ES2708823T3

ES2708823T3 - Variantes de SAP y su uso

Info

Publication number: ES2708823T3
Application number: ES15181052T
Authority: ES
Inventors: W Willett
Original assignee: Promedior Inc
Current assignee: Promedior Inc
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2010-06-17
Publication date: 2019-04-11
Anticipated expiration: 2030-06-17
Also published as: DK2987803T3; JP2012530714A; AU2010262847A1; HK1169997A1; JP2015134824A; PL2987803T3; JP6124943B2; AU2010262847B2; US8329659B2; ES2552793T3; CA3083911C; HUE041034T2; CA3083911A1; EP2987803B1; CA2765394A1; CA2765394C; HUE028067T2; EP2443144B1; EP2443144A4; HK1221478A1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una variante del amiloide P del suero (SAP) que comprende cinco protómeros de SAP, en la que cada uno de los protómeros de SAP tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y en la que los cinco protómeros de SAP comprenden un aminoácido en la posición 167 de SEQ ID NO: 1 que es asparagina (N), glutamina (Q), alanina (A) o histidina (H), y un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCION

Variantes de SAP y su uso

Antecedentes de la invencion

El amiloide P del suero (SAP) es un miembro de la familia de protemas de las pentraxinas. El SAP se secreta por el tHgado y circula en la sangre como un pentamero estable. La investigacion anterior demuestra que el SAP tiene una funcion importante en tanto las fases de iniciacion como de resolucion de la respuesta inmunitaria. SAP pueden unirse a residuos de azucar sobre la superficie de bacterias y asf promover su opsonizacion y fagocitosis por celulas presentadoras de antfgeno. SAP tambien se une a ADN libre y cromatina generada por celulas apoptosicas en la resolucion de una respuesta inmunitaria, previniendose asf una respuesta inflamatoria secundaria contra estos antigenos. Moleculas unidas por SAP se eliminan de las areas extracelulares debido a la capacidad de SAP para unirse a los tres receptores de Fcy clasicos (FcyR), que tienen una afinidad particular por FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Despues de la union al receptor, SAP y cualquier complejo unidos son generalmente internalizados y procesados por la celula.

Recientemente, se ha sugerido que SAP puede usarse como un agente terapeutico para tratar diversos trastornos, que incluyen trastornos relacionados con la fibrosis, trastornos de hipersensibilidad, trastornos autoinmunitarios, mucositis y trastornos inflamatorios, tales como aquellos producidos por infeccion microbiana. Veanse, por ejemplo, las solicitudes de patente de Estados Unidos N.°s: 11/707.333, 12/217.617, 12/720.845 y 12/720.847. Los agentes terapeuticos de protema para tratar enfermedad humana han revolucionado la industria sanitaria. Sin embargo, hay muchas dificultades en producir un producto terapeutico de protema que tenga la potencia necesaria y/o en cantidad suficiente para ser util como agente terapeutico. Muchos posibles agentes terapeuticos se modifican para aumentar su actividad biologica, tales como semivida en plasma, con respecto a la protema naturalmente derivada. La tecnologfa de expresion recombinante normalmente se implementa para producir polipeptidos en cantidad suficiente. Desafortunadamente, muchos sistemas recombinantes producen polipeptidos que tienen propiedades biologicas diferentes de las de las formas naturalmente derivadas, que pueden afectar la farmacocinetica, seguridad y eficacia de un producto terapeutico.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar polipeptidos SAP adecuados para el tratamiento terapeutico de seres humanos. Los documentos WO 2009/009019 y w O 20o9/009034 desvelan variantes de SAP para terapia.

Sumario de la invencion

La presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. Con mas detalle, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una variante de SAP que comprende cinco protomeros de SAP, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos el 95 % identica a la SEQ ID NO: 1, y en la que los cinco protomeros de SAP comprenden un aminoacido en la posicion 167 de la SEQ ID NO: 1 que es asparagina (N), glutamina (Q), alanina (A) o histidina (H), y un vehmulo oftalmico farmaceuticamente aceptable.

En parte, la divulgacion proporciona variantes de amiloide P del suero (SAP) y oligomeros de SAP. En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona una variante de SAP que comprende cinco protomeros de SAP, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos al menos el 90 % identica a SEQ ID NO: 1 y en la que al menos uno de los protomeros de SAP comprende una o mas modificaciones de aminoacidos que alteran una actividad biologica de la variante de SAP en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. En aspectos preferidos, una protomero de SAP variante comprende al menos una modificacion de aminoacidos que se caracteriza por la presencia de uno o mas aminoacidos variantes con respecto a SEQ ID NO: 1, la ausencia de uno o mas aminoacidos con respecto a SEQ ID NO: 1, el acoplamiento de uno o mas aminoacidos a un resto de modificacion (por ejemplo, un resto de PEG, un resto de dextrano, etc.), o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la variante de SAP es una variante de una protema SAP humana. En algunas realizaciones, uno o mas de los protomeros de SAP tienen una secuencia de aminoacidos al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o al menos el 100 % identica a SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas, variantes de SAP tienen una actividad biologica alterada seleccionada de una o mas de elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vitro o elevada estabilidad in vivo. En algunas realizaciones, variantes de SAP de la divulgacion se caracterizan por elevada eficiencia de fabricacion de la protema SAP (por ejemplo, mayor rendimiento del producto de protema, elevada homogeneidad del producto de protema, elevada estabilidad del producto de protema).

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona variantes de SAP que comprenden uno o mas protomeros de SAP que estan sustancialmente libres de glicanos asociados en N o asociados en O. En algunas realizaciones, un protomero de SAP comprende una modificacion de aminoacidos en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1 que inhibe la union de un glicano asociado en N. En algunas realizaciones, al menos un protomero de SAP comprende un aminoacido en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1 que no es asparagina (N). En realizaciones preferidas, al menos un protomero de SAP comprende un aspartato (D), glutamina (Q) o glutamato (E) en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona variantes de SAP que son mas resistentes a la escision por proteasas que una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. En algunas realizaciones, las variantes de SAP de la divulgacion son mas resistentes a la escision por proteasas por una serina proteasa, una treonina proteasa, una cistema proteasa, un acido aspartico proteasa, una metaloproteasa, un acido glutamico proteasa, o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, la divulgacion proporciona variantes de SAP que son mas resistentes a la escision por proteasas por quimotripsina, tripsina, Pronasa, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, una variante de SAP resistente a proteasas comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en la posicion 144 de SEQ ID NO: 1 que no es fenilalanina (F). En realizaciones preferidas, una variante de SAP resistente a proteasas comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1 que no es aspartato (D). En algunas realizaciones, una variante de SAP resistente a proteasas comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en la posicion 144 de SEQ ID NO: 1 que no es fenilalanina (F) y un aminoacido en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1 que no es aspartato (D). En realizaciones preferidas, una variante de SAP resistente a proteasas comprende al menos un protomero de SAP que comprende una leucina (L), isoleucina (I), valina (V) o alanina (A) en la posicion 144 de SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas, una variante de SAP resistente a proteasas comprende al menos un protomero de SAP que comprende un glutamato (E) en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona variantes de SAP que son mas resistentes a la auto-agregacion dependiente del calcio que una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. En algunas realizaciones, una variante de SAP que es resistente a auto-agregacion dependiente del calcio comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1 que no es glutamato (E). En realizaciones preferidas, una variante de SAP que es resistente a auto-agregacion dependiente del calcio comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aspartato (D), asparagina (N), glutamina (Q), alanina (A) o histidina (H) en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona variantes de SAP que comprenden al menos un protomero de SAP que comprende uno o mas aminoacidos que estan covalentemente unidos a uno o mas polnrieros inertes. En algunas realizaciones, al menos uno de los polfmeros inertes es un resto de polietilenglicol (PEG). En ciertas realizaciones, uno o mas de los protomeros de SAP comprende al menos una cistema (C) nativa o de variante (por ejemplo, por sustitucion, adicion o delecion de aminoacidos) con respecto a SEQ ID NO: 1, que tiene un resto de PEG unido. En una realizacion preferida, uno o mas de los protomeros de SAP comprende una cistema (C) de variante, localizada en el extremo N de SEQ ID NO: 1, que tiene un resto de PEG unido. En otras realizaciones, uno o mas de los protomeros de SAP comprende al menos una (Q) nativa o de variante, con respecto a SEQ ID NO: 1, que tiene un resto de PEG unido. En una realizacion preferida, uno o mas de los protomeros de SAP comprende una glutamina (Q) en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1 que tiene un resto de PEG unido. En algunas realizaciones, la variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende uno o mas residuos de cistema (C) y uno o mas residuos de glutamina (Q) que estan unidos a un resto de PEG. En algunas realizaciones, al menos uno de los polfmeros inertes es un resto de dextrano. En ciertas realizaciones, uno o mas de los protomeros de SAP comprende un residuo de glutamina (Q) nativa o de variante, con respecto a SEQ ID NO: 1, que tiene un resto de dextrano unido. En una realizacion preferida, uno o mas de los protomeros de SAP comprende un residuo de glutamina nativa en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1 que tiene un resto de dextrano unido. En ciertas realizaciones, la variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende uno o mas aminoacidos unidos a un resto de PEG y uno o mas aminoacidos unidos a un resto de dextrano.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona una variante de SAP que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco protomeros de SAP variantes diferentes como se describe en el presente documento.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona un oligomero de SAP covalentemente reticulado que comprende al menos dos pentameros de SAP, en el que cada uno de los pentameros de SAP comprende cinco protomeros de SAP. Los oligomeros de SAP de la invencion pueden comprender protomeros de SAP al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 100 % identicos a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, los oligomeros de SAP pueden comprender al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o mas de los protomeros de variante de SAP como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, los oligomeros de SAP pueden comprender al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o mas protomeros de SAP variantes diferentes como se describe en el presente documento. En realizaciones preferidas, los oligomeros de SAP reticulados se caracterizan por uno o mas de elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vitro y elevada estabilidad in vivo en comparacion con una muestra correspondiente de sA p aislado de suero humano.

En ciertos aspectos, los oligomeros de SAP comprenden pentameros de SAP covalentemente unidos mediante uno o mas reticulantes qmmicos. En ciertas realizaciones, al menos uno del reticulante qmmico es un agente heterobifuncional seleccionado de 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo, clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a(2-piridilditio)-tolueno, 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo o 6-((3-(2-piridilditio)propionato)hexanoato de succinimidilo. En ciertas realizaciones, al menos uno de los reticulantes qmmicos es un agente homobifuncional seleccionado de suberato de disuccinimidilo, bismaleimidohexano o dimetilpimelimidato-2HCl. En ciertas realizaciones, al menos uno de los reticulantes qmmicos es un agente fotorreactivo seleccionado de bis-(P-(4-azidosalicilamido)etil)disulfuro o N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona una preparacion farmaceutica adecuada para su uso en un mairnfero que comprende una o mas de las variantes de SAP y/u oligomeros de SAP covalentemente reticulados. Preparaciones farmaceuticas de la invencion incluyen al menos una de las variantes de SAP y/u oligomeros de SAP desvelados en el presente documento y un vefffculo farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la preparacion farmaceutica comprende ademas un agente activo adicional. En algunas realizaciones, la preparacion farmaceutica se prepara como una formulacion de liberacion sostenida. En algunas realizaciones, preparaciones farmaceuticas de la divulgacion son adecuadas para administracion a un paciente topicamente, mediante inyeccion, mediante inyeccion intravenosa, por inhalacion, por deposito continuo, o por bomba.

La divulgacion proporciona ademas procedimientos para tratar o prevenir trastornos o afecciones sensibles a SAP administrando a un paciente en necesidad de los mismos una cantidad terapeuticamente eficaz de una o mas de las variantes de SAP y/u oligomeros de SAP. Trastornos o afecciones sensibles a SAP incluyen, pero no se limitan a, trastornos o afecciones fibroticos o fibroproliferativos, trastornos o afecciones de hipersensibilidad, trastornos o afecciones autoinmunitarios y mucositis. La variante de SAP y/u oligomero de la invencion puede administrarse a un paciente topicamente, mediante inyeccion, mediante inyeccion intravenosa, por inhalacion, por deposito continuo o bomba, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la variante de SAP y/u oligomero de la invencion se administra conjuntamente con uno o mas agentes activos adicionales. En ciertas realizaciones, las variantes de SAP y/u oligomeros se formulan para administrarse conjuntamente. Las variantes de SAP y/u oligomeros pueden administrarse conjuntamente como formulaciones separadas o en formulaciones combinadas. Las variantes de SAP y/u oligomeros pueden administrarse simultaneamente o en programas de dosificacion diferentes.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: una variante de SAP que comprende una sustitucion de aminoacidos E167Q, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1, es mas resistente a la agregacion mediada por calcio que una muestra correspondiente de SAP humano recombinante sin modificar (rhSAP). Se anadieron cantidades graduales de calcio a una disolucion que comprendfa SAP y se observo la cantidad de agregacion de SAP midiendo la absorbancia de la disolucion a 600 nm en un espectrofotometro.

Figura 2: una variante de SAP que comprende una sustitucion de aminoacidos E167Q, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1, tiene una semivida en plasma similar en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano recombinante sin modificar (rhSAP). Se administraron ratas con SAP (dosis de 1 mg/kg i.v. por rata, n=3). Durante veinticuatro horas, las ratas se evaluaron para concentraciones plasmaticas (pg/ml) de protema SAP.

Figura 3: variantes de SAP E167Q y N32D, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1, son al menos tan activas como una muestra correspondiente de SAP humano recombinante sin modificar (rhSAP). Se incubaron celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) enriquecidas en monocitos con concentraciones variables de SAP. Tras la incubacion, los sobrenadantes de cultivo resultantes se extrajeron y se ensayaron por ELISA para cuantificar la cantidad de quimiocina derivada de macrofago (MDC) que se produjo.

Figura 4: la variante de SAP N32D tiene una semivida en plasma similar a la de rhSAP silvestre. Mientras que una forma asialo de hSAP tiene una semivida en plasma significativamente reducida en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano recombinante sin modificar (rhSAP). Se administraron ratas con SAP (dosis de 1 mg/kg i.v. por rata, n=3). Durante veinticuatro horas, las ratas se evaluaron para concentraciones plasmaticas (pg/ml) de protema SAP.

Figura 5: representa una reaccion qmmica que une covalentemente PEG a rhSAP.

Figura 6: se purifico rhSAP PEGilado de componentes de reaccion por cromatograffa de intercambio anionico. Se reunieron fracciones de la columna de cromatograffa y se concentraron antes del analisis por SDS-PAGE.

Descripcion detallada de la invencion

Vision general

El amiloide P del suero (“SAP”) es una protema del suero que existe de forma natural en marnfferos y es un miembro de la familia de las pentraxinas de protemas estructuralmente relacionadas. Se produce en el fffgado como una glicoprotema de 125.000 Dalton y tiene una semivida fisiologica de 24 horas en suero. El SAP esta compuesto por cinco subunidades identicas o “protomeros” que estan asociados no covalentemente en una molecula tipo disco. Los protomeros de SAP se asocian no covalentemente entre sf mediante dos “interfases de protomero”. La interfase de protomero 1 de la subunidad 1 se asocia con la interfase de protomero 2 de la subunidad 2. La interfase de protomero 1 de la subunidad 2 se asocia con la interfase de protomero 2 de la subunidad 3, etc. Cada protomero expone una “cara A” que puede unirse a FcyR y una “cara B” opuesta que media en la union al calcio y union a ligando mediada por el calcio. En altas concentraciones de calcio ionico, SAP se agrega y puede precipitar como el componente de amiloide P, que es un constituyente normal de la membrana basal glomerular, ademas de tejidos humanos de dermis, cuello uterino, tesffculo y placenta. Veanse Baltz, M. L., et al., Clin. Exp. Immunol., 66:691-700 (1986); Dyck, R. F., et al., J. Exp. Med., 152:1162-1174 (1980); Melvin, T., Am. J. Pathol., 125:460-464 (1986); Breathnach, S. M., J. Invest. Derm., 92:53-58 (1989); Clayton, J., Cell. Pathol., 43:63-66 (1983); Herriut, R., et al., J. Pathol., 157:11-14 (1989); Khan, A. M., et al., Placenta, 6:551-554 (1985). La secuencia madura del protomero de SAP humano se representa a continuacion (aminoacidos 20-223 de N.° de acceso de GenBank: NP_001630; secuencia senal no representada).

H TD L S G K V F V F P R E S V T D H V N L IT P L E K P L Q N F T L C F R A Y SD LSR A Y SLF

S Y N T Q G R D N E L L V Y K E R V G E Y S L Y IG R H K V T S K V 1 E K F P A P V H IC V S W E

S S S G IA E F W IN G T P LV K K G LR Q G Y F V E A Q P K JV L G Q E Q D S Y G G K F D R S Q

S F V G E IG D L Y M W D S V L P P E N IL S A Y Q G T P L P A N IL D W Q A L N Y E 1 R G Y V II

K P L V W V (SEQ ID N O : 1)

Los procesos de cicatrizacion normal, ademas de los acontecimientos desregulados que producen fibrosis, implican la proliferation y diferenciacion de fibroblastos y la deposition de matriz extracelular. Si estos fibroblastos se derivan localmente o de una poblacion precursora circulante no esta claro. Los fibrocitos, precursores de fibrocitos, precursores de miofibroblastos y precursores de monocitos hematopoyeticos pertenecen a una poblacion distinta de celulas tipo fibroblasto derivadas de monocitos de sangre periferica. Estas celulas pueden migran a sitios de lesion de tejido para promover la angiogenesis y cicatrizacion. Los monocitos de sangre periferica CD14+ cultivados en ausencia de suero o plasma se diferencian en fibrocitos en el plazo de 72 horas. Recientemente, se mostro que SAP inhibia la diferenciacion de fibrocitos, precursores de fibrocitos, precursores de miofibroblastos y/o precursores de monocitos hematopoyeticos a niveles similares a los del suero. A diferencia, el plasma agotado en SAP tiene una reducida capacidad para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos, precursores de fibrocitos, precursores de miofibroblastos y/o precursores de monocitos hematopoyeticos. En comparacion con sueros de individuos sanos, el suero de sujetos con artritis reumatoide, esclerodermia, enfermedades de tejido conjuntivo mixto y ciertas enfermedades fibroticas sistemicas, han reducido la potencia para inhibir la diferenciacion de fibrocitos, precursores de fibrocitos, precursores de miofibroblastos y/o precursores de monocitos hematopoyeticos in vitro. Por consiguiente, los niveles en suero de SAP son significativamente menores en algunos sujetos con estos trastornos que se observan para sujetos sanos. Estos resultados indican que niveles anormalmente bajos de SAP pueden aumentar los procesos patologicos que conducen a fibrosis y sugiere que SAP puede ser util como agente terapeutico para inhibir la fibrosis en afecciones inflamatorias cronicas. Recientemente, se ha sugerido que SAP puede usarse como agente terapeutico para tratar diversos otros trastornos, que incluyen trastornos relacionados con la fibrosis, trastornos de hipersensibilidad, trastornos autoinmunitarios, mucositis y trastornos inflamatorios, tales como aquellos producidos por infection microbiana. Veanse, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. N.°s: 11/707.333, 12/217.617, 12/720.845 y 12/720.847.

Los polipeptidos son susceptibles a desnaturalizacion o degradation enzimatica en la sangre, higado o rinon. Debido a la baja estabilidad de algunos polipeptidos, se ha requerido administrar farmacos de polipeptido en una frecuencia sostenida a un sujeto con el fin de mantener una concentration plasmatica eficaz de la sustancia activa. Ademas, como los farmacos de polipeptido se administran normalmente por infusion, la frecuente inyeccion de farmacos de polipeptido puede producir una molestia considerable a un sujeto. Asi, ha habido muchos estudios para desarrollar farmacos de polipeptido que tienen una elevada semivida circulante en la sangre, mientras que se mantiene una alta eficacia farmacologica. Por consiguiente, un objetivo primario de la presente divulgation es proporcionar variantes de SAP, composiciones, preparaciones farmaceuticas y formulaciones que tienen una prolongada semivida in vivo en comparacion con SAP humano. Ventajas de elevada semivida en plasma incluyen, pero no se limitan a, reducir la cantidad y/o frecuencia de dosificacion.

Ademas, las composiciones farmaceuticas de peptidos terapeuticos tienen preferentemente una estabilidad en almacen de varios anos con el fin de ser adecuadas para uso comun. Sin embargo, las composiciones de peptido son inherentemente inestables debido a la sensibilidad hacia degradacion qmmica y fisica. Ejemplos de degradacion qmmica incluyen cambio de enlaces covalentes, que incluyen, pero no se limitan a, oxidation, hidrolisis, racemizacion o reticulation. Ejemplos de degradacion fisica incluyen cambios conformacionales con respecto a la estructura nativa del peptido, que pueden conducir a agregacion, precipitation o adsorcion del polipeptido a superficies. Por consiguiente, otro objetivo de la presente divulgacion es proporcionar variantes de SAP, composiciones, preparaciones farmaceuticas y formulaciones que tienen una estabilidad en almacen prolongada, o estabilidad in vitro bastante elevada, en comparacion con SAP humano. Durante el proceso de fabrication, es frecuentemente dificil producir grandes cantidades de una protema con consistencia reproducible en las caracteristicas del producto, tales como modification post-traduccional y/o plegamiento. En algunas realizaciones, las variantes de SAP de la divulgacion se caracterizan por elevada eficiencia de fabricacion de la protema SAP (por ejemplo, mayor rendimiento del producto de protema, elevada homogeneidad del producto de protema, elevada estabilidad del producto de protema), particularmente para uso in vivo (por ejemplo, como agente terapeutico).

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cienfificos usados en el presente documento generalmente tienen el mismo significado que comunmente es entendido por un experto habitual en la materia. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genetica molecular, qmmica organica y qmmica e hibridacion de acidos nucleicos son aquellos muy conocidos y comunmente empleados en la materia. Tecnicas convencionales se usan para la smtesis de acidos nucleicos y de peptidos. Las tecnicas y procedimientos se realizan generalmente segun procedimientos convencionales en la materia y diversas referencias generales (por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que se proporcionan en todo este documento.

Los artmulos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a mas de uno (es dedr, a al menos un) del sujeto gramatical del artmulo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o mas de un elemento.

Como se usa en el presente documento, los terminos “tratamiento”, “tratar” y similares se refieren a obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en terminos de prevenir completamente o parcialmente un trastorno o smtoma del mismo y/o puede ser terapeutico en terminos de una cura parcial o completa de un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno. “Tratamiento”, como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mairnfero, particularmente en un ser humano e incluye: (a) aumentar el tiempo de supervivencia; (b) disminuir el riesgo de muerte debido a la enfermedad; (c) disminuir el riesgo de que una enfermedad se produzca en un sujeto que puede tener predisposicion a la enfermedad, pero todavfa no ha sido diagnosticado con que la tiene; (d) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo (por ejemplo, reducir la tasa de progresion de la enfermedad); y (e) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresion de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, un agente terapeutico que “inhibe” o “previene” un trastorno o afeccion es un compuesto que, en una muestra estadfstica, reduce la aparicion del trastorno o afeccion en la muestra tratada con respecto a una muestra de control no tratada, o retrasa la aparicion o reduce la gravedad de uno o mas smtomas del trastorno o afeccion con respecto a la muestra de control no tratada.

Como se usa en el presente documento, los terminos “sujeto” y “paciente” se refieren a animales que incluyen mamnferos, tales como seres humanos. El termino “mam^fero” incluye primates, animales domesticados que incluyen perros, gatos, ovejas, ganado vacuno, caballos, cabras, cerdos, ratones, ratas, conejos, cobayas, animales cautivos tales como animales de zoologico y animales salvajes.

Como se usa en el presente documento, el termino “tejido” se refiere a un organo o conjunto de celulas especializadas tales como tejido de piel, tejido de pulmon, tejido de rinon y otros tipos de celulas.

La expresion “efecto terapeutico” es reconocida en la tecnica y se refiere a un efecto local o sistemico en animales, particularmente m ai^eras y mas particularmente seres humanos, producido por una sustancia farmacologicamente activa. La frase “cantidad terapeuticamente eficaz” significa aquella cantidad de una sustancia tal que produce algun efecto local o sistemico deseado a una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. La cantidad terapeuticamente eficaz de tal sustancia variara dependiendo del sujeto y condicion de enfermedad que esta tratandose, el peso y edad del sujeto, la gravedad de la condicion de enfermedad, el modo de administracion y similares, que pueden determinarse facilmente por un experto habitual en la materia. Por ejemplo, ciertas composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse en una cantidad suficiente para producir un efecto deseado a una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a tal tratamiento.

Como se usa en el presente documento, el termino “acido nucleico” se refiere a un polinucleotido tal como acido desoxirribonucleico (ADN) y cuando corresponda, acido ribonucleico (ARN). Tambien debe entenderse que el termino incluye, como equivalentes, analogos de cualquier ARN o ADN preparado a partir de analogos de nucleotidos y como es aplicable a la realizacion que se describe, polinucleotido monocatenario (tal como sentido o antisentido) y bicatenario.

Los terminos “peptidos”, “protemas” y “polipeptidos” se usan indistintamente en el presente documento. El termino “protema purificada” se refiere a una preparacion de una protema o protemas que se afslan preferentemente de, o de otro modo sustancialmente libres de, otras protemas normalmente asociadas a la(s) protema(s) en una celula o lisado celular. El termino “sustancialmente libre de otras protemas celulares” o “sustancialmente libre de otras protemas contaminantes” se define como que engloba preparaciones individuales de cada una de las protemas que comprende menos del 20 % (por peso seco) de protema contaminante y preferentemente comprende menos del 5 % de protema contaminante. Pueden prepararse formas funcionales de cada una de las protemas como preparaciones purificadas usando un gen clonado como se conoce bien en la tecnica. Por “purificado” se indica que la molecula indicada esta presente en ausencia sustancial de otras macromoleculas biologicas, tales como otras protemas (particularmente otras protemas que pueden enmascarar, disminuir, confundir o alterar sustancialmente las caracterfsticas de las protemas componente tanto como preparaciones purificadas como en su funcion en la mezcla reconstituida objeto). El termino “purificado”, como se usa en el presente documento, significa preferentemente al menos el 80 % por peso seco, mas preferentemente en el intervalo del 85 % en peso, mas preferentemente del 95-99 % en peso y lo mas preferentemente al menos el 99,8 % en peso, de macromoleculas biologicas del mismo tipo presentes (pero pueden estar presentes agua, tampones y otras moleculas pequenas, especialmente moleculas que tienen un peso molecular inferior a 5000). El termino “puro”, como se usa en el presente documento, tiene preferentemente los mismos lfmites numericos que “purificado” inmediatamente anterior.

El termino “semivida” o “semivida en plasma”, como se usa en el presente documento en el contexto de administrar un farmaco de peptido a un sujeto, se define como el tiempo requerido para que la concentracion plasmatica de un farmaco en un sujeto se reduzca a la mitad. Explicacion adicional de “semivida” se encuentra en Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin y RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101 120).

Variantes de SAP y oligomeros de SAP

(ii) Protenas de variante de SAP

En parte, la divulgacion proporciona protemas de variante de amiloide P del suero (SAP). El termino “variante de SAP” pretende referirse a una protema SAP que comprende cinco subunidades o “protomeros” de SAP. En aspectos preferidos, una variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que tiene una o mas modificaciones de aminoacidos (es decir, un protomero de SAP variante) que modifican al menos una actividad biologica de la protema SAP. En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a, la presencia de uno o mas aminoacidos variantes con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, sustitucion o adicion de aminoacidos), la ausencia de uno o mas aminoacidos nativos con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, delecion de aminoacidos), el acoplamiento de uno o mas aminoacidos a un resto de modificacion (por ejemplo, un resto de PEG, un resto de dextrano, etc.), o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, un protomero de SAP comprende al menos un aminoacido variante, con respecto a SEQ ID NO: 1 y al menos un aminoacido acoplado a un resto de modificacion. En particular, las variantes de sAp se caracterizan por una actividad biologica alterada en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. En algunos aspectos, una variante de SAP de la divulgacion se caracteriza por una actividad biologica alterada seleccionada de una o mas de elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vivo, elevada estabilidad in vitro, o elevada eficiencia de fabricacion.

El termino “protomero de SAP” pretende referirse a un polipeptido que es al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 % identico al protomero de SAP ejemplificado por SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, el termino “protomero de SAP” engloba fragmentos y protemas de fusion que comprenden cualquiera de los precedentes. En aspectos preferidos, las variantes de SAP de la divulgacion son protemas SAP humanas. Generalmente, un protomero de SAP se disenara para ser soluble en disoluciones acuosas a temperaturas, niveles de pH y osmolaridad biologicamente relevantes. Los protomeros que se asocian no covalentemente juntos para formar una variante de SAP de la divulgacion pueden tener secuencias de aminoacidos identicas y/o modificaciones post-traduccionales o, alternativamente, protomeros individuales pueden tener diferentes secuencias y/o modificaciones. Por consiguiente, una variante de SAP puede comprender al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o cinco protomeros de SAP identicos o, alternativamente, comprender al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco protomeros de SAP variantes identicos o diferentes. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro de los protomeros de SAP tienen el 100 % de identidad de secuencias con SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas, una variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP variante que confiere uno o mas de actividad biologica alterada como se describe en el presente documento. Las modificaciones post-traduccionales pueden efectuarse in vivo y/o in vitro e incluyen, pero no se limitan a, procesamiento (por ejemplo, eliminacion de secuencias senal, maduracion de pro-peptidos, etc.) y modificacion qmmica (por ejemplo, glicosilacion, pegilacion, etc.) de los polipeptidos SAP traducidos.

La invencion tambien proporciona protomeros de SAP que comparten un grado especificado de identidad de secuencias o similitud con un polipeptido SAP. Para determinar la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoacidos, las secuencias se alinean para fines de comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos para el alineamiento optimo y secuencias no homologas pueden ignorarse para fines de comparacion). En una realizacion preferida, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o mas de la longitud de una secuencia de referencia (por ejemplo, SAP humano) se alinea para fines de comparacion. Entonces se comparan los residuos de aminoacidos en posiciones de aminoacidos correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion (como se usa en el presente documento, “identidad” de aminoacidos es equivalente a “homologfa” de aminoacidos). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para el alineamiento optimo de las dos secuencias.

La comparacion de secuencias y la determinacion de la identidad en porcentaje y similitud entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matematico (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).

En ciertas realizaciones, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com). En una realizacion espedfica, los siguientes parametros se usan en el programa GAP: tanto una matriz Blossom 62 como una matriz PAM250 y un peso por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realizacion mas, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleotidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387 (1984)) (disponible en http://www.gcg.com). Parametros a modo de ejemplo incluyen usar una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por hueco de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

En otra realizacion, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo de E. Myers y W. Miller (CABIOS, 4:l1-17 (1989)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4.

Otra realizacion para determinar el mejor alineamiento global entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el programa informatico FASTDb basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990)). En un alineamiento de secuencias, las secuencias de consulta y objeto son ambas secuencias de aminoacidos. El resultado de dicho alineamiento global de secuencias se presenta en terminos de identidad en porcentaje. En ciertas realizaciones, la identidad de secuencias de aminoacidos se realiza usando el programa informatico FASTDb basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990)). En una realizacion espedfica, los parametros empleados para calcular la identidad en porcentaje y la similitud de un alineamiento de aminoacidos comprenden: Matriz=PAM 150, k-tuple=2, Penalizacion por desapareamientos=1, Penalizacion por union =20, Longitud del grupo de aleatorizacion=0, Puntuacion de corte=1, Penalizacion por hueco=5 y Penalizacion por tamano del hueco =0,05.

Algunos aspectos de la invencion proporcionan polipeptidos SAP (es decir, protomeros), o proporcionan procedimientos terapeuticos para emplear aquellos polipeptidos, en los que dichos polipeptidos se definen, al menos en parte, por una secuencia de referencia. En realizaciones preferidas, la secuencia de referencia se corresponde con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, tales polipeptidos pueden tener un cierto porcentaje de residuos de aminoacidos que no son identicos a una secuencia de referencia. En una realizacion preferida, los residuos no identicos tienen propiedades qmmicas similares a los residuos a los que no son identicos. Grupos que tienen propiedades similares incluyen los siguientes aminoacidos: E, D, N y Q; H, K y R; Y, F y W; I, L, V, M, C y A; y S, T, C, P y A.

En otra realizacion, los residuos que no son identicos son aquellos que no estan evolutivamente conservados entre la secuencia de referencia y una secuencia ortologa en al menos una especie evolutivamente relacionada, tal como en especies dentro del mismo orden. En el caso de una secuencia de referencia de mairnfero, los aminoacidos que pueden mutarse en una realizacion preferida son aquellos que no estan conservados entre la secuencia de referencia y la secuencia ortologa en otra especie de m ai^ero. Por ejemplo, si se dice que un polipeptido usado en un procedimiento de la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos el 90 % identica a SAP humano (SEQ ID NO:1), entonces dicho polipeptido puede tener residuos no identicos a aquellas posiciones en las que se diferencian el SAP humano y el de otro mai^ero.

Polipeptidos SAP (es decir, protomeros) que comparten al menos el 90 % de identidad con SEQ ID NO: 1 incluyen polipeptidos que tienen sustituciones conservativas en estas areas de divergencia. Normalmente consideradas como sustituciones conservativas son las sustituciones, uno por el otro, entre los aminoacidos alifaticos Ala, Val, Leu y Ile, intercambio de los residuos de hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los residuos acidos Asp y Glu, sustitucion entre los residuos de amida Asn y Gln, intercambio de los residuos basicos Lys y Arg y sustituciones entre los residuos aromaticos Phe, Tyr. Orientacion adicional referente a que cambios de aminoacidos es probable que sean fenotfpicamente silenciosos puede encontrarse en Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990).

La divulgacion tambien proporciona protomeros de SAP con mutaciones en residuos de aminoacidos espedficos. Mutaciones a modo de ejemplo se desvelan en el presente documento y se numeran segun la posicion de aminoacido de SAP humano, por ejemplo, como se ejemplifica en SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, una variante de SAP i) comprende uno o mas protomeros que son al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 % o al menos el 99 % identicos a SEQ ID NO: 1, ii) tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero: elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vitro, elevada estabilidad in vivo o elevada eficiencia de fabricacion. Como se describe en el presente documento, los aminoacidos de un protomero de SAP pueden mutarse anadiendo uno o mas residuos de aminoacidos especificados, delecionando uno o mas residuos de aminoacidos especificados, o sustituyendo uno o mas residuos de aminoacidos especificados. Procedimientos para mutar o modificar qmmicamente polipeptidos SAP se describen en las siguientes secciones.

Puede ser deseable potenciada semivida en suero y estabilidad in vivo para reducir la frecuencia de dosificacion que se requiere para lograr la eficacia terapeutica. Por consiguiente, en ciertos aspectos, la semivida en suero de una variante de SAP es al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, o al menos veinte dfas o mas. Procedimientos para el analisis farmacocinetico y determinacion de la semivida y estabilidad in vivo seran conocidos para aquellos expertos en la materia. Pueden encontrarse detalles en Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Tambien se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Rev. Ex edicion (1982), que describe parametros farmacocineticos tales como semividas t alfa y t beta y area bajo la curva (ABC). Como se describe en los ejemplos de la divulgacion, un procedimiento para determinar la estabilidad in vivo implica administrar una variante de SAP a un animal y medir la concentracion de la variante de SAP dentro del plasma del animal a intervalos regulares despues de la administracion. El perfil farmacocinetico (es decir, la concentracion plasmatica de SAP con el tiempo) de una variante de SAP puede compararse con el de otra protema SAP, por ejemplo, una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero.

En ciertos aspectos, variantes de SAP de la divulgacion son mas estables que una composicion por lo demas identica de SAP humano en condiciones identicas. En ciertas realizaciones, las composiciones desveladas tienen una estabilidad en almacen, o in vitro, estabilidad al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, o al menos cinco veces o mas que un SAP humano de muestra correspondiente. Se conocen muchos procedimientos para medir la estabilidad in vitro en la materia, que incluyen, por ejemplo, medir la estabilidad de protemas por SDS-PAGE, transferencia Western, RP-HPLC, AEX-HPLC, CL-EM, o secuenciacion del extremo N.

En algunas realizaciones, las variantes de SAP de la invencion tienen una bioactividad alterada o similar en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. La bioactividad de una variante de SAP puede determinarse, por ejemplo, determinando la CI⁵⁰para inhibir la diferenciacion de monocitos en fibrocitos in vitro. En algunas realizaciones, la CI⁵⁰de una variante de SAP es inferior a 1/2, inferior a 1/3, inferior a 1/4, inferior a 1/10, o inferior a 1/100 que la de una muestra correspondiente de SAP silvestre aislado de suero humano. Hay muchos procedimientos bien caracterizados para determinar la sensibilidad de celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) o celulas de monocito a SAP para la diferenciacion de fibrocitos. Estos procedimientos pueden usarse para determinar la potencia relativa de cualquiera de la variante de SAP de la invencion en comparacion con una muestra de SAP derivado de suero humano, cualquier otro polipeptido de variante de SAP, u otro supresor de fibrocitos o agente de activacion. Las CMSP o monocitos adecuados para su uso en estos procedimientos pueden obtenerse de diversas lmeas de cultivo de tejido. Alternativamente, pueden obtenerse celulas adecuadas para los ensayos de diferenciacion de fibrocitos de cualquier muestra biologica que contenga CMSP o celulas de monocito. La muestra biologica puede obtenerse de suero, plasma, tejido sano o tejido fibrotico. En general, se realizan ensayos de diferenciacion de fibrocitos incubando CMSP o celulas de monocito en medios con diversas concentraciones de un polipeptido SAP para determinar el grado de diferenciacion de fibrocitos. La concentracion de SAP puede oscilar de 0,0001 pg/ml a 1 mg/ml y en algunas realizaciones es 0,001 pg/ml, 1,0 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 15 pg/ml, 20 pg/ml, 25 pg/ml, 30 pg/ml, 35 pg/ml, 40 pg/ml, 45 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml o 500 pg/ml. En algunos ensayos, los medios pueden complementarse con entre 1-100 ng/ml de hMCSF; siendo la concentracion preferida de hMCSF 25 ng/ml. La indicacion de que las CMSP y monocitos se han diferenciado en fibrocitos puede determinarse por un experto en la materia. En general, los fibrocitos se definen morfologicamente como celulas adherentes con una forma de husillo alargada y la presencia de un nucleo ovalado. En algunos ensayos, las celulas se fijan y se tinen con Hema 3 antes de enumerar los fibrocitos por recuento directo, por ejemplo, usando un microscopio invertido. La cantidad de diferenciacion de fibrocitos se interpreta por un experto en la materia como una indicacion de la sensibilidad de una celula a SAP. Como se indica por los ejemplos de la divulgacion, una mayor supresion de la diferenciacion de fibrocitos indica un mayor grado de sensibilidad de SAP. Un procedimiento alternativo de medicion de la diferenciacion de fibrocitos implica determinar la expresion de marcadores de la superficie celular espedficos de fibrocitos o factores secretados, por ejemplo, citocinas (tales como IL-1ra, ENA-78/CXCL-5, PAI-1), fibronectina, colageno-1, quimiocina derivada de macrofagos). Procedimientos de deteccion y/o cuantificacion de marcadores de la superficie celular o factores secretados son muy conocidos en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, diversas tecnicas basadas en ELISA y FACS usando anticuerpos inmunorreactivos contra uno o mas marcadores espedficos de fibrocitos.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona variantes de SAP que son mas resistentes a la escision por proteasas que una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. Una variante de SAP de la invencion puede ser resistente a la escision por proteasas de cualquier numero de proteasas que incluyen serina proteasas, treonina proteasas, cistema proteasas, acido aspartico proteasas, metaloproteasas y acido glutamico proteasas. En ciertas realizaciones, una variante de SAP es mas resistente a la escision por quimotripsina, tripsina o Pronase. En realizaciones preferidas, la variante de SAP resistente a proteasas tiene una elevada semivida en plasma en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. Procedimientos para medir la escision proteolftica incluyen, pero no se limitan a, analizar muestras tratadas con proteasa de una protema (por ejemplo, una variante de SAP y un patron de SAP humano derivado del suero) por Sd S-PAGE, transferencia Western, RP-HPLC, AEX-HPLC, CL-EM, o secuenciacion del extremo N. Otros ejemplos de ensayos de escision por proteasas estan dentro del ambito de un experto en la materia y se ejemplifican en Kinoshita CM, et al., Protein Science 1:700-709 (1992). Por tanto, variantes de SAP de la invencion pueden ensayarse facilmente para resistencia relativa a la escision por proteasas en comparacion con una muestra correspondiente de otra protema SAP, por ejemplo, una muestra de SAP humano derivado del suero.

En ausencia de calcio, SAP humano se susceptible a escision por a-quimotripsina entre los residuos Phe-M⁴y Asp-M⁵(Kinoshita CM, et. al., Protein Science 1:700-709 (1992)). En ciertas realizaciones, un protomero de SAP comprende una modificacion de aminoacidos en la posicion 144 y/o posicion 145 de SEQ ID NO: 1, produciendo una variante de SAP que es mas resistente a la escision por proteasas. En algunas realizaciones, un protomero de SAP comprende un aminoacido variante en la posicion 144 de SEQ ID NO: 1. En particular, variantes de SAP mas resistentes a la escision por proteasas pueden tener un residuo de leucina (L), isoleucina (I), valina (V), alanina (A) o glutamina (Q) en la posicion de aminoacido 144 de SEQ ID NO: 1. Un protomero de SAP tambien puede comprender, independientemente o en combinacion con, un aminoacido variante en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1. Protomeros de SAP variantes de la divulgacion pueden comprender un glutamato (E) en la posicion 145 en SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, una variante de SAP comprende uno o mas promotores que son i) al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 % al menos 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % identicos a SEQ ID NO: 1 y ii) comprenden una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos F144L, F144I, F144V, F144A, F144G, D145E con respecto a SEQ ID NO: 1. Cualquiera de los protomeros de SAP anteriormente mencionados que son resistentes a la escision por proteasas pueden comprender ademas cualquiera de las otras modificaciones de aminoacidos descritas en el presente documento.

La divulgacion proporciona ademas variantes de SAP con elevada union a metales en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. La elevada union a metales en el sitio de union al calcio de un protomero de SAP disminuye la susceptibilidad del protomero a la proteolisis estabilizando la estructura de bucle que contiene el residuo de aminoacido en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, una variante de SAP que tiene elevada union a metales comprende uno o mas protomeros de SAP con un aminoacido variante en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1. En particular, las variantes de SAP caracterizadas por elevada union a metales pueden tener un aminoacido glutamato (E), glutamina (Q), histidina (H), alanina (A), glicina (G) en la posicion 145 de s Eq ID NO: 1. En realizaciones preferidas, una variante de SAP demuestra elevada union al metal calcio en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. Las constantes de union al calcio para una protema SAP pueden medirse mediante una variedad de procedimientos, que incluyen aquellos ejemplificados en Calcium-binding Protein Protocols: methods and techniques por Hans J. Vogel, Contributor Hans J. Vogel, publicado por Humana Press, 2002. En algunas realizaciones, las constantes de union al calcio para una protema SAP pueden medirse por dialisis en equilibrio usando un intervalo de concentraciones de calcio, seguido de analisis de la representacion de Scatchard (vease, por ejemplo, Segel, I.H., Enzyme Kinetics 1975, Wiley-Interscience Publisher, p218-19). La dialisis en equilibrio puede realizarse usando tanto isotopos radiactivos del calcio como electrodos sensibles al calcio para cuantificar niveles de calcio libre. Las constantes de union al calcio tambien pueden determinarse valorando el calcio en una disolucion de SAP en presencia de un quelante cromoforo (acido 5,5'-dibromo-1,2-bis(2aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacetico (Linse, S, Helmbersson, A. Forsen, S, 1991 JBC 266:13 pp. 8050-8054). Tambien puede usarse calorimetna de valoracion isoterma para medir afinidades de union al calcio (Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J.F. y Lin, L.N., (1989) Anal Biochem 179, 131-7). Las variantes de SAP caracterizadas por elevada union a metales pueden compararse con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero para cambios en la estabilidad proteolftica (por ejemplo, digestion con quimotripsina en presencia y ausencia de calcio), bioactividad in vitro y o farmacocinetica, ademas de procedimientos de caracterizacion bioffsica (por ejemplo, RP-HPLC, SE-HPLC, SDS-PAGE, CL-EM). En ciertas realizaciones, una variante de SAP comprende uno o mas protomeros de SAP que son i) al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 % al menos 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % identicos a SEQ ID NO: 1 y ii) que comprenden una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: D145E, D145Q, D145H, D145A o D145G. Cualquiera de los protomeros de SAP anteriormente mencionados que demuestra elevada union a metales puede comprender ademas cualquiera de las otras modificaciones de aminoacidos descritas en el presente documento.

En ausencia de ligando, la union al calcio produce la auto-agregacion de SAP (Emsley, et. al. Nature 367:338-345 (1994)) y una vez agregado, SAP se elimina rapidamente de la corriente sangumea (Pepys, et. al., Nature 417:254-259 (2002)). En ciertas realizaciones, una variante de SAP de la divulgacion es mas resistente a la auto-agregacion dependiente del calcio que una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. En algunas realizaciones, una variante de SAP resistente a la auto-agregacion dependiente del calcio comprende uno o mas protomeros de SAP que comprenden un aminoacido variante en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una variante de SAP resistente a la auto-agregacion dependiente del calcio comprende un aspartato (D), asparaginas (N), glutamina (Q), alanina (A) o histidina (H) en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1. La agregacion de SAP puede determinarse por cualquier numero de procedimientos conocidos que incluyen cromatograffa de filtracion en gel y dispersion dinamica de la luz (vease Ho, et. al., J Biol Chem 280:31999-32008 (2005)). Por tanto, variantes de SAP de la invencion pueden ensayarse facilmente para resistencia relativa a la agregacion en comparacion con una muestra correspondiente de otra protema SAP, por ejemplo, una muestra de SAP humano derivado del suero. En ciertas realizaciones, una variante de SAP comprende uno o mas protomeros de SAP que son al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 % al menos 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % identicos a SEQ ID NO: 1 y ii) comprende una o mas de una de las siguientes sustituciones de aminoacidos: E167D, E167N, E167Q E167A, E167H. Cualquiera de los protomeros de SAP anteriormente mencionados que son resistentes a la auto-agregacion puede comprender ademas cualquiera de las otras modificaciones de aminoacidos descritas en el presente documento.

La glicosilacion de polipeptidos normalmente esta enlazada tanto en N como enlazada en O. Enlazada en N se refiere a la union del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripeptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoacido, salvo prolina, son las secuencias de reconocimiento para la union enzimatica de un resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Asf, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripeptidos en un polipeptido crea un posible sitio de glicosilacion enlazado en N. La glicosilacion enlazada en O se refiere a la union de restos de azucar (por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa) a un hidroxiaminoacido, lo mas comunmente sobre un residuo de serina o treonina.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona una variante de SAP que comprende al menos un protomero de SAP que esta sustancialmente libre de glicanos. Por “sustancialmente libre”“ se indica que al menos aproximadamente el 25 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 27 %, al menos el aproximadamente el 30 %, al menos el aproximadamente el 35 %, al menos el aproximadamente el 40 %, al menos el aproximadamente el 45 %, al menos el aproximadamente el 50 %, al menos el aproximadamente el 55 %, al menos el aproximadamente el 60 %, al menos el aproximadamente el 65 %, al menos el aproximadamente el 70 %, al menos el aproximadamente el 75 %, al menos el aproximadamente el 80 %, al menos el aproximadamente el 85 %, al menos el aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 %) de los aminoacidos del protomero de SAP no estan glicosilados. En realizaciones preferidas, un protomero de SAP, o variante de SAP, esta libre de cualquier estructura enlazada a glicano.

En algunas realizaciones, los protomeros de SAP de la divulgacion se han modificado para inhibir la union de glicanos enlazados en N, glicanos enlazados en O o glicanos enlazados tanto en N como en O. La eliminacion de sitios de glicosilacion enlazados en N sobre una variante de SAP se lleva a cabo modificando (por ejemplo, por delecion, adicion o sustitucion de aminoacidos) la secuencia de aminoacidos de uno o mas de los protomeros de SAP de forma que el protomero carezca de una o mas de las secuencias de tripeptidos anteriormente descritas (para sitios de glicosilacion enlazados en N). La alteracion tambien puede incluir la delecion o sustitucion de uno o mas residuos de serina o treonina del protomero de SAP. En realizaciones preferidas, una variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido variante en la posicion 32, 33 y/o 34 de SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas, un protomero de SAP variante comprende un aspartato (D), glutamina (Q) o glutamato (E) en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1. Un protomero de SAP variante tambien puede comprender, independientemente o en combinacion con, una prolina en la posicion 33 de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, una variante de SAP comprende uno o mas protomeros que son i) al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 % al menos 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % identicos a SEQ ID NO: 1 y ii) comprende una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: N32D, N32Q, N32E, 33P. Cualquiera de los protomeros de SAP anteriormente mencionados que estan sustancialmente libres de glicanos puede comprender ademas cualquiera de las otras modificaciones de aminoacidos descritas en el presente documento.

En ciertos aspectos, una variante de SAP de la invencion comprende uno o mas protomeros de SAP que comprenden uno o mas aminoacidos covalentemente unidos a uno o mas poifmeros inertes.

Un polfmero inerte unido a un protomero de SAP puede ser de cualquier peso molecular eficaz y puede estar ramificado o sin ramificar. Polnrieros usados en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, (a) dextrano y derivados de dextrano, que incluyen sulfato de dextrano, dextrina reticulada y carboximetildextrina; (b) celulosa y derivados de celulosa, que incluyen metilcelulosa y carboximetilcelulosa; (c) almidon, ciclodextrinas y dextrinas y derivados de los mismos; (d) polialquilenglicol y derivados del mismo, que incluyen PEG, mPEG, homopolnTieros de p Eg , homopolfmeros de polipropilenglicol, copolfmeros de etilenglicol con propilenglicol, en los que dichos homopol^meros y copolfmeros estan sin sustituir o sustituidos en un extremo con un grupo alquilo; (e) heparina y fragmentos de heparina; (f) poli(alcohol vimlico) y eteres poliviniletflicos; (g) polivinilpirrolidona; (h) a,p-poli((2-hidroxietil)-DL-aspartamida; y (i) polioles polioxietilados. Cualquiera de los protomeros de SAP anteriormente mencionados que tenga uno o mas aminoacidos covalentemente unidos a uno o mas pol^eras inertes puede comprender ademas cualquiera de las modificaciones de aminoacidos descritas en el presente documento.

En realizaciones preferidas, la divulgacion proporciona una variante de SAP que comprende uno o mas protomeros de SAP que comprenden al menos un aminoacido covalentemente unido a un resto de polietilenglicol. En algunas realizaciones, el peso molecular de un resto de polietilenglicol es entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el termino “aproximadamente” que, en preparaciones de polietilenglicol, algunas moleculas pesaran mas, algunos menos, que el peso molecular establecido). Pueden usarse otros tamanos, dependiendo del perfil terapeutico deseado (por ejemplo, la duracion de la liberacion sostenida deseada, el grado o ausencia de antigenicidad, etc.). En ciertas realizaciones, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de al menos 1, al menos 20, o al menos 40 kDa. El polietilenglicol puede tener una estructura ramificada y polietilenglicoles ramificados se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999). Los restos de polietilenglicol pueden unirse a una variante de SAP con consideracion de efectos sobre las porciones catalfticas o que eligen diana.

En realizaciones preferidas, la divulgacion proporciona una variante de SAP que comprende uno o mas protomeros de SAP que comprenden al menos un aminoacido covalentemente unido a un resto de dextrano. En algunas realizaciones, el peso molecular de un resto de dextrano unido al protomero de SAP esta generalmente entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 250 kDa (indicando el termino “aproximadamente” que, en preparaciones de conjugados de dextrano, algunas moleculas pesaran mas, algunos menos, que el peso molecular establecido). Pueden usarse otros tamanos, dependiendo del perfil terapeutico deseado (por ejemplo, la duracion de la liberacion sostenida deseada, el grado o ausencia de antigenicidad, etc.). En ciertas realizaciones, el dextrano puede tener un peso molecular promedio de al menos 1, al menos 20, o al menos 40 kDa. SAP puede conjugarse con dextrano o un derivado de dextrano que incluye sulfato de dextrano, dextrano reticulado con p-aminoetilo y carboximetildextrano.

(ii) Oligomeros de SAP

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona oligomeros de SAP que comprenden dos o mas pentameros de SAP. En aspectos preferidos, los oligomeros de SAP son pentameros covalentemente reticulados, es decir, mediante reticulaciones protomero-protomero.

Hay un gran numero de agentes de reticulacion qmmicos que son conocidos para aquellos expertos en la materia, ademas de su procedimiento de uso. En ciertas realizaciones, los pentameros de SAP se reticulan usando uno o mas reticulantes heterobifuncionales, que pueden usarse para enlazar protemas de una manera escalonada. Los reticulantes heterobifuncionales proporcionan la capacidad de disenar procedimientos de acoplamiento mas especficos para conjugar protemas, reduciendo asf los casos de reacciones secundarias no deseadas tales como polnrieros de homoproterna. Se conocen en la tecnica una amplia variedad de reticulantes heterobifuncionales. Estos incluyen: 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 6-((3-(2-piridilditio)propionato)hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP). Aquellos agentes de reticulacion que tienen restos de N-hidroxisuccinimida pueden obtenerse como los analogos de N-hidroxisulfosuccinimida, que generalmente tienen mayor solubilidad en agua. Ademas, aquellos agentes de reticulacion que tienen puentes de disulfuro dentro de la cadena de enlace pueden sintetizarse en lugar de los derivados de alquilo de manera que se reduzca la cantidad de escision de conectores in vivo.

Ademas de los reticulantes heterobifuncionales, existen varios otros agentes de reticulacion que incluyen reticulantes homobifuncionales y fotorreactivos. Suberato de disuccinimidilo (DSS), bismaleimidohexano (BMH) y dimetilpimelimidato-2HCl (DMP) son ejemplos de agentes de reticulacion homobifuncionales utiles y bis-(P-(4-azidosalicilamido)etil)disulfuro (BASED) y N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato (SANPAH) son ejemplos de reticulantes fotorreactivos utiles para su uso en la presente invencion. Para una revision de tecnicas de acoplamiento de protemas vease Means et al. (1990) Bioconjugate Chemistry 1:2-12.

Una clase particularmente util de reticulantes heterobifuncionales, incluidos anteriormente, contiene el grupo reactivo de amina primaria, N-hidroxisuccinimida (NHS), o su analogo soluble en agua N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS). Las aminas primarias (grupos epsilon-lisina) a pH alcalino no estan protonadas y reaccionan por ataque nucleofilo sobre esteres de NHS o sulfo-NHS. Esta reaccion produce la formacion de un enlace amida y la liberacion de NHS o sulfo-NHS como subproducto.

Los tioles tambien son grupos reactivos particularmente utiles como parte de un reticulante heterobifuncional. Grupos reactivos de tiol comunes incluyen maleimidas, halogenos y disulfuros de piridilo. Las maleimidas reaccionan especficamente con sulfhidrilo libres (residuos de cistema) en minutos, en condiciones de ligeramente acidas a neutras (pH 6,5-7,5). Los halogenos (funciones de yodoacetilo) reaccionan con grupos -SH a pH fisiologico. Ambos de estos grupos reactivos producen la formacion de enlaces tioeter estables.

Un tercer componente del reticulante heterobifuncional es el brazo espaciador o puente. El puente es la estructura que conecta los dos extremos reactivos. La caractenstica mas evidente del puente es su efecto sobre el impedimento esterico. En algunos casos, un puente mas largo puede abarcar mas facilmente la distancia necesaria para enlazar dos biomoleculas complejas.

La preparacion de conjugados de protema-protema usando reactivos heterobifuncionales es un proceso de dos etapas que implican la reaccion de amina y la reaccion de sulfhidrilo y tales procesos son generalmente muy conocidos en la tecnica. Veanse, por ejemplo, Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263); Ellman et al. (1958) Arch. Biochem. Biophys.

74:443; Riddles et al. (1979) Anal. Biochem. 94:75); Blattler et al. (1985) Biochem 24:1517).

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona un oligomero de SAP covalentemente reticulado que comprende al menos dos pentameros de SAP, en el que cada uno de los pentameros de SAP comprende cinco protomeros de SAP. En ciertas realizaciones, los oligomeros de SAP pueden estar compuestos por protomeros de SAP al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100% identicos a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, los oligomeros de SAP pueden comprender al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o mas de los protomeros de SAP variantes descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los oligomeros de SAP pueden comprender al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o mas protomeros de SAP variantes diferentes como se describen en el presente documento. En realizaciones preferidas, un oligomero de SAP reticulado se caracteriza por uno o mas de elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vitro y elevada estabilidad in vivo en comparacion con una muestra correspondiente de SAP aislado de suero humano. En ciertas realizaciones, los oligomeros de SAP reticulados tienen una o mas de las siguientes caractensticas en comparacion con SAP humano derivado del suero: elevada resistencia a proteasa, elevada resistencia a la auto-agregacion mediada por calcio y elevada union a ion metalico.

Procedimientos de produccion de variantes de SAP

En parte, la divulgacion proporciona procedimientos para generar las variantes de SAP y oligomeros de SAP de la invencion. Las variantes de SAP de la divulgacion pueden comprender al menos un protomero que tiene una o mas alteraciones de aminoacidos que modifican al menos una actividad biologica de la protema SAP. Como se describe en el presente documento, procedimientos de generacion de alteraciones de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a, mutar al menos un aminoacido de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, delecion de uno o mas aminoacidos, adicion de uno o mas aminoacidos, o sustitucion de uno o mas aminoacidos), modificar qmmicamente uno o mas aminoacidos de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, unir uno o mas polipeptidos inertes a un aminoacido de SEQ ID NO: 1), o una combinacion de los mismos.

En ciertos aspectos, pueden generarse protomeros de SAP variantes de la invencion usando tecnicas de mutagenesis al azar, tecnicas de mutagenesis dirigida, evolucion dirigida, o combinacion de las mismas. Pueden generarse protomeros de SAP variantes usando tecnicas que introducen mutaciones aleatorias o dirigidas en la secuencia codificante de un acido nucleico. El acido nucleico se expresa entonces en un sistema de expresion deseado y el peptido resultante se evalua para propiedades de interes, por ejemplo, resistencia a la auto-agregacion, resistencia a la escision por proteasas, elevada union a ion metalico, elevada semivida en suero, elevada semivida in vitro, elevada semivida in vivo. Tecnicas para introducir mutaciones aleatorias o dirigidas en secuencias de ADN son muy conocidas en la tecnica e incluyen mutagenesis por PCR, mutagenesis por saturacion y enfoques de oligonucleotidos degenerados. Veanse Sambrook y Russell (2001, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) y Ausubel et al. (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

En la mutagenesis mediante la PCR aleatoria se usa fidelidad reducida de la polimerasa Taq para introducir mutaciones aleatorias en un fragmento de ADN clonado (Leung et al., 1989, Technique 1: 11-15). La region de ADN que va a mutagenizarse se amplifica usando PCR en condiciones que reducen la fidelidad de la smtesis de ADN por la ADN polimerasa Taq usando, por ejemplo, una relacion dGTP/dATP alterada y anadiendo Mn2+ a la reaccion de la PCR. El conjunto de fragmentos de ADN amplificados se inserta en vectores de clonacion adecuados para proporcionar bibliotecas de mutantes aleatorios.

La mutagenesis por saturacion permite la rapida introduccion de un gran numero de sustituciones de una sola base en fragmentos de ADN clonados (Mayers et al., 1985, Science 229:242). Esta tecnica incluye la generacion de mutaciones, por ejemplo, mediante tratamiento qmmico o irradiacion de ADN monocatenario in vitro y la smtesis de una hebra de ADN complementario. Puede modularse la frecuencia de la mutacion modulando la gravedad del tratamiento y pueden obtenerse esencialmente todas las sustituciones de bases posibles. Debido a que este procedimiento no implica una seleccion genetica de fragmentos de mutantes, se obtienen sustituciones neutras, asf como aquellas que alteran la funcion. Ademas, la distribucion de mutaciones puntuales no esta sesgada hacia elementos de secuencias conservados.

Tambien puede generarse una biblioteca de homologos de acidos nucleicos a partir de un conjunto de secuencias de oligonucleotidos degenerados. Puede llevarse a cabo la smtesis qmmica de secuencias de oligonucleotidos degenerados en un sintetizador automatico de ADN y los genes sinteticos pueden entonces asociarse en un vector de expresion adecuado. Se conoce en la tecnica la smtesis de oligonucleotidos degenerados (veanse, por ejemplo, Narang, S A (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp. 273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Tales tecnicas se han empleado en la evolucion dirigida de otros peptidos (veanse, por ejemplo, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87:6378-6382; asf como las patentes de EE.UU. N.°s: 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).

Los protomeros de SAP variantes tambien pueden generarse usando tecnicas de “evolucion dirigida”. Estas estrategias son diferentes de los procedimientos de mutagenesis aleatoria tradicionales debido a que implican someter la secuencia de acido nucleico que codifica el peptido de interes a rondas repetitivas de mutacion, cribado y amplificacion.

En algunas tecnicas de “evolucion dirigida”, la diversidad de los acidos nucleicos obtenidos se genera mediante procedimientos de mutacion que crean al azar mutaciones puntuales en la secuencia de acido nucleico. Las tecnicas de mutacion puntual incluyen, pero no se limitan a, “error-prone PCRTM” (Caldwell y Joyce, 1994; PCR Methods Appl. 2:28 33; y Ke y Madison, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3371-3372), mutagenesis dirigida a oligonucleotidos repetidos (Reidhaar-Olson et al., 1991, Methods Enzymol. 208: 564-586) y cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados de mutagenesis aleatoria.

Otro procedimiento para crear diversidad mediante el que puede actuar la evolucion dirigida es el uso de genes mutadores. El acido nucleico de interes se cultiva en una cepa de celulas mutadoras, cuyo genoma normalmente codifica los genes de reparacion del ADN defectuoso (patente de Ee .UU. N.° 6.365.410; Selifonova et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649; Long-McGie et al., 2000, Biotech. Bioeng. 68:121-125; vease Genencor International Inc., Palo Alto Calif.).

El logro de diversidad usando tecnicas de evolucion dirigida tambien puede realizarse usando mutagenesis de saturacion junto con cebadores degenerados (Gene Site Saturation Mutagenesis™, Diversa Corp., San Diego, CA). En este tipo de mutagenesis de saturacion se usan cebadores degenerados disenados para cubrir la longitud de la secuencia de acido nucleico que va a diversificarse para cebar la polimerasa en las reacciones de la PCR. De este modo, cada codon de una secuencia codificante para un aminoacido puede mutarse para codificar cada uno de los diecinueve aminoacidos usuales que quedan. Esta tecnica tambien puede usarse para introducir mutaciones, deleciones e inserciones en regiones especficas de una secuencia codificante de acido nucleico dejando a la vez sin tocar el resto de la molecula del acido nucleico. Los procedimientos para la tecnica de saturacion de genes son muy conocidos en la tecnica y pueden encontrarse en la patente de los EE.UU. N.°: 6.171.820.

Tambien pueden generarse protomeros de SAP variantes usando las tecnicas de transposicion de genes, transposicion de motivos, transposicion de exones y/o transposicion de codones (denominadas en su conjunto “transposicion de ADN”). Las tecnicas de transposicion del ADN tambien pueden emplearse para modular las actividades de peptidos utiles en la invencion y pueden usarse para generar peptidos que tengan actividad alterada. Veanse, en general, las patentes de EE.UU. N.°s: 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; y 5.837.458 y Stemmer et al. (1994, Nature 370(6488):389-391); Crameri et al. (1998, Nature 391 (6664):288-291); Zhang et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(9):4504-4509); Stemmer et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91(22):10747-10751), Patten et al. (1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33); Harayama, (1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82); Hansson, et al., (1999, J. Mol. Biol.

287:265-76); y Lorenzo and Blasco (1998, Biotechniques 24(2):30813).

La transposicion de ADN implica el ensamblaje de dos o mas segmentos de ADN mediante recombinacion homologa o espedfica de sitio para generar variacion en la secuencia del polinucleotido. Se ha usado transposicion de ADN para generar variaciones novedosas de protemas del virus de tipo 1 de la inmunodeficiencia humana (Pekrun et al., 2002, J. Virol. 76(6):2924-35), triazina hidrolasas (Raillard et al. 2001, Chem Biol 8(9):891-898), protemas del virus de la leucemia murina (VLM) (Powell et al. 2000, Nat Biotechnol 18(12):1279 1282) e indolglicerol fosfato sintasa (Merz et al. 2000, Biochemistry 39(5):880889).

La tecnica de transposicion de ADN fue desarrollada para generar diversidad biomolecular imitando la recombinacion natural permitiendo la recombinacion homologa in vitro del ADN (Stemmler, 1994, Nature 370: 389-391; y Stemmler, 1994, PNAS 91: 10747-10751). Generalmente, en este procedimiento, una poblacion de genes relacionados se fragmenta y se somete a ciclos repetitivos de desnaturalizacion, rehibridacion, seguidas por la extension de los nucleotidos protuberantes de 5' por la polimerasa Taq. Con cada ciclo, la longitud de los fragmentos aumenta y se produce la recombinacion de ADN cuando los fragmentos que se originan a partir de diferentes genes se hibridan entre sf. La fragmentacion inicial del ADN se realiza normalmente por digestion con nucleasas, usando normalmente DNasa (veanse las referencias a Stemmler, anteriormente), pero tambien puede realizarse por smtesis interrumpida de PCR (patente de EE.UU. N.°: 5.965.408, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad; vease, Diversa Corp., San Diego, CA). Los procedimientos de transposicion del ADN tienen ventajas sobre los procedimientos de mutaciones puntuales aleatorias porque se consigue la recombinacion directa de mutaciones beneficiosas generadas por cada ronda de transposicion y, por tanto, existe una auto-seleccion de fenotipos mejorados de peptidos. Las tecnicas de transposicion de ADN son muy conocidas para los expertos en la materia. Explicaciones detalladas de tal tecnologfa se encuentran en Stemmler, 1994, Nature 370: 389-391 y Stemmler, 1994, PNAS 91: 10747-10751. La tecnica de transposicion de ADN tambien se describe en las patentes de EE.UU. N.°s: 6.180.406, 6.165.793, 6.132.970, 6.117.679, 6.096.548, 5.837.458, 5.834.252, 5.830.721,5.811.238 y 5.605.793.

La tecnica tambien proporciona modificaciones incluso mas recientes de la tecnica basica de transposicion de ADN. En un ejemplo, la transposicion de exones, exones o combinaciones de exones que codifican dominios espedficos de peptidos se amplifican usando oligonucleotidos quimericos. A continuacion, las moleculas amplificadas se recombinan autocebando el ensamblaje de PCR (Kolkman y Stemmler, 2001, Nat. Biotech. 19:423-428). En otro ejemplo, usando la tecnica de quimeragenesis aleatoria en la construccion de bibliotecas mediante moldes transitorios (RACHITT), se hibridan fragmentos de ADN parental monocatenario sobre un molde monocatenario de longitud completa (Coco et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19:354-359). En otro ejemplo mas, el proceso de extension por etapas (StEP), se emplea el termociclado con ciclos de hibridacion/extension muy abreviados para interrumpir repetidamente la polimerizacion del ADN a partir de cebadores flanqueantes (Zhao et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:258-261). En la tecnica conocida como CLERY, se combina la transposicion de la familia in vitro con la recombinacion homologa in vivo en levadura (Abecassis et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:E88). Para maximizar la recombinacion intergenica, el ADN monocatenario de hebras complementarias de cada uno de los acidos nucleicos se digiere con DNasa y se hibrida (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137). Los extremos romos de dos acidos nucleicos truncados de longitudes variables que estan enlazados por una secuencia escindible se enlazan a continuacion para generar la fusion genica sin recombinacion homologa (Sieber et al., 2001, Nat Biotechnol. 19: 456-460; Lutz et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:E16; Ostermeier et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:1205-1209; Lutz y Benkovic, 2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11:319-324). Tambien se ha potenciado la recombinacion entre acidos nucleicos con poca homologfa de secuencias en comun usando extremos romos mediados por exonucleasas de fragmentos de ADN y enlazando los fragmentos juntos para recombinarlos (patente de EE.UU. N.°: 6.361.974).

Ademas de los protocolos publicados que detallan las tecnicas de evolucion dirigida y de transposicion de genes, ahora estan disponibles servicios comerciales que llevan a cabo los procedimientos de transposicion y de seleccion de genes en los peptidos de eleccion. Maxygen (Redwood City, CA) ofrece servicios comerciales para generar bibliotecas personalizadas de ADN transpuesto. Ademas, esta empresa realizara procedimientos personalizados de evolucion dirigida que incluyen la transposicion y la seleccion de genes de una familia de peptidos de eleccion.

Optigenix, Inc. (Newark, Del.) ofrece el servicio relacionado de transposicion de plasmidos. Optigenix usa familias de genes para obtener mutantes de los anteriores que tienen nuevas propiedades. El acido nucleico de interes se clona en un plasmido en un sistema de expresion de Aspergillus. A continuacion, el ADN de la familia relacionada se introduce en el sistema de expresion y se produce la recombinacion en las regiones conservadas de la familia en el huesped. A continuacion, el ADN mutante resultante se expresa y se criba el peptido producido a partir del anterior para la presencia de propiedades deseadas y la ausencia de propiedades no deseadas.

Tras cada ronda repetitiva de “evolucion”, los peptidos deseados expresados mediante genes mutados se criban para las caractensticas de interes. Los genes “candidates” se amplifican a continuacion y se combinan para la siguiente ronda de transposicion del ADN. El procedimiento de cribado usado es muy dependiente del peptido que se esta “evolucionando” y las caractensticas de interes. Pueden seleccionarse caractensticas tales como la estabilidad del peptido, actividad biologica, antigenicidad, entre otras, usando procedimientos que son muy conocidos en la tecnica.

El tecnico experto apreciara que las anteriores tecnicas de mutacion y seleccion pueden combinarse entre s^ y con procedimientos adicionales para generar el mejor protomero de SAP variante posible util en los procedimientos de la invencion. Asf, la invencion no se limita a un procedimiento espedfico para la generacion de variantes de SAP y debe considerarse que engloba todas y cada una de las metodologfas descritas en el presente documento. Por ejemplo, inicialmente puede realizarse un procedimiento para introducir mutaciones puntuales especificadas en una secuencia de acido nucleico, seguido de rondas repetitivas de transposicion, seleccion y amplificacion de ADN. Para algunas variantes puede usarse la introduccion inicial de mutaciones puntuales para introducir diversidad en una poblacion de genes que carece de esta y la siguiente ronda de transposicion y cribado de ADN seleccionara mutaciones puntuales ventajosas.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona procedimientos para modificar qmmicamente uno o mas aminoacidos de un protomero de SAP. Hay varios procedimientos descritos en la materia para unir polfmeros inertes a un polipeptido que incluyen, pero no se limitan a, usar bromuro de cianogeno (alquilacion) y qmmica de acoplamiento de dialdehfdos y oxidacion con peryodato. En particular, se han descrito en la materia muchos procedimientos para PEGilar aminoacidos. Por ejemplo, la patente de e E.UU. N.°: 4.088.538 desvela un conjugado de polfmero enzimaticamente activo de enzimapolfmero de una enzima covalentemente unida a PEG. Similarmente, la patente de EE.UU. N.°: 4.496.689 desvela un complejo covalentemente unido del inhibidor a-1 de la proteasa con un polnriero tal como PEG o metoxipoli(etilenglicol) (“mPEG”). Abuchowski et al. (J. Biol. Chem. 252: 3578 (1977) desvelan la union covalente de mPEG a un grupo amina de albumina de suero bovino. La patente de EE.UU. N.°: 4.414.147 desvela un procedimiento de conversion de interferon menos hidrofobo conjugandolo con un antedrido de un acido dicarboxflico, tal como poli(anfndrido etilensucdnico). El documento PCT WO 87/00056 desvela la conjugacion de PEG y polioles polioxietilados con protemas tales como interferon-p, interleucina-2 e inmunotoxinas. El documento EP 154.316 desvela y reivindica linfocinas qmmicamente modificadas, tales como IL-2, que contienen PEG unido directamente a al menos un grupo amino primario de la linfocina. La patente de EE.UU. N.°: 4.055.635 desvela composiciones farmaceuticas de un complejo soluble en agua de una enzima proteolftica asociada covalentemente a una sustancia polimerica tal como un polisacarido. Otro modo de unir PEG a peptidos es mediante la oxidacion no espedfica de residuos de glicosilo sobre un peptido. El azucar oxidado se utiliza como locus para unir un resto de PEG al peptido. Por ejemplo, el documento WO 94/05332 desvela el uso de una hidracina- o amino-PEG para anadir PEG a una glicoprotema. Los restos de glicosilo se oxidan al azar a los aldehfdos correspondientes, que posteriormente se acoplan al amino-PEG.

La divulgacion tambien proporciona variantes de SAP que comprenden pegilacion especfica de sitio. En algunas realizaciones, un protomero de SAP se modifica por la introduccion de residuos de cistema “libres” (es decir, cistemas que no participan en enlaces disulfuro) a los que el PEG puede unirse usando qmmica de malaimida bien descrita (vease, por ejemplo, Natarajan, Bioconjug chem. 2005 En-Feb;16(1):113-21; Goodson, Biotechnology NY. 1990 Apr;8(4):343-6). Se proporcionan variantes de SAP modificadas, en las que los sitios de conjugacion de polfmeros se introducen mediante residuos de cistema de variante. El residuo de cistema puede sustituirse con uno o mas residuos de aminoacidos de SAP nativos o anadiendo una o mas cistemas a un polipeptido SAP. En algunas realizaciones, un residuo de cistema se introduce en la posicion -1 de SEQ ID NO: 1 (es decir, se anade al extremo N del polipeptido). En algunas realizaciones, un residuo de cistema se introduce por la sustitucion del aminoacido nativo en una posicion 32 de SEQ ID NO: 1 con un residuo de cistema. En algunas realizaciones, la cistema introducida esta PEGilada.

Para la pegilacion de residuos de cistema, el polipeptido puede tratarse con un agente reductor, tal como ditiotreitol (DDT) antes de la pegilacion. El agente reductor se elimina posteriormente por cualquier procedimiento convencional, tal como por desalacion. La conjugacion de PEG con un residuo de cistema normalmente tiene lugar en un tampon adecuado a pH 6-9 a temperaturas variables de 4 °C a 25 °C durante periodos de hasta aproximadamente 16 horas. Ejemplos de polfmeros de PEG activados para acoplar con residuos de cistema incluyen los siguientes PEG lineales y ramificados, que incluyen, pero no se limitan a, vinilsulfona-PEG (PEG-VS), tal como vinilsulfona-mPEG (mPEG-VS); disulfuro de ortopiridilo-PEG (PEG-OPSS), tal como disulfuro de ortopiridilo-mPEG (MPEG-OPSS); y maleimida-PEG (PEG-MAL), tal como maleimida-mPEG (mPEG-MAL) y maleimida-mPEG2 ramificado (mPEG2-MAL).

Un enfoque para anadir PEG o dextrano a SAP utiliza la enzima transglutaminasa (glutamil-peptido y-glutamiltransferasa; EC 2.3.2.13). Esta enzima cataliza la adicion de acilo dependiente del calcio a una amina primaria en la que el grupo gamma-carboxamida del residuo de glutamina unido al peptido es el donante de acilo y la amina primaria es el aceptor de acilo y el donante de amina. Por tanto, se emplea una reaccion de transglutaminasa para conjugar covalentemente y de forma espedfica de sitio SAP con un polnriero, tal como PEG o dextrano mediante un residuo de Gln que es capaz de actuar de aceptor de amina de la transglutaminasa.

El aceptor de amina de la transglutaminasa en SAP puede ser un residuo de Gln nativo o introducido (es decir, variante). En general, se ha mostrado que las repeticiones de glutamina potencian las propiedades aceptoras de cada residuo de glutamina en la repeticion y tambien se ha mostrado que la accesibilidad de residuos de glutamina es importante en determinar su capacidad para funcionar de sustratos de transglutaminasa (Kahlem, P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 14580-14585). En algunas realizaciones, la variante de SAP comprende una mutacion N32Q, que introduce un aceptor de amina de la transglutaminasa. En algunas realizaciones, la variante de SAP comprende la secuencia de aminoacidos al menos el 70, 80, 85, 90, 95, 98 o el 100 % identica a SEQ ID NO: 2 (en la que X es cualquier aminoacido, Aes3 a 20 e Yes 1 a 10):

XaQyHTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLQNFTLCFRAYSDLS

RAYSLFSYNTQGRDNELLVYKERVGEYSLYIGRHKVTSKVIEKFPAP

VHIC V S WES S SG1AEF WIN GTPL VKKGLRQG YF VE AQPKJ VLGQEQD

SYGGKFDRSQSFVGEIGDLYMWDSVLPPENILSAY QGTPLPANILDW

QALNYEIRGYVIIKPLVWV (SEQ ID NO: 2)

En algunas realizaciones, Yes 1. En algunas realizaciones, y es 2. En algunas realizaciones, la variante de SAP esta conjugada con PEG mediante un aceptor de amina de la transglutaminasa. En algunas realizaciones, la variante de SAP esta conjugada con dextrano mediante un aceptor de amina de la transglutaminasa.

Se han descrito en la tecnica procedimientos para anadir polimeros a residuos de Gln (veanse, por ejemplo, la publication de EE.UU. N.° 20060116322, Sugimuraet al. 281 (26): 17699. (2006); Sato, H. Adv Drug Deliv Rev. 2002 Jun 17;54(4):487-504; Sato, et al, Bioconjug Chem. 2000 Jul-Aug;11(4):502-9; Sato, et al Bioconjug Chem. 2001 Sep-Oct;12(5):701-10, Fontana, et al Adv Drug Deliv Rev. 2008 Jan 3;60(1):13-28. Epub 2007 Aug 16, Hohenadl, J Biol Chem. 1995 Oct 6;270(40):23415-20)). Los polimeros se enlazan o modifican para contener una amina primaria que actuara de donante de amina de la transglutaminasa.

Pueden producirse variantes de SAP y oligomeros de SAP covalentemente reticulados descritos en el presente documento en celulas bacterianas, celulas de insecto, levadura, celulas fungicas o celulas de mamifero que incluyen, por ejemplo, celulas humanas. En aquellos casos en los que la celula huesped es humana, la celula puede estar en un sujeto vivo o puede aislarse de un sujeto, por ejemplo, en un cultivo celular, muestra de tejido, suspension de celulas, etc. Otras celulas huesped adecuadas son conocidas para aquellos expertos en la materia.

La divulgation proporciona ademas vectores de expresion para producir protomeros de SAP. Por ejemplo, se contemplan vectores de expresion que incluyen una secuencia de nucleotidos que codifica un protomero de SAP, en el que la secuencia codificante esta operativamente enlazada a al menos una secuencia reguladora transcripcional. Secuencias reguladoras para dirigir la expresion de protomeros de SAP son reconocidas en la tecnica y se seleccionan por varios criterios bien entendidos. Secuencias reguladoras a modo de ejemplo se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, puede usarse cualquiera de una amplia variedad de secuencias reguladoras que controlan la expresion de una secuencia de ADN cuando se enlazan operativamente a ella en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican protomeros de SAP. Tales secuencias de control de la expresion utiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardios del SV40, promotor temprano inmediato del adenovirus o citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, promotor T7 cuya expresion esta dirigida por T7 ARN polimerasa, un promotor para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicoliticas, los promotores de acido fosfatasa, por ejemplo, Pho5 y los promotores de los factores de apareamiento a de la levadura y otras secuencias conocidas por controlar la expresion de genes de celulas procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la election de la celula huesped diana que va a transformarse. Ademas, tambien debe considerarse el numero de copias del vector, la capacidad para controlar ese numero de copias y la expresion de cualquier otra proteina codificada por el vector, tal como marcadores de antibiotico.

La divulgacion tambien proporciona una celula huesped transfectada con un gen recombinante con el fin de expresar un protomero de SAP. La celula huesped puede ser cualquier celula procariota o eucariota. Por ejemplo, puede expresarse un protomero de SAP en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto, levadura, o celulas de mamifero. Otras celulas huesped adecuadas son conocidos para aquellos expertos en la materia.

Por consiguiente, la divulgacion proporciona procedimientos de production de protomeros de SAP. Por ejemplo, puede cultivarse una celula huesped transfectada con un vector de expresion que codifica un protomero de SAP de la invention en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresion del polipeptido. El protomero de SAP puede secretarse, por inclusion de una secuencia senal de la secretion y aislarse de una mezcla de celulas y medio que contiene la proteina. Alternativamente, el protomero de SAP puede ser retenido citoplasmicamente y las celulas recogerse, lisarse y aislarse el protomero. Un cultivo celular incluye celulas huesped, medios y otros subproductos. Medios adecuados para el cultivo celular son muy conocidos en la tecnica. Las proteinas pueden aislarse del medio de cultivo celular, celulas huesped, o ambos, usando tecnicas conocidas en la tecnica para purificar proteinas, que incluyen cromatografia de intercambio ionico, cromatografia de filtration en gel, ultrafiltracion, electroforesis y purification por inmunoafinidad con anticuerpos espedficos para epitopos particulares de la proteina.

Asi, puede usarse una secuencia codificante para un protomero de SAP para producir una forma recombinante de la proteina mediante procesos microbianos o celulares eucariotas. El enlazar la secuencia de polinucleotidos en una construccion genica, tal como un vector de expresion y transformar o transfectar en huespedes, tanto eucariotas (levadura, aviares, de insecto o de mairnfero) como procariotas (celulas bacterianas), son procedimientos convencionales.

Vehmulos de expresion para la produccion de una protema recombinante incluyen plasmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores adecuados para la expresion de protomeros de SAP incluyen plasmidos de los tipos: plasmidos derivados de pBR322, plasmidos derivados de pEMBL, plasmidos derivados de pEX, plasmidos derivados de pBTac y plasmidos derivados de pUC para la expresion en celulas procariotas, tales como E. coli.

Existen varios vectores para la expresion de protemas recombinantes en levadura. Por ejemplo, yEp24, YIp5, YEp51, YEp52, pYES2 y YRp17 son vehmulos de clonacion y expresion utiles en la introduccion de construcciones geneticas en S. cerevisiae (vease, por ejemplo, Broach et al., (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83). Estos vectores pueden replicarse en E. coli debido a la presencia de pBR322 ori y en S. cerevisiae debido al determinante de replicacion del plasmido de 2 micrometros de levadura. Frecuentemente se usa seleccion o contraseleccion autotrofa en levadura. Ademas, puede usarse resistencia a marcadores de farmaco, tales como ampicilina, en bacterias.

Los vectores de expresion de m ai^ero pueden contener tanto secuencias procariotas para facilitar la propagacion del vector en bacterias, como una o mas unidades de transcripcion eucariotas que se expresan en celulas eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2 gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresion de m ai^ero adecuados para la transfeccion de celulas eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plasmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicacion y resistencia a la seleccion de farmacos en tanto celulas procariotas como eucariotas. Alternativamente, pueden usarse derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresion transitoria de protemas en celulas eucariotas. Pueden encontrarse ejemplos de otros sistemas de expresion virales (incluyendo retrovirales) mas adelante en la descripcion de los sistemas de administracion de terapia genica. Los diversos procedimientos empleados en la preparacion de los plasmidos y transformacion de organismos huesped son muy conocidos en la tecnica. Para otros sistemas de expresion adecuados para tanto celulas procariotas como eucariotas, ademas de procedimientos recombinantes generales, vease Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Capftulos 16 y 17. En algunos casos, puede desearse expresar los polipeptidos sAp recombinantes por el uso de un sistema de expresion de baculovirus. Ejemplos de tales sistemas de expresion de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tales como pBlueBac III que contiene beta-gal).

En algunos casos se deseara producir protomeros de SAP en celulas de vertebrado y la propagacion de celulas de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de lmeas de celulas huesped de mam^era utiles son la lmea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de rinon embrionario humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59. (1977)); celulas de rinon de hamster bebe (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/- DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 a Tc C Cc L 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de hfgado de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de hfgado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC c Cl51); celulas TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; una lmea de hepatoma humano (Hep G2); y celulas de mieloma o de linfoma (por ejemplo, celulas Y0, J558L, P3 y NS0) (vease la patente de EE.UU. N.°: 5.807.715).

En ciertas realizaciones, la produccion de protomeros de SAP puede lograrse usando sistemas de traduccion in vitro. Los sistemas de traduccion in vitro son, generalmente, un sistema de traduccion que es un extracto libre de celulas que contiene al menos los elementos mmimos necesarios para la traduccion de una molecula de ARN en una protema. Un sistema de traduccion in vitro normalmente comprende al menos ribosomas, ARNt, metionil-ARNtMet iniciador, protemas o complejos que participan en la traduccion, por ejemplo, eIF2, eIF3, el complejo de union a la caperuza (CB), que comprende la protema de union a la caperuza (CBP) y factor de iniciacion eucariota 4F (eIF4F). Una variedad de sistemas de traduccion in vitro son muy conocidos en la tecnica e incluyen kits comercialmente disponibles. Ejemplos de sistemas de traduccion in vitro incluyen lisados eucariotas, tales como lisados de reticulocitos de conejo, lisados de ovocitos de conejo, lisados de celula humanas, lisados de celulas de insecto y extractos de germen de trigo. Los lisados estan comercialmente disponibles de fabricantes tales como Promega Corp., Madison, Wis.; Stratagene, La Jolla, Calif.; Amersham, Arlington Heights, Ill.; y GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y. Los sistemas de traduccion in vitro normalmente comprenden macromoleculas, tales como enzimas, factores de traduccion, iniciacion y alargamiento, reactivos qmmicos y ribosomas. Ademas, puede usarse un sistema de transcripcion in vitro. Tales sistemas normalmente comprenden al menos una holoenzima ARN polimerasa, ribonucleotidos y cualquier factor de iniciacion, alargamiento y terminacion de la transcripcion necesario. Pueden acoplarse transcripcion y traduccion in vitro en una reaccion de una etapa para producir protemas de uno o mas ADN aislados.

Frecuentemente, es diffcil producir grandes cantidades de una protema con consistencia reproducible en las caracterfsticas del producto, tales como modificacion y/o plegamiento post-traduccional. En algunas realizaciones, las variantes de SAP de la divulgacion se caracterizan por elevada eficiencia de fabricacion de la protema SAP (por ejemplo, mayor rendimiento del producto de protema, elevada homogeneidad del producto de protema, elevada estabilidad del producto de protema), particularmente para uso in vivo (por ejemplo, como agente terapeutico). En algunas realizaciones, las variantes de SAP de la divulgacion se caracterizan por elevada estabilidad y/o homogeneidad cuando se expresan en una celula (por ejemplo, procariota, eucariota) en comparacion con SAP silvestre expresado en la misma lmea celular. Por ejemplo, las protemas recombinantes se caracterizan generalmente por un alto grado de heterogeneidad con respecto a sus estructuras de glicano unidas. Cabrfa esperar que las variantes de SAP que tienen una secuencia de aminoacidos modificada para inhibir la glicosilacion (tal como una sustitucion de aminoacidos en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1, por ejemplo, n 32D) se produjeran mas homogeneamente a partir de una celula.

En realizaciones a modo de ejemplo, las variantes de SAP pueden purificarse, por ejemplo, a una pureza del 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 %, o mayor, con respecto a macromoleculas contaminantes, particularmente otras protemas y acidos nucleicos y libres de agentes infecciosos y pirogenos. Las variantes de SAP pueden estar sustancialmente libres de otros polipeptidos, particularmente otros polipeptidos de origen animal.

Las variantes de SAP pueden purificarse usando procedimientos y medios de fraccionamiento y/o de purificacion convencional. Puede usarse precipitacion con sulfato de amonio y extraccion con acido o caotropo para el fraccionamiento de muestras. Etapas de purificacion a modo de ejemplo pueden incluir hidroxiapatita, exclusion por tamano, FPLC y cromatograffa lfquida de alta resolucion de fase inversa. Medios de intercambio anionico adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sflices de especialidad y similares. Son adecuados derivados de PEI, DEAE, QAE y Q, que incluyen, por ejemplo, DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Medios cromatograficos a modo de ejemplo incluyen aquellos medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, tales como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacnlicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Soportes solidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sflice, resinas celulosicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticulada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada y similares que son insolubles en las condiciones en las que van a usarse. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la union de protemas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de hidrato de carbono. Ejemplos de qmmicas de acoplamiento incluyen activacion con bromuro de cianogeno, activacion con N-hidroxisuccinimida, activacion con epoxido, activacion con sulfhidrilo, activacion con hidrazida y derivados de carboxilo y amino para las qmmicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios solidos son muy conocidos y se usan ampliamente en la materia y estan disponibles de proveedores comerciales. Procedimientos para unir polipeptidos a medios de soporte son muy conocidos en la tecnica. La seleccion de un procedimiento particular es una cuestion de diseno rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte elegido. Vease, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988). Las variantes de SAP descritas en el presente documento tambien pueden aislarse de una marca de afinidad (por ejemplo, polihistidina, protema de union a maltosa, GST, dominio de union a almidon, FLAG, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificacion como se describe adicionalmente en el presente documento.

Procedimientos de tratamiento

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona procedimientos para tratar un trastorno sensible a SAP en un paciente administrando una cantidad terapeuticamente eficaz de una variante de SAP u oligomero de SAP de la invencion a un paciente en necesidad del mismo. La dosificacion y frecuencia de tratamiento pueden ser determinadas por un experto en la materia y variaran dependiendo de los smtomas, edad y peso corporal del paciente y la naturaleza y gravedad del trastorno que va a tratarse o prevenirse. En algunas realizaciones, una variante de SAP u oligomero de SAP se administra a un paciente una vez o dos veces por dfa, una vez o dos veces por semana, una vez o dos veces por mes, o justo antes de o en la aparicion de los smtomas.

Pueden determinarse facilmente dosificaciones por tecnicas conocidas para aquellos expertos en la materia o como se ensena en el presente documento. La toxicidad y eficacia terapeutica de SAP pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL⁵⁰y la DE⁵⁰. La DE⁵⁰(dosis eficaz 50) es la cantidad de farmaco requerida para producir un efecto especificado en el 50 % de una poblacion de animales. La DL⁵⁰(dosis letal 50) es la dosis de farmaco que destruye el 50 % de una poblacion de muestra.

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es fibrosis. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para la fibrosis se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N.°: 2007/0243163. Trastornos relacionados con la fibrosis que pueden ser susceptibles al tratamiento con el procedimiento objeto incluyen, pero no se limitan a, enfermedad del colageno, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar fibrotica humana (por ejemplo, bronquiolitis obliterante, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis pulmonar de una etiologfa conocida, estroma tumoral en enfermedad pulmonar, esclerosis sistemica que afecta los pulmones, smdrome de Hermansky-Pudlak, neumoconiosis de los trabajadores del carbon, asbestosis, silicosis, hipertension pulmonar cronica, hipertension pulmonar asociada al SIDA, sarcoidosis, asma de moderado a grave y similares), enfermedad vascular fibrotica, esclerosis arterial, aterosclerosis, venas varicosas, infartos coronarios, infartos cerebrales, fibrosis miocardica, fibrosis musculoesqueletica, adherencias post-quirurgicas, enfermedad renal humana (por ejemplo, smdrome nefntico, smdrome de Alport, nefropatia asociada al VIH, enfermedad renal poliqmstica, enfermedad de Fabry, nefropatia diabetica, glomerulonefritis cronica, nefritis asociada a lupus sistemico y similares), esclerosis sistemica progresiva (PSS), colangitis esclerosante primaria (PSC), fibrosis hepatica, cirrosis hepatica, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis qmstica, enfermedad cronica de injerto contra huesped, esclerodermia (local y sistemica), oftalmopatfa de Graves, retinopatia diabetica, glaucoma, enfermedad de Peyronie, fibrosis del pene, uretrostenosis despues de cistoscopio, adherencia interna despues de cirugfa, cicatrizacion, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal idiopatica, fibrosis peritoneal de una etiologfa conocida, ergotismo inducido por farmacos, fibrosis conducente a cancer benigno o maligno, fibrosis conducente a infeccion microbiana (por ejemplo, viral, bacteriana, parasitica, fungica, etc.), enfermedad de Alzheimer, fibrosis conducente a enfermedad inflamatoria del intestino (que incluye formacion de constriccion en enfermedad de Crohn y colitis microscopica), tumores de celulas del estroma, mucositis, fibrosis inducida por productos qmmicos o agresiones medioambientales (por ejemplo, quimioterapia para el cancer, pesticidas o radiacion (por ejemplo, radioterapia para el cancer)).

En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con la fibrosis se selecciona de esclerodermia sistemica o local, queloides, cicatrices hipertroficas, aterosclerosis, reestenosis, inflamacion pulmonar y fibrosis, fibrosis pulmonar idiopatica, cirrosis hepatica, fibrosis como resultado de infeccion cronica por hepatitis B o C, enfermedad renal, enfermedad cardfaca resultante de tejido cicatricial, degeneracion macular y retinopatfa retiniana y vftrea. En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con la fibrosis resulta de farmacos quimioterapeuticos, fibrosis inducida por la radiacion y lesiones y quemaduras. En algunas realizaciones, el trastorno o afeccion relacionada con la fibrosis resulta de cicatrizacion post-quirurgica, por ejemplo, tras trabeculectoirna u otra cirugfa de filtracion del ojo.

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es un trastorno de hipersensibilidad tal como aquellos mediados por respuestas Th1 o Th2. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para los trastornos de hipersensibilidad tambien se describe en la solicitud provisional de EE.UU. N.°: 61/209.795. Los trastornos relacionados con la hipersensibilidad que pueden ser susceptibles a tratamiento con SAP incluyen, pero no se limitan a, rinitis alergica, sinusitis alergica, conjuntivitis alergica, broncoconstriccion alergica, disnea alergica, aumento alergico en la produccion de moco en los pulmones, eccema atopico, dermatitis, urticaria, anafilaxis, neumonitis y asma alergica.

En algunas realizaciones, una variante de SAP u oligomero de SAP de la invencion puede usarse para tratar respuestas inmunitarias espedficas de alergenos tales como anafilaxis, a diversos antfgenos, que incluyen, pero no se limitan a, antimicrobianos (por ejemplo, cefalosporinas, sulfonamidas, penicilina y otras p-lactamas), anticonvulsivos (por ejemplo, fenitoma, fenobarbital, carbamazepina, dapsona, alopurinal y minociclina), quimioterapeuticos (por ejemplo, taxanos, compuestos de platino, asparaginasas y epipodofilotoxinas), heparina, insulina, protamina, aspirina y otros farmacos antiinflamatorios no esteroideos, relajantes musculares (por ejemplo, succinilcolina, atracurio, vecuronio y pancuronio), agentes de induccion (por ejemplo, barbituricos, etomidato, propofol), narcoticos (por ejemplo, fentanilo, meperidina, morfina), coloides para la expansion del volumen intravascular, materiales de radiocontraste, hemoderivados, latex, productos animales, caspa de animal, acaros del polvo, insectos (por ejemplo, mordeduras, picaduras o veneno), cosmeticos, metales (por ejemplo, mquel, cobalto y cromato), plantas, esporas, polen, alimentos (por ejemplo, leche, huevos, trigo, soja, cacahuetes y frutos secos de arbol, marisco), vacunacion y antfgenos fungicos (por ejemplo, especies de Aspergillus, Curvularia, Exserohilum y Alternaria).

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es un trastorno autoinmunitario tal como aquellos mediados por respuestas Th1 o Th2. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para trastornos autoinmunitarios tambien se describe en la solicitud provisional de EE.UU. N.°: 61/209.845. Trastornos relacionados autoinmunitarios que pueden ser susceptibles al tratamiento con SAP incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo I, esclerosis multiple, artritis reumatoide, artritis psoriasica, miocarditis autoinmune, penfigo, miastenia grave, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmune, artritis cronica de Lyme, cardiomiopatfa dilatada familiar, dermatomiositis juvenil, policondritis, smdrome de Sjogren, psoriasis, artritis idiopatica juvenil, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistemico, enfermedad pulmonar obstructiva cronica y enfermedad del injerto contra el huesped.

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es una mucositis. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para la mucositis tambien se describe en la solicitud de EE.UU. N.°: 12/217.614. Los procedimientos descritos en el presente documento pueden ser utiles para tratar mucositis oral, esofagica y gastrointestinal, ademas de ulceras gastricas y duodenales, o erosiones del estomago y esofago.

En algunas realizaciones, una variante de SAP u oligomero de SAP puede usarse para tratar una enfermedad inflamatoria. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria puede ser una infeccion viral, bacteriana, fungica o parasitica. El uso de SAP como tratamiento terapeutico para la infeccion viral tambien se ha descrito en la patente de EE.UU. 6.406.698 y en la solicitud PCT WO1997/026906.

Preparaciones y formulaciones farmaceuticas

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona preparaciones farmaceuticas que comprenden uno o mas agentes terapeuticos de SAP (es decir, variantes de SAP y oligomeros de SAP) formulados para administracion. Los agentes terapeuticos de la invencion pueden formularse de un modo convencional usando uno o mas vehmulos o excipientes fisiologicamente aceptables. Por ejemplo, agentes terapeuticos y sus sales y solvatos fisiologicamente aceptables pueden formularse para administracion por, por ejemplo, inyeccion (por ejemplo, SubQ, IM, IP), inhalacion o insuflacion (tanto por la boca como la nariz) o administracion oral, bucal, sublingual, transdermica, nasal, parenteral o rectal. En ciertas realizaciones, los agentes terapeuticos pueden administrate localmente, en el sitio en el que las celulas diana estan presentes, es decir, en un tejido, organo o lfquido espedfico (por ejemplo, sangre, lfquido cefalorraqmdeo, masa tumoral, etc.).

La presente invencion proporciona ademas el uso de cualquier variante de SAP u oligomero de SAP de la invencion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de un trastorno o una afeccion, como se ha descrito en el presente documento, en un paciente, por ejemplo, el uso de una variante de SAP u oligomero de SAP en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno o afeccion descrita en el presente documento. En algunos aspectos, cualquier variante de SAP u oligomero de SAP de la invencion puede usarse para preparar una preparacion farmaceutica para uso en el tratamiento o prevencion de una enfermedad o afeccion descrita en el presente documento.

Los agentes terapeuticos pueden formularse para una variedad de modos de administracion, que incluyen administracion sistemica y topica o localizada. Las tecnicas y formulaciones generalmente pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA. Para administracion parenteral, se prefiere inyeccion, que incluye intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutanea. Para inyeccion, los compuestos pueden formularse en disoluciones lfquidas, preferentemente en tampones fisiologicamente compatibles tales como disolucion de Hank o disolucion de Ringer. Ademas, los compuestos pueden formularse en forma solida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de uso. Tambien estan incluidas formas liofilizadas. En algunas realizaciones, los agentes terapeuticos pueden administrarse a celulas mediante una variedad de procedimientos conocidos para aquellos conocidos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, encapsulacion en liposomas, por iontoforesis, o por incorporacion en otros vehfculos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocapsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas.

Para administracion por via oral, las composiciones farmaceuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos, pastillas para chupar, o capsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como aglutinantes (por ejemplo, almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sflice); disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato sodico de almidon); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por procedimientos muy conocidos en la tecnica. Preparaciones lfquidas para administracion por via oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para constitucion con agua u otro vehfculo adecuado antes de uso. Tales preparaciones lfquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arabiga); vehfculos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres aceitosos, alcohol etflico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico). Las preparaciones tambien pueden contener sales tampon, saborizantes, colorantes y edulcorantes, segun convenga. Las preparaciones para administracion por via oral pueden formularse adecuadamente para dar la liberacion controlada del compuesto activo.

Para administracion por inhalacion (por ejemplo, administracion pulmonar), los agentes terapeuticos pueden administrarse convenientemente en forma de una presentacion de espray en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor apropiado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para administrar una cantidad dosificada. Pueden formularse capsulas y cartuchos de gelatina, por ejemplo, para su uso en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidon.

En los procedimientos de la invencion, los compuestos farmaceuticos tambien pueden administrarse por vfas intranasales o intrabronquiales que incluyen insuflacion, polvos y formulaciones en aerosol (por ejemplos, de inhalantes de esteroides, vease Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol.

75:107-111). Por ejemplo, pueden disponerse formulaciones en aerosol en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrogeno y similares. Tambien pueden formularse como productos farmaceuticos para preparaciones no presurizadas tales como en un nebulizador o un atomizador. Normalmente, tal administracion es en un tampon acuoso farmacologicamente aceptable.

Pueden prepararse composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion respiratoria (por ejemplo, intranasal, inhalacion, etc.) de polipeptidos de SAP de variante en tanto forma solida como lfquida.

Pueden formularse variantes de SAP u oligomeros de SAP de la invencion para administracion parenteral mediante inyeccion, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multi-dosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehfculos aceitosos o acuosos y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitucion con un vetftculo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirogenos esteril, antes de uso.

Ademas, tambien pueden formularse variantes de SAP u oligomeros de SAP de la invencion como preparacion de deposito. Tales formulaciones de accion prolongada pueden administrate por implantacion (por ejemplo subcutaneamente o intramuscularmente) o mediante inyeccion intramuscular. As^ por ejemplo, pueden formularse agentes terapeuticos con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como sal moderadamente soluble. La formula de liberacion controlada tambien incluye parches.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse para administracion al sistema nervioso central (SNC) (revisado en Begley, Pharmacology & Therapeutics 104: 29-45 (2004)). Enfoques convencionales para la administracion defarmacos al SNC incluyen: estrategias neuroquirurgicas (por ejemplo, inyeccion intracerebral o infusion intracerebroventricular); manipulacion molecular del agente (por ejemplo, produccion de una protema de fusion quimerica que comprende un peptido de transporte que tiene una afinidad por una molecula de la superficie de celulas endoteliales en combinacion con un agente que es el mismo incapaz de cruzar la barrera hematoencefalica en un intento por explotar una de las vfas de transporte endogenas de la barrera hematoencefalica); estrategias farmacologicas disenadas para aumentar la solubilidad de ftpidos de un agente (por ejemplo, conjugacion de agentes solubles en agua con vetftculos de ftpido o de colesterol); y la rotura transitoria de la integridad de la BBB por rotura hiperosmotica (resultante de la infusion de una disolucion de manitol en la arteria carotida o el uso de un agente biologicamente activo tal como un peptido de angiotensina).

En ciertas realizaciones, las variantes de SAP u oligomeros de SAP de la invencion se incorporan en una formulacion topica que contiene un vetftculo topico que es generalmente adecuado para la administracion topica de farmacos y que comprende cualquier material de este tipo conocido en la tecnica. El vetftculo topico puede seleccionarse de manera que se proporcione la composicion en la forma deseada, por ejemplo, como una pomada, locion, crema, microemulsion, gel, aceite, disolucion, o similares y puede comprender un material que tanto existe de forma natural como es de origen sintetico. Es preferible que el vetftculo seleccionado no afecte adversamente el agente activo u otros componentes de la formulacion topica. Ejemplos de vetftculos topicos adecuados para su uso en el presente documento incluyen agua, alcoholes y otros disolventes organicos no toxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, vaselina, lanolina, acidos grasos, aceites vegetales, parabenos, ceras y similares.

Las composiciones farmaceuticas (incluyendo preparaciones cosmeticas) pueden comprender de aproximadamente el 0,00001 al 100 %, tal como del 0,001 al 10 % o del 0,1 % al 5 % en peso de una o mas de las variantes de SAP u oligomeros de SAP descritos en el presente documento. En ciertas formulaciones topicas, el agente activo esta presente en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 0,25 % en peso al 75 % en peso de la formulacion, preferentemente en el intervalo de aproximadamente el 0,25 % en peso al 30 % en peso de la formulacion, mas preferentemente en el intervalo de aproximadamente el 0,5 % en peso al 15 % en peso de la formulacion y lo mas preferentemente en el intervalo de aproximadamente el 1,0 % en peso al 10 % en peso de la formulacion.

Las afecciones del ojo pueden tratarse o prevenirse, por ejemplo, por inyeccion sistemica, topica, intraocular de agentes terapeuticos, o por insercion de un dispositivo de liberacion sostenida que libera agentes terapeuticos. Las variantes de SAP u oligomeros de SAP de la invencion pueden administrarse en un vetftculo oftalmico farmaceuticamente aceptable, de forma que el compuesto se mantenga en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el compuesto penetre en las regiones corneas e internas del ojo, como, por ejemplo, la camara anterior, conjuntiva, camara posterior, cuerpo vftreo, humor acuoso, humor vftreo, cornea, iris/ciliar, cristalino, coroides/retina y esclerotica. El vetftculo oftalmico farmaceuticamente aceptable puede, por ejemplo, ser una pomada, aceite vegetal o un material de encapsulamiento. Alternativamente, los compuestos pueden inyectarse directamente en el humor vftreo y acuoso. En otra alternativa, los compuestos pueden administrarse sistemicamente, tal como por infusion o inyeccion intravenosa, para el tratamiento del ojo.

Los agentes terapeuticos descritos en el presente documento pueden almacenarse en un entorno libre de oxfgeno segun procedimientos en la materia.

Composiciones a modo de ejemplo comprenden una variante de SAP u oligomero de SAP con uno o mas vetftculos farmaceuticamente aceptables y opcionalmente, otros componentes terapeuticos. El (Los) vetftculo(s) deben ser “farmaceuticamente aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de la composicion y no provocar un efecto perjudicial inaceptable en el sujeto. Tales vetftculos se describen en el presente documento o son de otro modo muy conocidos para aquellos expertos en la materia de la farmacologfa. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas estan libres de pirogenos y son adecuadas para administracion a un paciente humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas estan libres de irritantes y son adecuadas para administracion a un paciente humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas estan libres de alergenos y son adecuadas para administracion a un paciente humano. Las composiciones pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos muy conocidos en la tecnica de la farmacia.

En algunas realizaciones, una variante de SAP u oligomero de SAP se administra en una formulacion de liberacion con el tiempo, por ejemplo, en una composicion que incluye un poKmero de liberacion lenta. Puede prepararse una variante de SAP u oligomero de SAP con vehfculos que protegera contra la rapida liberacion. Ejemplos incluyen un vehfculo de liberacion controlada, tal como un polfmero, sistema de administracion microencapsulado o gel bioadhesivo. Alternativamente, puede lograrse la administracion prolongada de una variante de SAP u oligomero de SAP incluyendo en la composicion agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, hidrogeles de monoestearato de aluminio y gelatina.

Se conocen en la tecnica procedimientos para administrar compuestos de acido nucleico (vease, por ejemplo, Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; y Delivery Strategies for Antisense' Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Sullivan et al., publicacion PCT N.°: WO 94/02595). Estos protocolos pueden utilizarse para la administracion de practicamente cualquier compuesto de acido nucleico. Los compuestos de acido nucleico pueden administrarse a las celulas mediante una variedad de procedimientos conocidos para aquellos familiarizados con la materia, que incluyen, pero no se limitan a, encapsulacion en liposomas, por iontoforesis, o por incorporacion en otros vehfculos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocapsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas. Alternativamente, la combinacion de acido nucleico/vehfculo se administra localmente por inyeccion directa o por el uso de una bomba de infusion. Otras vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a, administracion oral (forma de comprimido o pfldora) y/o intratecal (Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158). Otros enfoques incluyen el uso de diversos sistemas de transporte y de vehfculo, por ejemplo, mediante el uso de conjugados y polfmeros biodegradables. Para una revision completa sobre las estrategias de administracion de farmacos vease Ho et al., 1999, Curr. Opin. Mol. Ther., 1,336-343 y Jain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 y Groothuis et al., 1997, J. NeuroVirol., 3, 387-400. Descripciones mas detalladas de la liberacion y administracion de acidos nucleicos se proporcionan en Sullivan et al., arriba, Draper et al., documento PCT WO93/23569, Beigelman et al., publicacion PCT N.°: WO99/05094 y Klimuk et al., publicacion PCT N.°: WO99/04819.

Los siguientes ejemplos sirven para describir mas completamente el modo de uso de la invencion anteriormente descrita, ademas de exponer los mejores modos contemplados para llevar a cabo diversos aspectos de la invencion. Se entiende que estos ejemplos no sirven de ninguna forma para limitar el alcance real de la presente invencion, sino que se presentan para fines ilustrativos.

Ejemplificacion

Ejemplo 1: Variantes de SAP resistentes a la agregacion mediada por calcio.

Se expreso una variante de SAP humano recombinante (rhSAP) que comprendfa una sustitucion E167Q de aminoacidos, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1, en celulas CHO y se purifico del medio de cultivo de celulas CHO. La agregacion mediada por calcio de la variante de rhSAP se comparo entonces con la de una muestra correspondiente de rhSAP silvestre. Se anadieron cantidades graduales de calcio a tanto una disolucion de variante de rhSAP E167Q como rhSAP silvestre (cada una a una concentracion de SAP de 4,4 mg/ml) y la cantidad de agregacion de SAP se observo midiendo la absorbancia de la disolucion a 600 nm en un espectrofotometro. La Figura 1 demuestra que la variante de rhSAP E167Q es significativamente mas resistente a la agregacion mediada por calcio que rhSAP silvestre.

La farmacocinetica (PK) de la variante de rhSAP E1 67Q tambien se comparo con una muestra correspondiente de rhSAP silvestre. Se administraron ratas (dosis de 1 mg/kg i.v. por rata, n=3) con tanto la variante de rhSAP E167Q como una muestra correspondiente de rhSAP silvestre. Durante las siguientes veinticuatro horas, las ratas se evaluaron para concentracion plasmatica (pg/ml) de protema SAP. La Figura 2 demuestra que la variante de rhSAP E167Q tiene una semivida en plasma similar a la de rhSAP silvestre.

En otro experimento, se uso un bioensayo in vitro para determinar la actividad relativa de la variante de rhSAP E167Q. En este ensayo, se incubaron celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) enriquecidas en monocitos con concentraciones variables de tanto la variante de rhSAP E167Q como hSAP durante 96 horas. Tras esta incubacion, los sobrenadantes de cultivo resultantes se extrajeron y se ensayaron por ELISA para cuantificar la cantidad de quimiocina derivada de macrofagos (MDC) que se produjo. La MDC se produce por fibrocitos y por tanto, un indicador de la diferenciacion de monocitos en fibrocitos. Comparando la concentracion inhibidora, el 50 % (CI⁵⁰) de la muestra, con el patron de referencia de hSAP puede determinarse la potencia relativa de una variante de SAP. El resultado se expresa como una relacion de CI⁵⁰de la muestra frente al patron de referencia de hSAP.

Todas las muestras y patrones de SAP se diluyeron inicialmente a una concentracion de 1,0 mg/ml en Supplemented FibroLife Media. Los patrones de SAP se diluyeron sucesivamente para generar concentraciones de patron de trabajo de 60, 30, 20, 13,4, 8,8, 6,0, 3,0, 1,5 y 0,75 pg/ml (concentracion patron final de 30, 15, 10, 6,7, 4,4, 3,0, 1,5, 0,75 y 0,375 pg/ml). Vease la siguiente Tabla 1

Para preparar el ensayo de ELISA, se diluyo el anticuerpo de captura (es dedr, raton anti-MDC humana) a la concentracion de trabajo en PBS sin protema transportadora. El anticuerpo de captura diluido se uso para recubrir placas de 96 pocillos y a continuacion cada placa se sello y se incubo durante la noche a temperatura ambiente. Antes de usar las placas recubiertas, cada pocillo se aspiro y se lavo con tampon de lavado, repitiendose el proceso dos veces durante un total de tres lavados. Las placas se bloquearon a continuacion anadiendo 300 pl de reactivo diluyente a cada pocillo e incubando a temperatura ambiente durante una hora. Despues de la incubacion se repitio el procedimiento de aspiracion y lavado de pocillos.

Para el ensayo de ELISA, se anadieron muestras de 100 pl de cualquiera de los sobrenadantes de los cultivos de monocitos/fibrocitos o los patrones de SAP a cada pocillo. La placa se incubo a continuacion a temperatura ambiente durante 2 horas antes de aspirar y lavar los pocillos. A continuacion, se anadieron 100 pl de una disolucion de trabajo de estreptavidina-HRP a cada pocillo. La placa se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de anadir 50 pl de disolucion de parada a cada pocillo. Inmediatamente, la densidad optica de cada pocillo se midio usando un lector de microplacas establecido a 450 nm. Si la correccion de la longitud de onda estuvo disponible, el lector de microplacas se establecio a 540 nm o 570 nm. Si la correccion de la longitud de onda no estuvo disponible, entonces las lecturas a 540 nm o 570 nm se restaron de las lecturas a 450 nm. Esta resta corrige las imperfecciones opticas en la placa.

La Figura 3 demuestra que la variante de rhSAP E167Q es al menos tan biologicamente activa como rhSAP silvestre.

Ejemplo 2: Variantes de SAP desglicosiladas tienen semivida en plasma y actividad biologica alteradas

Se expreso una variante de SAP humano recombinante (rhSAP) que comprendfa una sustitucion N32D de aminoacidos, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1, en celulas CHO y se purifico del medio de cultivo de celulas CHO. Esta mutacion altera el sitio consenso de N-glicosilacion y asf previene la union de glicanos enlazados en N a SAP en esa posicion. En paralelo, se trato hSAP silvestre con una sialidasa para eliminar todos los restos de acido sialico unidos al polipeptido SAP (es decir, asialo hSAP). Se compararon tanto rhSAP N32D tratado como asialo hSAP con una muestra correspondiente de rhSAP en un ensayo PK para medir la estabilidad en suero in vivo (Figura 4). Aunque la PK de rhSAP N32D fue ligeramente reducida en comparacion con SAP silvestre, la semivida de rhSAP N32D fue sustancialmente superior a la de la asialo hSAP. La variante de rhSAP N32D se comparo adicionalmente con una muestra correspondiente de hSAP derivado del suero usando un bioensayo in vitro para determinar la actividad relativa de estas protemas (Figura 3). Estos datos indican que la variante N32D de SAP mantiene una semivida en plasma y actividad comparable a hSAP silvestre.

Ejemplo 3: Union covalente de PEG a SAP.

Se unio covalentemente un SAP humano recombinante (rhSAP) a un derivado de metoxi-PEG activado de 20 kDa (PEG). El resto de PEG se unio a un grupo de amina primaria de rhSAP segun el siguiente protocolo y como se ilustra en la Figura 5. Primero, se disolvio aproximadamente 1 mg de metoxi-PEG-ester succinimidilcarboximetflico de 20 kDa (numero de catalogo de JenKem: M-SCM-20K) por mg de rhSAP en una disolucion de 20 mg/ml de rhSAP. Se dejo que la reaccion de acoplamiento avanzara durante 24 horas a temperatura ambiente. El hSAP PEGilado resultante se purifico de los componentes de reaccion por cromatograffa de intercambio anionico. Las fracciones de la columna de cromatograffa se reunieron y se concentraron (Figura 6). rhSAP PEGilado preparado por este procedimiento contuvo de 1-3 PEG/protomeros de 20 kDa, siendo 1 PEG/protomero la forma mas abundante, como se evalua por SDS-PAGE.

Se ensayaron rhSAP PEGilado y SAP derivado de suero humano (hSAP) para bioactividad usando un bioensayo in vitro. En este ensayo, se incubaron celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) enriquecidas en monocitos con concentraciones variables de tanto rhSAP PEGilado como hSAP durante 96 horas. Tras esta incubacion, se eliminaron los sobrenadantes de cultivo resultantes y se ensayaron por ELISA para cuantificar la cantidad de quimiocina derivada de macrofagos (MDC) que se produjo. La MDC se produce por fibrocitos y por tanto, un indicador de diferenciacion de monocitos en fibrocitos. Comparando la concentracion inhibidora, el 50 % (CI⁵⁰) de la muestra, con el patron de referencia de hSAP puede determinarse la potencia relativa de una variante de SAP. El resultado se expresa como una relacion de CI⁵⁰de la muestra frente al patron de referencia de hSAP como se describe en los ejemplos precedentes.

La variante de rhSAP PEGilado tuvo una relacion de CI⁵⁰de 0,24 en comparacion con una muestra correspondiente de hSAP, demostrando asf que el rhSAP PEGilado tiene actividad comparable a SAP silvestre.

En el presente documento tambien se describen los siguientes puntos:

1. Una variante del amiloide P del suero (SAP) que comprende cinco protomeros de SAP, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos el 90 % identica a SEQ ID NO: 1, y en la que al menos uno de los protomeros de SAP comprende una o mas mutaciones de aminoacidos o modificaciones qmmicas que alteran una actividad biologica de la variante de SAP en comparacion con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero.

2. La variante de SAP del punto 1, en la que la variante de SAP es una variante de una protema SAP humana.

3. La variante de SAP del punto 1, en la que uno o mas de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos el 99 % identica a SEQ ID NO: 1.

4. La variante de SAP de uno cualquiera de los puntos 1-3, en la que la actividad biologica se selecciona de una o mas de elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vitro, elevada estabilidad in vivo o elevada eficiencia de fabricacion.

5. La variante de SAP de uno cualquiera de los puntos 1-4, en la que al menos uno de los protomeros de SAP comprende una variante de aminoacido con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1.

6. La variante de SAP de uno cualquiera de los puntos 1-4, en la que uno o mas de los protomeros de SAP estan sustancialmente libres de glicanos enlazados en N y enlazados en O.

7. La variante de SAP del punto 6, en la que uno o mas de los protomeros de SAP comprende un aminoacido en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1 que no es asparagina (N).

8. La variante de SAP del punto 7, en la que el protomero de SAP comprende un aspartato (D), una glutamina (Q) o un glutamato (E) en la posicion 32 de Se Q ID NO: 1.

9. La variante de SAP de cualquiera de los puntos 1-8, en la que la variante de SAP es mas resistente a la escision por proteasas que una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero.

10. La variante de SAP del punto 9, en la que la variante de SAP es mas resistente a la escision por proteasas por una serina proteasa, una treonina proteasa, una cistema proteasa, un acido aspartico proteasa, una metaloproteasa, un acido glutamico proteasa o combinaciones de las mismas.

11. La variante de SAP del punto 9 o 10, en la que la variante de SAP es mas resistente a la escision por proteasas por quimotripsina, tripsina, Pronasa o combinaciones de las mismas.

12. La variante de SAP de uno cualquiera de los puntos 9-11, en la que la variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en la posicion 144 de SEQ ID NO: 1 que no es fenilalanina (F). 13. La variante de SAP de cualquiera de los puntos 9-11, en la que la variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1 que no es D.

14. La variante de SAP de uno cualquiera de los puntos 9-11, en la que la variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en las posiciones 144 de SEQ ID NO: 1 que no es F, y en la que el protomero de SAP comprende ademas un aminoacido en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1 que no es D.

15. La variante de SAP del punto 12 o 14, en la que el protomero de SAP comprende una leucina (L), isoleucina (I), valina (V) o alanina (A) en la posicion 144 de SEQ ID NO: 1.

16. La variante de SAP del punto 13 o 14, en la que el promotor de SAP comprende un glutamato (E) en la posicion 145 de SEQ ID NO: 1.

17. La variante de SAP de cualquiera de los puntos 1-16, en la que la variante de SAP es mas resistente a la autoagregacion dependiente del calcio que una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero.

18. La variante de SAP del punto 17, en la que la variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende un aminoacido en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1 que no es E.

19. La variante de SAP del punto 18, en la que el protomero de SAP comprende una mutacion de un aspartato (D), asparagina (N), glutamina (Q), alanina (A) o histidina (H) en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1.

20. La variante de SAP de uno cualquiera de los puntos 1-19, en la que la variante de SAP comprende al menos un protomero de SAP que comprende uno o mas aminoacidos que estan unidos covalentemente a uno o mas polfmeros inertes.

21. La variante de SAP del punto 20, en la que al menos uno de los polfmeros inertes es un resto de polietilenglicol (PEG).

22. La variante de SAP del punto 21, en la que el resto de PEG esta unido a al menos a un residuo de cistema nativa o variante del protomero de SAP.

23. La variante de SAP del punto 22, en la que el residuo de cistema variante se encuentra en el extremo N de SEQ ID NO: 1.

24. La variante de SAP del punto 21, en la que el resto PEG esta unido a al menos un residuo de glutamina (Q) nativa o variante de SEQ ID No : 1.

25. La variante de SAP del punto 24, en la que el residuo de glutamina (Q) nativa esta en la posicion 32 de SEQ ID NO: 1.

26. La variante de SAP de cualquiera de los puntos 20-25, en la que al menos uno de los polfmeros inertes es un resto dextrano.

27. La variante de SAP del punto 26, en la que el resto dextrano esta unido a al menos un residuo de glutamina nativa o variante de SEQ ID No : 1.

28. La variante de SAP del punto 27, en la que el residuo de glutamina nativa esta en la posicion Q32 correspondiente a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.

29. Un oligomero de SAP covalentemente reticulado que comprende al menos dos pentameros de SAP, en el que cada uno de los pentameros de SAP comprende cinco protomeros de SAP.

30. El oligomero de SAP covalentemente reticulado del punto 29, en el que el oligomero de SAP reticulado se caracteriza por una o mas de elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vitro, elevada estabilidad in vivo en comparacion con una muestra correspondiente de SAP aislado de suero humano.

31. El oligomero de SAP covalentemente reticulado del punto 29 o 30, en el que uno o mas de los protomeros de SAP tienen una secuencia de aminoacidos que es al menos el 90 % identica a SEQ ID NO: 1.

32. El oligomero de SAP covalentemente reticulado de cualquiera de los puntos 29-31, en el que al menos uno de los pentameros de SAP es una variante de SAP de cualquiera de los puntos 1-28.

33. El oligomero de SAP covalentemente reticulado de cualquiera de los puntos 29-32, en el que los pentameros de SAP se unen covalentemente mediante uno o mas reticulantes qmmicos.

34. El oligomero de SAP covalentemente reticulado del punto 33, en el que al menos uno de los reticulantes qmmicos es un agente heterobifuncional.

35. El oligomero de SAP covalentemente reticulado del punto 34, en el que el reticulante heterobifuncional se selecciona de succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, ester de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo, clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a(2-piridilditio)-tolueno, 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo o 6-((3-(2-piridilditio)propionato)hexanoato de succinimidilo.

36. El oligomero de SAP covalentemente reticulado del punto 33, en el que al menos uno de los reticulantes qmmicos es un agente homobifuncional.

37. El oligomero de SAP covalentemente reticulado del punto 36, en el que el agente homobifuncional se selecciona de suberato de disuccinimidilo, bismaleimidohexano o dimetilpimelimidato-2HCl.

38. El oligomero de SAP covalentemente reticulado del punto 33, en el que al menos uno de los reticulantes qmmicos es un agente fotorreactivo.

39. El oligomero SAP covalentemente reticulado del punto 38, en el que el agente fotorreactivo se selecciona de bis-(P-(4-azidosalicilamido)etil)disulfuro o N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato.

40. Una preparacion farmaceutica adecuada para su uso en un mairnfero que comprende una variante de SAP o un oligomero de SAP covalentemente reticulado de cualquiera de los puntos 1-39 y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica que comprende una variante del amiloide P del suero (SAP) que comprende cinco protomeros de SAP, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos el 95 % identica a s Eq ID NO: 1, y en la que los cinco protomeros de SAP comprenden un aminoacido en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1 que es asparagina (N), glutamina (Q), alanina (A) o histidina (H), y un vehfculo oftalmico farmaceuticamente aceptable.

2. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1, en la que la variante de SAP es mas resistente a la autoagregacion dependiente de calcio que una muestra correspondiente de SAP humano no variante.

3. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1 o 2, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos al 96 % identica a SEQ ID NO: 1.

4. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1 o 2, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos al 97 % identica a SEQ ID NO: 1.

5. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1 o 2, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos al 98 % identica a SEQ ID NO: 1.

6. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 1 o 2, en la que cada uno de los protomeros de SAP tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos al 99 % identica a SEQ ID NO: 1.

7. La composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que al menos uno de los protomeros de SAP comprende una glutamina (Q) en la posicion 167 de SEQ ID NO: 1.

8. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en el tratamiento o la prevencion de la degeneracion macular, la retinopatfa retiniana y vftrea, el trastorno o afeccion relacionado con la fibrosis despues de trabeculectoirna u otra cirugfa de filtracion del ojo, la oftalmopatia de Graves, la retinopatfa diabetica o el glaucoma.

9. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en el tratamiento o prevencion de la degeneracion macular.

10. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en el tratamiento de un trastorno fibrotico o fibroproliferativo.

11. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

12. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la composicion farmaceutica es adecuada para administracion topica, por inyeccion intraocular o por insercion de un dispositivo de liberacion sostenida.

13. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la composicion farmaceutica es adecuada para administracion por inyeccion intraocular.

14. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para su uso mediante administracion topica, por inyeccion intraocular, o por insercion de un dispositivo de liberacion sostenida.

15. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para su uso por inyeccion intraocular.