ES2846881T3 - Moléculas que se dirigen al sistema de secreción de tipo III - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión aislada que se une a al menos una proteína de punta en V bacteriana del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas, en donde la proteína de punta en V del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas es PcrV de Pseudomonas aeruginosa; en donde la proteína de fusión comprende una primera proteína de unión a la proteína de punta en V (VPBP1) y una segunda proteína de unión a la proteína de punta en V (VPBP2); en donde la VPBP1 y la VPBP2 se unen cada una a un epítopo diferente en la misma proteína de punta en V, en donde las VPBP son fragmentos de anticuerpos de dominio único (sdAb), y en donde la proteína de fusión inhibe la translocalización funcional de las moléculas efectoras a través de membranas celulares diana.
Description
DESCRIPCIÓN
Moléculas que se dirigen al sistema de secreción de tipo III
Campo
La presente divulgación se refiere en general a moléculas que se unen específicamente a proteínas de punta en V bacterianas del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa. Más específicamente, la presente divulgación se refiere a moléculas que bloquean o de otra manera inhiben la inyección de moléculas efectoras en células diana. Las moléculas de la presente divulgación son monoespecíficas o multiespecíficas y pueden unirse a su(s) antígeno(s) diana de una manera monovalente o multivalente. En algunas realizaciones, estos anticuerpos pueden ser combinados con un componente que se dirige a la superficie bacteriana, uniéndose a la proteína de Pseudomonas, OprI. La divulgación también se refiere generalmente a moléculas que se unen específicamente a proteínas de la superficie celular bacteriana tales como Oprl, y a métodos de uso de estas moléculas en varias indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o profilácticas. Antecedentes
Las proteínas de punta en V de Pseudomonas aeruginosa (PcrV) son componentes esenciales del sistema de secreción de tipo III bacteriano (T3SS) que es capaz de inyectar moléculas efectoras tóxicas en células eucariotas. Las proteínas de punta en V están ubicadas en el extremo terminal del aparato T3SS y se piensa que la oligomerización es necesaria para la translocalización funcional de las moléculas efectoras a través de membranas de células diana.
Oprl es una lipoproteína de la membrana exterior en Pseudomonas aeruginosa y otras especies de Pseudomonas. Oprl es altamente conservada en cepas de P. aeruginosa y, por lo tanto, representa un candidato excelente para el direccionamiento a la superficie celular de bacterias Pseudomonas.
En consecuencia, existe una necesidad de composiciones y terapias dirigidas a proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas y componentes de la superficie celular tales como Oprl.
El documento WO 2013/070615 A1 se refiere a "terapias de combinación que comprenden moléculas de unión a Psl y PcrV anti-Pseudomonas".
El documento US 2011/165172 A1 se refiere a "métodos de tratamiento de pacientes que tienen una infección por Staphylococcus donde el paciente también tiene un bajo nivel de Pseudomonas aeruginosa".
El documento WO 2014/074528 A2 se refiere al "uso de moléculas de unión a Psl y PcrV anti-Pseudomonas y composiciones relacionadas con la prevención y el tratamiento de la infección por Pseudomonas".
Hiromi Sato et al, Plos One, 6 (3), e18356 (2011) se refiere a "proteínas de punta de aguja modificadas PcrV" y "al control de la secreción de tipo III e intoxicación por Pseudomonas aeruginosa".
R. Rahner et al, Infection, 18 (4), 242-245 (1990) se refiere a la "protección de ratones inmunodeprimidos contra la infección por Pseudomonas aeruginosa".
Sumario
La presente invención es como se define en las reivindicaciones. La presente invención y otros aspectos de la presente divulgación pueden entenderse mejor por referencia a la siguiente descripción.
La divulgación proporciona moléculas, p. ej., polipéptidos incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno, polipéptidos tipo anticuerpo, y/o polipéptidos de fusión, y composiciones que se unen a proteínas de punta en V bacterianas del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas, tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa, y/o proteínas de la superficie celular tales como la proteína Oprl de Pseudomonas aeruginosa, y métodos de preparación y uso de estas composiciones en varias indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o profilácticas. Las moléculas que se dirigen a la proteína de punta en V de la presente divulgación son monoespecíficas o multiespecíficas y pueden unirse a su(s) antígeno(s) diana de una manera monovalente o multivalente.
Estas moléculas son útiles para unirse y neutralizar o de otra manera inhibir al menos una actividad biológica de una o más proteínas de punta en V bacterianas del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas.
Pseudomonas aeruginosa y otras bacterias gramnegativas resistentes a fármacos son una principal preocupación de salud, causando infecciones adquiridas en la comunidad y nosocomiales. Las infecciones con dichas bacterias pueden ser graves y potencialmente mortales. Un factor de virulencia importante es el sistema de secreción de tipo 3
(T3SS). El T3SS de bacterias gramnegativas es responsable de la translocación de toxinas en células eucariotas, causando muerte celular y lisis, permitiendo así que la bacteria establezca una infección.
PcrV de Pseudomonas aeruginosa, es un ejemplo de una proteína de punta en V común a muchos T3SS bacterianos gramnegativos. La proteína de punta en V está ubicada en el extremo terminal del aparato T3SS y se piensa que la oligomerización es necesaria para la translocalización funcional de las moléculas efectoras a través de membranas de células diana. PcrV de P. aeruginosa se requiere para la inyección de moléculas efectoras (ExoS, ExoT, ExoU, y ExoY) en el citosol de células eucariotas, dando como resultado muerte celular y lisis. Se ha demostrado que PcrV de P. aeruginosa es un antígeno protector, sugiriendo que dirigirse a las proteínas de punta en V de numerosas bacterias gramnegativas proporcionará una opción terapéutica eficaz.
En algunas realizaciones, las moléculas que se dirigen a la proteína de punta en V son anticuerpos y moléculas tipo anticuerpo que se unen específicamente a proteínas de punta en V bacterianas gramnegativas del aparato del sistema de secreción de tipo 3 (T3SS) y bloquean la citotoxicidad hacia células eucariotas. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se dirige a la proteína de punta en V, referido como las proteínas de unión a la proteína de punta en V (VPBP) se derivan de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno incluyendo, por ejemplo, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab, anticuerpos de dominio único (sdAb), Vnar, o VHHs. En realizaciones preferidas, las VPBP son sdAb humanos o humanizados. Los fragmentos sdAb pueden derivarse de VHH, Vnar, dominios VH o VK modificados. Los VHH pueden ser generados a partir de anticuerpos solo de cadena pesada de camélidos. Los Vnar pueden ser generados a partir de anticuerpos solo de cadena pesada de peces cartilaginosos. Se han implementado varios métodos para generar sdAb monoméricos a partir de dominios VH y VK convencionalmente heterodiméricos, que incluyen ingeniería de interfaz y selección de familias de línea germinal específicas.
En otras realizaciones, las VPBP se derivan de proteínas de andamio no anticuerpo, por ejemplo, pero no se limitan a, proteínas de repetición de anquirina diseñadas (darpins), avimero, anticalina/lipocalinas, centirinas y finómeros. En realizaciones preferidas, la proteína de punta en V es o se deriva de PcrV de Pseudomonas aeruginosa, y la VPBP se une específicamente a PcrV. En algunas realizaciones, la VPBP es capaz de unirse a 2 o más VPBP de varias bacterias gramnegativas, incluyendo al menos PcrV de Pseudomonas aeruginosa. En algunas realizaciones, la VPBP se une a una proteína de punta en V de una sola especie bacteriana gramnegativa tal como PcrV de Pseudomonas aeruginosa. En algunas realizaciones, la VPBP se une a una proteína de punta en V de más de una especie bacteriana gramnegativa, incluyendo al menos PcrV de Pseudomonas aeruginosa y de este modo es considerada por tener una reactividad cruzada entre especies.
En algunas realizaciones, la molécula que se dirige a la proteína de punta en V es una proteína de fusión. Inesperadamente, se descubrió que mejorar la valencia de la VPBP mejoró considerablemente la eficacia de citoprotección de Pseudomonas aeruginosa tanto in vitro como in vivo. Y lo que es más sorprendente, se descubrió que el direccionamiento a dos epítopos distintos en PcrV con las VPBP distintas en una sola proteína de fusión multiespecífica daba como resultado incluso una protección aún mayor contra la citotoxicidad causada por Pseudomonas aeruginosa. El último hallazgo resultó válido, Incluso cuando la VPBP monoespecífica individual solo fue débilmente protectora. De hecho, se descubrió que cuando las VPBP que reconocen distintos epítopos en PCRV se incorporaron en una sola proteína de fusión, eran más potentes frente a la citoprotección en comparación con las proteínas de fusión que contenían VPBP que eran multivalentes con respecto al mismo epítopo en PCRV o a la combinación con dos proteínas de fusión que contenían VPBP monoespecíficas separadas cada una reconociendo un epítopo distinto en PCRV.
En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye proteínas de fusión que incorporan más de una VPBP y se refieren en el presente documento como multivalentes. En algunas realizaciones, las VPBP de la proteína de fusión reconocen el mismo epítopo en la proteína en V diana y se refieren en el presente documento como monoespecíficas-multivalentes. En otras realizaciones, las VPBP de la proteína de fusión reconocen distintos epítopos en la proteína en V diana y se refieren en el presente documento como multiespecíficas-multivalentes. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP incluye dos VPBPs y tiene una capacidad de unión bivalente hacia la proteína de punta en V diana. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP incluye tres VPBPs y tiene una capacidad de unión trivalente hacia la proteína de punta en V diana. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP incluye cuatro VPBPs y tiene una capacidad de unión tetravalente hacia la proteína de punta en V diana. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP incluye seis VPBPs y tiene una capacidad de unión hexavalente hacia la proteína de punta en V diana. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP incluye ocho VPBPs y tiene una capacidad de unión octavalente hacia la proteína de punta en V diana. En estas realizaciones, las VPBP incorporadas en la proteína de fusión de la presente divulgación pueden ser monoespecíficas o multiespecíficas.
Generalmente, las proteínas de fusión de la presente divulgación consisten en al menos dos o más VPBP vinculadas operativamente mediante un polipéptido enlazador. El uso de fragmentos sdAb como la VPBP específica dentro de la fusión de la presente divulgación tiene el beneficio de evitar el problema de desemparejamiento de cadena pesada:cadena ligera común a muchos enfoques de anticuerpo bi/multiespecíficos. Asimismo, las proteínas de
fusión de la presente divulgación evitan el uso de enlazadores largos necesarios para muchos anticuerpos biespecíficos. Es más, las proteínas de fusión de la presente divulgación son generalmente más pequeñas en tamaño (oscilando aproximadamente de 75 a 125 kDa) que un anticuerpo convencional. Este peso molecular reducido quizás permita una mejor penetración en el sitio de infección en comparación con anticuerpos convencionales.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación está compuesta por un único polipéptido. En otras realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación está compuesta por más de un polipéptido. Por ejemplo, en donde se incorpora un dominio de heterodimerización en la proteína de fusión para construir una proteína de fusión asimétrica. Por ejemplo, si se incorpora una región Fc de inmunoglobulina en la proteína de fusión, el dominio CH3 se puede utilizar como dominio de homodimerización, o la región de interfaz de dímero CH3 puede mutarse para permitir la heterodimerización.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene las VPBP en extremos opuestos. Por ejemplo, las VPBP se ubican tanto en la porción del extremo amino-terminal (extremo N-terminal) de la proteína de fusión como la porción de extremo carboxi-terminal (extremo C-terminal) de la proteína de fusión. En otras realizaciones, todas las VPBP residen en el mismo extremo de la proteína de fusión. Por ejemplo, las VPBP residen en las porciones de extremo amino- o carboxilo-terminal de la proteína de fusión.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión carece de una región Fc.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene una región Fc de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina es un isotipo IgG seleccionado entre el grupo que consiste en la subclase IgG1, subclase IgG2, subclase IgG3, y subclase IgG4.
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la misma es un isotipo IgG. Por ejemplo, la región Fc de inmunoglobulina de la proteína de fusión es de subclase IgG1 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
p a p e |l l |g|g p s v f l f p p k p k d t l m i s r t p e v t c w v d v s h e d p ev k f n w y v
DGVEVHNAKT KPREEQY|Ñ]ST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 1)
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la misma comprende una secuencia de polipéptidos de IgG1 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, numeración de Kabat) para evitar la glicosilación de la proteína de fusión, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se modifica en el aminoácido Leu235 (con recuadro, numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu235Glu (L235E) o Leu235Ala (L235A). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se modifica en el aminoácido Leu234 (con recuadro, numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu234Ala (L234A). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se altera en ambos aminoácidos 234 y 235, p. ej., Leu234Ala y Leu235Ala (L234A/L235A) o Leu234Val y Leu235Ala (L234V/L235A). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión carece de un aminoácido en una o más de las siguientes posiciones para reducir la unión del receptor Fc: Glu233 (E233, en negrita en SEQ ID NO: 1), Leu234 (L234), o Leu235 (L235). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se altera en Gly235 para reducir la unión del receptor Fc. Por ejemplo, en donde Gly235 se elimina de la proteína de fusión. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana se modifica en el aminoácido Gly236 para potenciar la interacción con CD32A, p. ej., Gly236Ala (G236A, con recuadro en SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 218 de SEQ ID NO: 1 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la proteína de fusión es de subclase IgG2 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQF[Ñ]STF RW SVLTW H QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 2)
En algunas realizaciones, la proteína de fusión o un fragmento inmunológicamente activo de la misma comprende una secuencia de polipéptidos de IgG2 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG2 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG2 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 217 de SEQ ID NO: 2 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la proteína de fusión es de subclase IgG3 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVQFKWYV
DGVEVHNAKT KPREEQY|Ñ]ST FRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNIFSCSVMH
EALHN[r]f TQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
En algunas realizaciones, el anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia de polipéptidos de IgG3 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana se modifica en el aminoácido 435 para extender la semivida, p. ej., Arg435His (R435H, con recuadro en SEQ ID NO: 3). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 218 de SEQ ID NO: 3 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la proteína de fusión es de subclase IgG4 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
PAPEF[l]gGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSQE DPEVQFNWYV
DGVEVHNAKT KPREEQF|Ñ]ST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP
SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH
EALHNHYTQK SLSLSLGK (SEQ ID NO: 4)
En algunas realizaciones, el anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia de polipéptidos de IgG4 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la región Fc de IgG4 humana se modifica en el aminoácido 235 para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu235Glu (L235E). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o
Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 218 de SEQ ID NO: 4 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para potenciar la unión a FcRn. Los ejemplos de mutaciones de Fc que potencian la unión a FcRn son Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S254t , T256E, respectivamente) (numeración de Kabat, Dall'Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514-23524), Met428Leu y Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159), Met252Ile, Thr256Asp, Met428Leu (M252I, T256D, M428L, respectivamente) o Met252Tyr, Met428Leu/Val (M252Y, M428L/V, respectivamente), (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest). Met252 corresponde al residuo 23 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 22 en SEQ ID NO: 2. Ser254 corresponde al residuo 25 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 24 en SEQ ID NO: 2. Thr256 corresponde al residuo 27 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 26 en SeQ ID NO: 2. Met428 corresponde al residuo 199 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 198 en SEQ ID NO: 2. Asn434 corresponde al residuo 205 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 204 en SeQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, cuando la proteína de fusión de la divulgación incluye un polipéptido Fc, el polipéptido Fc se muta o modifica. En estas realizaciones, el polipéptido Fc mutado o modificado incluye las siguientes mutaciones: Met252Tyr y Met428Leu (M252Y, M428L) utilizando el sistema de numeración de Kabat.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), p. ej., las modificaciones de aminoácidos descritas en Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5: Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276(9): 6591-6604; Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Revisado en Kaneko y Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11. Los ejemplos de mutaciones que potencian la ADCC incluyen la modificación en Ser239 e lle332, por ejemplo, Ser239Asp e lle332Glu (S239D, I332E). Los ejemplos de mutaciones que potencian la CDC incluyen modificaciones en Lys326 que corresponde al residuo 97 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 96 de SEQ ID NO: 2, y Glu333, que corresponde al residuo 104 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 103 de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la región Fc se modifica en una o ambas de estas posiciones, por ejemplo, Lys326Ala y/o Glu333Ala (K326A y E333A) utilizando el sistema de numeración de Kabat.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para inducir la heterodimerización. Por ejemplo, con una modificación de aminoácidos dentro del dominio CH3 en Thr366, que cuando se reemplaza con un aminoácido más voluminoso, p. ej., Try (T366W), es capaz de emparejarse preferentemente con un segundo dominio CH3 que tiene modificaciones de aminoácidos con aminoácidos menos voluminosos en las posiciones Thr366, que corresponde al residuo 137 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 136 de SEQ ID NO: 2, Leu368, que corresponde al residuo 139 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 138 de SEQ ID NO: 2, y Tyr407, que corresponde al residuo 178 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 177 de SEQ ID NO: 2, p. ej., Ser, Ala y Val, respectivamente (T366S/L368A/Y407V). La heterodimerización mediante modificaciones en CH3 puede estabilizarse además por la introducción de un enlace disulfuro, por ejemplo, al cambiar Ser354, que corresponde al residuo 125 de s Eq ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 124 de Se Q ID No : 2, a Cys (S354C) y Y349, que corresponde al residuo 120 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 119 de SEQ ID NO: 2, a Cys (Y349C) en dominios Ch3 opuestos (Revisado en Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15). En algunas de estas realizaciones, la región Fc puede ser modificada en el sitio de unión a la proteína A en un miembro del heterodímero a fin de prevenir la unión a la proteína A y de este modo permitir una purificación más eficiente de la proteína de fusión heterodimérica. Una modificación a modo de ejemplo dentro de este sitio de unión es lle253, que corresponde al residuo 24 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 23 de SEQ ID NO: 2, por ejemplo, Ile253Arg ( i253R). Por ejemplo, la modificación I253R puede ser combinada con cualquiera de las modificaciones T366S/L368A/Y407V o con las modificaciones T366W. El Fc modificado con T366S/L368A/Y407V es capaz de formar homodímeros ya que no hay oclusión estérica de la interfaz de dimerización como la hay en el caso del Fc modificado con T336W. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la modificación I253R es combinada con el Fc modificado con T366SAL368A/Y407V para no permitir la purificación de algún Fc homodimérico que pueda formarse.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para evitar la dimerización. En estas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación son monoméricas. Por ejemplo, la modificación en el residuo Thr366 por un residuo cargado, p. ej., Thr366Lys, Thr366Arg, Thr366Asp, o Thr366Glu (T366K, T366R, T366D o T366E, respectivamente), evita la dimerización CH3-CH3.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene un polipéptido derivado de una región bisagra de inmunoglobulina. La región bisagra puede seleccionarse entre cualquiera de las subclases de IgG humana. Por ejemplo, la proteína de fusión puede contener una bisagra de IgGI modificada que tiene la secuencia de EPKSSDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 5), donde en el Cys220 que forma un disulfuro con la cisteína de extremo C-terminal de la cadena ligera se muta en serina, p. ej., Cys220Ser (C220S). En otras realizaciones, la proteína de fusión contiene una bisagra truncada que tiene una secuencia DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la proteína de fusión tiene una bisagra modificada de IgG4, que se modifica para evitar o reducir el
intercambio de cadena, p. ej., Ser228Pro (S228P), que tiene la secuencia ESKYGPPCPPC (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene uno o más polipéptidos enlazadores. En otras realizaciones, la proteína de fusión contiene uno o más enlazadores y uno o más polipéptidos de bisagra.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación carecen de o tienen una cantidad reducida de fucosa unida a la cadena glicano enlazada a N en N297. Hay numerosas maneras para evitar la fucosilación, que incluyen, pero no se limitan a, la producción en una línea celular deficiente de FUT8; la adición de inhibidores al medio de cultivo celular de mamífero, por ejemplo, castanospermina, 2-desoxi-fucosa, 2-fluorofucosa; el uso de la producción de líneas celulares con vías de fucosilación reducidas naturalmente, e ingeniería metabólica de la línea celular de producción.
En algunas realizaciones, la VPBP se modifica para eliminar el reconocimiento mediante anticuerpos preexistentes encontrados en humanos. En algunas realizaciones, los anticuerpos de dominio simple de la presente divulgación se modifican mediante mutación de la posición Leu11, por ejemplo, Leu11Glu (L11E) o Leu11Lys (L11K). En otras realizaciones, los anticuerpos de dominio simple de la presente divulgación se modifican mediante cambios en la región de extremo carboxi-terminal, por ejemplo, la secuencia terminal consiste en GQGTLVTVKPGG (SEQ ID NO: 8) o GQGTLVTVEPGG (SEQ ID NO: 9) o una modificación de las mismas. En algunas realizaciones, los anticuerpos de dominio simple de la presente divulgación se modifican mediante mutación de la posición 11 y mediante cambios en la región de extremo carboxi-terminal.
En algunas realizaciones, las VPBP de las proteínas de fusión de la presente divulgación se vinculan operativamente mediante enlazadores de aminoácidos. En algunas realizaciones, estos enlazadores están compuestos predominantemente por los aminoácidos glicina y serina, indicados como enlazadores GS en el presente documento. Los enlazadores GS de las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden tener varias longitudes, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el enlazador GS comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en GGSGGS, es decir, (GGS)2 (SEQ ID NO: 75); GGSGGSGGS, es decir, (GGS)3 (SEQ ID NO: 76); GGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)4 (SEQ ID NO: 77); GGSGGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)5 (SEQ ID NO: 45), GGGGS (SEQ ID NO: 78); GGGGSGGGGS, es decir, (GGGGS2) (SEQ ID NO: 79), y GGGGSGGGGSGGGGS, es decir, (GGGGS3) (SEQ ID NO: 80).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión es tetravalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión tetravalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano. En algunas realizaciones, la proteína de fusión tetravalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-bisagra-Fc-enlazador-VHH, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión es hexavalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión hexavalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano. En algunas realizaciones, la proteína de fusión hexavalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc-enlazador-VHH, o VHH-enlazador-bisagra-Fc-enlazador-VHH-enlazador-VHH, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión carece de una región Fc. En estas realizaciones, en donde la proteína de fusión es tetravalente, la proteína tiene la siguiente estructura VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador. En estas realizaciones, en donde la proteína de fusión es pentavalente, la proteína tiene la siguiente estructura VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH. En estas realizaciones, en donde la proteína de fusión es hexavalente, la proteína tiene la siguiente estructura VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH. En estas realizaciones, el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP también puede contener dominios de unión adicionales que reconocen proteínas que no son de punta en V de bacterias gramnegativas tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa. Estos dominios de unión bacterianos adicionales pueden conferir funcionalidad adicional a la proteína de fusión de la presente divulgación. Estas funcionalidades adicionales pueden incluir la neutralización de virulencia bacteriana adicional o factores de crecimiento o permiten la opsonofagocitosis de las bacterias por células fagocíticas hospedadoras. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP también puede contener dominios de unión adicionales que reconocen proteínas que no son bacterianas. Estos dominios de unión a no bacterias adicionales, pueden conferir funcionalidad adicional a la proteína de fusión de la presente divulgación. Estas funcionalidades adicionales pueden mejorar el reclutamiento de células inmunitarias o la activación, incluyendo neutrófilos, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, monocitos, células dendríticas y células T.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene VPBP también puede contener dominios de unión adicionales que reconocen la proteína de la membrana externa I (OprI) o un fragmento de la misma. En una
realización preferida, la proteína de fusión que contiene VPBP incluye al menos un primer dominio que se une a PcrV o un fragmento del mismo y un segundo dominio que se une a Oprl o un fragmento del mismo. Estas proteínas de fusión biespecíficas se refieren en el presente documento como "proteínas de fusión biespecíficas PcrV x Oprl", "proteínas de fusión PcrV x Oprl" y/o "fusiones PcrV x OprI". Oprl es una proteína de la superficie celular que es altamente conservada entre cepas de P. aeruginosa. Oprl es anclada a la membrana externa a través de lipidación de Cys en el extremo N-terminal, está presente en el 100 % de las cepas de P. aeruginosa sometidas a ensayo, y es 100 % conservada en cepas de P. aeruginosa secuenciadas en su genoma.
En algunas realizaciones, el primer dominio comprende una o más secuencias de las secuencias de PcrV mostradas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende una o más secuencias que se unen a OprI. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende una o más secuencias de las secuencias de Oprl mostradas en la Tabla 2.
El direccionamiento doble de PcrV y Oprl permite que los polipéptidos de fusión se sujeten o de otra manera se fijen y/o se unan a la superficie celular bacteriana, y proporciona una protección mejorada in vivo.
En algunas realizaciones, la molécula que se dirige a la proteína de punta en V comprende una o más secuencias de las secuencias de PcrV mostradas en la Tabla 1.
Las moléculas proporcionadas en el presente documento exhiben actividad inhibidora, por ejemplo, al inhibir al menos una actividad biológica de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas, tal como, por ejemplo, translocalización funcional de las moléculas efectoras a través de membranas de células diana. Las moléculas proporcionadas en el presente documento completa o parcialmente reducen o de otra manera modulan la expresión o actividad de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas tras la unión, o de otra manera la interacción con, las proteínas de punta en V tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa. La reducción o modulación de una función biológica de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas es completa o parcial tras la interacción entre las moléculas y la(s) proteína(s) de punta en V. Se considera que las moléculas inhiben completamente la expresión o actividad de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas cuando el nivel de expresión o actividad de la(s) proteína(s) de punta en V en presencia de la molécula disminuye en al menos 95 %, p. ej., en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con el nivel de expresión o actividad de la(s) proteína(s) de punta en V en ausencia de interacción, p. ej., unión, con una molécula descrita en el presente documento. Se considera que las moléculas inhiben parcialmente la expresión o actividad de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas cuando el nivel de expresión o actividad de la(s) proteína(s) de punta en V en presencia de la molécula disminuye en al menos 95 %, p. ej., 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % en comparación con el nivel de expresión o actividad de la(s) proteína(s) de punta en V en ausencia de interacción, p. ej., unión, con una molécula descrita en el presente documento.
Las moléculas que se dirigen a la proteína de punta en V proporcionadas en el presente documento son útiles en el tratamiento, alivio de un síntoma, mejora y/o retraso de la progresión de una enfermedad o trastorno en un sujeto que padece o se ha identificado por correr el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno asociado con al menos una actividad biológica de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa, tal como, por ejemplo, translocalización funcional de las moléculas efectoras a través de membranas de células diana.
La divulgación proporciona moléculas, p. ej., polipéptidos incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno, polipéptidos tipo anticuerpo, y/o polipéptidos de fusión, y composiciones que se unen a proteínas que no son de punta en V bacterianas del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas, tales como Oprl de Pseudomonas aeruginosa, y métodos de preparación y uso de estas composiciones en varias indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o profilácticas. Las moléculas que se dirigen a Oprl de la presente divulgación son monoespecíficas o multiespecíficas y pueden unirse a su(s) antígeno(s) diana de una manera monovalente o multivalente.
En algunas realizaciones, las moléculas que se dirigen a la proteína Oprl son anticuerpos y moléculas tipo anticuerpo que se unen específicamente a Oprl. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno del mismo se derivan de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno incluyendo, por ejemplo, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab, anticuerpos de dominio único (sdAb), Vnar, o VHHs. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Oprl son sdAb humanos o humanizados. Los fragmentos sdAb pueden derivarse de VHH, Vnar, dominios VH o VK modificados. Los VHH pueden ser generados a partir de anticuerpos solo de cadena pesada de camélidos. Los Vnar pueden ser generados a partir de anticuerpos solo de cadena pesada de peces cartilaginosos. Se han implementado varios métodos para generar sdAb monoméricos a partir de dominios VH y VK convencionalmente heterodiméricos, que incluyen ingeniería de interfaz y selección de familias de línea germinal específicas.
En otras realizaciones, las moléculas de direccionamiento anti-Oprl se derivan de proteínas de andamio no anticuerpo, por ejemplo, pero no se limitan a, proteínas de repetición de anquirina diseñadas (darpins), avimero,
anticalina/lipocalinas, centirinas y finómeros.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento anti-Oprl es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 46-70 y 88. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento anti-OprI o fragmento de unión al antígeno del mismo también comprende una región Fc de inmunoglobulina o fragmento inmunológicamente activo de la misma. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento anti-OprI o fragmento de unión al antígeno del mismo también comprende una región Fc de inmunoglobulina o fragmento inmunológicamente activo de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-4.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación está compuesta por un único polipéptido. En otras realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación está compuesta por más de un polipéptido. Por ejemplo, en donde se incorpora un dominio de heterodimerización en la proteína de fusión para construir una proteína de fusión asimétrica. Por ejemplo, si se incorpora una región Fc de inmunoglobulina en la proteína de fusión, el dominio CH3 se puede utilizar como dominio de homodimerización, o la región de interfaz de dímero CH3 puede mutarse para permitir la heterodimerización.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene las VPBP en extremos opuestos. Por ejemplo, las VPBP se ubican tanto en la porción del extremo amino-terminal (extremo N-terminal) de la proteína de fusión como la porción de extremo carboxi-terminal (extremo C-terminal) de la proteína de fusión. En otras realizaciones, todas las VPBP residen en el mismo extremo de la proteína de fusión. Por ejemplo, las VPBP residen en las porciones de extremo amino- o carboxilo-terminal de la proteína de fusión.
En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye proteínas de fusión que incorporan más de una secuencia que se dirige a OprI y se refieren en el presente documento como multivalentes. En algunas realizaciones, las secuencias que se dirigen a OprI de la proteína de fusión reconocen el mismo epítopo en Oprl y se refieren en el presente documento como monoespecíficas-multivalentes. En otras realizaciones, las secuencias que se dirigen a OprI de la proteína de fusión reconocen distintos epítopos en Oprl y se refieren en el presente documento como multiespecíficas-multivalentes. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene la secuencia que se dirige a Oprl incluye dos secuencias que se dirigen a OprI y tiene una capacidad de unión bivalente hacia OprI. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene la secuencia que se dirige a Oprl incluye tres secuencias que se dirigen a OprI y tiene una capacidad de unión trivalente hacia OprI. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene la secuencia que se dirige a Oprl incluye cuatro secuencias que se dirigen a OprI y tiene una capacidad de unión tetravalente hacia OprI. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene la secuencia que se dirige a Oprl incluye seis secuencias que se dirigen a OprI y tiene una capacidad de unión hexavalente hacia OprI. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene la secuencia que se dirige a Oprl incluye ocho secuencias que se dirigen a OprI y tiene una capacidad de unión octavalente hacia OprI. En estas realizaciones, las secuencias que se dirigen a OprI incorporadas en la proteína de fusión de la presente divulgación pueden ser monoespecíficas o multiespecíficas.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión carece de una región Fc.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una región Fc de inmunoglobulina o fragmento inmunológicamente activo de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-4.
En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI incluye una región 1 gG1 humana. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo y/o proteína de fusión, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo y/o proteína de fusión se modifica en el aminoácido Leu235 (con recuadro, numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu235Glu (L235E) o Leu235Ala (L235A). En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo y/o proteína de fusión se modifica en el aminoácido Leu234 (con recuadro, numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu234Ala (L234A). En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo y/o proteína de fusión se altera en ambos aminoácidos 234 y 235, p. ej., Leu234Ala y Leu235Ala (L234A/L235A) o Leu234Val y Leu235Ala (L234V/L235A). En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo y/o proteína de fusión carece de un aminoácido en una o más de las siguientes posiciones para reducir la unión del receptor Fc: Glu233 (E233, en negrita en SEQ ID NO: 1), Leu234 (L234), o Leu235 (L235). En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo y/o proteína de fusión se altera en Gly235 para reducir la unión del receptor Fc. Por ejemplo, en donde Gly235 se elimina del anticuerpo y/o proteína de fusión. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana se modifica en el aminoácido Gly236 para potenciar la interacción con CD32A, p. ej., Gly236Ala (G236A, con recuadro en SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 218 de SEQ ID NO: 1 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI incluye una región IgG2 humana. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG2 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG2 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 217 de SEQ ID NO: 2 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI incluye una región IgG3 humana. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana se modifica en el aminoácido 435 para extender la semivida, p. ej., Arg435His (R435H, con recuadro en SEQ ID NO: 3). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 218 de SEQ ID NO: 3 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI incluye una región IgG4 humana. En otras realizaciones, la región Fc de IgG4 humana se modifica en el aminoácido 235 para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu235Glu (L235E). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana carece de Lys447, que corresponde al residuo 218 de SEQ ID NO: 4 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI se modifica para potenciar la unión a FcRn. Los ejemplos de mutaciones de Fc que potencian la unión a FcRn son Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S254T, T256E, respectivamente) (numeración de Kabat, Dall'Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514 23524), Met428Leu y Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159), Met252Ile, Thr256Asp, Met428Leu (M252I, T256D, M428L, respectivamente) o Met252Tyr, Met428Leu/Val (M252Y, M428L/V, respectivamente), (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest). Met252 corresponde al residuo 23 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 22 en SEQ ID NO: 2. Ser254 corresponde al residuo 25 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 24 en SEQ ID NO: 2. Thr256 corresponde al residuo 27 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 26 en SeQ ID NO: 2. Met428 corresponde al residuo 199 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 198 en SEQ ID NO: 2. Asn434 corresponde al residuo 205 en SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 204 en SeQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI se muta o se modifica. En estas realizaciones, el polipéptido Fc mutado o modificado incluye las siguientes mutaciones: Met252Tyr y Met428Leu (M252Y, M428L) utilizando el sistema de numeración de Kabat.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI se modifica para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), p. ej., las modificaciones de aminoácidos descritas en Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276(9): 6591-6604; Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Revisado en Kaneko y Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11. Los ejemplos de mutaciones que potencian la ADCC incluyen la modificación en Ser239 e lle332, por ejemplo, Ser239Asp e lle332Glu (S239D, I332E). Los ejemplos de mutaciones que potencian la CDC incluyen modificaciones en Lys326 que corresponde al residuo 97 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 96 de SEQ ID NO: 2, y Glu333, que corresponde al residuo 104 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 103 de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la región Fc se modifica en una o ambas de estas posiciones, por ejemplo, Lys326Ala y/o Glu333Ala (K326A y E333A) utilizando el sistema de numeración de Kabat.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI se modifica para inducir la heterodimerización. Por ejemplo, con una modificación de aminoácidos dentro del dominio CH3 en Thr366, que cuando se reemplaza con un aminoácido más voluminoso, p. ej., Try (T366W), es capaz de emparejarse preferentemente con un segundo dominio CH3 que tiene modificaciones de aminoácidos con aminoácidos menos voluminosos en las posiciones Thr366, que corresponde al residuo 137 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 136 de SEQ ID NO: 2, Leu368, que corresponde al residuo 139 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 138 de SEQ ID NO: 2, y Tyr407, que corresponde al residuo 178 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 177 de SEQ ID NO: 2, p. ej., Ser, Ala y Val, respectivamente (T366S/L368A/Y407V). La heterodimerización mediante modificaciones en CH3 puede estabilizarse además por la introducción de un enlace disulfuro, por ejemplo, al cambiar Ser354, que corresponde al residuo 125 de s Eq ID
NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 124 de SEQ ID NO: 2, a Cys (S354C) y Y349, que corresponde al residuo 120 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 119 de SEQ ID NO: 2, a Cys (Y349C) en dominios Ch3 opuestos (Revisado en Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15). En algunas de estas realizaciones, la región Fc puede ser modificada en el sitio de unión a la proteína A en un miembro del heterodímero a fin de prevenir la unión a la proteína A y de este modo permitir una purificación más eficiente de la proteína de fusión heterodimérica. Una modificación a modo de ejemplo dentro de este sitio de unión es lle253, que corresponde al residuo 24 de SEQ ID NOs: 1, 3, y 4 y al residuo 23 de SEQ ID NO: 2, por ejemplo, Ile253Arg ( i253R). Por ejemplo, la modificación I253R puede ser combinada con cualquiera de las modificaciones T366S/L368A/Y407V o con las modificaciones T366W. El Fc modificado con T366S/L368A/Y407V es capaz de formar homodímeros ya que no hay oclusión estérica de la interfaz de dimerización como la hay en el caso del Fc modificado con T336W. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la modificación I253R es combinada con el Fc modificado con T366S/L368A/Y407V para no permitir la purificación de algún Fc homodimérico que pueda formarse.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana del anticuerpo que se dirige a Oprl o fragmento de unión al antígeno del mismo o el polipéptido de fusión que se dirige a OprI se modifica para evitar la dimerización. En estas realizaciones, los anticuerpos y/o proteínas de fusión de la presente divulgación son monoméricos. Por ejemplo, la modificación en el residuo Thr366 por un residuo cargado, p. ej., Thr366Lys, Thr366Arg, Thr366Asp, o Thr366Glu (T366K, T366R, T366D o T366E, respectivamente), evita la dimerización CH3-CH3.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación se vinculan operativamente mediante enlazadores de aminoácidos. En algunas realizaciones, estos enlazadores están compuestos predominantemente por los aminoácidos glicina y serina, indicados como enlazadores GS en el presente documento. Los enlazadores GS de las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden tener varias longitudes, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el enlazador GS comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en GGSGGS, es decir, (GGS)2 (SEQ ID NO: 75); GGSGGSGGS, es decir, (GGS)3 (SEQ ID NO: 76); GGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)4 (SEQ ID NO: 77); GGSGGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)5 (SEQ ID NO: 45), GGGGS (SEQ ID NO: 78); GGGGSGGGGS, es decir, (GGGGS2) (SEQ ID NO: 79), y GGGGSGGGGSGGGGS, es decir, (GGGGS3) (SEQ ID NO: 80).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión es tetravalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión tetravalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano. En algunas realizaciones, la proteína de fusión tetravalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-bisagra-Fc-enlazador-VHH, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión es hexavalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión hexavalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano. En algunas realizaciones, la proteína de fusión hexavalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc-enlazador-VHH, o VHH-enlazador-bisagra-Fc-enlazador-VHH-enlazador-VHH, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión carece de una región Fc. En estas realizaciones, en donde la proteína de fusión es tetravalente, la proteína tiene la siguiente estructura VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador. En estas realizaciones, en donde la proteína de fusión es pentavalente, la proteína tiene la siguiente estructura VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH. En estas realizaciones, en donde la proteína de fusión es hexavalente, la proteína tiene la siguiente estructura VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH. En estas realizaciones, el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la divulgación se administre con vehículos, tampones, excipientes, y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar una transferencia, suministro, tolerancia, y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente divulgación, siempre que el principio activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación es fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral
drug delivery-some emerging concepts". J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en el mismo para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una serie de representaciones esquemáticas de proteínas de fusión que contienen VPBP a modo de ejemplo de la presente divulgación. Las VPBP que reconoce distintos epítopos están sombreadas de manera diferente en estas representaciones esquemáticas.
Las Figuras 2A, 2B, y 2C son una serie de gráficas que representan un análisis de hemólisis utilizando varias proteínas de fusión que contienen VPBP de la divulgación.
Las Figuras 3A y 3B son una serie de gráficas que representan un análisis de citotoxicidad utilizando varias proteínas de fusión que contienen VPBP de la divulgación. La línea celular A549 se utilizó como la línea celular diana.
Las Figuras 4A, 4B, y 4C son una serie de gráficas que representan un análisis de supervivencia en un modelo de infección utilizando varias proteínas de fusión que contienen VPBP de la divulgación. El mAb V2L2, como control positivo, se utilizó como anticuerpo de bloqueo de PCRV. La Figura 5 es una gráfica que representa la unión de un anticuerpo de OprI de ejemplo para unirse a varias cepas de Pseudomonas aeruginosa y a Pseudomonas putida.
La Figura 6 es una gráfica que representa la capacidad de varias proteínas de fusión que contienen VPBP de la divulgación para unirse a P. aeruginosa a través de Oprl.
La Figura 7 es una gráfica que representa la capacidad de varias proteínas de fusión que contienen VPBP de la divulgación para proporcionar una protección superior in vivo en un modelo de profilaxis para neumonía por P. aeruginosa. Se incluye en el presente documento una proteína de fusión, PCRV-OprI (PCRV-18-15-OprI-7), multiespecífica a modo de ejemplo de la divulgación que demuestra una capacidad protectora mejorada sobre una PCRV y PSL de direccionamiento biespecífica (divulgadas en el documento US20150284450 y DiGiandomenico et al, "A multifunctional bispecific antibody protects against Pseudomonas aeruginosa". Sci Transl Med., vol. 6 (262): 262ra155 (2014)) en una dosis molar equivalente.
Descripción detallada
A menos que se definan de otra manera, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación tendrán los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Además, a no ser que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química de proteínas y oligo o polinucleótidos y de hibridación descritas en el presente documento son las conocidas y utilizadas comúnmente por los expertos en la materia. Se usan técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se lleva a cabo comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento son los conocidos y frecuentemente usados en la técnica. Se usan técnicas convencionales para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes. El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Tal como se utiliza de acuerdo con la presente divulgación, los siguientes términos, salvo que se indique lo contrario, se entenderán como que tienen los siguientes significados:
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "proteína de fusión que se dirige a" y "anticuerpo" pueden ser sinónimos. Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) a un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" o "dirigido contra" se refiere a que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (K > 10' 6). Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), monocatenarios, Fab, fragmentos Fab, y F(ab')2, Fv , scFvs, una biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de anticuerpo de dominio simple (sdAb), por ejemplo VhH, Vnar, Vh o Vk modificado.
La unidad estructural básica del anticuerpo es conocida por comprender un tetrámero. Cada tetrámero se compone
de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Determinadas clases también presentan subclases (también conocidas como isotipos), tal como IgG-i , IgG2 y otras. Es más, en seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los mAb contienen un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única con respecto a este.
La expresión "sitio de unión al antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") del extremo N-terminal de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, referidas como "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco conservadas", o "FRs". Por tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen una con respecto a la otra en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria de la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se refieren como "regiones de determinación de complementariedad", o "CDRs". La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)) o Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
Las porciones de fragmentos de anticuerpo de dominio simple (sdAb) de las proteínas de fusión de la presente divulgación se refieren de manera intercambiable en el presente documento como polipéptidos de direccionamiento en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a/mediante una inmunoglobulina o fragmento de la misma, o un receptor de células T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a/mediante una inmunoglobulina o un receptor de células T. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o glucídicas y, habitualmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 |j M; p. ej., < 100 nM, preferentemente < 10 nM y más preferentemente < 1 nM.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "unión inmunológica", "propiedades de unión inmunológica" y "unión específica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La potencia o afinidad de las interacciones de unión inmunológica pueden expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos implica medir las tasas del complejo formación y disociación de sitio de unión al antígeno/antígeno, en donde dichas tasas dependen de las concentraciones de los compañeros complejos, la afinidad de la interacción, y los parámetros geométricos que influyen de igual manera en la tasa en ambas direcciones. Por tanto, tanto la "constante de asociación" (kon) como la constante de disociación" (koff) pueden determinarse mediante el cálculo de las concentraciones y las tasas de asociación y disociación reales. (Véase, Nature 361:186-87 (1993)). La relación de koff/kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. (Véase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente divulgación se une específicamente a un antígeno, cuando la constante de unión en equilibrio (Kd) es 51 j M, preferentemente < 100 nM, más preferentemente < 10 nM, y lo más preferentemente < 100 pM a aproximadamente 1 pM, según lo medido mediante ensayos tales como ensayos de unión a radioligandos, resonancia de plasmón superficial (SPR), ensayo de unión por citometría de flujo, o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina, valina, glutamatoaspartato, y asparagina-glutamina.
Tal como se analiza en el presente documento, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina como abarcados por la presente divulgación, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos se mantengan en al menos 75 %, más preferentemente al menos 80 %, 90 %, 95 % y lo más preferentemente 99 %. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxialifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (ii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tenga un efecto principal sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco conservado. Se puede determinar sin inconvenientes si el cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional mediante la evaluación de la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en el presente documento. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar sin inconvenientes por los expertos en la técnica. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Preferentemente, se usan métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de configuración de proteínas predichos que se produzcan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la divulgación.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia que no sea la secuencia de péptidos de origen natural. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de uno o varios aminoácidos (preferentemente, sustituciones de aminoácidos conservadoras) en la secuencia de origen natural (preferentemente, en la porción del polipéptido fuera del(de los) dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservadora normalmente puede no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (p. ej., un reemplazo de aminoácidos no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia original). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991).
La expresión "fragmento polipeptídico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos tienen normalmente al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferentemente al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con respecto a una porción de una secuencia
de aminoácidos deducida y que tiene unión específica a CD47, en condiciones de unión adecuadas. Normalmente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución (o adición o eliminación) de aminoácidos conservadora con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos tienen normalmente al menos 20 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden tener una longitud igual a la de un polipéptido de origen natural de longitud completa.
Los análogos peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Normalmente, dichos compuestos se desarrollan con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o una actividad farmacológica), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado entre el grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S-, --CH2-CH2--, --CH=CH--(cis y trans), --COCH2--, CH(OH)CH2--, y -CH2SO--, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un aminoácido D del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Asimismo, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan al péptido.
El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, y/o un extracto hecho de materiales biológicos.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "etiqueta" o "etiquetado" se refiere a la incorporación de un marcador detectable, p. ej., mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos de biotina que puede detectarse mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o el marcador también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glucoproteínas. Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionucleótidos (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), etiquetas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, las etiquetas se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. La expresión "agente farmacéutico o fármaco", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento", y similares se refieren a reducir y/o mejorar un trastorno y/o síntomas asociados con el mismo. Por "aliviar" y/o "alivio" se refiere a disminuir, suprimir, atenuar, menguar, detener y/o estabilizar el desarrollo o el avance de una enfermedad tal como, por ejemplo, un cáncer. Se apreciará que, aunque no se excluye, tratar un trastorno o afección no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados con los mismos se eliminen por completo.
En esta divulgación, "comprende", "que comprende(n)", "que contiene(n)", "que tiene(n)", y similares pueden tener el significado atribuido a los mismos en la ley de patentes de EE.UU., y pueden significar "incluye", "que incluye(n)" y similares; las expresiones "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" análogamente tiene el significado atribuido en la ley de patentes de Estados Unidos y la expresión es abierta, permitiendo la presencia de más de lo que se enumera siempre que las características básicas o novedosas de lo que se enumera no se cambien por la presencia de más de lo que se enumera, pero excluye las realizaciones de la técnica anterior.
Por "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad necesaria para mejorar los síntomas de una enfermedad con respecto a un paciente no tratado. La cantidad eficaz de compuesto(s) activo(s) utilizado(s) para llevar a la práctica la presente divulgación para tratamiento terapéutico de una enfermedad varía dependiendo de la manera de administración, la edad, el peso corporal y el estado de salud general del sujeto. Por último, el médico o veterinario responsable decidirá la cantidad apropiada y el régimen de dosificación. Tal cantidad es la referida como una "cantidad eficaz". Por "sujeto" se refiere un individuo, incluyendo, pero no se limita a, un ser humano o un mamífero no humano, tal como bovino, equino, canino, roedor, ovino, primate, camélido o felino.
El término "administrar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modo de transferencia, suministro, introducción o transporte de un agente terapéutico a un sujeto que necesite un tratamiento con dicho
agente. Dichos modos incluyen, pero sin limitación, Administración oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, intranasal y subcutánea.
Por "fragmento" se entiende una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, preferentemente, al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la longitud total del polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos o aminoácidos.
Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son una forma abreviada de todos los valores comprendidos en el intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números, o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50.
Salvo que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que los términos "un, "una", y "el/la" son singular o plural. Salvo que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término "o" es inclusivo.
Salvo que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término "aproximadamente" está dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones típicas de la media. Aproximadamente puede entenderse dentro de 10 %, 9 %, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, 0,5%, 0,1 %, 0,05% o 0,01 % del valor establecido. Salvo que sea evidente por el contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento están modificados por el término "aproximadamente".
Las formulaciones terapéuticas de la divulgación, que incluyen una molécula dirigida a la proteína de punta en V de la divulgación, se utilizan para tratar o aliviar un síntoma asociado con una enfermedad o trastorno asociado con actividad aberrante y/o expresión de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas, tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa, en un sujeto. Se lleva a cabo un régimen terapéutico mediante la identificación de un sujeto, p. ej., un paciente humano que padece (o está en riesgo de desarrollar) una enfermedad o trastorno asociado con actividad y/o expresión aberrante de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas, tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa, utilizando métodos convencionales, que incluyen cualquiera de varios procedimientos clínicos y/o de laboratorio. El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios. El término sujeto incluye seres humanos y otros mamíferos.
La eficacia del tratamiento se determina junto con cualquier método conocido para el diagnóstico o el tratamiento de la enfermedad o trastorno particular asociado con actividad y/o expresión aberrante de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas, tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa. El alivio de uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno asociado con actividad y/o expresión aberrante de una o más proteínas de punta en V de bacterias gramnegativas, tales como PcrV de Pseudomonas aeruginosa, indica que la molécula dirigida a la proteína de punta en V confiere un beneficio clínico.
Los métodos para la identificación selectiva de las moléculas que se dirigen a la proteína de punta en V que poseen la especificidad deseada incluyen, pero sin limitación, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos enzimáticos, citometría de flujo y otras técnicas mediadas inmunológicamente conocidas en la técnica. Ejemplo 1: Bloqueo de hemólisis
La capacidad de las VPBP de la presente divulgación para bloquear una hemólisis inducida por bacterias de glóbulos rojos (GR) puede evaluarse mediante numerosos protocolos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los glóbulos rojos humanos se lavaron en PBS y se volvieron a suspender a 2 % (v/v) en DMEM. Las bacterias de Pseudomonas aeruginosa más anticuerpos diluidos en serie se añadieron a los GR en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las placas fueron incubadas durante 2 horas a 37 °C y después 2 horas a 4 °C. Las placas se centrifugaron para sedimentarse en GR intactos, después de lo cual el sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocillos de fondo plano para una observación espectrofotométrica de hemoglobina liberada.
Como se muestra en las Figuras 2A-2D, tanto las VPBP monoespecíficas como multiespecíficas multivalentes de la presente divulgación son capaces de bloquear la hemólisis inducida por bacterias de GR.
Ejemplo 2: Bloqueo de citotoxicidad
La capacidad de las VPBP de la presente divulgación para bloquear una citotoxicidad inducida por bacterias de células de mamífero puede evaluarse mediante numerosos protocolos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Se cultivó una monocapa confluente de células A549 (epiteliales de pulmón) en placas de 96 pocillos. Las células se cargaron con calceína AM y después se lavaron para retirar el exceso de calceína. Se añadieron P. aeruginosa y anticuerpos a concentraciones variables a las células A549 y se incubaron durante 2 h a 37 °C. Las monocapas se
lavaron a continuación, después de lo cual las células restantes fueron cuantificadas por fluorescencia.
Como se muestra en las Figuras 3A-3B, tanto las VPBP monoespecíficas como multiespecíficas multivalentes de la presente divulgación son capaces de bloquear la citotoxicidad inducida por bacterias de células de mamífero.
Ejemplo 3: Modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa
La capacidad de las VPBP de la presente divulgación para proteger frente a una infección bacteriana puede evaluarse utilizando un modelo de ratón de una infección por P. aeruginosa. Se pretrataron ratones con anticuerpos de PcrV 24 h antes de la infección por P. aeruginosa. En t = 0, a los ratones se les infectó por vía intratraqueal con P. aeruginosa y la supervivencia se controló durante 4 días. De forma importante, se descubrió que las proteínas de fusión que contenían VPBP multivalentes multiespecíficas conferían sustancialmente más protección en comparación con proteínas de fusión que contenían VPBP multivalentes monoespecíficas (Figuras 4A-4C). Las proteínas de fusión que contenían VPBP multivalentes multiespecíficas de la presente divulgación también son sustancialmente más potentes que el anticuerpo anti-PCRV, V2L2, conocido en la técnica por ser un bloqueador potente de la hemólisis inducida por P. aeruginosa (véase, p. ej., PCT/US2012/063639, publicado como el documento WO 2013/0170565).
Ejemplo 4: Los anticuerpos de OprI se unen a múltiples cepas
La capacidad de los anticuerpos que se dirigen a Oprl para unirse a cepas de Pseudomonas puede evaluarse mediante un ensayo ELISA bacteriano de células enteras. Los cultivos bacterianos se cultivaron hasta la fase media logarítmica en medio bacteriológico convencional, después se lavó y se volvió a suspender en PBS. Se colocaron volúmenes iguales de suspensión bacteriana en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Las placas se bloquearon con ASB y después se añadieron diluciones en serie. Después del lavado posterior, se añadió un anticuerpo secundario específico anti-Fc humano conjugado a PRP. Tras la incubación y el lavado, se añadió un sustrato de TMB y la absorbancia a 600 nm se midió para detectar la unión de anticuerpos a bacterias. Como se muestra en la Figura 5, se descubrió que los anticuerpos de OprI se unen a todas las cepas de Pseudomonas aeruginosa sometidas a ensayo, así como a Pseudomonas putida.
Ejemplo 5: Moléculas biespecíficas en un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa
Los estudios presentados en el presente documento demuestran que la capacidad de las VPBP de la presente divulgación para proteger frente a una infección bacteriana puede evaluarse utilizando un modelo de ratón de una infección por P. aeruginosa. En particular, estos estudios utilizan una VPBP que se une a tanto PcrV como a la proteína de la membrana externa I ("OprI"), también se refieren en el presente documento como "proteínas de fusión biespecíficas PcrV x Oprl", "proteínas de fusión PcrV x Oprl" y/o "fusiones PcrV x OprI". El direccionamiento doble de PcrV y Oprl permite que los polipéptidos de fusión se sujeten o de otra manera se fijen y/o se unan a la superficie celular bacteriana, y los estudios proporcionados en el presente documento demuestran que este direccionamiento doble también produce una protección mejorada in vivo.
Las fusiones biespecíficas PcrV x Oprl se dirigen a la superficie celular bacteriana al dirigirse a Oprl. La Figura 6 demuestra que las fusiones biespecíficas PcrV x Oprl de la divulgación se unen a P. aeruginosa mediante citometría de flujo.
Las fusiones biespecíficas PcrV x OprI también son más potentes in vivo que la molécula biespecífica Bis4, que se une a PcrV y PSL y se conoce en la técnica por ser un bloqueador de la hemólisis inducida por P. aeruginosa (véase, p. ej., DiGiandomenico et al., "A multifunctional bispecific antibody protects against Pseudomonas aeruginosa". Sci Transl Med., vol. 6 (262): 262ra155 (2014)). La Figura 7 demuestra que las proteínas de fusión biespecíficas PcrV x Oprl proporcionan una protección superior in vivo en un modelo animal de profilaxis para neumonía por P. aeruginosa.
Tabla 1. Secuencias PcrV-VPBP
PcrVIA (1A7)
EV QLV QS GGGLV Q AGGSLRLS C AAS GRIF GTY GMGWFRQ APGKERVFV AAISKSG
PTTYYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGASSHSMLVVTTSQ
VDYWGRGTQVTVSS (SEQ ID NO: 10)
PcrV2A (1B9)
EV QLV QSGGGLV QPGGSLRLSC AVSGLIFDNY GIGWFRQ APEKEREGV SC1HESDGS
TYYTDSVKGRFAISRDNAKNTGYLEMNNLKPEDTAVYYCVVLSYVSRCPEGSKYD
YWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 11)
PcrV3A (1B12)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYPIGWFRQAPGKEREGVSCISSSEGS
TYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNMKPEDTAVYYCATDFFTTGCPSGGGK
YDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 12)
PcrV4A (1G9)
EV QLV QS GGGLVRAGGSLRL S C AP S ERTF GSFGMGWFRQ APGKEREF V AALMW G
TSYTSYADSVKGRFTVSKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGAVGADPRRY
DYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 13)
PcrV5A (2A5)
EVQLVQS GGGLVQ AGGSLRLS C AAS GLAFRNYRMGWFRQ APGKEREF VAAIS GNI
GGS GV GTD Y AD S VKGRFTISRDNDKDT AYLQMN S LKPEDT AV YY C AADHHLTML
PGEYDFWGEGTQVTVSS (SEQ ID NO: 14)
PcrV6A (2A11)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVACISSSDG
STDY ADSMKGRFTISRDNAQKTVYLQMNSLKPEDT AV Y S C AAV AFFCGS S WYLS S
GMDYWGKGTQVTVSS (SEQ ID NO: 15)
PcrV7A (2A12)
EV QLV QSGGGLV Q AGGSLRLS C AAS GGTFS SNAMYWYRQ APGKQRELV ASISGTS
NANYPDSVKGRFTISRDNAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCRAAPVSGPLIGRIFWG
QGTQVTVSS (SEQ ID NO: 16)
PcrV8A (2B4)
EV QLV QSGGGLV Q AGGSLRL S C ATS GLTF S V Y AMGWFRQ APGKQREF V ARIT AGG
SGTYYADSMEGRFTISRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAARHWTRGTEHL
PTAYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 17)
PcrV9A (2B7)
EV QLV QSGGGLV QAGGSLRLSCAS SGSTFRTY GMGWFRQPPGKQREWVAGMAID
GLTTYADSAKGRFTASRDNARNIVYLQMNELKPEDTAVYYCYAAGYWGQGTQVT
VSS (SEQ ID NO: 18)
PcrV10A (2G6) EVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCTTSGITFSDNAMYWYRQAPGKQRELVASISSGG WTNYADSVKGRFTISRDNVKNTVTLQMNSLEPEDTALYYCRAAPVRGNFIGRVFW GQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 19)
PcrV11A (4H7)
EV QLV QS GGGLV QPGGSLRLSC AAF GSIFTIGTMGWYRQ APGKQRELV ATITRGS S TNYADSVKGRFTISIDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAADRGAVGPAMRVVA DYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 20)
PcrV12A (3B7)
EV QLV QSGGGLV QAGGSLRLSCAASGSTFS SNAMYWYRQ APGKQRELV ASISDGG FTTYYADSVKGRFTISKDNAENTVYLQMNIMKPEDTAVYYCAASISSRVVVHTAQ ADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 21)
PcrV13A (4G2)
EV QLV QSGGGLV QPGGSLRLPCAASGSIFTIGTMGWYRQ APGKQRELV ATITRGS S TNYADSVKDRFTISRDNAKRTLHLQMNGLKAEDTAVYYCATDLFENSCPLKHDFW GQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 22)
PcrV14A (4G10)
EV QLV QSGGGLV Q AGGSLRL S C AAS RITF AL YVID WYRQTPES QREL V ARIRPEGL AVYADSVKGRFTISRDNGRNTAYLQMNSLQEEDTAVYYCHADPVFTPGRNDYWG QGTQVTVSS (SEQ ID NO: 23)
PcrV15A (4G9)
EV QLV QSGGGLV QPGESLRLS C AAS GSIF SINTMVWYRQVPGKQRELV ASITNQGIP HYADSVKGRFTISRENAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYVCNAWIRSDGVSPYLNYW GQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 24)
PcrV16A (3B10)
EV QLV QSGGGLV QPGGSLGLSCV GSGSISG1HTMGWYRRAPGNQRELIATATS AGI TNYSESVKGRFTISRDNAKSTVYLQMSSLKPEDTGVYYCNDVFGRTSWGQGTQVT VSS (SEQ ID NO: 25)
PcrV17A (3G1)
EV QLV QSGGGLV QPGGSLRLS C AASGNIF GGNVMGWYRQ APGKQRELV AGIGSLG RTTYADSVKGRFSISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCNVVRLGGPDYWGQG TQVTVSS (SEQ ID NO: 26)
PcrV18A (3F2) EVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCTTSGNTFSDNAMYWYRQAPGKQREQVASISSGG WTNYADSVKGRFTISRDNVKNTVTLQMDRLEPEDTALYYCRAAPVRGYLIGRVFW GQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 27)
PcrV19A (4E12) EVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCSASGSNSIFNMGWYRQRPGRQRELVALISSGTGS TSYAGSVKGRFAISRDNAKATVYLQMNSLKLEDTAVYYCRITTDNARLVYWGQGT QVTVSS (SEQ ID NO: 28)
PcrV20A (3C1)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNNMGWYRQTPGKQRELVAVITVNG ITTYSDSVKGRFTLSRDNAKNTIYLQMNSLKPEDTAVYSCY GYIRLAATNPYV QYW GQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 29)
PcrV21A (3C7) EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMGWYRQAPGNQRDIVATITMNGV PHY AD AVKGRFTISRDNAKNTVYLQMN GLKPEDT AVYY CNAWINLY GSPPLQNY WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 30)
PcrV22A (4H8) EVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVTSITNQGI PHYADSVKGRFTISRENAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYVCNAWIRGDGGSPYLNY WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 31)
PcrV23A (1G6)
EV QLV QS GGGLV QPGESLRLS C AAS GSIF SINTMVWYRQVPGKQRELV ASITNQGIP HYADSVKGRFTISRENAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYVCNAWIRSDGVPPYLNYW GQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 32)
PcrV24A (2E1) EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFNINSMHWYRQAPGNQRELVASISKGGI TNY AD S VKGRF AI S RDD AQNTL YLQMNSLKPEDT AVYY CN AWISEIATGPIL YNY WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 33)
PcrV25A (1F9) EVQLVQSGGGLVQPGGSLSLSCAASGSVFSINRMAWYRQAPGKQRELVADIGTMG ASDYADSVKGRFTISRDNAKKTVDLQMNSLKPEDTAVYFCNAWMRGAPDVAYTN YWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 34)
PcrV26A (4H1) EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGRVVSINNMGWYQQTPGNQRELVAIITLNG VTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMASLKPEDTAIYYCNAWVRTVPGSAYSNY WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 35)
PcrV27A (1B4) EVQLVQSGGDLVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNNMGWYRQAPGKQRELVAVITMNG VTTYEDSVKGRFTLSRDNAKNTIYLQMNSLKPEDTAVYFCYGYIRLAATNPYVQY WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 36)
hzPcrV15v1 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKQRELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSDGVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 37)
hzPcrV15v2
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKQRELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSYGVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 38)
hzPcrV15v3 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKQRELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSEGVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 39)
hzPcrV15v4 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKQRELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSQGVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 40)
hzPcrV15DAv5 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKQRELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSDAVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 41)
hzPcrV15DTv6 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKQRELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSDTVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 42)
hzPcrV15v7 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKGRELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSQGVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 81)
hzPcrV15v8 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINTMVWYRQAPGKGLELVSSITNQGIP HYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNAWIRSQGVSPYLNYWG QGTLVTVKP (SEQ ID NO: 82)
hzPcrV 18 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGNTFSDNAMYWYRQAPGKQRELVSSISSGG WTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCRAAPVRGYLIGRVFW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 43)
hzPcrV 18v2 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGNTFSDNAMYWYRQAPGKGRELVSSISSGG WTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCRAAPVRGYLIGRVFW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 83)
hzPcrV18v3
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGNTFSDNAMYWYRQAPGKGLELVSSISSGG WTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCRAAPVRGYLIGRVFW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 84)
hzPcrV20v1 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNNMGWYRQAPGKQRELVSVITVNGI TTY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAEDT AVYY C Y GYIRL AATNP YV QYW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 44)
hzPcrV20v2
E VQLLE S GGGEV QPGGSLRL S C AAS GRIF S VNNMGWYRQ APGKQREL V S VITV GGI TTY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAEDT AVYY C Y GYIRL AATNP YV QYW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 71)
hzPcrV20v3
E VQLLE S GGGEV QPGGSLRL S C AAS GRIF S VNNMGWYRQ APGKQREL V S VITV QGI TTY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAEDT AVYY C Y GYIRL AATNP YV QYW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 72)
hzPcrV20v4
E VQLLE S GGGEV QPGGSLRL S C AAS GRIF S VNNMGWYRQ APGKQREL V S VITNQGI TTY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAEDT AVYY C Y GYIRL AATNP YV QYW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 73)
hzPcrV20v5
E VQLLE S GGGEV QPGGSLRL S C AAS GRIF S VNNMGWYRQ APGKQREL V S VITV S GI TTY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAEDT AVYY C Y GYIRL AATNP YV QYW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 74)
hzPcrV20v6
E VQLLE S GGGEV QPGGSLRL S C AAS GRIF S VNNMGWYRQ APGKGRELV S VITNQGI TTY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAEDT AVYY C Y GYIRL AATNP YV QYW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 85)
hzPcrV20v7 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNNMGWYRQAPGKGLELVSVITNQGI TTY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAEDT AVYY C Y GYIRL AATNP YV QYW GQGTLVTVKP (SEQ ID NO: 86)
hzPcrV20v8 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRIFSVNNMGWYRQAPGKGLEWVSVITNQC IITY AESVKGRF I'ISRDN AKNI'LYLQMSSLRAED IAVYYCYGYIRLAA I'NPY VQY WGQGTLVTVKP (SEQ ID NO 87)
Tabla 2. Secuencias de proteínas de unión a Oprl
OprI-VHH-1 (también referido en el presente documento como "Oprl-I")
QLQLQES GGGL V Q S GRSLRL S C S AS GS LFRFDTV WWYRQ APGKQREWV AYIT AGG MTNYADSVKGRFTISKDNAKNMVYLQMDSLLPEDTAVYYCNVGRNWGQGTQVT VSS (SEQ ID NO: 46)
OprI-VHH-2 (también referido en el presente documento como "OprI-2")
EV QLV QS GGGLV QPGESLRLSC AAS GNIFRFDTV WWYRQPPGEQREWV S YIT AGSI TNYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMDNLKPEDTAVYYCRVGGSSWGQGTQVT VSS (SEQ ID NO: 47)
OprI-VHH-3 (también referido en el presente documento como "OprI-3") EVQLVQSGGGLVQAGDSLRLSCAASGGISSTYAMGWFRQAPGKEREFVASIRLGSE ATYYADSVKGRFTISRDNALKTIYLQMNSLKPDDTAVYYCAVDASLFLVTVDYWG RGTQVTVSS (SEQ 48)
OprI-VHH-4 (también referido en el presente documento como "OprI-4")
QV QLVQSGGGLV QAGGSLRLSCAASGRTFSRCVMGWFRQAPGKEREFVATISWSG ASTVYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAESSWNGDIRLK GYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 49)
OprI-VHH-5 (también referido en el presente documento como "OprI-5")
QVTLKES GGGLV Q AGGSLRLSC AAS GRSFRTYTMAWFRQPPGKEREFV AAITW S G GSTFYADPVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLKPEDTAVYYCAVETSISGRYTVFQP RFYDSWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 50)
OprI-VHH-6 (también referido en el presente documento como "OprI-6") QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAASGNIFRFDTVWWYRQPPGEQREWVSYITAGSI TNYADSVKGRFIISRDNAKNMVYLQMDNLKPEDTAVYYCRVGGGSWGQGTQVTV SS (SEQ ID NO: 51)
OprI-VHH-7 (también referido en el presente documento como "OprI-7")
EV QLV QS GGGLV QPGGSLRLS CI AS GSIF STKTMGWYRQ APGKQREWV ALITTGLS TQYLDSLEGRFTISRDNANNRVFLQMNNLKPEDTGVYYCNVVPGRGATYWGKGT QVTVSS (SEQ ID NO: 52)
OprI-VHH-8 (también referido en el presente documento como "OprI-8")
QLQLQES GGGLVQPGRSLRLSCAGSGSIFRYDTVWWYRQ APGKQREWV AYVTAG GITNYADSVKGRFTISKDNAKNMVYLQMDSLLPEDTAVYYCHVGRNWGQGTQVT VSS (SEQ ID NO: 53)
OprI-VHH-9 (también referido en el presente documento como "OprI-9")
QLQLQES GGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSNVYSMGWFRQAPGKEREFVSAITW RGGTTYYADSVKDRFTISKDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCACSRMDSTRYD YWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 54)
OprI-VHH-11 (también referido en el presente documento como "Oprl-ll") EVQLVQSGGGLVQSGRSLRLSCSASGSLFRFDTVWWYRQAPGKQREWVAYITAGG ITNYADSVKGRFTISKDNAKNMVYLQMDSLLPEDTAVYYCSVGRNWGQGTQVTV SS (SEQ ID NO: 55)
OprI-VHH-12 (también referido en el presente documento como "OprI-12")
Q V QLQES GGGLV QPGGS LRL S C AAS GITVRINTMGWYRQ AP GKQREL V AYITS GGI TNYVD S VKGRFTIARDD AKNTV YLQMNSLKPEDT AV YY CNVHGWRDF W GQGT Q VTVSS (SEQ ID NO: 56)
OprI-VHH-13 (también referido en el presente documento como "OprI-13")
QV QLVQSGGGLV QPGGSLRLSCAASGTIFRFNTMAWYRQ APGKQREFVAYITWAG MTGYQDSVQDRFTISRDNAKNTVSLQMNNLKPEDTAVYFCNKHGSSFVRDYWGQ GTQVTVSS (SEQ ID NO: 57)
OprI-VHH-14 (también referido en el presente documento como "OprI-14")
EV QLV QS GGGLV QPGGS LRLS CAAAGSDFAIGAMGWYRQAPGKQRDFV AHITSGG IPSFADSVKGRFTLSRDNAKNTVYLQMDSLKPDDTAVYYCYLRKRGSGTTTWGQG TQVTVSS (SEQ 58)
OprI-VHH-15 (también referido en el presente documento como "OprI-15")
QVQLQES GGGLVQ AGGSLRL S C AAS GRIF SNCVMGWFRQ APGKEREFV AAIS WS G DTTHYADSLKGRFAISRDNANNTVFLQKDSLTPSDTAVYYCAASSRITSCQAMGVV PLLQPWYDYWGRGTQVTVSS (SEQ ID NO: 59)
OprI-VHH-16 (también referido en el presente documento como "OprI-16") QVQLQESGGGLVQPGRSLRLSCAASGNIFRFDTVWWYRQAPGKQREWVAYVTAG GITNYADSVKGRFTISKDNAKNIVYLHTDNLAPEDTAVYYCRVGQNWGQGTQVTV SS (SEQ ID NO: 60)
OprI-VHH-17 (también referido en el presente documento como "OprI-17") QLQLQESGGGLVQPGGSPRLSCAASESIFRFNTMAWYRQAPGKQRELVAYITWAG RTDYGDFVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCNKHGSRFERDYWGQ GTQVTVSS (SEQ 61)
OprI-VHH-18 (también referido en el presente documento como "OprI-18") QVQLQESGGDLVQPGGSLRLSCVASETIFRFNTMAWYRQAPGKRRELVGYITWAG RTGYGDFVEGRFTISRDNSKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCNKHGSSFTQDYWGQG TQVTVSS (SEQ ID NO: 62)
OprI-VHH-19 (también referido en el presente documento como "OprI-19")
QLQLQESGGDLVQPGGSLRLSCVASETIFRFNTMAWYRQAPGKRRELVGYITWAG RTGY GDFVEGRFTV SRDNSKNTV SLQMNSLKPEDTAVYY CNKHGASFTQDYWGQ GTQVTVSS (SEQ ID NO: 63)
OprI-VHH-21 (también referido en el presente documento como "OprI-21")
QLQLQESGGGLVRPGSSLTLSCVASETIFRFNTMAWYRQAPGKRRELVGYITWAGR TGYGDFVEGRFTISRDNSKNTVSLQMNSLEPEDTADYYCNKHGSSFLRDYWGQGT QVTVSS (SEQ ID NO: 64)
OprI-VHH-22 (también referido en el presente documento como "OprI-22")
QVQLQESGGGLVQPGRSLRLSCAGSGSMFRFDTVWWYRQAPGKQRDWVSYITAG SIANYADSVKGRFTISRDNTKNMVYLQMDSLKPEDTAVYYCRVGGNSWGQGTQV TVSS (SEQ ID NO: 65)
OprI-VHH-23 (también referido en el presente documento como "OprI-23")
QVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCEASSNIFRFNTMAWYRQAPGKQREFAAYITWAG LTGYGDSLKGRFIISRDNAKNIVTLQMNSLKPEDTAVYYCNKHGSDFVRDYWGQG TQVTVSS (SEQ ID NO: 66)
hzOprI-7v1 (también referido en el presente documento como "OprI-7v1")
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSTKTMGWYRQAPGKQREWVSLITTGLS TQY AES VKGRFTISRDNANNTVYLQMS SLRAEDT AVYY CNVVPGRGATYWGQGT LVTVKP (SEQ ID NO: 67)
hzOpr1-7v2 (también referido en el presente documento como "OprI-7v2")
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSTKTMGWYRQAPGKQREWVSLITTGLS TQYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNVVPGRGATYWGQGT LVTVKP (SEQ ID NO: 68)
hzOprIv3 (también referido en el presente documento como "OprI-7v3")
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSTKTMGWYRQAPGKGLEWVSLITTGLS TQYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCNVVPGRGATYWGQGT LVTVKP (SEQ ID NO: 69)
hzOprI-7v4 (también referido en el presente documento como "OprI-7v4")
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSTKTMGWYRQAPGKGLEWVSLITTGLS TQY AES VKGRFTISRDNAKNTVYLQMS SLRAEDT AVYY CNVVPGRGATYWGQGT LVTVKP (SEQ ID NO: 70)
hzOprI-7v5
Claims (10)
1. Una proteína de fusión aislada que se une a al menos una proteína de punta en V bacteriana del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas, en donde la proteína de punta en V del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas es PcrV de Pseudomonas aeruginosa;
en donde la proteína de fusión comprende una primera proteína de unión a la proteína de punta en V (VPBP1) y una segunda proteína de unión a la proteína de punta en V (VPBP2);
en donde la VPBP1 y la VPBP2 se unen cada una a un epítopo diferente en la misma proteína de punta en V, en donde las VPBP son fragmentos de anticuerpos de dominio único (sdAb), y en donde la proteína de fusión inhibe la translocalización funcional de las moléculas efectoras a través de membranas celulares diana.
2. La proteína de fusión aislada de la reivindicación 1, en donde los fragmentos sdAb están humanizados.
3. La proteína de fusión aislada de la reivindicación 1, en donde los fragmentos sdAb son VHHs.
4. La proteína de fusión aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de fusión comprende además un dominio de unión adicional que se une a OprI;
en donde el dominio de unión adicional es un fragmento sdAb.
5. Una proteína de fusión aislada que se une a al menos una proteína de punta en V bacteriana del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas y a al menos una proteína de no punta en V del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas; en donde al menos una proteína de punta en V del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas es PcrV de Pseudomonas aeruginosa y la al menos una proteína de no punta en V del sistema de secreción de tipo III de bacterias gramnegativas es OprI de Pseudomonas aeruginosa; en donde la proteína de fusión es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo;
y en donde la proteína de fusión inhibe la translocalización funcional de las moléculas efectoras a través de membranas celulares diana.
6. La proteína de fusión aislada de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo es un sdAb.
7. La proteína de fusión aislada de la reivindicación 6, en donde el sdAb es uno humanizado.
8. La proteína de fusión aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína de fusión aislada comprende un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina.
9. La proteína de fusión aislada de la reivindicación 8, en donde el polipéptido de región Fc de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-4.
10. La proteína de fusión aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un método para tratar una enfermedad infecciosa, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión a un sujeto que lo necesite.
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