ES2843724T3

ES2843724T3 - Antagonistas de NMDAR para el tratamiento de la angiogénesis tumoral

Info

Publication number: ES2843724T3
Application number: ES16805773T
Authority: ES
Inventors: Sylvia Cohen-Kaminsky; Sébastien Dumas; Gilles Bru-Mercier
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Saclay
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Saclay
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: US10583171B2; EP3383429B1; EP3383429A1; US20180318389A1; WO2017093354A1

Abstract

Un antagonista de NMDAR para uso en el tratamiento de la angiogénesis tumoral.

Description

DESCRIPCIÓN

Antagonistas de NMDAR para el tratamiento de la angiogénesis tumoral

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un antagonista de receptor de NMDA para uso en el tratamiento de angiogénesis tumoral.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis en un proceso biológico de generación de nuevos vasos sanguíneos en un tejido o un órgano. En condiciones fisiológicas normales, los seres humanos o animales experimentan angiogénesis solo en situaciones limitadas muy específicas. Por ejemplo, se observa normalmente angiogénesis en curación de heridas, desarrollo fetal y embrionario y formación del cuerpo lúteo, endometrio y placenta. Es ampliamente aceptado que el crecimiento de nuevos vasos está estrechamente controlado por muchos reguladores angiogénicos y el cambio del fenotipo de angiogénesis depende del balance neto entre regulación positiva de los estimulantes angiogénicos y regulación negativa de los supresores angiogénicos. Se ha encontrado que el control de la angiogénesis se altera en ciertos estados patológicos y, en muchos casos, el daño patológico asociado a la enfermedad está relacionado con la angiogénesis descontrolada.

Se cree que tanto la angiogénesis controlada como descontrolada proceden de manera similar. Las células endoteliales y pericitos rodeados por una membrana basal forman vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis empieza con la erosión de la membrana basal por enzimas liberadas por células endoteliales y leucocitos. Las células endoteliales, que revisten el lumen de los vasos sanguíneos, sobresalen entonces a través de la membrana basal. Los estimulantes angiogénicos inducen a las células endoteliales a migrar a través de la membrana basal erosionada. Las células migratorias forman un “brote” desde el vaso sanguíneo original, donde las células endoteliales experimentan mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales se fusionan entre sí formando bucles capilares, creando el nuevo vaso sanguíneo.

En estados patológicos en que se encuentra un desequilibrio del proceso angiogénico, aumentar o inhibir la angiogénesis podría evitar los correspondientes daños corporales.

En muchas otras situaciones, particularmente cuando se busca la prevención o tratamiento de cánceres, se desea una regulación negativa de la angiogénesis.

Son ya conocidas diversas sustancias que previenen la desregulación de la angiogénesis, la mayoría de ellas inhiben la angiogénesis.

Hasta ahora, se han identificado al menos 10 inhibidores angiogénicos endógenos en la materia. Una de tales moléculas es la angiostatina, que consiste en los dominios kringle I a IV de plasminógeno. También la apolipoproteína (a), una de las proteínas que tiene estructuras kringle, es un candidato para un inhibidor de angiogénesis novedoso.

Se han usado varias otras clases de compuestos para prevenir la angiogénesis. Por ejemplo, Taylor et al. han usado protamina para inhibir la angiogénesis, aunque su toxicidad limita su uso práctico como agente terapéutico (Taylor et al., 1982, Nature, Vol. 297: 307). Folkman et al. han divulgado el uso de heparina y esteroides para controlar la angiogénesis (Folkman et al., 1983, Science, Vol. 221: 719). Otros agentes que se han usado para inhibir la angiogénesis incluyen éteres de ácido ascórbico y compuestos relacionados (patente japonesa Kokai Tokkyo Koho n.° 58-131978). También un producto fúngico, la fumagilina, es un potente agente angiostático in vitro, así como su derivado sintético fumagilina O-sustituida.

La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos ha concedido la primera autorización de comercialización para un agente terapéutico antiangiogénico, que se denomina bevacizumab. El bevacizumab es un anticuerpo humanizado dirigido contra el factor angiogénico VEGF. El bevacizumab previene la unión de VEGF a su receptor efector y se ha usado inicialmente para tratar cáncer colorrectal.

Cuando se tiene en cuenta la amplia diversidad de afecciones o enfermedades que están causadas por una desregulación de la angiogénesis, o en que está implicada la desregulación de la angiogénesis, así como la gravedad de varias de estas enfermedades, se deduce que hay una gran necesidad en la materia de provisión de sustancias terapéuticamente activas novedosas que permitan sortear situaciones fisiológicas asociadas a la desregulación de la angiogénesis, típicamente una actividad de angiogénesis patológicamente fuerte, y especialmente en cáncer.

Existe también la necesidad en la materia de nuevos métodos que posibiliten el cribado de sustancias candidatas por su potencia de regulación de la angiogénesis.

El receptor de D-aspartato de N-metilo (NMDAR) es un canal activado por ligando y dependiente de voltaje perteneciente a la familia de receptores ionotrópicos de glutamato5. Forma un canal iónico heterotetramérico a través de la membrana celular y está compuesto por dos subunidades GluN1 (codificadas por el gen GRIN1), subunidades obligatorias para formar el NMDAR funcional, que contienen un sitio de unión a glicina o D-serina, principalmente asociadas a dos subunidades GluN2, cualquiera de las subunidades GluN2A, GluN2B, GluN2C o GluN2D, que comprenden el sitio de unión a glutamato y modulan las propiedades de canal5. Se activa tanto por glutamato como por glicina o D-serina, y en el contexto de la despolarización de membrana necesaria para liberar ion magnesio que actúa como bloqueante de canal al potencial de reposo. El NMDAR convencional tiene un papel importante en el sistema nervioso central (SNC) como actor clave de la comunicación neuronal sináptica excitatoria5. Es más, el NMDAR se distribuye en la membrana celular en sitios de contacto de célula-célula, tanto sitios sinápticos (definidos por un estrecho contacto entre procesos neuronales) como extrasinápticos (asociados a estrechos contactos principalmente entre neuronas y células de microglía o astrocitos)6. La desregulación de la comunicación glutamatérgica mediada por NMDAR se ha destacado en muchos trastornos del SNC, concretamente los trastornos neurodegenerativos enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington7, pero también depresión, ansiedad8, esquizofrenia, autismo9, apoplejía10 etc. caracterizados por la modificación transcripcional y/o postranscripcional de NMDAR1011. El NMDAR se ha encontrado también fuera del SNC: se expresa por osteoclastos, osteoblastos, células beta pancreáticas, testículos, queratinocitos, podocitos renales, células inmunitarias, músculo esquelético, cardiomiocito, etc. y también células endoteliales y de músculo liso cerebrales y aórticas12-25. Por otro lado, los transportadores de glutamato vesicular (Vglut), que permiten la acumulación de glutamato y la liberación rápida de modo dependiente de calcio, un evento necesario para una rápida comunicación glutamatérgica, se identifican también en tejidos periféricos tales como huesos, islotes de Langerhans, testículos, glándula pineal, intestinos y estómago26. Algunos estudios han sugerido un papel potencial del NMDAR en el desarrollo de trastornos periféricos crónicos tales como osteoporosis13 y diabetes sacarina de tipo 215, indicando que orientar a NMDAR periférico un antagonista específico podría ser beneficioso en estas afecciones. Algunas células cancerosas pueden secuestrar el NMDAR para proliferar de modo aberrante27. El uso de antagonistas específicos de NMDAR en modelos animales de cáncer ha mostrado mejoras drásticas de la supervivencia animal pausando el crecimiento tumoral2829. Adicionalmente, se ha demostrado que la activación por NMDAR de células endoteliales cerebrales o aórticas contribuye a la apertura de la barrera hematoencefálica, la infiltración de monocitos, la producción de especies de oxígeno reactivas, la apoptosis o proliferación18-24. En células de músculo liso aórtico, la activación de NMDAR desencadena la proliferación y síntesis de MMP-225.

Compendio de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del receptor de D-aspartato de N-metilo (NMDAR) para uso en el tratamiento de angiogénesis tumoral.

En una realización, dicho antagonista de NMDAR puede ser un compuesto de bajo peso molecular, p. ej. una molécula orgánica pequeña (natural o no).

En una realización, dicho antagonista es un antagonista competitivo o no competitivo o acompetitivo del receptor de NMDA.

Típicamente, el antagonista según la invención incluye:

i una molécula orgánica pequeña;

ii un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo anti-NMDAR que puede bloquear parcial o completamente la activación de NMDAR por glutamato (y glicina);

ii un polipéptido que puede inhibidor parcial o completamente el tráfico y anclaje en la membrana celular del NMDAR.

En otro aspecto, la invención proporciona un inhibidor de la expresión de NMDAR para uso en el tratamiento de angiogénesis tumoral.

Descripción detallada de la invención

Al usar modelos de múrido de hipertensión arterial pulmonar (HAP), los inventores aprovecharon las diferencias significativas en la expresión de NMDAR vascular para explorar el papel del receptor principal de las sinapsis excitatorias del SNC en la patofisiología de HAP, a través de mecanismos pulmonares vasculares-pulmonares intrínsecos.

Los inventores proporcionan pruebas de que la activación de NMDAR promueve la remodelación arterial pulmonar en HAP. Usando diferentes enfoques, incluyendo observaciones in situ de rasgos desregulados de comunicación glutamatérgica en pulmones de HAP explantados humanos, pruebas in vitro de liberación de glutamato de células vasculares y el papel de la activación de NMDAR en la proliferación y angiogénesis celular vascular y la inactivación génica orientada in vivo de NMDAR en células endoteliales o de músculo liso, demuestran el papel de la activación de NMDAR en los procesos de remodelación vascular subyacentes a la hipertensión pulmonar. Por consiguiente, los inventores muestran que bloquear el receptor de NMDA constituye un eje terapéutico alternativo en una enfermedad asociada a la proliferación celular vascular y angiogénesis errónea y descontrolada.5

Métodos y usos terapéuticos

• Antagonista de NMDAR

La presente invención proporciona composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) para uso en el tratamiento de angiogénesis tumoral.

Por tanto, es un objeto de la invención un antagonista del receptor de D-aspartato de N-metilo (NMDAR) para uso en el tratamiento de angiogénesis tumoral.

Se entiende por “antagonista” o “antagonista de receptor” un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico opuesto al de un agonista. Un antagonista se une al receptor y bloquea la acción de un agonista de receptor al competir con el agonista por el receptor. Un antagonista se define por su capacidad de bloquear las acciones de un agonista.

El término “compuesto”, como se usa a lo largo de la memoria descriptiva, incluye, pero sin limitación: molécula orgánica pequeña; anticuerpo o fragmento de anticuerpo que puede bloquear parcial o completamente la activación de NMDAR por glutamato (y glicina), un polipéptido o un inhibidor de la expresión de NMDAR.

Las expresiones “receptor de D-aspartato de N-metilo” y “receptores de NMDA” y “NMDAR” se usan intercambiablemente en la presente memoria y hacen referencia a la proteína NMDAR humana. Los receptores de NMDA consisten en dos subunidades GluN1 de unión a glicina codificadas por ocho variantes de corte y empalme de un solo gen y dos subunidades GluN2 (A-D) de unión a glutamato, que surgen de cuatro genes (Traynelis SF et al Pharm Rev. 2010; 62(3)). El NMDAR puede también tener una subunidad GluN3 (A-B) (Kehoe LA et al Neural Plast.

2013;2013: 145387). Los receptores de NMDA requieren únicamente tanto glutamato como glicina como coagonistas para la activación de receptor (Johnson JW, et al Nature. 1987). Después de la apertura del canal, se requiere despolarización de membrana para aliviar el bloqueo de Mg2+ dependiente de voltaje antes de que los iones puedan permear el poro de canal (Mayer ML, Nature. 1984).

La expresión “antagonista de receptor de NMDA” hace referencia a un compuesto que reduce o bloquea el flujo de cationes (Na+, K+, Ca2+) a través del receptor de NMDA. Los antagonistas de receptor de NMDA comprenden cuatro categorías de compuestos: antagonistas competitivos, que se unen y bloquean el sitio de unión del neurotransmisor glutamato; antagonistas de glicina, que se unen y bloquean el sitio de glicina; antagonistas no competitivos, que inhiben los receptores de NMDA al unirse a sitios alostéricos y antagonistas acompetitivos o bloqueantes de canal, que bloquean el canal iónico al unirse a un sitio en él.

- "Antagonistas no competitivos” hace referencia a compuestos que requieren la unión de glicina y glutamato y entonces dicho compuesto puede unirse a un sitio alostérico del canal y bloquear el flujo de cationes.

- "Antagonistas acompetitivos” hace referencia a compuestos que requieren la unión de un agonista del receptor de NMDA (p. ej., glicina, glutamato) y la apertura del canal para acceder a su sitio de bloqueo. El bloqueante de canal acompetitivo se atrapa entonces en el receptor de NMDA.

En otra realización, el antagonista de receptor de NMDA según la invención se une al receptor de NMDA y bloquea el efecto biológico de glutamato (y glicina) sobre NMDAR. Tal antagonista puede actuar ocupando el sitio de unión a ligando o una porción del mismo del receptor de NMDA, haciendo así al receptor inaccesible para su ligando natural de forma que se impide o reduce su actividad biológica normal. Para identificar a un antagonista capaz de bloquear el efecto biológico entre glutamato (y glicina) sobre NMDAR, puede usarse una prueba basada en el efecto del candidato a antagonista de NMDAR sobre la inhibición de la angiogénesis (ensayo Matrigel) como se explica en los ejemplos (Figura 1).

Como alternativa, tal antagonista puede actuar uniéndose directamente al dominio intracelular del receptor e inhibiendo el tráfico de NMDAR a la membrana celular. Por tanto, un antagonista de NMDAR puede por ejemplo bloquear o inhibir la activación y/o tráfico de NMDAR a la membrana celular y/o el anclaje a la membrana celular: p. ej., bloqueando o inhibiendo la interacción del dominio intracelular de NMDAR con el dominio PDZ de la proteína de armazón (como PSD95) y prevenir su anclaje a la membrana celular (Tymianski M. et al Science. 25 oct. 2002;298(5594): 846-50).

En una realización, el antagonista de NMDAR es un compuesto de bajo peso molecular, p. ej. una molécula orgánica pequeña (natural o no).

La expresión “molécula orgánica pequeña” hace referencia a una molécula de un tamaño comparable a aquellas moléculas orgánicas usadas generalmente en farmacia. La expresión excluye macromoléculas biológicas (p. ej., proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas preferidas oscilan en tamaño hasta aproximadamente 5.000 Da, más preferiblemente hasta 2.000 Da y lo más preferiblemente hasta aproximadamente 1.000 Da.

En una realización específica, el antagonista de receptor de NMDA según la invención es una molécula orgánica pequeña que se une a cualquier parte del NMDAR, incluyendo la parte de canal, y es capaz a través de efectos alostéricos de modular la actividad de NMDAR.

Los antagonistas de NMDAR de bajo peso molecular son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los antagonistas de NMDAR de bajo peso molecular que pueden usarse por la invención incluyen, por ejemplo, antagonistas de NMDAR competitivos; antagonistas de NMDAR de glicina; antagonistas de NMDAR no competitivos y antagonistas de NMDAR acompetitivos o bloqueantes de canal, así como todas las sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos antagonistas de NMDAR, tales como aquellos descritos en las siguientes publicaciones de patente: publicaciones de patente internacional y nacional n° WO9112797, WO9710240, WO2002072542, WO2006017409, WO2006113471; WO2006023957; WO2006020171, WO2007119098, WO2008137474, WO2009006437, WO2009061935; WO2009137843, WO2009092324, WO2009129181, WO20100033801, WO201013948, WO2010139483, WO201012213, WO2010060037, WO2010037533, WO2010033757, WO2012019106, US3254124, US6916816, US8129414, US7786140, US20080268071, EP2039354.

Los ejemplos no limitantes adicionales de antagonistas de NMDAR de bajo peso molecular incluyen cualquiera de los bloqueantes de canal (tales como memantina, lanicemina, remacemida, amantadina, tiletamina, rimantadina, fenciclidina (PCP); derivados funcionales de hidrocloruro de PCP, dizocilpina MK-801, argiotoxina 636, dextrorfano), puesto que estos bloqueantes de canal se han descrito también en Yamakura T, Neuroreport 1993;4(6): 687-90, Kashiwagi K, Mol Pharm 2002;61(3): 533-45, LePage KT Neuropharmacology 2005;49(1): 1-16, Jin L, J Pharmacol Exp Ther 2007;320(1): 47-55, Burnashev N,. Science 1992;257(5075): 1415-19.

Por lo tanto, un ejemplo específico de antagonista de NMDAR de bajo peso molecular que puede usarse según la presente invención puede ser la (3,5-dimetiladamantan-1-amina) (también conocida como memantina, Axura, Namenda, Ebixa y Mimetix) (publicación de patente n° US5061703, EP0392059) y que tiene la siguiente estructura:

Otro ejemplo específico de un antagonista de NMDAR de bajo peso molecular que puede usarse según la presente invención puede ser la [5R,10S]-[+]-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]ciclohepten-5,10-imina (también conocida como MK801, dizocilpina (INN)) (publicación de patente n° US4399141, GB2061947) y que tiene la siguiente estructura:

Otro ejemplo específico de antagonista de NMDAR de bajo peso molecular que puede usarse según la presente invención puede ser la adamantan-1-amina (también conocida como amantadina, Symmetrel) (publicación de patente n.° US3310469, WO1992000066)

Otro ejemplo específico de antagonista de NMDAR de bajo peso molecular que puede usarse según la presente invención puede ser la 1-(1-fenilciclohexil)piperidina (también conocida como fenciclidina, PCP, Sernyl)) (publicación de patente n.° UK836083 y US3097136) y que tiene la siguiente estructura:

Otro ejemplo específico de un antagonista de NMDAR de bajo peso molecular que puede usarse según la presente invención puede ser la (RS)-2-(2-clorofenil)-2-(metilamino)ciclohexanona (también conocida como ketamina e hidrocloruro de ketamina) (publicación de patente n.° US3254124) y que tiene la siguiente estructura:

Otro ejemplo específico de un antagonista de NMDAR de bajo peso molecular que puede usarse según la presente invención puede ser el 1-(1-(1-aminoetil)adamantano) (también conocido como rimantadina, Flumadine)) (publicación de patente n.° US4551552 y US 3352912) y que tiene la siguiente estructura:

Otro ejemplo específico de un antagonista de NMDAR de bajo peso molecular (antagonistas no competitivos) que puede usarse según la presente invención puede ser el 4-[2-(4-bencilpiperidin-1-il)-1-hidroxipropil]fenol (también conocido como ifenprodil, Vadilex; Dilvax; Creocral;)) (publicación de patente n.° US3509164 y EP0109317) y que tiene la siguiente estructura:

Otro ejemplo específico de un antagonista de NMDAR de bajo peso molecular (antagonistas competitivos) que puede usarse según la presente invención puede ser el ácido 2-amino-5-fosfonopentanoico (nomenclatura IUPAC) (también conocido como APV o AP5 o ácido 2-amino-5-fosfonovalérico), que inhibe el sitio de unión y que tiene la siguiente estructura

Los ejemplos no limitantes adicionales de antagonistas de receptor de NMDA de bajo peso molecular incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los antagonistas de receptor de NMDA descritos en Santagelo RM. et al. (Exp Opin. Ther Pat 22(11) 2012) o descritos en Strong KL et al ((Exp Opin. Ther Pat 24(12) 2014) o Mlodzic H et al (Exp Opin. Ther Pat 6(4), 1996) o Kolher M. et al (Exp Opin. Ther Pat 20(12), 2010) o Kulagowski JJ (Exp Opin. Ther Pat 6(10), 1996).

En una realización de la invención, el antagonista de bajo peso molecular es un antagonista no competitivo del receptor de NMDA. Los ejemplos de antagonistas no competitivos incluyen, pero sin limitación: ketamina, HU-211 o dexanabinol, rincofilina, aptiganel o Cerestat o CNS-5 1102, ifenprodil y/o análogos y/o derivados funcionales de los mismos.

En otra realización, el antagonista de bajo peso molecular es un bloqueante de canal acompetitivo del receptor de NMDA. Los ejemplos de antagonistas acompetitivos del receptor de NMDA incluyen, pero sin limitación: memantina, lanicemina, remacemida, amantadina, tiletamina; rimantadina, fenciclidina (PCP); derivados funcionales de hidrocloruro de PCP, dizocilpina MK-801, argiotoxina 636, dextrorfano y/o análogos y/o derivados funcionales de los mismos.

En otra realización, dicho compuesto es memantina o MK-801 y/o un análogo y/o un derivado funcional de los mismos.

En otra realización, el antagonista de bajo peso molecular es un bloqueante de canal competitivo del receptor de NMDA. Los ejemplos de antagonistas competitivos del receptor de Nm Da incluyen, pero sin limitación: AP5 (también conocido como APV), AP7, CPPeno y Selfotel también conocido como CGS 19755) y/o análogos y/o derivados funcionales de los mismos.

El término “análogo” hace referencia ampliamente a la modificación o sustitución de uno o más restos químicos en un compuesto original y puede incluir derivados funcionales, isómeros posicionales, tautómeros, zwiteriones, enantiómeros, diastereómeros, racematos, isoésteres o mezclas estereoquímicas de los mismos.

La expresión “derivado funcional” hace referencia a un compuesto que posee valores de CI50 y propiedades cinéticas similares a MK-801 y memantina en el receptor de NMDA. El derivado funcional de la invención posee la capacidad de suprimir y/o disminuir la angiogénesis. El derivado funcional de la invención también puede no orientarse al NMDAR central, al no cruzar la barrera hematoencefálica después de la administración del compuesto.

En una realización particular, el antagonista de la invención no cruza la barrera hematoencefálica. Los ejemplos de tales antagonistas incluyen, pero sin limitación, AP5, también conocido como APV (ácido (2R)-amino-5-fosfonovalérico; (2R)-amino-5-fosfonopentanoato) (Synaptic plasticity and learning: selective impairment of learning rats and blockade of long-term potentiation in vivo by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist AP5. Morris RG Journal of Neuroscience. 1989 Sep;9(9): 3040-57. PMID 2552039) y L-703.717 (Allosteric modulation of the glutamate site on the NMDA receptor by four novel glycine site antagonists. Grimwood S et al. Eur J Pharmacol. 15 Ago 1995;290(3): 221-6).

En otra realización, el antagonista de NMDAR consiste en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que puede bloquear parcial o completamente la activación del receptor de NMDA por glutamato o glicina, o modular su actividad al unirse al sitio de canal o cualquier sitio alostérico del receptor.

Los anticuerpos contra NMDAR son conocidos en la materia. Los ejemplos de antagonistas de NMDAR basados en anticuerpos incluyen aquellos descritos en el documento WO 2014187879 e incluyen el bien caracterizado anticuerpo NMDA Nr 1 pananticuerpo monoclonal de ratón, Novus biologicals, NB 300-118.

Pueden crearse antagonistas de anticuerpo adicionales según métodos conocidos mediante la administración del antígeno o epítopo apropiado a un animal hospedador seleccionado, p. ej., de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Pueden usarse diversos otros coadyuvantes conocidos en la materia para potenciar la producción de anticuerpos. Aunque los anticuerpos útiles en la práctica de la invención pueden ser policlonales, se prefieren los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales contra el receptor de NMDA pueden prepararse y aislarse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por estirpes celulares continuas en cultivo. Las técnicas para la producción y aislamiento incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975); la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Cote et al., 1983) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véanse, p. ej., la pat. de EE. UU. N.° 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos anti-NMDAR o anticuerpos monocatenarios anti-NMDAR. Los antagonistas de NMDAR útiles en la práctica de la presente invención incluyen también anticuerpos anti-NMDAR o fragmentos de anticuerpo anti-NMDAR incluyendo, pero sin limitación, fragmentos F(ab')², que pueden generarse por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo intacta, y fragmentos Fab, que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')². Como alternativa, pueden construirse colecciones de expresión de Fab y/o scFv para permitir la identificación rápida de fragmentos que tienen la especificidad deseada por el receptor de NMDA.

Los anticuerpos anti-NMDAR humanizados y fragmentos humanizados de los mismos pueden prepararse también según técnicas conocidas. Los “anticuerpos humanizados” son formas de anticuerpos quiméricos no humanos (p. ej. de roedores) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que se reemplazan residuos de una región hipervariable (CDR) del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá opcionalmente también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente de una inmunoglobulina humana. Se describen métodos para elaborar anticuerpos humanizados, por ejemplo, en Winter (pat. de EE. UU. N.° 5.225.539) y Boss (Celltech, pat. de EE. UU. N.24.816.397).

En otra realización, el antagonista de NMDAR consiste en un polipéptido.

Un polipéptido es una cadena de aminoácidos ligados por enlaces peptídicos que contiene entre 10 y 100 aminoácidos.

Como se explica anteriormente, el antagonista de la invención puede bloquear la interacción receptor de NMDAproteína, tal como PSD-95 (proteína postsináptica de densidad 95) que interacciona con un dominio intracelular de NMDAR e impide su anclaje en la membrana celular (Tymianski M. et al Science. 25 Oct 2002;298(5594): 846-50).

En una realización, el antagonista de NMDAR consiste en un polipéptido que puede inhibir parcial o completamente el tráfico o anclaje en la membrana celular del NMDAR.

Los ejemplos específicos de polipéptido que se orienta al dominio intracelular de NMDAR que pueden usarse según la presente invención incluyen aquellos descritos en los documentos US20110097324, US8071548, US8008253, US7846897, US20120083449, US20100160240, US7510824.

• Inhibidor de la expresión

Es otro objeto de la invención un inhibidor de la expresión de NMDAR para inhibir la angiogénesis.

Los inhibidores de la expresión de NMDAR para uso en la presente invención pueden estar basados en constructos oligonucleotídicos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo moléculas de ARN antisentido y moléculas de ADN antisentido, actúan bloqueando directamente la traducción de ARNm de NMDAR al unirse al mismo e impidiendo por tanto la traducción de proteína o aumentando la degradación de ARNm, disminuyendo por tanto el nivel de proteínas NMDAR, y por tanto la actividad, en una célula. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios de regiones únicas de la secuencia del transcrito de ARNm que codifica NMDAR pueden sintetizarse, p. ej. mediante técnicas de fosfodiéster convencionales, y administrarse, p. ej. por inyección o infusión intravenosa. Son bien conocidos en la materia métodos para usar técnicas antisentido para inhibir específicamente la expresión génica de genes cuya secuencia es conocida (p. ej., véanse las pat. de EE. UU. N.26.566.135, 6.566.131,6.365.354, 6.410.323, 6.107.091,6.046.321 y 5.981.732).

Los ejemplos específicos de ARNip orientados a NMDAR que pueden usarse según la presente invención incluyen aquellos descritos en la publicación de patente de EE. UU. N.° 8372817.

Los ARN inhibidores pequeños (ARNip) pueden funcionar también como inhibidores de la expresión de NMDAR para uso en la presente invención. La expresión génica de NMDAR puede reducirse poniendo en contacto el sitio patológico con un tumor de tipo angiogénesis desregulada, una célula con un ARN bicatenario pequeño (ARNbp) o un vector o constructo que cause la producción de ARN bicatenario pequeño, de tal forma que se inhiba específicamente la expresión de NMDAR (concretamente, interferencia de ARN o iARN). Los métodos para seleccionar un ARNbp o vector que codifica un ARNbp apropiado son bien conocidas en la materia para genes cuya secuencia es conocida (p. ej. véanse Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, t R. et al. (2002); pat. de EE. UU. N.° 6.573.099 y 6.506.559 y publicaciones de patente internacional n.2 WO 01/36646, WO 99/32619 y WO 01/68836).

Las ribozimas pueden funcionar también como inhibidores de la expresión de NMDAR para uso en la presente invención. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de ARN. El mecanismo de acción de la ribozima implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleolítica. Las moléculas de ribozima de motivo de horquilla o cabeza de martillo genomanipuladas que catalizan específica y eficazmente la escisión endonucleolítica de secuencias de ARNm de NMDAR son así útiles dentro del alcance de la presente invención. Los sitios de escisión de ribozima específicos en cualquier diana de ARN potencial se identifican inicialmente cribando en la molécula diana los sitios de escisión de ribozima, que incluyen típicamente las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, pueden evaluarse en las secuencias cortas de ARN de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión los rasgos estructurales predichos, tales como estructura secundaria, que pueden volver inadecuada la secuencia oligonucleotídica. La idoneidad de las dianas candidatas puede evaluarse también probando su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando, p. ej., ensayos de protección de ribonucleasa.

Tanto los oligonucleótidos antisentido como las ribozimas útiles como inhibidores de la expresión de NMDAR pueden prepararse mediante métodos conocidos. Estos incluyen técnicas para síntesis química tales como, p. ej., síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Como alternativa, pueden generarse moléculas de ARN antisentido mediante la transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Tales secuencias de ADN pueden incorporarse a una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Pueden introducirse diversas modificaciones a los oligonucleótidos de la invención como medio de aumentar la estabilidad y semivida intracelular. Las posibles modificaciones incluyen, pero sin limitación, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5’ y/o 3’ de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2’-O-metilo en lugar de los ligamientos fosfodiesterasa en el esqueleto oligonucleotídico.

Los ARNip oligonucleotídicos antisentido y ribozimas de la invención pueden suministrarse in vivo solos o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un “vector” es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del ARNip oligonucleotídico antisentido o ácido nucleico de ribozima a las células, y preferiblemente células que expresan NMDAR. Preferiblemente, el vector transporta el ácido nucleico a células con una degradación reducida respecto a la extensión de la degradación resultante en ausencia del vector. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes víricas o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ARNip oligonucleotídicos antisentido o ácido nucleico de ribozima. Los vectores víricos son un tipo preferido de vector e incluyen, pero sin limitación, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, tales como virus de leucemia de múrido Moloney, virus de sarcoma de múrido Harvey, virus de tumor mamario de múrido y virus de sarcoma de Roux; adenovirus, virus adenoasociados; virus de tipo SV40; poliomavirus; virus de Epstein-Barr; papilomavirus; herpesvirus; virus vaccinia; poliovirus y virus de ARN tales como retrovirus. Pueden emplearse fácilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la materia.

Los vectores víricos preferidos están basados en virus eucarióticos no citopáticos en que se han reemplazado genes no esenciales por el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus (p. ej., lentivirus), cuyo ciclo vital implica la transcripción inversa de ARN vírico genómico a ADN con posterior integración provírica en el ADN celular del hospedador. Los retrovirus se han aprobado para ensayos de terapia génica humana. Los más útiles son aquellos retrovirus que son deficientes de replicación (concretamente, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Tales vectores de expresión retrovíricos alterados genéticamente tienen utilidad general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos estándares para producir retrovirus deficientes de replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno a un plásmido, transfección de una estirpe celular de empaquetamiento con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la estirpe celular de empaquetamiento, recogida de partículas víricas de los medios de cultivo de tejido e infección de células diana con partículas víricas) en KRIEGLER (“A Laboratory Manual", W.H. Freeman C.O., New York, 1990) y en MURRY ("Methods in Molecular Biology", vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991).

Son virus preferidos para ciertas aplicaciones los adenovirus y virus adenoasociados, que son virus de ADN bicatenario que ya se han aprobado para uso humano en terapia génica. El virus adenoasociado puede genomanipularse para ser deficiente de replicación y es capaz de infectar un amplio intervalo de tipos celulares y especies. Tiene además ventajas tales como estabilidad al calor y disolventes lipídicos, altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluyendo células hematopoyéticas, y falta de inhibición de superinfección, permitiendo por tanto una serie múltiple de transducciones. Supuestamente, los virus adenoasociados pueden integrarse en ADN celular humano de manera específica de sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis insercional y la variabilidad de la expresión génica insertada característica de la infección retrovírica. Además, las infecciones por virus adenoasociados de tipo silvestre se han seguido en cultivo de tejido durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, lo que implica que la integración genómica de virus adenoasociados es un evento relativamente estable. El virus adenoasociado puede funcionar también de forma extracromosómica.

Otros vectores incluyen vectores de plásmido. Los vectores de plásmido se han descrito extensamente en la materia y son bien conocidos por los especialistas en la materia. Véase, p. ej., SAMBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, se han usado vectores de plásmido como vacunas de ADN para suministrar genes que codifican antígenos a células in vivo. Son particularmente ventajosos para esto porque no tienen los mismos problemas de seguridad que muchos de los vectores víricos. Estos plásmidos, sin embargo, al tener un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido a partir de un gen codificado operativamente en el plásmido. Algunos plásmidos usados comúnmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 y pBlueScript. Son bien conocidos por los especialistas en la materia otros plásmidos. Adicionalmente, los plásmidos pueden diseñarse a medida usando enzimas de restricción y reacciones de ligación para retirar y añadir fragmentos específicos de ADN. Los plásmidos pueden suministrarse mediante una variedad de vías parenterales, mucosas y tópicas. Por ejemplo, el plásmido de ADN puede inyectarse por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea u otras. Puede administrarse también por pulverizadores o gotas intranasales, supositorio rectal y por vía oral. Puede administrarse también a la epidermis o superficie mucosa usando una pistola génica. Los plásmidos pueden procurarse en solución acuosa, secados sobre partículas de oro o en asociación con otro sistema de suministro de ADN incluyendo, pero sin limitación, liposomas, dendrímeros, cocleato y microencapsulación.

• Método para inhibir la angiogénesis

En el contexto de la invención, el término “tratar” o “tratamiento”, como se usa en la presente memoria, significa revertir, aliviar, inhibir la progresión o prevenir el trastorno o afección al que se aplica tal término, o uno o más síntomas de tal trastorno o afección.

Según la invención, el término “paciente” o “paciente necesitado de ello” pretende indicar un humano o mamífero no humano afectado o que es probable que se afecte por una afección patológica o enfermedad que implica angiogénesis desregulada. Se entiende por una “cantidad terapéuticamente eficaz” del antagonista o inhibidor de la expresión como se describe anteriormente una cantidad suficiente del antagonista o inhibidor de la expresión para tratar la enfermedad asociada a la angiogénesis a una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención se decidirá por el médico a cargo dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específica para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno que se esté tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de administración; la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o coincidentes con el agente terapéutico específico empleado y factores similares bien conocidos en la medicina. Por ejemplo, está dentro de los conocimientos de la materia empezar las dosis del compuesto a niveles menores que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta conseguir el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto al día. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente para tratar. Un medicamento contiene típicamente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Se suministra normalmente una cantidad eficaz del fármaco a un nivel de dosificación de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal al día.

Métodos de cribado:

Los antagonistas de la invención pueden identificarse además mediante métodos de cribado descritos en el estado de la técnica. Los métodos de cribado pueden llevarse a cabo según métodos conocidos.

El método de cribado puede medir la unión de un compuesto candidato al receptor de NMDA, o a células o membranas portadoras del receptor NMDAR, o de una proteína de fusión del mismo mediante un marcaje asociado directa o indirectamente con el compuesto candidato. Como alternativa, un método de cribado puede implicar medir o detectar cualitativa o cuantitativamente la competición de unión de un compuesto candidato al receptor con un competidor marcado (p. ej., antagonista o agonista). Además, los métodos de cribado pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por un antagonista del receptor, usando sistemas de detección apropiados para células portadoras del receptor de NMDA. Los antagonistas pueden ensayarse en presencia de un agonista (p. ej., glutamato o NMDA) y coagonista (glicina, D-serina) conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista de la presencia del compuesto candidato. También es adecuada la unión competitiva usando un agonista conocido tal como glutamato (o glicina).

Enfermedad asociada con la angiogénesis

Es por tanto un objeto de la invención un antagonista del receptor de D-aspartato de N-metilo (NMDAR) para uso en el tratamiento de angiogénesis tumoral.

En el contexto de la presente invención, la expresión “enfermedad asociada con la angiogénesis” significa una enfermedad asociada con una angiogénesis no regulada persistente. Las afecciones o enfermedades afectadas son aquellas para las que la angiogénesis es patológica y debería reducirse o bloquearse.

Aparece angiogénesis no regulada persistente en una multitud de estados patológicos, incluyendo crecimiento tumoral y metástasis tumoral, y apoya el daño patológico visto en estas afecciones. Los diversos estados patológicos que son debidos a la angiogénesis no regulada se han agrupado conjuntamente como enfermedades o afecciones dependientes de la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis.

Es un ejemplo de enfermedad mediada por la angiogénesis la enfermedad neovascular ocular, que se caracteriza por la invasión de nuevos vasos sanguíneos en la estructura del ojo tal como retina o córnea. Es la causa más común de ceguera y está implicada en alrededor de 20 enfermedades oculares. En la degeneración macular relacionada con la edad, los problemas visuales asociados están causados por un crecimiento interno de capilares coroidales a través de defectos en la membrana de Bruch con proliferación de tejidos fibrovasculares detrás del epitelio pigmentario retiniano. El daño angiogénico está también asociado a retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular y fibroplasis retrolentales. Otras enfermedades asociadas a la neovascularización corneal incluyen, pero sin limitación, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, exceso de uso de lente de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, pterigión, queratitis seca, Sjogren, acné rosácea, filectenulosis, sífilis, infecciones micobacterianas, degeneración lipídica, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecciones por Herpes simplex, infecciones por Herpes zoster, infecciones protozoicas, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Stevens-Johnson, penfigoide, queratotomía radial y rechazo de injerto de córnea.

Las enfermedades asociadas a la neovascularización retiniana/coroidea incluyen, pero sin limitación, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, seudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la carótida, uveítis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus sistémico eritematoso, retinopatía del prematuro, enfermedad de Eale, enfermedad de Bechet, infecciones que causan retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Best, miopía, fosetas ópticas, enfermedad de Stargardt, uveítis intermedia, desprendimiento retiniano crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumatismo y complicaciones posláser. Otras enfermedades incluyen, pero sin limitación, enfermedades asociadas a la rubeosis, que causa neovascularización del ángulo, y enfermedades causadas por una proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso, incluyendo todas las formas de vitrorretinopatía proliferativa.

Otra enfermedad en que está implicada la angiogénesis es la artritis reumatoide. Los vasos sanguíneos en el revestimiento sinovial de las articulaciones experimentan angiogénesis. Además de formar nuevas redes vasculares, las células endoteliales liberan factores y especies de oxígeno reactivas que conducen al crecimiento de pannus y la destrucción de cartílago. Los factores implicados en la angiogénesis pueden contribuir activamente, y ayudar a mantener, el estado inflamado crónicamente de la artritis reumatoide.

La angiogénesis está también implicada en la osteoartritis. La activación de los condrocitos por factores relacionados con la angiogénesis contribuye a la destrucción de la articulación.

También, la desregulación de la angiogénesis es la causa del hemangioma, que es una de las enfermedades angiogénicas más frecuentes en la niñez.

La desregulación de la angiogénesis es también responsable del daño encontrado en enfermedades hereditarias tales como la enfermedad de Osler-Weber-Rendu o telangiectasia hemorrágica hereditaria. Esta es una enfermedad hereditaria caracterizada por múltiples angiomas pequeños, tumores de la sangre o vasos linfáticos.

La angiogénesis está también implicada en procesos fisiológicos normales tales como reproducción y curación de heridas. La angiogénesis es una etapa importante en la ovulación y también en la implantación de la blástula después de la fertilización. La prevención de la angiogénesis podría usarse para inducir amenorrea, bloquear la ovulación o prevenir la implantación de la blástula.

En la curación de heridas, una reparación excesiva o fibroplasias puede ser un efecto secundario perjudicial de procedimientos quirúrgicos, y pueden estar causadas o exacerbadas por la angiogénesis. Las adhesiones son una complicación frecuente de la cirugía y conducen a problemas tales como obstrucción del intestino delgado.

Con particular importancia, tanto los tumores primarios como metastáticos necesitan agrupar vasos angiogénicos para su crecimiento. Si esta actividad angiogénica pudiera reprimirse o eliminarse, entonces el tumor no crecería. Por tanto, la angiogénesis es destacada en la formación y metástasis de tumores sólidos.

Se han encontrado factores angiogénicos asociados a diversos tumores sólidos tales como rabdomiosarcomas, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, neuroblastoma, osteosarcoma, así como cáncer colorrectal. Los tumores en que es importante la angiogénesis incluyen tumores sólidos y tumores benignos, tales como neuroma acústico, neurofibroma, tracoma y granulomas piogénicos. Además, la angiogénesis se ha asociado a tumores portados en la sangre tales como leucemias y cualquiera de diversas enfermedades neoplásicas de la médula ósea agudas o crónicas con proliferación incontrolada de glóbulos blancos.

La angiogénesis es importante en dos pasos de la metástasis tumoral. El primer paso en que la angiogénesis es importante es en la vascularización del tumor que permite a las células tumorales entrar en la corriente sanguínea y circular por el cuerpo. Después de que las células tumorales hayan dejado el sitio primario y se hayan establecido en el sitio de metástasis secundario, debe aparecer angiogénesis antes de que el nuevo tumor pueda crecer y expandirse.

Como se ilustra aquí anteriormente, la desregulación de la angiogénesis es la causa de una amplia variedad de afecciones patológicas o estados patológicos.

Composiciones farmacéuticas:

El antagonista o inhibidor de la expresión de la invención puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas para uso en el tratamiento de angiogénesis tumoral como se ilustra aquí anteriormente.

“Farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” hace referencia a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra indeseada cuando se administran a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable hace referencia a una carga, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo sólido, semisólido o líquido no tóxico.

En las formulaciones farmacéuticas de la presente invención para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitaria adecuadas comprenden formas de vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de inyectarse. Estos pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas estériles (fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones que comprenden compuestos de la invención como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse también en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

El antagonista o inhibidor de la expresión de la invención puede formularse en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivar también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El portador puede ser también un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede ocasionarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ocasionarse mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los polipéptidos activos en la cantidad requerida al disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporan los diversos ingredientes activos esterilizados a un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución esterilizada por filtración anteriormente del mismo.

Tras la formulación, se administran las soluciones de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero pueden emplearse también cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, se tampona adecuadamente la solución si es necesario y se vuelve primero el diluyente isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los especialistas en la materia a la vista de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto. Aparecerá necesariamente cierta variación de la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.

El antagonista o inhibidor de la expresión de la invención puede formularse en una mezcla terapéutica para comprender de aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o de aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o así. Pueden administrarse también dosis múltiples.

Además de los compuestos de la invención formulados para administración parenteral, tales como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposómicas; cápsulas de liberación temporal y cualquier otra forma usada actualmente.

La invención se ilustrará adicionalmente a la vista de las siguientes figuras y ejemplos.

FIGURAS:

Figura 1: La activación de NMDAR de células endoteliales contribuye a la remodelación vascular en el desarrollo de hipertensión pulmonar.

(a) La tabla resume la cuantificación de GluN1 de membrana total, concretamente NMDAR, disponible para activación en células endoteliales y también específicamente en contacto de tipo sináptico (definido como un contacto estrecho <70 pm entre dos células endoteliales sin uniones). Se determinó el índice de concentración de GluNI en los contactos de tipo sináptico calculando la relación porcentual de GluN1 de membrana en estos contactos de tipo sináptico dividido entre el porcentaje de longitud de contacto sináptico.

(b) Análisis de RT-PCR cuantitativo de la expresión génica de GRIN1 de ARN total de células CD31 y células CD31-aisladas de los pulmones de ratones de tipo silvestre (n= 4) y ratones con inactivación génica (n= 4) de NMDAR en CE que muestra la eficacia de la inactivación génica de Grinl en CE. La expresión del gen Grinl se normaliza a la expresión del gen Actinb. Los valores se normalizan a los de ratones WT.

(c) Medida de presión sistólica ventricular derecha (PSVD) en ratones de tipo silvestre (n= 11-12) y con inactivación génica de NMDAR en CE (n= 17-18) después de 3 semanas de normoxia o hipoxia crónica (FÓ ²: 10 %).

(d) Relación de peso ventricular derecho a peso ventricular izquierdo más septo (índice de Fulton) medida en ratones de tipo silvestre (n= 12) o con inactivación génica de NMDAR en CE (n= 19-20) después de 3 semanas de normoxia o hipoxia crónica (FiÜ²: 10 %). El mismo experimento que en c).

(e) Análisis morfométrico de vasos pulmonares en ratones de tipo silvestre o con inactivación génica de NMDAR en CE después de 3 semanas de normoxia o hipoxia crónica (FiÜ²: 10 %). El mismo experimento que en c) y d). Los vasos pulmonares se dividen en 4 grupos dependiendo del diámetro externo de vaso (menos de 30 pm, de 30 pm a 50 pm, de 50 pm a 75 pm y de 75 pm a 125 pm). Se analizaron 100 vasos para cada grupo (20 vasos por grupo y por ratón). Se clasificó cada vaso como vaso no muscularizado (VWF+, a-actina de músculo liso-), vaso parcialmente muscularizado (VWF+, a-actina de músculo liso+/-) y vaso totalmente muscularizado (VWF+, aactina de músculo liso+).

(f) Medida de la proliferación de hPMVEC de control (incorporación de BrdU) después de exposición a VEGF-A (10 ng.ml-1) en ausencia o presencia de concentraciones incrementales de los antagonistas de NMDAR MK-801 o memantina (MMT) (ambos de 10 pM a 100 pM). Los valores se normalizan a los de cultivos no estimulados. Los datos son medias de 8 duplicados y las gráficas son representativas de tres experimentos independientes.

(g) Experimentos de angiogénesis in vitro que usan hPMVEC de control en el ensayo Matrigel™ con o sin el antagonista de NMDAR (+)-maleato MK-801 100 pM. A la izquierda, cuantificación automática de la longitud de tubo total y del número total de nodos usando el complemento "Analizador de angiogénesis" del software ImageJ en un total de 7-8 imágenes (1 imagen/duplicado, cubriendo cada imagen casi toda el área de pocillo). Los valores se expresan como porcentaje del control. A la derecha, se muestran imágenes de microscopía de luz transmitida representativas (imágenes superiores y medias) e imágenes esqueletizadas asociadas (imágenes inferiores) de los tres experimentos. Barra de escala 500 pm. Se obtuvieron resultados similares usando DAP-V 50 pM (Fig. 2f).

(h) Experimentos de angiogénesis in vitro en un ensayo de cocultivo que usa hPASMC y hPMVEC de control. Se sembraron hPMVEC sobre la capa confluente de hPASMC, con o sin concentraciones incrementales del antagonista de NMDAR (+)-maleato MK-801 en el intervalo de 10 a 100 pM, en 6 cultivos duplicados para cada concentración. Se usó marcaje con CD31 para visualizar la red de tubos después de 15 días de cocultivo.

Se determinó la significancia estadística mediante la prueba de Mann Whitney (b), ANOVA de dos factores regular seguido de la prueba de Bonferonni (c-e), ANOVA de un factor seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferonni (f, h) o la prueba de Student (g). *p < 0,05, ***p < 0,001 en comparación con WT/control (b-e, g, h) o §§§p < 0,001 en comparación con control, *p < 0,05, ***p < 0,001 en comparación con VEGF (f). Los valores son medianas ± intervalo intercuartil (b) o media ± EEM (c-h).

Figura 2: Figuras suplementarias sobre que la activación de NMDAR de células endoteliales contribuye a la remodelación vascular en el desarrollo de hipertensión pulmonar.

(a) Cuantificación de las partículas de inmuno-oro asociadas a GluN1 totales por 100 pm2 de células endoteliales en arterias de un paciente de control, y en una lesión de íntima y lesión de plexiforme de un paciente de HAP.

(b) Genotipado de ratones Tek-creXGrin1. Para el gen Cre, el primer gel de agarosa muestra una banda al peso molecular esperado: el carril 1 es la escala de ADN, el carril 2 es un ratón WT (ausencia de banda) y el carril 3 es un ratón recombinante (presencia de una banda a 390 pb). Para el gen Grinl floxado, el segundo gel de agarosa muestra bandas a los pesos moleculares esperados: el carril 4 es la escala de ADN, el carril 5 es un ratón hemocigótico (dos bandas a 180 pb y 280 pb), el carril 6 es un ratón homocigótico (banda de Grinl floxado solo, a 280 pb) y el carril 7 es un ratón WT (banda Grinl de WT solo, a 180 pb).

(c) Edad de ratones de tipo silvestre (n= 12) y con inactivación génica de NMDAR en CE (n= 19-20) después de 3 semanas de normoxia o hipoxia crónica, que se usaron en el experimento representado en las Fig. 1c-e.

(d) Peso corporal de ratones de tipo silvestre (n= 12) y con inactivación génica de NMDAR en C E(n= 19-20) después de 3 semanas de normoxia o hipoxia crónica, que se usaron en el experimento representado en las Fig. 1c-e.

(e) Medida de la proliferación de hPMVEC de control (incorporación de BrdU) después de exposición a suero fetal bovino (FBS al 10 %) en ausencia o presencia de los antagonistas de NMDAR MK-801 o memantina (MMT) (tanto a 10 pM como 100 pM). Los valores se normalizan a los de cultivos no estimulados. Los datos son medias de 6 duplicados y la gráfica es representativa de tres experimentos independientes.

(f) Experimentos de angiogénesis in vitroque usan hPMVEC de control en el ensayo MatrigelTM con o sin el agonista de NMDAR DAP-V 50 pM. Cuantificación automática de la longitud de tubo total y del número total de nodos usando el complemento "Analizador de angiogénesis” del software ImageJ en un total de 7-8 imágenes (1 imagen/duplicado, cubriendo cada imagen casi toda el área del pocillo). Los valores se expresan como porcentaje del control. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.

(g) Experimentos de angiogénesis in vitro en un ensayo de cocultivo que usa hPASMC y hPMVEC de control con o sin concentraciones incrementales del antagonista de NMDAR (+)-maleato MK-801 en el intervalo de 10 a 100 pM, en 6 cultivos duplicados para cada concentración. Diferente método de cuantificación del mismo experimento que en la Fig. 1h. Cuantificación automática de la longitud de tubo total representada por el área de tinción de CD31 efectuada usando el software AngioQuant. Los valores se expresan como porcentaje del control.

Se determinó la significancia estadística mediante la prueba de Kruskal Wallis seguida de pruebas de comparación múltiple de Dunn (a), ANOVA de dos factores regular seguido de prueba de Bonferonni (c, d), ANOVA de un factor seguido de prueba de comparación múltiple de Bonferonni (e, g) o prueba de Student (f). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 en comparación con WT/control (a, c, d, f, g) o §§p < 0,01, §§§p < 0,001 en comparación con control, *p < 0,05, ***p < 0,001 en comparación con FBS al 10 % (e). Los valores son medianas ± intervalo intercuartil (a) o media ± EEM (c-d, f-h).

EJEMPLO:

Material y métodos

Cultivo celular

Los experimentos que requerían células se efectuaron en células de músculo liso arterial pulmonar humano (hPASMC, LONZA, Basilea, Suiza), células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (hPMVEC, LONZA, Basilea, Suiza) de entre P4 y P7, ambas de donantes sanos no fumadores y no alcohólicos, y en el cultivo primario de neuronas de hipocampo de fetos de rata.

Para el cultivo de hPASMC, se sembraron 250.000 células en matraces T75 (BD Falcon, CORNING, Tewksbury, MA, EE. UU.) y se hicieron crecer en medio completo SmGm2 que contenía medio basal SmBm y también factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento epidérmico, insulina y gentamicina/anfotericina IX (todos de LONZA, Basilea, Suiza).

Para el cultivo de hPMVEC, se sembraron 375.000 células en matraces T75 (BD Falcon, CORNING, Tewksbury, MA, EE.UU.) y se hicieron crecer en medio completo EGM2-MV que contenía medio basal EBM2 y factor de crecimiento de fibroblastos básico b, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento endotelial vascular, hidrocortisona, ácido ascórbico, factor de crecimiento de tipo insulina y gentamicina/anfotericina IX (todos de LONZA, Basilea, Suiza).

Se cultivaron todas las células a 37 °C en atmósfera humidificada de 5 % de CO²y 95 % de aire.

Ensayos de angiogénesis

Se efectuaron ensayos Matrigel en p-slide Angiogenesis (IBIDI, Martinsried, Alemania). Se pusieron 10 pl de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD, Franklin lakes, NJ, EE. UU.) en cada pocillo y se incubaron los portaobjetos durante 30 min a 37 °C. Se añadieron entonces 50 pl de medio EGM2-MV con o sin los antagonistas de NMDAR ((+)-maleato MK-801 100 pM o DAP-V 50 pM, ambos de ABCAM BIOCHEMICALS, Cambridge, RU) a geles Matrigel durante 1 hora. Se sembraron 3500 hPMVEC en cada pocillo en presencia o ausencia de antagonistas de NMDAR. Después de 4 horas, se capturaron imágenes de campo brillante de estructuras de tipo capilar usando un microscopio Eclipse 80i acoplado con el software Nis Elements BR2.30. Se analizaron automáticamente entonces las imágenes con el complemento “Analizador de angiogénesis” del software ImageJ, dando como resultado la determinación de la longitud de tubo total y del número de nodos total.

Para el modelo de angiogénesis de cocultivo de hPASMC/hPMVEC, se sembraron 20000 PASMC en cubreobjetos de vidrio en una placa de 12 pocillos (CORNING, Tewksbury, MA, EE.UU.) y se cultivaron hasta confluencia en medio completo SmGm2. Después de alcanzar una alta confluencia, se sembraron 80000 PMVEC sobre la capa de PASMC cambiando el medio de medio completo SmGm2 a un medio completo EGM2-MV modificado que contenía 2 % de FBS con o sin el antagonista de NMDAR MK-801 a 0 |uM, 10 |uM, 30 |uM o 100 |uM de MK-80l (6 duplicados por condición). Se cambió el medio cada 2 a 3 días y, después de 15 días de cocultivo, se fijaron las células y se tiñeron con CD31. Después de la tinción, se capturaron 5x5 imágenes de cada cubreobjetos usando el modo de adquisición en mosaico con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 acoplado con el software Axiovision 4.8 (ambos de CARL ZEISS, Oberkochen, Alemania). Se analizaron las imágenes usando el software ImageJ para calcular la relación de área de tinción de CD31 a área celular total. Esta relación se nombró adicionalmente longitud de tubo total. Se consiguió también la cuantificación automática usando el software AngioQuant70 para determinar la longitud de tubo total.

Modelos animales

Se usaron todos los animales en estricto acuerdo con los reglamentos de la Unión Europea (Directiva 2010/63/UE) para experimentos animales y cumplían las directrices de la institución para el cuidado y manejo animal. Todos los animales se mantuvieron en una sala de temperatura y humedad controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h con acceso a pienso de rata estándar y agua a voluntad. Los siguientes procedimientos efectuados en las ratas o ratones se aprobaron por el comité ético CEEA26 (Comité ético de experimentación animal n° 26) y el Ministerio de Enseñanza Superior e Investigación francés.

Las cepas de ratones transgénicos usadas son B6.129S4-Grin1tm2Stl/J (nombrada adicionalmente ratones GRIN1fllfl), (de JACKSON LABORATORY, Bar Harbor, ME, EE. UU.) y B6.Cg-Tg(Tek-crelERT2)1ArndlArndCnrm (nombrada adicionalmente ratones Tek-cre) (EUROPEAN m Ou SE MUt An T ARCHIVE, CNR Monterotondo, Monterotondo, RM, Italia). Brevemente, se cruzaron ratones GRIN1,l,flcon ratones Tek-cre. Para inactivación génica de NMDAR en células endoteliales, se efectuaron los experimentos en ratones Tek-cre x GRIN1,l,fl macho y se usaron ratones Tek-cre macho como controles después de 5 semanas de administración de pienso que contiene tamoxifeno (HARLAN LABORATORIES, Indianápolis, IN, EE.UU.) seguido de 1 semana de pienso estándar. Se indujo la hipertensión pulmonar exponiendo los ratones a 3 semanas de hipoxia (10 % de FiO²). Se sometieron entonces los ratones a anestesia inducida por inhalación de isoflurano al 3 % mezclado con aire y se mantuvieron disminuyendo la concentración de isoflurano a entre 1 y 1,5 %. Se efectuaron la cateterización del corazón derecho y el procesamiento de órganos usando métodos estándares. Se extrajo el corazón de la caja torácica 30, se retiraron las aurículas y se separaron los ventrículos derechos de los ventrículos izquierdos asociados a los septos. Se midió el peso de cada parte y se calculó la relación de peso de ventrículo derecho a peso de ventrículo izquierdo con septo para cada ratón. Se procesaron los pulmones inflándolos con 10 ml de una mezcla de solución salina y OCT a relación 1/1 (Shandon™Cryomatrix™, THERMOFISCHER SCIENTIFIC). Se congelaron entonces los ventrículos y pulmones inflados en isopentano enfriado (VWR) y se almacenaron a -80 °C.

Para análisis morfométrico de arterias pulmonares, se cortaron secciones de 6 |um de grosor de pulmones de ratón con un criomicrotomo (LEICA MICROSYSTEMS). Se dejaron secar las secciones durante 1 hora en una campana. Se fijaron entonces en acetona fría durante 10 minutos. Se incubaron suero de cabra al 10 % más suero de ratón al 5 % durante 1 hora para prevenir la unión inespecífica de anticuerpos. Se incubaron anticuerpos anti-VWF y 10 anti-célula de músculo liso alfa-FITC en presencia de suero de ratón al 2 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Se efectuó un control negativo omitiendo los anticuerpos primarios. Se incubó el anticuerpo secundario durante 30 minutos en presencia de suero de ratón al 2 %. Se incubó DAPI (LIFE TECHNOLOGIES) diluido a 1/500 durante 1 minuto. Se montaron finalmente los portaobjetos de vidrio usando medio de montaje fluorescente Dako 15 (DAKO). Se analizaron entonces las secciones usando un microscopio Eclipse 80i acoplado con software Nis Elements BR2.30 (NIKON). Para el análisis estadístico efectuado en pulmones de ratón, se dividieron las arteriolas intrapulmonares en cuatro grupos basados en su diámetro externo: menos de 30 |um, de 30 |um a 50 |um, de 50 |um a 75 |um y de 75 |um a 125 |um. Se calificaron 20 arteriolas por 20 categoría identificadas con la tinción de VWF como no muscularizadas, parcialmente muscularizadas o totalmente muscularizadas basándose en la tinción de alfa-actina de músculo liso. Se incluyeron 5 ratoneslgrupo en el estudio.

Resultados

La activación de NMDAR en células de músculo liso contribuye a la remodelación vascular que aparece durante el desarrollo de HP.

La activación de NMDAR se ha asociado anteriormente a la proliferación de células de músculo liso aórtico dependiente de la activación de la ruta de señalización de MAPK y PI3K25. Además, la activación de NMDAR se ha destacado como un componente importante de la proliferación aberrante de células cancerosas y los PASMC de HAP exhiben un fenotipo de tipo canceroso. Para determinar el papel potencial de NMDAR de PASMC en la remodelación vascular progresiva y la posterior HAP, se han desarrollado ratones con inactivación génica (KO) de NMDAR, con deleción orientada del gen Grin1 en SMC usando un enfoque CrelLox. La expresión del gen Grin1 se redujo claramente en arterias pulmonares de ratones KO en comparación con ratones de tipo silvestre (WT), indicando una recombinación genética eficaz. Se expusieron ratones macho KO y WT de edad coincidente a 3 semanas de normoxia o hipoxia (FiO²al 10 %) para inducir HP experimental. Los ratones KO y WT normóxicos no mostraban diferencias en la presión sistólica ventricular derecha (PSVD) ni hipertrofia cardiaca derecha (índice de Fulton) en contraposición con los ratones KO hipóxicos que presentaban PSVD e índice de Fulton significativamente menores que los ratones WT hipóxicos. Esto estaba asociado a una muscularización disminuida de las arteriolas pulmonares pequeñas (<50 pm de diámetro externo) en ratones KO hipóxicos en comparación con ratones WT. De forma interesante, se observó también una muscularización disminuida de las arterias grandes (de 75 pm a 125 pm de diámetro externo) en ratones KO en comparación con ratones WT independientemente de la exposición a hipoxia, sugiriendo un papel para el NMDAR en la cobertura de células de músculo liso de las arterias pulmonares. No se observó una diferencia significativa de peso corporal entre ratones KO y WT tanto en normoxia como hipoxia. Como la proliferación de hPASMCs es un determinante crucial de la remodelación vascular asociada a una resistencia y presión vascular pulmonar aumentada, se analizó el papel de la activación de NMDAR en la proliferación de hPASMC. Usando dos antagonistas de NMDAR acompetitivos no estructuralmente relacionados, MK-801 y memantina (MMT), se muestra la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación inducida por PDGF-BB, un factor de crecimiento de PASMC, sobreexpresado en HAP, sobreactivando por tanto el PDGFR y participando en la remodelación vascular37. De forma interesante, funciona un solapamiento de las rutas de NMDAR y PDGFR en neuronas del SNC, con la estimulación de PDGF modulando la actividad de NMDAR y orientando la respuesta de NMDAR a la activación de las rutas de señalización de MAPK y CREB relacionadas con la proliferación3839. De forma importante, los antagonistas de NMDAR MK-801 y MMT atenuaban la proliferación de hPASMC inducida por PDGF-b B sin añadir agonistas de NMDAR al medio. Al contrario que la estimulación de ET-1, el PDGF-BB no aumentaba adicionalmente la liberación basal de glutamato de hPASMC de control, sugiriendo un papel en la movilización de NMDAR. Por tanto, se exploró el potencial de PDGF-BB para fosforilar GluN1 en hPASMC en Ser896, un sitio fosforilado en arterias pulmonares de pacientes de HAP. El análisis cinético mostraba una fosforilación de GluN1 aumentada después de 10 min de exposición a PDGF-BB y seguido de una ligera disminución después de 30 min a 1 h. Estos resultados indican que el PDGF-BB podría activar el tráfico de NMDAR, fosforilando la subunidad GluN1 obligatoria en minutos, y contribuyendo entonces a los efectos proliferativos. Por tanto, PDGF-BB y/o ET-1 podrían ser responsables de la fosforilación aumentada de GluN1 observada in situ en arterias pulmonares de pacientes de HAP, especialmente en PASMC, un tipo celular conocido por expresar abundantemente PDGFR. Se concluye que el NMDAR expresado por PASMC contribuye a la remodelación vascular, dando como resultado una PSVD aumentada y posteriormente hipertrofia cardiaca derecha en el modelo de ratón hipóxico. Además, el PDGF-BB podría movilizar NMDAR para participar en el efecto proliferativo resultante.

La activación de NMDAR endotelial contribuye a la remodelación vascular que aparece durante el desarrollo de HP.

Se ha sugerido que la activación de NMDAR en células endoteliales del SNC puede perturbar la barrera endotelial mediante la producción de especies de oxígeno reactivas, favorecer la transmigración de monocitos e inducir la proliferación18-2022. Como la remodelación vascular asociada a HAP implica degradación de las uniones endoteliales, estrés oxidativo, proliferación e inflamación adventicia40, se evaluó la participación de NMDAR endoteliales en el desarrollo de HAP. La microscopía óptica y electrónica correlativa permitió investigar el número y localización de los NMDAR (precisamente proteína GluN1) en células endoteliales arteriales pulmonares de un paciente de HP en comparación con el control. Se centró en una lesión de íntima y plexiforme, ya que dependen principalmente de la disfunción de la capa endotelial. Se definió el contacto de tipo sináptico como un estrecho contacto de <70 pm entre dos células endoteliales sin uniones. Se muestra que el número total de partículas de inmuno-oro por 100 pm2 de células endoteliales (Fig. 2a), el reparto/distribución entre GluN1 de membrana y citoplasmático, así como la proporción de longitud de contacto de tipo sináptico respecto a la longitud de membrana total (Fig. 1a) no cambiaban entre la arteria de HAP en comparación con la arteria de control. De forma importante, la GluN1 de membrana localizado en estas áreas de contacto aumenta en la lesión de plexiforme en comparación con la lesión de íntima y la arteria de control (29,5 % de GluN1 de membrana total en lesión de plexiforme frente a 7,7 % en lesión de íntima y 4,1 % en arteria de control). En la lesión de íntima, las proteínas GluN1 de membrana se enriquecen 3,5 veces dentro/a lo largo de los contactos de tipo sináptico en comparación con la arteria de control. En la lesión de plexiforme, este índice alcanza incluso 7,1 (Fig. 1a). Estas proteínas GluN1 de membrana representan el NMDAR disponible para activación que parece acumulado y/o concentrado dentro/a lo largo del contacto de tipo sináptico entre células endoteliales, sugiriendo señalización glutamatérgica aumentada entre células endoteliales en lesiones de HAP. Para explorar la implicación potencial del NMDAR endotelial en la remodelación vascular asociada a HP, se desarrollaron ratones KO del gen Grinl orientado a células endoteliales usando la estrategia de Cre/Lox inducible por tamoxifeno. Después de la administración de tamoxifeno, se redujo notablemente la expresión del gen Grinl en células CD31 aisladas del pulmón de ratones KO en comparación con ratones WT, sugiriendo una recombinación eficaz del gen Grinl (Fig. 1b). Se expusieron estos ratones a normoxia o hipoxia durante 3 semanas antes de medir la PSVD y calcular el índice de Fulton. No se observó diferencia en el peso corporal, aunque los ratones KO normóxicos eran ligeramente mayores que los ratones WT. En ratones normóxicos, no se resaltó diferencia en PSVD o índice de Fulton entre ratones WT y KO. Después de la hipoxia, los ratones KO presentaban una hipertrofia cardiaca derecha disminuida y una PSVD disminuida (Fig. 1c, d). El análisis morfométrico de las arterias pulmonares revelaba una disminución significativa de la muscularización solo en arteriolas pequeñas (<50 pm de diámetro externo) entre ratones WT y KO después de hipoxia crónica (Fig. 1e). No se observaba diferencia para arterias mayores entre ratones WT y KO tanto en normoxia como hipoxia. Como la proliferación excesiva de células endoteliales y la angiogénesis desregulada son parte de los procesos de remodelación vascular demostrados en lesiones de plexiforme de HAP41, y porque se ha mostrado que la señalización de VEGF y NMDAR coopera en neuronas del SNC42, se ha investigado si la activación de NMDAR podría participar en la proliferación y angiogénesis de células endoteliales. Los antagonistas de NMDAR MK-801 y m Mt inhiben dependientemente de la dosis la proliferación de hPMVEC estimulada por FBS al 10 % o VEGF-A 10 ng.ml-1 sin adición de agonistas de NMDAR exógenos (Fig. 1f, Fig. 2e). Como el VEGF es uno de los mediadores principales de la angiogénesis, se ha explorado la hipótesis de si la activación de NMDAR está implicada en la angiogénesis. En el ensayo Matrigel, MK-801 y el antagonista competitivo de NMDAR DAP-5 disminuyen la formación de longitud de tubo total y el número de nodos (Fig. 1g, Fig. 2f). En un segundo ensayo de angiogénesis in vitro basado en el cocultivo de hPMVEC y hPASMC, MK-801 inhibe dependientemente de la dosis la formación de red de tubos endoteliales (Fig. 1h, Fig. 2g). Se concluye que el NMDAR está desregulado en células endoteliales en lesiones de íntima y plexiforme de HAP y contribuye a la remodelación vascular. Además, participa en la proliferación y angiogénesis por VEGF.

Discusión

Usando microscopía electrónica en tejidos pulmonares humanos de pacientes de HAP y de control, se ha observado una concentración local de NMDAR en contacto de tipo sináptico entre células endoteliales, especialmente en la lesión de plexiforme, una lesión típica de HAP caracterizada por una angiogénesis desorganizada y excesiva en que se ha destacado anteriormente la señalización aumentada de VEGF41. En células granulares cerebelares, el VEGFR-2 interacciona físicamente con NMDAR modulando su actividad42. Aquí se ha mostrado que los antagonistas de NMDAR son capaces de inhibir dependientemente de la dosis la proliferación y angiogénesis inducidas por VEGF. De forma intrigante, la expresión de las proteínas sinápticas asociadas a NMDAR neurologina y neurexina, que desencadenan la formación de sinapsis en el SNC, se ha descrito ya en células vasculares que desempeñan un papel en la angiogénesis56 y variantes comunes de cerebelina 2, un copartícipe de neurexina y expresado por células endoteliales pulmonares, aumentan el riesgo de HAP en aproximadamente dos veces57.

REFERENCIAS:

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un antagonista de NMDAR para uso en el tratamiento de la angiogénesis tumoral.

2. El antagonista de NMDAR para uso según la reivindicación 1, que se selecciona del grupo consistente en:

i. una molécula orgánica pequeña;

ii. un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-NMDAR;

iii. un polipéptido.

3. Un inhibidor de la expresión de NMDAR para uso en el tratamiento de la angiogénesis tumoral.

4. El inhibidor de la expresión de NMDAR para uso según la reivindicación 3, en el que dicho inhibidor de NMDAR es un ARNip, una ribozima o un oligonucleótido antisentido.

5. Una composición farmacéutica que comprende un antagonista de NMDAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o un inhibidor de la expresión de NMDAR según una cualquiera de las reivindicaciones 3-4, para uso en el tratamiento de la angiogénesis tumoral, en combinación con al menos un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.