ES2853823T3

ES2853823T3 - Anticuerpos de PD-L1 que se unen a PD-L1 canino

Info

Publication number: ES2853823T3
Application number: ES15771582T
Authority: ES
Inventors: Mohamad Morsey; Yuanzheng Zhang; - Morozov Denise Bartels; Jason Erskine; Ian Tarpey
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2035-09-29
Also published as: CN107074952B; US10550194B2; US20200109212A1; WO2016050721A1; CA2961987A1; AU2015326996B2; US20180237535A1; BR112017006203A2; AU2021218094B2; US11447561B2; CN112851816B; AU2015326996A1; CN112851816A; JP2017534267A; CN107074952A; RU2722562C2; US20220389114A1; JP6797111B2; AU2021218094A1; RU2017114341A3

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen al ligando 1 de muerte programada canino (PD-L1 canino) con especificidad que comprende un conjunto de tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera: CDR ligera 1 (CDRL1), CDR ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3); con tres CDR de cadena pesada: CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDRH2) y CDR pesada 3 (CDRH3) seleccionados del grupo que consiste en: (a) en donde CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13; (b) en donde CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14; (c) en donde CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15; (d) en donde CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16; (e) en donde CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17; (f) en donde CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18; y (g) en donde CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 19; (h) en donde CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 20: (i) en donde CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 21; (j) en donde CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 22; (k) en donde CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 23; (l) en donde CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24; y en donde el anticuerpo se une al PD-L1 canino y bloquea la unión del PD-L1 canino a la muerte programada canina 1 (PD-1).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de PD-L1 que se unen a PD-L1 canino

La divulgación técnica detallada que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención per se y puede también proporcionar unos antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes técnicos adicionales proporcionados no pretenden definir la invención como tal (la cual se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien situarla en un contexto técnico más amplio. En consecuencia, se apreciará que las expresiones "realizaciones", "aspectos", "materia objeto" reflejan detalles específicos de la divulgación, pero en la medida en que se refieren a una parte de los antecedentes técnicos adicionales, no pretenden definir como parte de la materia objeto de la invención que no entra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-PD-L1 caninos con propiedades específicas. La presente invención también se refiere a anticuerpos caninizados contra PD-L1 canino que tienen secuencias específicas y una alta afinidad de unión por PD-L1 canino. La presente invención se refiere además a epítopos de PD-L1 canino que se unen a estos anticuerpos, así como a los anticuerpos anti-PD-L1 caninos que se unen a estos epítopos. La invención se refiere además al uso de los anticuerpos de la presente invención en el tratamiento de perros, incluido el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención

Un receptor inmunoinhibidor que se expresa principalmente en los linfocitos T y B activados, el receptor de muerte celular programada 1, también conocido como receptor de muerte programada 1 (PD-1), es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas relacionada con CD28 y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). El PD-1 y miembros de la familia similares son glicoproteínas transmembrana de tipo I que contienen un dominio extracelular de tipo variable de Ig (tipo V) que se une a sus ligandos y una cola citoplasmática que se une a moléculas de señalización. La cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de señalización basados en tirosina, un ITIM (motivo inmunorreceptor de inhibición basado en tirosina) y un ITSM (motivo inmunorreceptor de cambio basado en tirosina).

El PD-1 atenúa las respuestas de los linfocitos T cuando se une al ligando 1 de muerte celular programada, también denominado ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y/o ligando 2 de muerte celular programada, también denominado ligando 2 de muerte programada (PD-L2). La unión de cualquiera de estos ligandos a PD-1 regula negativamente la señalización del receptor de antígeno. El bloqueo de la unión de PD-L1 a PD-1 mejora la inmunidad de los linfocitos T CD8+ específica de tumor, mientras ayuda a la eliminación de las células tumorales por parte del sistema inmunológico. Se ha documentado la estructura tridimensional del PD-1 murino, así como la estructura cocristalina del PD-1 de ratón con PD-L1 humana [Zhang et al., Immunity 20: 337-347 (2004); Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 105: 3011-3016 (2008)].

PD-L1 y PD-L2 son ligandos transmembrana de tipo I que contienen dominios similares a IgV e IgC en la región extracelular junto con regiones citoplásmicas cortas sin motivos de señalización conocidos. Tanto PD-L1 como PD-L2 se expresan constitutivamente o se pueden inducir en varios tipos de células, incluidos tejidos no hematopoyéticos, así como diversos tipos de tumores. PD-L1 no solo se expresa en linfocitos B, T, células mieloides y dendríticas (CD), sino también en células periféricas, tales como células endoteliales microvasculares y órganos no linfoides, por ejemplo, corazón o pulmón. Por el contrario, PD-L2 solo se encuentra en macrófagos y Cd. El patrón de expresión de los ligandos de PD-1 sugiere que PD-1 juega un papel en el mantenimiento de la tolerancia periférica y puede servir además para regular las respuestas autorreactivas de linfocitos T y B en la periferia.

En cualquier caso, ahora está muy claro que PD-1 y PD-L1 desempeñan funciones críticas en al menos ciertos cánceres humanos, presumiblemente mediando la evasión inmunitaria. En consecuencia, se ha demostrado que PD-L1 se expresa en varios tumores de ratón y humanos y es inducible por IFN-y en la mayoría de las líneas de células tumorales negativas para PD-L1 [Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 99: 12293-12297 (2002); Strome et al., Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003)]. Adicionalmente, la expresión de PD-1 en linfocitos que se infiltran en tumores y/o PD-L1 en células tumorales se ha identificado en varias biopsias de tumores humanos primarios. Dichos tejidos tumorales incluyen cánceres de pulmón, hígado, ovario, cuello del útero, piel, colon, glioma, vejiga, mama, riñón, esófago, estómago, células escamosas orales, células uroteliales y páncreas, así como tumores de cabeza y cuello [Brown et al., J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong et al., Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Wintterle et al., Cancer Res. 63: 7462-7467 (2003); Strome et al., Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003); Thompson et al., Cancer Res.

66: 3381-5 (2006); Thompson et al., Clin. Cancer Res. 13: 1757-1761 (2007); Nomi et al., Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157. (2007)]. Más sorprendentemente, la expresión del ligando de PD en células tumorales se ha correlacionado con un mal pronóstico de pacientes humanos con cáncer en múltiples tipos de tumores [revisado en Okazaki y Honjo, Int. Immunol. 19: 813-824 (2007)].

Además, Nomi et al. [Clin. Cáncer Res. 13: 2151-2157 (2007)] demostraron la eficacia terapéutica de bloquear la unión de PD-L1 a pD-1 en un modelo murino de cáncer de páncreas agresivo mediante la administración de anticuerpos dirigidos contra PD-1 o PD-L1. Estos anticuerpos promovieron eficazmente la infiltración de linfocitos T CD8+ reactivos al tumor en el tumor, lo que dio como resultado la regulación positiva de efectores antitumorales, incluyendo IFN-y, granzima B y perforina. De forma similar, el uso de anticuerpos para bloquear la unión de PD-L1 y PD-1 inhibió significativamente el crecimiento tumoral en un modelo de carcinoma de células escamosas de ratón [Tsushima et al., Oral Oncol. 42: 268-274 (2006)].

En otros estudios, la transfección de una línea de mastocitoma murino con PD-L1 condujo a una disminución de la lisis de las células tumorales cuando se cultivaron conjuntamente con un clon de CTL específico del tumor. La lisis se restauró cuando se añadió el anticuerpo monoclonal anti-PD-Ll [Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 99: 12293-12297 (2002)]. In vivo, se demostró que el bloqueo de la interacción PD1/PD-L1 aumenta la eficacia de la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T en un modelo de tumor de ratón [Strome et al., Cancer Res. 63: 6501-6505 (2003)]. La evidencia adicional del papel de PD-1 y PD-L1 en el tratamiento del cáncer proviene de experimentos realizados con ratones con genes inactivados para PD-1 en los que las células de mieloma que expresan PD-L1 crecieron solo en animales de tipo silvestre (lo que dio como resultado el crecimiento tumoral y la muerte animal asociada), pero no en ratones deficientes en PD-1 [Iwai Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 99: 12293-12297 (2002)]. Más recientemente, los anticuerpos monoclonales murinos humanizados contra PD-1 humano han mostrado un éxito inicial en la terapia del cáncer en humanos [véase, por ejemplo, lo documentos US 8.354.509 B2, US 8.008.449 B2 y US 7.595.048 B2].

Los anticuerpos anti-PD-Ll también pueden ser útiles en la infección vírica crónica. Los linfocitos T CD8+ generados después de una infección vírica aguda son altamente funcionales y constituyen un componente importante de la inmunidad protectora. Por el contrario, las infecciones crónicas se caracterizan a menudo por diversos grados de deterioro funcional (agotamiento) de las respuestas de los linfocitos T específicos del virus, y este defecto es la razón principal de la incapacidad del hospedador para eliminar el patógeno persistente. Aunque los linfocitos T efectores funcionales se generan inicialmente durante las primeras etapas de la infección, pierden función de manera gradual durante el curso de una infección crónica. Barber et al. [Nature 439: 682-687 (2006)] mostró que los ratones infectados con una cepa de laboratorio de LCMV desarrollaron una infección crónica que dio como resultado niveles altos de virus en la sangre y otros tejidos. Estos ratones desarrollaron inicialmente una fuerte respuesta de linfocitos T, pero finalmente sucumbió a la infección al agotarse los linfocitos T. Barber et al. descubrieron que la disminución en el número y la función de los linfocitos T efectores en ratones infectados crónicamente se podría revertir inyectando un anticuerpo que bloqueara la interacción entre PD-1 y PD-L1. El documento WO 2013/079174 describe un anticuerpo anti-PD-L1 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo funcional del PD-L1 humano. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos caninos quiméricos (también denominados inmunoglobulina G o IgG), son proteínas tetraméricas grandes de aproximadamente 150 Kd.

Cada proteína IgG está compuesta por dos cadenas ligeras idénticas de aproximadamente 25 Kd cada una y dos cadenas pesadas idénticas de aproximadamente 50 Kd cada una. Hay cuatro subclases de cadenas pesadas de IgG conocidas de IgG canina y se las conoce como IgGA, IgGB, IgGC e IgGD. Existen dos tipos de cadenas ligeras; las cadenas kappa y lambda. Cada una de las cadenas ligeras kappa o lambda se componen de un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Cada una de las dos cadenas pesadas consta de un dominio variable (VH) y tres dominios constantes denominados CH-1, CH-2 y CH-3. El dominio CH-1 está conectado al dominio CH-2 a través d una secuencia de aminoácidos denominada "bisagra" o, como alternativa, "región de bisagra". En los seres humanos, la IgG existe en una de las cuatro subclases denominadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La subclase de IgG está determinada en gran medida por la secuencia de la región de bisagra, que difiere entre las cuatro subclases de IgG. Las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro y cada cadena pesada está unida a una de las cadenas ligeras también mediante un enlace disulfuro.

La digestión de anticuerpos IgG con la enzima papaína rompe la molécula de anticuerpo en la región de bisagra y da como resultado la formación de tres fragmentos. Dos de estos fragmentos son idénticos y cada uno consta de la cadena ligera unida a los dominios VH y CH1 de la cadena pesada. Estos fragmentos se denominan fragmentos "Fab" y contienen los sitios de unión al antígeno del anticuerpo. El tercer fragmento que es resultado de la digestión con papaína se llama "Fc" y contiene el resto de las dos cadenas pesadas unidas por enlaces disulfuro. Por tanto, el Fc contiene un dímero que consta de los dominios CH2 y CH3 de cada una de las dos cadenas pesadas. Mientras que el Fab permite que el anticuerpo se una a su epítopo análogo, el Fc permite que el anticuerpo medie en funciones efectoras inmunes tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), fagocitosis dependiente de anticuerpos (ADCP, por sus siglas en inglés) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Es bien conocido en la técnica que los anticuerpos IgG median funciones efectoras tales como ADCC y ADCP mediante la unión de su porción Fc a una familia de proteínas conocida como receptores Fcv, mientras que la CDC está mediada por la unión del Fc al primer componente del complemento, C1q. También es bien conocido en la técnica que las diferentes subclases de IgG difieren en su capacidad para mediar en estas funciones efectoras. Por ejemplo, la IgG1 humana muestra una fuerte ADCC y CDC, mientras que la IgG4 muestra una ADCC y CDC débiles o nulas. Además, los métodos para la identificación de las subclases de IgG que presentan o carecen de funciones efectoras son bien conocidos en la técnica.

Los enfoques que se basan en el uso de anticuerpos monoclonales con fines terapéuticos requieren el diseño de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos adecuados para un propósito para lograr la respuesta terapéutica deseada. Por ejemplo, algunos enfoques terapéuticos para el cáncer requieren que los anticuerpos terapéuticos tengan funciones efectoras mejoradas, mientras que otros requieren que las funciones efectoras se reduzcan significativamente o se eliminen por completo. La potenciación o eliminación de las funciones efectoras se puede lograr mediante la introducción de una o más mutaciones de aminoácidos (sustituciones) en la porción Fc del anticuerpo para potenciar o reducir la unión a los receptores Fcv y el primer componente del complemento. Existen numerosos informes en la técnica anterior que describen sustituciones de aminoácidos que se pueden introducir en una molécula de anticuerpo para modular sus funciones efectoras. Por ejemplo, Shields et al., [J. of Biol. Chem., 276 (9): 6591-6604 (2001)] desveló que una sustitución de asparagina por alanina (N297A), que da como resultado un anticuerpo no glicosilado, redujo significativamente la unión de anticuerpos a varios receptores Fcv. De manera adicional, Shields et al., desveló que una sustitución de ácido aspártico por alanina (D265A) también redujo significativamente la unión del anticuerpo a receptores Fcv. También se demostró que cada una de las sustituciones de N297A y D265A afectaba significativamente a la CDC. Hay otros informes similares que identifican posibles sustituciones para reducir o eliminar la función efectora en los anticuerpos [por ejemplo, Sazinsky et al., Proc.Nat.Acad.Sci.,105:20167-20172 (2008), Alegre et al., Transplantation, 57:1537-1543 (1994), Hutchins et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 92:11980-11984 (1994), McEarchem et al., Blood, 109:1185-1192 (2007)].

La cita de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" para la presente solicitud.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (incluidos anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno aislados de los mismos) que se unen al ligando 1 de muerte programada canino (PD-L1 canino) con especificidad. En realizaciones particulares, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos son anticuerpos de mamífero. En realizaciones más particulares, los anticuerpos de mamíferos son anticuerpos murinos (es decir, de ratón). En un aspecto relacionado de la presente invención, los anticuerpos aislados son anticuerpos caninizados. En realizaciones específicas, los anticuerpos caninizados son anticuerpos caninizados de mamíferos (por ejemplo, de ratón) anti-PD-L1 canino. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se unen al PD-L1 canino y pueden bloquear la unión del PD-L1 canino al receptor 1 de muerte programada canino (PD-1). La presente invención proporciona además el uso de tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, el tratamiento del cáncer en caninos.

En realizaciones particulares, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al PD-L1 canino con especificidad comprenden tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera: CDR ligera 1 (CDRL1), CDR ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3); y tres CDR de cadena pesada: CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDRH2) y CDR pesada 3 (CDRH3).

En determinadas realizaciones, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13. En otras realizaciones, la CDRH1 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 13. En otras realizaciones más, la CDRH1 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 13 que comprende la clase de estructura canónica de 1. En otras realizaciones más, la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 19. En otras realizaciones más, la CDRH1 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 19. En otras realizaciones más, la CDRH1 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 19 que comprende la clase de estructura canónica de 1.

En determinadas realizaciones, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones, la CDRH2 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones más, la CDRH2 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 14 que comprende la clase de estructura canónica de 3B. En otras realizaciones más, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 20. En otras realizaciones más, la CDRH2 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 20. En otras realizaciones más, la CDRH2 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 20 que comprende la clase de estructura canónica de 3B.

En determinadas realizaciones, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones, la CDRH3 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones más, la CDRH3 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 15 que comprende la clase de estructura canónica de 10. En otras realizaciones más, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 21. En otras realizaciones más, la CDRH3 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 21. En otras realizaciones más, la CDRH3 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 21 que comprende la clase de estructura canónica de 8.

En determinadas realizaciones, la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16. En otras realizaciones, la CDRL1 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 16. En otras realizaciones más, la CDRL1 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 16 que comprende la clase de estructura canónica de 2. En otras realizaciones más, la secuencia de aminoácidos de la CDRL1 comprendel SEQ ID NO: 22. En otras realizaciones más, la CDRL1 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 22. En otras realizaciones más, la CDRL1 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 22 que comprende la clase de estructura canónica de 3.

En determinadas realizaciones, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17. En otras realizaciones, la CDRL2 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 17. En otras realizaciones más, la CDRL2 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 17 que comprende la clase de estructura canónica de 1. En otras realizaciones más, la CDRL2 comprendel SEQ ID NO: 23. En otras realizaciones más, la CDRL2 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 23. En otras realizaciones más, la CDRL2 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 23 que comprende la clase de estructura canónica de 1.

En determinadas realizaciones, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18. En otras realizaciones, la CDRL3 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 18. En otras realizaciones más, la CDRL3 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 18 que comprende la clase de estructura canónica de 1. En otras realizaciones más, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24. En otras realizaciones más, la CDRL3 comprende una variante modificada de forma conservativa del SEQ ID NO: 24. En otras realizaciones más, la CDRL3 comprende una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 24 que comprende la clase de estructura canónica de 1.

La presente invención proporciona además combinaciones de dos o más de las CDR de la presente invención (o variantes de las mismas) en un anticuerpo dado, por ejemplo, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18.

En realizaciones específicas, los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno que se unen a PD-L1 canino comprenden una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 13, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 13 que comprende la clase de estructura canónica de 1; una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 14, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 14 que comprende la clase de estructura canónica de 3B; una CDRH3 que comprendel SEQ ID NO: 15, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 15, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 15 que comprende la clase de estructura canónica de 10; una CDRL1 que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 16, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 16 que comprende la clase de estructura canónica de 2; una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 17, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 17 que comprende la clase de estructura canónica de 1; y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 18, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 18 que comprende la clase de estructura canónica de 1.

En realizaciones relacionadas, los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno que se unen a PD-L1 canino comprenden una CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 19, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 19, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 19 que comprende la clase de estructura canónica de 1; una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 20, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 20, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 20 que comprende la clase de estructura canónica de 3B; una CDRH3 que comprendel SEQ ID NO: 21, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 21, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 21 que comprende la clase de estructura canónica de 8; una CDRL1 que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 22, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 22, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 22 que comprende la clase de estructura canónica de 3; una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 23, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 23, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 23 que comprende la clase de estructura canónica de 1; y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24, una variante modificada de manera conservativa del SEQ ID NO: 24, o una variante (por ejemplo, una variante de función conservativa) del SEQ ID NO: 24 que comprende la clase de estructura canónica de 1. En consecuencia, en un aspecto particular de la presente invención, la presente invención proporciona además anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino. En determinadas realizaciones, los anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino son anticuerpos caninizados de mamífero (por ejemplo, murino) anti-PD-L1 canino. En realizaciones específicas, los anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino (por ejemplo, anticuerpos caninizados de mamífero anti-PD-L1 canino, tales como los anticuerpos caninizados de murino anti-PD-L1 canino) comprenden un cFc que ha sido modificado genéticamente para aumentar, disminuir o eliminar una o más funciones efectoras. En realizaciones particulares de este tipo, el cFc modificado genéticamente disminuye o elimina una o más funciones efectoras. En otras realizaciones particulares, el cFc modificado genéticamente aumenta una o más funciones efectoras.

En determinadas realizaciones, la región cFc modificada genéticamente es una región Fc de IgGB canina modificada genéticamente. En otra de dichas realizaciones, la región cFc modificada genéticamente es una región Fc de IgGC canina modificada genéticamente. En una realización particular, la función efectora es la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) que aumenta, se reduce o se elimina. En otra realización, la función efectora es la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) que aumenta, se reduce o se elimina. En otra realización más, la región cFc ha sido modificada genéticamente para aumentar, reducir o eliminar tanto la ADCC como la CDC.

La presente invención proporciona además marcos caninos y/o cadenas pesadas de longitud completa que comprenden las regiones cFc modificadas genéticamente. En consecuencia, la presente invención proporciona cadenas pesadas de longitud completa de anticuerpos en las que las cadenas pesadas de longitud completa comprenden las regiones cFc modificadas genéticamente de la presente invención y las CDR de la presente invención. Tales cadenas pesadas de longitud completa también se pueden combinar con las correspondientes cadenas ligeras caninas (kappa o lambda) para formar un anticuerpo completo. En realizaciones particulares de este tipo, el anticuerpo resultante se une a PD-L1 canino.

En determinadas realizaciones, la región cFc genéticamente modificada comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 (o el SEQ ID NO: 68) en la que de uno a siete de los siguientes restos de aminoácidos se reemplazan por otro resto de aminoácido en las posiciones indicadas: P4, D31, N63, G64, T65, A93 o P95. El aminoácido que sustituye a P4, D31, N63, G64, T65, A93 y/o P95 se selecciona individualmente de uno de los otros 19 aminoácidos estándar de origen natural, tal como se enumera en la Tabla 1 a continuación. La presente invención proporciona además variantes de las regiones cFc modificadas genéticamente que comprenden una secuencia de aminoácidos que es el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de dichas regiones cFc modificadas genéticamente y conservan al menos el 50 %, el 75 %, el 90 %, el 95 % o más del aumento, la reducción o la eliminación de la ADCC y/o la CDC como las regiones cFc modificadas genéticamente que comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 (o el SEQ ID NO: 68) en la que se sustituyeron uno o más de los siguientes restos de aminoácidos: es decir, en P4, D31, N63, G64, T65, A93 o P95.

En otras realizaciones, de dos a cinco de los siguientes restos de aminoácidos se sustituyen por otro resto de aminoácido en las posiciones indicadas: P4, D31, N63, G64, T65, A93 o P95. En realizaciones particulares de este tipo, la región cFc modificada genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 o el SEQ iD NO: 68 con las siguientes sustituciones: P4A, D31A, N63A, A93G e P95A. En realizaciones relacionadas, la región cFc modificada genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 o el SEQ ID NO: 68 con las siguientes sustituciones: P4A, D31A, N63A e P95A. En otras realizaciones, la región cFc modificada genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 o el SEQ ID NO: 68 con sustituciones en D31 y N63. En realizaciones particulares de este tipo, el resto de ácido aspártico en la posición 31 se sustituye por un resto de ácido glutámico, un resto de asparagina o un resto de alanina, considerando que el resto de asparagina de la posición 63 se sustituye por un resto de glutamina, un resto de histidina o un resto de alanina. En una realización más particular de este tipo, la región cFc modificada genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos del SeQ ID NO: 66 o el SEQ ID NO: 68 con las siguientes sustituciones: D31A y N63A. En realizaciones particulares, la región cFc modificada genéticamente está codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 65 o el SEQ ID NO: 67 que comprende cambios de nucleótidos que se corresponden con las secuencias de aminoácidos que codifican.

En otras realizaciones, la región cFc modificada genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 o el SEQ ID NO: 68 con la sustitución en A93. En una realización particular de este tipo, la sustitución es A93G. En una realización relacionada, la sustitución es A93S. Como se describe en la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/030.812, presentada el 30 de julio de 2014, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad, la sustitución de A93G lleva a una mejora en la unión del complemento C1q, lo que es indicativo de un aumento de la actividad de la CDC.

En realizaciones relacionadas, la región cFc modificada genéticamente comprende además una región de bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 45. En otras realizaciones, la región Fc modificada genéticamente comprende además una región de bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones más, la región Fc modificada genéticamente comprende además una región de bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 47. En otras realizaciones más, la región Fc modificada genéticamente comprende además una región de bisagra modificada genéticamente que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 48.

En realizaciones alternativas, la presente invención proporciona una región Fc de IgGD canina con una región de bisagra modificada genéticamente de un anticuerpo IgGD canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGA canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGB canino o una región de bisagra de un anticuerpo IgGC canino. Además, la presente invención proporciona cadenas pesadas de anticuerpos de longitud completa en las que las cadenas pesadas de longitud completa comprenden la región Fc de IgGD canina de la presente invención con una región de bisagra modificada genéticamente de un anticuerpo IgGD canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGA canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGB canino o una región de bisagra de un anticuerpo IgGC canino. Tales cadenas pesadas de longitud completa también se pueden combinar con las correspondientes cadenas ligeras caninas (kappa o lambda) para formar un anticuerpo completo.

En consecuencia, la presente invención proporciona una región Fc de IgGD canina que además comprende una región de bisagra modificada genéticamente de un anticuerpo IgGD canino. En realizaciones particulares de este tipo, la región Fc de IgGD canina y la región de bisagra modificada genéticamente comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos que es el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6, que comprende un resto de prolina en la posición 10 (P10). En una realización más particular, la región Fc de la IgGD canina y la región de bisagra modificada genéticamente están codificadas por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 5. En otras realizaciones, la región Fc de la IgGD canina comprende además una región de bisagra de un anticuerpo IgGA canino. En realizaciones particulares de este tipo, la región Fc de IgGD canina y la región de bisagra comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos que es el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8. En una realización más particular, la región Fc de la IgGD canina y la región de bisagra están codificadas por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 7. En otras realizaciones más, la región Fc de la IgGD canina comprende además una región de bisagra de un anticuerpo IgGB canino. En realizaciones particulares de este tipo, la región Fc de IgGD canina y la región de bisagra comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10. En una realización más particular, la región Fc de la IgGD canina y la región de bisagra están codificadas por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones más, la región Fc de la IgGD canina comprende además una región de bisagra de un anticuerpo IgGC canino. En realizaciones particulares de este tipo, la región cFc de IgGD canina y la región de bisagra comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que es el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12. En una realización más particular, la región cFc de la IgGD canina y la región de bisagra están codificadas por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 11. La presente invención proporciona además anticuerpos caninizados que comprenden estas regiones Fc de IgGD canina y regiones de bisagra. En una realización particular, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une al receptor 1 de muerte programada canino (PD-1 canino) con especificidad.

Por tanto, la presente invención proporciona anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino con especificidad y/o que tienen una alta afinidad de unión por el PD-L1 canino. En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino también tienen la capacidad de bloquear la unión del PD-L1 canino al PD-1 canino. Dichos anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al PD-L1 canino pueden comprender una cadena pesada de IgG canina de la presente invención y una cadena ligera kappa o lambda. En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino son anticuerpos caninizados murinos anti-PD-L1 canino. La presente invención también se refiere al uso de tales anticuerpos caninizados en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer y/o las debidas a infecciones.

En realizaciones particulares, el anticuerpo caninizado anti-PD-L1 canino comprende una región cFc modificada genéticamente de la presente invención. En realizaciones alternativas, el anticuerpo caninizado anti-PD-L1 canino comprende la región Fc de la IgGD canina con una región de bisagra modificada genéticamente de un anticuerpo IgGD canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGA canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGB canino o una región de bisagra de un anticuerpo IgGC canino. La presente invención proporciona además tales anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino que comprenden los marcos caninos de la presente invención en combinación con las CDR obtenidas a partir de anticuerpos anti-PD-L1 canino de ratón, es decir, tres CDR de cadena ligera: CDR ligera 1 (CDRL1), CDR ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3) y tres CDR de cadena pesada CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDRH2) y CDR pesada 3 (CDRH3).

En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados murinos anti-PD-L1 comprenden la región cFc modificada genéticamente de IgGB o IgGC de la presente invención o, como alternativa, la región Fc de la IgGD canina, junto con una región de bisagra modificada genéticamente de un anticuerpo IgGD canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGA canino, una región de bisagra de un anticuerpo IgGB canino, o una región de bisagra de un anticuerpo IgGC canino en combinación con las CDR obtenidas de anticuerpos anti-PD-L1 canino de ratón. Además, la presente invención no solo proporciona anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino de ratón con CDR específicas tal como se detalla en el presente documento, sino que además proporciona anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino de ratón que comprenden variantes modificadas de forma conservativa de esas CDR así como variantes que comprenden (por ejemplo, comparten) la misma estructura canónica.

Por consiguiente, en realizaciones particulares, el anticuerpo caninizado anti-PD-LI canino comprende además regiones determinantes de complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-3B y H3-10, respectivamente para la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la cadena pesada. En realizaciones incluso más particulares, las CDR para las correspondientes cadenas ligeras tienen estructuras canónicas de: L1-2, L2-1 y L3-1, respectivamente para la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la cadena ligera. En otras realizaciones, el anticuerpo caninizado anti-PD-L1 canino comprende además regiones determinantes de complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-3B y H3-8, respectivamente para la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la cadena pesada. En realizaciones aún más particulares de este tipo, las CDR para las correspondientes cadenas ligeras tienen estructuras canónicas de: L1-3, L2-1 y L3-1, respectivamente para la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la cadena ligera.

En realizaciones más particulares, el anticuerpo caninizado de la presente invención o su fragmento de unión a antígeno comprende una o más de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 1 (CDR1 de VH) con una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13 o el SEQ ID NO: 19. En otra realización, la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 2 (CDR2 de VH) comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14 o el SEQ ID NO: 20. E otra realización más, la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 3 (CDR3 de VH) comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15 o el SEQ ID NO: 21. En una realización particular de este tipo, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende tanto una CDR1 de VH que comprende tanto una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13 o el SEQ ID NO: 19 como una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14 o el SEQ ID NO: 20.

En otra de dichas realizaciones, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende tanto una CDR1 de VH que comprende tanto una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13 o el SEQ ID NO: 19 como una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15 o el SEQ ID NO: 21. En otra más de estas realizaciones, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende tanto una CDR2 de VH que comprende tanto una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14 o el SEQ ID NO: 20 como una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15 o el SEQ ID NO: 21. En otra más de dichas realizaciones, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende una CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13 o el SEQ ID NO: 19, una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14 o el SEQ ID NO: 20, y una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15 o el SEQ ID NO: 21.

En realizaciones particulares, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno también comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de VL) que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16 o el SEQ ID NO: 22. En realizaciones relacionadas, la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera 2 (CDR2 de VL) comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17 o el SEQ ID NO: 23. E otra realización más, la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera 3 (CDR3 de VL) comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18 o el SEQ ID NO: 24. En una realización particular de este tipo, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende tanto una CDR1 de VL que comprende tanto una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16 o el SEQ ID NO: 22 como una CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17 o el SEQ ID NO: 23. En otra de dichas realizaciones, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende tanto una CDR1 de VL que comprende tanto una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16 o el SEQ ID NO: 22 como una CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18 o el SEQ ID NO: 24. En otra más de estas realizaciones, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende tanto una CDR2 de VL que comprende tanto una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17 o el SEQ ID NO: 23 como una CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18 o el SEQ ID NO: 24. En otra más de dichas realizaciones, el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión al antígeno comprende una CDR1 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16 o el SEQ ID NO: 22, una CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17 o el SEQ ID NO: 23, y una CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18 o el SEQ ID NO: 24.

La presente invención proporciona además anticuerpos caninizados que comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 o que es el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 y el SEQ ID NO: 28 o es decir, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos caninizados. La presente invención también proporciona anticuerpos caninizados que comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 30 o que es el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 30 y el SEQ ID No: 32 o es decir, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 o fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos caninizados.

En realizaciones particulares, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SEQ ID NO: 26) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 242, (ii) A, G o S en la posición 269, (iii) A, G o S en la posición 301, (iv) G, P o A en la posición 302, (v) T, A, G o S en la posición 303, (vi) A, G o S en la posición 331, y (vii) P, A, G o S en la posición 333. En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SeQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 240, (ii) A, G o S en la posición 267, (iii) A, G o S en la posición 299, (iv) G, P o A en la posición 300, (v) T, A, G o S en la posición 301, (vi) A, G o S en la posición 329, y (vii) P, A, G o S en la posición 331. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SEQ ID NO: 32) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 238, (ii) A, G o S en la posición 265, (iii) A, G o S en la posición 297, (iv) G, P o A en la posición 298, (v) T, A, G o S en la posición 299, (vi) A, G o S en la posición 327, y (vii) P, A, G o S en la posición 329.

En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SEQ iD NO: 26) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 242, (ii) A en la posición 269, (iii) A en la posición 301, (iv) G, P o A en la posición 302, (v) T, A, G o S en la posición 303, (vi) A, G o S en la posición 331, y (vii) P, A, G o S en la posición 333. En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 240, (ii) A en la posición 267, (iii) A en la posición 299, (iv) G, P o A en la posición 300, (v) T, A, G o S en la posición 301, (vi) A, G o S en la posición 329, y (vii) P, A, G o S en la posición 331. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SEQ ID NO: 32) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 238, (ii) A en la posición 265, (iii) A en la posición 297, (iv) G, P o A en la posición 298, (v) T, A, G o S en la posición 299, (vi) A, G o S en la posición 327, y (vii) P, A, G o S en la posición 329.

En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID No: 26) que comprende (i) A en la posición 242, (ii) A en la posición 269, (iii) A en la posición 301, (iv) P en la posición 302, (v) A en la posición 303, (vi) G, en la posición 331, y (vii) A, en la posición 333. En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) A en la posición 240, (ii) A en la posición 267, (iii) A en la posición 299, (iv) P en la posición 300, (v) A en la posición 301, (vi) G en la posición 329 y (vii) A en la posición 331. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 32) que comprende (i) A en la posición 238, (ii) A en la posición 265, (iii) A en la posición 297, (iv) P en la posición 298, (v) A en la posición 299, (vi) G en la posición 327 y (vii) A en la posición 329.

En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 26) que comprende (i) P en la posición 242, (ii) A, G o S en la posición 269, (iii) A, G o S en la posición 301, (iv) G en la posición 302, (v) T en la posición 303, (vi) A en la posición 331 y (vii) P en la posición 333. En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) P en la posición 240, (ii) A, G o S en la posición 267, (iii) A, G o S en la posición 299, (iv) G en la posición 300, (v) T en la posición 301, (vi) A en la posición 329 y (vii) P en la posición 331. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID No: 32) que comprende (i) P en la posición 238, (ii) A, G o S en la posición 265, (iii) A, G o S en la posición 297, (iv) G en la posición 298, (v) T en la posición 299, (vi) A en la posición 327 y (vii) P en la posición 329.

En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID No: 26) que comprende (i) P en la posición 242, (ii) A en la posición 269, (iii) A en la posición 301, (iv) G en la posición 302, (v) T en la posición 303, (vi) A en la posición 331 y (vii) P en la posición 333. En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) P en la posición 240, (ii) A en la posición 267, (iii) A en la posición 299, (iv) G en la posición 300, (v) T en la posición 301, (vi) A en la posición 329 y (vii) P en la posición 331. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 32) que comprende (i) P en la posición 238, (ii) A en la posición 265, (iii) A en la posición 297, (iv) G en la posición 298, (v) T en la posición 299, (vi) A en la posición 327 y (vii) P en la posición 329.

En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SEQ iD NO: 26) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 242, (ii) A, G o S en la posición 269, (iii) A, G o S en la posición 301, (iv) G en la posición 302, (v) T en la posición 303, (vi) A, G o S en la posición 331, y (vii) P, A, G o S en la posición 333. En otras realizaciones de este tipo, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SeQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 240, (ii) A, G o S en la posición 267, (iii) A, G o S en la posición 299, (iv) G en la posición 300, (v) T en la posición 301, (vi) A, G o S en la posición 329, y (vii) P, A, G o S en la posición 331. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SEQ ID NO: 32) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 238, (ii) A, G o S en la posición 265, (iii) A, G o S en la posición 297, (iv) G en la posición 298, (v) T en la posición 299, (vi) A, G o S en la posición 327, y (vii) P, A, G o S en la posición 329.

En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SEQ ⁱD NO: 26) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 242, (ii) A en la posición 269, (iii) A en la posición 301, (iv) G en la posición 302, (v) T en la posición 303, (vi) A, G o S en la posición 331, y (vii) P, A, G o S en la posición 333. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 240, (ii) A en la posición 267, (iii) A en la posición 299, (iv) G en la posición 300, (v) T en la posición 301, (vi) A, G o S en la posición 329, y (vii) P, A, G o S en la posición 331. En otras realizaciones de este tipo, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, 98% o 99% idéntica a el SeQ ID NO: 32) que comprende (i) P, A, G o S en la posición 238, (ii) A en la posición 265, (iii) A en la posición 297, (iv) G en la posición 298, (v) T en la posición 299, (vi) A, G o S en la posición 327, y (vii) P, A, G o S en la posición 329.

En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID No : 26) que comprende (i) A en la posición 242, (ii) A en la posición 269, (iii) A en la posición 301, (iv) G en la posición 302, (v) T en la posición 303, (vi) G en la posición 331 y (vii) A en la posición 333. En otras realizaciones más, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SeQ ID NO: 28 o 30) que comprende (i) A en la posición 240, (ii) A en la posición 267, (iii) A en la posición 299, (iv) G en la posición 300, (v) T en la posición 301, (vi) G en la posición 329 y (vii) A en la posición 331. En otras realizaciones de este tipo, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 (o el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 32) que comprende (i) A en la posición 238, (ii) A en la posición 265, (iii) A en la posición 297, (iv) G en la posición 298, (v) T en la posición 299, (vi) G en la posición 327 y (vii) A en la posición 329. Además, la presente invención proporciona un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende además una cadena ligera canina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38 o el SEQ ID NO: 44.

En consecuencia, la presente invención proporciona además un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38. En otra realización, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44.

En otra realización más, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44. En otra realización más, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38.

La presente invención proporciona además un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38. En otra realización, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44.

La presente invención proporciona además un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 44. En otra realización, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38. En una realización relacionada, el anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 38.

La presente invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la presente invención, incluidas las CDR, las regiones cFc, las regiones cFc con las regiones de bisagra, y las cadenas pesadas, y las cadenas ligeras de los anticuerpos caninizados de la presente invención. La presente invención proporciona además vectores de expresión que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos de la presente invención. La presente invención proporciona además células hospedadoras que comprenden uno o más vectores de expresión de la presente invención y métodos para expresar las CDR y/o las regiones cFc, y/o las regiones cFc con las regiones de bisagra y/o las cadenas pesadas, y/o las cadenas ligeras de los anticuerpos caninizados de la presente invención usando tales células hospedadoras. La presente invención también proporciona células hospedadoras que han sido modificadas genéticamente para expresar las CDR y/o las regiones cFc, y/o las regiones cFc con las regiones de bisagra y/o las cadenas pesadas, y/o las cadenas ligeras de los anticuerpos caninizados de la presente invención en ausencia de tales vectores. En realizaciones particulares, estos ácidos nucleicos, vectores de expresión, polipéptidos o células hospedadoras de la invención son útiles en los métodos de preparación de un anticuerpo.

En realizaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno recombinante del mismo. En realizaciones relacionadas, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera están conectados por un enlazador flexible para formar un anticuerpo monocatenario.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno aislado del mismo) que se une al PD-L1 canino con especificidad, y que cuando se une al PD-L1 canino, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82. En realizaciones relacionadas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al PD-L1 canino con especificidad, también se une a al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 83. En otras realizaciones más, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al PD-L1 canino con especificidad, también se une a al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y al menos a un resto de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 83. En realizaciones particulares, estos anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno de los mismos bloquean la unión del PD-L1 canino al PD-1 canino. En realizaciones relacionadas, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En realizaciones particulares de este tipo, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal murino anti-PD-L1 canino. En realizaciones más particulares, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo caninizado. En realizaciones aún más particulares, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a 2 a 5 restos de aminoácidos del SEQ ID NO: 82. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a 6 a 12 restos de aminoácidos del SEQ ID NO: 82. En otras realizaciones más, el anticuerpo aislado o su fragmento de unión a antígeno se une a 13 a 20 restos de aminoácidos del SEQ ID NO: 82. En realizaciones relacionadas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a 2 a 5 restos de aminoácidos del SEQ ID NO: 83. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a 6 a 11 restos de aminoácidos del SEQ ID NO: 83.

En otras realizaciones más, se proporcionan anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que compiten de forma cruzada por la unión con el PD-L1 canino con uno o más de los anticuerpos anti-PD-L1 canino de la presente invención. En realizaciones particulares, los anticuerpos de competencia cruzada y sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino y bloquean la unión del PD-L1 canino al PD-1 canino. En realizaciones más particulares, los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de unión a antígeno compiten de forma cruzada con 4F9 (o un anticuerpo con las 6 CDR de 4F9) para unirse al PD-L1 canino. En otras realizaciones más particulares, los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de unión a antígeno compiten de forma cruzada con 5F12 (o un anticuerpo con las 6 CDR de 5F12) para unirse al PD-L1 canino. En otras realizaciones más, los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de unión a antígeno compiten de forma cruzada con 4F9 y con 5F12 para unirse al PD-L1 canino.

En realizaciones particulares, un anticuerpo monoclonal de la presente invención es un anticuerpo murino. En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo caninizado. En realizaciones más particulares, un anticuerpo monoclonal de la presente invención es un anticuerpo caninizado murino.

Adicionalmente, la presente invención proporciona anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos caninizados) para el PD-L1 canino que comprenden las CDR de la presente invención o variantes de las c Dr , que tienen las estructuras canónicas correspondientes proporcionadas en el presente documento, y/o que se unen a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o 83 del PD-L1. En realizaciones particulares de este tipo, la constante de disociación (Kd) para la unión anticuerpo caninizado-PD-L1 canino es 1 X 10'5 hasta 1 X 10'12 M. En realizaciones más particulares, los anticuerpos caninizados contra el PD-L1 canino comprenden variantes de las CDR de la presente invención que tienen las estructuras canónicas correspondientes proporcionadas en el presente documento y se unen a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o la 83 del PD-L1. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al PD-L1 canino con especificidad, y cuando se unen al PD-L1 canino, el anticuerpo se une a al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o la 83 del PD-L1. En realizaciones particulares de este tipo, los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino y bloquean la unión del PD-L1 canino al PD-1 canino. En consecuencia, en realizaciones particulares cuando se une al PD-L1 canino, el anticuerpo caninizado (incluidos los anticuerpos con una o más variantes de CDR, por ejemplo, una variante tal como, pero sin limitarse a una variante modificada de manera conservativa y/o una variante que comprende una clase de estructura canónica definida) se une a al menos un resto de aminoácido dentro de un epítopo de PD-L1, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o el SEQ ID NO: 83.

La presente invención proporciona además anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al PD-L1 canino con una constante de disociación (Kd) que es inferior a 1 X 10'12 M (por ejemplo, 1 X 10'13 M, o incluso más baja). En otras realizaciones, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino con una constante de disociación de 1 X 10'5 M hasta 1 X 10'12 M. En realizaciones más particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino con una constante de disociación de 1 X 10'7 M hasta 1 X 10'11 M. En realizaciones aún más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen al PD-L1 canino con una constante de disociación de 1 X 10'8 M hasta 1 X 10'11 M. En realizaciones aún más particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino con una constante de disociación de 1 X 10'8 M hasta 1 X 10'10M.

La presente invención también proporciona anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al PD-L1 canino con una tasa de (kon) que es mayor que 1 X 107 M' V 1. En otras realizaciones, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino con una tasa de 1 x 102 M' V 1 hasta 1 X 107 M' V 1. En realizaciones más particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino con una tasa de 1 x 103 M' V 1 hasta 1 X 106 M' V 1. En realizaciones aún más particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PD-L1 canino con una tasa de 1 x 103 M' V 1 hasta 1 X 105 M' V 1. En realizaciones todavía más particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PDV 1 canino con una tasa de 1 x 104 M' V 1 hasta 1 X 105 M' V 1.

La presente invención también proporciona anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al PDV 1 canino con una tasa de (kf menor que 1 X 10' V 1. En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PDV 1 canino con una tasa de (kf de 1 x 10' V 1 hasta 1 X 10' V 1. En realizaciones más particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PDV 1 canino con una tasa de (kf de 1 x 10' V 1 hasta 1 X 10' V 1. En realizaciones aún más particulares, los anticuerpos caninizados o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al PDV1 canino con una tasa de (kf de 1 x 10' V 1 hasta 1 X 10' V 1.

En realizaciones relacionadas, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos caninizados) o sus fragmentos de unión a antígeno estimulan respuestas de memoria específicas de antígeno a un tumor o patógeno. En realizaciones particulares, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos caninizados) o sus fragmentos de unión a antígeno estimulan una respuesta de anticuerpos in vivo. En otras realizaciones particulares, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos caninizados) o sus fragmentos de unión a antígeno estimulan una respuesta inmune en un sujeto animal. En realizaciones más específicas, el sujeto animal es un canino. En una realización relacionada, el sujeto animal es un felino.

En consecuencia, cualquiera de los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos caninizados) de la presente invención pueden presentar una, dos, tres, cuatro, cinco, o todas estas propiedades, es decir, las constantes de disociación mencionadas anteriormente con el PDV 1 canino, las tasas kon de unión con PDV 1 canino mencionadas anteriormente, las tasas kf para disociarse del complejo de unión anticuerpo caninizado'PD'L1 canino mencionadas anteriormente, estimular respuestas de memoria específicas de un antígeno a un tumor o patógeno, estimular una respuesta de anticuerpos in vivo, y/o estimular una respuesta inmune en un sujeto animal.

En realizaciones más particulares, los anticuerpos y/o sus fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen al PD-L1 canino y también bloquean la unión del PD-L1 canino al PD-1. En realizaciones incluso más particulares, los anticuerpos caninizados y sus fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen al PD-L1 canino y bloquean la unión del PD-L1 canino al PD-1.

Tal como se indica anteriormente, los anticuerpos (y sus fragmentos de unión a antígeno) de la presente invención, incluyendo ciertos anticuerpos antes mencionados (y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos), pueden ser anticuerpos monoclonales (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos), anticuerpos de mamífero (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos), por ejemplo, anticuerpos murinos (de ratón) (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos), anticuerpos caninizados (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que incluyen anticuerpos murinos caninizados (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos). En ciertas realizaciones, se aíslan los anticuerpos (y sus fragmentos de unión a antígeno).

En realizaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno. En realizaciones relacionadas, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera están conectados por un enlazador flexible para formar un anticuerpo monocatenario.

En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab. En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab'. En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un fragmento (Fab')2. En otras realizaciones más, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un diacuerpo. En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo de dominio. En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo de dominio único camelizado.

En realizaciones particulares, un anticuerpo caninizado de murino anti-PD-L1 canino o un fragmento de unión a antígeno aumenta la respuesta inmune del sujeto animal en tratamiento (por ejemplo, canino o felino).

La presente invención proporciona además ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican cualquiera de los anticuerpos y porciones de los mismos (incluidas las CDR) de la presente invención. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican cualquiera de las cadenas ligeras de los anticuerpos caninizados o porciones de los mismos de la presente invención. De forma similar, la presente invención proporciona ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican cualquiera de las cadenas pesadas del anticuerpo caninizado o porciones del mismo de la presente invención. La presente invención proporciona además vectores de expresión que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos (incluyendo ácidos nucleicos aislados) de la presente invención. En consecuencia, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos caninizados murinos anti-PD-L1 canino o partes de los mismos de la presente invención. En realizaciones relacionadas, tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se pueden usar para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto canino y/o felino. Como alternativa, o en conjunto, la presente invención proporciona el uso de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente invención para uso diagnóstico. En más realizaciones adicionales, se proporciona un kit que comprende cualquiera de los anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno desvelados en el presente documento. En realizaciones específicas, se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos caninizados murinos anti-PD-L1 canino o fragmentos de unión a antígeno de la invención. La presente invención proporciona además células hospedadoras que comprenden uno o más vectores de expresión de la presente invención. En realizaciones particulares, estos ácidos nucleicos, los vectores de expresión o polipéptidos de la invención son útiles en los métodos para preparar un anticuerpo.

La presente invención proporciona además péptidos antigénicos (incluidos péptidos antigénicos aislados) que consisten en 80 o menos restos de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o el SEQ ID NO: 83. En realizaciones relacionadas, los péptidos antigénicos (incluidos péptidos aislados) consisten en 60 o menos restos de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o el SEQ ID NO: 83. En realizaciones relacionadas, los péptidos antigénicos (incluidos péptidos aislados) consisten en 11 a 45 restos de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o el SEQ ID NO: 83. En otras realizaciones más, los péptidos antigénicos consisten en 5 a 20 restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 83. En otras realizaciones más, los péptidos antigénicos consisten en 5 a 11 restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 83.

La presente invención proporciona además péptidos antigénicos (incluidos péptidos aislados) que consisten en 80 o menos restos de aminoácidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o el SEQ ID NO: 83 y se une a un anticuerpo de mamífero aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En realizaciones relacionadas, los péptidos antigénicos (incluidos los péptidos antigénicos aislados) consisten en 60 o menos restos de aminoácidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y/o el SEQ ID NO: 83 y se une a un anticuerpo de mamífero aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otras realizaciones, los péptidos constan de 5 a 20 restos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos que es el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 y se une a un anticuerpo de mamífero aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otras realizaciones, los péptidos constan de 5 a 11 restos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos que es el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 83 y se une a un anticuerpo de mamífero aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones particulares, el anticuerpo de mamífero es 4E9. En otras realizaciones, el anticuerpo de mamífero es 5F12.

La presente invención proporciona además proteínas de fusión que comprenden cualquiera de los péptidos antigénicos mencionados anteriormente. En una realización particular, la proteína de fusión comprende tal péptido antigénico y una región Fc de un anticuerpo IgG de mamífero no canino. En una realización más particular, la proteína de fusión comprende una región Fc de un anticuerpo IgG de mamífero no canino. En ciertas realizaciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG murina. En realizaciones alternativas, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG humana. En otras realizaciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG equina. En otras realizaciones más, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG porcina. En otras realizaciones más, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG bovina.

En realizaciones particulares, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG1. En otras realizaciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG2a. En otras realizaciones más, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG3. En otras realizaciones más, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG4.

En otras realizaciones, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos y proteína de unión a maltosa mencionados anteriormente. En otras realizaciones más, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y óefa-galactosidasa. En otras realizaciones más, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y glutatión S-transferasa. En otras realizaciones más, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y tiorredoxina. En otras realizaciones más, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y Gro EL. En otras realizaciones más, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y NusA.

La presente invención proporciona además ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican los péptidos antigénicos y las proteínas de fusión correspondientes de la presente invención. La presente invención también proporciona vectores de expresión que comprenden estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que comprenden uno o más vectores de expresión de la presente invención.

Además, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-PD-L1 caninos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención, péptidos antigénicos (incluidos péptidos antigénicos aislados) de PD-L1 canino, proteínas de fusión que comprenden los péptidos antigénicos de PD-L1 canino de la presente invención, ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican los fragmentos antigénicos y/o proteínas de fusión de la presente invención, los vectores de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos, o cualquier combinación de los mismos, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En realizaciones particulares, tales composiciones farmacéuticas comprenden además un anticuerpo anti-PD-1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones más particulares, el anticuerpo anti-PD-1 canino es un anticuerpo caninizado murino anti-PD-1 canino o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo caninizado murino anti-PD-1 canino. En realizaciones relacionadas, dichas composiciones farmacéuticas comprenden además un anticuerpo anti-CTLA-4 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones particulares, el anticuerpo anti-CTLA-4 canino es un anticuerpo caninizado murino anti-CTLA-4 canino o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo caninizado murino anti-CTLA-4 canino.

En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno, dos, tres o más de los siguientes: un anticuerpo anti-PD-L1 canino, un anticuerpo anti-PD-1 canino, un anticuerpo anti-CTLA-4 canino, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-PD-L1 canino, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-PD-1 canino, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CTLA-4 canino. En realizaciones particulares, tales anticuerpos anti-proteína canina (es decir, anti-PD-L1, PD-1 o CTLA-4 de canino) o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos murinos anti-proteína canina. En otros de tales anticuerpos anti-proteína canina o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos caninizados anti-proteína canina. En realizaciones más particulares, los anticuerpos anti-proteína canina o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos caninizados murinos anti-proteína canina.

Además, la presente invención proporciona métodos para aumentar la actividad de una célula inmunitaria, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la presente invención. En determinadas realizaciones, el método se utiliza para el tratamiento del cáncer. En otras realizaciones, el método se utiliza en el tratamiento de una infección o enfermedad infecciosa. En otras realizaciones más, un anticuerpo caninizado de la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo se usa como adyuvante de vacuna. En realizaciones particulares, se puede administrar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo caninizado murino anti-PD-L1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo antes, después o simultáneamente con un anticuerpo caninizado murino anti-PD-1 canino o el fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo caninizado murino anti-CTLA-4 canino o el fragmento de unión a antígeno del mismo.

Estos y otros aspectos de la presente invención se comprenderán mejor en referencia la siguiente Breve descripción de los dibujos y la Descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de ELISA para la reactividad de dos mAb anti-PD-L1 canino de ratón contra PD-L1 canino, como una función de la DO 650/490 frente al log mAb (nM). Ambos mAb, denominados 4F9 y 5F12, demuestran una unión fuerte y dependiente de la dosis al PD-L1 canino.

La Figura 2 muestra el bloqueo de ligando con mAb de ratón anti-PD-L1 canino. Se analizó la capacidad de dos mAb denominados 4F9 y 5F12 para inhibir la unión de PD-L1 a PD-1 expresado en células CHO. Ambos mAb bloquearon la unión de PD-L1 a PD-1, aunque el mAb 4F9 es un inhibidor más fuerte que 5F12.

Descripción detallada

Abreviaturas

A lo largo de la descripción detallada y de los ejemplos de la invención, se utilizarán las siguientes abreviaturas: ADCC citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

CDC citotoxicidad dependiente del complemento

CDR región determinante de complementariedad en las regiones variables de inmunoglobulina, definido para anticuerpos humanos utilizando el sistema de numeración de Kabat

CHO Ovario de hámster chino

CE50 concentración que da como resultado una eficacia o unión del 50 %

ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

FR Región marco del anticuerpo: las regiones variables de inmunoglobulina excluyendo las regiones CDR.

HRP Peroxidasa de rábano picante

IFN interferón

CI50 concentración que da como resultado una inhibición del 50 %

IgG Inmunoglobulina G

Kabat Un sistema de alineación y numeración de inmunoglobulinas para anticuerpos humanos iniciado por Elvin A. Kabat [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]

mAb Anticuerpo monoclonal (también Mab o MAb)

MES ácido 2-(A/-morfolin)etanosulfón¡co

MDA Mecanismo de acción

SHN Suero humano normal

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

FC Farmacocinética

EBS Enterotoxina B de Staphylococcus

TT toxoide tetánico

Región V El segmento de cadenas de IgG humanas que es variable en secuencia entre diferentes anticuerpos.

Se extiende hasta el resto 109 de Kabat en la cadena ligera y hasta el 113 en la cadena pesada. VH Región variable de cadena pesada de inmunoglobulina

VK Región variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina

Definiciones

Para que la invención se entienda más fácilmente, a continuación se definen específicamente algunos términos técnicos y científicos. A menos que se defina específicamente en otra parte del presente documento, todos los demás términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Tal como se usan en el presente documento, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como "un", "uno/una", "el" y "la", incluyen sus referencias plurales correspondientes a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

"Activación", de la manera en la que se aplica a células o a receptores, se refiere a la activación o al tratamiento de una célula o de un receptor con un ligando, a menos que el contexto indique lo contrario o explícitamente. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y compuestos de unión derivados de anticuerpos. "Ligando" también abarca moléculas pequeñas, por ejemplo, miméticos peptídicos de citocinas y miméticos peptídicos de anticuerpos. "Activación" puede referirse a la activación celular regulada por mecanismos internos así como por factores externos o ambientales.

La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula con un ligando o con un receptor, a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización celular, diferenciación o maduración; a la actividad antigénica, a la modulación de las actividades de otras moléculas, y similares. La "actividad" de una molécula también puede referirse a la actividad para modular o conservar interacciones entre células, por ejemplo, adhesión o actividad en la conservación de la estructura de una célula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. "Actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína] o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico, o similar. "Actividad" puede referirse a la modulación de componentes de los sistemas inmunitarios innato o adaptativo.

La "administración" y el "tratamiento", como se aplica a un animal, por ejemplo, un sujeto experimental canino, célula, tejido, a un órgano o a un líquido biológico, se refiere al contacto de un agente farmacéutico exógeno, terapéutico, de diagnóstico o composición para el animal, por ejemplo, un sujeto canino, célula, tejido, órgano o líquido biológico. El tratamiento de una célula abarca el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un líquido, donde el líquido está en contacto con la célula. "Tratar" o "tratamiento" significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención, interna o externamente a un sujeto veterinario (por ejemplo, un canino o un felino) que tiene uno o más síntomas de enfermedad, o se sospecha que tiene una enfermedad, para lo cual el agente tiene actividad terapéutica. En consecuencia, "administración" y "tratamiento" también significa tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, mediante un reactivo, diagnóstico, compuesto de unión, o por otra célula.

Normalmente, para aliviar y/o mejorar uno o más síntomas de enfermedad en el sujeto tratado o en la población tratada, el agente se administra en una cantidad eficaz, ya sea induciendo la regresión del avance de dicho(s) síntoma(s) o inhibiendo su avance en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad en particular (también denominada "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar según factores tales como la patología de la enfermedad, la edad y el peso del sujeto (por ejemplo, canino), y la capacidad de la composición farmacéutica para provocar una respuesta deseada en el sujeto. El alivio o la mejora de un síntoma de la enfermedad puede evaluarse mediante cualquier medida clínica utilizada normalmente por los veterinarios u otros proveedores de atención médica capacitados para evaluar la gravedad o el estado de avance de ese síntoma. Aunque una realización de la presente invención (por ejemplo, un método de tratamiento o un artículo de fabricación) puede que no sea eficaz para aliviar el síntoma o los síntomas de la enfermedad específica en cada sujeto, debería aliviar el síntoma o los síntomas de la enfermedad específica en un número estadísticamente significativo de sujetos según lo determinado por cualquier prueba estadística conocida en la técnica, tal como la prueba de la t de Student, la prueba de chi2, la prueba U de Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complemento) que da como resultado un daño selectivo sobre, la destrucción o eliminación del cuerpo de los mamíferos (por ejemplo, cuerpo canino) de células cancerosas, células o tejidos infectados con patógenos o patógenos invasores.

El término "sujeto" incluye cualquier organismo, preferentemente un animal, más preferentemente un mamífero (por ejemplo, canino, felino o humano) y lo más preferentemente un canino.

Tal como se usan en el presente documento, el término "canino" incluye todos los perros domésticos, Canis lupus familiaris o Canis familiaris, a menos que se indique otra cosa.

Tal como se usan en el presente documento, el término "felino" se refiere a cualquier miembro de la familia Felidae. Los miembros de esta familia incluyen miembros silvestres, de zoológico y domésticos, tal como cualquier miembro de las subfamilias Felinae, por ejemplo, gatos, leones, tigres, pumas, jaguares, leopardos, leopardos de las nieves, panteras, leones de montaña de América del Norte, guepardos, linces, gatos monteses, caracales o cualquier cruce de los mismos. Los gatos también incluyen gatos domésticos, gatos de compañía de raza pura y/o mestizos, gatos de espectáculos, gatos de laboratorio, gatos clonados y gatos silvestres o asilvestrados.

Se ha descubierto que el PD-1 canino comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 50 [solicitud provisional de EE. UU. 61/918,946, presentada el 20 de diciembre de 2013, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento en su totalidad]. En una realización específica, el PD-1 canino está codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 49.

Se ha descubierto que el PD-L1 canino comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 56 [solicitud provisional de EE. UU. 61/918,946, presentada el 20 de diciembre de 2013, citado anteriormente]. En una realización específica, el PD-L1 canino está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprendel SEQ ID NO: 55.

Tal como se usan en el presente documento, una "sustitución de un resto de aminoácido" por otro resto de aminoácido en una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, un anticuerpo, es equivalente a "reemplazar un resto de aminoácido" con otro resto de aminoácido e indica que un resto de aminoácido particular en una posición específica en la secuencia de aminoácidos ha sido reemplazado (o sustituido) por un resto de aminoácido diferente. Por ejemplo, una de estas sustituciones (reemplazos) se denota como P4A de una región Fc de una secuencia de aminoácidos IgGB o IgGC, en cuyo caso, el resto de prolina en la posición de aminoácido 4 de la secuencia de aminoácidos de la región Fc de una IgGB o la región Fc de una IgGC se ha sustituido (reemplazado) por un resto de alanina.

En consecuencia, tales sustituciones se pueden diseñar particularmente, es decir, reemplazar intencionalmente una alanina con una serina en una posición específica en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, la tecnología del ADN recombinante. Como alternativa, un resto de aminoácido particular o una cadena de restos de aminoácidos de un anticuerpo puede ser sustituida por uno o más restos de aminoácidos a través de procesos de selección más naturales, por ejemplo, basados en la capacidad del anticuerpo producido por una célula para unirse a una región determinada de ese antígeno, por ejemplo, uno que contiene un epítopo o una porción del mismo, y/o que el anticuerpo comprenda una CDR particular que conserva la misma estructura canónica que la CDR que está sustituyendo. Tales sustituciones/reemplazos pueden llevar a "variantes" de CDR y/o a variantes de anticuerpos. La identidad de secuencia se refiere al grado en el que los aminoácidos de dos polipéptidos son iguales en posiciones equivalentes cuando las dos secuencias están alineadas de manera óptima. Como se usa en el presente documento, una secuencia de aminoácidos es 100% "idéntica" a una segunda secuencia de aminoácidos cuando los restos de aminoácidos de ambas secuencias son idénticos. En consecuencia, una secuencia de aminoácidos es un 50 % "idéntica" a una segunda secuencia de aminoácidos cuando el 50 % de los restos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son idénticos. La comparación de la secuencia se lleva a cabo sobre un bloque contiguo de restos de aminoácidos comprendido por una proteína dada, por ejemplo, una proteína, o una porción del polipéptido que se está comparando. En una realización particular, se tienen en cuenta las deleciones o inserciones seleccionadas que podrían alterar de otra manera la correspondencia entre las dos secuencias de aminoácidos. La similitud de secuencia incluye restos idénticos y no idénticos, aminoácidos bioquímicamente relacionados. A continuación se analizan los aminoácidos relacionados bioquímicamente que comparten propiedades similares y pueden ser intercambiables.

Las siguientes referencias se refieren a algoritmos BLAST que se utilizan a menudo para el análisis de secuencias: ALGORITMOS BLAST: Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish, W., et al., Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden, T.L., et al., Meth. Enzymol. 266:131-141(1996); Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res.

25:3389-3402 (1997); Zhang, J., et al., Genome Res. 7:649-656 (1997); Wootton, J.C., et al., Comput. Chem.

17:149-163 (1993); Hancock, J.M. et al., Comput. Appl. Biosci. 10:67-70 (1994); SISTEMAS DE PUNTUACIÓN DE ALINEACIÓN: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins" en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), págs. 345-352, (1978); Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships" en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.

5, supl. 3." (1978), M.O. Dayhoff (ed.), págs. 353-358 (1978), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J. Mol. Biol. 219:555-565 (1991); States, D.J., et al., Methods 3:66-70(1991); Henikoff, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:10915-10919 (1992); Altschul, S.F., et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993); DATOS ESTADÍSTICOS DE ALINEACIÓN: Karlin, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 87:2264-2268 (1990); Karlin, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90:5873-5877 (1993); Dembo, A., et al., Ann. Prob. 22:2022-2039 (1994); y Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments" en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), págs. 1-14, Plenum, Nueva York (1997).

Anticuerpos caninizados contra antígenos caninos

Tal como se usan en el presente documento, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de antígeno determinada (en este caso, una parte de la secuencia de aminoácidos de un antígeno canino, por ejemplo, PD-L1 canino) si se une a polipéptidos que comprenden esa porción de la secuencia de aminoácidos del antígeno canino, por ejemplo, PD-L1 canino, pero no se une a otras proteínas caninas que carecen de esa parte de la secuencia del antígeno canino, por ejemplo, PD-L1 canino. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende PD-L1 canino se puede unir a una forma marcada con FLAG® de PD-L1 canino, pero no se unirá con especificidad a otras proteínas caninas marcadas con FLAG®. Un anticuerpo, o compuesto de unión procedente del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, se une a su antígeno canino, o una variante o muteína del mismo, "con especificidad" cuando tiene una afinidad por ese antígeno canino o una variante o muteína del mismo que es al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor, e incluso más preferentemente al menos 100 veces mayor que su afinidad por cualquier otro antígeno canino ensayado.

Tal como se usan en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que presente la actividad biológica deseada. Por lo tanto, se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos caninizados, anticuerpos completamente caninos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos de dominio único camelizados. Los "anticuerpos precursores" son anticuerpos obtenidos mediante la exposición de un sistema inmunitario a un antígeno antes de la modificación de los anticuerpos para un uso previsto, tal como la caninización de un anticuerpo para su uso como anticuerpo terapéutico canino.

Tal como se usan en el presente documento, salvo que se indique de otro modo, "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión a antígeno" se refiere a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, es decir, fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno unido por el anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, fragmentos que conservan una o más regiones CDR. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario, por ejemplo, sc-Fv; nanocuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones C^h1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab" puede ser el producto de la escisión con papaína de un anticuerpo.

Una región de "fragmento cristalizable" ("Fc") contiene dos fragmentos de cadena pesada (es decir, dos polipéptidos idénticos) que comprenden los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de la cadena pesada se mantienen unidos mediante dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrófobas de los dominios C^h3. En la presente invención, la secuencia de aminoácidos para cada uno de los cuatro fragmentos Fc de IgG canina se basa en el límite identificado de los dominios CH1 y CH2 según lo determinado por Tang et al. [Vet. Immunol. Immunopathol. 80: 259-270 (2001)].

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una parte o un fragmento de una cadena pesada que contiene el dominio V^hy el dominio C^h1 y también la región entre los dominios C^h1 y C^h2, de tal forma que puede formarse un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula de F(ab')2.

Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios C^h1 y C^h2, de tal forma que se forma un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas. Por tanto, un fragmento F(ab')2 está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. Un "fragmento F(ab')2" puede ser el producto de la escisión con pepsina de un anticuerpo.

La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera, pero carece de las regiones constantes.

La expresión anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv", se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión con el antígeno. [Véase, Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113 Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); WO 88/01649; y US 4.946.778 y US 5.260.203.]

Tal como se usan en el presente documento, la expresión "estructura canónica" se refiere a la conformación local que puede ser adoptada por cada una de las regiones hipervariables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo dentro del marco en el que residen. Para cada región hipervariable, hay una pequeña cantidad de estructuras canónicas (generalmente denotadas por número enteros simples como 1 o 2, etc.), que se puede predecir con gran precisión a partir de las secuencias de aminoácidos de la región hipervariable correspondiente (particularmente dentro del contexto de la secuencia de aminoácidos de su marco, tal como se proporciona a continuación para los correspondientes dominios variables caninizados murinos de anti-PD-L1 canino). Estas estructuras canónicas pueden ser determinantes con respecto a si una modificación de la secuencia de aminoácidos de una CDR determinada dará como resultado la conservación o la pérdida de la capacidad de unirse a su miembro de unión al antígeno [Véase, Chothia y Lesk, Canonical Structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol.

196:901-917(1987); Chothia et al., Conformation of immunoglobulin hypervaribale regions, Nature, 34:877-883(1989); y Al-Lazikani et al., Standard Conformations for the canonical structures of immunoglobulins, J. Mol. Biol.

273:927-948 (1997)].

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones V^hse unen covalentemente con un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades antigénicas. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase más adelante).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales en el presente documento también incluyen anticuerpos de dominio único camelizados. [Véase, por ejemplo, Muyldermans et al., Trends Biochem. Sci. 26:230 (2001); Reichmann et al., J. Immunol. Methods 231:25 (1999); WO 94/04678; WO 94/25591; US 6.005.079]. En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios Vh con modificaciones tales que se forman anticuerpos de dominio único.

Tal como se usan en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado con un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl o Vl-V^h). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. [Véase, EP 0404097 B1; WO 93/11161; y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 6444-6448 (1993)]. Para una revisión de variantes de anticuerpos genomodificadas véase, en general, Holliger y Hudson Nat. Biotechnol. 23:1126-1136 (2005)].

Normalmente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos un 10% de su actividad de unión al PD-L1 canino (cuando se compara con el anticuerpo precursor) cuando esa actividad se expresa sobre una base molar. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos el 20 %, el 50 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % o más del antígeno canino, (por ejemplo, PD-L1) de afinidad de unión como el anticuerpo originario. También se pretende que un anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno de la invención pueda incluir sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas (denominadas "variantes conservativas o "variantes conservadas en función" del anticuerpo) que no alteren sustancialmente su actividad biológica.

"Anticuerpo aislado" se refiere al estado de purificación y en dicho contexto significa que la molécula carece sustancialmente de otras moléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales, tales como restos celulares y medios de crecimiento. Generalmente, el término "aislado" no pretende referirse a una ausencia total de dicho material o una ausencia de agua, tampones o sales, a menos que estén presentes en cantidades que interfieran sustancialmente con el uso experimental o terapéutico del compuesto de unión como se describe en el presente documento.

Tal como se usan en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, en donde el primer y segundo anticuerpos son de diferentes especies. [Documento U.S. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.

81: 6851-6855 (1984)]. Normalmente, los dominios variables se obtienen de un anticuerpo de un animal experimental (el "anticuerpo originario"), tal como un roedor, y las secuencias de dominio constante se obtienen de los anticuerpos del sujeto animal, por ejemplo, canino, de modo que sea menos probable que el anticuerpo quimérico resultante provoque una respuesta inmune adversa en un sujeto canino, que el anticuerpo originario (por ejemplo, de roedor).

Tal como se usan en el presente documento, la expresión "anticuerpo caninizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias tanto caninas como no caninas (por ejemplo, anticuerpos murinos). En general, el anticuerpo caninizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no canina (por ejemplo, que comprende 6 CDR murinas anti-PD-L1 canino tal como se ejemplifica a continuación), y todo o sustancialmente todo el marco canino.

La expresión "anticuerpo completamente canino" se refiere a un anticuerpo que comprende solo secuencias de proteína de inmunoglobulina canina. Un anticuerpo completamente canino puede contener cadenas de carbohidratos murinos si se produce en un ratón, en una célula de ratón o en un hibridoma procedente de una célula de ratón. De forma similar, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo que comprende solo secuencias de inmunoglobulina de ratón. Como alternativa, un anticuerpo completamente canino puede contener cadenas de carbohidratos de rata si se produce en una rata, en una célula de rata o en un hibridoma procedente de una célula de rata. De forma similar, "anticuerpo de rata" se refiere a un anticuerpo que comprende solo secuencias de inmunoglobulina de rata.

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, en general, un anticuerpo inalterado tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son, en general, iguales.

Normalmente, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera comprenden tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), localizadas dentro de regiones estructurales (FR, del inglés framework regions) relativamente conservadas. Las CDR están normalmente flanqueadas mediante las regiones estructurales, lo que permite la unión a un epítopo específico. En general, del N-terminal al C-terminal, los dominios variables de las cadenas tanto ligera como pesada comprenden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio para los anticuerpos humanos es, generalmente, de acuerdo con las definiciones de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5a ed.; NIH Publ. N.° 91-3242 (1991); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978); Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) o Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989)].

Tal como se usan en el presente documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 en el dominio variable de cadena ligera y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en el dominio variable de cadena pesada). [Véase Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), que define las regiones CDR de un anticuerpo humano por secuencia; véase también Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) que define las regiones CDR de un anticuerpo por estructura]. Tal como se usan en el presente documento, la expresión restos "estructurales" o "FR" se refiere a los restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR.

Como se usa en este documento, la expresión "marco canino" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo canino distinto de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR. En ambas cadenas, las secuencias de aminoácidos de las CDR caninas naturales se reemplazan con las CDR extrañas correspondientes (por ejemplo, las de un anticuerpo de ratón). Opcionalmente, las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo canino pueden contener algunos restos extraños no de CDR, por ejemplo, para preservar la conformación de las CDR extrañas dentro del anticuerpo canino y/o modificar la función Fc, tal como se ejemplifica a continuación.

Tal como se usan en el presente documento, un "anticuerpo anti-PD-L1 canino" se refiere a un anticuerpo que se generó contra el PD-L1 canino (por ejemplo, en un mamífero tal como un ratón o un conejo) y que se une específicamente al PD-L1 canino. Un anticuerpo que "se une específicamente al PD-L1 canino", o un anticuerpo que "se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 56", es un anticuerpo que presenta unión preferencial con el PD-L1 canino en comparación con otros antígenos, por ejemplo, se une al PD-L1 canino "con especificidad". La unión no requiere una especificidad de unión absoluta. Un anticuerpo anti-PD-L1 canino se considera "específico" para PD-L1 canino si su unión es determinante de la presencia de PD-L1 canino en una muestra, o si es capaz de alterar la actividad de PD-L1 canino sin interferir indebidamente con la actividad de otras moléculas en una muestra canina, por ejemplo, sin producir resultados no deseados tales como falsos positivos en un contexto diagnóstico o efectos secundarios en un contexto terapéutico. El grado de especificidad necesario para un anticuerpo anti-PD-L1 canino puede depender del uso pretendido del anticuerpo y, en cualquier caso, se define por su idoneidad para su uso para un propósito pretendido. El anticuerpo, o compuesto de unión procedente del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, del método contemplado se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que sea al menos dos veces mayor, preferentemente al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor y, lo más preferentemente, al menos 100 veces mayor, que la afinidad con cualquier otro antígeno.

Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos caninizados anti-PD-L1 canino o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (incluso en forma aislada) que se unen al PD-L1 canino (por ejemplo, con especificidad) y usos de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos. En realizaciones específicas, se proporcionan CDR de murino anti-PD-L1 canino de anticuerpos murinos anti-PD-L1 canino que se ha demostrado que se unen al PD-L1 canino y que bloquean la unión del PD-L1 canino a su receptor, por ejemplo, PD-1 canino. Estas CDR se pueden insertar en un marco canino modificado de la presente invención para producir un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino, como se ejemplifica en el presente documento.

Más específicamente, un "anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1" de la presente invención se refiere a un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de un anticuerpo murino anti-PD-L1 canino junto con un marco canino o un marco canino modificado. Un marco canino modificado comprende uno o más cambios de aminoácidos tal como se ejemplifica en el presente documento que optimizan aún más la eficacia del anticuerpo caninizado, por ejemplo, para aumentar, reducir o eliminar las funciones efectoras de los anticuerpos, para aumentar su unión al antígeno canino, por ejemplo, PD-L1 canino, y/o aumentar su capacidad para bloquear la unión del antígeno canino, por ejemplo, PD-L1 canino, a su miembro de unión natural, (por ejemplo, PD-1 canino en el caso de que el antígeno sea PD-L1 canino).

"Homología" se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos cuando están alineadas de manera óptima. Cuando en las dos secuencias comparadas, una posición está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácidos, por ejemplo, si en cada una de las dos moléculas de ADN, una posición está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en dicha posición. El porcentaje de homología es el número de posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido entre el número total de posiciones comparadas * 100. Por ejemplo, si en dos secuencias, 6 de 10 de las posiciones coinciden o son homólogas cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, entonces las dos secuencias son 60 % homólogas. Generalmente, la comparación se hace cuando dos secuencias se alinean para proporcionar el máximo porcentaje de homología.

"Molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc de origen sintético o alguna combinación de los mismos que no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. A efectos de la presente divulgación, ha de entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias específicas de ácido nucleico pueden incluir, además de las secuencias específicas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte o más proteínas distintas o partes o fragmentos de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras unidas operativamente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácido nucleico citadas y/o pueden incluir secuencias de vector.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está unido operativamente con ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se realiza mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular", se pueden utilizar indistintamente y todas estas denominaciones incluyen la descendencia. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos procedentes de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que no toda la descendencia tendrá un contenido de ADN exactamente idéntico, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la explorada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenda hacer denominaciones distintas, estas quedaran claras a partir del contexto.

Tal como se usan en el presente documento, la expresión "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas. Se puede usar cualquier fuente adecuada de secuencias de inmunoglobulina no reordenadas. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, de las bases de datos de la línea germinal JOINSOLVER® en el sitio web del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal de ratón, por ejemplo, tal como se describe en Giudicelli et al. [Nucleic Acids Res. 33:D256-D261 (2005)].

Propiedades de los anticuerpos caninizados

En canino, hay cuatro cadenas pesadas de IgG denominadas A, B, C y D. Estas cadenas pesadas representan cuatro subclases diferentes de IgG de perro, que se conocen como IgGA, IgGB, IgGC e IgGD. Las secuencias de ADN y aminoácidos de estas cuatro cadenas pesadas fueron identificadas por primera vez por Tang et al. [Vet. Immunol. Immunopathol. 80: 259-270 (2001)]. Las secuencias de aminoácidos y ADN de estas cadenas pesadas también están disponibles en las bases de datos de GenBank. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de IgGA tiene el número de referencia AAL35301.1, IgGB tiene el número de referencia AAL35302.1, IgGC tiene el número de referencia AAL35303.1 e IgGD tiene el número de referencia (AAL35304.1). Los anticuerpos caninos también contienen dos tipos de cadenas ligeras, kappa y lambda. El ADN y la secuencia de aminoácidos de estas cadenas ligeras se pueden obtener de las bases de datos de GenBank. Por ejemplo la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera kappa tiene el número de registro ABY 57289.1 y la cadena ligera lambda tiene el número de registro ABY 55569.1. En la presente invención, la secuencia de aminoácidos para cada uno de los cuatro fragmentos Fc de IgG canina se basa en el límite identificado de los dominios CH1 y CH2 según lo determinado por Tang et al, citado anteriormente.

El desarrollo de un anticuerpo monoclonal terapéutico es un proceso complejo que implica la coordinación de un conjunto complejo de actividades para generar el anticuerpo deseado. Estos incluyen la optimización de la especificidad del anticuerpo, de la afinidad, la actividad funcional, el nivel de expresión en líneas celulares diseñadas, la estabilidad a largo plazo, la eliminación o la mejora de las funciones efectoras y el desarrollo de métodos de fabricación y purificación comercialmente disponibles. Teniendo en cuenta los objetivos de la presente invención y además de la capacidad de activar células del sistema inmunológico, un anticuerpo monoclonal caninizado o canino contra el PD-L1 canino tiene de manera óptima tres atributos adicionales:

1. falta de funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC),

2. vida media relativamente larga in vivo; y

3. purificarse fácilmente a gran escala utilizando tecnologías estándar de la industria, tales como la basada en la cromatografía de la proteína A.

Ninguna de las subclases de IgG canina de origen natural satisface todos estos criterios. Por ejemplo, la IgGB se puede purificar usando proteína A, pero tiene un alto nivel de actividad ADCC. La IgGC también tiene una actividad ADCC considerable. Por otro lado, la IgGA se une débilmente a la proteína A, pero muestra una actividad ADCC no deseada. Además, Ni la IgGC ni la IgGD se pueden purificar en columnas de proteína A, aunque la IgGD no muestra actividad ADCC. Además, la IgGC tiene una semivida sérica corta ya que no se une al receptor de FcRn canino. La presente invención supera esta dificultad proporcionando anticuerpos IgG caninos modificados específicos para antígenos caninos, por ejemplo, el PD-L1 canino; tales anticuerpos carecen de funciones efectoras tales como ADCC y CDC, muestran una vida media relativamente larga y se pueden purificar fácilmente utilizando cromatografía de proteína A estándar de la industria.

Hasta el momento, las IgG caninas modificadas genéticamente que carecían de funciones efectoras tanto de ADCC como de CDC y, además, se podían purificar mediante cromatografía de proteína A no se habían descrito previamente. Tal como se desvela en el presente documento, una única sustitución en una posición en la IgG canina que es análoga a la de la IgG humana y de ratón, tal como N297A o D265A, no elimina completamente las funciones efectoras tanto de ADCC como de CDC en el correspondiente anticuerpo canino. Por ejemplo, mientras que cada una de las sustituciones N297 y D265 en anticuerpos humanos o murinos da como resultado la anulación de la unión al receptor Fcv y C1q, ninguna sustitución sola derogó completamente la unión de los anticuerpos caninos a C1q. En cambio, tal como se describe a continuación, para eliminar tanto la ADCC como la CDC en los anticuerpos caninos de las subclases IgGB o IgGC, resultó necesario hacer una doble sustitución en el Fc del anticuerpo canino combinando una sustitución de asparagina a alanina y ácido aspártico a alanina. Además, de manera completamente inesperada, una sustitución que se ha demostrado que reduce las funciones efectoras en los anticuerpos humanos en realidad dio como resultado un aumento en la unión de la IgG canina correspondiente al FcvR y C1q.

Para generar variantes de IgGB e IgGC caninas que carecen de funciones efectoras, se pueden generar cadenas pesadas de IgGB canina modificada o IgGC canina modificada. Se identificaron un total de siete restos de aminoácidos que están presentes en estas dos regiones cristalizables de fragmentos caninos (cFcs) para tal posible sustitución. Estos siete restos de aminoácidos son: P4, D31, N63, G64, T65, A93 y P95 para ambas secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 para el Fc de la IgGB canina; y la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 68 para la Fc de la IgGC canina. En consecuencia, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 difiere de la de SEQ ID NO: 66 por tener los restos de aminoácidos en las posiciones: 4, 31, 63, 64, 65, 93 y 95, que son prolina (P), ácido aspártico (D), asparagina (N), glicina (G), treonina (T), alanina (A) y prolina (P), respectivamente, en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 como "X" (o "Xaa" en el código de tres letras) para las siete posiciones, lo que significa que estas siete posiciones de aminoácidos pueden ser cualquiera de los veinte aminoácidos naturales (véase la lista en la columna 1 de la Tabla 1 a continuación). De forma similar, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 difiere del SEQ ID NO: 68 porque los restos de aminoácidos en las posiciones 4, 31, 63, 64, 65, 93 y 95 se enumeran como "X" (o " Xaa "en el código de tres letras) para las siete posiciones, lo que significa que estas siete posiciones de aminoácidos pueden ser cualquiera de los veinte aminoácidos naturales. La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 está codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1, mientras que la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 está codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3.

En una realización, el cFc comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 con las siguientes sustituciones P4 (A, G o S), D31(A, G o S) N63 (A, G o S), G64(A o P), T65(A, G o S), A93(G o S) y P95(A, G o S); en la que P4 (A, G o S) significa que el resto de prolina en la posición 4 se sustituye por un resto de alanina, glicina o serina, y de manera similar G64 (P o A) significa que el resto de glicina en la posición 64 se sustituye por un resto de prolina o de alanina, etc.). En una realización particular, el cFc comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 con las siguientes sustituciones: P4A, D31A, N63A, G64P, T65A, A93G y P95A,

En una realización relacionada, el cFc comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, que contiene 7 aminoácidos designados como Xaa, con los siguientes restos de aminoácidos: A4, A31, A63, G64, T65, G93 y A95, es decir, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 68 con los siguientes cinco (5) cambios de restos de aminoácidos: P4A, D31A, N63A, A93G y P95A y los dos restos de aminoácidos restantes de los siete, G64 y T65, siendo retenido de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 68.

Las secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 26, el SEQ ID NO: 28, el SEQ ID NO: 30 y el SEQ ID NO: 32 contienen todas "X" (o "Xaa" en el código de tres letras) en siete posiciones de aminoácidos, lo que significa que estas siete posiciones de aminoácidos pueden ser cualquiera de los veinte aminoácidos naturales enumerados en la columna 1 de la Tabla 1 a continuación. En particular, el SEQ ID NO: 26, el SEQ ID NO: 28, el SEQ ID NO: 30 y el SEQ ID NO: 32 comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o del SEQ ID NO: 4 dentro de sus respectivas secuencias. Los ejemplos específicos de los restos de aminoácidos en una o más de estas siete posiciones de las secuencias de aminoácidos se delinean arriba y abajo y, por lo tanto, se incluyen dentro del género de las secuencias de aminoácidos individuales del SEQ ID NO: 2, el SEQ ID NO: 4, el SEQ ID NO: 26, el SEQ ID NO: 28, el SEQ ID NO: 30 y el SEQ ID NO: 32, así como dentro de los anticuerpos caninizados que comprenden estas secuencias.

La Tabla 10 proporcionada a continuación, correlaciona específicamente las siete posiciones de aminoácidos que se pueden sustituir, tal como se desvela en el presente documento, del Fc de la cIgGB (SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 2) y el Fc de la cIgGC (SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 4) con el de las cadenas pesadas caninas de longitud completa que comprenden estas secuencias de aminoácidos de cFc, es decir, el SEQ ID NO: 26, el SEQ ID NO: 28, el s Eq ID NO: 30 y el SEQ ID NO: 32. En consecuencia, la posición real en la secuencia de longitud completa de la IgGB o la IgGC puede coordinarse fácilmente con la del cFc que comprende mediante el uso de la Tabla 10 a continuación.

En realizaciones particulares, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 que comprende (i) P, A, G o S en la posición 242, (ii) D, A, G o S en la posición 269, (iii) N, A, G o S en la posición 301, (iv) G, P o A en la posición 302, (v) T, A, G o S en la posición 303, (vi) A, G o S en la posición 331, y (vii) P, A, G o S en la posición 333. En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28 o 30 que comprende (i) P, A, G o S en la posición 240, (ii) D, A, G o S en la posición 267, (iii) N, A, G o S en la posición 299, (iv) G, P o A en la posición 300, (v) T, A, G o S en la posición 301, (vi) A, G o S en la posición 329, y (vii) P, A, G o S en la posición 331. En otras realizaciones, la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 31 que comprende (i) P, A, G o S en la posición 238, (ii) D, A, G o S en la posición 265, (iii) N, A, G o S en la posición 297, (iv) G, P o A en la posición 298, (v) T, A, G o S en la posición 299, (vi) A, G o S en la posición 327, y (vii) P, A, G o S en la posición 329.

La presente invención también proporciona IgGD caninas modificadas que comprenden una región de bisagra de la IgGA, la IgGB o la IgGC en lugar de su región de bisagra de la IgGD natural. Como alternativa, la región de bisagra de la IgGD se puede modificar genéticamente sustituyendo un resto de serina con un resto de prolina tal como se muestra en la Tabla 5. Tales modificaciones pueden llevar a una IgGD canina que carece de intercambio de brazo fab. Las IgGD caninas modificadas se pueden construir usando métodos estándar de tecnología del ADN recombinante [por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)]. Para construir estas variantes, los ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de la IgGD canina se pueden modificar de modo que codifique las IgGD modificadas. Las secuencias de ácido nucleico modificadas se clonan luego en plásmidos de expresión para la expresión de proteínas. Los ácidos nucleicos que codifican los Fc de las IgGD caninas con la región de bisagra sustituida se ejemplifican mediante las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 7, 9 y 11 que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 8, 10 y 12. Un ácido nucleico que codifica un Fc de IgGD canino con una región de bisagra de IgGD modificada comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 5 que codifica la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6.

La presente invención proporciona además cadenas pesadas caninas de longitud completa que se pueden combinar con las cadenas ligeras correspondientes para producir un anticuerpo caninizado. En consecuencia, la presente invención proporciona además anticuerpos murinos caninizados anti-antígeno canino (incluidos anticuerpos murinos caninizados anti-PD-L1 canino aislados) y métodos de uso de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, el tratamiento del cáncer en caninos.

Además, la presente invención proporciona anticuerpos murinos caninizados anti-PD-L1 canino o fragmentos de unión a antígeno que se unen al PD-L1 canino y bloquean la unión del PD-1 canino al PD-L1 canino. En determinadas realizaciones, los anticuerpos murinos caninizados anti-PD-L1 canino comprenden un Fc de IgGB canina modificada, Fc de IgGC canina modificada, o una IgGD canina modificada que carece de brazo fab tal como se describe en el presente documento.

El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al antígeno canino, por ejemplo, PD-L1 canino, puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo murino anti-canino tal como se describe en el presente documento. Las una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR se pueden seleccionar independientemente de las secuencias de CDR de las que se proporcionan a continuación. En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al PD-L1 canino comprende una cadena ligera kappa de anticuerpo canino que comprende una CDR-1, CDR-2 y/o CDR-3 de cadena ligera murina y una cadena pesada de anticuerpo canino IgG que comprende una CDR-1, CDR-2 y/o CDR-3 de cadena pesada murina. En consecuencia, la presente invención proporciona además cadenas pesadas caninas de longitud completa que luego se pueden combinar, por ejemplo, con las correspondientes cadenas ligeras para producir un anticuerpo caninizado [véase la Tabla 2 a continuación, en la que se proporcionan las secuencias de dos conjuntos de CDR de murino anti-PD-L1 canino, por ejemplo, 4F9 y 5F12].

En otras realizaciones, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PD-L1 con especificidad y tienen cadenas ligeras kappa de anticuerpos caninos que comprenden de una a seis CDR diferentes que comprenden al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 16, 17, 18, 22, 23 y/o 24 e IgG de cadena pesada de anticuerpo canino que comprende de una a seis CDR diferentes que comprenden al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 19, 20 y/o 21, sin dejar de presentar las propiedades aglutinantes y funcionales deseadas. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención comprende un marco canino que comprende una combinación de secuencia de cadena pesada de la IgG con una cadena ligera kappa que tiene una o más de las secuencias de aminoácidos de las CDR mencionadas anteriormente con 0, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, sin dejar de presentar las propiedades aglutinantes y funcionales deseadas.

"Variantes modificadas de manera conservativa" o "sustitución conservativa" se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína por otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de la cadena lateral, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.), de tal manera que pueden realizarse cambios con frecuencia sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica [véase, por ejemplo, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4a Ed.; 1987)]. Además, las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de alterar la actividad biológica. En la Tabla 1 a continuación se exponen sustituciones conservativas ilustrativas.

En la presente invención también se contemplan variantes de función conservativa de los anticuerpos de la invención. "Variantes de función conservativa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos o a fragmentos en los que se han cambiado uno o más restos de aminoácidos sin alterar una propiedad deseada, tal como una afinidad y/o especificidad del antígeno. Dichas variantes incluyen, pero no se limitan a, el remplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares, tal como las sustituciones de aminoácidos conservativas de la Tabla 1 anterior.

Ácidos nucleicos

La presente invención comprende además los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de inmunoglobulina de anticuerpos murinos caninizados anti-PD-L1 caninos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento (véanse los ejemplos a continuación).

También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de inmunoglobulina que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 70 % idénticas, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % idénticas, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % idénticas y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % idénticas (por ejemplo, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 100 %) a las secuencias de aminoácidos de las ^cD^ry/o cFc caninos y/o anticuerpos proporcionados en el presente documento cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en el que los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia. La presente invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de inmunoglobulina que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 70 % similares, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % similar, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % similar y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % similar (por ejemplo, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 100 %) a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de referencia cuando la comparación se realiza con un algoritmo BLAST, en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia.

Esta presente invención también proporciona vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos (incluidos los ácidos nucleicos aislados) de la invención, en donde el ácido nucleico está unido operativamente a secuencias de control que son reconocidas por una célula hospedadora cuando la célula hospedadora se transfecta con el vector. También se proporcionan células hospedadoras que comprenden un vector de expresión de la presente invención y métodos para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se desvelan en el presente documento que comprenden cultivar en un medio de cultivo una célula hospedadora que lleva un vector de expresión que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y aislar el antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

Un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino, por ejemplo, se puede producir de forma recombinante mediante métodos conocidos en el campo. En la materia se conocen bien líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión de los anticuerpos o fragmentos desvelados en el presente documento e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection, ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 y diversas líneas celulares distintas. Las células hospedadoras de mamífero incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, de bovino, de caballo y de hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden utilizarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando los vectores de expresión recombinante codifican la cadena pesada o la parte de unión al antígeno o un fragmento de la misma, la cadena ligera y/o el fragmento de unión a antígeno de la misma se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadoras.

Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Además, usando diversas de técnicas conocidas, puede potenciarse la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras fracciones de los mismos) a partir de líneas celulares de producción. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es una estrategia habitual para mejorar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se analiza, total o parcialmente, en relación con las patentes europeas N.° 0216846, 0256055 y 0323997 y con la solicitud de patente europea N.° 89303964.4.

En general, las glucoproteínas producidas en una línea celular o animal transgénico particular tendrán un patrón de glucosilación que es característico de las glucoproteínas producidas en la línea celular o animal transgénico. Por lo tanto, el patrón de glucosilación particular de un anticuerpo dependerá de la línea celular particular o animal transgénico usado para producir el anticuerpo. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento, comprenden la presente invención, independiente del patrón de glucosilación que puedan tener los anticuerpos. De forma similar, en realizaciones particulares, anticuerpos con un patrón de glucosilación que comprenden solo W-glucanos no fucosilados pueden ser ventajosos, debido a que se ha demostrado que estos anticuerpos presentan normalmente una eficacia más potente que sus homólogos fucosilados tanto in vitro como in vivo [Véase, por ejemplo, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); las patentes de EE. UU. N.° 6.946.292 y 7.214.775].

La presente invención incluye además fragmentos de anticuerpos de los anticuerpos murinos caninizados anti-PD-L1 canino desvelados en el presente documento. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab)2, que pueden producirse por escisión enzimática de una IgG mediante, por ejemplo, pepsina. Los fragmentos Fab pueden ser producidos por, por ejemplo, reducción de F(ab)2 con ditiotreitol o mercaptoetilamina. Un fragmento Fab es una cadena V^l-C^lunida a una cadena V^h-C^himediante un puente disulfuro. Un fragmento F(ab)2 está constituido por dos fragmentos Fab que, a su vez, están unidos por dos puentes disulfuro. La parte Fab de una molécula F(ab)2 incluye una parte de la región Fc entre la que se encuentran los puentes disulfuro. Un fragmento Fv es una región Vl o Vh.

En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante canina, tales como una región constante de cadena pesada canina IgGA, IgGB, IgGC e IgGD o una variante de la misma. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena ligera, por ejemplo, una región constante de cadena ligera canina, tal como la región de cadena ligera canina lambda o kappa o una de sus variantes. A modo de ejemplo, y sin limitación, la región constante de la cadena pesada canina puede ser de IgGB y la región constante de la cadena ligera canina puede ser de kappa.

Diseño genético de anticuerpos

Los anticuerpos anti-PD-L1 caninos murinos caninizados de la presente invención pueden diseñarse genéticamente para incluir modificaciones en el marco canino de un anticuerpo monoclonal originario (es decir, canino), por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo, tal como se detalla a continuación.

Anticuerpos de bloqueo cruzado y unión a epítopos

Los anticuerpos de bloqueo cruzado y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que compiten de forma cruzada con 4F9 y/o 5F12, incluyendo anticuerpos caninizados de bloqueo cruzado y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, forman parte de la presente invención. Además, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 canino o fragmentos de los mismos de la presente invención también forman parte de la presente invención. Los anticuerpos de bloqueo cruzado y los fragmentos de unión a antígeno se pueden identificar en función de su capacidad para competir de forma cruzada con 4F9 y/o 5F12 en ensayos de unión estándar (por ejemplo, BIACore®, ELISA o citometría de flujo). Por ejemplo, se pueden usar ensayos ELISA convencionales en los que se inmoviliza la proteína PD-L1 canina recombinante sobre la placa, se marca fluorescentemente uno de los anticuerpos y se evalúa la capacidad de los anticuerpos no marcados para competir por la unión del anticuerpo marcado. De forma adicional o alternativa, se puede usar el análisis BIAcore® para evaluar la capacidad de los anticuerpos para competir de manera cruzada. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de, por ejemplo, 4F9 y/o 5F12 a PD-L1 canino demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con 4F9 y/o 5F12 por la unión a PD-L1 canino y, por lo tanto, pueden, en algunos casos, unirse al mismo epítopo en PD-L1 canino que 4F9 y/o 5F12. En realizaciones más particulares, los anticuerpos de bloqueo cruzado y sus fragmentos de unión a antígeno que compiten de forma cruzada con 4F9 y/o 5F12 y también se unen al mismo epítopo en PD-L1 canino que 4F9 y/o 5F12 también son parte de la presente invención.

Vacunas de péptidos y proteínas de fusión

Los péptidos que comprenden epítopos (o porciones de los mismos) reconocidos por los mAb anti-PD-L1 canino y las proteínas de fusión que comprenden dichos péptidos se pueden usar como vacunas para provocar anticuerpos que bloquean la unión de PD-L1 a PD-1 y dan como resultado la activación de linfocitos T y mejora de la respuesta inmune. Dichas vacunas pueden ser útiles como vacunas terapéuticas para enfermedades tales como el cáncer o para actuar como potenciadores de la respuesta inmune a otras vacunas. Para utilizar estos péptidos como vacunas, uno o más de estos péptidos se pueden acoplar químicamente o mediante técnicas de tecnología de ADN recombinante a una proteína de vehículo para potenciar la inmunogenicidad de estos péptidos y provocar anticuerpos específicos de péptidos. Los expertos en la técnica conocen técnicas para acoplar péptidos a proteínas de vehículo. Las vacunas de péptidos (y la proteína de fusión correspondiente) se pueden usar para vacunar animales, por ejemplo, mediante las vías intramuscular (IM), subcutánea (S/C), oral, por pulverizado o in ovo (véase también a continuación). Tales vacunas se pueden usar como proteínas de subunidad expresadas a partir de sistemas de virus bacterianos, víricos, de levadura o baculovirus. Como alternativa, tales vacunas de péptidos (o proteínas de fusión) se pueden administrar después de la administración de varios vectores víricos o bacterianos que expresan tales péptidos o proteínas de fusión que se pueden poner en práctica mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las vacunas de péptidos o proteínas de fusión se pueden administrar en dosis de 1 a 1000 |jg y pueden contener opcionalmente un adyuvante y un vehículo farmacéutico aceptable Composiciones farmacéuticas y administración

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles de un anticuerpo murino caninizado anti-PD-LI canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se puede mezclar con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. [Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y Farmacopea de los Estados Unidos: Formulario nacional, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)].

Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mezclando con vehículos aceptables, excipientes o estabilizantes en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, suspensiones acuosas, soluciones o suspensiones acuosas [véase, por ejemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY]. En una realización, los anticuerpos anti-PD-L1 de la presente invención se diluyen a una concentración apropiada en una solución de acetato de sodio a pH 5-6, y se añade NaCl o sacarosa para tonicidad. Los agentes adicionales, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80, se pueden añadir para mejorar la estabilidad.

La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpos, administrados solos o en combinación con otro agente, se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (DL50/ DE50). En aspectos particulares, se prefieren anticuerpos que presenten índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en caninos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración.

El modo de administración puede variar. Las vías de administración adecuadas incluyen oral, rectal, transmucosa, intestinal, parenteral, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópica, cutánea, transdérmica o intraarterial. En realizaciones particulares, el anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino o su fragmento de unión a antígeno se puede administrar mediante una vía invasiva tal como mediante inyección. En realizaciones adicionales de la invención, un anticuerpo murino anti-PD-L1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica del mismo, se administra por administración por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intratumoral o por inhalación, o aerosoles. La administración por vías no invasivas (por ejemplo, por vía oral; por ejemplo, en una píldora, cápsula o comprimido) también está dentro del alcance de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento también se pueden administrar mediante infusión. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos para la administración de composiciones farmacéuticas incluyen: la Patente de Estados Unidos N.° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicamento a una tasa controlada; la Patente de Estados Unidos N.° 4.447.233, que desvela una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento a una tasa de infusión precisa; la Patente de Estados Unidos N.° 4.447.224, que desvela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; la Patente de Estados Unidos N.° 4.439.196, que desvela un sistema de administración osmótica de fármaco que tiene compartimentos multicámara. Muchos otros de estos implantes, sistemas de administración y módulos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Como alternativa, se puede administrar un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del anticuerpo directamente en una articulación artrítica o una lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología, con frecuencia en una formulación en depósito o de liberación sostenida. Adicionalmente, se puede administrar el anticuerpo en un sistema de administración de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido, direccionamiento, por ejemplo, a la articulación artrítica o la lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología. Los liposomas se dirigirán a y serán captados de manera selectiva por el tejido aquejado.

El régimen de administración depende de varios factores, incluyendo la tasa de renovación de suero o tejido del anticuerpo terapéutico, el nivel de los síntomas, la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferentemente, el régimen de administración proporciona suficiente anticuerpo terapéutico para lograr una mejora en el estado de enfermedad diana, al mismo tiempo que minimiza los efectos secundarios no deseados. En consecuencia, la cantidad de producto biológico administrado depende en parte del anticuerpo terapéutico en particular y de la gravedad de la afección que se trate. Se dispone de orientación para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos terapéuticos [véase, por ejemplo, Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, RU (1996); Kresina (ed.) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY (1991); Bach (ed.) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY (1993); Baert, et al. New Engl. J. Med. 348:601-608 (2003); Milgrom et al. New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamon et al. New Engl. J. Med. 344:783-792 (2001); Beniaminovitz et al. New Engl. J. Med. 342:613-619 (2000); Ghosh et al. New Engl. J. Med. 348:24-32 (2003); Lipsky et al. New Engl. J. Med. 343:1594-1602 (2000)].

El veterinario realiza la determinación de la dosis adecuada, por ejemplo, utilizando parámetros o factores conocidos o sospechosos en la técnica que afectan al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y a continuación se incrementa en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento se pueden proporcionar mediante infusión continua, o mediante dosis administradas, por ejemplo, diariamente, 1-7 veces a la semana, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, bimensualmente, trimestralmente, cada seis meses, anualmente, etc. Se pueden proporcionar dosis, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral, por vía intramedular o por inhalación. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 pg/kg de peso corporal, más generalmente al menos 0,2 pg/kg, 0,5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, 0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg o más [véase, por ejemplo, Yang, et al. New Engl. J. Med. 349:427-434 (2003); Herold, et al. New Engl. J. Med. 346:1692-1698 (2002); Liu, et al. J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456 (1999); Portielji, et al. Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144 (2003)]. También se pueden proporcionar dosis para lograr una concentración diana predeterminada de un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino en el suero del sujeto, tal como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 pg/ml o más. En otras realizaciones, un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino de la presente invención se administra por vía subcutánea o intravenosa, en una semana, quincenalmente, "cada 4 semanas", mensualmente, bimestral o trimestralmente a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 o 2500 mg/sujeto.

Tal como se usan en el presente documento, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados con un trastorno y/o una reducción en la gravedad de los síntomas de dicho trastorno. Los términos incluyen además mejorar los síntomas no deseados o incontrolados existentes, prevenir síntomas adicionales y aliviar o prevenir las causas subyacentes de dichos síntomas. Por lo tanto, los términos indican que se ha conferido un resultado beneficioso a un sujeto vertebrado con un trastorno, enfermedad o síntoma, o con el potencial de desarrollar tal trastorno, enfermedad o síntoma.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad de un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido, o sujeto, es eficaz para provocar una mejora medible en uno o más síntomas de una enfermedad o afección o la progresión de dicha enfermedad o afección. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además a la cantidad de compuesto de unión suficiente para producir al menos una mejora parcial de los síntomas, por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o alivio de la afección médica relevante, o aumentar la tasa de tratamiento, curación, prevención o alivio de dichas afecciones. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en combinación, en serie o de manera simultánea. Una cantidad eficaz de un agente terapéutico dará como resultado una mejora de una medida o parámetro de diagnóstico en al menos 10%; habitualmente en al menos 20%; preferentemente al menos aproximadamente 30 %; más preferentemente al menos 40 % y lo más preferentemente al menos 50 %. Una cantidad eficaz también puede dar como resultado una mejora en una medida subjetiva en los casos en que se utilizan medidas subjetivas para evaluar la gravedad de la enfermedad.

Otras terapias combinadas

Como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo se puede coadministrar con uno u otros agentes terapéuticos (tales como un agente quimioterapéutico). El anticuerpo puede estar unido al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después de o simultáneamente con el agente o puede administrarse conjuntamente con otras terapias conocidas.

En terapias de combinación particulares, un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede coadministrarse con un anticuerpo murino caninizado anti-PD-1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo [por ejemplo, tal como se devela en la Solicitud Provisional de Estados Unidos de N.° de Serie 61/918.946, presentada el 20 de diciembre de 2013, y la solicitud provisional estadounidense con n.° de serie 62/030.812, presentada el 30 de julio de 2014, La solicitud provisional n.° 62/092.496, presentada el 16 de diciembre de 2014, PCT/EP2014/078655 (WO2015091911) y PCTEP2014/078653 (WO2015/091910), y/o un anticuerpo murino caninizado anti-linfocito T citotóxico canino asociado a proteína 4 (CTLA-4), o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En consecuencia, se puede coadministrar cualquier combinación de estos tres anticuerpos murinos caninizados anti-proteínas caninas (es decir, anti-PD-L1, PD-1 o CTLA-4 canino) o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, el anticuerpo murino caninizado anti-PD-LI canino o su fragmento de unión a antígeno se puede administrar antes, después, o simultáneamente con un anticuerpo anti-PD-1 canino murino caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o con un anticuerpo murino caninizado de CTLA-4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Además, la combinación del anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino o el fragmento de unión a antígeno del mismo con el anticuerpo murino caninizado anti-PD-1 canino un fragmento de unión a antígeno del mismo, y/o el anticuerpo murino caninizado de CTLA-4 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo también se puede coadministrarse con otras terapias conocidas, es decir, antes, después o al mismo tiempo.

Kits

Se proporcionan además kits que comprenden uno o más componentes que incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, como se describe en el presente documento, que se une específicamente a PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo) en asociación con uno o más componentes adicionales que incluyen, pero sin limitarse a un anticuerpo murino caninizado anti-PD-1 canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y/o un anticuerpo murino caninizado anti-CTLA-4 canino o fragmento de unión a antígeno del mismo, un vehículo y/o un agente quimioterapéutico farmacéuticamente aceptable, tal como se trata en el presente documento. En realizaciones alternativas, el kit puede comprender uno o más péptidos que comprenden un epítopo o porción del mismo (o una proteína de fusión que comprende el epítopo o porción del mismo) reconocidos por mAb anti-PD-L1 canino tal como se trató anteriormente. La composición de unión y/o el agente quimioterapéutico o el péptido que comprende un epítopo o una porción del mismo (o una proteína de fusión que comprende el epítopo o una porción del mismo) se pueden formular como una composición pura o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una composición farmacéutica.

En una realización, el kit incluye una composición de unión de la presente invención, por ejemplo, un anticuerpo murino caninizado anti-PD-L1 canino (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) o una composición farmacéutica del mismo en un recipiente (por ejemplo, en un vial estéril de vidrio o plástico) y/o una composición farmacéutica del mismo y/o un agente quimioterapéutico en otro recipiente (por ejemplo, en un vial estéril de vidrio o plástico) y/o un anticuerpo murino caninizado anti-PD-1 canino (o fragmento de unión a antígeno del mismo) y/o un anticuerpo murino caninizado anti-CTLA-4 canino (o fragmento de unión a antígeno del mismo) o una composición farmacéutica del mismo en uno o más de otros recipientes (por ejemplo, en un vial de plástico o vidrio estéril).

Si el kit incluye una composición farmacéutica para administración parenteral a un sujeto, el kit también puede incluir un dispositivo para realizar dicha administración. Por ejemplo, el kit puede incluir una o más agujas hipodérmicas u otros dispositivos de inyección tal como se trató anteriormente. El kit también puede incluir un prospecto que incluya información sobre las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación del kit. Generalmente, dicha información ayuda a los dueños de mascotas y a los veteranos a usar las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación adjuntas de manera eficaz y segura. Por ejemplo, la siguiente información sobre una combinación de la invención se puede proporcionar en el prospecto: farmacocinética, farmacodinámica, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosis y administración adecuadas, cómo suministrarlo, condiciones adecuadas de almacenamiento, referencias, información sobre el fabricante/distribuidor e información sobre patentes.

Por cuestiones de conveniencia, un anticuerpo o agente de unión específico desvelado en el presente documento se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico o detección. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar unas concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

Ejemplos

EJEMPLO 1

PD-1 Y PD-L1 CANINO

Secuencias de PD-1 y PD-L1 canino:

Las solicitudes provisionales de EE. UU. N.° 61/918946, presentada el 20 de diciembre de 2013 y 62/030.812, presentada el 30 de julio de 2014, proporciona: la secuencia de nucleótidos de longitud completa para PD-1 canino (cPD-1) del SEQ ID NO: 49 [el S^eQ ID NO: 69 incluye la secuencia señal]; la correspondiente secuencia de aminoácidos traducida del SEQ ID NO: 50 [el SEQ ID NO: 70 incluye la secuencia señal]; la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular (DEC) del PD-1 canino, el SEQ ID NO: 51; la secuencia de aminoácidos del DEC del PD-1 canino, el SEQ ID NO: 52; la secuencia de nucleótidos del DEC del PD-1 canino más un enlazador GT y la parte Fc del gen Fc de la IgG1 humana, el SEQ ID NO: 53; y la secuencia de aminoácidos del DEC del PD-1 canino más un enlazador GT y la parte Fc del gen Fc de la IgG1 humana, el SEQ ID NO: 54 [el SEQ ID NO: 81 incluye la secuencia señal].

Las solicitudes provisionales de EE. UU. N.° 61/918946, presentada el 20 de diciembre de 2013 y 62/030.812, presentada el 30 de julio de 2014, incorporadas por el presente documento a modo de referencia en su totalidad proporcionan además: la secuencia de nucleótidos de longitud completa para el PD-L1 canino (cPD-L1) del SEQ ID NO: 55 [SEQ ID NO: 71 incluye la secuencia señal]; la correspondiente secuencia de aminoácidos traducida del SEQ ID NO: 56 [el SEQ ID NO: 72 incluye la secuencia señal]; la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular (DEC) del PD-L1 canino, el SEQ ID NO: 57; la secuencia de aminoácidos del DEC del PD-L1 canino, el SEQ ID NO: 58; la secuencia de nucleótidos del DEC del PD-L1 canino más un enlazador GT y la parte Fc del gen Fc de la IgG1 humana, del SEQ ID NO: 59; y la secuencia de aminoácidos del DEC del PD-L1 más un enlazador GT y la parte Fc del gen Fc de la IgG1 humana, el SEQ ID NO: 60.

Identificación y clonación de PD-1 canino:

Se identificó un ácido nucleico que codifica un PD-1 canino de longitud completa (cPD-1) mediante una búsqueda en las bases de datos del banco de genes del NCBI (número de registro XM_543338.4). La secuencia de aminoácidos traducida (número de registro XP_543338.3) se correspondía con una posible proteína PD-1 canina que se identificó más a través de la búsqueda en las bases de datos de proteínas del banco de genes (NCBI) y alineando la secuencia de aminoácidos identificada con secuencias de aminoácidos de PD-1 murino, felino y humano. La secuencia de ADN correspondiente al gen PD-1 canino de longitud completa que tenía un codón optimizado para células CHO se sintetizó y se clonó en un plásmido denominado p96793. La comparación de secuencias de ^aDⁿy proteínas de PD-1 canino predicho con secuencias conocidas de ADN y proteínas de PD-1 condujo a la identificación de las secuencias de ADN que codifican el dominio extracelular (DEC) de PD-1 canino y la secuencia de aminoácidos del DEC de PD-1 canino.

Se sintetizó una secuencia de ADN que codifica el DEC del PD-1 canino además de un enlazador GT y 8 restos de histidina y se clonó en un plásmido denominado LPD2726. Una secuencia de ácido nucleico correspondiente al DEC del PD-1 canino más un enlazador GT y la parte Fc del gen Fc de la IgG1 humana se sintetizó químicamente y se clonó en un plásmido denominado LPD2727. El DEC del PD-1 canino y la parte Fc del Fc de la IgG1 humana comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 81 (incluida la secuencia señal).

Identificación y clonación de PD-L1 canino:

Se identificó un ácido nucleico que codifica un PD-L1 canino de longitud completa mediante una búsqueda en las bases de datos del banco de genes del NCBI (número de registro XM_541302.4). La secuencia de aminoácidos traducida (número de registro XP-541302.4) correspondiente a la posible proteína PD-L1 canina se identificó buscando en las bases de datos de proteínas del banco de genes (NCBI) y alineando la secuencia identificada con secuencias de PD-L1 humano y de ratón conocidas.

La comparación del ADN que codifica el PD-L1 canino con secuencias conocidas de PD-L1 identificó la secuencia de ADN correspondiente al dominio DEC del PD-L1 canino (que tenía un codón optimizado para células CHO). La secuencia de aminoácidos predicha del DEC del PD-L1 canino es el SEQ ID NO: 58. El ADN que codifica el DEC del PD-L1 más enlazador GT y 8 restos de histidina se sintetizó y se clonó en un plásmido denominado LPD2695. Se sintetizó químicamente una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del DEC del PD-L1 canino más enlazador GT y la parte Fc del Fc de la IgG1 humana y se clonó en un plásmido denominado LPD2697. El DEC del PD-L1 canino más el enlazador GT y la parte Fc de la IgG1 humana comprenden la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 60.

Expresión de proteínas PD-1 y PD-L1:

Los plásmidos de expresión que codifican las proteínas PD-1DEC-HIS, PD-IDEC-Fc, PD-L1 DEC-HIS y PD-L1DEC-Fc se transfectaron en células HEK 293 y las proteínas se purificaron del sobrenadante de las células transfectadas utilizando cromatografía de columna con Proteína A para proteínas de fusión Fc o con níquel (N¡2+) para proteínas marcadas con HIS. Las proteínas purificadas se utilizaron para: ELISA o ensayos de unión como se detalla a continuación. Las proteínas expresadas se analizaron mediante geles SDS-PAGE.

Secuencia completa de ADN del PD-1 canino: secuencia señal subrayada y en negrita. La secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 49, está sin la secuencia de señal.

atggggagccggcgggggccctggccgctcgtctgggccgtgctgcagctgggctggtggccagg

atcjcjctcctagactcccctgacaggccctggagcccgctcaccttctccccggcgcagctcacgg

tgcaggagggagagaacgccacgttcacctgcagcctggccgacatccccgacagcttcgtgctc

aactggtaccgcctgagcccccgcaaccagacggacaagctggccgccttccaggaggaccgcat

cgagccgggccgggacaggcgcttccgcgtcatgcggctgcccaacgggcgggacttccacatga

gcatcgtcgctgcgcgcctcaacgacagcggcatctacctgtgcggggccatctacctgcccccc

aacacacagatcaacgagagtccccgcgcagagctctccgtgacggagagaaccctggagccccc

cacacagagccccagccccccacccagactcagcggccagttgcaggggctggtcatcggcgtca

cgagcgtgctggtgggtgtcctgctactgctgctgctgacctgggtcctggccgctgtcttcccc

agggccacccgaggtgcctgtgtgtgcgggagcgaggacgagcctctgaaggagggccccgatgc

agcgcccgtcttcaccctggactacggggagctggacttccagtggcgagagaagacgccggagc

ccccggcgccctgtgccccggagcagaccgagtatgccaccatcgtcttcccgggcaggccggcg

tccccgggccgcagggcctcggccagcagcctgcagggagcccagcctccgagccccgaggacgg

acccggcctgtggcccctctga

Secuencia completa de aminoácidos del PD-1 canino: secuencia de señal subrayada y en negrita. La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 50 está sin la secuencia señal.

MGSRRGPWPLVWAVLQLGWWPGWLLDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVL

NWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPP

NTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLVIGVTSVLVGVLLLLLLTWVLAAVFP

RATRGACVCGSEDEPLKEGPDAAPVFTLDYGELDFQWREKTPEPPAPCAPEQTEYATIVFPGRPA

SPGRRASASSLQGAQPPSPEDGPGLWPL

Secuencia de ADN del dominio extracelular de PD-1 canino: SEQ ID NO: 51 (optimizada por codón para expresión en células CHO)

ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccagga

aggcgagaatgccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggt

acagactgagccccaggaaccagaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaaccc

ggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctgcccaacggcagggacttccacatgtccatcgt

ggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgctatctacctgccccccaacaccc

agatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacctcccacccag

agcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtg

Dominio extracelular del PD-1 canino: SEQ ID NO: 52

LDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEP

GRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQ

SPSPPPRLSGQLQGLV

Dominio extracelular de PD-1 canino - secuencia de ADN de Fc de la IgG1 humana: SEQ ID NO: 53 (optimizada por codón para expresión en células HEK-293)

ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccagga

aggcgagaatgccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggt

acagactgagccccaggaaccagaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaaccc

ggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctgcccaacggcagggacttccacatgtccatcgt

ggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgctatctacctgccccccaacaccc

agatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacctcccacccag

agcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtgggtaccgacaaaactca

cacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaa

aacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagc

cacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagac

aaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacc

aggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatc

gagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc

ccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcg

acatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg

ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagca

ggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc

tctccctgtctccgggtaaatga

Dominio extracelular del PD-1 canino - proteína de fusión de Fc de IgG1 humana: secuencia señal subrayada y en negrita: los aminoácidos del SEQ ID NO: 54 están sin la secuencia señal.

MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQALDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSF

VLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYL

PPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLVGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL

TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY

TQKSLSLSPGK

Secuencia completa de ADN del PD-L1 canino: secuencia señal subrayada y en negrita. La secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 55 está sin la secuencia señal.

atgagaatgtttagtgtctttacattcatggcctactgccatttgctaaaagcatttacqatcac agtttctaaggacctgtatgtggtagagtatggtggcaatgtgacaatggaatgcaaattcccgg tggaaaaacagttaaacttgtttgcactaatcgtctactgggaaatggaggataaaaaaattata caatttgtgaatggaaaggaagacctgaaagttcagcacagcagctacagccagagggctcagct attgaaggaccagctcttcttggggaaggctgcgcttcagatcacagatgtgagattgcaggatg caggggtttactgctgcttgatcggctatggcggtgctgactacaagcggattactttgaaagtt catgccccgtaccgcaacatcagccaaagaatttctgtggatcctgtcacctctgaacatgaact aatgtgtcaggctgagggttaccctgaggctgaagtcatctggacaagcagtgaccaccgagtcc tgagtggcaaaaccaccatcactaattccaatagggaagagaagcttttcaatgtgaccagcacg ctgaacatcaatgcaacagctaatgagattttctactgcacttttcaaagatcaggtcctgagga aaacaatactgccgagttggtcatcccagaacgactgcccgttccagcaagtgagaggactcatt tcatgattctgggacctttcctgttgcttcttggtgtagtcctggcagtcactttctgtctaaaa aaacatgggagaatgatggatgtggaaaaatgttgcacccgagataggaactcaaagaaacgaaa tgatatacaatttgaagagacataa

PD-L1 canino de longitud completa: secuencia señal subrayada y en negrita. La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 56 está sin la secuencia señal.

MRMFSVFTFMAYCHLLKAFTITVSKDLYWEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKII

QFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKV

HAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTST

LNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTHFMILGPFLLLLGVVLAVTFCLK

KHGRMMDVEKCCTRDRNSKKRNDIQFEET

Secuencia de ADN del dominio extracelular de PD-L1 canino: SEQ ID NO: 57 (optimizado por codón para expresión en células CHO)

tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtg caagttccccgtggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggaca agaagatcatccagttcgtgaacggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccag agagcccagctgctgaaggaccagctgttcctgggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgag actgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggaggcgccgactacaagaggatca ccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcccgtgaccagc gagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcga

ccacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacg tgaccagcaccctcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagc ggccccgaagagaacaacaccgccgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcga gaggacccac

Proteína de dominio extracelular del PD-L1 canino: SEQ ID NO: 58

FTITVSKDLYVVEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQ

RAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTS

EHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRS

GPEENNTAELVIPERLPVPASERTH

Dominio extracelular de PD-L1 canino - secuencia de ADN de Fc de la IgG1 humana: SEQ ID NO: 59 (optimizada por codón para expresión en células HEK-293)

tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtg caagttccccgtggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggaca agaagatcatccagttcgtgaacggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccag agagcccagctgctgaaggaccagctgttcctgggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgag actgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggaggcgccgactacaagaggatca ccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcccgtgaccagc gagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcga ccacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacg tgaccagcaccctcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagc ggccccgaagagaacaacaccgccgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcga gaggacccacggtaccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggg gaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtg tggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtc tccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgaga accacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacct gcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggag aacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagct caccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctc tgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

Dominio extracelular del PD-L1 canino - proteína de fusión de Fc de IgG1 humana: SEQ ID NO: 60

FTITVSKDLYWEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQ

RAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTS

EHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRS

GPEENNTAELVIPERLPVPASERTHGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE

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SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

EJEMPLO 2

ANTICUERPOS MURINOS ANTI-PD-L1 CANINO

Generación de anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 canino:

Se inmunizó un total de tres ratones Balb/c varias veces (con 10 ^g cada vez) durante un período de 17 días. El antígeno inmunizante fue la proteína de fusión Fc-DEC del PD-L1 canino. Después de la inmunización, se recogió suero de cada ratón y se analizó la reactividad con la proteína DEC del PD-L1 canino marcada con HIS. Las células del bazo del ratón con el título más alto de suero anti-DEC del PD-L1-HIS se fusionaron con la línea celular de mieloma P3X63Ag8.653. Aproximadamente 2 semanas después de la fusión, el sobrenadante de las supuestas células de hibridoma se ensayó mediante ELISA para determinar su reactividad con la proteína DEC del PD-L1 marcada con HIS. Los hibridomas que producían fuertes señales positivas en el ELISA se subclonaron mediante dilución limitante y se ensayaron de nuevo para determinar la reactividad con la proteína DEC del PD-L1 canino marcada con HIS.

Confirmación de la reactividad de los anticuerpos monoclonales frente a PD-L1 canino:

La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas al DEC de PD-L1 canino se confirmó mediante ELISA. Las células de hibridoma se cultivaron usando biorreactores CELLine (Integra-biosciences) durante 10-30 días. Las células se mantuvieron inicialmente en DMEM suplementado con L-glutamina 4 mM y suero bovino fetal (FBS) de IgG ultrabaja al 10 % de Gibco. Las células de hibridoma se sembraron en cámaras de células del biorreactor CELLine a una densidad celular de aproximadamente 2x106 células/ml en 15 ml del mismo medio con la concentración de FBS aumentada al 20 %. La cámara exterior se llenó con 1 litro de medio nutritivo (DMEM con L-glutamina 4 mM y FBS estándar al 2 %). Las células de hibridoma en la cámara celular se expandieron a aproximadamente 2,5x107 células/ml durante 3-7 días. A continuación, se recogieron 10 ml de suspensión celular de la cámara celular y se reemplazaron con medio fresco para permitir la reexpansión de las células y las posteriores recolecciones. Este procedimiento se repitió según fue necesario para obtener cantidades adecuadas de mAb de cada clon de hibridoma. Las suspensiones de células recolectadas se centrifugaron y los sobrenadantes se filtraron a través de membranas de filtro de 0,2 micrómetros. Para la purificación de anticuerpos, el sobrenadante de cada clon se purificó usando una columna de 5 ml de flujo rápido de proteína G Sepharose 4 (GE Healthcare) mediante flujo por gravedad. Después de lavar con tampón Tris-EDTA (T^e) a pH 8,0, Los anticuerpos unidos se eluyeron usando tampón de glicina 0,1 M, a pH 2,7, seguido de la neutralización del pH con Tris 1 M, a pH 8,0. Los anticuerpos se concentraron y se intercambió el tampón en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando unidades de filtro centrífugo Centriprep YM-10,10 kDa NMWL (Millipore). Las concentraciones de anticuerpos se cuantificaron mediante espectrofotometría.

Los mAb anti-PD-L1 canino purificado se analizaron para determinar la reactividad con la proteína de fusión PD-L1 canino-hFc mediante ELISA de la siguiente manera: La proteína de fusión PD-L1 canino-hFc se diluye a 10 pg/ml en tampón de recubrimiento (carbonato/bicarbonato a pH 9,0) y se distribuye a 100 pl/pocillo en placas ELISA de fondo plano de 96 pocillos (NUNC). Las placas se incuban a 4 °C durante una noche. Después, las placas se lavan tres veces con solución salina tamponada con fosfato que contiene Tween-20 al 0,05 % (PBST). A continuación, se añaden 200 pl de tampón de bloqueo (leche desnatada al 5 % en PBST) a cada pocillo y las placas se incuban a 37 °C durante 60 minutos. Después, las placas se lavan tres veces con PBST. A continuación, se añaden 100 pl de mAb de prueba diluido en tampón de bloqueo a los primeros pocillos de las columnas correspondientes. Los mAb de prueba se diluyen luego dos veces hasta la posición apropiada de la placa. Tras la incubación de las placas a 37 °C durante 60 minutos, las placas se lavan tres veces con PBST. A continuación, se añaden a las placas 100 pl por pocillo de una dilución a 1:2000 de un anti-IgG de ratón en cabra (KPL) conjugada con peroxidasa de rábano picante, que después se incuban a 37 °C durante 60 minutos. Luego, las placas se lavan tres veces con PBST y a las placas se añaden 100 pl/pocillo de sustrato de 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB) (de KPL). Se deja que se desarrolle la reacción de color durante 5-20 minutos a 37 °C antes de medir la absorbancia a 650 nm.

Células CHO que expresan la proteína PD-1 canina:

El gen PD-1 canino de longitud completa se clonó en el plásmido p96793. En este plásmido, la expresión de la proteína PD-1 está dirigida por un promotor de hCMV. Las células ^cH^oDXB11 (dhfr-) se mantuvieron en MEM-alfa (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10 %. La transfección de células CHO con el plásmido p96793 se realizó en matraces de 75 cm2 que contienen aproximadamente 6x106 células mediante administración de genes mediada por liposomas usando Lipofectamina (Invitrogen). Después de 48 horas, las células se pasaron al medio MEM-alfa sin nucleósidos, suplementado con FBS al 10 % y 400 pg/ml de higromicina B (medio selectivo). La clonación de dilución limitada se realizó en el conjunto de células dhfr+, resistentes a higromicina. Los clones se evaluaron para determinar la expresión de PD-1 canino mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Resumiendo, las monocapas de células se fijaron en placas de 96 pocillos con acetona al 80 %. Después, las monocapas de células fijadas y secas se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo policlonal de cabra anti-PD-1 humano (R&D Systems). Las placas se lavaron con PBS y luego se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo IgG anti-cabra en conejo marcado con fluoresceína (KPL). Las placas se lavaron con PBS. Se expandieron los clones que mostraban fluorescencia y se establecieron las reservas de células.

Bloqueo de ligando por mAbs anti-PD-L1 de ratón:

Se utilizó un ensayo ELISA basado en células (CELISA) basado en la línea celular CHO que expresa PD-1 canino para demostrar la capacidad de los anticuerpos de ratón anti-PD-L1 canino para bloquear la interacción entre (por ejemplo, bloquear la unión de) PD-L1 canino y su receptor canino PD-1. El bloqueo de ligando se confirmó usando este ensayo junto con la proteína PD-L1 canino/h Fc de la siguiente manera:

1. Sembrar células cPD-1 CHO en placas de 96 pocillos y cultivar las células hasta una confluencia del 95-100 %.

Directrices generales para la colocación en placas de células CHO,

el día -3: 1x10a c/pocillo (1x1c5 c/ml)

-2: 2x1c4 c/pocillo (2x105c/ml)

-1: 4x1c4 c/pocillo (4x105c/ml)

2. diluir 3 veces los mAb anti-cPDL1 en medio de CHO, a partir de 30 pg/ml, a 100 pl/pocillo. Añadir cPD-L1-hFc a 4 pg/ml en medio de CHO, a 100 pl/pocillo, incubar conjuntamente en una placa de dilución a 37 °C, con CO2 al 5 % con agitación durante 60 min.

3. Aspirar el medio de cultivo celular de las placas recubiertas de células, lavar las placas de PBS a 3x Tween20 al 0,05 % y medio CHO a 1x.

4. Agregue los mAb cPD-L1/PD-L1 Fc coincubados de la placa de dilución a la placa recubierta de células. 100 ul/pocillo. Incubar a 37 °C, con CO2 al 5 % con agitación durante 60 min.

5. Lavar las placas de PBS a 6x Tween 20 al 0,05% (utilizando el protocolo de lavado manual).

6. Añadir anti-Fc Humano-HRP (Calbiochem) (1:2500) en medio de CHO, a 100ul/pocillo, incubar 30-60min a 37 °C/CO2 al 5 %.

7. Lavar las placas de PBS a 5x Tween20 al 0,05 % (utilizando el protocolo de lavado manual).

8. Añadir 100 pl/pocillo de sustrato TMB mircowell. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Utilizar sustrato de una etapa de Pierce.

9. Detener con 100 pl/pocillo de ácido fosfórico 1,5M.

10. Medir la A450 - A620 en el lector ELISA.

Clonación e identificación de secuencias de ADN correspondientes a regiones variables de mAb anti-PD-L1 canino de ratón:

La secuencia de ADN de las cadenas VH y VL de ratón y las secuencias de ADN que codifican sus CDR se identifican después del aislamiento del ARNm de cada hibridoma usando métodos estándar de biología molecular. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los dos anticuerpos ejemplificados en el presente documento se proporcionan en la Tabla 12 a continuación. Las SEQ ID NO. de las secuencias de aminoácidos predichas de las CDR de estos hibridomas se enumeran en la Tabla 2 a continuación:

TABLA 2

SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE LAS CDR

4F9

SEQ ID NO.

CDR1 de VH SYAMS 13

CDR2 de VH TISDGGSYTHYPDN LMG 14

CDR3 de VH ESYDGYYVAN 15

CDR1 de VL RASQSISNNLH 16

CDR2 de VL YASQSIS 17

CDR3 de VL QQSNSWPQT 18

5F12

CDR1 de VH DYYMN 19

CDR2 de VH WIFPGSGATYYNERFMG 20

CDR3 de VH SDWDVGDF 21

CDR1 de VL RSSRSLLHTNGITYLS 22

CDR2 de VL QMSNLAS 23

CDR3 de VL AQTLGLPRT 24

Estructuras canónicas (clases) para CDR de cadena VH

mAb: 4F9: CDR1: H1-1; CDR2: H2-3B; CDR3: H3-10

mAb: 5F12: CDR1: H1-1; CDR2: H2-3B; CDR3: H3-8

Estructuras canónicas (clases) para CDR de cadena VL

mAb: 4F9: CDR1: L1-2; CDR2: L2-1; CDR3: L3-1

mAb: 5F12: CDR1: L1-3; CDR2: L2-1; CDR3: L3-1

EJEMPLO 3

CANINIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS CANINIZADOS

Para producir anticuerpos caninizados fue necesario identificar la secuencia de ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de la IgG canina. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada canina se pueden obtener de las bases de datos de genes y proteínas del NCBI. Hay cuatro subclases de IgG conocidas de IgG canina: IgGA, IgGB, IgGC e IgGD y dos tipos de cadenas ligeras: kappa y lambda. La Tabla 7 enumera las SEQ ID NO de aminoácidos y nucleótidos de los fragmentos Fc caninos no modificados.

Sin quedar ligados a enfoque específico alguno, el proceso de producción de variantes de anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 con diversos contenidos de secuencias caninas y de ratón involucró el siguiente esquema general: i) Determinar la secuencia de nucleótidos de las cadenas VH y VL de mAb de ratón;

ii) Identificar las CDR de las cadenas H y L de los mAb de ratón;

iii) Identificar una cadena H y L adecuada de IgG canina;

iv) Determinar la secuencia de nucleótidos de las cadenas H y L de IgG canina;

v) Sustituir la secuencia de nucleótidos que codifica las CDR endógenas de las cadenas H y L caninas por secuencias de nucleótidos que codifican las respectivas CDR de ratón. También, opcionalmente, sustituir algunos restos del marco canino con restos seleccionados de las regiones marco del ratón;

vi) Sintetizar el nucleótido de la etapa (v) e insertarlo en un plásmido de expresión adecuado; Transfectar plásmidos en células apropiadas, por ejemplo, células HEK 293;

vii) Purificar el anticuerpo expresado del sobrenadante de HEK 293; y

viii) Analizar el anticuerpo purificado para determinar si se une al PD-L1 canino.

EJEMPLO 4

IgG CANINAS GENÉTICAMENTE MODIFICADAS

Para generar variantes de IgG canina que carecen de funciones efectoras, se generaron varias cadenas pesadas de IgGB canina mutantes [véase, la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/030.812, presentada el 30 de julio de 2014, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad]. Estas variantes pueden incluir una de las siguientes sustituciones simples o combinadas en la porción Fc de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada: P4A, D31A, N63A, G64P, T65A, A93G e P95A. Las variantes de cadenas pesadas (es decir, que contienen tales sustituciones de aminoácidos) se clonaron en plásmidos de expresión y se transfectaron en células HEK 293 junto con un plásmido que contenía el gen que codifica una cadena ligera. Los anticuerpos intactos expresados y purificados a partir de células HEK 293 se evaluaron para determinar su unión a FC^yRI y C1q para evaluar su potencial para la mediación de funciones efectoras inmunes. La Tabla 3 enumera ejemplos de los plásmidos que codifican las cadenas pesadas caninizadas modificadas genéticamente, las cadenas pesadas caninizadas; y las modificaciones genéticas en estas cadenas pesadas. Las variantes de cadenas pesadas se utilizaron para evaluar la función efectora en los mAb modificados genéticamente. Todas las cadenas pesadas comprendían las CDR de los anticuerpos murinos anti-PD-1 canino. [Véase, la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/030.812, citado anteriormente]

(continuación)

TABLA 12

Fc modificado

Fc de la clgGB [SEQ ID NO: 2]

LGGXSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCWVXLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQF

XXXYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKXLXSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREEL

SKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ

RGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK

Fc de la cIgGB [SEQ ID NO: 1]

ctgggcggcnnnagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagataccctgctgattgcgcg caccccggaagtgacctgcgtggtggtgnnnctggatccggaagatccggaagtgcagatta gctggtttgtggatggcaaacagatgcagaccgcgaaaacccagccgcgcgaagaacagttt nnnnnnnnntatcgcgtggtgagcgtgctgccgattggccatcaggattggctgaaaggcaa acagtttacctgcaaagtgaacaacaaannnctgnnnagcccgattgaacgcaccattagca aagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagccgcgaagaactg agcaaaaacaccgtgagcctgacctgcctgattaaagatttttttccgccggatattgatgt ggaatggcagagcaacggccagcaggaaccggaaagcaaatatcgcaccaccccgccgcagc tggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcag cgcggcgatacctttatttgcgcggtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagga aagcctgagccatagcccgggcaaa

Fc de la cIgGC [SEQ ID NO: 4]

LGGXSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCWVXLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQS

XXXYRWSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKXLXSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEM

SKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ

RGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK

Fc de la cIgGC [SEQ ID NO: 3]

ctgggcggcnnnagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctggtgaccgcgcg caccccgaccgtgacctgcgtggtggtgnnnctggatccggaaaacccggaagtgcagatta gctggtttgtggatagcaaacaggtgcagaccgcgaacacccagccgcgcgaagaacagagc nnnnnnnnntatcgcgtggtgagcgtgctgccgattggccatcaggattggctgagcggcaa acagtttaaatgcaaagtgaacaacaaannnctgnnnagcccgattgaagaaattattagca aaaccccgggccaggcgcatcagccgaacgtgtatgtgctgccgccgagccgcgatgaaatg agcaaaaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaaagatttttttccgccggaaattgatgt ggaatggcagagcaacggccagcaggaaccggaaagcaaatatcgcatgaccccgccgcagc tggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcag cgcggcgatacctttatttgcgcggtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagat tagcctgagccatagcccgggcaaa

Fc de la cIgGD (S -> P en la bisagra D) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 6]

PKESTCKCIPPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCWLDLGREDPEVQISWFV

DGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARG

QAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDE

DGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK

Fc de la clgGD (S -> P en la bisagra D) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 5]

ccgaaagaaagcacctgcaaatgcattccgccgtgcccggtgccggaaagcctgggcggccc gagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctgcgcattacccgcaccccggaaa ttacctgcgtggtgctggatctgggccgcgaagatccggaagtgcagattagctggtttgtg gatggcaaagaagtgcataccgcgaaaacccagccgcgcgaacagcagtttaacagcaccta tcgcgtggtgagcgtgctgccgattgaacatcaggattggctgaccggcaaagaatttaaat gccgcgtgaaccatattggcctgccgagcccgattgaacgcaccattagcaaagcgcgcggc caggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagcccgaaagaactgagcagcagcga taccgtgaccctgacctgcctgattaaagatttttttccgccggaaattgatgtggaatggc agagcaacggccagccggaaccggaaagcaaatatcataccaccgcgccgcagctggatgaa gatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcagcagggcga tacctttacctgcgcggtgatgcatgaagcgctgcagaaccattataccgatctgagcctga gccatagcccgggcaaa

Fc de la cIgGD (bisagra A) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 8]

FNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCWLDLGREDPEVQISWFV

DGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARG

QAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDE

DGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK

Fc de la cIgGD (bisagra A) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 7]

tttaacgaatgccgctgcaccgataccccgccgtgcccggtgccggaaccgctgggcggc ccgagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctgcgcattacccgcaccccg gaaattacctgcgtggtgctggatctgggccgcgaagatccggaagtgcagattagctgg tttgtggatggcaaagaagtgcataccgcgaaaacccagccgcgcgaacagcagtttaac agcacctatcgcgtggtgagcgtgctgccgattgaacatcaggattggctgaccggcaaa gaatttaaatgccgcgtgaaccatattggcctgccgagcccgattgaacgcaccattagc aaagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagcccgaaagaa ctgagcagcagcgataccgtgaccctgacctgcctgattaaagatttttttccgccggaa attgatgtggaatggcagagcaacggccagccggaaccggaaagcaaatatcataccacc gcgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaa agccgctggcagcagggcgatacctttacctgcgcggtgatgcatgaagcgctgcagaac cattataccgatctgagcctgagccatagcccgggcaaa

Fc de la cIgGD (bisagra B) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 10]

PKRENGRVPRRRDCRKCPAREMLGGRSVFIFRRKRKDILRITRTPEITCWLDLGREDREVQ

ISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTI

SKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTA

PQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK

Fc de la cIgGD (bisagra B) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 9]

ccgaaacgcgaaaacggccgcgtgccgcgcccgccggattgcccgaaatgcccggcgccg gaaatgctgggcggcccgagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctgcgc attacccgcaccccggaaattacctgcgtggtgctggatctgggccgcgaagatccggaa gtgcagattagctggtttgtggatggcaaagaagtgcataccgcgaaaacccagccgcgc gaacagcagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgccgattgaacatcaggat tggctgaccggcaaagaatttaaatgccgcgtgaaccatattggcctgccgagcccgatt gaacgcaccattagcaaagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccg ccgagcccgaaagaactgagcagcagcgataccgtgaccctgacctgcctgattaaagat ttttttccgccggaaattgatgtggaatggcagagcaacggccagccggaaccggaaagc aaatatcataccaccgcgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaa ctgagcgtggataaaagccgctggcagcagggcgatacctttacctgcgcggtgatgcat gaagcgctgcagaaccattataccgatctgagcctgagccatagcccgggcaaa

Fc de la clgGD (bisagra C) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 12]

AKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCWLDLGREDPEVQIS

WFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISK

ARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQ

LDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK

Fc de la cIgGD (bisagra C) cambio en brazo fab [SEQ ID NO: 11]

gccaaggagtgcgagtgcaagtgcaactgcaacaactgcccctgccccggctgcggcctg ctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcacc agaacccccgagatcacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcag atcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagcccagagagcag cagttcaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctg accggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcggcctgcccagccccatcgagaga accatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagc cccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttc ccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcccgagcccgagagcaagtac cacaccaccgccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagc gtggacaagagcagatggcagcagggcgacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggcc ctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag

Fc natural

Fc de la cIgGA [SEQ ID NO: 62]

LGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQF

NGTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKEL

SSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW

QQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK

Fc de la cIgGA [SEQ ID NO: 61]

ctgggcggccccagcgtgctgatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcacc agaacccccgaggtgacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcag atcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagagcagagagcag cagttcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctg accggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcgacctgcccagccccatcgagaga accatcagcaaggccagaggcagagcccacaagcccagcgtgtacgtgctgccccccagc cccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgagcatcacctgcctgatcaaggacttctac ccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagaaagcac agaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagc gtggacaagagcagatggcagcagggcgaccccttcacctgcgccgtgatgcacgagacc ctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag

Fc de la cIgGD [SEQ ID NO: 64]

LGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCWLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQF

NSTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKEL

SSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRW

QQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK

Fc de la cIgGD [SEQ ID NO: 63]

ctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcacc agaacccccgagatcacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcag atcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagcccagagagcag cagttcaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctg accggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcggcctgcccagccccatcgagaga accatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagc cccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttc ccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcccgagcccgagagcaagtac cacaccaccgccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagc gtggacaagagcagatggcagcagggcgacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggcc ctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag

Fc de la cIgGB [SEQ ID NO: 66]

LGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRWSVL

PIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDID

VEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK

Fc de la cIgGB [SEQ ID NO: 65]

ctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacaccctgctgatcgcc agaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacctggaccccgaggaccccgaggtgcag atcagctggttcgtggacggcaagcagatgcagaccgccaagacccagcccagagaggag cagttcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctg aagggcaagcagttcacctgcaaggtgaacaacaaggccctgcccagccccatcgagaga accatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagc agagaggagctgagcaagaacaccgtgagcctgacctgcctgatcaaggacttcttcccc cccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacaga accacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtg gacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctg cacaaccactacacccaggagagcctgagccacagccccggcaag

Fc de la cIgGC [SEQ ID NO: 68]

LGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCWVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQS

NGTYRWSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEM

SKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQ

RGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK

Fc de la cIgGC [SEQ ID NO: 67]

ctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctggtgaccgcc agaacccccaccgtgacctgcgtggtggtggacctggaccccgagaaccccgaggtgcag atcagctggttcgtggacagcaagcaggtgcagaccgccaacacccagcccagagaggag cagagcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctg agcggcaagcagttcaagtgcaaggtgaacaacaaggccctgcccagccccatcgaggag atcatcagcaagacccccggccaggcccaccagcccaacgtgtacgtgctgccccccagc agagacgagatgagcaagaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaaggacttcttcccc cccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacaga atgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtg gacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctg cacaacoactacacecagatcagcctgagccacagccccggcaag

Cadenas pesadas sustituidas individuales

4F9-VH3 cIgGB [SEQ ID NO: 26]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDN

LMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAP

SVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSM

VTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGXSVFIFP

PKPKDTLLIARTPEVTCWVXLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFXXXYRWSVL

PIGHQDWLKGKQFTCKVNNKXLXSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCL

IKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVM

HEALHNHYTQESLSHSPGK

F9-VH3 cIgGB DNA [SEQ ID NO: 25]

gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgag ctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggcccccggca agggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactaccccgacaac ctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctgcagctgaa cagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctacgacggctact acgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgccccc agcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctg cctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgacca gcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatg gtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgc cagcaagaccaaggtggacaagcccgtgcccaagagagagaacggcagagtgcccagacccc ccgactgccccaagtgccccgcccccgagatgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccc cccaagcccaaggacaccctgctgatcgccagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtgnn nctggaccccgaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaagcagatgcaga ccgccaagacccagcccagagaggagcagttcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctg cccatcggccaccaggactggctgaagggcaagcagttcacctgcaaggtgaacaacaagnn nctgnnnagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcg tgtacgtgctgccccccagcagagaggagctgagcaagaacaccgtgagcctgacctgcctg atcaaggacttcttcccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcc cgagagcaagtacagaaccacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtaca gcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatg cacgaggccctgcacaaccactacacccaggagagcctgagccacagccccggcaag

F9-VH3 cIgGC [SEQ ID NO: 28]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDN

LMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAP

SVFPLAPSCGSQSGSTVALACLVSGYIPEPVTVSWNSVSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSM

VTVPSSRWPSETFTCNVAHPATNTKVDKPVAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGXSVFIFPPK

PKDILVTARTPTVTCVWXLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSXXXYRWSVLPI

GHQDWLSGKQFKCKVNNKXLXSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVK

DFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHE

ALHNHYTQISLSHSPGK

F9-VH3 cIgGC DNA [SEQ ID NO: 27]

gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgag ctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggcccccggca agggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactaccccgacaac ctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctgcagctgaa cagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctacgacggctact acgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgccccc agcgtgttccccctggcccccagctgcggcagccagagcggcagcaccgtggccctggcctg cctggtgagcggctacatccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcgtgagcctgacca gcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatg gtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgc caccaacaccaaggtggacaagcccgtggccaaggagtgcgagtgcaagtgcaactgcaaca actgcccctgccccggctgcggcctgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccccccaag cccaaggacatcctggtgaccgccagaacccccaccgtgacctgcgtggtggtgnnnctgga ccccgagaaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacagcaagcaggtgcagaccgcca acacccagcccagagaggagcagagcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctgcccatc ggccaccaggactggctgagcggcaagcagttcaagtgcaaggtgaacaacaagnnnctgnn nagccccatcgaggagatcatcagcaagacccccggccaggcccaccagcccaacgtgtacg tgctgccccccagcagagacgagatgagcaagaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaag gacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagag caagtacagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagc tgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgag gccctgcacaaccactacacccagatcagcctgagccacagccccggcaag

F12-VH3 ClgGB [SEQ ID NO: 30]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNER

FMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSV

FPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVT

VPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGXSVFIFPPK

PKDTLLIARTPEVTCWVXLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFXXXYRWSVLPI

GHQDWLKGKQFTCKVNNKXLXSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIK

DFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHE

ALHNHYTQESLSHSPGK

F12-VH3 ClgGB DNA [SEQ ID NO: 29]

gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgag ctgcgtggccagcttcaccttcgactactacatgaactgggtgagacaggcccccggcaagg gcctgcagtggatcggcagatggatcttccccggcagcggcgccacctactacaacgagaga ttcatgggcaaggccaccatcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctacatgcagctgaa cagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcctgagaagcgactgggacgtgggcg acttctggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtg ttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggt gagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgaccagcggcg tgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatggtgacc gtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgccagcaa gaccaaggtggacaagcccgtgcccaagagagagaacggcagagtgcccagaccccccgact gccccaagtgccccgcccccgagatgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccccccaag cccaaggacaccctgctgatcgccagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtgnnnctgga ccccgaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaagcagatgcagaccgcca agacccagcccagagaggagcagttcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctgcccatc ggccaccaggactggctgaagggcaagcagttcacctgcaaggtgaacaacaagnnnctgnn nagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacg tgctgccccccagcagagaggagctgagcaagaacaccgtgagcctgacctgcctgatcaag gacttcttcccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagag caagtacagaaccacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagc tgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgag gccctgcacaaccactacacccaggagagcctgagccacagccccggcaag

F12-VH3-cIgGC Fc [SEQ ID NO: 32]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNER

FMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSV

FPLAPSCGSQSGSTVALACLVSGYIPEPVTVSWNSVSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVT

VPSSRWPSETFTCNVAHPATNTKVDKPVAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGXSVFIFPPKPK

DILVTARTPTVTCWVXLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSXXXYRWSVLPIGH

QDWLSGKQFKCKVNNKXLXSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDF

FPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEAL

HNHYTQISLSHSPGK

5Fl2-VH3-cIgGC Fc DNA [SEQ ID NO: 31]

gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgag ctgcgtggccagcttcaccttcgactactacatgaactgggtgagacaggcccccggcaagg gcctgcagtggatcggcagatggatcttccccggcagcggcgccacctactacaacgagaga ttcatgggcaaggccaccatcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctacatgcagctgaa cagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcctgagaagcgactgggacgtgggcg acttctggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtg ttccccctggcccccagctgcggcagccagagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggt gagcggctacatccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcgtgagcctgaccagcggcg tgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatggtgacc gtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgccaccaa caccaaggtggacaagcccgtggccaaggagtgcgagtgcaagtgcaactgcaacaactgcc cctgccccggctgcggcctgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccccccaagcccaag

gacatcctggtgaccgccagaacccccaccgtgacctgcgtggtggtgnnnctggaccccga gaaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacagcaagcaggtgcagaccgccaacaccc agcccagagaggagcagagcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccac caggactggctgagcggcaagcagttcaagtgcaaggtgaacaacaagnnnctgnnnagccc catcgaggagatcatcagcaagacccccggccaggcccaccagcccaacgtgtacgtgctgc cccccagcagagacgagatgagcaagaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaaggacttc ttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagta cagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcg tggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctg cacaaccactacacccagatcagcctgagccacagccccggcaag

Cadenas pesadas y ligeras caninizadas individuales no sustituidas

4F9-VH3-cIgGA Fc [SEQ ID NO: 34]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDN

LMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAP

SVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLHSLSSM

VTVPSSRWPSETFTCNWHPASNTKVDKPVFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKD

ILRITRTPEVTCWLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQ

DWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDF

YPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETL

QNHYTDLSLSHSPGK

4F9-VH3-cIgGA Fc [SEQ ID NO: 33]

gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactg agctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggccccc ggcaagggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactacccc gacaacctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctg cagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctac gacggctactacgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagc accaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcacc gtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaac agcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctg cacagcctgagcagcatggtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacc tgcaacgtggtgcaccccgccagcaacaccaaggtggacaagcccgtgttcaacgagtgc agatgcaccgacacccccccctgccccgtgcccgagcccctgggcggccccagcgtgctg atcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgaggtgacctgc gtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggc aaggaggtgcacaccgccaagacccagagcagagagcagcagttcaacggcacctacaga gtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgc agagtgaaccacatcgacctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggc agagcccacaagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagc gacaccgtgagcatcacctgcctgatcaaggacttctacccccccgacatcgacgtggag tggcagagcaacggccagcaggagcccgagagaaagcacagaatgacccccccccagctg gacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcag cagggcgaccccttcacctgcgccgtgatgcacgagaccctgcagaaccactacaccgac ctgagcctgagccacagccccggcaag

F9-VH3 cIgGD Fc [SEQ ID NO: 36]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDN

LMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAP

SVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSST

VTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKD

ILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQ

DWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDF

FPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEAL

QNHYTDLSLSHSPGK

F9-VH3 cIgGD Fc [SEQ ID NO: 35]

gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactg agctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggccccc ggcaagggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactacccc gacaacctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctg cagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctac gacggctactacgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagc accaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcacc gtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaac agcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctg tacagcctgagcagcaccgtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacc tgcaacgtggtgcaccccgccagcaacaccaaggtggacaagcccgtgcccaaggagagc acctgcaagtgcatcagcccctgccccgtgcccgagagcctgggcggccccagcgtgttc atcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgagatcacctgc gtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggc aaggaggtgcacaccgccaagacccagcccagagagcagcagttcaacagcacctacaga gtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgc agagtgaaccacatcggcctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggc caggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagc gacaccgtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggag tggcagagcaacggccagcccgagcccgagagcaagtaccacaccaccgccccccagctg gacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcag cagggcgacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggccctgcagaaccactacaccgac ctgagcctgagccacagccccggcaag

F9-VL3-cL-Kappa [SEC ID N.° 38]

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASMSCRASQSISNNLHWYRQKPGQSPQVLVKYASQSISGVPDRF

IGSGSGTDFTLRISRVEADDLGVYYCQQSNSWPQTFGQGTKLELKRNDAQPAVYLFQPSPDQ

LHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEY

LSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD

F9-VL3-cL-Kappa [SEC ID N.° 37]

gaca tcg tg a tgacccagacccccc tgag cc tgagcg tgagccccgg cgagcccgccagc a tgagctgcagagccagccagagca tcagcaacaacctgcactgg tacagacagaagccc

ggccaga gcccccagg tgc tgg tgaag tacgccagccagagca tcagcggcg tgcccgac aga ttca tcg gcagcggcagcgg caccgac ttcaccc tgagaa tcagcagag tgga ggcc g a cg a cc tg g g cg tg ta c ta c tg cca g ca g a g ca a ca g c tg g cccca g a cc ttcg g cca g g g ca cca a gc tggagc tgaag agaaacgacgcccag cccgccg tg tacc tg ttccagccc a g ccccg a cca g c tg ca ca ccg g ca g cg cca g cg tg g tg tg cc tg c tg a a ca g c ttc ta c cccaagga ca tcaacg tgaag tggaagg tggacggcg tga tccaggacaccggca tccag gagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgacc a tgagcagcaccgag tacc tgagccacgagc tg tacagc tgcgaga tcacccacaagagc ctgcccagcaccc tg a tcaagagc ttccaga gaagcgag tgcca gagag tggac

F12-VH3-cIgGA Fc [SEQ ID NO: 40]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNER

FMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSV

FPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLHSLSSMVT

VPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDIL

RITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDW

LTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYP

PDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQN

HYTDLSLSHSPGK

F12-VH3-cIgGA Fc [SEQ ID NO: 39]

gagg tg cagctgg tgcagagcggcggcgacctgg tgaagcccggcggcagcg tgagactg a g c tg c g tg g c c a g c ttc a c c ttc g a c ta c ta c a tg a a c tg g g tg a g a c a g g c c c c c g g c a a g g g cc tg ca g tg g a tcg g ca g a tg g a tc ttccccg g ca g cg g cg cca cc ta c ta ca a c gagaga ttca tgggcaaggccacca tcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctaca tg cagc tgaacagcc tgagagccga ggacaccgccg tg tac ta c tgcc tgagaagcga c tgg gacg tgggcgac ttc tggggccag ggcaccc tgg tgaccg tg agcagcgccagcacca cc gcccccagcg tg ttccccc tggcccccagc tgcggcag caccagcggcagcaccg tggcc c tg g c c tg c c tg g tg a g cg g c ta c ttc cccg a g cccg tg a ccg tg a g c tg g a a ca g cg g c agcc tgacca gcggcg tgcacacc ttccccag cg tgc tgcagagcag cggcc tgcacagc c tgagcag ca tg g tg a ccg tg ccca g ca g ca g a tg g ccca g cg a g a cc ttca cc tg ca a c g tgg tgca ccccgccagcaacaccaag g tggacaagcccg tg ttcaacgag tgcaga tgc a c c g a c a c c c c c c c c tg ccccg tg cccg a g cccc tg g g cg g cccca g cg tg c tg a tc ttc ccccccaagcccaa ggaca tcc tgagaa tcaccagaacccccgagg tgacc tgcg tgg tg c tggacc tgggcagagaggaccccgagg tgcaga tcagc tgg ttcg tggacggcaaggag g tgcacaccgccaagacccagagcagagagcagcag ttcaacggcacctacagag tgg tg agcg tg c tg ccca tcg a g ca cca g g a c tg g c tg a ccg g ca a g g a g ttca a g tg ca g a g tg aaccacatcgacctgcccagcccca tcgagagaacca tcagcaaggccagaggcagagcc cacaagcccagcg tg tacg tgc tgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacacc g tg a g c a tc a c c tg c c tg a tc a a g g a c ttc ta c c c c c c c g a c a tc g a c g tg g a g tg g c a g agcaacggccagcaggagcccgagagaaagcacagaatgacccccccccagctggacgag gacggca gc tac ttcc tg tacagcaag c tgagcg tggacaa gagcaga tggca gcagggc g a cccc ttca cc tg cg ccg tg a tg ca cg a g a ccc tg ca g a a cca c ta ca ccg a cc tg a g c ctgagccacagccccggcaag

F12-VH3-cIgGD Fc [SEQ ID NO: 42]

EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNER

FMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSV

FPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVT

VPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDIL

RITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDW

LTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFP

PEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQN

HYTDLSLSHSPGK

5F12-VH3-cIgGD Fc [SEQ ID NO: 41]

gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactg agctgcgtggccagcttcaccttcgactactacatgaactgggtgagacaggcccccggc aagggcctgcagtggatcggcagatggatcttccccggcagcggcgccacctactacaac gagagattcatgggcaaggccaccatcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctacatg cagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcctgagaagcgactgg gacgtgggcgacttctggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccacc gcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggcc ctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggc agcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagc ctgagcagcaccgtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaac gtggtgcaccccgccagcaacaccaaggtggacaagcccgtgcccaaggagagcacctgc aagtgcatcagcccctgccccgtgcccgagagcctgggcggccccagcgtgttcatcttc ccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgagatcacctgcgtggtg ctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggag gtgcacaccgccaagacccagcccagagagcagcagttcaacagcacctacagagtggtg agcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtg aaccacatcggcctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcc caccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacacc gtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcag agcaacggccagcccgagcccgagagcaagtaccacaccaccgccccccagctggacgag gacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggc gacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggccctgcagaaccactacaccgacctgagc ctgagccacagccccggcaag

5F12-VL3-cLKappa [SEQ ID NO: 44]

DIVMTQTPLSLSVSLGEPASISCRSSRSLLHTNGITYLSWYRQKPGQIPQLLIYQMSNLASG

VPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCAQTLGLPRTFGQGTKVEIKRNDAQPAVYLFQ

PSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTM

SSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD

5F12-VL3-cLKappa [SEQ ID NO: 43]

gacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgagcgtgagcctgggcgagcccgccagc atcagctgcagaagcagcagaagcctgctgcacaccaacggcatcacctacctgagctgg tacagacagaagcccggccagatcccccagctgctgatctaccagatgagcaacctggcc agcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgagaatc agcagagtggaggccgacgacgccggcgtgtactactgcgcccagaccctgggcctgccc agaaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagagaaacgacgcccagcccgccgtg

tacctgttccagcccagccccgaccagctgcacaccggcagcgccagcgtggtgtgcctg ctgaacagcttctaccccaaggacatcaacgtgaagtggaaggtggacggcgtgatccag gacaccggcatccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctg agcagcaccctgaccatgagcagcaccgagtacctgagccacgagctgtacagctgcgag atcacccacaagagcctgcccagcaccctgatcaagagcttccagagaagcgagtgccag agagtggac

Regiones variables de anti-PDL-1 canino de ratón:4F9

Cadena pesada: Secuencia de ADN [SEQ ID NO: 73]

gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctc

ctgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagactccgg

acaagagactggagtgggtcgcaaccattagtgatggtggaagttacacccactaccccgac

aatttaatgggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaacctgtacctgcaaat

gagccatctgaagtctgacgacacagccatgtattactgtgcacgagagagctatgatggtt

actacgtggctaactggggccaagggactctggtcactgtctcagca

Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 74]

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPDKRLEWVATISDGGSYTHYPD

NLMGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSA

Cadena ligera: Secuencia de ADN [SEQ ID NO: 75]

gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgaatccaggagatagcgtcagtct

ttcctgcagggccagccaaagtattagcaacaacctacactggtatcaacaaaaatcacatg

agtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctgggatcccctccaggttc

agtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattt

tggaatgtatttctgtcaacagagtaacagctggcctcagacgttcggtggaggcaccaagc

tggaaatcaaa

Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 76]

DIVLTQSPATLSVNPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRF

SGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPQTFGGGTKLEIK

Regiones variables de anti-PDL-1 canino de ratón: Anti-PDL-15F12

Cadena pesada: Secuencia de ADN [SEQ ID NO: 77]

caggtccagctacagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatc

ctgcaaggcttctggctacaccttcactgactactatatgaattgggtgaaacagaggcctg

gacagggacttgagtggattggatggatttttcccggaagtggtgctacttactacaatgag

aggttcatgggcaaggccacacttactgtggataaatcttccaacacagcctacatgttgtt

cagtagcctgacctctgaggactctgcggtctatttctgtttaagatctgactgggacgtcg

gggacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca

Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 78]

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQRPGQGLEWIGWIFPGSGATYYNE

RFMGKATLTVDKSSNTAYMLFSSLTSEDSAVYFCLRSDWDVGDFWGQGTTLTVSS

Cadena ligera: Secuencia de ADN [SEQ ID NO: 79]

gatattgtgatgacgcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccat

ctcctgcaggtctagtaggagtctcctacatactaatggcatcacttatttgtcttggtttc

tgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcagga

gtcccagacaggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagtagagt

ggaggctgaggatgtgggtatttattactgtgctcaaactctaggacttcctcggacgttcg

gtggaggcaccaagctggaaatcaaa

Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 80]

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSRSLLHTNGITYLSWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASG

VPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGIYYCAQTLGLPRTFGGGTKLEIK

EJEMPLO 5

MAPEO DE EPÍTOPOS DE ANTICUERPOS ANTI-PD-L1 CANINO

La interacción de los anticuerpos con sus antígenos proteicos afines está mediada por la unión de aminoácidos específicos de los anticuerpos (parátopos) con aminoácidos específicos (epítopos) de los antígenos diana. Un epítopo es un determinante antigénico que provoca una reacción específica de una inmunoglobulina. Un epítopo consiste en un grupo de aminoácidos en la superficie del antígeno. Una proteína de interés puede contener varios

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen al ligando 1 de muerte programada canino (PD-L1 canino) con especificidad que comprende un conjunto de tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera: c Dr ligera 1 (CDRL1), CDR ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3); con tres C^dR de cadena pesada: CDR pesada 1 (C^dR^h1), CDR pesada 2 (CDRH2) y CDR pesada 3 (CDRH3) seleccionados del grupo que consiste en:

(a) en donde CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13;

(b) en donde CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14;

(c) en donde CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15;

(d) en donde CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16;

(e) en donde CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17;

(f) en donde CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18; y

(g) en donde CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 19;

(h) en donde CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 20:

(i) en donde CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 21;

(j) en donde CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 22;

(k) en donde CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 23;

(l) en donde CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24; y

en donde el anticuerpo se une al PD-L1 canino y bloquea la unión del PD-L1 canino a la muerte programada canina 1 (PD-1).

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo caninizado.

3. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2 que comprende

una región cristalizable de fragmento canino (región cFc) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 66 y el SEQ ID NO: 68; en donde se sustituyen de dos a cinco restos de aminoácidos en las posiciones indicadas seleccionadas del grupo que consiste en P4A, D31A, N63A, A93G y P95A del SEQ ID NO: 66 y el SEQ ID NO: 68.

4. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 3, en donde hay dos sustituciones de restos de aminoácidos D31A y N63A.

5. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2 que comprende una región cristalizable de un fragmento canino (región cFc) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 62 y el SEQ ID NO: 64.

6. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 5, que comprende una región de bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 45, el SEQ ID NO: 46, el SEQ ID NO: 47 y el SEQ ID NO: 48.

7. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26, en donde la región cFc de dicho anticuerpo caninizado comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 que comprende dos sustituciones de restos de aminoácidos D31A y N63A.

8. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 28, en donde la región cFc de dicho anticuerpo caninizado comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 68 que comprende dos sustituciones de restos de aminoácidos D31A y N63A.

9. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en el SEQ ID NO: 34 y el SEQ ID NO: 36.

10. El anticuerpo caninizado de las reivindicaciones 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 que comprende una cadena ligera canina que comprende el aminoácido del SEQ ID NO: 38.

11. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 30, en donde la región cFc de dicho anticuerpo caninizado comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 66 que comprende dos sustituciones de restos de aminoácidos D31A y N63A.

12. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 32, en donde la región cFc de dicho anticuerpo caninizado comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 68 que comprende dos sustituciones de restos de aminoácidos D31A y N63A.

13. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en el SEQ ID NO: 40 y el SEQ ID NO: 42.

14. El anticuerpo caninizado de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12 o 13 que comprende una cadena ligera canina que comprende el aminoácido del SEQ ID NO: 44.

15. El anticuerpo aislado de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14, en donde cuando se une al PD-L1 canino, dicho anticuerpo se une a al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82 o el SEQ ID NO: 83; en donde el anticuerpo y el fragmento de unión al antígeno del mismo se unen al PD-L1 canino y bloquean la unión del PD-L1 canino al PD-1 canino.

16. Un fragmento de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 5, 6 y 15, seleccionado entre el grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv y diacuerpos.

17. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera del anticuerpo de las reivindicaciones 10 o 14.

18. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada del anticuerpo de las reivindicaciones 7, 8, 9, 11, 12 o 13.

19. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1 o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 16 que codifica las secuencias de aminoácidos que consisten en las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 y 24.

20. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de las reivindicaciones 17, 18 o 19.

21. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, el vector de expresión de la reivindicación 20, o la combinación de los mismos, y un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.