ES2733948T3 - Doble carbonilo reductasa mutante y aplicación de la misma - Google Patents
Doble carbonilo reductasa mutante y aplicación de la misma Download PDFInfo
- Publication number
- ES2733948T3 ES2733948T3 ES14891354T ES14891354T ES2733948T3 ES 2733948 T3 ES2733948 T3 ES 2733948T3 ES 14891354 T ES14891354 T ES 14891354T ES 14891354 T ES14891354 T ES 14891354T ES 2733948 T3 ES2733948 T3 ES 2733948T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dkr
- mutant
- seq
- nucleotide sequence
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 title description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 24
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 12
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- -1 diketone compound Chemical class 0.000 claims description 11
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 7
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 13
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 9
- 102200131194 rs3219154 Human genes 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 125000005594 diketone group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- IPCSIKXLXDFUAC-UHFFFAOYSA-N 2,2-dihydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCCC(O)(O)C(O)=O IPCSIKXLXDFUAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055682 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006591 Apoenzymes Proteins 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000647111 Rhodococcus erythropolis PR4 Species 0.000 description 1
- 241000327096 Rhodococcus erythropolis SK121 Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical group CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003506 protein modification method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960000672 rosuvastatin Drugs 0.000 description 1
- BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N rosuvastatin Chemical compound CC(C)C1=NC(N(C)S(C)(=O)=O)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Una dicetorreductasa (DKR) mutante, que comprende una de las secuencias de aminoácidos, que se muestran como en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6.
Description
DESCRIPCIÓN
Doble carbonilo reductasa mutante y aplicación de la misma
Campo técnico de la invención
La invención se refiere a una dicetorreductasa (DKR) mutante y a una aplicación de la misma, y, en particular, a una DKR mutante, obtenida por mutagénesis de saturación dirigida al sitio, y cuyas propiedades, tal como la actividad catalítica, están mejoradas, y una aplicación de la DKR mutante para la preparación de un compuesto 3R,5S hidroxilo.
Antecedentes de la invención
La carbonilo reductasa es un tipo de oxidorreductasa, y tiene un importante papel en muchos procesos de biotransformación de organismos biológicos. Basándose en su capacidad en la generación de manera catalítica de alcoholes quirales con alta enantioselectividad, la carbonilo reductasa se aplica habitualmente como un biocatalizador muy importante para la síntesis de intermediarios quirales en la industria química y farmacéutica. La DKR puede reducir estereoselectivamente dos carbonilos de un éster de dicetoácido simultáneamente para dar lugar al correspondiente hidroxilo, y se puede utilizar para sintetizar intermediarios farmacológicos clave, sintetizar particularmente un ácido dihidroxi hexanoico quiral de un fármaco estatina tal como los fármacos para bajar el colesterol que se venden por todo el mundo atorvastatina y rosuvastatina.
Las DKR conocidas en la actualidad se pueden utilizar como un biocatalizador para reducir un sustrato dicetona en una etapa para preparar un intermediario quiral 3R, 5S-dihidroxi-6-benzoil-tert-butil hexanoato de un fármaco estatina para la disminución de lípidos con aproximadamente una única pureza óptica, simplificando de esta manera las etapas de síntesis y reduciendo la producción de polución. Sin embargo, la aplicación en producción industrial sigue teniendo algunos problemas por resolver. Por ejemplo, la actividad catalítica enzimática baja equivale a una gran cantidad de enzima líquida y a un aumento del volumen total del sistema de reacción, lo que aumenta los lotes de producción y los costes de producción. Estos problemas se pueden resolver por evolución dirigida para mejorar la actividad catalítica de la DKR. Como biocatalizador, una enzima puede desarrollar completamente sus características de alta eficacia y alta especificidad en un sistema biológico. Sin embargo, existen los problemas comunes de inadaptabilidad a una condición de producción industrial, la baja capacidad catalítica de un sustrato no natural y similares durante las aplicaciones industriales. Es necesario modificar las moléculas enzimáticas para que cumplan diferentes requisitos de la aplicación mediante métodos de modificación proteica. Los métodos de modificación proteica se pueden resumir en tres: diseño racional, diseño irracional y diseño semi-racional.
El diseño racional se refiere al cambio de aminoácidos individuales en las moléculas proteicas mediante mutagénesis dirigida al sitio u otros métodos basados en el conocimiento de la estructura espacial de las proteínas, generando de esta manera proteínas con nuevas características. Este método es teóricamente alto en relevancia, y se utiliza principalmente para la modificación de la actividad catalítica de apoenzimas naturales, especificidad de sustrato y estabilidad, cambio de tipo de inhibidor, especificidad de la coenzima y similares.
La tecnología de mutagénesis de saturación dirigida al sitio es una tecnología importante en la modificación proteica, que pertenece al diseño semi-racional, que combina ventajas del diseño racional y el diseño irracional, superando los defectos respectivos y modificando un código genético de una proteína diana (tal como un gen de la cepa PR4 de Rhodococcus erythropolis que codifica una supuesta 3-hidroxbutiril-CoA deshidrogenasa como se publica en M. Sekine et al.: "Sequence analysis of three plasmids harboured in Rhodococcus erythropolis strain PR4", Environmental Mircobiology 2006, 8(2), páginas 334-346) para conseguir un mutante cuyo aminoácido en un sitio diana se sustituye por otros 19 aminoácidos respectivamente en poco tiempo. Esta tecnología no solo es una herramienta potente para la modificación dirigida de proteínas, sino también es un medio importante para la investigación de la relación estructura-función de las proteínas. Las investigaciones demuestran que la mutagénesis multisitio siempre puede obtener una evolución más ideal que la que se obtiene por mutagénesis de un único sitio. La mutagénesis multisitio es improbable que se implemente directamente por mutagénesis dirigida al sitio. Sin embargo, la mutagénesis de saturación dirigida al sitio puede aumentar la diversidad de mutantes y es simple de manipular.
Por lo tanto, si se pudiera utilizar una tecnología de mutagénesis de saturación dirigida al sitio para modificar la DKR mejorando su actividad catalítica y especificidad de sustrato y/o estabilidad, los problemas de la gran cantidad de líquido enzimático, los altos costes de producción y similares de la técnica anterior se podrían resolver.
Sumario de la invención
En vista de lo anterior, la invención pretende modificar la DKR mediante una tecnología de mutagénesis de saturación dirigida al sitio para mejorar su actividad catalítica y especificidad de sustrato y/o estabilidad.
El primer aspecto de la invención se refiere a una DKR mutante, que comprende una de las secuencias de
aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6.
En otra realización, la DKR mutante comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID NO: 1, 2, o 3.
En otra realización, la DKR mutante comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID NO: 2. El segundo aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos codificante de la DKR mutante mencionada anteriormente, en la que la secuencia de nucleótidos codificante no contiene una secuencia que se muestra como SEQ ID NO: 8.
En una realización, la secuencia de nucleótidos codificante comprende una secuencia que se muestra como SEQ ID NO: 9-14.
El tercer aspecto de la invención se refiere a un casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos codificante mencionada anteriormente.
El cuarto aspecto de la invención se refiere a un vector recombinante unido eficazmente con la secuencia de nucleótidos codificante, preferentemente, el vector recombinante es un vector de expresión recombinante.
El quinto aspecto de la invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector recombinante mencionado anteriormente.
El sexto aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de un compuesto 3R, 5S-dihidroxilo, que incluye las siguientes etapas: poner en contacto la DKR mutante mencionada anteriormente o una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos codificante mencionada anteriormente o una proteína obtenida mediante el casete de expresión mencionado anteriormente o el vector mencionado anteriormente o la célula huésped mencionada anteriormente con un compuesto dicetona en condiciones que hagan que la DKR actúe durante un periodo de tiempo,
en el que el compuesto dicetona es un material en bruto comercial del mercado o un compuesto cetona de preparación fácil
con la fórmula general I:
(fórmula 1)
en la que R1 se selecciona de entre un grupo aromático, un grupo alquilo, una base nafténica, una base aromática sustituida con un alquilo, un arilo sustituido con un halógeno, un heterociclo aromático, un heterocicloalquilo o un heterocicloalquilo sustituido con un alquilo; y R2 se selecciona de entre un grupo alquilo, una base nafténica, un grupo haloalquilo o una base nafténica halógena.
En una realización, el compuesto dicetona se selecciona de entre 6-benciloxi-3,5-dioxo-tert-butil hexanoato, 6-benciloxi-3,5-dioxo-neopentil hexanoato, 6-benciloxi-3,5-dioxo-metil hexanoato y 6-benciloxi-3,5-dioxo-etil hexanoato. En otras palabras, la mutación genética de la DKR mutante con mejor actividad enzimática se obtiene por un método que lleva a cabo la mutación genética tomando un gen de DKR (que se muestra como la SEQ ID NO: 7) de una cepa SK121 de Rhodococcus erythropolis como gen parental y se lleva a cabo por exploración dirigida.
En la invención, una secuencia de aminoácidos de la DKR mutante derivada de la cepa SK121 de Rhodococcus erythropolis incluye las siguientes secuencias:
(1) una secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 1: un sitio de mutación es F231W:
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDWAYDINAEVIEKAKARFDSLAAA
YKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLAT VAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDP AVYREWEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKT WRIGTGAPWGPFQIMDWGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAV GDGFYNYKG;
(2) una secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 2: los sitios de mutación son I94V+F231W:
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDWAYDINAEVIEKAKARFDSLAAA
YKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLAT VAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDP AVYREWEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKT WRIGTGAPWGPFQIMDWGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAV GDGFYNYKG;
(3) una secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 3: los sitios de mutación son 194V+V151Q+F231W:
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDWAYDINAEVIEKAKARFDSLAAA
YKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLAT VAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDP AVYREWEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKT WRIGTGAPWGPFQIMDWGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAV GDGFYNYKG;
(4) una secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 4: los sitios de mutación son V2391+R257K:
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDWAYDINAEVIEKAKARFDSLAAA
YKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLAT VAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVVWNNTAEVMGTESTDP AVYREWEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKT WRIGTGAPFGPFQIMDIVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVG DGFYNYKG;
(5) una secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 5: los sitios de mutación son V151Q+R257K:
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDWAYDINAEVIEKAKARFDSLAAA
YKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLAT VAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDP AVYREWEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKT WRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAV GDGFYNYKG; o
(6) una secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 6: los sitios de mutación son I94V+V151Q:
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDWAYDINAEVIEKAKARFDSLAAA
YKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLAT VAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDP AVYREWEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKT WRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAV GDGFYNYKG;
una secuencia codificante de ácido desoxirribonucleico (ADN) de la DKR mutante que incluye las siguientes secuencias de ADN:
(1) SEQ ID NO: 9, que se obtiene mutando TTC en TGG en el sitio de 691-693 pb en la secuencia genética de DKR que se muestra como SEQ ID NO: 8;
(2) SEQ ID NO: 10, que se obtiene mutando TTC en TGG en el sitio de 691-693 pb y mutando ATT en GTT, GTC, GTA, o GTG en el sitio de 280-282 pb en la secuencia genética de DKR que se muestra como SEQ ID NO: 8;
(3) SEQ ID NO: 11, que se obtiene mutando TTC en TGG en el sitio de 691-693 pb y mutando ATT en GTT, g Tc , GTA, o GTG en el sitio de 280-282 pb, y mutando GTC en CAA o CAG en el sitio de 451-453 pb en la secuencia genética de DKR que se muestra como SEQ ID NO: 8;
(4) SEQ ID NO: 12, que se obtiene mutando GTC en ATT, ATC o ATA en el sitio de 751-717 pb, y mutando CGC en AAA o AAG en el sitio de 769-771 pb en la secuencia genética de DKR que se muestra como SEQ ID NO: 8;
(5) SEQ ID NO: 13: que se obtiene mutando GTC en CAA o CAG en el sitio de 451-453 pb, y mutando CGC en AAA o AAG en el sitio de 769-771 pb en la secuencia genética de DKR que se muestra como SEQ ID NO: 8;
(6) SEQ ID NO: 14: que se obtiene mutando GTC en CAA o CAG en el sitio de 451-453 pb, y mutando ATT en GTT, GTC, GTA o GTG en el sitio de 280-282 pb en la secuencia genética de DKR que se muestra como SEQ ID NO: 8.
Cuando la mutante de la invención se utiliza para la preparación de un compuesto 3R, 5S-dihidroxilo, el valor ee del compuesto 3R, 5S-dihidroxilo es mayor del 99 % y un valor de es aproximadamente del 90 %. La DKR mutante es un intermediario farmacéutico clave, y proporcionar particularmente un catalizador eficaz para la síntesis de una cadena de dihidroxi hexanoato quiral de un fármaco estatina, de manera que el coste de producción industrial del compuesto 3R, 5S-dihidroxilo se reduce mucho.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un proceso de reacción química de la síntesis de un compuesto 3R,5S-dihidroxilo de acuerdo con la invención;
La Fig. 2 es una ecuación de la reacción química de la síntesis de 3R,5S-dihidroxi-6-benciloxi-tert-butil hexanoato de acuerdo
con la invención;
La Fig. 3 es una ecuación de la reacción química de la síntesis de 3R,5S-dihidroxi-6-benciloxi-tert-butil hexanoato de acuerdo
con la invención;
La Fig. 4 es un diagrama que imita la estructura tridimensional de DKR unida al dinucleótido nicotinamida adenina (NAD);
y
La Fig. 5 es un diagrama que imita la estructura tridimensional de una DKR marcando los sitios de mutación eficaces.
Descripción detallada de las realizaciones
En la invención, se adopta un método de mutagénesis de saturación dirigida al sitio para mutar un gen DKR parental, cambiando de esta manera una secuencia de aminoácidos de DKR, e implementando un cambio de la estructura proteica y función, obteniendo entonces una DKR mutante con una actividad enzimática muy mejorada mediante un método de exploración dirigida, y mejorando la actividad enzimática para que sea más de dos veces e incluso el triple de la de la DKR parental, reduciendo mucho el coste de producción industrial de un compuesto 3R, 5S-dihidroxilo. En algunas realizaciones, un valor ee del producto obtenido es mayor del 99 % y un valor de es aproximadamente del 90 %.
De acuerdo con una realización de la invención, una cantidad de DKR mutante de la invención que se utiliza en un procedimiento para producir un compuesto 3R, 5S-dihidroxilo solamente es el 34 % de la cantidad de DKR codificada por un gen parental, y la mutante es adecuada para su aplicación industrial.
En una realización de la invención, se adopta una tecnología de mutagénesis de saturación dirigida al sitio para llevar a cabo la mutación genética tomando un gen DKR derivado de una cepa SK121 de Rhodococcus erythropolis como gen de partida, y entonces se obtiene la DKR mutante con mejor actividad enzimática mediante un método de exploración dirigida. Un resto de aminoácido mutado de la DKR mutante de la invención se posiciona en un sitio de unión al sustrato o un área relacionada con el sustrato y la unión a NAD y relacionada con la transferencia de protones con NAD. Por ejemplo, I94 se posiciones en un área de unión a NAD y cuatro aminoácidos (es decir, V151, F231, V239 y R257) se posicionan en la vecindad del sitio de unión al sustrato. Cambiando estos aminoácidos se puede mejorar la especificidad de unión al sustrato, mejorando de esta manera la actividad enzimática. Un resultado experimental de la invención muestra que la mutación simple F231W puede mejorar espectacularmente la actividad de la DKR. La introducción adicional de la mutación I94V y/o V151Q sobre la base de la mutación F231W pueden mejorar adicionalmente la actividad de la DKR. La combinación de la mutación R257K y V239I o V151Q puede
mejorar espectacularmente la actividad de la DKR.
La DKR mutante obtenida se puede conectar genéticamente a un pET-22b (+) y otro vector de expresión mediante medios de modificación genética, y entonces expresarse en exceso en Escherichia coli. El peso molecular de la DKR mutante expresada en exceso en la SDS-PAGE es aproximadamente de 30 KD, y puede reducir un correspondiente sustrato dicetona en una etapa en condiciones de 30 °C y un pH de 6,0 para obtener el compuesto 3R, 5S-dihidroxilo con una pureza óptica más alta.
El material dicetona en bruto correspondiente al compuesto 3R, 5S-dihidroxilo en la invención puede ser un material en bruto comercial del mercado o un compuesto cetónico de preparación fácil con la fórmula química general
en la que R1 se selecciona de entre un grupo aromático, un grupo alquilo, una base nafténica, una base aromática sustituida con un alquilo, un arilo sustituido con un halógeno, un heterociclo aromático, un heterocicloalquilo o un heterocicloalquilo sustituido con un alquilo; y R2 se selecciona de entre un grupo alquilo, una base nafténica, un grupo haloalquilo o una base nafténica halógena. El producto dihidroxilo se expresa mediante la siguiente fórmula química general:
en la que R1 se selecciona de entre un grupo aromático, un grupo alquilo, una base nafténica, una base aromática sustituida con un alquilo, un arilo sustituido con un halógeno, un heterociclo aromático, un heterocicloalquilo o un heterocicloalquilo sustituido con un alquilo; y R2 se selecciona de entre un grupo alquilo, una base nafténica, un grupo haloalquilo o una base nafténica halógena.
Definiciones
El término "identidad" utilizado en la invención tiene el significado conocido habitualmente en el campo, y los expertos en la técnica conocen bien las reglas y convenciones para medir la identidad de diferentes secuencias. En la invención, las secuencias limitadas por diferentes grados de identidad también son necesarias para tener una actividad de DKR mejorada. Los expertos en la técnica conocen bien un método y medio para medir la actividad de una DKR y explorar una secuencia mutante. Los expertos en la técnica pueden obtener fácilmente dicha secuencia mutante con la guía de los contenidos de la invención. En algunas realizaciones una secuencia de DKR mutante es una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 % o 99,6 % con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 7 u 8 y tiene o codifica una proteína con actividad DKR mejorada. Por ejemplo, se puede sustituir uno o más restos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos con aminoácidos conservadores y, por ejemplo, el uno o más restos de aminoácidos son los restos de aminoácido 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50. Los aminoácidos conservadores entre los aminoácidos son conocidos en el campo.
La expresión "actividad mejorada de DKR" que se utiliza en la invención se refiere a que la bioactividad de un DKR obtenida por tecnología de mutagénesis de saturación dirigida al sitio está mejorada en cuanto a la DKR de partida, por ejemplo, mejor actividad catalítica, ampliación del espectro de sustratos, mejor estabilidad térmica, mejor estabilidad de pH, o aumento de la cantidad de expresión, y por ejemplo, está mejorada en al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 % o más en comparación con la de la DKR de partida.
La expresión "condiciones de alta rigurosidad" que se utiliza en la invención se puede definir de la siguiente manera: (1) se adoptan una fuerza iónica débil y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, 0,015 M de cloruro sódico/0,0015 M de citrato sódico/0,1 % de sulfato dodecil sódico, 50 °C; (2) se adopta un desnaturalizante tal como la formamida en un proceso de hibridación, por ejemplo, un 50 % (v/v) de formamida y un 0, 1 % de seroalbúmina bovina/0,1 % de Ficoll/un 0,1 % de polivinilpirrolidona/50 mM de solución de tampón de fosfato sódico con un pH de 6,5, que incluye 750 mM de cloruro sódico y 75 mM de citrato sódico, 42 °C; o (3) se adopta un 50 % de formamida, 5x s Sc (0,75 M de NaCl y 0,075 M de citrato sódico), 50 mM de fosfato sódico (pH 6,8), un 0,1 % de pirofosfato sódico, 5 X de solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón tratado ultrasónicamente (50 g/ml), un 0,1 % de SDS y un 10 % de sulfato de dextrano, 42 °C, se lleva a cabo el lavado en 0,2 x SCC (cloruro sódico/citrato sódico) y un 50 % de formamida a 42 °C, 55 °C, y se lleva a cabo un lavado altamente riguroso en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C.
La expresión "casete de expresión" que se utiliza en la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico en forma de anillo o lineal , que cubre a Dn y secuencias de ácido ribonucleico (ARN) capaces de dirigir secuencias de nucleótidos específicas que se van a expresar en las células huésped apropiadas e incluye en general un promotor
unido eficazmente con un polinucleótido diana, que se une eficazmente de manera aleatoria con una señal de terminación y/u otros elementos de regulación. El casete de expresión puede incluir adicionalmente secuencias necesarias para corregir la traducción de las secuencias de nucleótidos. Un área codificante codifica habitualmente proteínas diana, y también codifica un ARN funcional diana en una dirección en sentido o antisentido, por ejemplo, un ARN antisentido o un ARN no traducido. Un casete de expresión que incluye una secuencia de polinucleótido diana puede estar integrado, refiriéndose a que al menos un componente y al menos otro componente son heterogéneos. Un casete de expresión también puede existir naturalmente, pero se obtiene en forma de recombinación eficaz para la expresión heterogénea.
La expresión "unido eficazmente" que se utiliza en la invención se refiere a dicha manera de unión en la que un nucleótido codificante tiene una posición apropiada del vector para hacer que el nucleótido codificante se copie, transcriba o exprese correcta y fluidamente.
El término vector que se utiliza en la invención incluye cualquier plásmido, cósmido, bacteriófago o molécula de ácido nucleico binario de Agrobacterium tumefaciens en una forma de doble cadena o cadena sencilla, linear o con forma de anillo, es preferentemente un vector de expresión recombinante, puede ser un vector de expresión en procariotas, puede ser también un vector de expresión en eucariotas, y es preferentemente un vector de expresión en procariotas. En algunas realizaciones, el vector recombinante se selecciona de entre pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b(+), pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-18, pUC-18 o pUC-19. En algunas realizaciones, el vector es el pET-22b (+). La expresión "célula huésped" que se utiliza en la invención incluye una célula procariota, una levadura o una célula eucariota superior. Una célula procariota apropiada incluye, pero no se limita a, eubacterias, tal como organismos gramnegativos o grampositivos, tales como Escherichia coli o enterobacteriáceas. Se pueden obtener públicamente distintas cepas de Escherichia coli.
La expresión "condición que hace que la DKR actúe" que se utiliza en la invención se refiere a una condición capaz de hacer que la DKR catalice su sustrato para transformarlo en un producto correspondiente. En algunas realizaciones, la "condición que hace que la DKR actúe" incluye la DKR, el sustrato de la DKR, una coenzima y un sistema tampón apropiado.
La expresión "contactar durante un periodo de tiempo" que se utiliza en la invención se refiere a hacer reaccionar la DKR mutante con su sustrato de reacción durante un tiempo suficiente en condiciones que hagan que la DKR actúe hasta transformar al menos parcialmente el sustrato en un producto correspondiente.
Los expertos en la técnica saben que, aunque se adopta "incluye" como expresión cuando el polinucleótido se define en la invención, no significa que otras secuencias no relacionadas con la función del polinucleótidos se puedan añadir libremente a los dos extremos del polinucleótido. Los expertos en la técnica saben que es necesario añadir sitios de digestión enzimática de enzimas de restricción a los dos extremos del polinucleótido o añadir codones de inicio, codones de terminación y similares. Por lo tanto, la definición de un anticuerpo tetravalente biespecífico adoptando una expresión cerrada puede no cubrir realmente estas condiciones.
Los expertos en la técnica saben que se pueden sustituir uno o más codones de una secuencia de nucleótidos de manera equivalente en condiciones que no cambien los aminoácidos codificados, y, por ejemplo, los uno o más codones son codones tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 codones. La tabla de aplicación de codones se conoce bien en el campo.
La invención se describirá adicionalmente a continuación con realizaciones no restrictivas.
Los siguientes métodos experimentales son métodos convencionales si no hay anotaciones especiales, y los materiales experimentales adoptados pueden obtenerse fácilmente en compañías comerciales si no hay anotaciones especiales. Los distintos anticuerpos adoptados en las siguientes realizaciones de la invención son anticuerpos comerciales convencionales.
Realización
Realización 1: mutagénesis de saturación dirigida al sitio de DKR (SEQ ID NO: 7) derivada de una cepa SK121 de Rhodococcus erythropolis
Una secuencia de aminoácidos de la DKR se simula en una estructura tridimensional de una proteína en el modelo de un sitio de internet suizo, entonces se simula la unión de un sustrato y la proteína mediante Docking, y se lleva a cabo finalmente el análisis Pymol para seleccionar un aminoácido relacionado con el sustrato y la unión a NAD y
relacionado con la transferencia de protones con NAD como aminoácido mutado (Fig. 4).
Un cebador de mutación correspondiente (Tabla 1) es diseñado por Primmer5.0 de acuerdo con el aminoácido mutado y sus secuencias flanqueantes (el aminoácido mutado se refiere al sitio de mutación en la Tabla 1). Se obtiene un fragmento lineal completo mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) de plásmido completo tomando un vector de expresión pET22b (+) (adquirido en Novagen y con un número de producto de 69744) que contiene un gen DKR como matriz, y después se retira la matriz parental mediante digestión con DPn I, el producto de la PCR se transfiere en Escherichia coli BL21(DE3) y se reviste en una placa de cultivo LB que contiene 50 pg/ml de ampicilina para el cultivo durante una noche a 37 °C.
Tabla 1 Secuencia de cebadores de muta énesis de saturación diri ida al sitio
continuación
Realización 2: exploración preliminar de una DKR mutante
De acuerdo con los contenidos de la realización 1, una única colonia de la placa de cultivo se selecciona y se inocula en una placa de 96 pocillos profundos, se pre-añaden 0,5 mililitros de medio de cultivo LB líquido que contenía 50 |jg/ml de ampicilina en cada pocillo, se lleva a cabo un agitado durante 3 h a 37 °C, después se añade IPTG hasta una concentración de 0,2 mM, se llevó a cabo la expresión inducida durante 16 h a 18 °C, se llevó a cabo una centrifugación a 6.000 g durante 10 min para recolectar las bacterias, se destruyen las células bacterianas mediante un disruptor ultrasónico (JY92-2D, Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd.), se llevó a cabo la centrifugación a 4 °C durante 20 min a 10.000 g para obtener el sobrenadante, y la exploración preliminar de actividad se llevó a cabo mediante un lector de microplacas. Se añadieron 30 ml de DMSO en la placa de 96 pocillos, 1,5 ml de un material principal en bruto 6-benciloxi-3,5-dioxo-tert-butil hexanoato (disuelto en DMSO a 30 mg/ml), 2,5 ml de NADH (20 mg/ml) y 216 ml de una solución de tampón de fosfato (100 mM, pH = 6,0) se añaden en una placa de 96 pocillos, la detección del fondo se llevó a cabo a 340 nm, se añaden 50 ml de la enzima mutante líquida en cada pocillo y se detecta inmediatamente una carga de un valor de absorción fotométrica a 340 nm a 30 °C.
Una fórmula de cálculo de la actividad enzimática: actividad enzimática (u/ml) = (AA x 60 x V1) / (6,22 x t x V2) AA: un valor cambiado de absorción fotométrica en un proceso de reacción;
V1: un volumen total de un sistema de reacción;
6,22: un coeficiente de extinción;
t: tiempo de detección de AA; y
V1: el volumen de la enzima líquida añadida.
Realización 3: exploración secundaria de una DKR mutante
Una mutante cuya actividad enzimática es mayor que la de la cepa parental de la realización 2 se inocula en 500 ml de medio de cultivo líquido LB que contenía 50 jg/ml de ampicilina, se lleva a cabo el agitado del cultivo a 37 °C hasta una DO600=0.6, se añade IPTG hasta una concentración final de 0,2 mM, y se llevó a cabo la inducción de la expresión a 18 °C. Después de llevar a cabo la inducción durante 16 h, se lleva a cabo una centrifugación a 6.000 g
durante 10 min para recolectar las bacterias. Las células bacterianas se destruyen mediante un disruptor ultrasónico (JY92-2D, Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd.), y se lleva a cabo una centrifugación a 4 °C durante 20 min a 10.000 g para obtener el sobrenadante para la detección de la actividad. Se añadieron 0,05 g de material principal en bruto
(6-benciloxi-3,5-dioxo-tert-butil hexanoato) y 0,5 ml de polietilenglicol PEG-400 en un matraz de reacción de 10 ml, se añaden 4,0 ml de solución tampón de fosfato (100 mM, pH = 6,0) después de disolver el material en bruto, y el material principal en bruto se dispersa uniformemente en la solución tampón, y se añaden 1,5 mg de NAD+, 20,6 mg de formato amónico, 10 mg de coenzima formato deshidrogenasa y 0,5 ml de DKR, el pH del sistema es 6,0, y la temperatura del sistema se conserva a 30 /-3 °C durante 16 h, después se lleva a cabo un rastreo con Cromatografía de capa fina (TLC), un sistema con un punto obvio de producto de transformación y un punto de material principal en bruto no obvio se seleccionaron por extracción en etil acetato, se llevó a cabo el reposo para la separación del líquido, y se extrajo una fase orgánica mediante un análisis de cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC).
Una mutante cuya actividad catalítica es mayor que la de la cepa parental se selecciona para la secuenciación, análisis del sitio de mutación y cultivo a gran escala, se repitió la medición de la actividad catalítica para confirmar las mutantes, la actividad catalítica de los mutantes F231W (SEQ ID NO: 1), I94V+ F231W (SEQ ID NO: 2), I94V+ F231W (SEQ ID NO: 3), V239I+ R257K (SEQ ID NO: 4), V151Q+ R257K (SEQ ID NO: 5), I94V+ V151Q (SEQ ID NO: 6) está extraordinariamente mejorada en comparación con la de la cepa parental, y los resultados de la exploración secundaria se muestran en la Tabla 2. El análisis de simulación por computadora se llevó a cabo en una estructura tridimensional de la DKR adoptando un software, en el que se posiciona I94 en un área de unión a NAD, cuatro aminoácidos V151, F231, V239, R257 se posicionaron en la vecindad de los sitios de unión al sustrato, y el cambio de estos aminoácidos puede mejorar la especificidad de unión al sustrato, mejorando de esta manera la actividad enzimática (Fig. 5).
Tabla 2 Comparación de actividad de 3R, 5S-dihidroxi-6-benzoil-tert-butil hexanoato preparado mediante DKR de la ce a arental mutantes
Realización 4: clonación y expresión de una DKR mutante
Con el fin de facilitar la expresión e identificación de una DKR mutante, se diseñaron sitios de digestión de enzimas de restricción compatibles en los extremos 5' y 3' de su gen. La digestión enzimática se lleva a cabo respectivamente en un gen diana y pET-22b(+) (también se pueden utilizar otros plásmidos de expresión que expresen proteínas en Escherichia coli ) al mismo tiempo utilizando NdeI y XhoI, la reacción de conexión se lleva a cabo sobre los fragmentos mayores del gen diana digerido enzimáticamente y el plásmido mediante la ADN ligasa T4, se transforma un producto de la conexión en una célula competente de la cepa DH5a de Escherichia coli , y se reviste una placa plana de cultivo LB que contiene 50 pg/ml de ampicilina con la célula transformada para su cultivo durante una noche a 37 °C.
Se selecciona una única colonia cultivada en la placa de cultivo y se inocula en un medio de cultivo LB líquido que contiene 50 mg/ml de ampicilina, se lleva a cabo el agitado del cultivo durante una noche a 37 °C, se recolectan las bacterias para la extracción del plásmido, la identificación por PCR y la identificación de la digestión enzimática dual,
y entonces el vector clonado correctamente se denomina pET22b(+)-R-M y se transforma en Escherichia coli BL21 (DE3), y se reviste una placa plana de cultivo LB que contiene 50 mg/ml de ampicilina con la Escherichia coli BL21 (DE3), para su cultivo durante una noche a 37 °C. Se selecciona una única colonia cultivada en la placa de cultivo plana y se inocula en 5 ml de medio de cultivo LB líquido que contiene 50 mg/ml de ampicilina para la identificación con PCR de colonia y posteriormente se lleva a cabo la inducción de la expresión en Escherichia coli que contiene un vector de expresión correcto. El líquido bacteriano se transfiere a 500 ml de medio de cultivo LB líquido que contiene 50 mg/ml de ampicilina, se lleva a cabo el agitado del cultivo a 37 °C hasta una DO600=0,5~ 0,6, se añade IPTG hasta una concentración final de 0,2 ~1,0 mM respectivamente, se lleva cabo la expresión inducida durante 10 a 16 h a 18-25 °C, se extrae la solución bacteriana, se lleva a cabo la centrifugación a 6.000 g durante 10 min para recolectar las bacterias y las bacterias se congelan y conservan para su uso posterior a -20 °C. Las células de las bacterias se destruyen mediante un disruptor ultrasónico (JY92-2D, Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd ), se lleva a cabo la centrifugación durante 20 min a 10.000 g y 4 °C para obtener el sobrenadante y los precipitados, y se lleva a cabo la detección por SDS-PAGE en el sobrenadante mediante un dispositivo de electroforesis vertical. El peso molecular de la DKR mutante en SDS-PAGE es de aproximadamente 30 KD.
Realización 5: aplicación de la DKR mutante I94V+F231W a la preparación de un compuesto 3R, 5S-dihidroxilo
Un compuesto dicetona consistente con la fórmula general I
(fórmula general 1) se selecciona como un material inicial en bruto, en la que R1 se selecciona de entre un grupo aromático, un grupo alquilo, una base nafténica, una base aromática sustituida con un alquilo, un arilo sustituido con un halógeno, un heterociclo aromático, un heterocicloalquilo o un heterocicloalquilo sustituido con un alquilo; y R2 se selecciona de entre un grupo alquilo, una base nafténica, un grupo haloalquilo o una base nafténica halógena. El producto dihidroxilo se expresa mediante la siguiente fórmula química general II:
(fórmula general II), en la que R1 se selecciona de entre un grupo aromático, un grupo alquilo, una base nafténica, una base aromática sustituida con un alquilo, un arilo sustituido con un halógeno, un heterociclo aromático, un heterocicloalquilo o un heterocicloalquilo sustituido con un alquilo; y R2 se selecciona de entre un grupo alquilo, una base nafténica, un grupo haloalquilo o una base nafténica halógena.
(1) aplicación de la DKR mutante I94V+F231W para la preparación de un compuesto 3R, 5S-dihidroxi-6-benciloxitert-butil hexanoato
Se añadieron 5 g de material principal en bruto 6-benciloxi-3,5-dioxo-tert-butil hexanoato:
y 20 ml de polietilenglicol PEG-400 en un matraz de reacción de 250 ml, se añadieron 160 ml de solución tampón de fosfato (100 mM, pH=6,0) después de que se disolvieran los materiales en bruto, y el material principal en bruto se dispersó uniformemente en la solución tampón; se añadieron 0,15 g de NAD+, 20,6 g de formato amónico, 0,25 g de coenzima formato deshidrogenasa y enzima en bruto líquida de 2 ph de DKR mutante I94V F231W, el pH del sistema es 6,0 y la temperatura se conserva durante 17 h a 30 /-3 °C; y se terminó la reacción mediante 200 ml de etil acetato, se llevó a cabo la filtración mediante 125 g de tierra de diatomeas, se llevó a cabo la extracción dos veces con 200 ml de etil acetato, se dejó en reposo para la separación de líquidos, y se secó una fase orgánica, se filtró y se concentró para obtener un producto en bruto, en el que la proporción de
(6-benzoil-3,5-dioxo-tert-butil hexanoato) en el sistema del producto 3R, 5S-dihidroxi-6-benciloxi-tert-butil hexanoato es 86-91 %, el rendimiento es del 80-86 %, el valor ee es mayor del 99,5 % y el valor de es del 88-95 %.
Claims (9)
1. Una dicetorreductasa (DKR) mutante, que comprende una de las secuencias de aminoácidos, que se muestran como en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6.
2. Una secuencia de nucleótidos codificante de la DKR mutante de acuerdo con la reivindicación 1.
3. La secuencia de nucleótidos codificante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos codificante comprende las secuencias, que se muestran como SEQ ID NO: 9-14.
4. Un casete de expresión, que comprende la secuencia de nucleótidos codificante de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3.
5. Un vector recombinante, al que se ha unido eficazmente la secuencia de nucleótidos codificante, de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3.
6. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el vector recombinante es un vector de expresión recombinante.
7. Una célula huésped, que comprende el vector recombinante, de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6.
8. Un método para la producción de un compuesto 3R,5S-dihidroxilo, que comprende las siguientes etapas: producir la DKR mutante de acuerdo con la reivindicación 1, o una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos codificante de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, o una proteína obtenida mediante el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 o el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 7 para ponerla en contacto con un compuesto dicetona en condiciones que hagan que la DKR actúe durante un periodo de tiempo,
siendo el compuesto dicetona un material en bruto comercial del mercado o un compuesto cetona de fácil preparación con la fórmula general I:
en la que R1 se selecciona de entre un grupo aromático, un grupo alquilo, una base nafténica, una base aromática sustituida con un alquilo, un arilo sustituido con un halógeno, un heterociclo heterocicloaromático aromático, un heterocicloalquilo o un heterocicloalquilo sustituido con un alquilo; y R2 se selecciona de entre un grupo alquilo, una base nafténica, un grupo haloalquilo o una base nafténica halógena.
9. El método para la producción del compuesto 3R,5S-dihidroxilo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el compuesto dicetona se selecciona de entre 6-benciloxi-3,5-dioxo-tert-butil hexanoato, 6-benciloxi-3,5-dioxo-neopentil hexanoato, 6-benciloxi-3,5-dioxo-metil hexanoato y 6-benciloxi-3,5-dioxo-etil hexanoato.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410196920.5A CN103966176B (zh) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
| PCT/CN2014/083648 WO2015168999A1 (zh) | 2014-05-09 | 2014-08-04 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2733948T3 true ES2733948T3 (es) | 2019-12-03 |
Family
ID=51236183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14891354T Active ES2733948T3 (es) | 2014-05-09 | 2014-08-04 | Doble carbonilo reductasa mutante y aplicación de la misma |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10131883B2 (es) |
| EP (1) | EP3141601B1 (es) |
| JP (1) | JP6473175B2 (es) |
| KR (1) | KR102176054B1 (es) |
| CN (2) | CN107603961B (es) |
| ES (1) | ES2733948T3 (es) |
| WO (1) | WO2015168999A1 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107603961B (zh) | 2014-05-09 | 2020-04-24 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
| WO2016095223A1 (zh) * | 2014-12-19 | 2016-06-23 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
| CN104560907B (zh) * | 2014-12-19 | 2017-12-22 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
| CN108048416B (zh) * | 2017-12-25 | 2021-05-18 | 吉林凯莱英医药化学有限公司 | 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用 |
| CN110387359B (zh) * | 2018-04-17 | 2021-04-20 | 湖州颐盛生物科技有限公司 | 羰基还原酶突变体及其应用 |
| JP7715045B2 (ja) * | 2019-11-22 | 2025-07-30 | Ｕｂｅ株式会社 | カルボニル還元酵素、これをコードする核酸、及びこれらを利用した光学活性化合物の製造方法 |
| CN113801859B (zh) * | 2021-09-29 | 2023-08-01 | 山东睿鹰制药集团有限公司 | 一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101429514B (zh) * | 2007-11-08 | 2011-06-15 | 陈依军 | 一种双羰基还原酶、其基因及其应用 |
| CN101880694B (zh) | 2009-12-01 | 2014-06-11 | 陈依军 | 一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法 |
| CN102277338A (zh) * | 2011-08-02 | 2011-12-14 | 中国药科大学 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
| CN102517241B (zh) * | 2011-12-19 | 2013-06-19 | 中国药科大学 | 一种含有d型氨基酸的双羰基还原酶的突变体的制备方法 |
| CN103937759B (zh) | 2014-05-06 | 2017-03-22 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶、其编码基因及应用 |
| CN103937761B (zh) | 2014-05-06 | 2017-03-22 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶、其编码基因及应用 |
| CN107603961B (zh) | 2014-05-09 | 2020-04-24 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
-
2014
- 2014-05-09 CN CN201711040940.3A patent/CN107603961B/zh active Active
- 2014-05-09 CN CN201410196920.5A patent/CN103966176B/zh active Active
- 2014-08-04 ES ES14891354T patent/ES2733948T3/es active Active
- 2014-08-04 US US15/309,690 patent/US10131883B2/en active Active
- 2014-08-04 JP JP2016567554A patent/JP6473175B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-08-04 WO PCT/CN2014/083648 patent/WO2015168999A1/zh not_active Ceased
- 2014-08-04 EP EP14891354.4A patent/EP3141601B1/en not_active Not-in-force
- 2014-08-04 KR KR1020167034582A patent/KR102176054B1/ko active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015168999A1 (zh) | 2015-11-12 |
| US10131883B2 (en) | 2018-11-20 |
| KR20170002619A (ko) | 2017-01-06 |
| EP3141601A4 (en) | 2017-09-20 |
| EP3141601B1 (en) | 2019-06-12 |
| JP2017518744A (ja) | 2017-07-13 |
| WO2015168999A8 (zh) | 2018-12-06 |
| US20170152488A1 (en) | 2017-06-01 |
| CN107603961B (zh) | 2020-04-24 |
| CN103966176B (zh) | 2017-12-22 |
| EP3141601A1 (en) | 2017-03-15 |
| CN103966176A (zh) | 2014-08-06 |
| CN107603961A (zh) | 2018-01-19 |
| KR102176054B1 (ko) | 2020-11-09 |
| JP6473175B2 (ja) | 2019-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2733948T3 (es) | Doble carbonilo reductasa mutante y aplicación de la misma | |
| CN102796728B (zh) | 用于通过转座酶的dna片段化和标记的方法和组合物 | |
| US8759028B2 (en) | Expression cassette, recombinant host cell and process for producing a target protein | |
| CN104531628B (zh) | 醇脱氢酶突变体及其应用 | |
| Patel et al. | Periplasmic expression of carbonic anhydrase in Escherichia coli: a new biocatalyst for CO2 hydration | |
| CN110205310B (zh) | 转氨酶突变体及其应用 | |
| Novak et al. | Characterisation of an l-haloacid dehalogenase from the marine psychrophile Psychromonas ingrahamii with potential industrial application | |
| Peng et al. | Co-expression of chaperones from P. furiosus enhanced the soluble expression of the recombinant hyperthermophilic α-amylase in E. coli | |
| US20240002890A1 (en) | Lipase Mutant and use thereof | |
| EP4330386A2 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
| EP4276178B1 (en) | Esterase mutant and use thereof | |
| KR100914525B1 (ko) | 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를 이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법 | |
| CN104745557A (zh) | 来源于嗜清洁细小杆菌卤醇脱卤酶突变体及其应用 | |
| Luo et al. | Increased solubility of glutathione S‐transferase‐p16 (GST‐p16) fusion protein by co‐expression of chaperones groes and groel in Escherichia coli | |
| CN103773783B (zh) | 利用重组表达核糖磷酸转移酶生产5’-肌苷酸的方法 | |
| Park et al. | Expression of codon-optmized phosphoenolpyruvate carboxylase gene from Glaciecola sp. HTCC2999 in Escherichia coli and its application for C4 chemical production | |
| CN118240807A (zh) | 一种热稳定性提高的腈水解酶突变体及在合成2-氯烟酸中的应用 | |
| Urbonavicius et al. | Deciphering the complex enzymatic pathway for biosynthesis of wyosine derivatives in anticodon of tRNAPhe | |
| RU2716975C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая гибридный белок l-hep, штамм escherichia coli продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного белка | |
| Competty | Production of Human Paraoxonase I (huPON1) In E. coli With Periplasmic Expression and Chaperone Co-expression | |
| CN120866274A (zh) | 一种高活性脂肪酶突变体及在功能油脂合成中的应用 | |
| CN105602916A (zh) | 一种dbat突变酶r363h及其应用 | |
| Larentis et al. | Expression and homology modeling of 2′-aminobiphenyl-2, 3-diol-1, 2-dioxygenase from Pseudomonas stutzeri carbazole degradation pathway | |
| Setayesh et al. | Cloning, molecular characterization and expression of a DNA-ligase from a new bacteriophage: Phax1 | |
| Bralley delCardayre | Catalysis by ribonuclease A: Specificity, processivity, and mechanism |