 1B y 6, respectivamente. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg ). Este conjunto de experimentos se usó como un control negativo.

[0129] Se diluyeron 2 jg de proteasa de Streptomyces griseus (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) a 0,25 mL con solución acuosa de CaCl²20 mM a pH 7,5 y se incubaron a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 361 y 324 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 1 y 7, respectivamente. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg ). Este conjunto de experimentos se usó como otro control negativo.

[0130] Se añadieron 2 jg de proteasa de Streptomyces griseus a otra alícuota de 66 jL de las VLP que comprenden suspensión de cápsidas de MS2, se diluyeron a 0,25 mL con solución acuosa de CaCl²20 mM a pH 7.5 y se incubaron a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGe después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 2940 y 3012 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 2 y 8, respectivamente. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg). Este conjunto de experimentos se usó para probar la estabilidad proteolítica frente a la proteasa de Streptomyces griseus de las cápsidas de MS2 que forman las VLP. Se observó menos de un 10 % de degradación.

[0131] Otra alícuota de 66 jL de las VLP que comprenden suspensión de cápsidas de MS2, diluida a 0,25 mL con solución acuosa de CaCl²20mM a pH 7,5 se sometió a tres ciclos de calentamiento a 95 °C durante 10 minutos y enfriamiento en hielo húmedo durante 10 min para conseguir el desmontaje de las VLP. Luego se añadieron 2 jg de proteasa de Streptomyces griseus a esta suspensión y se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 2601 y 3033 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 3 y 9, respectivamente. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg ). Las partículas desmontadas fueron degradadas en una extensión significativa por proteasa de Streptomyces griseus. Este conjunto de experimentos se usó como un control positivo.

[0132] Se añadieron 2 jg de proteasa de Streptomyces griseus disueltos en 0,002 mL de solución acuosa de CaCl²20 mM a pH 7,5 a 0,248 mL de lisado de celular bacteriano obtenido a partir de 41 mL de cultivo celular del Ejemplo V y se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 3192 y 4837 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 4 y 10, respectivamente. El último carril de la figura 20, marcado con una L, muestra el lisado celular bacteriano no tratado. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg ). Más del 90 % de las proteínas distintas a proteína de cápsida de MS2 fueron degradadas por la proteasa de Streptomyces griseus. Este conjunto de experimentos se usó como otro control positivo.

[0133] Este conjunto de cinco experimentos demuestra que las cápsidas de MS2 que forman las VLP de esta divulgación son resistentes a la proteólisis por proteasa de Streptomyces griseus.

[0134] Se diluyeron 2 jg de proteasa de Bacillus licheniformis (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) a 0,25 mL con solución acuosa de acetato de Na 10 mM y acetato de Ca 5 mM a pH 7,5 y se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 976 y 1003 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 2B y 7B, respectivamente. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg ). Este conjunto de experimentos se usó como otro control negativo.

[0135] Se añadieron 2 jg de proteasa de Bacillus licheniformis a otra alícuota de 66 jL de las VLP que comprenden suspensión de cápsidas de MS2, se diluyeron a 0,25 mL con solución acuosa de acetato de Na 10 mM y acetato de Ca 5 mM a pH 7,5 y se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 3144 y 3727 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 3B y 8B, respectivamente. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg). Este conjunto de experimentos se usó para probar la estabilidad proteolítica frente a la proteasa de Bacillus licheniformis de las cápsidas de MS2 que forman las VLP. Se observó menos de un 10 % de degradación.

[0136] Otra alícuota de 66 jL de las VLP que comprenden suspensión de cápsidas de MS2, diluida a 0,25 mL con solución acuosa de acetato de Na 10 mM y acetato de Ca 5 mM a pH 7,5 se sometió a tres ciclos de calentamiento a 95 °C durante 10 minutos y enfriamiento en hielo húmedo durante 10 min para desmontar las VLP. Se añadieron entonces 2 jg de proteasa de Bacillus licheniformis a esta suspensión y se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 1769 y 1785 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 4B y 9B, respectivamente. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg ). Las partículas desmontadas fueron degradadas por la proteasa de Bacillus licheniformis. Este conjunto de experimentos se usó como un control positivo.

[0137] Se añadieron 2 jg de proteasa de Bacillus licheniformis disueltos en 0,002 mL de solución acuosa de acetato de Na 10 mM y acetato de Ca 5 mM a 0,248 mL de lisado celular bacteriano obtenido a partir de 41 mL del cultivo celular del Ejemplo CC y se incubaron a 37 °C. Se tomaron muestras para la concentración de proteína y los análisis de SDS PAGE después de 1 hora y 4 horas de incubación. La concentración de proteína en estas 2 muestras fue 3696 y 4078 mg/L, respectivamente. Los análisis de SDS PAGE se muestran en la figura 20, carriles 6B y 10B, respectivamente. El último carril de la FIG 21, marcado con una L, muestra el lisado celular bacteriano no tratado. La misma cantidad de proteína fue cargada en cada carril (4 jg ). Más del 90 % de las proteínas distintas a proteína de cápsida de MS2 fueron degradadas por la proteasa de Bacillus licheniformis. Este conjunto de experimentos se usó como otro control positivo.

[0138] Este conjunto de cuatro experimentos demostró que cápsidas de MS2 que forman las VLP de esta divulgación son resistentes a la proteólisis por la proteasa de Bacillus licheniformis.

[0139] Tres conjuntos adicionales de experimentos equivalentes demostraron que las cápsidas de MS2 que forman las VLP de esta divulgación son resistentes a la proteólisis por cualquiera de las siguientes tres proteasas: proteinasa K de Engyodontium álbum, pepsina de la mucosa gástrica porcina (número CAS 9001-75-6) y papaína de látex de la papaya (número CAS 9001-73-4) (todo proveniente de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cada proteasa se usó según las instrucciones del fabricante. La proteinasa K se usó a pH 7,5, la pepsina se usó a pH 1,6 y la papaína se usó a pH 6,6.

Ejemplo X

Composiciones con ARN largo

[0140] La capacidad para empaquetar moléculas de ARN monocatenario largo, hasta aproximadamente 3600 nucleótidos en una cápsida de MS2, proporciona potencialmente un método simple y eficiente para la producción de moléculas de ARN bicatenario tal como miARN, o sustratos para sistemas de procesado del ARN tal como CRISPR (en bacterias), DICER (en animales) o por proteínas similares a Dicer (en plantas). En un método, cada cadena de la molécula de ARN bicatenario largo deseado es producida como un transcrito que contiene una secuencia de empaquetamiento y una ribozima diseñada para cortar la cadena larga en un punto preciso, para separar la secuencia de ARN deseado de las secuencias de empaquetamiento y de ribozima. En otro método, no se requiere ninguna ribozima y las secuencias complementarias permanecen unidas a la secuencia de empaquetamiento. Por los métodos descritos en estos ejemplos cada cadena se puede empaquetar por separado y mezclar cantidades molares purificadas e iguales de cada VLP purificada que contiene una de las cadenas y recuperar el ARN monocatenario de cada VLP e hibridar para formar el ARN bicatenario deseado. En un método, la ribozima de cada molécula de ARN es específica a su propia cadena y por lo tanto escinde solo su diana cognada. Se deja que las cadenas de ARN complementarias largas se hibriden y se recuperen de la mezcla por métodos físicos o por tratamiento con ribonucleasa A, que degrada preferentemente ARN monocatenarios tales como las secuencias de ribozima y de empaquetamiento. En el caso de las moléculas de ARN sin ribozimas, las secuencias de empaquetamiento seguirán siendo monocatenarias después de que se hayan hibridado las secuencias complementarias y se puedan eliminar por tratamiento con ribonucleasa A.

[0141] Para demostrarlo, un inserto de ADN (SEQ ID N.°: 11) codificante para un sitio de restricción de BamHI, seguido de un promotor de la polimerasa T7 que impulsa la expresión de un ARN de cadena sentido largo diseñado para producir ARNip dirigido contra la arginina quinasa de Anasa tristis (que se conoce comúnmente como chinche de calabacín, una plaga de insectos agrícola importante), seguido de una secuencia de empaquetamiento de MS2 de alta afinidad y un terminador T7 se clona en pACYC184.

[0142] De forma similar, un inserto de ADN (SEQ ID N.°: 12) codificante para un promotor de la polimerasa T7 que impulsa la expresión de un ARN de cadena antisentido largo diseñado para producir ARNip dirigido contra la arginina quinasa de Anasa tristis, seguido de una secuencia de empaquetamiento de MS2 de alta afinidad y un terminador T7 se clona también en pACYC184.

[0143] Cada plásmido se transforma por separado en la cepa de E. coli BL21/DE3 que contiene un plásmido que expresa la proteína de cápsida de MS2 del promotor T7 de pDEST14 y se cultivan cultivos de cada una, la polimerasa T7 se induce por IPTG, las células se incuban durante un periodo adicional y las VLP se recuperan como se describe en los ejemplos precedentes. Se combinan cantidades iguales de las VLP de cada preparación y las moléculas de carga de ARN se recuperan como se describe en el ejemplo P.

[0144] Las moléculas de ARN sentido y antisentido se calientan a una temperatura aproximadamente igual o superior a la temperatura de fusión calculada del ARN bicatenario deseado. La mezcla acuosa se enfría luego a 10 °C. Se realizan ciclos adicionales de calentamiento y enfriamiento a las mismas temperaturas, para conseguir una hibridación más completa entre las cadenas sentido y antisentido. El ARN bicatenario se puede tratar con ribonucleasa A que degrada preferentemente ARN monocatenario para eliminar las secuencias de empaquetamiento no hibridadas y cualquier secuencia de ribozima que pueda estar presente.

[0145] En un experimento de prueba dirigido a matar insectos usando tal método, se diseña una VLP de control en la que una secuencia de ARN aleatoria se usó en un experimento de control. En un experimento de prueba, al menos 10 insectos se inyectan con el ARN dirigido a arginina quinasa y, en un experimento de control, el mismo número de insectos se inyectan con el ARN aleatorio. Siete (7) días después de la inyección, un número significativamente más alto de insectos mueren en el experimento de prueba que en el experimento de control.

Ejemplo Y

Composiciones con ARN abultado largo

[0146] Aunque la cápsida de MS2 es capaz de encapsidar aproximadamente 3,600 nucleótidos de ARN monocatenario, la capacidad para encapsidar directamente ARN bicatenario está muy limitada, ya que tales ARN tienen un eje relativamente rígido a lo largo de la hélice bicatenaria y las hélices que exceden el diámetro interior de la cápsida no pueden empaquetarse de manera eficaz. Sin embargo, colocando estratégicamente desapareamientos (abultamientos) a lo largo de la longitud de la secuencia complementaria, ARN bicatenario de longitudes más largas que el diámetro interior de la cápsida se puede empaquetar.

[0147] Para demostrar esto, se contruyó el pACYC184 con ADN con la SEQ ID N.°: 13. La SEQ ID N.°: 13 codifica un promotor T7 que impulsa la expresión de un modelo de ADN que codifica variantes de las cadenas sentido y antisentido largas de los precursores de ARNip dirigido a arginina quinasa del ejemplo X, dispuestas de manera que estén separadas por una secuencia no complementaria de 25 bases para permitir que la molécula forme un bucle sobre sí misma de modo que las secuencias sentido y antisentido complementarias pueden hibridar entre sí. El constructo incluye también una secuencia de empaquetamiento, localizada en el extremo 5' de la secuencia transcrita, y una ribozima HDV capaz de escindir el modelo para eliminarse a sí misma y las secuencias terminadoras en dirección hacia el extremo 3'. Ya que la cadena antisentido de la molécula hibridada es el agente activo para la inhibición de ARNip del ARN mensajero de la arginina quinasa del huésped diana, la cadena sentido se modifica de modo que se añaden de 1 a 3 nucleótidos consecutivos cada 19 a 28 nucleótidos a la cadena de ARN sentido de modo que dejen de ser perfectamente complementarios a la secuencia antisentido. Tales regiones abultadas parecen impartir suficiente flexibilidad a la estructura general para que todo el transcrito de ARN se pueda empaquetar dentro de una cápsida. Además, el ARN bicatenario (abultado) es más resistente a la degradación por ribonucleasa A que el ARN monocatenario. De manera importante, un constructo similar que carezca de los desapareamientos de 1 a 3 bases cada 19 a 28 bases no se empaquetará de manera eficaz.

[0148] El plásmido se transforma en la cepa de E. coli BL21/DE3 que contiene un plásmido que expresa la proteína de cápsida de MS2 del promotor T7 de pDEST14 y se cultivan cultivos a una densidad adecuada, se induce la polimerasa T7 por IPTG, las células se incuban durante un periodo adicional y las VLP se recuperan como se describe en los ejemplos precedentes. El ARN se extrae de las VLP como se describe en el ejemplo P.

[0149] Las moléculas de ARN se calientan a una temperatura aproximadamente igual a o superior a la temperatura de fusión calculada de la región bicatenaria deseada del ARN. La mezcla acuosa se enfría luego a 10 °C. Se pueden realizar ciclos adicionales de calentamiento y enfriamiento a las mismas temperaturass, para conseguir una hibridación más completa entre las cadenas sentido y antisentido. El ARN bicatenario abultado se puede tratar con ribonucleasa A que degrada preferentemente ARN monocatenario para eliminar las secuencias de empaquetamiento no hibridadas y cualquier secuencia de ribozima que puede estar presente.

[0150] En un experimento de prueba dirigido a matar insectos usando tal método, se diseñó una VLP de control donde se usó una secuencia de ARN abultado complementaria aleatoria en un experimento de control. En un experimento de prueba, se inyecta a al menos 10 insectos el ARN abultado dirigido a arginina quinasa y, en un experimento de control, se inyectan al mismo número de insectos el ARN abultado aleatorio. Siete (7) días después de la inyección, un número significativamente más alto de insectos mueren en el experimento de prueba que en el experimento de control.

Ejemplo Z

Composiciones con múltiples ARNhc

[0151] Se expresó la siguiente cadena de ARN: 5'-PAC-ARNhc-ribozima-3', donde PAC es la secuencia de empaquetamiento de MS2 de alta afinidad y ARNhc es ARN ARN-bucle-antisentido. El ARN sentido es una cadena de ARN compuesta por de 19 a 24 nts con la misma secuencia que una sección de una cadena de ARN endógena seleccionada para la escisión a través de ARNi. RNA antisentido es una cadena de ARN compuesta por de 21 a 26 nts con una secuencia consistente en el complemento inverso de una sección de una cadena de ARN endógena seleccionada para la escisión. El ARN resultante se empaqueta en cápsidas de MS2 para formar una VLP.

[0152] En algunos casos, se diseñan cadenas de RNA antisentido para dirigirse, a través de ARNi, a cadenas de ARN endógenas esenciales para la supervivencia del huésped que toma tales ARN dentro de las VLP. Por ejemplo, en un caso, se diseña ARN antisentido de 21 nucleótidos de largo para dirigirse a una sección del ARNm de la arginina quinasa de Anasa tristis en un experimento de prueba dirigido a matar tales insectos usando tal VLP de prueba. Se realiza un experimento de VLP de control en el que se usa un ARN de 21 nucleótidos de largo de secuencia aleatoria. En un experimento de prueba, más de 10 insectos se inyectan con la VLP de prueba. En un experimento de control, el mismo número de insectos se inyectan con la VLP de control. Siete días después de la inyección, un número significativamente más alto de insectos mueren en el experimento de prueba que en el experimento de control.

[0153] El inserto de ADN que codifica para el transcrito descrito aquí (SEQ ID N.°: 14) incluye una secuencia de empaquetamiento de MS2 de alta afinidad seguida del ARNip de cadena sentido, un bucle, el ARNip de cadena antisentido y una ribozima HDV:

Otra forma de realización de tal constructo de ARN (SEQ ID N.°: 15) incluye una secuencia de empaquetamiento de MS2 de alta afinidad seguida de un separador AT, el ARNip de cadena sentido dirigido contra una primera secuencia de ARNm del huésped, un bucle, el ARNip de cadena antisentido dirigido contra la primera secuencia de ARNm del huésped, un segundo separador AT, otro ARNip de cadena sentido dirigido contra una segunda secuencia de ARNm del huésped, un bucle, el ARNip antisentido dirigido contra la segunda secuencia de ARNm del huésped, otro separador AT y una ribozima HDV. Es evidente para una persona experta en la materia que las secuencias diana de ARNm del huésped primera y segunda pueden ser secuencias específicas para diferentes partes del mismo ARNm, o para partes de diferentes ARNm, o incluso para ARNm de diferentes organismos. En primer lugar, los ARNpi primero y segundo se pueden dirigir a diferentes secuencias de un gen transcrito único dentro de una única especie tal como la arginina quinasa de Anasa tristis. Alternativamente, los ARNpi primero y segundo se pueden seleccionar para separar genes transcritos en una única especie tal como dirigir el primer ARNip a la arginina quinasa de Anasa tristis y el segundo ARNip a la quitina sintasa de Anasa tristis. De forma similar, el primer ARNip puede dirigirse a la arginina quinasa (o la quitina sintasa, o algún otro gen esencial) de Anasa tristis mientras que el segundo ARNip se dirige al mismo gen en un huésped diferente tal como, por ejemplo, Acyrthosiphon pisum. Finalmente, los ARNpi primero y segundo pueden dirigirse a genes esenciales del huésped diferentes en huéspedes diferentes. Cada una de estas composiciones se pueden extender para abarcar muchos múltiplos de ARNpi encadenando juntas muchas copias del separador AT-ARNip de cadena sentido-bucle-ARNip de cadena antisentido-motivo de ribozima y usarse para controlar una o más especies de plagas de insectos con una única preparación de VLP.

Ejemplo AA

Composiciones con ARNhc semi-en bucle

[0154] En algunos casos, una mejora significativa en el rendimiento de empaquetamiento se obtiene expresando y empaquetando modelos de ARN que contienen múltiples secuencias de empaquetamiento de MS2. Un ejemplo de tal constructo, la SEQ ID N.°: 16, incluye una secuencia de empaquetamiento de MS2 seguida por una secuencia de ARNip de cadena sentido seguida de una secuencia corta en "semi bucle", seguida de una segunda secuencia de empaquetamiento de MS2 seguida de otro "semi bucle" seguido de la secuencia de ARNip antisentido. En esta disposición la escisión del "semi bucle" y la secuencia de empaquetamiento de MS2 se eliminan por DICER u otros sistemas de procesamiento en el organismo huésped diana.

[0155] En algunos casos, las cadenas de ARN antisentido se diseñan para dirigirse, a través de ARNi, cadenas de ARN endógenas esenciales para la supervivencia del huésped tomando una VLP que contiene tal ARN. Por ejemplo, en un caso, un ARN antisentido de 21 bases de largo se diseña para dirigirse a una sección del ARNm de la arginina quinasa de Anasa tristis en un experimento de prueba dirigido a matar tales insectos usando tal VLP de prueba. Se diseña una VLP de control en la que un ARN antisentido de simulación de 21 bases de largo de secuencia de ARN aleatoria se usa en un experimento de control. En un experimento de prueba más de 10 insectos se inyectan con tal VLP de prueba. En un experimento de control, el mismo número de insectos se inyecta con tal VLP de control. 7 días después de la inyección, un número significativamente más alto de insectos mueren en el experimento de prueba que en el experimento de control.

Ejemplo AB

Composiciones con ARNhc abultado y semi-en bucle

[0156] Un experto en la técnica reconocerá que las disposiciones descritas en la presente no son mutuamente excluyentes y se pueden combinar en varias configuraciones., por ejemplo, una configuración abultada de los ARN bicatenarios largos descritos en el ejemplo Y se pueden combinar con las múltiple secuencias de empaquetamiento de MS2 y/o la configuración de semi-bucle descrita en los ejemplos Z y AA. Tales configuraciones pueden o pueden no incluir ribozimas o pueden basarse solamente en funciones del huésped tales como CRISPR o DICER para procesar la molécula de carga. La característica unificadora de tales composiciones es que se pueden producir y empaquetar en VLP in vivo y purificarse fácilmente tratando lisados celulares con proteasas y otras enzimas tales como amilasas, lipasas y nucleasa para permitir la filtración o precipitación simples para purificar las VLP que contienen los ARN descritos aquí.

Ejemplo AC

Uso de VLP para la expresión de proteína

[0157] Los ejemplos precedentes se han enfocado en las composiciones y los métodos para silenciar o reducir la expresión génica del huésped diana a través de varias formas de a Rn í. Los ejemplos siguientes divulgan composiciones y métodos para aumentar la expresión génica en un organismo huésped diana por producción eficiente de ARN mensajeros usando VLP.

Expresión de proteína en bacterias (E. coli):

[0158] Un constructo diseñado para empaquetarse a sí mismo en cápsidas de MS2, y después de la transfección dirigida a expresar la EGFP en células de E. coli se representa en la SEQ ID N.°: 17. Este constructo de ADN incluye un sitio de restricción BamHI, un promotor T7 que impulsa la expresión de una variante de la secuencia de empaquetamiento de MS2 seguido de 10 bases de la región de la replicasa de MS2 donde la primera C se cambia a una G (para extender el tallo) seguidas por el extremo 5' del genoma del bacteriófago MS2 donde todos excepto las primeras 9 bases del gen de la maturasa al igual que toda la proteína de cápsida se han sustituido con la secuencia codificante de la EGFP, seguido de un separador de 15 bases, una segunda copia de la secuencia de empaquetamiento de MS2 y una ribozima HDV diseñada para escindir en su propio extremo 5' seguida de un sitio de restricción NotI. El constructo de ADN se puede clonar a través de los sitios BamHI y NotI en un plásmido compatible y transformarse en una célula huésped de E. coli BL21/DE3 que ya contiene un plásmido capaz de expresar cápsida de MS2 proteína (como se describe en los ejemplos precedentes). Las células se tratan con IPTG para inducir la transcripción por polimerasa T7 y producir v Lp que contienen el transcrito de 950 bases producido a partir de la SEQ ID N.°: 17. Las VLP se purifican por los métodos descritos en el ejemplo O.

[0159] Cuando se exponen cepas naive de E. coli a tales VLP, la absorción de las VLP y la traducción posterior de la molécula de carga que contiene la secuencia de EGFP se puede detectar por fluorescencia debido a la proteína de EGFP. Aquellas personas expertas en la técnica reconocerán que otros genes de interés se pueden usar en lugar de la EGFP y que la expresión de estos genes en cualquier bacteria que toma las VLP que los contienen se puede demostrar por muchos métodos tal como el análisis de transferencia de Northern o por detección de las proteínas producidas a partir de tales genes por técnicas de transferencia de Western o por una actividad enzimática o de otro tipo específica de la proteína codificada por el gen de interés. En bacterias que no pueden tomar directamente v Lp de la cápsida de MS2, la carga de ARN de la VLP se puede aislar y transformar por separado en las bacterias diana por métodos estándar, ampliamente conocidos en la técnica.

Ejemplo AD

Uso de VLP para la expresión de proteínas en plantas

[0160] De una forma similar, las VLP capaces de dirigir la expresión génica en plantas se pueden construir basándose en el diseño de virus vegetales apropiados para contener el gen de interés al igual que una o más secuencias de empaquetamiento de MS2.

Plantas dicotiledóneas

[0161] En el caso de plantas dicotiledóneas, un constructo que incorpora las características del virus de la mancha anular del clavel italiano puede proporcionar una plataforma para dirigir la expresión génica. Tal constructo de ADN está representado por la SEQ ID n° 18, que incluye un sitio de restricción de BamHI seguido de un promotor T7 que impulsa la expresión de una secuencia de empaquetamiento de MS2 seguida de 10 bases de la región de la replicasa de MS2 donde la primera C se cambia a una G (para extender el tallo), seguidas de las primeras 77 bases del virus de la mancha anular del clavel italiano (n.° de acceso de GeneBank NC_003500.2) que contienen el adaptador 5' viral, seguidas de la secuencia codificante de la EGFP, seguida de las últimas 351 bases del genoma viral (empezando en la base 4410 de n.° de acceso de GeneBank NC_003500.2) que codifica el Estimulador de la traducción independiente de cap 3' (3' CITE), seguidos de un separador de 15 bases, una segunda copia de la secuencia de empaquetamiento de MS2 al igual que una ribozima HDV diseñada para escindirse en su propio extremo 5', seguida de un sitio de restricción Notl. El constructo de ADN se puede clonar a través de los sitios BamHI y Notl en un plásmido compatible y transformarse en una célula huésped de E. coli BL21/DE3 que ya contiene un plásmido capaz de expresar la cápsida de MS2 proteína (como se describe en los ejemplos precedentes). Las células transformadas se tratan con IPTG para inducir la transcripción por polimerasa T7 y producir VLP con el transcrito de 1,236 bases generado a partir de la SEQ ID N.°: 18. Las VLP se purifican por los métodos descritos en el ejemplo O.

[0162] Cuando se exponen las plantas dicotiledóneas a tales VLP, la absorción de las VLP y la traducción posterior de la molécula de carga que contiene la secuencia de EGFP se puede detectar por fluorescencia debido a la presencia de la proteína de EGFP expresada. Aquellas personas expertas en la técnica reconocerán que se pueden usar otros genes de interés en lugar de la EGFP y que la expresión de estos genes en cualquier planta dicotiledónea que toma las VLP que los contienen se puede demostrar por muchos métodos, tal como el análisis de transferencia de Northern o por detección de las proteínas producidas a partir de tales genes por técnicas transferencia de Western o por una actividad enzimática o de otro tipo específica de la proteína codificada por el gen de interés. En plantas dicotiledóneas que no pueden tomar directamente VLP de la cápsida de MS2, la carga de ARN de la VLP se puede aislar y transformar por separado en las plantas diana por métodos estándar, ampliamente conocidos en la técnica.

Plantas monocotiledóneas

[0163] En el caso de plantas monocotiledóneas, un constructo que incorpora las características del virus de la mancha anular del clavel italiano al igual que el 3'-CITE del virus del estriado necrótico del maíz puede proporcionar una plataforma para dirigir la expresión génica. Tal constructo de ADN está representado por la SEQ iD N.°: 19, que incluye un sitio de restricción de BamHI seguido de un promotor T7 que impulsa la expresión de una secuencia de empaquetamiento de MS2 seguida de 10 bases de la región de la replicasa de MS2 donde la primera C se cambia a una G (para extender el tallo), seguidas de las primeras 77 bases del virus de la mancha anular del clavel italiano (n.° de acceso de GeneBank NC_003500.2) que contienen el adaptador 5' viral, seguidas de la secuencia codificante de la EGFP, seguida de 112 bases de la secuencia 3'-CITE del virus del estriado necrótico del maíz (correspondiente a las bases 3892 - 4003 de n.° de acceso de GeneBank NC_007729.1 como se describe por Nicholson, et al. (2013) Journal of Virology 87(3): 1872-83), seguidas de las últimas 87 bases del genoma del virus de la mancha anular del clavel italiano (bases 4674 - 4760 del n.° de acceso de GeneBank NC_003500,2), seguidos de un separador de 15 bases, una segunda copia de la secuencia de empaquetamiento de MS2 al igual que una ribozima HDV diseñada para escindirse en su propio extremo 5', seguida de un sitio de restricción Notl. El constructo de ADN se puede clonar a través de los sitios BamHI y Notl en un plásmido compatible y transformarse en una célula huésped de E. coli BL21/DE3 que ya contiene un plásmido capaz de expresar la cápsida de MS2 proteína (como se describe en los ejemplos precedentes). Las células transformadas se tratan con IPTG para inducir la transcripción por polimerasa T7 y producir VLP con el transcrito de 1,084 bases generadas a partir de la SEQ ID N.°: 19. Las VLP se purifican por los métodos descritos en el ejemplo O.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Partícula similar a un virus (VLP) que comprende:

- una cápsida, que muestra resistencia a la hidrólisis catalizada por al menos una hidrolasa que actúa en los enlaces peptídicos cuando la cápsida se pone en contacto con la hidrolasa,

- una molécula de carga heteróloga, donde dicha molécula comprende una molécula de ARN bicatenario de más de 100 pares de bases de nucleótidos y una secuencia de empaquetamiento de cápsida,

donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende además más de una región complementaria, donde cada una de dichas regiones complementarias comprenden:

(a) una única secuencia de ARN corto de cadena sentido o múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas, inmediatamente seguidas de

(b) una secuencia de ARN no complementaria capaz de formar un bucle, inmediatamente seguida de (c) una única secuencia de ARN corto de cadena antisentido complementaria a la secuencia de ARN corto de cadena sentido o múltiples secuencias de ARN corto de cadena antisentido complementarias a las múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas

donde las regiones complementarias están dispuestas de manera contigua, donde, si la región complementaria comprende múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas, las múltiples secuencias de ARN corto de cadena sentido encadenadas se enlazan por 1 a 3 nucleótidos no complementarios para formar ARN abultado, y donde si la región complementaria comprende una única secuencia de ARN corto de cadena sentido, la única secuencia de ARN corto de cadena sentido se modifica de modo que 1 a 3 nucleótidos consecutivos no complementarios se añaden cada 19 a 28 nucleótidos para formar ARN abultado.

2. VLP según la reivindicación 1, donde la secuencia de ARN capaz de formar un bucle comprende una o más ribozimas.

3. VLP según la reivindicación 1 o 2, donde dicha VLP comprende la proteína de la cápsida viral del enterobacteriófago MS2 (SEQ ID NO:3).