ES2709489T3 - Uso de ácidos nor-biliares en el tratamiento de arteriosclerosis - Google Patents

Abstract

Forma de dosificación oral que comprende al menos ácido nor-ursodesoxicólico y/o al menos una sal y/o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento y/o la prevención de arteriosclerosis, en la que la forma de dosificación oral comprende de 10 a 8.000 mg o de 1 a 100 mg/kg/d de al menos ácido nor-ursodesoxicólico o de al menos una sal y/o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que la forma de dosificación oral es una forma de dosificación de liberación controlada que libera al menos ácido nor-ursodesoxicólico y/o al menos una sal y/o éster farmacéuticamente aceptable del mismo sólo después de que la forma de dosificación oral haya alcanzado el estómago o el tubo digestivo.

Description

DESCRIPCION

Uso de acidos nor-biliares en el tratamiento de arteriosclerosis

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo del tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis. En particular, la invencion se refiere a acido nor-ursodesoxicolico para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis.

Antecedentes de la invencion

La aterosclerosis es una enfermedad progresiva caracterizada por la acumulacion de lfpidos, elementos fibrosos y celulas en las arterias grandes, lo que puede conducir en ultima instancia a la formacion de placas ateroscleroticas. La formacion de placas en la aterosclerosis tiene dos implicaciones. En primer lugar, las placas ateromatosas pueden a la larga romperse y conducir a estenosis de la arteria y, por tanto, a un suministro insuficiente de sangre en el organo que lo necesita. Las consecuencias pueden ser, por ejemplo, un infarto de diversos organos, de la manera mas importante del corazon (infarto de miocardio) y el cerebro (accidente cerebrovascular). En segundo lugar, el proceso de agrandamiento de la arteria, que es una respuesta a la formacion de placas, puede volverse excesivo y dar como resultado un aneurisma.

Se sabe que la aterosclerosis es un caso de un tipo de enfermedad comunmente denominada arteriosclerosis, es decir, el endurecimiento de las arterias como resultado de deposiciones de lfpidos, colageno y otros elementos fibrosos. Otro subtipo del estado general, arteriosclerosis, es la enfermedad arteriolosclerosis en la que se observa un endurecimiento de las arterias pequenas como resultado de, entre otros, deposicion de colageno, engrosamiento de la pared muscular y deposicion de protefnas.

La arteriosclerosis y particularmente la aterosclerosis son una de las principales causas de muerte, al menos en el hemisferio occidental. En Europa Occidental y los Estados Unidos, se reconoce como la enfermedad mas comun y mas letal aparte del cancer. Los mecanismos patologicos que subyacen a la arteriosclerosis y particularmente a la aterosclerosis han sido el foco de una investigacion intensa a lo largo de las ultimas decadas, y se revisan constantemente en diversas publicaciones. Pueden encontrarse descripciones generales representativas sobre la comprension actual de los mecanismos moleculares que subyacen y contribuyen a la aterosclerosis, por ejemplo, en Libby et. al. (Nature, 2002, 420, 868-874), Lusis et. al. (Nature, 2000, 407, 233-241) y Ross et. al. (New England Journal of Medicine, 1999, 340(2) 115-126).

El tratamiento y/o la prevencion de la aterosclerosis, al ser el ejemplo mas prominente de arteriosclerosis, incluyen evitar factores de riesgo ambientales y tratamientos medicos.

Los factores de riesgo tfpicos para la aterosclerosis incluyen niveles altos de colesterol en la sangre, tension arterial alta, diabetes, obesidad e inactividad ffsica.

Ademas, se ha sugerido recientemente (vease, por ejemplo, Targher G. et Arcaro G. en Atherosclerosis, 2007, 191, 235-240) que la enfermedad de hfgado graso no alcoholico (EHGNA) esta probablemente asociada con riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV) aumentado que surge de la posibilidad de que EHGNA pueda ser un mediador temprano de aterosclerosis. EHGNA esta presente en hasta un tercio de la poblacion general y en la mayorfa de los pacientes con factores de riesgo cardiometabolicos. Parece que la gravedad de la histologfa hepatica en pacientes con EHGNA esta estrechamente asociada con marcadores de aterosclerosis temprana.

Por tanto, parece que EHGNA representa otro factor de riesgo para el desarrollo de aterosclerosis.

Estos factores de riesgo pueden abordarse mediante un estilo de vida diferente, que incluye una modificacion de la dieta, un aumento de la actividad deportiva y una reduccion del consumo de tabaco.

La segunda lfnea de tratamiento para la aterosclerosis incluye el uso de medicamentos, siendo el tratamiento con estatinas el mas destacado. Las estatinas tienen como objetivo principalmente reducir los niveles elevados de colesterol en sangre y, por tanto, tienen un efecto mas bien profilactico. La mayorfa de las estatinas disponibles en la actualidad no son adecuadas, por ejemplo, para reducir las lesiones y/o placas ateroscleroticas.

Ademas, algunos de los medicamentos que se usan actualmente para el tratamiento de la aterosclerosis tienen efectos secundarios considerables.

El documento WO 2007/061820 titulado “Dissolution of arterial cholesterol plaques by a class of pharmacological compounds” se refiere, entre otros, a una sustancia farmacologica, concretamente una sal biliar o acido o precursor o derivado con propiedades emulsionantes administrada a la circulacion sistemica de un paciente por medio de una variedad de vfas de administracion incluyendo administracion oral.

Existe, por tanto, la necesidad continua de farmacos que puedan usarse en el tratamiento y/o la prevention de arteriosclerosis y particularmente de aterosclerosis.

Ademas, con respecto a la correlation de factores de riesgo (particularmente EHGNA) y aterosclerosis, existe la necesidad de farmacos que puedan usarse en el tratamiento y/o la prevention de arteriosclerosis y particularmente aterosclerosis y al mismo tiempo en el tratamiento y/o la prevention de dichos factores de riesgo (particularmente EHGNA).

Sumario de la invention

El objetivo de la presente invention es proporcionar acido nor-ursodesoxicolico y/o al menos una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de arteriosclerosis y particularmente aterosclerosis tal como se reivindica en la revindication independiente 1.

Segun la divulgation, un aspecto se refiere a al menos un acido nor-biliar y/o al menos una sal, ester y/o derivado farmaceuticamente aceptable del mismo para el tratamiento y/o la prevention de arteriosclerosis.

Segun la divulgation, un aspecto se refiere a composiciones farmaceuticas que comprende al menos un acido norbiliar y/o al menos una sal, ester y/o derivado farmaceuticamente aceptable del mismo para el tratamiento y/o la prevention de arteriosclerosis.

Segun la divulgation, un aspecto se refiere al uso de al menos un acido nor-biliar y/o al menos una sal, ester y/o derivado farmaceuticamente del mismo en la fabrication de un medicamento para el tratamiento y/o la prevention de arteriosclerosis.

Segun la divulgation, un aspecto se refiere a un metodo de tratamiento y/o prevention de arteriosclerosis en un sujeto humano o animal que comprende la etapa de administrar al menos un acido nor-biliar y/o al menos una sal, ester y/o derivado farmaceuticamente aceptable del mismo. En una realization, los acidos nor-biliares pueden tener la siguiente formula (I):

siendo R1 -OH o -H,

siendo R2 -OH o -H,

siendo R₃ - OH o -H, y

siendo R₄ - OH o -H,

en la que los grupos OH de R1 , R², R³ o R⁴ estan en conformation a o p .

Segun la divulgation en un aspecto, el acido nor-biliar se selecciona del grupo que consiste en: acido 24-nor[3a , 7a -dihidroxi-5β-colan-23-oico] (que tambien se designa acido nor-quenodesoxicolico), acido 24-nor[3a , 7p-dihidroxi-5p-colan-23-oico] (que tambien se designa acido nor-ursodesoxicolico (nor-UDCA), acido 24-nor[3a , 12a -dihidroxi-5p-colan-23-oico] (que tambien se designa acido nor-desoxicolico, acido 24-nor[3a -hidroxi-5p-colan-23-oico] (que tambien se designa acido nor-litocolico), acido 24-nor[3a , 7a , 12a -trihidroxi-5p-colan-23-oico] (que tambien se designa acido nor-colico), acido 24-nor[3a , 12p-dihidroxi-5p-colan-23-oico] y acido 24-nor[3a , 6p-dihidroxi-5p-colan-23-oico].

La numeration se basa en los numeros proporcionados para la formula (I).

Segun la invention el al menos un acido nor-biliar es acido nor-ursodesoxicolico, es decir nor-UDCA. Se considerara usar de aproximadamente 10 a aproximadamente 8.000 mg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 5.000 mg, de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.500 mg o de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 mg de al menos nor-UDCA o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo para las composiciones farmaceuticas, para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis tal como se menciono anteriormente.

El tratamiento y/o la prevencion de aterosclerosis constituyen una realizacion preferida del cuadro de la enfermedad resumido por el termino arteriosclerosis en el contexto de la presente invencion.

Una realizacion particularmente preferida de la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden nor-UDCA y/o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo para el tratamiento y/o la prevencion de aterosclerosis. Otra realizacion particularmente preferida se refiere al uso de nor-UDCA y al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de aterosclerosis.

Puede aplicarse nor-UDCA y/o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo en las cantidades mencionadas anteriormente.

Segun la invencion, se formula nor-UDCA en una forma de dosificacion oral. Se considerara usar de aproximadamente 10 a aproximadamente 8.000 mg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 5.000 mg, de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.500 mg o de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 mg de nor-UDCA o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo para las composiciones farmaceuticas para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis tal como se menciono anteriormente.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Configuracion experimental para los datos de los estudios de tratamiento descritos en el experimento 1 y tal como se muestra en las figuras 2 y 3.

Figura 2: Nor-UDCA reduce la aterosclerosis en ratones ApoE- /- en un estudio de tratamiento.

A): analisis histologico de secciones de aorta tenidas con aceite rojo de ratones ApoE -/- criados con una dieta de comida occidental (el 21% p/p de grasa, el 1,5% p/p de colesterol). B): analisis histologico de secciones de aorta tenidas con aceite rojo de ratones ApoE -/- alimentados con una dieta de comida occidental que contiene el 0,5% p/p de nor-UDCA. Las flechas indican regiones de tamano reducido de placa.

Figura 3: Nor-UDCA reduce la aterosclerosis en ratones ApoE-/ en un estudio de tratamiento, analisis morfometrico del area esclerotica en ratones ApoE -/- que se alimentaron con una dieta de comida occidental durante 8 semanas mas 4 semanas o bien sin nor-UDCA (12 semanas en total) (barra izquierda) o bien con el 0,5% p/p de nor-UDCA (barra derecha).

Figura 4: Configuracion experimental para los datos del estudio de tratamiento descrito en el ejemplo 2 y tal como se representa en la figura 5.

Figura 5: Nor-UDCA reduce la aterosclerosis en ratones LDLR-/- en un estudio de tratamiento.

A): analisis histologico (en face) en arterias de ratones LDLR-/-. La aorta de los ratones LDLR-/- se corto longitudinalmente y posteriormente se tino en face con aceite rojo. Las imagenes muestran la aorta tenida con aceite rojo en face de ratones LDLR -/- alimentados con una dieta de comida occidental. bB): muestra aortas de ratones LDLR-/ alimentados con una dieta de comida occidental y el 0,5% p/p de nor-UDCA (el aumento para el panel superior e inferior es de 40 veces). Las flechas indican regiones de tamano reducido de placa.

Figura 6: configuracion experimental para los datos de estudios de tratamiento descritos en el experimento 3 y tal como se representa en las figuras 7 a 13.

Figura 7: Nor-UDCA reduce el numero de granulocitos neutrofilos hepaticos en un estudio de tratamiento.

Parte superior: analisis inmunohistoqufmico para el numero de celulas positivas para CD11b (correspondientes a granulocitos neutrofilos) en preparaciones hepaticas; parte inferior: analisis cuantitativo de celulas positivas para CD11b en el hfgado mediante recuento de dichas celulas en 5 ratones de cada grupo.

Figura 8: Nor-UDCA reduce los niveles de p-JNK en el hfgado en un estudio de tratamiento.

Analisis de inmunotransferencia de tipo Western de diferentes homogeneizados hepaticos tal como se indica a partir de o bien ratones ApoE-/- alimentados normalmente, ratones ApoE-/- alimentados con dieta occidental, ratones ApoE-/- alimentados con dieta occidental y UDCA o ratones ApoE-/- alimentados con dieta occidental y nor-UDCA (vease tambien la figura 6) para p-JNK.

Figura 9: Nor-UDCA reduce los niveles de trigliceridos hepaticos en un estudio de tratamiento

Se determinaron los niveles de trigliceridos hepaticos para 5 ratones de cada grupo tal como se explica resumidamente en la figura 6.

Figura 10: Nor-UDCA reduce ligeramente los niveles de ALT en un estudio de tratamiento.

Se determinaron los niveles de alanina-amino-transferasa en suero para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental solo y para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental que comprende ademas nor-UDCA. Figura 11: Nor-UDCA reduce ligeramente los niveles de colesterol en suero en un estudio de tratamiento.

Se determinaron los niveles de colesterol en suero para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental solo y para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental que comprende ademas nor-UDCA.

Figura 12: Nor-UDCA reduce las placas en el arco aortico en un estudio de tratamiento.

Se tineron en face secciones longitudinales de la aorta con aceite rojo y se determino el area que comprende placas y se expreso como % de placas del area total. Se realizo el analisis para 5 ratones en cada grupo tal como se representa.

Figura 13: Nor-UDCA reduce las placas en la valvula aortica en un estudio de tratamiento. Se tineron secciones transversales de la valvula aortica con aceite rojo y se determino el area que comprende placas y se expreso como % de placas del area de superficie total. Se realizo el analisis para 5 ratones en cada grupo tal como se representa. Figura 14: configuracion experimental para los datos de estudios de prevencion descritos en el experimento 4 y tal como se representa en las figuras 15 a 20.

A: configuracion experimental; B: pesos corporales de ratones de los tres grupos diferentes a lo largo de las semanas de tratamiento.

Figura 15: Nor-UDCA reduce los niveles de trigliceridos hepaticos en un estudio de prevencion.

Parte superior: Preparaciones histologicas del hfgado de ratones de grupos tal como se indica en las que se tineron acidos grasos neutros con aceite rojo; parte inferior: se determinaron los niveles de trigliceridos hepaticos para 5 ratones de cada grupo tal como se senala en figura 14.

Figura 16: Nor-UDCA reduce los niveles de ALT en un estudio de prevencion.

Parte superior: Preparaciones histologicas del hfgado de ratones de grupos tal como se indica en las que se tineron nucleos celulares y citosol con H&E; parte inferior: se determinaron los niveles de alanina-amino-transferasa en suero para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental solamente, para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental que comprende ademas nor-UDCA y para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental que comprende ademas UDCA.

Figura 17: Nor-UDCA no parece reducir los niveles de colesterol en suero en un estudio de prevencion. Los niveles de colesterol en suero se determinaron para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental solo y para 5 ratones del grupo alimentado con dieta occidental que comprende ademas nor-UDCA.

Figura 18: Nor-UDCA reduce la cantidad de tejido adiposo blanco en un estudio de prevencion. Se determinaron los pesos de o bien el tejido adiposo marron (BAT) o bien el tejido adiposo blanco (WAT) para 5 ratones de cada grupo y se representan como peso de grasa en gramos.

Figura 19: Nor-UDCA reduce UDCA reduce las placas en la aorta en un estudio de prevencion. Se tineron en face secciones longitudinales de la aorta con aceite rojo para el grupo de control (a) y para el grupo alimentado ademas con nor-UDCA para prevencion (b). Ademas, se determino el area que comprende placas y se expreso como % de placas del area total. Se realizo el analisis para 10 ratones en cada grupo tal como se representa.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que puede usarse acido nor-ursodeoxicolico y/o sus sales y esteres farmaceuticamente aceptables para el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis. En el contexto de la presente divulgacion, debe entenderse que el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis pueden comprender el tratamiento y/o la prevencion de factores de riesgo para la arteriosclerosis y tambien particularmente aterosclerosis. En este aspecto, se prefiere el tratamiento y/o la prevencion de EHGNA como factor de riesgo.

Antes de que algunas de las realizaciones de la presente invencion se describan con mas detalle, se introducen las siguientes definiciones.

Tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas singulares de “un” y “una” tambien incluyen los respectivos plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Los terminos “sobre” y “aproximadamente” en el contexto de la presente invencion, indican generalmente un nivel o intervalo de exactitud que un experto en la tecnica entendera que todavfa garantiza el efecto tecnico de la caracterfstica en cuestion. Respecto a valores numericos, estos terminos indican normalmente una desviacion del valor numerico indicado de ±10% y preferiblemente de ±5%.

Debe entenderse que el termino “que comprende” no es limitativo. Para los fines de la presente invencion, el termino “que consiste en” se considera que es una realizacion preferida del termino “compuesto por”. Si a continuacion en el presente documento se define que un grupo comprende al menos un numero determinado de realizaciones, esto tambien significa dar a conocer un grupo, que consiste preferiblemente en estas realizaciones unicamente.

De manera similar, si en el contexto de la presente invencion, se menciona que un grupo comprende “al menos una” realizacion, tambien significa dar a conocer un grupo, que preferiblemente consiste en la unica realizacion que se menciona especfficamente.

Se proporcionaran definiciones adicionales de terminos en el contexto de las cuales se usan estos terminos.

Tal como se menciono anteriormente, la presente invencion se basa en el hallazgo de que puede usarse al menos acido nor-ursodesoxicolico y/o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo para el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis.

El termino “sal farmaceutica aceptable” tal como se usa en el presente documento, incluye sales de adicion de acido asf como sales de adicion de base.

Las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables adecuadas pueden incluir sales elaboradas a partir de acidos inorganicos tales como la sal de cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato acido, nitrato. Las sales de adicion de acido tambien pueden incluir sales de acidos organicos tales como la sal de citrato, oxalato, isonicotinato, lactato, salicilato, tartrato, oleato, fumarato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucoronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, aspartato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y parmoato.

Otros acidos organicos que incluyen clases de acidos organicos alifaticos, cicloalifaticos, aromaticos, heterocfclicos, carboxflicos y sulfonicos a partir de los cuales pueden elaborarse sales de acidos nor-biliares farmaceuticamente aceptables incluyen acido propionico, glicolico, piruvico, antranflico, mandelico, mesflico, p-hidroxibenzoico, fenilacetico, 2-hidroxietanosulfonico, algfnico, sulfanilico, estearico, p-hidroxibutfrico, ciclohexilaminosulfonico, galactarico y galacturonico y similares.

Las bases adecuadas para formacion de sales de adicion de base incluyen, pero no se limitan a, hidroxidos de metales alcalinos tales como sodio, potasio y litio; hidroxidos de metales alcalinoterreos tales como calcio y magnesio; hidroxidos de otros metales tales como aluminio y zinc, amoniaco y aminas organicas tales como mono, di o trialquilaminas no sustituidas o sustituidas con hidroxilo; diciclohexilamina; tributilamina; piridina; N-metil, N-etilamina; dietilamina, trietilamina; mono-, bis- o tris-(2-hidroxialquil inferior-aminas) tales como mono-, bis- o tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina o tris-(hidroximetil)metilamina; N,N-di-alquil inferior-N(hidroxialquil inferioraminas tales como N,N-dimetil-N(2-hidroxietil)amina o tri-(2-hidroxietil)amina y N-metil-D-glucamina. Otras bases, que pueden usarse para formar sales de adicion de base son, por ejemplo, aminoacidos tales como arginina, lisina y similares.

En el contexto de la presente invencion, el termino “esteres farmaceuticamente aceptables” son esteres no toxicos de acidos nor-biliares tal como se menciono anteriormente y preferiblemente esteres alquflicos tales como esteres metflico, etflico, propflico, isopropflico, butflico, isobutflico o pentflico, asf como esteres arflicos. La esterificacion de acidos carboxflicos tales como nor-UDCA puede realizarse mediante procedimientos, tal como se conoce comunmente en la tecnica. Los esteres tfpicos de nor-UDCA comprenden, por ejemplo, un ester acetatometflico de nor-UDCA (ID de sustancia de PubChem (SID) 10543236) o un ester trimetilsililetermetflico de nor-UDCA (SID de PubChem 10492328). La base de datos publica de PubChem puede encontrarse en http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.

El termino “derivado farmaceuticamente aceptable” se refiere a los esteres de taurina y glicina de acidos nor-biliares tales como nor-UDCA. Otros derivados de acidos nor-biliares incluyen las formas de sulfato o glucoronido de acidos nor-biliares, tales como nor-UDCA.

En el contexto de la presente invencion, las sales, esteres y/o derivados farmaceuticamente aceptables mencionados anteriormente se refieren a nor-UDCA. Nor-UDCA puede administrarse preferiblemente como acido libre.

Nor-UDCA y/o una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo puede usarse en una cantidad de 10 a 8.000 mg, de 25 a 5.000 mg, de 50 a 1.500 mg o de 250 a 500 mg.

Respecto a pacientes humanos, pueden administrarse nor-UDCA y/o sales y/o esteres farmaceuticamente aceptables del mismo a un paciente en una cantidad de aproximadamente 25 mg a 5.000 mg, preferiblemente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 2.500 mg al dfa. Un paciente humano puede tratarse en particular con de aproximadamente 800 mg a aproximadamente 1.500 mg y mas especfficamente con de aproximadamente 1.000 mg al dfa de nor-UDCA y/o sales y/o esteres farmaceuticamente aceptables del mismo.

Otro criterio adecuado para seleccionar una cantidad apropiada de nor-UDCA y/o de una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo es que pueden administrarse nor-UDCA y/o sales y/o esteres farmaceuticamente aceptables del mismo a un individuo en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/kg/d, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg/d, mas preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 mg/kg/d y en particular en una cantidad de aproximadamente 12 a aproximadamente 15 mg/kg/d.

Estas cantidades pueden administrarse de una vez o como multiples dosis (al menos 2, 3, 4, 5 o 10 dosis) al dfa. El termino “arteriosclerosis” se usa en el contexto de la presente invencion por su significado habitual, es decir, estados que implican el endurecimiento de las arterias.

Un estado especffico que se encuentra bajo la definicion comun “arteriosclerosis” es el tratamiento y/o la prevencion de arteriolosclerosis, que se refiere a estados en los que se ven afectados las arterias pequenas. El termino “arteriolosclerosis” tambien se usa tal como se aplica comunmente en la tecnica.

La invencion se refiere a la aplicacion de nor-UDCA y/o sales y esteres farmaceuticamente aceptables del mismo en el tratamiento de aterosclerosis.

El termino “aterosclerosis” se usa en el contexto de la presente invencion teniendo el mismo significado que se usa comunmente en la tecnica. Por tanto, el termino “aterosclerosis” describe la serie completa de etapas que incluyen la deposicion de lfpidos, globulos blancos tales como leucocitos, monocitos y macrofagos en arterias, lo que conduce en ultima instancia a formaciones de placas ateromatosas en las paredes de los vasos de las arterias.

Los terminos “tratamiento de arteriosclerosis” y preferiblemente “aterosclerosis” indican que puede mejorarse la arteriosclerosis y/o aterosclerosis existentes mediante la aplicacion de nor-UDCA y/o sales, esteres o derivados farmaceuticamente aceptables del mismo. Mejora en el contexto de la presente invencion puede significar que, por ejemplo, se reduce el tamano y/o la frecuencia de placas ateromatosas. Las mejoras tambien pueden referirse a una reduccion de granulocitos neutrofilos hepaticos, una reduccion de niveles de trigliceridos hepaticos, una reduccion de niveles de colesterol en suero y una reduccion de tejido adiposo blanco.

Los terminos “tratamiento de arteriosclerosis” y preferiblemente “aterosclerosis” tambien se refieren a una mejora de manifestaciones clave de los mismos tales como arteriopatfa coronaria, enfermedad cerebrovascular y enfermedad vascular periferica.

Los terminos “prevencion de arteriosclerosis” y preferiblemente “de aterosclerosis” significan que la administracion de nor-UDCA y/o sales y esteres farmaceuticamente aceptables del mismo reduce la probabilidad de desarrollo de estos estados o al menos alivia el grado y/o la frecuencia con la que estas enfermedades se desarrollan.

Los terminos “prevencion de arteriosclerosis” y preferiblemente “de aterosclerosis” tambien significan que la administracion de nor-UDCA y/o sales y esteres farmaceuticamente aceptables del mismo reduce la probabilidad de desarrollo de manifestaciones clave de los mismos tales como arteriopatfa coronaria, enfermedad cerebrovascular y enfermedad vascular periferica.

Tal como se establecio anteriormente, la divulgacion tambien se refiere al tratamiento y/o la prevencion de factores de riesgo para la arteriosclerosis. En un aspecto, la divulgacion se refiere al tratamiento y/o la prevencion de EHGNA como factor de riesgo.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere al tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis y particularmente aterosclerosis en combinacion con el tratamiento y/o la prevencion de EHGNA mediante una unica clase de compuestos, concretamente acidos nor-biliares prefiriendose nor-UDCA. Por tanto, la EHGNA y aterosclerosis pueden tratarse mediante una unica clase de compuestos, preferiblemente mediante nor-UDCA. El termino “EHGNA” se usa en el contexto de la presente divulgacion con su significado habitual, es decir, la esteatosis hepatica no alcoholica con un amplio espectro de manifestaciones y estados clfnicos y patologicos tales como obesidad abdominal, diabetes tipo 2, resistencia a la insulina, hipertension y dislipidemia.

El termino “tratamiento de EHGNA” indica que parametros de EHGNA tales como altas concentraciones de acidos grasos en el hfgado (por ejemplo, trigliceridos) o altos niveles de transaminasa en suero (por ejemplo, alaninaamino-transferasa) mejoran mediante la aplicacion de acidos nor-biliares y/o sales, esteres y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos y preferiblemente de nor-UDCA y/o sales, esteres y derivados farmaceuticamente aceptables del mismo.

El termino “prevencion de EHGNA” significa que la probabilidad de desarrollo de manifestaciones tfpicas de EHGNA tal como se establecio anteriormente se reduce mediante la administracion de acidos nor-biliares y/o sales, esteres y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos y preferiblemente de nor-UDCA y/o sales, esteres y derivados farmaceuticamente aceptables del mismo.

Con el fin de determinar si se logra una mejora en, por ejemplo, aterosclerosis o un efecto preventivo en la aterosclerosis mediante la aplicacion de nor-UDCA y/o sales y esteres farmaceuticamente aceptables del mismo, se hara una comparacion con un control que puede, por ejemplo, ser un sujeto humano para el que el diagnostico indica que no padece, por ejemplo, aterosclerosis. En una realizacion preferida, los efectos mejorados durante el tratamiento y/o el efecto preventivo mejorado se determinaran con respecto a un grupo de control que esta bajo tratamiento medico con uno de los medicamentos que se usan en la actualidad, por ejemplo, para el tratamiento de aterosclerosis tales como estatinas.

Con el fin de determinar, por ejemplo, si se ha visto afectada la formacion de placas en la aterosclerosis mediante la aplicacion de nor-UDCA y/o sales y esteres farmaceuticamente aceptables del mismo, uno puede basarse en los metodos de diagnostico comunes conocidos en la tecnica, tales como por ejemplo examenes histopatologicos. Los medicamentos o formas de dosificacion farmaceuticas que comprenden al menos nor-UDCA y o al menos una sal y ester farmaceuticamente aceptables del mismo se formulan para aplicacion oral.

Las formas de dosificacion farmaceuticas pueden ser formas de dosificacion solidas o lfquidas o pueden tener un caracter intermedio, por ejemplo, de tipo gel segun la via de administracion y otros objetivos.

Segun la invencion, se usan formas de dosificacion oral, en las que la forma de dosificacion oral es una forma de dosificacion de liberacion controlada que libera al menos nor-UDCA y/o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo solo despues de que la forma de dosificacion oral haya alcanzado el estomago o el tubo digestivo. Se usan formas de dosificacion orales en vista de la aceptacion global de los pacientes de este tipo de formas de dosificacion.

Las formas de dosificacion orales pueden ser lfquidas o solidas.

Las formas de dosificacion orales solidas pueden incluir, por ejemplo comprimidos, trociscos, pastillas, capsulas, polvos y granulos.

En una realizacion, las formas de dosificacion orales pueden formularse para garantizar una liberacion controlada de nor-UDCA y/o sus sales, esteres y/o derivados farmaceuticamente aceptables. Tales formas de dosificacion pueden, por tanto, designarse como formas de dosificacion farmaceuticas de liberacion controlada (LC).

El termino “forma de dosificacion de liberacion controlada” en el contexto de la presente invencion se usa para resaltar que una forma de dosificacion farmaceutica no es una forma de dosificacion farmaceutica de liberacion inmediata (LI). Una forma de dosificacion farmaceutica de liberacion oral inmediata liberara normalmente de manera sustancial todo del al menos un acido nor-biliar y/o sus sales, esteres y/o derivado farmaceuticamente aceptables del mismo en el plazo de un corto periodo de tiempo tras la administracion. Normalmente, una forma de dosificacion de LI habra liberado el 70% en peso de los agentes farmaceuticamente activos en el plazo de treinta minutos de la administracion. Estas tasas de liberacion pueden determinarse usando el metodo de paletas de la Farmacopea Europea.

Una forma de dosificacion de liberacion controlada puede designar una forma de dosificacion farmaceutica que libera el agente activo solo despues de que la forma de dosificacion haya alcanzado un determinado sitio del cuerpo, es decir el estomago o el tubo digestivo. Adicional o alternativamente, puede designarse una forma de dosificacion, que libera el agente activo a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. En este ultimo caso, una forma de dosificacion de liberacion controlada puede designarse como una forma de dosificacion de liberacion sostenida. Puede, por ejemplo, lograrse una liberacion controlada especffica de sitio del agente farmaceuticamente activo, siendo en el caso presente nor-UDCA o sales, esteres y/o derivados farmaceuticamente aceptables del mismo, en la que la liberacion se hace dependiente del valor de pH de los lfquidos que la forma de dosificacion se encuentra cuando pasa a traves del cuerpo humano. Una liberacion dependiente del pH de este tipo puede permitir que una forma de dosificacion libere el agente activo no en el estomago, sino solo en el tubo digestivo. Otro aspecto serfa que una forma de dosificacion de liberacion controlada de este tipo libera el agente activo una vez entra en el cuerpo. Un ejemplo tfpico de forma de dosificacion de liberacion controlada que libera de manera independiente del pH el agente activo son formas de dosificacion que comprenden un recubrimiento enterico.

El termino “liberacion sostenida”, en cambio, se refiere a la liberacion de los compuestos farmaceuticamente activos de la forma de dosificacion a lo largo de un periodo de tiempo prolongado pero no necesariamente a la liberacion en un sitio definido. En general, liberacion sostenida en el contexto de la presente invencion significa que un agente farmaceuticamente activo tal como nor-UDCA y sus sales, esteres y/o derivados farmaceuticamente aceptables se liberan de la forma de dosificacion farmaceutica a lo largo de un periodo de tiempo de al menos 2 horas. Por supuesto, la liberacion del agente farmaceuticamente activo de la forma de dosificacion puede tener lugar a lo largo de periodos de tiempo de al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 10 horas, al menos 12 horas o al menos 14 horas.

Las caracterfsticas de liberacion sostenida de una forma de dosificacion pueden adaptarse de modo que se logra un efecto terapeutico durante al menos 8 horas, durante al menos 12 horas o durante al menos 24 horas. Tales formas de dosificacion farmaceuticas tienen la ventaja de que pueden administrarse en una base de 3 veces, 2 veces o una vez al dfa al paciente.

Por supuesto, los principios anteriores pueden combinarse. Por ejemplo, una forma de dosificacion farmaceutica puede comprender un recubrimiento enterico con el fin de garantizar que el agente activo se libera solo en el tubo digestivo. La liberacion durante el paso gastrointestinal puede, sin embargo, presentar las caracterfsticas de liberacion sostenida.

Segun la divulgacion, pueden combinarse adicional y/o alternativamente los principios de liberacion inmediata y liberacion sostenida. Por tanto, segun la divulgacion, una forma de dosificacion puede comprender una fase de liberacion inmediata que garantiza un rapido comienzo de la accion terapeutica que entonces se prolonga por una segunda fase de la forma de dosificacion farmaceutica garantizando las caracterfsticas de liberacion sostenida. Pueden lograrse las caracterfsticas de liberacion sostenida mediante diferentes enfoques de formulacion. Por ejemplo, una forma de dosificacion farmaceutica puede comprender una matriz de liberacion sostenida en la que el agente farmaceuticamente activo tal como nor-UDCA se incrusta con el fin de lograr las propiedades de liberacion sostenida de la forma de dosificacion.

En otra realizacion, puede usarse un recubrimiento de liberacion sostenida para garantizar las caracterfsticas de liberacion sostenida de la forma de dosificacion. En tal caso, el agente farmaceuticamente activo tal como nor-UDCA puede aplicarse sobre/o dentro de, por ejemplo, un portador, que no tiene influencia sustancial sobre la liberacion del agente activo. Este portador cargado con farmaco puede entonces recubrirse por encima con un recubrimiento de liberacion sostenida correspondiente.

Estos enfoques para lograr la liberacion sostenida de un agente farmaceuticamente activo, es decir, uso de una matriz o un recubrimiento, pueden, por supuesto, combinarse. El experto en la tecnica es consciente ademas de otros enfoques tecnicos para lograr una liberacion sostenida de la forma de dosificacion que incluyen, por ejemplo, formas de dosificacion sostenida impulsadas de manera osmotica.

Normalmente, si se usa un sistema de matriz de liberacion sostenida, el agente farmaceuticamente activo tal como nor-UDCA se dispersara por todo un material formador de matriz. Los materiales formadores de matriz pueden escogerse para lograr una matriz erosiva, una matriz de difusion o un sistema de matriz, que combina las caracterfsticas de una matriz erosiva y una de difusion. Los materiales adecuados para su inclusion en una matriz de liberacion sostenida incluyen polfmeros hidrofilos o hidrofobos incluyendo eteres de celulosa y preferiblemente alquilcelulosas e hidroxilalquilcelulosas asf como resinas acrflicas. Otros materiales que pueden usarse en una matriz de liberacion sostenida pueden ser alcoholes grasos, acidos grasos o polietilenglicoles. El experto en la tecnica sera consciente de como construir tales formas de dosificacion farmaceuticas.

En general, las formas de dosificacion solidas comprenderan diversos excipientes farmaceuticos aceptables que se seleccionaran segun que funcionalidad va a lograrse para la forma de dosificacion. Los excipientes farmaceuticamente aceptables tfpicos incluyen sustancias como sacarosa, manitol, sorbitol, almidon y derivados de almidon, lactosa y agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, agentes disgregantes y tamponantes. En el caso de que se consideren formas de dosificacion lfquidas para la presente invencion, estas pueden incluir emulsiones, disoluciones, suspensiones y jarabes farmaceuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes usados comunmente en la tecnica tales como agua. Estas formas de dosificacion pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina para conferir volumen, acido algfnico o alginato de sodio como agente de suspension, metilcelulosa como potenciador de la viscosidad y agentes edulcorantes/aromatizantes.

Los excipientes convencionales adicionales, que pueden usarse en las formas de dosificacion mencionadas anteriormente segun la funcionalidad que va a lograrse para la forma de dosificacion, incluyen sustancias portadoras organicas o inorganicas farmaceuticamente aceptables que no reaccionan con el compuesto activo. Los portadores farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, agua, disoluciones de sal, alcohol, aceites, preferiblemente aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, tensioactivos, aceite de perfume, monogliceridos y digliceridos de acidos grasos, esteres de acidos grasos de petroetral, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares. Las preparaciones farmaceuticas pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, como lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presion osmotica, tampones, colorantes, sustancias, aromatizantes y/o aromaticas y similares que no reaccionan de manera perjudicial con los compuestos activos. Para aplicacion parenteral, los vehfculos particularmente adecuados consisten en disoluciones, preferiblemente disoluciones oleosas u acuosas, asf como suspensiones, emulsiones o implantes.

El experto en la tecnica es consciente de que la biodisponibilidad de nor-UDCA, sales y/o esteres farmaceuticamente aceptables del mismo puede potenciarse mediante micronizacion de las formulaciones y los compuestos activos usando tecnicas convencionales tales como trituracion, molienda y secado por pulverizacion en presencia de excipientes o agentes adecuados tales como fosfolfpidos o tensioactivos.

Las composiciones farmaceuticas segun la presente invencion pueden no solo comprender nor-UDCA y/o sales y/o esteres farmaceuticamente aceptables del mismo sino tambien agentes farmaceuticamente activos que se sabe que tienen un efecto positivo sobre el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis y preferiblemente de aterosclerosis. Estos agentes farmaceuticamente activos adicionales incluyen, por ejemplo, estatinas asf como glitazonas y acido acetico acetflico.

Ademas, dado que las composiciones farmaceuticas segun la divulgacion, siendo nor-UDCA un representante preferido de las mismas y/o sales y/o esteres farmaceuticamente aceptables del mismo tienen un efecto positivo sobre EHGNA, tambien pueden usarse en combinacion con agentes farmaceuticamente activos que por un lado se sabe que tienen un efecto positivo sobre el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis y preferiblemente de aterosclerosis pero, por otro lado, tambien se sabe que inducen esteatosis del hfgado, tales como por ejemplo antagonistas de LXR o similares.

Sin embargo, tal como se establecio anteriormente, las composiciones farmaceuticas segun la divulgacion, siendo nor-UDCA un representante preferido de las mismas y/o sales y/o esteres farmaceuticamente aceptables del mismo tambien pueden usarse como unico agente activo que tiene un efecto positivo sobre el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis y preferiblemente de aterosclerosis por un lado, y sobre el tratamiento y/o la prevencion de EHGNA por el otro.

Una composicion farmaceutica que comprende al menos nor-UDCA y/o sales, esteres y/o derivados farmaceuticamente aceptables del mismo puede usarse especialmente para el tratamiento y/o la prevencion de aterosclerosis al menos inhibiendo parcialmente y/o revirtiendo parcialmente de manera activa una formacion de placa.

Realizaciones adicionales preferidas de la divulgacion se refieren al:

1. Uso de al menos acido nor-ursodesoxicolico y/o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis.

2. Uso segun 1, en el que el medicamento se usa para el tratamiento y/o la prevencion de arteriolosclerosis y/o preferiblemente de aterosclerosis.

3. Uso segun 1 o 2, en el que se usa al menos acido nor-ursodesoxicolico o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo.

4. Uso segun 3, en el que el medicamento comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz de al menos acido nor-ursodesoxicolico o al menos una sal, ester y/o derivado farmaceuticamente aceptable del mismo y opcionalmente al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.

5. Uso segun 4, en el que el medicamento comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 8.000 mg, preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 5.000 mg, mas preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.500 mg y lo mas preferiblemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 mg de al menos acido nor-ursodesoxicolico o de al menos una sal, ester y/o derivado farmaceuticamente aceptable del mismo.

La presente invencion se ilustrara ahora con respecto a ejemplos que, sin embargo, no han de interpretarse como limitativos.

Experimento 1 - Tratamiento de ratones ApoE-/- con nor-UDCA

Con el fin de estudiar los efectos de nor-UDCA sobre la aterosclerosis, se trataron ratones deficientes en ApoE. Para este fin, ratones ApoE-/- tal como se describe en Piedrahita et. al. (PNAS, 1992, 89, 4471-4475) que llevan la mutacion Apoetm1Unc se sometieron a retrocruzamiento 10 veces en C57BL76J. Tambien pueden obtenerse ratones deficientes en ApoE del Jackson Laboratory (Maine, EE.UU.) con el nombre de cepa B6.129P2.-Apoetm1Unc/J(http://jaxmice.jax.org).

Se alimentaron ratones ApoE-/- (n = 10) con dieta normal durante 8 semanas tras el nacimiento, seguido por dieta de comida occidental durante otras 8 semanas. La dieta de comida occidental consiste en el 21% en peso de grasa, el 1,5% en peso de colesterol y acido no colico (“dieta alta en grasas”).

Este tipo de dieta de comida occidental se sabe que fuerza la formacion de placas ateroscleroticas en la lfnea temporal indicada en ratones ApoE-/-. Tras ocho semanas de alimentacion con dieta de comida occidental, los ratones se segregaron en dos grupos comprendiendo cada grupo cinco ratones. En el grupo de control A, los ratones se alimentaron adicionalmente con la dieta de comida occidental durante cuatro semanas adicionales. En el otro grupo B, los ratones ApoE-/- se alimentaron con una dieta de comida occidental que comprendfa el 0,5% p/p de nor-UDCA durante cuatro semanas adicionales. Considerando una ingesta de alimento de 4 g/dfa de comida por raton, esto corresponde a 20 mg/dfa de nor-UDCA por raton.

La configuracion experimental se representa en la figura 1.

Posteriormente estos ratones se analizaron 20 semanas tras el nacimiento mediante diferentes medios tal como se muestra en las figuras 2 y 3.

La figura 2 muestra un analisis histologico. Se representan vistas en seccion transversal de secciones de aorta tenidas con aceite rojo en ratones ApoE-/-. Puede observarse claramente el desarrollo de placas arterioscleroticas en ratones de control (A) mientras que los ratones alimentados con nor-UDCA muestran un grado significativamente reducido de estas placas (B).

La figura 3 representa entonces un analisis morfometrico en el que se determina el area esclerotica frente al area de la aorta. Puede observarse claramente que el area esclerotica es significativamente menor en los ratones ApoE-/-con nor-UDCA (grupo B). El numero de ratones analizado fue de 5 para cada grupo.

Experimento 2 - Tratamiento de ratones LDLR-/- con nor-UDCA

En un segundo experimento (figura 4 y 5), se investigo el efecto de nor-UDCA en ratones LDLR -/- que se criaron con una dieta de comida occidental.

Como los ratones deficientes en ApoE, los ratones deficientes en LDLR se consideran un modelo animal genuino de desarrollo de aterosclerosis. Si estos ratones se crfan con una dieta occidental, evolucionan a los sfntomas tfpicos de la aterosclerosis que implica la formacion de placas ateroscleroticas en la aorta (figura 5).

Se produjeron ratones LDLR-/- tal como se describe en Ishebashi et. al. (J. Clin. Jnnvest., 1993, 92, 883-893). Se uso la lfnea celular AB1 ES derivada de 129. La cepa se sometio a retrocruzamiento con ratones C57BL/6J durante 10 generaciones. Ld 1 rtm1 Her/Ld 1 rtm1 Her implica: 129S7/SvEvBrd * C57BL/6. Tambien pueden obtenerse ratones deficientes en LDLR del Jackson Laboratory (Maine, EE.UU.) con el nombre de cepa B6.129S7-Ldblr>m1Her/J (http://jaxmice.jax.org).

Como en el experimento 1, se criaron diez ratones deficientes en LDLR con dieta normal durante las 8 primeras semanas tras el nacimiento seguido por la dieta de comida occidental durante otras ocho semanas.

Despues de eso, los diez ratones se separaron en dos grupos para los cuales el grupo de control A recibio alimentacion adicional con una dieta de comida occidental durante 4 semanas. En el grupo de prueba B, la dieta de comida occidental de las 4 semanas siguientes se complemento con el 0,5% p/p de nor-UDCA. Considerando una ingesta de alimento de 4 g/dfa de comida por raton, esto corresponde a 20 mg/dfa de nor-UDCA por raton.

El diseno del estudio se representa en la figura 4.

Posteriormente, estos ratones se analizaron 20 semanas tras el nacimiento tal como se muestra en la figura 5: Se realizo un analisis histologico de la aorta de ratones LDLR-/-. Para este fin, se tino una seccion longitudinal en face de la aorta con aceite rojo. A partir de la figura 5, puede observarse claramente que el grado y el tamano de la placa aterosclerotica se reduce significativamente en los ratones del grupo B.

Puede observarse claramente a partir de los experimentos 1 y 2 que nor-UDCA reduce el tamano de placas ateroscleroticas en modelos animales, que se considera que son representantes genuinos del desarrollo aterosclerotico.

Experimento 3 - Tratamiento de ratones ApoE-/- con nor-UDCA en comparacion con UDCA

Se usaron ratones deficientes en ApoE tal como se describe en el experimento 1.

Se alimentaron ratones ApoE-/- (n = 15) con dieta normal durante 8 semanas tras el nacimiento, seguido por dieta de comida occidental (“dieta alta en grasas”) durante otras 8 semanas. Los ratones se segregaron entonces en tres grupos comprendiendo cada grupo cinco ratones. En el grupo de control, los ratones se alimentaron adicionalmente con la dieta de comida occidental durante cuatro semanas adicionales. En el segundo grupo, los ratones ApoE-/- se alimentaron con una dieta de comida occidental que comprendfa el 0,5% p/p de nor-UDCA durante cuatro semanas adicionales. Finalmente, en el tercer grupo, los ratones ApoE-/- se alimentaron con una dieta de comida occidental que comprendfa el 0,5% p/p de UDCA durante cuatro semanas adicionales. Considerando una ingesta de alimento de 4 g/dfa de comida por raton, esto corresponde a 20 mg/dfa de nor-UDCA o UDCA, respectivamente, por raton.

La configuracion experimental se representa en la figura 6.

Posteriormente estos ratones se analizaron 20 semanas tras el nacimiento mediante diferentes medios tal como se muestra en las figuras 7 a 13.

La figura 7 muestra el efecto de o bien UDCA o bien nor-UDCA sobre el numero de granulocitos neutrofilos hepaticos. Dichas celulas son indicativas de una inflamacion en el hfgado y, por tanto, de la presencia de senales inflamatorias en general. En la parte superior de la figura 7, se muestra un analisis inmunohistoqufmico de tejido hepatico de los tres grupos diferentes a-c. En cada caso, se incubaron en primer lugar preparaciones de tejido hepatico con un anticuerpo especffico para el antfgeno de superficie CD11b, que esta presente en la superficie de granulocitos neutrofilos solo. Tras dicha incubacion, se detecto el anticuerpo anti-CD11b con un conjugado de anticuerpo secundario, lo que da como resultado la tincion de celulas positivas para CD11b (veanse las flechas). Claramente, el numero de granulocitos neutrofilos hepaticos se reduce en ratones alimentados con nor-UDCA (c). Debajo de las tinciones, se muestra un analisis cuantitativo. Para este fin, se analizaron preparaciones hepaticas tenidas con CD11b de 5 ratones de cada grupo: En cada preparacion, se contaron celulas positivas para CD11b en 30 areas diferentes de la preparacion usando un microscopio con un aumento de x20. Entonces se calculo el promedio del numero de celulas para una unica area en cada preparacion y posteriormente para una unica area de las 5 preparaciones / grupo. De nuevo, el numero de granulocitos neutrofilos hepaticos esta claramente reducido en ratones alimentados con nor-UDCA. Por tanto, nor-UDCA presenta un efecto antiinflamatorio.

La figura 8 muestra un analisis del nivel de expresion de p-JNK en tejido hepatico. El nivel de expresion de la p-JNK-cinasa es indicativo de la presencia de senales inflamatorias puesto que p-JNK es parte de la senalizacion inflamatoria en celulas. Para este fin, se homogeneizo una cantidad identica de tejido hepatico de tres ratones (correspondientes a diferentes carriles en el WB) de o bien ratones alimentados normalmente deficientes en ApoE (ApoE) o bien de los tres grupos tal como se senalo anteriormente (ApoE WD, ApoE WD UDCA, ApoE WD nor-UDCA) y se prepararon lisados celulares segun metodos convencionales. Se normalizaron dichos lisados para la cantidad de protefna presente segun metodos convencionales. Entonces se analizaron fracciones que contenfan cantidades identicas de protefna mediante tecnicas de inmunotransferencia de tipo Western convencionales (desnaturalizacion de las muestras anadiendo tampon SDS y sometiendo a ebullicion seguido por SDS-PAGE y transferencia a una membrana; analisis cuantitativo de las protefnas unidas a la membrana mediante incubacion con un primer anticuerpo (anti-p-JNK 1/2) y un segundo anticuerpo (dirigido contra el primer anticuerpo, usado como conjugado) seguido por deteccion quimioluminiscente del conjugado del segundo anticuerpo) para determinar la cantidad de p-JNK. Claramente, nor-UDCA puede regular por disminucion la expresion de p-JNK (para niveles “normales”, vease control de ApoE en los carriles de la izquierda) a diferencia de UDCA.

La figura 9 muestra los niveles de trigliceridos hepaticos de las tres poblaciones diferentes. Para cada poblacion, se analizaron 5 ratones y los valores representados representan las cantidades de trigliceridos promediadas. Se homogeneizo una cantidad identica de tejido hepatico de cada raton y se determino la cantidad de trigliceridos presente en cada homogeneizado mediante metodos convencionales. Claramente, nor-UDCA puede reducir significativamente la cantidad de trigliceridos en el hfgado en comparacion con el control o con los ratones tratados con UDCA.

La figura 10 muestra los niveles de transaminasa en suero (en este caso alanina-amino-transferasa) como indicadores del estado de celulas hepaticas (cuantas mas celulas hepaticas mueran, mayores seran los niveles de transaminasa en suero). Para este fin, se determino la actividad de la alanina-amino-transferasa presente en un volumen definido de una muestra de sangre mediante metodos de laboratorio de diagnostico convencionales y se proporciono como actividad enzimatica de unidades/litro. Se usaron 5 ratones o bien en el control o bien la poblacion tratada con nor-UDCA y los valores representados representan las actividades de ALT promediadas.

Nor-UDCA muestra una tendencia de reduccion de los niveles de transaminasa en suero en comparacion con el control y, por tanto, parece tener un impacto positivo sobre celulas hepaticas.

La figura 11 muestra los niveles totales de colesterol en suero. Para este fin, se determino la cantidad de colesterol en suero en un volumen definido de una muestra de sangre mediante metodos de laboratorio de diagnostico convencionales y se muestra en mg/dl. Se usaron 5 ratones o bien en el control o bien la poblacion tratada con nor-UDCA y los valores representados representan las cantidades de colesterol promediadas. Nor-UDCA parece poder reducir el colesterol total en comparacion con el control. Los efectos positivos de nor-UDCA sobre la aterosclerosis, sin embargo, parecen ser principalmente independientes de los niveles de colesterol en suero globales.

La figura 12 representa un analisis cuantitativo en el que se determina el area que comprende placas frente al area total en el arco aortico. Para este fin, se realizo un analisis histologico seguido por una cuantificacion. En primer lugar, se tino en face una seccion longitudinal de la aorta con aceite rojo (en cada grupo para 5 ratones). En una segunda etapa, se determino el area que comprendfa placas y, usando el area total, se expreso dicha area de placas en % de placas en el arco aortico (los valores representados representan los recuentos o porcentaje promediados, respectivamente, para 5 ratones en cada grupo). Nor-UDCA parece ser tan eficaz como UDCA disminuyendo ambas sustancias el porcentaje de placas.

La figura 13 muestra un analisis histologico (parte superior). Se representan vistas en seccion transversal de valvulas aorticas tenidas con aceite rojo preparadas a partir de ratones tal como se indico. Claramente, la cantidad de placas se reduce tanto en los ratones tratados con UDCA como los tratados con nor-UDCA. Coherente con este resultado, tambien una cuantificacion del area de placas frente al area de superficie total (expresada como placas en % del area de superficie) muestra una reduccion significativa de dicho % de placas en ratones tratados con nor-UDCA. Se usaron 5 muestras de cada poblacion para dicha cuantificacion.

Resumiendo los datos obtenidos en los estudios de tratamientos tal como se senalo anteriormente, nor-UDCA da como resultado

1. una reduccion del numero, el grado y el tamano de placas ateroscleroticas, lo mas probablemente por medio de un efecto directo sobre las placas (y macrofagos, respectivamente) y no por medio de una reduccion de los niveles de colesterol en suero

1. una reduccion de los niveles de trigliceridos hepaticos y transaminasa en suero

2. una reduccion de senales inflamatorias y de celulas inducidas por tales senales inflamatorias en el hfgado.

Por tanto, nor-UDCA reduce las placas ateroscleroticas, tiene efectos positivos sobre el hfgado graso no alcoholico durante el tratamiento de la aterosclerosis y actua como antiinflamatorio.

Experimento 4 -Prevencion de aterosclerosis en ratones ApoE-/- mediante nor-UDCA en comparacion con UDCA

Se usaron ratones deficientes en ApoE tal como se describe en el experimento 1.

Se alimentaron ratones ApoE-/- (n = 15) con dieta normal durante 8 semanas tras el nacimiento y despues se segregaron en tres grupos comprendiendo cada grupo cinco ratones. En el grupo de control, los ratones se alimentaron con la dieta de comida occidental durante 12 semanas adicionales. En el segundo grupo, los ratones ApoE-/- se alimentaron con una dieta de comida occidental que comprendfa el 0,5% p/p de nor-UDCA durante 12 semanas adicionales. Finalmente, en el tercer grupo, los ratones ApoE-/- se alimentaron con una dieta de comida occidental que comprendfa el 0,5% de p/p UDCA durante 12 semanas adicionales. Considerando una ingesta de alimento de 4 g/dfa de comida por raton, esto corresponde a 20 mg/dfa de nor-UDCA o UDCA, respectivamente, por raton.

Por tanto, en esta configuracion de prevencion experimental, los ratones se alimentan con dieta que se sabe que fuerza la formacion de placas ateroscleroticas junto con o bien UDCA o bien nor-UDCA (ratones del segundo y tercer grupo) que tienen efectos preventivos sobre la formacion de placas. Cuando se comparan con un control alimentado con dieta de comida occidental solo, pueden estudiarse los efectos preventivos.

La configuracion experimental se representa en la figura 14 (a).

La figura 14(b) representa los pesos corporales de los animales de los tres grupos (5 por grupo con grupos tal como se indica en (a)) a lo largo de un periodo del tratamiento tal como se indica. Ninguna de las terapias tal como se represento en a) tuvo una influencia significativa sobre los pesos corporales de los ratones puesto que los pesos corporales no varfan significativamente entre los grupos. Por tanto, todos los efectos mostrados a continuacion no pueden atribuirse a los pesos corporales de los animales.

Posteriormente estos ratones se analizaron 20 semanas tras el nacimiento mediante diferentes medios tal como se muestra en las figuras 15 a 20.

La figura 15 muestra los niveles de trigliceridos hepaticos para las tres poblaciones diferentes. Las figuras a)-c) son preparaciones histologicas del hfgado en las que se tineron acidos grasos neutros (principalmente trigliceridos) con aceite rojo. Claramente, las cantidades de trigliceridos hepaticos se reducen en la preparacion c) de un raton alimentado con nor-UDCA adicional. En la cuantificacion d) debajo de las preparaciones, se analizaron 10 ratones de cada grupo y los valores representados representan las cantidades de trigliceridos promediadas. Se homogeneizo una cantidad identica de tejido hepatico de cada raton y se determino la cantidad de trigliceridos presente en cada homogeneizado mediante metodos convencionales. Claramente, nor-UDCA puede reducir significativamente la cantidad de trigliceridos en el hfgado en comparacion con el control o con los ratones tratados con UDCA.

La figura 16 muestra una tincion de celulas hepaticas en general (a) - c)) y los niveles de transaminasa en suero (en este caso alanina-amino-transferasa) como indicadores del estado de celulas hepaticas (cuantas mas celulas hepaticas mueran, mayores seran los niveles de transaminasa en suero) en d). Las figuras a)- c) son preparaciones histologicas del hfgado en las que se tinen celulas con tincion de hematoxilina y eosina.

Ademas, se determino la actividad de la alanina-amino-transferasa presente en un volumen definido de una muestra de sangre mediante metodos de laboratorio de diagnostico convencionales y se proporciona como actividad enzimatica de unidades/litro (d). Se usaron 5 ratones o bien en el control, la poblacion tratada con UDCA o la tratada con nor-UDCA y los valores representados representan las actividades de ALT promediadas. Nor-UDCA reduce significativamente los niveles de transaminasa en suero en comparacion con el control y UDCA y, por tanto, parece tener un impacto positivo sobre las celulas hepaticas. Este resultado esta claramente respaldado por el aspecto general de las celulas hepaticas tenidas con H&E de la figura c).

La figura 17 muestra los niveles totales de colesterol en suero. Para este fin, se determino la cantidad de colesterol en suero en un volumen definido de una muestra de sangre mediante metodos de laboratorio de diagnostico convencionales y se muestra en mg/dl. Se usaron 5 ratones o bien en el control o bien en la poblacion tratada con nor-UDCA y los valores representados representan las cantidades de colesterol promediadas. Los efectos positivos de nor-UDCA sobre la aterosclerosis parecen ser independientes de los niveles globales de colesterol en suero. La figura 18 muestra la influencia de nor-UDCA frente a control y UDCA sobre el peso de tejido adiposo blanco y marron de los ratones. Para este fin, se determino el peso del tejido adiposo correspondiente de cada raton. Se usaron 5 ratones por grupo y se calculo el promedio de los datos obtenidos con respecto a dicha poblacion. Claramente, ni UDC^a ni nor-UDCA tuvieron una influencia sobre el peso del tejido adiposo marron. Nor-UDCA, sin embargo, mostro una fuerte reduccion de la cantidad de tejido adiposo blanco en comparacion con el control o los ratones tratados con UDCA. Por tanto, nor-UDCA tiene un efecto positivo sobre la reduccion de la cantidad de tejido adiposo blanco.

En la figura 19, se muestra un analisis histologico de la aorta en las dos preparaciones en la parte superior. Para este analisis, se tino en face una seccion longitudinal de la aorta con aceite rojo para placas de lfpidos. Al comparar dichas dos preparaciones, puede observarse claramente que el grado y el tamano de placas ateroscleroticas se reduce significativamente en el raton que se alimenta con nor-UDCA adicional (b). La figura 20 entonces representa un analisis morfometrico en el que el area esclerotica frente al area de aorta total se determina en las preparaciones segun la figura 19. En cada grupo, se analizaron 10 ratones y cada punto en la mancha del control o los ratones alimentados con “nor-UDCA complementado” se corresponde con el resultado para un raton. Puede observarse claramente que el area esclerotica es significativamente menor en los ratones ApoE-/- alimentados con nor-UDCA. Resumiendo los datos obtenidos en los estudios de prevencion tal como se senalo anteriormente, nor-UDCA da como resultado

1. una reduccion del numero, el grado y el tamano de placas ateroscleroticas, lo mas probablemente por medio de un efecto directo sobre las placas (y macrofagos, respectivamente) y no por medio de una reduccion de niveles de colesterol en suero

2. una reduccion de niveles de trigliceridos hepaticos y transaminasa en suero asf como en la cantidad de tejido adiposo blanco

Por tanto, nor-UDCA reduce las placas ateroscleroticas y tiene efectos positivos sobre el hfgado graso no alcoholico durante la prevencion de la aterosclerosis.

Resumiendo los datos obtenidos en los estudios de tratamiento y prevencion, parece que nor-UDCA ejerce sus efectos positivos mediante un efecto directo sobre los macrofagos, lo que da como resultado un aumento de la exportacion de colesterol a partir de los macrofagos en el suero y, por tanto, una reduccion de placas (puesto que los macrofagos son “parte de” las placas en forma de celulas espumosas) y mediante un efecto positivo sobre las enzimas hepaticas responsables de metabolizar colesterol en suero transportado de manera inversa dando como resultado un mayor metabolismo del colesterol en el hfgado mejorando, por tanto, el hfgado graso no alcoholico.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Forma de dosificacion oral que comprende al menos acido nor-ursodesoxicolico y/o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de arteriosclerosis, en la que la forma de dosificacion oral comprende de 10 a 8.000 mg o de 1 a 100 mg/kg/d de al menos acido nor-ursodesoxicolico o de al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que la forma de dosificacion oral es una forma de dosificacion de liberacion controlada que libera al menos acido nor-ursodesoxicolico y/o al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo solo despues de que la forma de dosificacion oral haya alcanzado el estomago o el tubo digestivo.

2. Forma de dosificacion oral para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la forma de dosificacion oral comprende ademas al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.

3. Forma de dosificacion oral para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la forma de dosificacion oral comprende de aproximadamente 25 a aproximadamente 5.000 mg, preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.500 mg y mas preferiblemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 mg de al menos acido nor-ursodesoxicolico o de al menos una sal y/o ester farmaceuticamente aceptable del mismo.

4. Forma de dosificacion oral para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la forma de dosificacion oral se usa para el tratamiento y/o la prevencion de arteriolosclerosis y/o preferiblemente de aterosclerosis.