RU2716975C1 - Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая гибридный белок l-hep, штамм escherichia coli продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного белка - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая гибридный белок l-hep, штамм escherichia coli продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2716975C1 RU2716975C1 RU2019100017A RU2019100017A RU2716975C1 RU 2716975 C1 RU2716975 C1 RU 2716975C1 RU 2019100017 A RU2019100017 A RU 2019100017A RU 2019100017 A RU2019100017 A RU 2019100017A RU 2716975 C1 RU2716975 C1 RU 2716975C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hep
- cbd
- recombinant protein
- seq
- escherichia coli
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 14
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 101001012451 Homo sapiens Enteropeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 17
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 16
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 16
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 16
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 10
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 6
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 claims description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 4
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001012262 Bos taurus Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 1H-imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102000018690 Trypsinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010027252 Trypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007210 heterogeneous catalysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- -1 β-cyanethyl-diisopropylamino Chemical group 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии и в частности к рекомбинантному белку L-HEP-HG6-CBD, рекомбинантному белку, который используется для получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD, рекомбинантной плазмидной ДНК pET32b-L-HEP-HG6-CBD для экспрессии рекомбинантного белка, штамму Escherichia coli BL 21(DE3)/L-HEP-HG6-CBD, который продуцирует рекомбинантный белок, а также способу получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD. Технический результат данного изобретения заключается в получении клеток штамма-продуцента рекомбинантного белка, обладающего каталитической активностью лёгкой цепи энтеропептидазы человека и способного к иммобилизации на металл-хелатных и хитиновых носителях без потери каталитической активности. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 пр., 3 ил.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного рекомбинантного белка легкой цепи энтерокиназы человека, способного к иммобилизации.
Уровень техники
Энтеропептидаза (синоним: энтерокиназа, EC) представляет собой гетеродимерную сериновую протеазу, которая катализирует реакцию получения активного трипсина из предшественника трипсиногена высокоспецифическим отщеплением пептида активации трипсиногена после последовательности (Asp)4-Lys (SEQ ID NO 1). Он также имеет большой биотехнологический интерес из-за уникальной субстратной специфичности легкой цепи человеческой энтеропептидазы L-HEP.
Известно применение методов очистки на металл-аффинных сорбентах для производства энтеропептидазы L-HEP /патенты RU2011121471A, RU2011121471A, RU2495934C2/. Недостатком данных работ является наличие всего одного сайта специфического связывания, что не даёт возможности дальнейшей иммобилизации L-HEP.
Известна технология функционального фагового дисплея /Gasparian, M. E., Bobik, T. V., Kim, Y. V., Ponomarenko, N. A., Dolgikh, D. A., Gabibov, A. G., & Kirpichnikov, M. P. (2013). Heterogeneous catalysis on the phage surface: Display of active human enteropeptidase. Biochimie, 95(11), 2076-2081/, предлагающая способ производства активной энтеропептидазы, подходящей для удаления пептидных последовательностей в гибридных белках или функционального анализа мутантов. Недостатком приведённой технологии оказывается невысокий выход L-HEP, который ниже, чем в системах экспрессии на основе бактериальных клеток.
Известен способ иммобилизации L-HEP в глиоксилагарозных шариках /Suh, C. W., Choi, G. S., & Lee, E. K. (2003). Enzymic cleavage of fusion protein using immobilized urokinase covalently conjugated to glyoxyl‐agarose. Biotechnology and applied biochemistry, 37(2), 149-155/. Однако, полученный таким способом препарат сохранял свою активность не более одного цикла, что делает метод экономически неэффективным для применения в производстве.
Известна работа, в которой осуществили иммобилизацию энтерокиназы, обладающей высокой селективностью сайта расщепления и высокой скоростью расщепления /Suh, C. W., Park, S. H., Park, S. G., & Lee, E. K. (2005). Covalent immobilization and solid-phase refolding of enterokinase for fusion protein cleavage. Process Biochemistry, 40(5), 1755-1762/. Помимо приведённых преимуществ, авторы добились высокого выхода процесса рефолдинга иммобилизованной L-HEP, однако удельная активность фермента при продолжительном использовании составляла всего 20-30%., что делает метод экономически неэффективным для применения в производстве.
Известен способ иммобилизации L-HEP с использованием аминомодифицированных парамагнитных микросфер и гексаметиламино-модифицированных носителей «Sepabeads» /Kubitzki, T., Noll, T., & Lütz, S. (2008). Immobilisation of bovine enterokinase and application of the immobilised enzyme in fusion protein cleavage. Bioprocess and biosystems engineering, 31(3), 173-182/. Недостатком приведённого способа является существенное снижение скорости реакции уже после второго цикла, что делает метод экономически неэффективным для применения в производстве.
Известно повторное использование иммобилизованной L-HEP на протяжении 18-ти циклов, где иммобилизация проводится с использованием пористых гексаметиламино-модифицированных носителей «Sepabeads» /Kubitzki, T., Minör, D., Mackfeld, U., Oldiges, M., Noll, T., & Lütz, S. (2009). Application of immobilized bovine enterokinase in repetitive fusion protein cleavage for the production of mucin 1. Biotechnology Journal: Healthcare Nutrition Technology, 4(11), 1610-1618/. Недостатком приведённого способа является то, что результат расщепления контрольных гибридных белков обычно демонстрируется электрофорезом в додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Данный метод предоставляет информацию о расщеплении рекомбинантного белка, однако не предоставляет данных о специфичности сайта расщепления, что не может считаться удовлетворительным для производства.
Известны методы иммобилизации L-HEP на различных эпоксидных смолах /Tengattini, S., Rinaldi, F., Piubelli, L., Kupfer, T., Peters, B., Bavaro, T., Temporini, C. (2018). Enterokinase monolithic bioreactor as an efficient tool for biopharmaceuticals preparation: on-line cleavage of fusion proteins and analytical characterization of released products. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 157, 10-19/. Недостатком приведённого способа является проблема неспецифичного расщепления энтерокиназы в иммобилизованной форме с некоторыми субстратами, таким образом использование подобного метода не может считаться универсальным, что не может считаться удовлетворительным для производства.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ получения лёгкой цепи энтеропептидазы человека L-HEP, который заключающийся в экспрессии рекомбинантного белка, состоящего из L-HEP, сайта её расщепления и тиоредоксина /Marine E. Gasparian, Valeriy G. Ostapchenko, Alexey A. Schulga, Dmitry A. Dolgikh, Mikhail P. Kirpichnikov, Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli, Protein Expression and Purification, Volume 31, Issue 1, 2003, 133-139/. В данном способе получаемый в растворимой форме гибридный белок автокаталитически расщепляется, давая активную форму L-HEP. Основной недостаток данного способа заключается в том, что получаемый L-HEP является растворимым и не показана возможность его иммобилизации, необходимой для более эффективной утилизации в производстве. Таким образом, техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, является получение рекомбинантного белка, обладающего каталитической активностью легкой цепи энтеропептидазы человека
Технический результат заключается в сохранении высокой каталитической активности рекомбинантного белка при иммобилизации на протяжении нескольких производственных циклов (возможность многократного использования рекомбинантного белка).
Для решения технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагается рекомбинантный белок (SEQ ID NO 2), включающий в себя сайты связывания металл-хелатного носителя (HG6), сайт узнавания хитинового носителя (CBD), лёгкую цепь энтерокиназы человека L-Hep.
Предлагается также рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3, состоящий из модифицированного сайта расщепления L-HEP (SEQ ID NO 4), сайта связывания на металл-хелатном носителе (HG6), лёгкой цепи энтеропептидазы L-HEP, сайта связывания с хитиновым носителем (CBD).
Другим объектом изобретения является рекомбинантная плазмидная ДНК pET32b-L-HEP-HG6-CBD для экспрессии рекомбинантного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3, имеющая длину 6365 пар оснований и состоящая из следующих ключевых генетических элементов:
а) гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);
б) ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
в) промотора T7 и оператора lacO;
г) синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 5;
д) гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (LacI promoter).
Объектом изобретения является также штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/L-HEP-HG6-CBD, продуцирующий рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pET32b-L-HEP-HG6-CBD.
Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/L-HEP-HG6-CBD получен путём трансформации клеток Escherichia coli рекомбинантной плазмидной ДНК pET32b-L-HEP-HG6-CBD.
Предлагается способ получения рекомбинантного белка L-HEP SEQ ID NO 2, включающий в себя стадии:
а) культивирования клеток штамма-продуцента Escherichia coli по любому из пунктов 4—5 с получением культуральной жидкости;
б) выделения L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 3 из клеток штамма-продуцента Escherichia coli, получаемых на стадии а);
в) автокаталитического расщепления рекомбинантного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3 с образованием рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2.
На стадии выделения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD (SEQ ID NO 2) осуществляют отделение клеток от культуральной жидкости, дезинтеграцию клеток, выделение тел включений из полученного дезинтеграта, солюбилизацию тел включения.
Культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD, в ростовой среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 7 часов.
Индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD осуществляют через 3 часа после начала культивирования при помощи изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида.
Отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
Дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
Выделение тел включения из дезинтеграта осуществляют центрифугированием.
Выделение рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD из полученных солюбилизированных тел включения осуществляют хроматографически на металл-хелатном или на хитиновом сорбенте.
Раскрытие изобретения
Рекомбинантный белок L-HEP-HG6-CBD (SEQ ID NO 2), способный к иммобилизации и состоящий из лёгкой цепи энтеропептидазы человека L-HEP, модифицирован по 112 аминокислотному остатку, сайта связывания металл-металл-халатного носителя HG6, и сайта связывания хитинового носителя CBD.
Гибридный белок, далее обозначаемой как BL21(DE3)/L-HEP-HG6-CBD, и имеющий последовательность SEQ ID NO 3 включает в себя модифицированный сайт узнавания энтеропептидазы человека L-HEP (SEQ ID NO 4), который, как известно из уровня техники /Marine E. Gasparian, Maxim L. Bychkov, Dmitry A. Dolgikh, Mikhail P. Kirpichnikov, Strategy for improvement of enteropeptidase efficiency in tag removal processes, Protein Expression and Purification, Volume 79, Issue 2, 2011, 191-196/, повышает эффективность каталитического расщепления.
Создание экспрессионной плазмиды.
В предлагаемом изобретении создают плазмидную ДНК (плазмиду) длиной 6365 п.о., обеспечивающую экспрессию рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD в клетках Escherichia Coli, трансформированных указанной плазмидой.
Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET32b-L-HEP-HG6-CBD, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с Фигурой 1:
(а) гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);
(б) ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
(в) промотора T7 и оператора lacO;
(г) синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 5, кодирующей гибридный белок (SEQ ID NO 2), включающий в себя сайты связывания металл-хелатного носителя, сайт связывания хитиновго носителя, лёгкую цепь энтерокиназы человека L-Hep, пептид SEQ ID NO 4;
(д) гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (LacI promoter).
В вышеуказанной плазмиде, строение которой раскрыто на Фигуре 1 настоящего описания, ген AmpR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia Coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter) предназначен для его экспрессии.
Ориджин репликации бактериофага f1 /Analysis of Genes and Genomes, John Wiley & Sons, 2004, S. 140/ широко используется для создания экспрессионных векторов.
Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ ID NO 5 является полипептид последовательности SEQ ID NO 3, включающий тиоредоксин E. Coli, модифицированный сайт расщепления энтеропептидазы человека (SEQ ID NO 4), лёгкую цепь энтеропептидазы человека L-HEP, гексагистидиновый участок HG6 и участок связывания хитина CBD.
Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из ключевых генетических элементов (а) – (д), представлена на Фигуре 1.
Плазмиду согласно изобретению получают из плазмидного вектора pET-32b, описанного в предшествующем уровне техники /http://www.merckmillipore.com/RU/ru/product/pET-32b+-DNA-Novagen,EMD_BIO-69016/. Для получения плазмиды по изобретению последовательность SEQ ID NO 5, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор pET-32b по сайтам рестрикции NdeI и BamHI.
Получение штамма-продуцента Е.coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD
Штамм BL21(DE3)/L-HEP-HG6-CBD получают трансформированием клеток Escherichia Coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидой pET32b-L-HEP-HG6-CBD размером 6365 пар оснований (далее — п.о.), кодирующей гибридный белок SEQ ID NO 3, состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
(а) гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);
(б) ориджина репликации бактериофага f1;
(в) промотора T7 и оператора lacO;
(г) синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 5, кодирующей гибридный белок SEQ ID NO 3, включающий в себя сайты связывания металл-хелатного сорбента, узнавания хитина, лёгкую цепь энтерокиназы человека L-Hep, пептид SEQ ID NO 4;
(д) гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (LacI promoter).
Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм Е.Coli BL21 (DE3) /Haeyoung Jeong, Valérie Barbe, Choong Hoon Lee, David Vallenet, Dong Su Yu, Sang-Haeng Choi, Arnaud Couloux, Seung-Won Lee, Sung Ho Yoon, Laurence Cattolico, Cheol-Goo Hur, Hong-Seog Park, Béatrice Ségurens, Sun Chang Kim, Tae Kwang Oh, Richard E. Lenski, F. William Studier, Patrick Daegelen, Jihyun F. Kim, Genome Sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3), Journal of Molecular Biology, Volume 394, Issue 4, 2009, 644-652/. Экспрессионной плазмидой длиной 6365 п.о., состоящей из ключевых генетических элементов (а) – (д), расположенных друг относительно друга так, как представлено на Фигуре 1, трансформируют клетки штамма Е.Coli BL21 (DE3).
Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е.Coli BL21 (DE3) используют метод электропорации, известный из уровня техники /Tamara Kleber-Janke, Wolf-Meinhard Becker, Use of Modified BL21(DE3) Escherichia coli Cells for High-Level Expression of Recombinant Peanut Allergens Affected by Poor Codon Usage, Protein Expression and Purification, Volume 19, Issue 3,2000, 419-424/ и включенный в настоящее описание посредством ссылки. Специалисту понятно, что в других воплощениях настоящего изобретения для введения плазмиды в клетки Е.Coli BL21 (DE3) могут использоваться и другие методы трансформации, известные из уровня техники, например, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки Е.Coli BL21 (DE3) плазмиды, представленной на Фигуре 1 и состоящей из ключевых генетических элементов (а) – (д), могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.
Трансформированные клетки рассевают на чашки Петри с агаризованной средой с добавлением селекционного агента ампициллина до конечно концентрации ампициллина 50 мкг/мл клетки. Из клонов, устойчивых к ампициллину, выделяют ДНК плазмиды pET32b-L-HEP-HG6-CBD, которую анализируют путём секвенирования.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде «LB» (на 1 литр 10г пептон, 5г дрожжевого экстракта,10 г NaCl, 20 г агара) – колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Получение, выделение и очистка рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD
Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD включает культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD, полученной путем трансформации клеток Escherichia coli BL21 (DE3) раскрытой на Фигуре 1 плазмидой длиной 6365 п.о., состоящей из ключевых генетических элементов (а) – (д), на ростовой среде с получением культуральной жидкости, отделение клеток от культуральной жидкости, дезинтеграцию клеток, выделение тел включений из полученного дезинтеграта, солюбилизацию тел включения и выделение рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD из полученных солюбилизированных тел включения.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD, в ростовой среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 7 часов.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD осуществляют на 3 часе культивирования при помощи изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, выделение тел включения из дезинтеграта осуществляют центрифугированием.
Наконец, в предпочтительном воплощении, однако также без ограничения, выделение рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD из полученных солюбилизированных тел включения осуществляют хроматографически. В более предпочтительных воплощениях, но без ограничения ими, выделение рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD из солюбилизированных тел включения осуществляют на металл-хелатном хроматографическом сорбенте.
Изобретение иллюстрируют следующие рисунки:
Фигура 1. Карта плазмиды; обозначения:
f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1,
AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы),
ori - ориджин репликации colE1,
lacI - ген репрессора лактозного оперона,
T7 promoter - промотор бактериофага T7,
TrxA - ген тиоредоксина E. Coli,
L-HEP-HG6-CBD - ген рекомбинантного белка энтерокиназы человека с гексагистидиновой и хитин-связывающими последовательностями,
enterokinase site - сайт распознавания нтерокиназы человека,
T7 terminator - терминатор бактериофага T7.
Фигура 2. Электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3) /L-HEP-HG6-CBD.
Фигура 3. Электрофореграмма расщепления гибридного белка интерферона.
Дорожка геля 1: Гибридный белое интерферона.
Дорожка геля 2: Расщепление гибридного белка интерферона иммобилизованным L-HEP-HG6-CBD.
Осуществление изобретения
Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами 1 – 4.
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET32b (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 10 мМ Трис-HCl, 5 мМ MgCl2, 50 мМ ацетатат калия, 100 мМ KCl, 0.02% Triton X-100, 100 мкг/мл БСА рестриктазой BamHI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT , растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII . Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Олигонуклеотидную последовательность SEQ ID NO 5, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 3, получают полным нуклеотидным синтезом. Полученный синтетическую последовательность SEQ ID NO 5 обрабатывают в 40 мкл буфера 10 мМ Трис-HCl, 5 мМ MgCl2, 50 мМ ацетатат калия, 100 мМ KCl, 0.02% Triton X-100, 100 мкг/мл БСА рестриктазой BamHI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетический фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Описанный выше полученный синтетический фрагмент в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК лазмиды pET32b, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Помещают на лёд пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчёта одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку плазмидную ДНК, полученную в примере 1, аккуратно перемешивают содержимое легким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (42°C) на 30-45 сек. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лёд и инкубируют в течение 3—5 мин. Добавляют не менее 3-х объёмов предварительно подогретой до 37-42°C среды SOB или SOC (Becton Dickinson), перемешивают содержимое и инкубируют при 37°C в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диамтером 60 мм (Перинт).
Аликвоту полученной после обработки Т4-ДНК-лигазой реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды L-HEP-HG6-CBD. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.
Пример 2. Получение штамма-продуцента Е.coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD и характеристика его продуктивности.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в примере 1.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/ pET32b-L-HEP-HG6-CBD культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой ампициллина до конечной концентрации ампициллина 100 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерленмейера (1л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Результаты представлены на Фиг. 2. М — стандарт молекулярных масс, С - лизат клеток.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD.
После окончания культивирования по примеру 3 клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе (Elma) в буферном растворе (50 мМ Tрис/HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8) и отделяют тела включения центрифугированием (15000 g, 45 мин). Тела включения экстрагируют в буфере (50 мМ Тris pH11 8M Urea). Солюбилизированый белок наносят на металл-хелатный сорбент (Profinity IMAC, Ni-charged, Bio-Rad) и элюируют белок ступенью буферного раствора 0,250 M имидазол, 0,025 мМ Трис, 6 M мочевина, 0,1 M NaCl, pH 8 и ренатурируют при 22°С в течение 18 ч в буферном растворе 50мМ Трис, 20% глицерин, рН 10. Пробы по 40 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930.
Пример 4. Иммобилизация рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD и проверка его каталитической активности.
Иммобилизацию проводили на хитиновом носителе компании NEB.
Ренатурат очищенного L-HEP-HG6-CBD с концентрацией 1 мг/мл наносили на уравновешенный носитель буферным раствором 50 мМ Трис/HCl, 0,1 М NaCl, рН 8. Далее уравновешивали колонну буфером 50мМ Трис/HCl, 0,1 М NaCl, 2 М мочевина, рН 8. После ещё раз уравновешивали буфером 50мМ Трис/HCl, 0,1 М NaCl, рН 8.
Проверку каталитической активности проводили на гибридном белке, состоящем из тиоредоксина, сайта расщепления энтеропептидазы и интерферона. К 500 мкл буферного раствора (50мМ Трис/HCl 0,2М хлорид натрия, рН 8) с гибридным белком в концентрации 5 мг/мл добавили 40 мкл хитинового носителя с иммобилизованным L-HEP-HG6-CBD. Через 1 час реакции брали пробу, которую анализировали методом электрофореза в полиакрилаимдном геле. Эксперимент повторяли 5 раз. Результаты представлены на Фиг. 3. Расщеплению подвергается не меньше 90% гибридного белка, что свидетельствует об каталитической активности иммобилизирошванного L-HEP-HG6-CBD не менее 30000 МЕ/мг.
Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают получение рекомбинантного белка, обладающего высокой каталитической активностью, которая сохраняется на протяжении нескольких производственных циклов при иммобилизации.
Claims (24)
1. Рекомбинантный белок L-HEP-HG6-CBD (SEQ ID NO 2), включающий в себя сайты связывания металл-хелатного носителя (HG6), сайт связывания хитинового носителя (CBD), лёгкую цепь энтерокиназы человека L-Hep, обладающий протеазной активностью и уникальной субстратной специфичности легкой цепи человеческой энтеропептидазы LHEP.
2. Рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3, состоящий из модифицированного сайта расщепления L-HEP (SEQ ID NO 4), сайта связывания на металл-хелатном носителе (HG6), лёгкой цепи энтеропептидазы L-HEP, сайта связывания с хитиновым носителе (CBD), использующийся для получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по п.1
3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET32b-L-HEP-HG6-CBD для экспрессии рекомбинантного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3, имеющая длину 6365 пар оснований и состоящая из следующих ключевых генетических элементов:
а) гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);
б) ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
в) промотора T7 и оператора lacO;
г) синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 5;
д) гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (LacI promoter).
4. Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/L-HEP-HG6-CBD, продуцирующий рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pET32b-L-HEP-HG6-CBD по п.3.
5. Штамм Escherichia coli по п. 4, отличающийся тем, что получен путём трансформации клеток Escherichia coli рекомбинантной плазмидной ДНК pET32b-L-HEP-HG6-CBD по п.4.
6. Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/L-HEP-HG6-CBD по п.5, отличающийся тем, что для трансформации были взяты клетки штамма Escherichia coli BL 21(DE3).
7. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2, включающий в себя стадии:
а) культивирования клеток штамма-продуцента Escherichia coli по любому из пп.4-6 с получением культуральной жидкости;
б) выделения L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 3 из клеток штамма-продуцента Escherichia coli, получаемых на стадии а);
в) автокаталитического расщепления рекомбинантного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3 с образованием рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2.
8. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по п.7, отличающийся тем, что на стадии выделения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD (SEQ ID NO 2) осуществляют отделение клеток от культуральной жидкости, дезинтеграцию клеток, выделение тел включений из полученного дезинтеграта, солюбилизацию тел включения.
9. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из пп.7, 8, отличающийся тем, что культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEPHG6-CBD, в ростовой среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 7 часов.
10. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/L-HEP-HG6-CBD осуществляют через 3 часа после начала культивирования при помощи изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида.
11. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
12. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из пп.7-11, отличающийся тем, что дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
13. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из пп.7-12, отличающийся тем, что выделение тел включения из дезинтеграта осуществляют центрифугированием.
14. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из пп.7-13, отличающийся тем, что выделение рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD из полученных солюбилизированных тел включения осуществляют хроматографически.
15. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из п.14, отличающийся тем, что выделение осуществляют на металл-хелатном сорбенте.
16. Способ получения рекомбинантного белка L-HEP-HG6-CBD SEQ ID NO 2 по любому из п.14, отличающийся тем, что выделение осуществляют на хитиновом сорбенте.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019100017A RU2716975C1 (ru) | 2019-01-09 | 2019-01-09 | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая гибридный белок l-hep, штамм escherichia coli продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного белка |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019100017A RU2716975C1 (ru) | 2019-01-09 | 2019-01-09 | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая гибридный белок l-hep, штамм escherichia coli продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного белка |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2716975C1 true RU2716975C1 (ru) | 2020-03-17 |
Family
ID=69898586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019100017A RU2716975C1 (ru) | 2019-01-09 | 2019-01-09 | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая гибридный белок l-hep, штамм escherichia coli продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного белка |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2716975C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2495934C2 (ru) * | 2011-05-30 | 2013-10-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА |
| RU2560577C2 (ru) * | 2010-11-23 | 2015-08-20 | Аллерган, Инк. | Композиции и способы получения энтерокиназы в дрожжах |
-
2019
- 2019-01-09 RU RU2019100017A patent/RU2716975C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2560577C2 (ru) * | 2010-11-23 | 2015-08-20 | Аллерган, Инк. | Композиции и способы получения энтерокиназы в дрожжах |
| RU2495934C2 (ru) * | 2011-05-30 | 2013-10-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HUANG L. et al., Functional expression and purification of bovine enterokinase light * |
| HUANG L. et al., Functional expression and purification of bovine enterokinase light chain in recombinant Escherichia coli, Preparative biochemistry & biotechnology, 2007, Vol.37, N3, pp.205-217. * |
| MARINE E. GASPARAN et al. Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli, Protein Expression and Purification, Volume 31, Issue 1, 2003, 133-139. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1874933B1 (en) | Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein | |
| CN105543191A (zh) | 一种酯酶phe21及其编码基因和应用 | |
| Sears et al. | Engineering enzymes for bioorganic synthesis: peptide bond formation | |
| KR100888513B1 (ko) | 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법 | |
| CN106244569B (zh) | 一种酯酶EstC10及其编码基因和应用 | |
| RU2716975C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая гибридный белок l-hep, штамм escherichia coli продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного белка | |
| CN108285895A (zh) | 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用 | |
| CN107488639B (zh) | 甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用 | |
| CN105802935A (zh) | 一种酯酶phe14及其编码基因和应用 | |
| EP2643457B1 (en) | Compositions and methods of producing enterokinase in yeast | |
| CN110592037A (zh) | 一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用 | |
| CN110607289A (zh) | 一种氨基酸脱氢酶及其应用 | |
| CN112481320B (zh) | 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法 | |
| CN115851684A (zh) | 一种腈水解酶及其在蛋氨酸合成中的应用 | |
| CN113832127A (zh) | 一种限制性内切酶BamHⅠ的突变体及其应用 | |
| CN102517265A (zh) | 一种酯酶及其制备方法和应用 | |
| CN106119233B (zh) | 头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用 | |
| JP2005095001A (ja) | ヘテロマーペプチドの遺伝子工学的固定化 | |
| Li et al. | One-step Purification and Immobilization of Nucleoside Deoxyribosyltransferase for Continuous-flow Biosynthesis of 2'-deoxyadenosine. | |
| RU2789032C1 (ru) | Рекомбинантный аналог домена Б белка А BDPA-1, рекомбинантная плазмида для экспрессии белка BDPA-1, штамм-продуцент Escherichia coli, продуцирующий белок BDPA-1, способ получения белка BDPA-1 и способ получения аффинного сорбента, содержащего BDPA-1 или его фрагмент в качестве лиганда | |
| CN119265174B (zh) | 用于催化rna连接反应的固定化酶及其制备方法和应用 | |
| CN112442474B (zh) | 一种(-)γ-内酰胺的制备方法 | |
| CN103614347A (zh) | 一种嗜热酮还原酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN116064476B (zh) | 一种非限制性核酸内切酶突变体及其制备方法 | |
| CN110699345A (zh) | 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用 |