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ES2708650T3 - Oligonucleótidos antisentido para el tratamiento de células madre tumorales - Google Patents

Oligonucleótidos antisentido para el tratamiento de células madre tumorales Download PDF

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ES2708650T3
ES2708650T3 ES14770117T ES14770117T ES2708650T3 ES 2708650 T3 ES2708650 T3 ES 2708650T3 ES 14770117 T ES14770117 T ES 14770117T ES 14770117 T ES14770117 T ES 14770117T ES 2708650 T3 ES2708650 T3 ES 2708650T3
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Eriz Luis O Burzio
Menendez Veronica A Burzio
Olavarria Jaime E Villegas
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Andes Biotechnologies Global Inc
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Andes Biotechnologies Global Inc
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Abstract

Un oligonucleótido para su uso en un método: (a) de supresión de la metástasis de un cáncer en un individuo; o (b) para el tratamiento del cáncer metastásico en un individuo; en el que el oligonucleótido es complementario a una molécula de ARN mitocondrial quimérico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o complementario a una molécula de ARN mitocondrial quimérico no codificante sentido (ARNmtncS), y en el que el oligonucleótido es capaz de hibridarse con la molécula de ARN mitocondrial quimérico para formar un dúplex estable, y en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cáncer con una terapia.

Description

DESCRIPCION
Oligonucleotidos antisentido para el tratamiento de celulas madre tumorales
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a oligonucleotidos complementarios a un ARN mitocondrial quimerico no codificante para su uso en metodos de tratamiento y supresion de la metastasis en un individuo tratado anteriormente contra el cancer. La divulgacion tambien se refiere a oligonucleotidos complementarios a un ARN mitocondrial quimerico no codificante y a su uso en el tratamiento de un cancer resistente (por ejemplo, un cancer asociado al VPH resistente) en un individuo.
Antecedentes de la invencion
El cancer es una malignidad celular cuyo rasgo caractenstico, la perdida del control normal del ciclo celular, da como resultado un crecimiento no regulado, falta de diferenciacion y capacidad para invadir otros tejidos y hacer metastasis. La carcinogenesis es un proceso de multiples etapas mediante el cual una celula normal se transforma en una celula maligna (McKinnell et al., "The Biology Basis of Cancer', Capftulo 3, 1998). La etiologfa del cancer es compleja e incluye la alteracion de la regulacion del ciclo celular, anomaftas cromosomicas y la rotura de los cromosomas. Se cree que los agentes infecciosos (por ejemplo, virus oncogenos), los productos qmmicos, la radiacion (por ejemplo, la radiacion ultravioleta o ionizante) y los trastornos inmunitarios son las principales causas de la carcinogenesis (McKinnell et al., "The Biological Basis of Cancer', Capftulo 3, 1998).
Las pruebas recientes respaldan la opinion de que los tumores se organizan en una jerarqma de poblaciones celulares heterogeneas con diferentes propiedades biologicas. Se han propuesto dos modelos para explicar esta heterogeneidad dentro de los tumores y para el crecimiento tumoral. Un modelo de este tipo se basa en celulas madre cancerosas (CMC) que se cree que son responsables de aspectos del cancer tales como el inicio, la progresion, la metastasis y la recidiva. Vease Chen et al., Acta Pharmacol Sin., 34 (6): 732-740, 2013; Ponti et al., Cancer Res, 65 (13): 5506-11, 2005; Singh et al., Cancer Res, 63: 5821-5828, 2003; y Feng et al., Oncology Reports, 22: 1129-1134, 2009. Aunque las CMC en general representan una poblacion muy pequena de la poblacion tumoral global, generalmente se consideran una subpoblacion de inicio autorrenovable de celulas tumorales o una pequena poblacion de celulas cancerosas que pueden dar origen a nuevos tumores. Se han identificado CMC en una serie de canceres, incluyendo, entre otros, canceres de mama, cerebro, hematicos, de tugado, rinon, cuello uterino, ovario, colon y pulmon, entre otros. Vease Ponti et al., Cancer Res, 65 (13): 5506-11, 2005; Feng et al., Oncology Reports, 22: 1129-1134, 2009; Zhang et al., Cancer Res, 68 (11): 4311: 4320, 2008; Singh et al., Cancer Res, 63: 5821-5828, 2003; Clarke et al., Cancer Res, 66: 9339, 2006; Sendurai et al., Cell, 133: 704, 2008; Ohata et al., Cancer Res, 72: 5101,2012; y Mukhopapadhyay et al., Plos One, 8 (11): e78725, 2013).
La reseccion quirurgica de un tumor o tumores o de metastasis que se originan a partir de uno o mas tumores primarios seguida de la administracion sistemica de terapia antineoplasica es el protocolo clrnico establecido para el tratamiento de varios canceres. Aunque es satisfactorio para el tratamiento de algunos tipos de cancer, una complicacion bien conocida del tratamiento del cancer es la supervivencia de celulas tumorales residuales o CMC que no se eliminan eficazmente, lo que puede dar como resultado una recafda despues de la remision, regresando el cancer al sitio primario de formacion del tumor o en sitios distantes debido a la metastasis. Recientemente, se descubrio que las CMC tambien pueden contribuir a una recafda despues de la remision debido a la resistencia a la quimioterapia. Vease Domingo-Domenech et al., Cancer Cell, 22 (3): 373, 2012. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar agentes terapeuticos que puedan dirigirse a celulas que contribuyan a la recafda y la metastasis (por ejemplo, las CMC). El descubrimiento de dichos agentes terapeuticos puede permitir el desarrollo de un tratamiento util para prevenir la recidiva del cancer despues de la remision (es decir, la recafda) o prevenir la propagacion del tumor primario a los sitios secundarios (es decir, la metastasis). Vease Clarke et al., Cancer Res, 66: 9339, 2006. Sumario de la invencion
En el presente documento se desvelan, entre otras cosas, metodos para suprimir la metastasis de un cancer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS), en los que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en los que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En algunas realizaciones, el oligonucleotido es suficientemente complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante humano que comprende: un ARN ribosomico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida o un ARN ribosomico mitocondrial 16S sentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser al menos un 85 % complementary a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el uno o mas oligonucleotidos pueden comprender una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrate en combinacion con al menos un agente antineoplasico. En una realizacion adicional, el al menos un agente antineoplasico se selecciona entre el grupo que consiste en remicade, docetaxel, celecoxib, melfalan, dexametasona, esteroides, gemcitabina, cisplatino, temozolomida, etoposido, ciclofosfamamida, temodar, carboplatino, procarbazina, gliadel, tamoxifeno, topotecan, metotrexato, gefitinib, taxol, taxotere, fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, xeloda, CPT-11, interferon alfa, interferon alfa pegilado, capecitabina, cisplatino, tiotepa, fludarabina, carboplatino, daunorrubicina liposomica, citarabina, doxetaxol, paclitaxel, vinblastina, IL-2, GM-CSF, dacarbazina, vinorelbina, acido zoledronico, palmitronato, biaxina, busulfan, prednisona, bortezomib, bifosfonato, trioxido de arsenico, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel, ganciclovir, adriamicina, fosfato de sodio de estramustina, sulindaco y etoposido. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran secuencialmente. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran simultaneamente. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una radioterapia. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con cirugfa. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una terapia de trasplante de celulas madre alogeno. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una terapia de trasplante de celulas madre autologo. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el individuo puede haber sido tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprendiera quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de los mismos. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el cancer en el individuo puede haber recafdo despues del tratamiento con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon pegilado, alfa prednisona, talidomida y vincristina. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, en las que el cancer puede ser un cancer solido. En una realizacion adicional, el cancer solido es cancer de vejiga, cancer de cerebro, cancer de mama, cancer de cervix, cancer de colon, cancer de endometrio, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer de fugado y vfas biliares, cancer de pulmon, melanoma, cancer de boca, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de faringe, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de testfculo o cancer de tiroides. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, en donde el cancer puede ser un cancer no solido. En una realizacion adicional, el cancer no solido es mieloma multiple, leucemia o linfoma. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede reducir el numero de celulas madre cancerosas en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede inhibir el crecimiento tumoral y/o la metastasis en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
En un aspecto, en el presente documento se desvelan metodos para prevenir la recafda del cancer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS), en los que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en los que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En una realizacion adicional, el oligonucleotido es suficientemente complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerica no codificante humana que comprende: un ARN ribosomico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida o un ARN ribosomico mitocondrial 16S sentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser al menos un 85 % complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el uno o mas oligonucleotidos pueden comprender una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con al menos un agente antineoplasico. En una realizacion adicional, el al menos un agente antineoplasico se selecciona entre el grupo que consiste en remicade, docetaxel, celecoxib, melfalan, dexametasona, esteroides, gemcitabina, cisplatino, temozolomida, etoposido, ciclofosfamamida, temodar, carboplatino, procarbazina, gliadel, tamoxifeno, topotecan, metotrexato, gefitinib, taxol, taxotere, fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, xeloda, CPT-11, interferon alfa, interferon alfa pegilado, capecitabina, cisplatino, tiotepa, fludarabina, carboplatino, daunorrubicina liposomica, citarabina, doxetaxol, paclitaxel, vinblastina, IL-2, GM-CSF, dacarbazina, vinorelbina, acido zoledronico, palmitronato, biaxina, busulfan, prednisona, bortezomib, bifosfonato, trioxido de arsenico, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel, ganciclovir, adriamicina, fosfato de sodio de estramustina, sulindaco y etoposido. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran secuencialmente. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran simultaneamente. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una radioterapia. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con cirugfa. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una terapia de trasplante de celulas madre alogeno. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una terapia de trasplante de celulas madre autologo. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el individuo puede haber sido tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprendiera quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de los mismos. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el cancer en el individuo puede haber recafdo despues del tratamiento con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon pegilado, alfa prednisona, talidomida y vincristina. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, en las que el cancer puede ser un cancer solido. En una realizacion adicional, el cancer solido es cancer de vejiga, cancer de cerebro, cancer de mama, cancer de cervix, cancer de colon, cancer de endometrio, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer de fugado y vfas biliares, cancer de pulmon, melanoma, cancer de boca, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de faringe, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de testfculo o cancer de tiroides. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, en donde el cancer puede ser un cancer no solido. En una realizacion adicional, el cancer no solido es mieloma multiple, leucemia o linfoma. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede reducir el numero de celulas madre cancerosas en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede inhibir el crecimiento tumoral y/o la metastasis en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
En otro aspecto mas, en el presente documento se desvelan metodos para el tratamiento del cancer metastasico en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS), en los que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en los que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En una realizacion adicional, el oligonucleotido es suficientemente complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerica no codificante humana que comprende: un ARN ribosomico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida o un ARN ribosomico mitocondrial 16S sentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser al menos un 85 % complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el uno o mas oligonucleotidos pueden comprender una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con al menos un agente antineoplasico. En una realizacion adicional, el al menos un agente antineoplasico se selecciona entre el grupo que consiste en remicade, docetaxel, celecoxib, melfalan, dexametasona, esteroides, gemcitabina, cisplatino, temozolomida, etoposido, ciclofosfamamida, temodar, carboplatino, procarbazina, gliadel, tamoxifeno, topotecan, metotrexato, gefitinib, taxol, taxotere, fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, xeloda, CPT-11, interferon alfa, interferon alfa pegilado, capecitabina, cisplatino, tiotepa, fludarabina, carboplatino, daunorrubicina liposomica, citarabina, doxetaxol, paclitaxel, vinblastina, IL-2, GM-CSF, dacarbazina, vinorelbina, acido zoledronico, palmitronato, biaxina, busulfan, prednisona, bortezomib, bifosfonato, trioxido de arsenico, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel, ganciclovir, adriamicina, fosfato de sodio de estramustina, sulindaco y etoposido. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran secuencialmente. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran simultaneamente. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una radioterapia. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con cirugfa. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una terapia de trasplante de celulas madre alogeno. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una terapia de trasplante de celulas madre autologo. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el individuo puede haber sido tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprendiera quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de los mismos. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el cancer en el individuo puede haber recafdo despues del tratamiento con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon pegilado, alfa prednisona, talidomida y vincristina. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, en las que el cancer puede ser un cancer solido. En una realizacion adicional, el cancer solido es cancer de vejiga, cancer de cerebro, cancer de mama, cancer de cervix, cancer de colon, cancer de endometrio, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer de fugado y vfas biliares, cancer de pulmon, melanoma, cancer de boca, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de faringe, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de testfculo o cancer de tiroides. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, en donde el cancer puede ser un cancer no solido. En una realizacion adicional, el cancer no solido es mieloma multiple, leucemia o linfoma. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede reducir el numero de celulas madre cancerosas en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede inhibir el crecimiento tumoral y/o la metastasis en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
En otro aspecto mas, en el presente documento se desvelan metodos para el tratamiento de un cancer resistente (por ejemplo, un cancer asociado al VPH resistente) en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS), en los que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable. En una realizacion adicional, el oligonucleotido es suficientemente complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerica no codificante humana que comprende: un ARN ribosomico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida o un ARN ribosomico mitocondrial 16S sentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede ser al menos un 85 % complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el uno o mas oligonucleotidos pueden comprender una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con al menos un agente antineoplasico. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran secuencialmente. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran simultaneamente. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con una radioterapia. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con cirugfa. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede reducir el numero de celulas madre cancerosas en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido puede inhibir el crecimiento tumoral y/o la metastasis en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS) e instrucciones para poner en practica cualquier metodo desvelado en el presente documento. La invencion proporciona un oligonucleotido para su uso en un metodo:
(a) de supresion de la metastasis de un cancer en un individuo; o
(b) para el tratamiento del cancer metastasico en un individuo;
en el que el oligonucleotido es complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS) y en el que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con la molecula de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 representa un esquema general del procedimiento experimental y el ensayo utilizados en el presente documento para medir el efecto de los oligonucleotidos antisentido dirigidos a ARNmtncAS sobre el numero de esferas formadas en celulas de cancer de colon, en funcion de la capacidad espedfica de las celulas madre cancerosas para formar estos cuerpos esferoides.
La Figura 2 representa ejemplos representativos de esferas formadas en celulas de cancer de colon primario despues de ningun tratamiento, tratamiento solo con Lipofectamine, tratamiento con un oligonucleotido de control (Oligo 154 de control) o tratamiento con un oligonucleotido antisentido (OAS) dirigido a ARNmtncAS (OAS 1537S). El tratamiento con OAS 1537S suprimio la formacion de esferas.
La Figura 3 representa una cuantificacion de la capacidad de las celulas de tumor de colon primarias para formar esferas. Aproximadamente el 0,6 % del numero total de celulas sembradas pudieron formar esferas. Las celulas transfectadas con OAS 1537S no pudieron formar esferas.
La Figura 4 muestra ejemplos representativos de esferas formadas en celulas de la estirpe celular de cancer de colon HCT-116 despues de ningun tratamiento, tratamiento solo con Lipofectamina, tratamiento con un oligonucleotido de control (Oligo 154 de control) o tratamiento con un oligonucleotido antisentido dirigido a ARNmtncAS (OAS 1107S). El tratamiento con Oa S 1107S suprimio la formacion de esferas.
La Figura 5 representa una cuantificacion de la capacidad de las celulas de cancer de colon HCT-116 para formar esferas. Aproximadamente el 0,3 % del numero total de celulas sembradas pudieron formar esferas. Las celulas transfectadas con OAS 1107S no pudieron formar esferas.
La Figura 6 representa un esquema general del procedimiento experimental y el ensayo utilizados en el presente documento para medir el efecto de los oligonucleotidos antisentido dirigidos a ARNmtncAS sobre el numero de esferas formadas por la estirpe celular SiHa de cancer de cuello uterino y celulas de cultivo primario de tumores de cuello uterino. El ensayo se basa en la capacidad de las celulas madre cancerosas para formar esferas, tambien denominadas cuerpos esferoides.
La Figura 7 representa ejemplos representativos de esferas formadas por la estirpe celular SiHa de cancer de cuello uterino y celulas de cultivo primario de tumores de cuello uterino despues de ningun tratamiento (NT), tratamiento con un oligonucleotido de control (Oligo 154 de control: OAS-C) o tratamiento con un oligonucleotido antisentido dirigido a ARNmtncAS (OAS 1537S), o tratamiento con cisplatino 45 |jM (CISP). El tratamiento con el OAS 1537S suprimio la formacion de esferas. Las celulas CerCa 3 obtenidas del cultivo primario, que esta infectado con VPH 45, son resistentes al tratamiento con cisplatino en comparacion con otras dos celulas obtenidas del cultivo primario, que estan infectadas con VPH 16.
La Figura 8 representa la cuantificacion de la formacion de esferas por la estirpe celular SiHa y celulas de tumor de cuello uterino primarias (CerCa 1, CerCa 2 y CerCa 3) con o sin tratamiento. Las celulas transfectadas con OAS 1537S no pudieron formar esferas. El cultivo primario de CerCa 3 infectadas con VPH 45 fue resistente al tratamiento con cisplatino, pero no al tratamiento con OAS 1537S.
La Figura 9 representa la ausencia de recafda del tumor y la ausencia de nodulos metastasicos en los pulmones y el hugado de ratones tratados con OAS 1560S (cuadrados) pero no con Oligo 154 de control (drculos) despues de la extirpacion quirurgica de tumores de melanoma intradermicos.
La Figura 10 representa la presencia de nodulos negros metastasicos de recafda tumoral en los pulmones e hfgados de los ratones tratados con Oligo 154 de control, pero no en los pulmones e hfgados de los ratones tratados con OAS 1560S.
La Figura 11 representa la ausencia de recafda del tumor y la supervivencia completa de ratones tratados con OAS 1560S (triangulos) pero no con OAS 154 de control (cuadrados) despues de la extirpacion quirurgica de tumores de carcinoma de rinon intradermico.
La Figura 12 representa la ausencia de recafda y supervivencia de ratones tratados con OAS 1560S (cuadrados) pero no con oAs 154 de control (drculos) despues de la extirpacion quirurgica de tumores de carcinoma de rinon intradermicos.
La Figura 13 representa la ausencia de recafda tumoral y la supervivencia completa de ratones tratados con OAS 1560S, pero no con OAS 154 de control, despues de la extirpacion quirurgica de tumores de carcinoma de melanoma intradermicos.
La Figura 14 representa la ausencia de tumores y la supervivencia completa de ratones tratados con OAS 1560S, pero no con OAS 154 de control, despues de la extirpacion quirurgica de tumores de carcinoma de vejiga subcutaneos, ip indica administracion intraperitoneal e iv indica administracion intravenosa.
La Figura 15 representa la reduccion en los tumores y el aumento en la supervivencia de ratones Rag -/-tratados con OAS 1537S, pero no con OAS 154 de control, despues de la extirpacion de un tumor de melanoma A375 humano.
Descripcion detallada
En el presente documento se desvelan, entre otras cosas, composiciones que comprenden uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS) y usos de las mismas para suprimir la metastasis de un cancer en un individuo. En determinadas realizaciones, la divulgacion proporciona composiciones que comprenden uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtncAS o a una molecula de ARNmtncS y usos de las mismas para tratar o prevenir la recafda de un cancer en un individuo. En determinadas realizaciones, la divulgacion proporciona composiciones que comprenden uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtncAS o a una molecula de ARNmtncS y usos de las mismas para tratar el cancer metastatico en un individuo. En determinadas realizaciones, la divulgacion proporciona composiciones que comprenden uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtncAS o a una molecula de ARNmtncS y usos de las mismas para tratar un cancer resistente (por ejemplo, un cancer resistente asociado al VPH) en un individuo. En algunas de las realizaciones del presente documento, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas).
I. Tecnicas generales
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa, biologfa celular, bioqmmica, qmmica de acidos nucleicos e inmunologfa, que son bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas tecnicas se explican en detalle en la bibliograffa, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion (Sambrook y Russel, 2001), (denominados conjuntamente en el presente documento "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., editores, 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., editores, 1994); Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny (denominados conjuntamente en el presente documento "Harlow y Lane"), Beaucage et al. editores, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000), Handbook of Experimental Immunology, 4a edicion (D.M. Weir y C.C. Blackwell, editores, Blackwell Science Inc., 1987); y Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, editores, 1987). Otras referencias utiles incluyen Harrison’s Principles of Internal Medicine (McGraw Hill; J. Isseleacher et al., editores), Dubois’ Lupus Erythematosus (5a ed.; D.J. Wallace y B.H. Hahn, editores.
II. Definiciones
Antes de describir la presente invencion en detalle, ha de entenderse que la presente invencion no se limita a composiciones o sistemas biologicos particulares, que pueden, por supuesto, variar. Tambien ha de entenderse que la terminologfa utilizada en el presente documento tiene el proposito de describir realizaciones particulares solamente y no tiene por objeto ser limitante.
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que se indique lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un oligonucleotido" opcionalmente incluye una combinacion de dos o mas de dichos oligonucleotidos.
Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invencion que se describen en el presente documento incluyen "que comprende", "que consiste" y "que consiste esencialmente en" aspectos y realizaciones.
Una molecula de acido nucleico "aislada" (por ejemplo, un "oligonucleotido aislado") es una molecula de acido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molecula de acido nucleico contaminante con la que normalmente esta asociada en la fuente natural del acido nucleico. Una molecula de acido nucleico aislada no esta en la forma o el entorno en que se encuentra en la naturaleza. Las moleculas de acido nucleico aisladas, por tanto, se distinguen de la molecula de acido nucleico como existe en las celulas naturales.
Como se usa en el presente documento, la expresion "oligonucleotido complementario a un ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido" o "oligonucleotido complementario a un ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido" se refiere a un acido nucleico que tiene suficiente complementariedad de secuencia con un ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido objetivo o un ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido objetivo, respectivamente. Un oligonucleotido "suficientemente complementario" a un ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido objetivo o un ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido objetivo significa que el oligonucleotido tiene una secuencia suficiente para hibridar con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable.
El termino "oligonucleotido" se refiere a un polfmero corto de nucleotidos y/o analogos de nucleotidos. Una "composicion oligonucleotidica" desvelada en el presente documento incluye cualquier agente, compuesto o composicion que contenga uno o mas oligonucleotidos e incluye, por ejemplo, composiciones que comprenden oligonucleotidos monocatenarios y/o bicatenarios (bc), incluyendo, por ejemplo, ARN monocatenario, ADN monocatenario, oligonucleotidos tubridos de ADN/ADN y ARN/a Dn , asf como oligonucleotidos derivados/modificados de los mismos. Dichas "composiciones oligonucleotfdicas" tambien pueden incluir productos oligonucleotfdicos amplificados, por ejemplo, productos de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles). Una "composicion oligonucleotidica" desvelada en el presente documento tambien puede incluir composiciones reconocidas en la tecnica disenadas para imitar la actividad de oligonucleotidos, tales como moleculas de acido nucleico peptfdico (ANP).
La frase "corresponde a" o "secuencia que corresponde a" como se relaciona con el ARN que se describe en el presente documento (por ejemplo, ARNmtncAS), indica que el ARN tiene una secuencia que es identica o sustancialmente igual a un ARN o un ARN codificado por un ADN analogo, que se describe en el presente documento. Por ejemplo, un ARNmtncAS que corresponde a la SEQ ID NO: 4 indica que el ARNmtncAS tiene una secuencia que es identica o sustancialmente igual a la del ARN de la SEQ ID NO: 203 o el ARN codificado por el ADN analogo de la SEQ ID NO: 4.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de acido nucleico" o "porcentaje (%) de complementariedad" con respecto a una secuencia de nucleotidos de referencia (por ejemplo, secuencia ARNmtncS o secuencia ARNmtncAS) se define como el porcentaje de restos de acido nucleico en una secuencia candidata (por ejemplo, secuencia de oligonucleotidos) que son identicos a los restos de acido nucleico de la secuencia de nucleotidos de referencia, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el porcentaje maximo de identidad de secuencia y no considerar ninguna sustitucion conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineacion con el proposito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico puede conseguirse de diversas maneras que estan dentro de la tecnica, por ejemplo, usando un software informatico disponible publicamente tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parametros apropiados para alinear secuencias, incluidos cualesquier algoritmos necesarios para conseguir la alineacion maxima en la longitud completa de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, el % de identidad de secuencia de acido nucleico de una secuencia de acido nucleico A dada, con o frente a una secuencia de acido nucleico B dada (que puede como alternativa parafrasearse como una secuencia de acido nucleico A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de acido nucleico en, con o frente a una secuencia de acido nucleico B dada) se calcula de la siguiente manera:
100 veces la fraccion X/Y
donde X es el numero de restos de acido nucleico puntuados como coincidencias identicas por la secuencia en esa alineacion del programa de A y B, y donde Y es el numero total de restos de acido nucleico en B. Se apreciara que cuando la longitud de la secuencia de acido nucleico A no sea igual a la longitud de la secuencia de acido nucleico B, el % de identidad de secuencia de acido nucleico de A con respecto a B no sera igual al % de identidad de secuencia de acido nucleico de B con respecto a A.
Un "trastorno" o "enfermedad" es cualquier afeccion que se beneficiana del tratamiento con una sustancia/molecula o un metodo que se desvela en el presente documento. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicos y agudos, incluyendo aquellas afecciones patologicas que predisponen al mairnfero al trastorno en cuestion. En una realizacion, el trastorno o enfermedad es un cancer. En otra realizacion, el trastorno o enfermedad es un cancer metastasico.
El termino "cancer" se refiere a o describe la afeccion fisiologica en los mai^eras que se caracteriza normalmente por un crecimiento/proliferacion celular no regulado. Los ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.
Las expresiones "cancer metastasico" o "metastasis del cancer" se refieren a un cancer primario susceptible de metastasis o cancer que se ha diseminado (es decir, metastatizo) desde un cancer primario, tejido canceroso primario o celulas cancerosas primarias (por ejemplo, celulas madre cancerosas) desde una parte del cuerpo a una o mas partes del cuerpo para formar un cancer secundario o canceres secundarios. El cancer metastasico o la metastasis del cancer tambien se refieren a un cancer localmente avanzado que se ha diseminado desde un cancer primario a los tejidos o ganglios linfaticos cercanos. El cancer metastasico incluye tumores que se definen como de alto grado y/o estadio alto, por ejemplo, tumores con una puntuacion de Gleason de 6 o mas en el cancer de prostata son mas propensos a metastatizarse. El cancer metastasico tambien se refiere a tumores definidos por uno o mas marcadores moleculares que se correlacionan con la metastasis.
Las expresiones "cancer recidivante", "recafda de un cancer", "recafda del cancer" o "recafda del tumor" se refieren a la reaparicion o la recidiva de un cancer despues de un penodo de mejona. Normalmente, el penodo de mejona es despues de la administracion de una terapia que dio como resultado la disminucion o desaparicion de los signos y smtomas de cancer. El penodo de mejona puede ser la disminucion o desaparicion de todos los signos y smtomas de cancer. El penodo de mejona tambien puede ser la disminucion o desaparicion de algunos, pero no todos, los signos y smtomas de cancer. En algunas realizaciones, el cancer recidivante es un cancer que ha dejado de responder o no responde parcialmente a un farmaco o una terapia. Por ejemplo y sin limitacion, el cancer recidivante incluye cancer en pacientes cuya primera progresion se produce en ausencia de cualquier tratamiento despues de un tratamiento satisfactorio con un farmaco o una terapia; un cancer en pacientes que progresan con un tratamiento o en los 60 dfas posteriores al tratamiento; y un cancer en pacientes que progresan mientras reciben tratamiento. Las expresiones "celula madre cancerosa", "celulas madre cancerosas" o "CMC" como se usan en el presente documento se refieren a una subpoblacion de celulas tumorales o celulas cancerosas. Las celulas madre cancerosas poseen caractensticas asociadas a las celulas madre normales, tales como la capacidad de originar diferentes tipos celulares que se encuentran en un cancer o tumor particular. Las celulas madre cancerosas tienen la capacidad de impulsar la produccion o formacion de un tumor o tumores a traves de la autorrenovacion y/o diferenciacion. Se han identificado celulas madre cancerosas en diversos tipos de cancer que incluyen, pero no se limitan a, canceres de mama, cerebro, sangre, tugado, rinon, cuello uterino, ovario, colon y pulmon, entre otros. Como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervencion clmica en un intento de alterar el curso natural del individuo o la celula que se esta tratando y puede realizarse ya sea para la profilaxis o durante el curso de la patologfa clmica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevencion de la aparicion o la recidiva de la enfermedad, el alivio de los smtomas, la disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, la prevencion o la supresion de la metastasis, la disminucion de la velocidad de progresion de la enfermedad, la mejora o la paliacion de la patologfa y la remision o la mejora del pronostico. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos que se describen en el presente documento se usan para prevenir o suprimir la metastasis. Un individuo se "trata" satisfactoriamente, por ejemplo, usando un oligonucleotido que se desvela en el presente documento si el individuo muestra una reduccion observable y/o medible en ausencia de uno o mas de los siguientes: reduccion en el numero de celulas cancerosas o ausencia de celulas cancerosas; reduccion en el tamano del tumor; inhibicion (es decir, ralentizacion hasta cierto punto y preferentemente detencion) de la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos incluyendo la propagacion del cancer en tejidos blandos y huesos; inhibicion (es decir, ralentizacion hasta cierto punto y preferentemente detencion) de la metastasis tumoral; inhibicion, hasta cierto punto, del crecimiento tumoral o de la recafda tumoral; y/o alivio hasta cierto punto, uno o mas de los smtomas asociados al cancer espedfico; reduccion de la morbilidad y la mortalidad y mejora de la calidad de vida.
Como se usa en el presente documento, el termino "prevencion" incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparicion o la recidiva de una enfermedad en un individuo. Un individuo puede estar predispuesto o ser susceptible a un trastorno o estar en riesgo de desarrollar un trastorno, pero aun no habersele diagnosticado el trastorno. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos que se describen en el presente documento se usan para prevenir o suprimir la metastasis.
Como se usa en el presente documento, un individuo "en riesgo" de desarrollar un trastorno puede o puede no tener una enfermedad o smtomas de enfermedad detectables, y puede o puede no haber mostrado una enfermedad o smtomas de enfermedad detectables antes de los metodos de tratamiento que se describen en el presente documento. "En riesgo" denota que un individuo tiene uno o mas factores de riesgo, que son parametros medibles que se correlacionan con el desarrollo de cancer (por ejemplo, cancer metastasico), como se sabe en la tecnica. Un individuo que tenga uno o mas de estos factores de riesgo tiene una mayor probabilidad de desarrollar el trastorno que un individuo sin uno o mas de estos factores de riesgo.
Un "individuo" o "sujeto" puede ser un vertebrado, un mairnfero o un ser humano. Los mairnferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja (tales como vacas), animales deportivos, mascotas (tales como caballos), primates, ratones y ratas. Los individuos tambien incluyen animales de comparMa incluyendo, pero no limitados a, perros y gatos. En un aspecto, un individuo es un ser humano.
Un "profesional de la salud", como se usa en el presente documento, puede incluir, sin limitacion, medicos, enfermeras, asistentes medicos, tecnicos de laboratorio, cientfficos investigadores, trabajadores de oficina empleados por los mismos o cualquier persona implicada en la determinacion, el diagnostico, la ayuda en el diagnostico o que influya en el curso del tratamiento para el individuo.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de compuesto terapeutico, tal como un oligonucleotido u otra terapia antineoplasica, administrada a un individuo, ya sea como una dosis unica o como parte de una serie de dosis, que es eficaz para producir un resultado terapeutico o profilactico deseado.
Una "cantidad terapeuticamente eficaz" es al menos la concentracion mmima requerida para efectuar una mejora medible de un trastorno particular. Una cantidad terapeuticamente eficaz en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como la patologfa, la edad, el sexo y el peso del paciente, y la capacidad del oligonucleotido para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien puede ser una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial del oligonucleotido sea superado por los efectos terapeuticamente beneficiosos. En el caso del cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz del oligonucleotido puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano tumoral; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metastasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o mas de los smtomas asociados al cancer. En la medida en que el oligonucleotido pueda prevenir el crecimiento y/o la destruccion de las celulas cancerosas existentes, puede ser citostatico y/o citotoxico.
Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los penodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. Por ejemplo, una cantidad profilacticamente eficaz de los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento es al menos la concentracion mmima que previene o atenua el desarrollo de al menos un smtoma de cancer metastasico.
La administracion "en combinacion con" uno o mas agentes terapeuticos adicionales incluye la administracion simultanea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
La expresion "formulacion farmaceutica" se refiere a una preparacion que esta en una forma de manera que permite que la actividad biologica del principio activo sea eficaz y que no contenga componentes adicionales que sean inaceptablemente toxicos para un sujeto al que se administrana la formulacion. Dichas formulaciones son esteriles. Una formulacion "esteril" es aseptica o esta libre de cualquier microorganismo vivo y sus esporas.
El termino "prospecto" se usa para referirse a instrucciones habitualmente incluidas en los paquetes comerciales de productos terapeuticos, que contienen informacion acerca de las indicaciones, el uso, la dosificacion, la administracion, las contraindicaciones y/o las advertencias sobre el uso de dichos productos terapeuticos.
El termino "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo facilmente conocido por el experto en este campo tecnico.
Se pretende que cada limitacion numerica maxima proporcionada en toda la presente memoria descriptiva incluya todas las limitaciones numericas mas bajas, como si dichas limitaciones numericas mas bajas estuvieran expresamente escritas en el presente documento. Cada limitacion numerica minima proporcionada en toda la presente memoria descriptiva incluira todas las limitaciones numericas mas altas, como si dichas limitaciones numericas mas altas estuvieran expresamente escritas en el presente documento. Cada intervalo numerico proporcionado en la presente memoria descriptiva incluira todos los intervalos numericos mas estrechos que pertenezcan a dicho intervalo numerico mas amplio, como si dichos intervalos numericos mas estrechos estuvieran expresamente escritos en el presente documento.
III. Oligonucleotidos y otras terapias antineoplasicas
Las celulas humanas expresan una serie de moleculas de ARN mitocondrial quimerico unicas. Estas moleculas son no codificantes (es decir, no se sabe que sirvan como molde para la traduccion de una protema) y comprenden el ARN ribosomico mitocondrial 16S unido covalentemente en el extremo 5' a una secuencia de repeticion invertida. Las moleculas de ARN mitocondrial quimerico se encuentran en dos formas: sentido y antisentido.
La molecula de ARN mitocondrial no codificante quimerico sentido (ARNmtncS) corresponde al ARN ribosomico mitocondrial 16S transcrito a partir de la "cadena H" del genoma mitocondrial circular (documento WO 2005/001030). Unida covalentemente al extremo 5' de esta molecula de ARN hay una secuencia de nucleotidos o una secuencia de repeticion invertida que corresponde a un ARN transcrito a partir de la "cadena L" del gen 16S mitocondrial. El tamano de la secuencia de repeticion invertida en el ARNmtncS puede variar de aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 u 800 nucleotidos o mas a entre aproximadamente 100-200, 150-250, 200-300, 250-350, 400-500, 450-550, 500-600, 550-650, 600-700, 650-750 o 700-800 nucleotidos o mas, incluyendo cualquier numero entre estos valores. En una realizacion, la secuencia de repeticion invertida en el ARNmtncS corresponde a un fragmento de 815 nucleotidos del ARN transcrito a partir de la cadena L del gen 16S del genoma mitocondrial. En otra realizacion, la secuencia de repeticion invertida en el ARNmtncS corresponde a un fragmento de 754 nucleotidos del ARN transcrito a partir de la cadena L del gen 16S del genoma mitocondrial. En otra realizacion mas, la secuencia de repeticion invertida en el ARNmtncS corresponde a un fragmento de 694 nucleotidos del ARN transcrito a partir de la cadena L del gen 16S del genoma mitocondrial. En otra realizacion, el ARNmtncS corresponde a la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3. En otra realizacion, el ARNmtncS comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 200, la SEQ ID NO: 201 y la SEQ ID NO: 202.
La molecula de ARN mitocondrial no codificante quimerico antisentido (ARNmtncAS) corresponde al ARN ribosomico mitocondrial 16S transcrito a partir de la "cadena L" del genoma mitocondrial circular. Unida covalentemente al extremo 5' de esta molecula de ARN hay una secuencia de nucleotidos o la secuencia de repeticion invertida correspondiente a un ARN transcrito a partir de la "cadena H" del gen 16S mitocondrial. El tamano de la secuencia de repeticion invertida en el ARNmtncAS puede variar de aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800 nucleotidos o mas a entre aproximadamente 100-200, 150-250, 200-300, 250-350, 400-500, 450­ 550, 500-600, 550-650, 600-700, 650-750 o 700-800 o mas, incluyendo cualquier numero entre estos valores. En otra realizacion, el ARNmtncAS corresponde a la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6. En otra realizacion, el ARNmtncAS comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 203, la SEQ ID NO: 204 y la SEQ ID NO: 205.
Puede encontrarse informacion adicional relacionada con moleculas de ARN mitocondrial quimerico en la Patente de los EE.UU. N.° 8.318.686.
En un aspecto, la invencion proporciona uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtncAS o una molecula de ARNmtncS, en la que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable para su uso en un metodo que se desvela en el presente documento. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan metodos para suprimir la metastasis de un cancer en un individuo usando uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan metodos para tratar o prevenir la recafda de un cancer en un individuo. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan metodos para tratar el cancer metastasico en un individuo. En algunas realizaciones en el presente documento, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas). En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtncAS o una molecula de ARNmtncS que se describen en el presente documento tienen una o mas de las siguientes caractensticas cuando se usan en un metodo que se desvela en el presente documento: (1) se hibridan con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico (es decir, una molecula de ARNmtncAS o una molecula de ARNmtncS) para formar un duplex estable; (2) se hibridan con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico expresadas por las celulas tumorales e inhiben, detienen, destruyen o suprimen las celulas tumorales; (3) se hibridan con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico expresadas por las celulas madre cancerosas (CMC) e inhiben, detienen, destruyen o suprimen las CMC; (4) suprimen la metastasis de un cancer en un individuo (por ejemplo, un individuo tratado anteriormente contra el cancer con una terapia); (5) tratan o previenen la recafda de un cancer en un individuo (por ejemplo, un individuo tratado anteriormente contra el cancer con una terapia); (6) tratan el cancer metastasico en una persona (por ejemplo, una persona tratada anteriormente contra el cancer con una terapia); y (7) prolongan la supervivencia general en un individuo tratado anteriormente contra el cancer con una terapia (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas).
En un aspecto, los oligonucleotidos para su uso en cualquiera de los metodos que se describen en el presente documento pueden ser complementarios a una molecula de ARNmtncS y/o a una molecula de ARNmtncAS desveladas en el presente documento. Sin quedar ligado a la teona, se cree que los oligonucleotidos complementarios se unen a los ARNmtnc e interfieren con sus funciones celulares. Como se usa en el presente documento, una secuencia de oligonucleotidos es "complementaria" a una porcion de un ARNmtnc, como se menciona en el presente documento, si el oligonucleotido posee una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poder hibridarse con el ARNmtnc para formar un duplex estable. La capacidad de hibridarse dependera del grado de complementariedad y de la longitud del oligonucleotido. En general, cuanto mas largo sea el oligonucleotido de hibridacion, mayor sera el numero de desapareamientos de bases con un ARNmtnc que puede contener y aun formar un duplex estable. En algunos aspectos, el uno o mas oligonucleotidos utilizados de acuerdo con los metodos que se desvelan en el presente documento son al menos 8 (tal como al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 o mas) pares de bases en longitud. Los expertos en la materia pueden determinar un grado tolerable de desapareamiento mediante el uso de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusion del complejo hibridado. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos tienen una complementariedad de al menos un 85 % (tal como al menos el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %) con una molecula de ARNmtncS y/o con una molecula de ARNmtncAS desveladas en el presente documento. En algunas realizaciones, el oligonucleotido complementario es un oligonucleotido antisentido. En una realizacion, el uno o mas oligonucleotidos son complementarios a uno o mas ARNmtnc codificados por una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198.
a. Modificaciones de oligonucleotidos
El enlace internucleosfdico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiester de 3 'a 5'. Los oligonucleotidos (por ejemplo, un oligonucleotido antisentido) utilizados para suprimir la metastasis de un cancer, tratar o prevenir la recafda de un cancer, o tratar el cancer metastasico de acuerdo con cualquiera de los metodos que se desvelan en el presente documento pueden tener uno o mas enlaces internucleosfdicos modificados, es decir, no de origen natural. Con respecto a la terapeutica, los enlaces internucleosfdicos modificados se seleccionan con frecuencia sobre los oligonucleotidos que tienen enlaces internucleosfdicos de origen natural debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular potenciada, afinidad potenciada por acidos nucleicos diana y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas presentes en fluidos corporales.
Los oligonucleotidos (por ejemplo, un oligonucleotido antisentido) que tienen enlaces internucleosfdicos modificados incluyen enlaces internucleosfdicos que conservan un atomo de fosforo, asf como enlaces internucleosfdicos que no tienen un atomo de fosforo. Los enlaces internucleosfdicos representativos que contienen fosforo incluyen, pero no se limitan a, fosfodiesteres, fosfotriesteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los metodos de preparacion de enlaces que contienen fosforo y que no contienen fosforo son bien conocidos en la tecnica.
En una realizacion, los oligonucleotidos (por ejemplo, un oligonucleotido antisentido) dirigidos a una molecula de ARNmtncS y/o a una molecula de ARNmtncAS desveladas en el presente documento comprenden uno o mas enlaces internucleosfdicos modificados. En algunas realizaciones, los enlaces internucleosfdicos modificados son enlaces fosforotioato.
Como se sabe en la tecnica, un nucleosido es una combinacion de base y azucar. La porcion de base del nucleosido es normalmente una base heterodclica. Las dos clases mas comunes de dichas bases heterodclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleotidos son nucleosidos que incluyen adicionalmente un grupo fosfato unido covalentemente a la porcion de azucar del nucleosido. Para aquellos nucleosidos que incluyen un azucar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azucar. En la formacion de oligonucleotidos, los grupos fosfato unen covalentemente los nucleosidos adyacentes entre sf para formar un compuesto polimerico lineal. A su vez, los extremos respectivos de esta estructura polimerica lineal pueden unirse adicionalmente para formar una estructura circular, sin embargo, generalmente se prefieren las estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura del oligonucleotido, los grupos fosfato se denominan habitualmente formadores de la cadena principal internucleosfdica del oligonucleotido. El enlace normal o la cadena principal de ARN y ADN es un enlace fosfodiester de 3' a 5'.
Los ejemplos espedficos, aunque no limitantes, de oligonucleotidos (por ejemplo, un oligonucleotido antisentido) utiles en los metodos que se desvelan en el presente documento incluyen oligonucleotidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleosfdicos no naturales. Como se define en la presente memoria descriptiva, los oligonucleotidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen aquellos que conservan un atomo de fosforo en la cadena principal y aquellos que no tienen un atomo de fosforo en la cadena principal. Para los fines de la presente memoria descriptiva y como se hace referencia a veces en la tecnica, los oligonucleotidos modificados que no tienen un atomo de fosforo en su cadena principal internucleosfdica tambien pueden considerarse oligonucleosidos.
En algunas realizaciones, las cadenas principales de oligonucleotidos modificados incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos, incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tiono-fosforamidatos, tioalquilfosfonatos, tioalquilfosfotriesteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces normales 3'-5', analogos unidos 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en los que uno o mas enlaces internucleotidicos es una union de 3' a 3', de 5' a 5' o de 2' a 2'. Los oligonucleotidos que tienen polaridad invertida comprenden un unico enlace de 3' a 3' en el enlace internucleotfdico mas hacia 3', es decir, un unico resto de nucleosido invertido que puede ser abasico (falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en de la misma). Tambien se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de acido libre. Las cadenas principales oligonucleotfdicas que no incluyen un atomo de fosforo tienen cadenas principales que estan formadas por enlaces internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroatomo mixto y enlaces internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo, o uno o mas enlaces internucleosfdicos heteroaromaticos o heterodclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porcion de azucar de un nucleosido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfoxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo de metileno; cadenas principales de riboacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilendihidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.
En otras realizaciones, tanto el azucar como el enlace internucleosfdico, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleotidos se reemplazan con grupos nuevos. Las unidades basicas se mantienen para la hibridacion con un compuesto objetivo de acido nucleico apropiado. Un compuesto oligomerico de este tipo, un mimetico de oligonucleotido, se denomina un acido nucleico peptfdico (ANP). En los compuestos de ANP, la cadena principal de azucar de un oligonucleotido se reemplaza con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se conservan y se unen directa o indirectamente a atomos de nitrogeno aza de la porcion de amida de la cadena principal. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de compuestos de ANP incluyen, pero no se limitan a, la patente de los EE.UU. N.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Puede encontrarse contenido adicional de compuestos de ANP en Nielsen et al., Science, 254: 1497-1500, 1991.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los enlaces anteriores que contienen fosforo y que no contienen fosforo incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de los EE.UU. N.° 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050. 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439.
Los oligonucleotidos modificados (por ejemplo, oligonucleotidos antisentido) complementarios a ARNmtncS y/o ARNmtncAS utilizados como terapias antineoplasicas en combinacion con cualquiera de los metodos que se desvelan en el presente documento (por ejemplo, metodo de supresion de metastasis de un cancer) tambien pueden contener uno o mas restos de azucar sustituidos. Por ejemplo, el anillo de azucar de furanosilo puede modificarse de varias maneras, incluyendo la sustitucion con un grupo sustituyente, un puente para formar un acido nucleico bidclico "ANB" y la sustitucion del 4'-O con un heteroatomo tal como S o N(R) como se describe en la Patente de los EE.UU. N.° 7.399.845. Otros ejemplos de ANB se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada N.° WO 2007/146511.
Los oligonucleotidos (por ejemplo, oligonucleotidos antisentido) para su uso en los metodos que se desvelan en el presente documento (por ejemplo, el metodo de supresion de metastasis de un cancer) pueden contener opcionalmente uno o mas nucleotidos que tengan restos de azucar modificados. Las modificaciones del azucar pueden transmitir estabilidad de nucleasa, afinidad de union o alguna otra propiedad biologica beneficiosa a los compuestos antisentido. El anillo de azucar de furanosilo de un nucleosido puede modificarse de varias maneras, incluyendo, pero no limitadas a: la adicion de un grupo sustituyente, en particular en la posicion 2'; la union de dos atomos de anillo no germinales para formar un acido nucleico bidclico (ANB); y la sustitucion de un atomo o grupo tal como -S-, -N(R)- o -C(R1)(R2) por el oxfgeno de anillo en la posicion 4'. Los azucares modificados incluyen, pero no se limitan a: azucares sustituidos, especialmente azucares sustituidos en 2' que tienen un grupo sustituyente 2'-F, 2'-OCH2 (2'-OMe) o un 2'-O(CH2)2-OCH (2'-O-metoxietilo o 2'-MOE); y azucares modificados bidclicos (ANB), que tienen una union 4'-(CH2)n-O-2', donde n = 1 o n = 2. Los metodos para la preparacion de azucares modificados son bien conocidos por los expertos en la materia.
En determinadas realizaciones, un nucleosido modificado en 2' tiene un resto de azucar bidclico. En determinadas realizaciones de este tipo, el resto de azucar bidclico es un azucar D en la configuracion alfa. En determinadas realizaciones de este tipo, el resto de azucar bidclico es un azucar D en la configuracion beta. En determinadas realizaciones de este tipo, el resto de azucar bidclico es un azucar L en la configuracion alfa. En determinadas realizaciones de este tipo, el resto de azucar bidclico es un azucar L en la configuracion beta.
En otras realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende un grupo de union entre los atomos de carbono 2' y 4'. En determinadas realizaciones de este tipo, el grupo de union comprende de 1 a grupos birradicales unidos. En determinadas realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende de 1 a 4 grupos birradicales unidos. En determinadas realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende 2 o 3 grupos birradicales unidos. En determinadas realizaciones, el resto de azucar bidclico comprende 2 grupos birradicales unidos. En determinadas realizaciones, un grupo birradical unido se selecciona entre -O-, -S-, -N(Rl)-, -C(R1)(R2)-, -C(R1)=C(R1)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -Si(R1)(R2)-, -S(=O)2-, -S(=O)-, -C(O)- y -C(=S)-; donde cada R1 y R2 es, independientemente, H, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alidclico C5-C7, radical alidclico C5-C7 sustituido, halogeno, oxi sustituido (-O-), amino, amino sustituido, azido, carboxilo, carboxilo sustituido, acilo, acilo sustituido, CN, tiol, tiol sustituido, sulfonilo (S(=O)2-H), sulfonilo sustituido, sulfoxilo (S(=O)-H) o sulfoxilo sustituido; y cada grupo sustituyente es, independientemente, halogeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, amino, amino sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalcoxi C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido, aminoalcoxi C1-C12 sustituido o un grupo protector.
Los oligonucleotidos (por ejemplo, oligonucleotidos antisentido) para su uso en cualquiera de los metodos que se desvelan en el presente documento (por ejemplo, el metodo de supresion de la metastasis de un cancer) tambien pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (con frecuencia denominadas en la tecnica simplemente como "base"). Las modificaciones o sustituciones de nucleobases pueden distinguirse estructuralmente, pero son funcionalmente indistinguibles, de nucleobases no modificadas de origen natural o sinteticas. Las nucleobases tanto naturales como modificadas son capaces de participar en la formacion de enlaces de hidrogeno. Dichas modificaciones de nucleobase pueden transmitir estabilidad de nucleasa, afinidad de union o alguna otra propiedad biologica beneficiosa a los compuestos oligonucleotidicos. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sinteticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Determinadas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente utiles para aumentar la afinidad de union de un compuesto oligonucleotidico (tal como un compuesto oligonucleotfdico antisentido) para un acido nucleico diana (tal como un ARNmtnc).
Las nucleobases adicionales no modificadas incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alquilos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros alquilos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CeC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidfnicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otras uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desaza-guanina y 3-desazaadenina.
Los restos de bases heterodclicas tambien pueden incluir aquellos en los que la base purica o pirimidfnica se reemplaza por otros heterociclos, por ejemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente utiles para aumentar la afinidad de union de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-aza-pirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
Como se usa en el presente documento, las nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las bases punnicas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidfnicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sinteticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alquilos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros alquilos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CeC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidfnicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7desazaguanina y 7-desazadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tridclicas tales como fenoxazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), O-fijaciones tales como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las nucleobases modificadas tambien pueden incluir aquellas en las que la base purica o pirimidmica se reemplaza por otros heterociclos, por ejemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases adicionales incluyen aquellas desveladas en la Patente de los EE.UU. 3.687.808, aquellas desveladas en The Concise Enciclopedia Of Polymer Science and Engineering, paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas desveladas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y aquellas desveladas por Sanghvi, Y.S., Capftulo 15, Antisense Research and Applications, paginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de algunas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, asf como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de los EE.UU. N.° 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121.
5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; y 5.681.941.
b. Ribozimas
En otra realizacion, pueden usarse ribozimas para interferir con las moleculas de ARNmtnc que se describen en el presente documento para inducir muerte celular en celulas proliferativas asociadas a metastasis (por ejemplo, CMC). La secuencia de la ribozima puede disenarse de acuerdo con la secuencia del ARNmtncAS (por ejemplo, una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6 o una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204 o SEQ ID NO: 205) o el ARNmtncS (por ejemplo, una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, o una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 o SEQ ID NO: 203) para escindir regiones espedficas del transcrito. Las ribozimas son moleculas de ARN enzimatico capaces de catalizar la escision espedfica del ARN (Rossi, Curr. Biology 4: 469-471, 1994). El mecanismo de accion de la ribozima implica la hibridacion espedfica de secuencia de la molecula de ribozima con el ARN diana complementario, seguido de una escision endonucleolftica. La composicion de moleculas de ribozima debe incluir una o mas secuencias complementarias al ARN y debe incluir la secuencia catalftica bien conocida responsable de la escision del ARN y se describe en la Patente de los EE.UU. N.° 5.093.246. Como tal, dentro del alcance de la divulgacion, las moleculas de ribozima de cabeza de martillo pueden disenarse por ingeniena genetica para catalizar espedfica y eficazmente la escision endonucleolftica de las moleculas de ARNmtncAS o de ARNmtncS que se desvelan en el presente documento. La construccion y la produccion de ribozimas de cabeza de martillo son bien conocidas en la tecnica y se describieron (Haseloff et al., Gene, 82: 43-52, 1989). Las ribozimas que se desvelan en el presente documento tambien pueden incluir endorribonucleasas de ARN (Zaug et al., Science, 224: 574-578, 1984). En algunas realizaciones, una ribozima descrita en el presente documento puede usarse en cualquier metodo que se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo de supresion de la metastasis de un cancer en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una o mas ribozimas que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo para tratar o prevenir la recafda de cancer en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una o mas ribozimas que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo para tratar el cancer metastasico en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una o mas ribozimas que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo para tratar un cancer resistente (por ejemplo, un cancer resistente asociado al VPH) en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una o mas ribozimas que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas).
c. Interferencia de ARN
En otro aspecto, la interferencia con la funcion de las moleculas de ARNmtncAS y/o de ARNmtncS que se desvelan en el presente documento para su uso en cualquiera de los metodos que se desvelan en el presente documento (por ejemplo, metodo de supresion de metastasis de un cancer) puede conseguirse mediante interferencia de ARN o silenciamiento de ARN. La interferencia de ARN (ARNi) ha surgido como un enfoque novedoso y prometedor para el silenciamiento genico en celulas de mairnferos (Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001; McManus et al., Nature Rev. Genet. 3: 737-747, 2002). Las moleculas de ARN bicatenario sintetizadas sinteticamente de aproximadamente 8 a 40 (tales como de aproximadamente 10 a 36, de 14 a 32, 18-28 o 22-24) pares de bases (pb) o al menos aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 pb de longitud, se hibridan espedficamente con su ARN objetivo complementario, lo que conduce a la degradacion del ARN. Se han silenciado varios genes diferentes satisfactoriamente mediante ARN interferente pequeno o ARNip (Lu et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 5: 225-234, 2003; Wacheck et al., Oligonucleotides 13: 393-400, 2003). Por tanto, el ARN bicatenario sintetico dirigido a las moleculas de ARNmtncAS y/o ARNmtncS que se desvelan en el presente documento puede usarse para degradar estos transcritos e inducir la muerte de celulas cancerosas (por ejemplo, muerte de CMC). Aquellos que esten familiarizados con la tecnica entenderan que la secuencia del ARNip tiene que ser complementaria a cualquier region de las moleculas de ARNmtncAS y/o ARNmtncS (tales como las complementarias a una cualquiera de entre una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y/o la SEQ ID NO: 6 o complementarias a una cualquiera de entre una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 200, la SEQ ID NO: 201, la SEQ ID NO: 202, la SEQ ID NO: 203, la SEQ ID NO: 204 y/o la SEQ ID NO: 205). En algunas realizaciones, un ARN que se describe en el presente documento puede usarse en cualquier metodo que se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo de supresion de la metastasis de un cancer en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas ARN que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo de tratamiento o prevencion de la recafda del cancer en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas ARN que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo de tratamiento del cancer metastasico en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas ARN que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo de tratamiento de un cancer resistente (por ejemplo, un cancer asociado al VPH resistente) en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas ARN que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas).
d. Entrega de oligonucleotidos
En una realizacion, puede usarse un vector recombinante para entregar uno o mas oligonucleotidos (tales como cualquiera de los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento) complementarios a una molecula de ARN mitocondrial no codificante quimerico sentido y/o antisentido al individuo. Esto puede incluir tanto la entrega sistemica como la entrega localizada a una region particular del cuerpo (tal como la medula osea). En el presente documento se contempla cualquier vector capaz de permitir la produccion recombinante de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtnc quimerica antisentido o antisentido y/o que pueda entregar uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtnc quimerico antisentido o antisentido en una celula hospedadora. El vector puede ser ARN o ADN, procariotico o eucariota y normalmente es un virus o un plasmido. El vector puede ser parte de una vacuna de ADN o puede usarse como parte de cualquier otro metodo para entregar un gen heterologo para la expresion en una celula hospedadora que es conocida por un experto en la materia. Los vectores recombinantes son capaces de replicarse cuando se transforman en una celula hospedadora adecuada. Los vectores vmcos infectan una amplia gama de celulas humanas que no se dividen y se han utilizado ampliamente en vacunas vivas sin efectos secundarios adversos. Un vector vmco (tal como, por ejemplo, un vector adenovmco o un vector vmco adenoasociado (AAV, por sus siglas en ingles) (por ejemplo, a AV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6)., etc. o los vectores de AAV hnbridos que comprenden el mismo) es un ejemplo de un vector para su uso en los presentes metodos para entregar uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARNmtnc quimerico sentido o antisentido a celulas cancerosas (tales como un plasmocito; vease, por ejemplo, la Publicacion de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° 2004/0224389 o una CMC). En algunas realizaciones, un vector recombinante (por ejemplo, un vector vmco) que se describe en el presente documento puede usarse en cualquier metodo que se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo de supresion de la metastasis de un cancer en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un vector recombinante (por ejemplo, un vector vmco) que comprende uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo para tratar o prevenir la recafda del cancer en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un vector recombinante (por ejemplo, un vector vmco) que comprende uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo para tratar el cancer metastasico en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un vector recombinante (por ejemplo, un vector vmco) que comprende uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, un metodo para tratar un cancer resistente (por ejemplo, un cancer asociado al VPH resistente) en un individuo comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un vector recombinante (por ejemplo, un vector vmco) que comprende uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas).
En otro aspecto, uno o mas oligonucleotidos (tales como cualquiera de los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento) complementarios a una molecula de ARN mitocondrial no codificante quimerica antisentido y/o sentido se encapsulan dentro de un microvehnculo para la entrega a un individuo. En determinadas realizaciones, una mezcla de diferentes oligonucleotidos (tales como cualquiera de los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento) complementarios a una molecula de ARN mitocondrial no codificante quimerico sentido y/o antisentido puede encapsularse con un microvehnculo, de manera que el microvetnculo encapsula mas de una especie de oligonucleotido. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos (tales como cualquiera de los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento) complementarios a una molecula de ARN mitocondrial no codificante quimerico sentido y/o antisentido encapsulados dentro del microvehnculo comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos (tales como cualquiera de los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento) complementarios a una molecula de ARN mitocondrial no codificante quimerico sentido y/o antisentido encapsulados dentro del microvehnculo comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198.
Los metodos de encapsulacion de oligonucleotidos en microveldculos son bien conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional WO98/55495. Los sistemas de dispersion coloidal, tales como microesferas, perlas, complejos macromoleculares, nanocapsulas y sistemas a base de lfpidos, tales como emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas pueden proporcionar una encapsulacion eficaz de oligonucleotidos dentro de composiciones de microveldculos. La composicion de encapsulacion puede comprender adicionalmente cualquiera de una amplia diversidad de componentes. Estos incluyen, pero no se limitan a, alumbre, lfpidos, fosfolfpidos, estructuras de membrana lipfdica (EML), polietilenglicol (PEG) y otros polfmeros, tales como polipeptidos, glicopeptidos y polisacaridos.
Otras terapias antineoplasicas
En algunos aspectos, cualquiera de los metodos de tratamiento que se describen en el presente documento puede comprender administrar una o mas terapias antineoplasicas adicionales al individuo. En algunas realizaciones, la una o mas terapias antineoplasicas se seleccionan entre el grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia y cirugfa. Agentes quimioterapicos y antineoplasicos se usan indistintamente en el presente documento. Pueden usarse diversas clases de agentes antineoplasicos. Los ejemplos no limitantes incluyen: agentes alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas, alcaloides vegetales, inhibidores de la topoisomerasa, podofilotoxina, anticuerpos (por ejemplo, monoclonales o policlonales), inhibidores de la tirosina cinasa (por ejemplo, mesilato de imatinib (Gleevec® o Glivec®)), tratamientos hormonales, receptores solubles y otros antineoplasicos
Los inhibidores de la topoisomerasa tambien son otra clase de agentes antineoplasicos que pueden usarse en el presente documento. Las topoisomerasas son enzimas esenciales que mantienen la topologfa del ADN. La inhibicion de las topoisomerasas de tipo I o de tipo II interfiere tanto con la transcripcion como con la replicacion del ADN alterando el superenrollamiento apropiado del ADN. Algunos inhibidores de la topoisomerasa de tipo I incluyen las camptotecinas: irinotecan y topotecan. Los ejemplos de inhibidores de tipo II incluyen amsacrina, etoposido, fosfato de etoposido y teniposido. Estos son derivados semisinteticos de las epipodofilotoxinas, alcaloides que se producen naturalmente en la rafz de la manzana de mayo americana (Podophyllum peltatum).
Los antineoplasicos incluyen el inmunosupresor dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida. Los compuestos antineoplasicos generalmente actuan modificando qmmicamente el ADN de una celula.
Los agentes alquilantes pueden alquilar muchos grupos funcionales nucleofilos en las condiciones presentes en las celulas. Cisplatino y carboplatino y oxaliplatino son agentes alquilantes. Deterioran la funcion celular mediante la formacion de enlaces covalentes con los grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo y fosfato en moleculas biologicamente importantes.
Los alcaloides de la vinca se unen a sitios espedficos en la tubulina, inhibiendo el ensamblaje de la tubulina en microtubulos (fase M del ciclo celular). Los alcaloides de la vinca incluyen: vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina.
Los antimetabolitos se parecen a las purinas (azatioprina, mercaptopurina) o pirimidina e impiden que estas sustancias se incorporen al ADN durante la fase "S" del ciclo celular, deteniendo el desarrollo y la division normales. Los antimetabolitos tambien afectan a la smtesis de ARN.
Los alcaloides y terpenoides vegetales derivan de las plantas y bloquean la division celular mediante la prevencion de la funcion de los microtubulos. Puesto que los microtubulos son vitales para la division celular, sin ellos, la division celular no puede producirse. Los principales ejemplos son alcaloides de la vinca y taxanos.
La podofilotoxina es un compuesto derivado de plantas de la que se ha informado que ayuda con la digestion y que se usa para producir otros dos farmacos citostaticos, etoposido y teniposido. Evitan que la celula entre en la fase G1 (el inicio de la replicacion del ADN) y la replicacion del ADN (la fase S).
Los taxanos como grupo incluyen paclitaxel y docetaxel. El paclitaxel es un producto natural, originalmente conocido como Taxol y derivado en primer lugar de la corteza del arbol de tejo del Padfico. El docetaxel es un analogo semisintetico de paclitaxel. Los taxanos potencian la estabilidad de los microtubulos, evitando la separacion de los cromosomas durante la anafase.
En algunos aspectos, el agente antineoplasico puede seleccionarse entre remicade, docetaxel, celecoxib, melfalan, dexametasona (Decadron®), esteroides, gemcitabina, cisplatino, temozolomida, etoposido, ciclofosfamida, temodar, carboplatino, procarbazina, gliadel, tamoxifeno, topotecan, metotrexato, gefitinib (Iressa®), taxol, taxotere, fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, xeloda, CPT-11, interferon alfa, interferon alfa pegilado (por ejemplo, PEG-INTRON-A), capecitabina, cisplatino, tiotepa, fludarabina, carboplatino, daunorrubicina liposomica, citarabina, doxetaxol, paclitaxel, vinblastina, IL-2, GM-CSF, dacarbazina, vinorelbina, acido zoledronico, palmitronato, biaxina, busulfan, prednisona, bortezomib (Velcade®), bifosfonato, trioxido de arsenico, vincristina, doxorrubicina (Doxil®), paclitaxel, ganciclovir, adriamicina, fosfato de sodio de estramustina (Emcyt®), sulindaco o etoposido.
En otras realizaciones, el agente antineoplasico puede seleccionarse entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon alfa pegilado, prednisona, talidomida o vincristina.
En algunos aspectos, la una o mas terapias antineoplasicas es radioterapia. Como se usa en el presente documento, el termino "radioterapia" se refiere a la administracion de radiacion para destruir celulas cancerosas. La radiacion interactua con moleculas en la celula, tales como el ADN, para inducir la muerte celular. La radiacion tambien puede danar las membranas celulares y nucleares y otros organulos. Dependiendo del tipo de radiacion, el mecanismo de dano del ADN puede variar, al igual que la eficacia biologica relativa. Por ejemplo, las partfculas pesadas (es decir, protones, neutrones) danan el ADN directamente y tienen una mayor eficacia biologica relativa. La radiacion electromagnetica produce una ionizacion indirecta que actua a traves de radicales libres hidroxilo de corta duracion producidos principalmente por la ionizacion del agua celular. Las aplicaciones clmicas de la radiacion consisten en radiacion de haz externo (de una fuente externa) y braquiterapia (usando una fuente de radiacion implantada o insertada en el paciente). La radiacion de haz externo consiste en rayos X y/o rayos gamma, mientras que la braquiterapia emplea nucleos radiactivos que se descomponen y emiten partfculas alfa o partfculas beta junto con un rayo gamma. La radiacion tambien contemplada en el presente documento incluye, por ejemplo, la entrega dirigida de radioisotopos a celulas cancerosas. Tambien se contemplan otras formas de factores que danan el ADN en el presente documento, tales como las microondas y la radiacion UV.
La radiacion puede administrarse en una dosis unica o en una serie de dosis pequenas en un esquema de dosis fraccionada. La cantidad de radiacion contemplada en el presente documento vana de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 Gy, incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 Gy o aproximadamente 10 Gy. La dosis total puede aplicarse en una pauta fraccionada. Por ejemplo, la pauta puede comprender dosis individuales fraccionadas de 2 Gy. Los intervalos de dosificacion para los radioisotopos vanan ampliamente y dependen de la semivida del isotopo y de la intensidad y el tipo de radiacion emitida. Cuando la radiacion comprende el uso de isotopos radiactivos, el isotopo puede conjugarse con un agente de direccionamiento, tal como un anticuerpo terapeutico, que transporta el radionucleotido al tejido diana (por ejemplo, tejido tumoral). Los isotopos radiactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, astatina211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57hierro, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, Ahidrogeno, yodo123, yodo131, indio111, 59ion, 32fosforo, renio186, 75selenio, 35azufre, tecnicio99m y/o itrio.
La cirugfa que se describe en el presente documento incluye la extirpacion en la que todo o parte de un tejido canceroso se extirpa, se escinde y/o se destruye ffsicamente. La reseccion del tumor se refiere a la extirpacion ffsica de al menos parte de un tumor. Ademas de la extirpacion del tumor, el tratamiento quirurgico incluye cirugfa con laser, criocirugfa, electrocirugfa y cirugfa controlada de manera microscopica (cirugfa de Mohs). La extirpacion de precanceres o tejidos normales tambien se contempla en el presente documento.
Trasplante de celulas madre y tratamiento ex vivo de celulas madre hematopoyeticas autologas
En otros aspectos, cualquiera de los metodos de tratamiento que se describen en el presente documento puede incluir terapia de trasplante autologo o alogeno de celulas madre. En los ultimos anos, la quimioterapia de dosis altas con trasplante autologo de celulas madre hematopoyeticas se ha convertido en el tratamiento preferido para determinados canceres tales como el mieloma multiple, el linfoma no Hodgkin, el linfoma de Hodgkin y la leucemia. Si bien no es curativo, este procedimiento prolonga la supervivencia global y la remision completa. Antes del trasplante de celulas madre, los pacientes reciben un tratamiento inicial de quimioterapia de induccion. Las pautas de induccion mas comunes que se usan hoy en dfa son talidomida-dexametasona, pautas a base de bortezomib y lenalidomida-dexametasona (Kyle & Rajkumar, Blood, 111 (6): 2962-72, 2008). Por ejemplo, el trasplante autologo de celulas madre perifericas es util para hasta el 50 % de los pacientes con mieloma multiple. A pesar de una baja tasa de mortalidad, los problemas con dicha terapia de trasplante incluyen la incapacidad de erradicar el tumor y la dificultad en la extirpacion de celulas de mieloma y sus precursores de la coleccion de celulas madre utilizadas para el trasplante.
El trasplante alogeno (el trasplante de celulas madre de una persona sana al individuo afectado) es otra opcion terapeutica para tratar determinados canceres, tales como el mieloma multiple, el linfoma no Hodgkin, el linfoma de Hodgkin y la leucemia, pero se usa con menos frecuencia porque puede no proporcionar una cura. Por ejemplo, la mayona de los estudios que evaluan su uso en pacientes con mieloma multiple muestran una supervivencia a largo plazo sin enfermedad del 10-20 %, con una fraccion significativa de pacientes que desarrollan recafda.
Cuando se incluye como un tratamiento para suprimir o prevenir la metastasis de acuerdo con cualquiera de los metodos que se desvelan en el presente documento, el trasplante autologo de celulas madre tambien puede incluir la etapa de tratar las celulas madre hematopoyeticas y/o la medula osea que se han de trasplantar al individuo afectado con cualquiera de los agentes antineoplasicos que se desvelan en el presente documento, antes del trasplante al individuo afectado. En una realizacion, las celulas madre hematopoyeticas y/o la medula osea para su uso en el trasplante autologo de celulas madre pueden tratarse con una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos (por ejemplo, oligonucleotidos antisentido) suficientemente complementarios a una molecula de ARNmtncAS o ARNmtncS (por ejemplo, cualquiera de las moleculas de ARNmtncAS y/o ARNmtncS que se desvelan en el presente documento) para formar un duplex estable antes del trasplante en el individuo afectado. En otra realizacion, el uno o mas oligonucleotidos son suficientemente complementarios a uno o mas ARNmtnc codificados por una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6, para formar un duplex estable. En otras realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198.
Se ha demostrado que el trasplante autologo de medula osea o celulas madre hematicas tambien puede usarse para tratar varias formas de canceres hematicos (tales como, pero sin limitacion, mieloma multiple, leucemia y linfoma). En consecuencia, en algunos aspectos, cuando se incluye como tratamiento para un cancer hematico, en el presente documento se proporciona un metodo de realizacion de un trasplante autologo de celulas madre que incluye la etapa de tratar las celulas madre hematopoyeticas y/o la medula osea que se han de trasplantar en el individuo afectado con cualquiera de los agentes antineoplasicos que se desvelan en el presente documento, antes del trasplante en el individuo afectado. En una realizacion, las celulas madre hematopoyeticas y/o la medula osea para su uso en el trasplante autologo de celulas madre en un individuo con un cancer hematico pueden tratarse con una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos (por ejemplo, oligonucleotidos antisentido) suficientemente complementarios a una molecula de ARNmtncAS o ARNmtncS (por ejemplo, cualquiera de las moleculas de ARNmtncAS y/o ARNmtncS que se desvelan en el presente documento) para formar un duplex estable antes del trasplante en el individuo afectado. En otra realizacion, el uno o mas oligonucleotidos son suficientemente complementarios a uno o mas ARNmtnc codificados por una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6, para formar un duplex estable. En otras realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198.
IV. Composiciones
Cualquiera de los agentes antineoplasicos (tales como los agentes a base de oligonucleotidos) que se desvelan en el presente documento pueden administrarse en forma de composiciones (por ejemplo, composiciones farmaceuticas). Estos compuestos pueden administrarse mediante la administracion sistemica o la administracion local a traves de diversas vfas. La via o vfas de administracion utiles en una aplicacion particular son evidentes para un experto en la materia. Las vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: oral, rectal, cerebroespinal, transdermica, subcutanea, topica, transmucosa, nasofarmgea, pulmonar, intravenosa, intramuscular e intranasal. En algunas realizaciones, la administracion es una administracion local. En algunas realizaciones, la administracion local se selecciona entre el grupo que consiste en la administracion en un organo, en una cavidad, en un tejido y en la administracion subcutanea. En algunas realizaciones, la administracion es administracion sistemica. En algunas realizaciones, la administracion sistemica es la administracion intravenosa o intraperitoneal. Estos compuestos son eficaces como composiciones tanto inyectables como orales. Dichas composiciones se preparan de una manera bien conocida en la tecnica farmaceutica y comprenden al menos un compuesto activo. Las composiciones del presente documento tambien pueden contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion particular que se esta tratando, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sf. Cuando se emplean como composiciones orales, los oligonucleotidos y otros agentes antineoplasicos que se desvelan en el presente documento estan protegidos de la digestion acida en el estomago por un protector farmaceuticamente aceptable.
La presente divulgacion tambien incluye composiciones farmaceuticas que contienen, como principio activo, uno o mas de los agentes antineoplasicos que se desvelan en el presente documento asociados a uno o mas excipientes o vetuculos farmaceuticamente aceptables. En la fabricacion de las composiciones que se desvelan en el presente documento, el principio activo se mezcla por lo general con un excipiente o vetuculo, se diluye con un excipiente o vetuculo o se encierra dentro de dicho excipiente o vetuculo que puede estar en forma de capsula, sobre, papel u otro envase. Cuando el excipiente o vetuculo sirve como diluyente, puede ser un material solido, semisolido o lfquido, que actua como vetuculo, excipiente o medio para el principio activo. Por tanto, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, pfldoras, polvos, pastillas, sobres, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (tales como un solido o en un medio lfquido), pomadas que contengan, por ejemplo, hasta el 10 % en peso del compuesto activo, capsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables esteriles y polvos en envases esteriles.
En algunas realizaciones, en la preparacion de una formulacion, puede ser necesario moler el compuesto liofilizado activo para proporcionar el tamano de partfcula adecuado antes de la combinacion con los otros ingredientes. Si el compuesto activo es sustancialmente insoluble, normalmente se muele hasta un tamano de partfcula inferior a una malla 200. Si el compuesto activo es sustancialmente hidrosoluble, el tamano de partfcula se ajusta normalmente mediante molienda para proporcionar una distribucion sustancialmente uniforme en la formulacion, por ejemplo, aproximadamente una malla 40.
Algunos ejemplos de excipientes o vehnculos adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arabiga, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua esteril, jarabe y metilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente: agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y suspensores; agentes conservantes tales como metil- y propilhidroxi-benzoatos; agentes edulcorantes; y agentes aromatizantes. Las composiciones que se describen en el presente documento pueden formularse para proporcionar una liberacion rapida, sostenida o retardada del principio activo despues de la administracion al paciente empleando procedimientos conocidos en la tecnica.
Las composiciones pueden formularse en una forma de dosificacion unitaria, conteniendo cada dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg o mas, tal como cualquiera de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg, de 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 80 mg o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 90 mg, inclusive, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores, del principio activo. La expresion "formas de dosificacion unitarias" se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para individuos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con un excipiente o vehfculo farmaceutico adecuado.
Los agentes antineoplasicos (tales como agentes a base de oligonucleotidos) que se desvelan en el presente documento son eficaces en un amplio intervalo de dosis y generalmente se administran en una cantidad terapeuticamente eficaz. Sin embargo, se entendera que la cantidad de los agentes antineoplasicos administrados realmente sera determinada por un medico, a la luz de las circunstancias pertinentes, incluyendo la afeccion que se trata, la via de administracion elegida, el compuesto real administrado, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual y la gravedad de los smtomas del paciente.
Para preparar composiciones solidas tales como comprimidos, el principio principal de la terapia antineoplasica se mezcla con un excipiente o vehfculo farmaceutico para formar una composicion de preformulacion solida que contiene una mezcla homogenea de un compuesto que se desvela en el presente documento. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulacion como homogeneas, se entiende que el principio activo se dispersa uniformemente en toda la composicion, de manera que la composicion puede subdividirse facilmente en formas de dosificacion unitarias igualmente eficaces, tales como comprimidos, pfldoras y capsulas.
Los comprimidos o pfldoras que se desvelan en el presente documento pueden recubrirse o combinarse de otro modo para proporcionar una forma de dosificacion que ofrezca la ventaja de una accion prolongada y para proteger las terapias antineoplasicas (tales como un oligonucleotido) a partir de la hidrolisis acida en el estomago. Por ejemplo, el comprimido o pfldora puede comprender un componente de dosificacion interna y un componente de dosificacion externa, estando este ultimo en forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden separarse mediante una capa enterica que sirve para resistir la disgregacion en el estomago y permitir que el componente interno pase intacto al duodeno o se retrase en la liberacion. Se puede usar una diversidad de materiales para dichas capas o recubrimientos entericos, incluyendo dichos materiales varios acidos polimericos y mezclas de acidos polimericos con materiales tales como goma laca, alcohol cetflico y acetato de celulosa.
Las formas lfquidas en las que las composiciones que se desvelan en el presente documento pueden incorporarse para la administracion por via oral o por inyeccion, incluyen soluciones acuosas, jarabes aromatizados adecuadamente, suspensiones acuosas u oleosas y emulsiones aromatizadas con aceites comestibles tales como aceite de mafz, aceite de semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de coco o aceite de cacahuete, asf como elixires y vehfculos farmaceuticos similares.
Las vfas de administracion parenterales incluyen, pero no se limitan a, la inyeccion directa en una via venosa central, inyeccion intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradermica o subcutanea. Las formulaciones de oligonucleotidos (por ejemplo, una formulacion de oligonucleotido y microvehnculo) adecuadas para la administracion parenteral generalmente se formulan en agua USP o agua para inyeccion y pueden comprender adicionalmente tampones de pH, agentes de carga de sales, conservantes y otros excipientes farmaceuticamente aceptables. El oligonucleotido u oligonucleotidos, por ejemplo, como complejos o encapsulados de microvehnculos de oligonucleotidos, para la inyeccion parenteral pueden formularse en soluciones isotonicas esteriles farmaceuticamente aceptables tales como solucion salina y solucion salina tamponada con fosfato para inyeccion.
Las composiciones para inhalacion o insuflacion incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u organicos, farmaceuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones lfquidas o solidas pueden contener excipientes farmaceuticamente aceptables adecuados como se describe en el presente documento. Las composiciones pueden administrarse por via respiratoria oral o nasal por efecto local o sistemico.
Las composiciones en disolventes farmaceuticamente aceptables pueden nebulizarse mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden inhalarse directamente desde el dispositivo de nebulizacion o el dispositivo de nebulizacion puede fijarse a una mascara facial o a una maquina de respiracion de presion positiva intermitente. Tambien pueden administrarse composiciones en solucion, suspension o polvo, por via oral o nasal, desde dispositivos que entregan la formulacion de una manera apropiada.
V. Metodos de tratamiento
A. Metodos para suprimir o prevenir la metastasis de un cancer
En un aspecto, en el presente documento se proporciona uno o mas oligonucleotidos (o una composicion de los mismos) para su uso en la supresion o prevencion de la metastasis de un cancer en un individuo. En otro aspecto, en el presente documento se proporciona uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en combinacion con al menos una terapia para suprimir o prevenir la metastasis de un cancer en un individuo. En cualquiera de los aspectos, en el presente documento, el individuo puede haberse tratado anteriormente contra el cancer con una terapia.
En algunos aspectos, la divulgacion proporciona un metodo de supresion de la metastasis de un cancer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento, en el que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En una realizacion adicional, el metodo de supresion de la metastasis de un cancer en un individuo comprende administrar uno o mas oligonucleotidos en combinacion con al menos una terapia que se desvela en el presente documento. En algunas realizaciones, la al menos una terapia se selecciona entre el grupo que consiste en un agente antineoplasico, una radioterapia, cirugfa, una terapia de trasplante alogeno de celulas madre y una terapia de trasplante autologo de celulas madre. En algunas de las realizaciones del presente documento, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprende quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon alfa pegilado, prednisona, talidomida y vincristina. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran secuencialmente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse a un individuo antes o despues de que un tumor o tumores se hayan resecado quirurgicamente del individuo. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran simultaneamente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse a un individuo durante la reseccion quirurgica de un tumor o tumores del individuo.
En algunos aspectos, la divulgacion proporciona un metodo de prevencion de la metastasis de un cancer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento, en el que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En una realizacion adicional, el metodo de supresion o prevencion de la metastasis de un cancer en un individuo comprende administrar el uno o mas oligonucleotidos en combinacion con al menos una terapia que se desvela en el presente documento. En algunas realizaciones, la al menos una terapia se selecciona entre el grupo que consiste en un agente antineoplasico, una radioterapia, cirugfa, una terapia de trasplante alogeno de celulas madre y una terapia de trasplante autologo de celulas madre. En algunas de las realizaciones del presente documento, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprende quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon alfa pegilado, prednisona, talidomida y vincristina. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran secuencialmente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse a un individuo antes o despues de que un tumor o tumores se hayan resecado quirurgicamente del individuo. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran simultaneamente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse a un individuo durante la reseccion quirurgica de un tumor o tumores del individuo.
Como ejemplos no limitantes, un metodo de supresion o de prevencion de la metastasis del cancer de acuerdo con la presente divulgacion puede ser mediante la administracion de uno o mas oligonucleotidos (o una composicion de los mismos) que se describen en el presente documento como una dosis diaria en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg, como de aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 23, aproximadamente 25, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente
100 mg/kg, por dia, al menos uno de los dfas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o como alternativa, al menos una de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 despues del inicio del tratamiento o cualquiera de sus combinaciones, usando dosis unicas o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4 o 2 horas o cualquier combinacion de las mismas.
En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos (o una composicion de los mismos) pueden administrarse
en combinacion con al menos una terapia (por ejemplo, un agente antineoplasico, una radioterapia, cirugfa, una
terapia de trasplante alogeno de celulas madre o una terapia de trasplante autologo de celulas madre). En algunas realizaciones, la combinacion se administra secuencialmente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 dfas o, como alternativa, aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 semanas de separacion de la administracion de la al menos una terapia durante el tratamiento de combinacion. En algunas realizaciones, la combinacion se administra simultaneamente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse aproximadamente a 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18., 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 o 59 minutos o, como alternativa, aproximadamente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas despues de la administracion de la al menos una terapia durante el tratamiento de combinacion.
B. Metodos de tratamiento o prevencion de la recaida de un cancer
En otros aspectos, en el presente documento se proporciona uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en el tratamiento o la prevencion de la recafda de un cancer en un individuo. En algunas realizaciones, el individuo ha respondido al tratamiento inicial y esta en remision.
En algunos aspectos, la divulgacion proporciona un metodo de tratamiento o prevencion de la recafda del cancer en
un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento, en el que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En una realizacion adicional, el metodo de tratamiento o prevencion de la recafda del cancer en un individuo comprende administrar los uno o mas oligonucleotidos en combinacion con al menos una terapia que
se desvela en el presente documento. En algunas realizaciones, la al menos una terapia se selecciona entre el grupo que consiste en un agente antineoplasico, una radioterapia, cirugfa, una terapia de trasplante alogeno de
celulas madre y una terapia de trasplante autologo de celulas madre. En algunas de las realizaciones del presente documento, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprende quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon alfa pegilado, prednisona, talidomida y vincristina. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran secuencialmente.
Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse a un individuo antes o despues de que un tumor o tumores se hayan resecado quirurgicamente del individuo. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran simultaneamente. Por ejemplo, pueden administrarse uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento a un individuo durante la reseccion quirurgica de un tumor o tumores del individuo.
Como ejemplos no limitantes, un metodo de tratamiento o prevencion de la recafda de un cancer de acuerdo con la presente divulgacion puede ser mediante la administracion de uno o mas oligonucleotidos (o una composicion de los mismos) que se describen en el presente documento como una dosis diaria en una cantidad de aproximadamente
0,1 a aproximadamente 100 mg/kg, tal como de aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 23, aproximadamente 25, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente
100 mg/kg, por dfa, al menos uno de los dfas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o, como alternativa, al menos una de entre las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 despues del inicio del tratamiento o cualquier combinacion de los mismos, usando dosis unicas o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4 o 2 horas o cualquier combinacion de las mismas.
En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos (o una composicion de los mismos) pueden administrarse en combinacion con al menos una terapia (por ejemplo, un agente antineoplasico, una radioterapia, c io^a, una terapia de trasplante alogeno de celulas madre o una terapia de trasplante autologo de celulas madre). En algunas realizaciones, la combinacion se administra secuencialmente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 dfas o, como alternativa, aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 semanas de separacion de la administracion de al menos una terapia durante el tratamiento de combinacion. En algunas realizaciones, la combinacion se administra simultaneamente. Por ejemplo, pueden administrarse uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento aproximadamente a 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 o 59 minutos o, como alternativa, aproximadamente a 1, 2,3,4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas de separacion de la administracion de la al menos una terapia durante el tratamiento de combinacion.
En otras realizaciones, puede usarse una "pauta de mantenimiento" en la que una o mas terapias de mantenimiento a base de oligonucleotidos (tales como a base de oligonucleotidos antisentido) se administran con menos frecuencia que en el tratamiento original administrado antes de la remision, tal como una vez por semana o una vez cada dos semanas. La pauta de mantenimiento puede continuarse durante un penodo de tiempo fijo, generalmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 anos o por tiempo indefinido, a condicion de que el paciente continue sin mostrar signos de enfermedad progresiva y tolere el tratamiento sin toxicidad significativa.
C. Metodos de tratamiento del cancer metastasico
En otros aspectos mas, en el presente documento se proporciona uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en el tratamiento del cancer metastasico (tal como el cancer metastasico recidivante) en un individuo.
En algunos aspectos, la divulgacion proporciona un metodo para el tratamiento del cancer metastasico (tal como el cancer metastasico recidivante) en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento, en el que el oligonucleotido puede hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable y en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En una realizacion adicional, el metodo de tratamiento del cancer metastasico (tal como el cancer metastasico recidivante) en un individuo comprende administrar uno o mas oligonucleotidos en combinacion con al menos una terapia que se desvela en el presente documento. En algunas realizaciones, la al menos una terapia se selecciona entre el grupo que consiste en un agente antineoplasico, una radioterapia, cirugfa, una terapia de trasplante alogeno de celulas madre y una terapia de trasplante autologo de celulas madre. En algunas de las realizaciones del presente documento, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprende quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran secuencialmente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse a un individuo antes o despues de que un tumor o tumores se hayan resecado quirurgicamente del individuo. En algunas realizaciones, el oligonucleotido y la al menos una terapia se administran simultaneamente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse a un individuo durante la reseccion quirurgica de un tumor o tumores del individuo.
Como ejemplos no limitantes, un metodo para el tratamiento del cancer metastasico (tal como el cancer metastasico recidivante) de acuerdo con la presente divulgacion puede ser mediante la administracion de uno o mas oligonucleotidos (o una composicion de los mismos) que se describe en el presente documento como una dosis diaria en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg, tal como de aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 25, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 mg/kg, por dfa, en al menos uno de los dfas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o, como alternativa, al menos una de entre las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 despues del inicio del tratamiento o cualquier combinacion de los mismos, usando dosis unicas o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4 o 2 horas o cualquier combinacion de las mismas.
En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos (o una composicion de los mismos) pueden administrate en combinacion con al menos una terapia (por ejemplo, un agente antineoplasico, una radioterapia, cirugfa, una terapia de trasplante alogeno de celulas madre o una terapia de trasplante autologo de celulas madre). En algunas realizaciones, la combinacion se administra secuencialmente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 dfas o, como alternativa, aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 semanas de separacion de la administracion de al menos una terapia durante el tratamiento de combinacion. En algunas realizaciones, la combinacion se administra simultaneamente. Por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento pueden administrarse aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 o 59 minutos o, como alternativa, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas despues de la administracion de al menos una terapia durante el tratamiento de combinacion.
En otra realizacion, la cantidad terapeuticamente eficaz de dicho uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) se administra como parte de una terapia de rescate en el tratamiento de un individuo en el que el cancer se ha vuelto resistente a otro tratamiento contra el cancer. En algunas realizaciones, el individuo recayo despues del tratamiento con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon alfa pegilado, prednisona, talidomida y vincristina.
Sin quedar ligado a teona alguna, se cree que las CMC dan origen a la recafda y/o la metastasis de un cancer despues del tratamiento del tumor primario. En algunos aspectos, los metodos de tratamiento como se describen en el presente documento (por ejemplo, un metodo de supresion o de prevencion de la metastasis de un cancer, etc.) eliminan o suprimen celulas madre cancerosas. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento pueden destruir o inhibir las celulas madre cancerosas (CMC) para suprimir la metastasis, prevenir la metastasis o prevenir la recafda de un cancer en un individuo. En algunas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia. En una realizacion, los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento pueden destruir o inhibir las celulas madre cancerosas (CMC) que son resistentes al tratamiento (por ejemplo, quimioterapia). En una realizacion, el tratamiento de un individuo con uno o mas oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento (por ejemplo, un oligonucleotido complementario de una molecula de ARNmtncAS) inhibe, detiene, destruye o suprime de manera no selectiva las CMC en el individuo. En una realizacion, uno o mas oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento (por ejemplo, un oligonucleotido complementario a una molecula de ARNmtncAS) reduce el numero de CMC en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido. En una realizacion adicional, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia.
En cualquiera de las realizaciones de los metodos del presente documento, uno o mas oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento (por ejemplo, un oligonucleotido complementario a una molecula de ARNmtncAS) inhibe el crecimiento tumoral y/o la metastasis en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
En cualquiera de las realizaciones de los metodos del presente documento (por ejemplo, un metodo de supresion o de prevencion de la metastasis de un cancer, un metodo de tratamiento o prevencion de la recafda de un cancer, un metodo de tratamiento del cancer metastasico, etc.), el cancer puede ser un cancer solido o un cancer no solido. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el cancer es un cancer solido. Los ejemplos de canceres solidos contemplados en el presente documento incluyen, sin limitacion, cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon microdtico, cancer de pulmon macrodtico, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas escamosas, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer cerebral, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de dgado, sarcoma, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, cancer de orofaringe, carcinoma de glandula salival, cancer de rinon, cancer de Idgado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, cancer gastrico, melanoma y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello.
En algunas realizaciones, el cancer se asocia a una infeccion por el virus del papiloma humano (VPH), tambien denominado en el presente documento "cancer asociado al VPH", tal como en el cancer de cuello uterino, el cancer orofarmgeo y el cancer de cabeza y cuello. Por ejemplo, uno de los factores de riesgo mas importantes para el desarrollo del cancer de cuello uterino es una infeccion por VPH. Se han identificado mas de 100 cepas de VPH, sin embargo, solo un subconjunto se clasifica como tipos de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82) o de alto riesgo probable (26, 53 y 66) para el desarrollo de cancer (Munoz et al., NEJM, 348: 518-527, 2003). De estos tipos de VPH, se informa que VPH16 y VPH18 provocan casi el 70 % de todos los casos de cancer de cuello uterino, mientras que el VPH 31 y 35 provocan otro 10 % de los casos de cancer de cuello uterino. Consulte Walboomers et al., J Pathol., 189 (1): 12-9, 1999. El cancer asociado al VPH puede implicar uno o mas de las siguientes etapas: (1) infeccion inicial por VPH, (2) infeccion persistente por v Ph , (3) transformacion de la infeccion por VPH, en presencia o ausencia de integracion del ADN del VPH en el genoma de la celula hospedadora, (4) desarrollo de lesiones precancerosas, (5) desarrollo de al menos un tumor primario y (6) desarrollo de cancer invasivo (por ejemplo, cancer metastasico).
En algunos casos, el cancer asociado al VPH es resistente a agentes quimioterapicos que se usan regularmente para el tratamiento del cancer. Por ejemplo, las celulas de cuello uterino inmortalizadas con VPH 16 pueden desarrollar resistencia al cisplatino, paclitaxel, actinomicina D, doxorrubicina, etoposido y 5-fluorouracilo, lo que representa un obstaculo importante en el tratamiento del cancer. Vease Ding et al., Int J Cancer, 15: 87 (6) 818-23, 2000. En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en la supresion de la metastasis de un cancer en un individuo, en el que el cancer es resistente a un agente quimioterapico y en el que el cancer es un cancer asociado al VPH. En algunas realizaciones en el presente documento, se proporciona en el presente documento uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en el tratamiento o la prevencion de la recafda de un cancer en un individuo, en el que el cancer es resistente a un agente quimioterapico y en el que el cancer es un cancer asociado al VPH. En algunas realizaciones en el presente documento, en el presente documento se proporciona uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en el tratamiento del cancer metastasico (tal como el cancer metastasico recidivante) en un individuo, en el que el cancer metastasico es resistente a un agente quimioterapico y en el que el cancer metastasico es un cancer asociado al VPH. En algunas realizaciones en el presente documento, se proporciona en el presente documento uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en el tratamiento de un cancer resistente en un individuo. En algunas realizaciones, el cancer resistente es un cancer resistente asociado al VPH. En algunas realizaciones, el cancer resistente asociado al VPH es resistente a un agente quimioterapico. Como se usa en el presente documento, la expresion "cancer resistente" se refiere a un cancer (por ejemplo, un cancer asociado al VPH) que no responde al tratamiento, por ejemplo, un cancer que es resistente al inicio del tratamiento (por ejemplo, tratamiento con un agente quimioterapico) o un cancer que puede volverse resistente durante el tratamiento. En algunas realizaciones, el agente quimioterapico se selecciona entre el grupo que consiste en cisplatino, paclitaxel, actinomicina D, doxorrubicina, etoposido y 5-fluorouracilo. En algunas realizaciones, el agente quimioterapico es cisplatino. En algunas de las realizaciones del presente documento, el cancer asociado al VPH (por ejemplo, un cancer asociado al VPH resistente) proviene de una infeccion con una o mas cepas de VPH seleccionadas entre el grupo que consiste en VPH 16, VPH 18, VPH 31 y VPH 45. En algunas de las realizaciones del presente documento, el cancer asociado al VPH (por ejemplo, un cancer asociado al VPH resistente) proviene de una infeccion con la cepa VPH 45 del VPH. En algunas realizaciones, el oligonucleotido es complementario a la molecula de ARNmtncS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos es complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198. En algunas realizaciones, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198.
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) para su uso en el tratamiento de un cancer resistente en un individuo. En algunas realizaciones, el cancer resistente es resistente a un agente quimioterapico. En algunas realizaciones, el agente quimioterapico es cisplatino. En algunas realizaciones, el cancer resistente es un cancer solido que se desvela en el presente documento. Por ejemplo, el cancer solido resistente puede ser uno o mas de entre cancer de vejiga, cancer de cerebro, cancer de mama, cancer de cuello uterino (por ejemplo, un cancer de cuello uterino asociado al VPH resistente), cancer de colon, cancer de endometrio, cancer de esofago, cancer gastrico, hugado y cancer de las vfas biliares, cancer de pulmon, melanoma, cancer de boca, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de faringe, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de testfculo o cancer de tiroides. En algunas realizaciones, el cancer resistente es un cancer no solido que se desvela en el presente documento. Por ejemplo, el cancer resistente puede ser uno o mas de entre mieloma multiple, leucemia o linfoma.
En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el cancer es un cancer no solido. "Cancer no solido" se refiere a una malignidad hematica que implica un crecimiento anormal y/o la metastasis de una celula sangumea. Los ejemplos de canceres no solidos contemplados en el presente documento incluyen, sin limitacion, mieloma multiple, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia linfocftica cronica, leucemia no linfocftica aguda, leucemia granulocftica aguda, leucemia granulocftica cronica, leucemia promielocftica aguda, leucemia de linfocitos T de adultos, leucemia aleucemica, leucemia leucocitemica, leucemia basofila, leucemia de celulas blasticas, leucemia bovina, leucemia mielocftica cronica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinofila, leucemia de Gross, leucemia de celulas pilosas, leucemia hemoblastica, leucemia hemocitoblastica, leucemia histiocftica, leucemia de celulas madre, leucemia monocftica aguda, leucemia leucopenica, leucemia linfatica, leucemia linfoblastica, leucemia linfocftica, leucemia linfogena, leucemia linfoide, leucemia de celulas de linfosarcoma, leucemia de mastocitos, leucemia megacariocftica, leucemia micromieloblastica, leucemia monocftica, leucemia mieloblastica, leucemia mielocftica, leucemia granulocftica mieloide, leucemia mielomonocftica, leucemia de Naegeli, leucemia de celulas plasmaticas, leucemia plasmocftica, leucemia promielocftica, leucemia de celulas Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de celulas madre, leucemia subleucemica, leucemia de celulas indiferenciadas, mielofibrosis idiopatica, linfoma (tal como linfoma no Hodgkin y linfoma de Hodgkin) y smdrome mielodisplasico.
Los metodos que se desvelan en el presente documento pueden ponerse en practica en un contexto adyuvante. El "contexto adyuvante" puede referirse a un contexto clmico en el que un individuo ha tenido una historia de cancer y, en general (pero no necesariamente) ha respondido a la terapia, que incluye, pero no se limita a, cirugfa (tal como reseccion quirurgica), radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, debido a su historial de cancer (tal como el melanoma o el cancer de colon), estas personas se consideran en riesgo de desarrollar cancer. El tratamiento o la administracion en el "contexto adyuvante" se refiere a un modo de tratamiento posterior. El grado de riesgo (es decir, cuando un individuo en el contexto adyuvante se considera "alto riesgo" o "bajo riesgo") depende de varios factores, mas por lo general el grado de la enfermedad (cancer) cuando se trata por primera vez.
En consecuencia, la presente divulgacion se refiere a metodos para inhibir los smtomas o afecciones (discapacidades, deficiencias) asociados al cancer (por ejemplo, cancer metastasico o cancer recidivante) como se describe en detalle a continuacion. Como tal, no se requiere que todos los efectos de la afeccion se prevengan o se reviertan por completo, aunque los efectos de los metodos actualmente desvelados probablemente se extiendan a un beneficio terapeutico significativo para el individuo. Como tal, un beneficio terapeutico no es necesariamente una prevencion o cura completa para la afeccion, sino que puede abarcar un resultado que incluye reducir o prevenir los smtomas que son resultado del cancer (por ejemplo, cancer metastasico o cancer recidivante), reduciendo o previniendo la aparicion de dichos smtomas (cuantitativa o cualitativamente), reduciendo la gravedad de dichos smtomas o los efectos fisiologicos de los mismos y/o potenciando la recuperacion del individuo despues de experimentar smtomas de cancer (por ejemplo, cancer metastasico o cancer recidivante).
Espedficamente, las terapias (por ejemplo, uno o mas oligonucleotidos) que se desvelan en el presente documento, cuando se administran a un individuo, pueden tratar o prevenir uno o mas de los smtomas o afecciones asociados al cancer (por ejemplo, cancer metastasico o cancer recidivante) y/o reducir o aliviar los smtomas o afecciones asociados a este trastorno. Como tal, proteger a un individuo de los efectos o smtomas resultado del cancer (por ejemplo, cancer metastasico o cancer recidivante) incluye tanto prevenir como reducir la aparicion y/o la gravedad de los efectos del trastorno y tratar a un paciente en el que los efectos del trastorno ya estan produciendose o comienzan a producirse. Un experto en la materia y/o un medico capacitado que este tratando al paciente puede evaluar facilmente un efecto beneficioso. Preferentemente, existe una diferencia positiva o beneficiosa en la gravedad o la aparicion de al menos una puntuacion, un valor o una medida clmicos o biologicos utilizados para evaluar a dicho individuo en aquellos que se han tratado con los metodos que se desvelan en el presente documento en comparacion con aquellos que no. Por ejemplo, la al menos una puntuacion, un valor o una medida clmicos o biologicos utilizados para evaluar a un individuo de este tipo es la capacidad de las celulas (por ejemplo, celulas madre cancerosas) tomadas de un tumor primario, un tumor secundario, una biopsia o lfquido asdtico de un individuo para formar esferas en un ensayo de formacion de esferas. Los metodos para purificar celulas tales como celulas madre cancerosas de tumores u otras muestras biologicas son bien conocidos en la tecnica, tal como en la Patente de los EE.UU. N.° 8.614.095. En un ensayo de formacion de esferas ejemplar, un tumor se extirpa quirurgicamente de un sujeto y se tritura con un bistun en fragmentos de aproximadamente 2 a 3 mm3. Los fragmentos se lavan con un tampon (por ejemplo, PBS) y despues se incuban con un tampon que contiene hipoclorito de sodio. Los fragmentos de tejido tumoral se lavan con tampon y se digieren con PBS y se digieren con un medio que contiene uno o mas de entre colagenasa I, colagenasa IV, dispasa, hialuronidasa y ADNasa. La suspension celular se centrifuga y el sedimento se suspende en un tampon que contiene pFGF y EGF. Las celulas se lavan para retirar el suero y se suspenden en medio complementado con EGF humano, pFGF humano, complemento de B27 sin vitamina A, hidrocortisona, insulina y complemento de N2. Las celulas se cultivan posteriormente en placas no adherentes. Despues de 10 dfas en cultivo, se obtienen y se cuentan esferas de 100 a 200 pm de diametro. Las esferas pueden expandirse adicionalmente de forma clonica o pueden inyectarse en un sujeto para observar la capacidad de formacion de tumores. En algunas realizaciones, un individuo que ha recibido una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos (o composiciones de los mismos) que se desvelan en el presente documento, solos o en combinacion con al menos una terapia que se desvela en el presente documento, tiene una formacion de esferas reducida en comparacion con un individuo no tratado con los oligonucleotidos que se desvelan en el presente documento.
VI. Artfculos de fabricacion o kits
En otro aspecto, se proporciona un artmulo de fabricacion o kit que comprende uno o mas oligonucleotidos que se describen en el presente documento. El artmulo de fabricacion o kit puede comprender adicionalmente instrucciones para el uso del uno o mas oligonucleotidos en los metodos que se desvelan en el presente documento. En consecuencia, en determinadas realizaciones, el artmulo de fabricacion o kit comprende instrucciones para el uso de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS) en metodos de supresion de la metastasis de un cancer, prevenir o tratar la recafda de un cancer y/o tratar el cancer de metastasis en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos. En determinadas realizaciones, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas). En algunas realizaciones, el artmulo de fabricacion o kit comprende instrucciones para el uso de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerica no codificante (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS) en metodos para tratar un cancer resistente (por ejemplo, un cancer resistente asociado al VPH) en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos.
El artfculo de fabricacion o kit puede comprender adicionalmente un recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales (por ejemplo, viales de doble camara), jeringuillas (por ejemplo, jeringuillas de camara simple o doble), bolsas IV y tubos de ensayo. El contenedor puede estar formado por una diversidad de materiales tales como vidrio o plastico. El recipiente contiene la composicion (por ejemplo, formulacion farmaceutica).
El artfculo de fabricacion o kit puede comprender adicionalmente una etiqueta o un prospecto, que esta dentro de o asociado al envase y puede indicar instrucciones para la reconstitucion y/o uso de la composicion (por ejemplo, formulacion farmaceutica). La etiqueta puede indicar adicionalmente que la formulacion es util o esta destinada a la administracion intravenosa, subcutanea u otros modos de administracion de supresion de la metastasis de un cancer, prevenir o tratar la recafda de un cancer y/o tratar el cancer metastasico en un individuo. En otras realizaciones, la etiqueta puede indicar adicionalmente que la formulacion es util o esta destinada a la administracion intravenosa, subcutanea u otros modos de tratamiento para el tratamiento de un cancer resistente (por ejemplo, un cancer resistente asociado al VPH) en un individuo. El recipiente que contiene la formulacion puede ser un vial de un solo uso o un vial de usos multiples, que permite la administracion repetida (por ejemplo, de 2 a 6 administraciones) de la composicion reconstituida (por ejemplo, la formulacion farmaceutica). El artfculo de fabricacion o kit puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprenda un diluyente adecuado. El artfculo de fabricacion o kit puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde el punto de vista comercial, terapeutico y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas e insertos de paquetes con instrucciones de uso.
El artfculo de fabricacion o kit que se describe en el presente documento comprende adicionalmente un recipiente que comprende una segunda composicion terapeutica (por ejemplo, un agente antineoplasico). Por ejemplo, el artfculo de fabricacion o kit puede comprender uno o mas oligonucleotidos como una primera composicion (por ejemplo, una primera composicion farmaceutica) y un agente antineoplasico como una segunda composicion (por ejemplo, una segunda composicion farmaceutica). En algunas realizaciones, el kit comprende adicionalmente instrucciones para el uso del uno o mas oligonucleotidos en combinacion con el agente antineoplasico en los metodos que se describen en el presente documento. Un ejemplo de agentes antineoplasicos puede ser remicade, docetaxel, celecoxib, melfalan, dexametasona, esteroides, gemcitabina, cisplatino, temozolomida, etoposido, ciclofosfamamida, temodar, carboplatino, procarbazina, gliadel, tamoxifeno, topotecan, metotrexato, gefitinib, taxol, taxotere, fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, xeloda, CPT-11, interferon alfa, interferon alfa pegilado, capecitabina, cisplatino, tiotepa, fludarabina, carboplatino, daunorrubicina liposomica, citarabina, doxetaxol, paclitaxel, vinblastina, IL-2, GM-CSF, dacarbazina, vinorelbina, acido zoledronico, palmitronato, biaxina, busulfan, prednisona, bortezomib, bifosfonato, trioxido de arsenico, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel, ganciclovir, adriamicina, fosfato de sodio de estramustina, sulindaco y etoposido.
VII. Realizaciones ejemplares adicionales
La presente solicitud en algunas realizaciones proporciona un metodo de tratamiento para un cancer resistente en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos complementarios a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS), en el que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con las moleculas de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido es suficientemente complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante humano que comprende: a) un ARN ribosomico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida o b) un ARN ribosomico mitocondrial 16S sentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido es complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido es al menos un 85 % complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el uno o mas oligonucleotidos comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36, 197 y 198.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido se administra en combinacion con al menos un agente antineoplasico.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran secuencialmente.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran simultaneamente.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido se administra en combinacion con una radioterapia.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido se administra en combinacion con cirugfa.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprende quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el cancer resistente es un cancer asociado al VPH resistente.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el cancer asociado al VPH resistente es uno o mas seleccionados entre el grupo que consiste en: cancer de cuello uterino, cancer orofarmgeo y cancer de cabeza y cuello.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el cancer asociado al VPH resistente es resistente a un agente quimioterapico.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el agente quimioterapico es uno o mas seleccionados entre el grupo que consiste en: cisplatino, paclitaxel, actinomicina D, doxorrubicina, etoposido y 5-fluorouracilo.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el cancer resistente asociado al VPH proviene de una infeccion con una o mas cepas de VPH seleccionadas entre el grupo que consiste en: VPH 16, VPH 18, VPH 31 y VPH 45.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido reduce el numero de celulas madre cancerosas en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
En algunas realizaciones de acuerdo con (o como se aplican a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el oligonucleotido inhibe el crecimiento tumoral y/o la metastasis en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
Ejemplos
Ejemplo 1: El tratamiento de celulas de cancer de colon HCT-116 y cultivos primarios de celulas de cancer de colon humano con oligonucleotidos antisentido complementarios a ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido suprimio la formacion de esferas
En este estudio, se determinara la capacidad de las celulas, tanto de la estirpe celular de cancer de colon HCT-116 como de cultivos primarios de celulas de cancer de colon humano derivadas de pacientes, para formar cuerpos esferoides despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido dirigidos a ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS). El ensayo utilizado midio los numeros de cuerpos esferoides, tambien denominados en el presente documento esferas, en funcion de la capacidad espedfica de las celulas madre cancerosas para formar estos cuerpos esferoides.
Materiales y metodos
Esquema experimental:
La FIG. 1 muestra un esquema general del procedimiento experimental y el ensayo utilizado en el presente documento para medir el efecto de oligonucleotidos antisentido dirigidos a ARNmtncAS en el numero de esferas formadas en celulas de cancer de colon, en funcion de la capacidad espedfica de las celulas madre cancerosas para formar estos cuerpos esferoides. La formacion de esferas se midio en celulas de cancer de colon HCT-116 y cultivos primarios de celulas de cancer de colon humano derivadas de pacientes.
Cultivos primarios de celulas cancerosas humanas:
Las biopsias de cancer de colon se recibieron despues de la cirugfa y con el correspondiente consentimiento informado de cada paciente. Se transfirieron trozos de tumores de aproximadamente 500 mm3 a tubos esteriles de 50 ml que conteman medio DMEM. Glucosa alta, GlataMax™ (GlBCO), FCS al 10 % (Biological Industries), Fungizone® 1x, mezcla de antibioticos y antimicoticos 2x y gentamicina 25 pg/ml (Invitrogen). Las biopsias se procesaron 2 a 3 h despues de la cirugfa.
Con el fin de disgregar el tumor, se corto un trozo de tumor de colon con un bistun en fragmentos de aproximadamente 2 a 3 mm3. Los fragmentos se lavaron dos veces con PBS y despues se incubaron durante 20 minutos con PBS que contema hipoclorito de sodio al 0,5 %. Los fragmentos se lavaron tres veces con PBS y se digirieron con medio RPMI (Invitrogen) que contema colagenasa I 1 mg/ml, colagenasa IV 2 mg/ml, dispasa 1 mg/ml, hialuronidasa 20 pg/ml y ADNasa 2000 U/ml. La mezcla se incubo a 37 °C durante 60 min y con agitacion constante. A continuacion, la suspension celular se centrifugo a 200 x g durante 5 minutos y el sedimento se suspendio en PBS y se centrifugo nuevamente a 200 x g durante 5 minutos. El sedimento se resuspendio en DMEM/F12 que contema 1x N2, pFGF 10 ng/ml y EGF 20 ng/ml, para la formacion de esferas.
Cultivo de celulas HCT-116:
Se cultivaron celulas HCT-116 de acuerdo con protocolos convencionales. Las celulas HCT-116 obtenidas de ATCC se cultivaron en medio DMEM que contema penicilina, gentamicina y fungizona, con FCS al 10 %, a 37 °C y con CO2 al 5 %.
Seleccion de celulas tumorales por su formacion de esferas y adherencia a placas recubiertas:
Se recogieron celulas derivadas de tumores de cancer de colon o cultivos de HCT-116 y se lavaron para retirar el suero y se suspendieron en DMEM/F12 sin suero complementado con penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100 mg/ml, EGF humano 20 ng/ml, pFGF humano 20 ng/ml, complemento de B27 al 2 % sin vitamina A, hidrocortisona, insulina (Lonza) y complemento de N2 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las celulas se cultivaron posteriormente en placas no adherentes (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) a una densidad de aproximadamente 5.000 celulas/pocillo o 1x105 celulas en matraces T25 (Corning Inc. T25 3815). Despues de 10 dfas en cultivo, se obtuvieron esferas de 100 a 200 pm de diametro. El medio que contema las esferas se filtro usando un filtro de nylon de 70 pm para eliminar celulas individuales. Las esferas se recogieron y se disociaron con tripsina-EDTA y se rompieron mecanicamente con una pipeta. Las celulas despues se centrifugaron para retirar la enzima, se lavaron una vez con medio DMEM que contema 105 CFS y se sembraron en placas adherentes recubiertas con colageno I (Gibco) y se cultivaron a 37 °C y CO2 al 5 % como se ha descrito anteriormente.
T ransfeccion celular y oligonucleotidos antisentido:
Se sintetizaron oligonucleotidos antisentido (OAS) utilizados en este estudio por IDT (Integrated DNA Technologies, EE.UU.), Invitrogen o Biosearch Inc. con enlaces internucleosfdicos de fosforotioato (PS) al 100 %. Para la transfeccion, las celulas se sembraron en placas de 12 pocillos (Nunc) a 50.000 celulas/pocillo. Al dfa siguiente, las celulas seleccionadas entre tumores de cancer de colon o de cultivos de HCT-116 (vease Seleccion de celulas tumorales por su formacion de esferas y adherencia a placas recubiertas) se transfectaron con los oligonucleotidos antisentido (OAS 1107S: 5'-GTCCT AAACT ACCAAACC-3' (SEQ ID NO: 197) o OAS 1537S: 5'-CACCCACCCAAGAACAGG-3' (SEQ ID NO: 36), dependiendo del tipo de celula) o un oligonucleotido de control (Oligo 154 de control: 5'-AGGTGGAGTGGATt Gg g G-3' (SEQ ID NO: 199)) a una concentracion final de 100 a 200 nM (dependiendo del tipo de celula) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ademas, un subconjunto de celulas se dejo sin tratar o en presencia de solo Lipofectamine 2000. La transfeccion se realizo durante 48 horas en condiciones de cultivo normales.
Ensayo de formacion de esferas:
48 horas despues de la transfeccion, las celulas se recogieron, se contaron y se cultivaron de 5.000 a 6.000 celulas en placas de 6 pocillos no adherentes (Corning Inc., Corning, NY, EE.u U.) como se ha descrito anteriormente (descrito anteriormente). Despues de 10 dfas en cultivo, se obtuvieron y se contaron esferas de 100 a 200 pm de diametro.
Resultados
La formacion de la esfera no se modifico en los cultivos primarios de celulas de tumor de colon despues de ningun tratamiento, tratamiento con Lipofectamine solamente o tratamiento con Oligo 154 de control. Pero la formacion de esferas se suprimio en estas celulas primarias despues del tratamiento con OAS 1537S (FIG 2).
Se uso un cultivo primario de un tumor de colon (paciente TPT; 50.000 celulas) para cuantificar la formacion de esferas y evaluar el efecto de la transfeccion con OAS 1537S sobre la capacidad de estas celulas para formar esferas. Los tres grupos de celulas de control (no tratadas, tratadas con Lipofectamine solamente o tratadas con Oligo 154 de control) formaron esferas (de 30 a 37 esferas) equivalentes a aproximadamente el 0,6 % del numero total de celulas sembradas. Las celulas transfectadas con OAS 1537S no pudieron formar esferas (FIG 3).
La formacion de esferas no se modifico en las celulas de la estirpe celular de tumor de colon HCT-116 despues de ningun tratamiento, tratamiento con Lipofectamine solamente o tratamiento con Oligo 154 de control. Sin embargo, la formacion de esferas se suprimio en estas celulas despues del tratamiento con OAS 1107S (FIG 4).
La estirpe celular de tumor de colon HCT-116 se uso para cuantificar la formacion de esferas y evaluar el efecto de la transfeccion con OAS 1107S sobre la formacion de esferas. Los tres grupos de celulas de control (no tratadas, tratadas con Lipofectamine solamente o tratadas con Oligo 154 de control) formaron esferas (de 100 a 160 esferas), equivalentes al 0,3 % de la cantidad total de celulas sembradas (en este ejemplo representativo 50.000 celulas en matraces T25). Sin embargo, las celulas transfectadas con OAS 1107S no pudieron formar esferas (FIG 5).
Tomados en conjunto, estos resultados muestran que los grupos que no se trataron, se trataron con Lipofectamine solamente o se transfectaron con un oligonucleotido de control conservaron la capacidad de formar esferas. Por el contrario, las celulas de tumor de colon primario o las celulas de cancer de colon HCT-116 transfectadas con oligonucleotidos antisentido perdieron su capacidad para formar esferas. Estos resultados indican que los oligonucleotidos antisentido fueron capaces de destruir las celulas madre cancerosas, como lo indica la falta de formacion de esferas tras el tratamiento. Ademas, estos resultados tambien indican que solo una fraccion de todas las celulas sembradas fueron capaces de formar esferas.
Ejemplo 2: El tratamiento de una estirpe celular de cancer de cuello uterino y cultivos primarios de celulas de cancer de cuello uterino humano con oligonucleotidos antisentido complementarios a ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido suprimio la formacion de esferas
Se determino la capacidad de las celulas de cuello uterino de la estirpe celular de cancer de cuello uterino SiHa (transformada con Papilomavirus Humano 16 o VPH 16) y de cultivos primarios de celulas de cancer de cuello uterino humano derivadas de pacientes para formar cuerpos esferoides despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido dirigidos a ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS). El ensayo utilizado midio los numeros de cuerpos esferoides, tambien denominados esferas en el presente documento, que estan formados por celulas madre cancerosas.
Materiales y metodos
Esquema experimental:
El procedimiento experimental y el ensayo utilizados en el presente documento midieron el efecto de oligonucleotidos antisentido que se dirigieron a ARNmtncAS sobre el numero de esferas formadas por celulas de cancer de cuello uterino (FIG 6). La formacion de esferas se midio en la estirpe celular de cancer de cuello uterino SiHa y en cultivos primarios de celulas cancerosas de cuello uterino humanas derivadas de pacientes (CerCa). Se obtuvieron CerCa 1, CerCa 2 y CerCa 3 (transformadas con Papilomavirus Humano 45) de las biopsias de los pacientes.
Cultivo de celulas SiHa:
Se cultivaron celulas SiHa en DMEM, "Alta Glucosa", GlutaMAX™, que contiene penicilina, gentamicina y fungizona, con FCS al 10 % a 37 °C y CO2 al 5 %.
Cultivos primarios de celulas cancerosas humanas:
Las biopsias de cancer de cuello uterino se recibieron despues de la cirugfa y con el consentimiento informado correspondiente de cada paciente. Se transfirieron trozos de tumores de aproximadamente 500 mm3 a tubos esteriles de 50 ml que conteman medio DMEM, Alta Glucosa, GlataMax™ (GIBCO), FCS al 10 % (Biological Industries), Fungizone® 1x, mezcla de antibioticos y antimicoticos 2x y gentamicina 25 pg/ml (Invitrogen). Las biopsias se procesaron 2 a 3 horas despues de la cirugfa.
Con el fin de disgregar el tumor, la muestra de tejido se coloco en una placa de Petri de 10 cm con 10 ml de PBS esteril (Gibco) y se corto con un bistun en trozos pequenos (1-3 mm3). Las piezas se transfirieron a placas de 6 cm junto con 2 ml de medio que contema Colagenasa I al 0,5 %, Colagenasa II al 0,5 %, Colagenasa IV al 0,5 % (GIBCO), hialuronidasa al 0,5 % (AppliChem), Dispasa al 0,1 % (GIBCO), ADNasa al 0,05 % (AppliChem), BSA al 0,1 % (Rockland), mezcla de antibioticos y antimicoticos 2x (GIBCO) y Fungizone® 2x (GIBCO). Los fragmentos se incubaron a 37 °C durante 30 min y la suspension celular se centrifugo a 300 x g durante 5 minutos. El sedimento se suspendio en 5 ml de medio MEGM™ que contema hEGF 2020 ng/ml, hidrocortisona, insulina, GA-1000 (Lonza), B-270,5x sin vitamina A (Invitrogen), FGFb 20 ng/ml (Invitrogen) y CFB al 5 %. Las celulas se cultivaron en un matraz T25 recubierto con colageno (BD Bioscience) a 37 °C y con CO2 al 5 %. El medio se cambio cada 48 horas.
Seleccion de celulas tumorales por su formacion de esferas y adherencia a placas recubiertas:
Se sembraron en placas de adherencia ultra baja (Corning) aproximadamente 1x105 celulas resuspendidas en medio MEGM™ complementado con hEGF 20 ng/ml, hidrocortisona, insulina, GA-1000 (Lonza), B-27 0,5x sin vitamina A (Invitrogen), FGFb 20 ng/ml (Invitrogen) sin CFS. Diez dfas despues, las esferas se contaron bajo microscopfa de fase, se recogieron y se filtraron usando una malla de nylon de 70 pm para desechar las celulas individuales. Las esferas se recuperaron del filtro y se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning) recubiertas anteriormente con colageno de tipo I (Gibco) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente. Se aislaron tres cultivos primarios humanos de tumores de cuello uterino, CerCa 1, CerCa 2 y CerCa 3.
Genotipado del virus del papiloma humano (VPH):
Los diferentes cultivos primarios se analizaron con Matriz Lineal PGMY09/11 (Roche). La presencia de VPH 16 se detecto en los cultivos celulares primarios de CerCa 1 y CerCa 2, mientras que se detecto VPH 45 en el cultivo celular primario de CerCa 3.
T ransfeccion celular y oligonucleotidos antisentido:
Los oligonucleotidos antisentido (OAS) utilizados en este estudio fueron sintetizados por IDT (Integrated DNA Technologies, EE.UU.), Invitrogen o Biosearch Inc. con enlaces internucleosfdicos de fosforotioato (PS) al 100 %. Para la transfeccion, las celulas se sembraron en placas de 12 pocillos (Nunc) a 5000 celulas/pocillo. Al dfa siguiente, se transfectaron celulas seleccionadas entre tumores de cancer de cuello uterino o entre celulas SiHa (vease Seleccion de celulas tumorales por su formacion de esferas y adherencia a placas recubiertas) con un oligonucleotido antisentido (OAS 1537S: 5'-CACCCACCCAAGAACAg G-3' (SEQ ID NO: 36), dependiendo del tipo celular) o un oligonucleotido de control 154 (OAS-C: 5-AGGTGGAGTGGATTGGGG-3' (SEQ iD NO: 199)) a una concentracion final de 100 nM (celulas SiHa) o 200 nM (celulas CerCa) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ademas, un subconjunto de celulas se dejo sin tratar (NT), se transfectaron en presencia de Lipofectamine 2000 (LIPO) solamente o se incubaron con cisplatino 45 uM (CISP). La transfeccion se realizo durante 72 horas en condiciones de cultivo normales.
Ensayo de formacion de esferas:
72 horas despues de la transfeccion, las celulas se recogieron, se contaron y se cultivaron de 5.000 a 6.000 celulas en placas de 6 pocillos no adherentes (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) como se ha descrito anteriormente. Despues de 10 dfas en cultivo, se obtuvieron y contaron esferas de 100 a 200 pm de diametro.
Resultados
La formacion de la esfera no se modifico en cultivos primarios de celulas de tumor de cuello uterino despues de ningun tratamiento (NT), tratamiento con Lipofectamine solamente (LIPO) o tratamiento con oligonucleotido de control 154 (OAS-C). Por el contrario, la formacion de esferas se suprimio en los cultivos primarios de SiHa, CerCa 1, CerCa 2 y CerCa 3 despues del tratamiento con OAS 1537S (FIG 7 y FIG 8). La formacion de esferas de celulas SiHa, CerCa 1 y CerCa 2 (todas infectadas con VPH 16) tambien se suprimio cuando las celulas se trataron con el farmaco cisplatino (CISP) (45 pM) (FIG 7 y FIG 8) mientras que no se observo ningun efecto en celulas CerCa 3 (infectadas con VPH 45) tratadas con cisplatino.
En conjunto, estos resultados muestran que los cultivos primarios de cancer de cuello uterino (celulas CerCa 1, CerCa 2 y CerCa 3) y la estirpe celular SiHa se dejaron sin tratar, se trataron solo con Lipofectamine o se transfectaron con un oligonucleotido de control que conservo la capacidad de formar esferas. Por el contrario, las celulas de tumor de cuello uterino primarias o las celulas SiHa transfectadas con oligonucleotidos antisentido dirigidos a las moleculas de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o a la molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS), perdieron su capacidad para formar esferas si eran positivas para VPH 16 o VPH 45. Estos resultados indican que los oligonucleotidos antisentido fueron capaces de destruir las celulas madre cancerosas de cuello uterino, como lo indica la falta de formacion de esferas durante el tratamiento. Ademas, el tratamiento con el farmaco antineoplasico cisplatino suprimio la formacion de esferas de celulas SiHa, CerCa 1 y CerCa 2 (todas positivas para VPH 16) pero no de CerCa 3 que esta infectada con VPH 45 (FIG 7 y FIG 8). Por tanto, estos resultados indican que los oligonucleotidos antisentido son capaces de destruir celulas madre de cancer de cuello uterino (celulas CerCa 3) resistentes al tratamiento con cisplatino. Vease Tjalme et al., Enm. J. Clin. Pathol., 137: 161, 2012; de Sanjose et al., Eur J Cancer., 49 (16): 3450, 2013; Tjalma et al., Int J Cancer., 132 (4): 854, 2013.
Ejemplo 3: El tratamiento de ratones con oligonucleotidos antisentido complementarios al ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido despues de la cirugia para extirpar tumores evito la recaida del crecimiento tumoral y la metastasis en los pulmones y el higado
Un protocolo clmico comun para el melanoma incluye la reseccion quirurgica seguida de la administracion sistemica de farmacos. Se usan protocolos similares en la practica de otros tumores. En el modelo de melanoma presentado en este ejemplo representativo, las celulas de melanoma B16F10 (100.000 celulas en 200 pl de solucion salina) se inyectaron por via subcutanea en el lomo de ratones C57BL/6. Aproximadamente entre 11 y 12 dfas despues de la inyeccion celular, se desarrollaron tumores entre 700 y 1.000 mm3 (un tumor de 1.000 mm3 en ratones se considera equivalente a un tumor de 3.000 cc3 en seres humanos). En este momento, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (Oligo OAS 154 de control y OAS 1560S (SEQ ID NO: 198)) con un volumen tumoral similar. Los tumores se resecaron quirurgicamente con anestesia y la herida se lavo una vez con 250 pl que conteman 100 pg de OAS 1560S o OAS 154. Despues de la sutura quirurgica, se aplico un bolo de 200 pl de solucion salina que contema 100 pg de OAS 154 o OAS 1560S en la cavidad dejada por el tumor. Tres dfas despues de la cirugfa, los ratones recibieron en dfas alternativos, 3 inyecciones intravenosas (FIG. 9; flechas 1a, 3a y 5a en la lmea temporal) o 3 inyecciones intraperitoneales (FIG. 9; flechas 2a, 4a y 6a en la lmea temporal) de 250 pl de solucion salina que contema 100 pg de OAS 1560S o OAS 154. El crecimiento tumoral se midio dos veces por semana con un calibre. La recafda del crecimiento tumoral en ratones tratados con OAS 154 se observo aproximadamente 3 dfas despues de la cirugfa y el volumen tumoral de aproximadamente 1.500 mm3 se alcanzo aproximadamente el dfa 25 despues de la inyeccion celular (FIG 9). Estos ratones se sacrificaron con anestesia y el tumor y otros organos se fijaron y se guardaron para estudios posteriores. No se observo recafda en ratones tratados con OAS 1560S dirigidos al ARNmtncAS de raton. 130 dfas despues de la inyeccion celular, los ratones paredan sanos sin la presencia de tumores detectables y se sacrificaron para recoger los organos. Los Imgados y pulmones se analizaron para detectar la presencia de nodulos metastasicos.
Los ratones de control (tratados con Oligo OAS 154 de control) mostraron la presencia de recafda del cancer y nodulos negros metastasicos en el pulmon y el hugado. Por el contrario, los pulmones y los hfgados de los ratones tratados con OAS 1560S caredan de la presencia de nodulos metastasicos, lo que demuestra que el OAS 1560S evito o suprimio la recafda del cancer (FIG 10).
Ejemplo 4: El tratamiento intravenoso de ratones con oligonucleotidos antisentido complementarios al ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido despues de la cirugia para extirpar tumores renales intradermicos dio como resultado la ausencia de recaida tumoral y la supervivencia completa
Se inyectaron 100.000 celulas RENCA (ATCC ® CRL-2947™ adenocarcinoma renal de rinon de mus musculus) por via subcutanea el dfa 0. El dfa 12, se extirparon tumores de un tamano promedio de 800 mm3 y el sitio del tumor se lavo con 100 pg de Oligo OAS 154 de Control (4 animales) o OAS 1560S (5 animales) en 200 pl, ambos formulados en liposomas. Los animales se suturaron y se inyectaron por via intravenosa en el sitio del tumor extirpado con 100 pg de OAS 154 (FIG 11, cuadrados) o OAS 1560S (FIG 11, triangulos), ambos formulados en liposomas, en 250 pl. No se dio ningun tratamiento adicional. El dfa 40 (30 dfas despues de la cirugfa), todos los animales de control murieron con tumores de un tamano promedio de 1.200 mm3 y metastasis extensas, mientras que todos los animales tratados con OAS 1560S no teman tumores y aun estaban vivos en el dfa 61 (FIG. 11).
Ejemplo 5: El tratamiento intraperitoneal de ratones con oligonucleotidos antisentido complementarios al ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido despues de la cirugia para extirpar tumores renales intradermicos que dieron como resultado la ausencia de recaida tumoral y la supervivencia completa Se inyectaron 100.000 celulas RENCA (ATCC ® CRL-2947™ adenocarcinoma renal de rinon de mus musculus) por via subcutanea el dfa 0 en 8 ratones. El dfa 11, los tumores teman un tamano promedio de 800 mm3. Los tumores de todos los animales se extirparon mediante cirugfa y se dividieron en 2 grupos. La herida del grupo de control se lavo una vez con Oligo OAS 154 de control antes de suturar y la herida del grupo tratado se lavo con OAS 1560S antes de suturar. Despues de la sutura, se inyecto por via intraperitoneal un bolo de 250 pl en el lugar donde habfa crecido el tumor: el grupo de control se inyecto con OAS 154 y el grupo tratado con OAS 1560S. En los dfas 13, 15, 17 y 19, se inyectaron inyecciones intraperitoneales de 25 pg de OAS 154 (FIG. 12, drculos) o 25 pg de OAS 1560S (FIG 12, cuadrados) formulados en liposomas en un volumen de 250 pl. En los dfas 14, 16 y 18, los ratones fueron inyectados por via intravenosa con el mismo protocolo. El dfa 22, todos los animales de control teman tumores mayores de 1.200 mm3 y se sacrificaron. El dfa 60, todos los animales tratados con OAS 1560S no tema ningun tumor y todavfa estaban vivos (FIG. 12).
Ejemplo 6: El tratamiento de ratones con oligonucleotidos antisentido complementarios al ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido despues de la cirugia para extirpar tumores de melanoma intradermicos dio como resultado la ausencia de recaida tumoral y la supervivencia completa
Se inyectaron celulas de melanoma B16F10 (100.000 celulas en 200 pl de medio RPMI) en ratones por via subcutanea en el dfa 0. El dfa 11, se realizo cirugfa para extirpar tumores. Los volumenes tumorales variaron de aproximadamente 800 a 1200 mm3. La herida se lavo una vez. Despues de la sutura, se inyecto un bolo de 250 |jl de oligo en liposomas en el sitio del tumor. En los dfas 13, 15, 17, 19 y 21, se inyectaron por via intraperitoneal en los ratones una dosis de 25 jg de OAS 154 de control desnudo (FIG 13, cuadrados), 25 jg de OAS 154 de control en liposomas (FIG 13, drculos) o 50 jg de OAS 154 en liposomas (FIG 13, triangulos), cada uno en un volumen de 250 jl. Otros grupos de ratones (6 ratones por grupo) se inyectaron de una manera similar a la descrita anteriormente con 50 jg de OAS 1560 desnudo, 25 jg de OAS 1560S en liposomas o 50 jg de OAS 1560S en liposomas (FIG 13, diamantes).
En comparacion con los ratones tratados con un oligonucleotido de control, el tratamiento posterior a la cirugfa con 25 y 50 jg de inyecciones intraperitoneales de OAS 1560S dio como resultado la ausencia de recafda tumoral de melanoma intradermico y la supervivencia completa (FIG 13).
Ejemplo 7: El tratamiento intraperitoneal o intravenoso de ratones con oligonucleotidos antisentido complementarios al ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido despues de la cirugia para extirpar tumores de carcinoma de vejiga subcutaneo dio como resultado la ausencia de tumores y la supervivencia completa
Se inyectaron por via subcutanea doce ratones con 100.000 celulas MB49 (celulas de cancer de vejiga de raton). Despues de 15 dfas, los ratones teman tumores de un diametro promedio de 800 mm3. Los tumores se extirparon quirurgicamente (dfa 0) y se inyecto un bolo de 200 j l que contema 100 jg de OAS 154 (control) o OAS 1560S (farmaco activo) en el sitio de la cirugfa. Tres dfas despues de la cirugfa, los ratones se dividieron en 2 grupos y se trataron por via intraperitoneal o intravenosa con 100 j l de inyecciones que conteman OAS 154 (grupo de control) o OAS 1560S (grupo tratado) como se indica en la FIG. 14. Solo un raton tratado por via intraperitoneal con OAS 1560S desarrollo un tumor. Todos los ratones tratados por via intravenosa con OAS 1560S permanecieron sin tumores y experimentaron supervivencia completa. Los animales de control tratados con Oligo OAS 154 de control se sacrificaron el dfa 41 (FIG 14).
Ejemplo 8: El tratamiento de ratones Rag -/- con oligonucleotidos antisentido complementarios al ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido despues de la extirpacion del tumor de un melanoma humano dio como resultado una eliminacion significativa de la recaida tumoral y un gran aumento de la supervivencia
Se inyectaron ratones Rag -/- con 5 millones de celulas de melanoma A375 humanas. Aproximadamente 34 dfas despues de la inyeccion celular, todos los ratones desarrollaron tumores de aproximadamente 700 mm3. Los ratones se sometieron a cirugfa de extirpacion del tumor y se dividieron aleatoriamente en dos grupos.
Grupo 1 (control): la herida se lavo con 50 jg de Oligo 154 de control (6 ratones en grupo) en un volumen de 200 jl. Grupo 2 (terapia): la herida se lavo con 50 jg de OAS 1537S (8 ratones en grupo) (Secuencia del oligonucleotido proporcionada en el Ejemplo 1) en 200 jl. Despues de la sutura, se aplico un bolo de 250 j l que contema 50 jg de Oligo 154 de control (6 ratones de control) o 250 j l que conteman 50 jg de OAS Oligo 1537s (8 ratones de terapia). Dos dfas despues, los ratones recibieron 6 inyecciones con Oligo 154 de control u OAS Oligo 1537S cada dos dfas. La primera inyeccion fue intraperitoneal y la segunda inyeccion fue en la vena de la cola.
El dfa 30 despues de la cirugfa, los 6 ratones tratados con Oligo 154 de control teman tumores del orden de 2000 mm3 y se sacrificaron (FIG 15, drculos). El dfa 57 despues de la cirugfa, 4 de los 8 ratones que recibieron OAS Oligo 1537S permanedan sin tumores (FIG 15, triangulos). El dfa 17 posterior a la cirugfa, 4 de los 8 ratones que recibieron OAS Oligo 1537S comenzaron a mostrar pequenos tumores que credan lentamente, que en el dfa 36 alcanzaron un tamano de aproximadamente 500 mm3 (FIG. 15, cuadrados). Estos ratones fueron sometidos nuevamente a cirugfa para extirpar los tumores y posteriormente murieron 2 ratones. Los otros 2 ratones se sometieron al mismo protocolo terapeutico (alternando 3 inyecciones intraperitoneales y 3 inyecciones intravenosas) con 50 jg de OAS Oligo 1537S en 250 j l (FIG. 15).
Secuencias
<210> SEQ ID NO 1
<211> LONGITUD: 2374
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 1
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
<210> SEQ ID NO 2
<211> LONGITUD: 1679
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 2
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000035_0001
<210> SEQ ID NO 3
<211> LONGITUD: 1635
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 3
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000036_0001
<210> SEQ ID NO 4
<211> LONGITUD: 1921
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 4
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
<210> SEQ ID NO 5
<211> LONGITUD: 1744
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 5
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
<210> SEQ ID NO 6
<211> LONGITUD: 1854
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 6
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
<210> SEQ ID NO 7
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 7
taggtttagc accgcaaggg 20
<210> SEQ ID NO 8
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 8
taggtttagc aaggactaac 20
<210> SEQ ID NO 9
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 9
ggggtaagat ttgccgag 18
<210> SEQ ID NO 10
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 10
atgctagagg tgatgttttt gg 22
<210> SEQ ID NO 11
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 11
cggtgcctct aatactgg 18
<210> SEQ ID NO 12
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 12
gttaaacatg tgtcactggg 20
<210> SEQ ID NO 13
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 13
ttgcacggtt agggtacc 18
<210> SEQ ID NO 14
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 14
ggaacaagtg attatgctac c 21
<210> SEQ ID NO 15
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 15
ggagccattc atacaggtcc c 21
<210> SEQ ID NO 16
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 16
agtaagagac agctgaaccc 20
<210> SEQ ID NO 17
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 17
ggcaggtcaa tttcactgg 19
<210> SEQ ID NO 18
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 18
gctgtgttat gcccgcctc 19
<210> SEQ ID NO 19
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 19
agctccatag ggtcttctc 19
<210> SEQ ID NO 20
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 20
gttaggtact gtttgcatta 20
<210> SEQ ID NO 21
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 21
aagtcttagc atgtactg 18
<210> SEQ ID NO 22
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 22
tagtagttcg ctttgactg 19
<210> SEQ ID NO 23
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 23
caagttattg gatcaattg 19
<210> SEQ ID NO 24
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 24
gggtaacttg ttccgttg 18
<210> SEQ ID NO 25
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 25
aataggattg cgctgtta 18
<210> SEQ ID NO 26
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 26
cctattgttg atatggac 18
<210> SEQ ID NO 27
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 27
ctgatccaac atcgagg 17
<210> SEQ ID NO 28
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 28
tagcggctgc accattgg 18
<210> SEQ ID NO 29
<211> LONG ITUD : 19
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 29
gttgaacaaa cgaaccttt 19
<210> SEQ ID NO 30
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 30
aactcagatc acgtaggac 19
<210> SEQ ID NO 31
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 31
cgacctggat tactccgg 18
<210> SEQ ID NO 32
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 32
ggaatttgaa gtagatag 18
<210> SEQ ID NO 33
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 33
ctcttgtcct ttcgtacag 19
<210> SEQ ID NO 34
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 34
ggcgctttgt gaagtagg 18
<210> SEQ ID NO 35
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 35
gttgagatga tatcatttac gg 22
<210> SEQ ID NO 36
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENC IA : 36
cacccaccca agaacagg 18
<210> SEQ ID NO 37
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 37
caacttagta ttatacccac accca 25
<210> SEQ ID NO 38
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 38
tcccccgtaa atgattacat ct 22
<210> SEQ ID NO 39
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 39
gagaaataag gcctacttca caaag 25
<210> SEQ ID NO 40
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 40
caaattcctc cctgtacgaa ag 22
<210> SEQ ID NO 41
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 41
agtaatccag gtcggtttct atct 24
<210> SEQ ID NO 42
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 42
aagtcctagc tgatctgagt tcag 24
<210> SEQ ID NO 43
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 43
gctattaaag gttcgtttgt tcaac 25
<210> SEQ ID NO 44
<211> LONGITUD: 16
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 44
tcccgatggt gcagcc 16
<210> SEQ ID NO 45
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 45
ttacgacctc gatgttggat ca 22
<210> SEQ ID NO 46
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 46
atcctattct agagtccata tcaac 25
<210> SEQ ID NO 47
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 47
aataggattg cgctgttatc ccta 24
<210> SEQ ID NO 48
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 48
tagggataac agcgcatacc tatt 24
<210> SEQ ID NO 49
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 49
ggaacaagtt accctaggga taa 23
<210> SEQ ID NO 50
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 50
ttgatccaat aacttgacca acg 23
<210> SEQ ID NO 51
<211> LONG ITUD : 21
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 51
acttcaccag tcaaagcgaa c 21
<210> SEQ ID NO 52
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 52
aacccaacct ccgagcag 18
<210> SEQ ID NO 53
<211> LONGITUD: 16
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 53
gttggggcga cctcgg 16
<210> SEQ ID NO 54
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 54
aaactaccaa acctgcttaa aa 22
<210> SEQ ID NO 55
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 55
aaacagtacc taacaaaccc acag 24
<210> SEQ ID NO 56
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 56
gaccctatgg agctttaatt tatta 25
<210> SEQ ID NO 57
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 57
cataacacag caagacgaga aga 23
<210> SEQ ID NO 58
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENC IA : 58
tgacc tgccc g tgaagag 18
<210> SEQ ID NO 59
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 59
cagctgtctc ttacttttaa ccagtg 26
<210> SEQ ID NO 60
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 60
ctgtatgaat ggctccacga 20
<210> SEQ ID NO 61
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 61
agcataatca cttgttcctt aaatag 26
<210> SEQ ID NO 62
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 62
accgtgcaaa ggtagcataa tca 23
<210> SEQ ID NO 63
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 63
tgattatgct acctttgcac ggt 23
<210> SEQ ID NO 64
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 64
gtaccctaac cgtgcaaag 19
<210> SEQ ID NO 65
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 65
cctgcccagtgacacatgtt t 21
<210> SEQ ID NO 66
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 66
cacctctagc atcaccagta ttaga 25
<210> SEQ ID NO 67
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 67
cttaccccgc ctgtttacca 20
<210> SEQ ID NO 68
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 68
aggttaaaaa aagtaaaagg aactcg 26
<210> SEQ ID NO 69
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 69
cccaacacag gcatgctca 19
<210> SEQ ID NO 70
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 70
accaacaagt cattattacc ctca 24
<210> SEQ ID NO 71
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 71
tgacaattaa cagcccaata tcta 24
<210> SEQ ID NO 72
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 72
gcctgcgtca gattaaaaca c 21
<210> SEQ ID NO 73
<211> LONG ITUD : 24
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 73
gtaacatgaa aacattctcc tccg 24
<210> SEQ ID NO 74
<211> LONGITUD: 28
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 74
tatcacccta tagaagaact aatgttag 28
<210> SEQ ID NO 75
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 75
ctgaactcct cacacccaat t 21
<210> SEQ ID NO 76
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 76
cactacctaa aaaatcccaa aca 23
<210> SEQ ID NO 77
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 77
ttaagaaagc gttcaagctc a 21
<210> SEQ ID NO 78
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 78
catagtaggc ctaaaagcag c 21
<210> SEQ ID NO 79
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 79
aaaccttgta gagagagtaa aaaatt 26
<210> SEQ ID NO 80
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENC IA : 80
aaagaggaac agctctttgg acac 24
<210> SEQ ID NO 81
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 81
aatccccttg taaatttaac tgtt 24
<210> SEQ ID NO 82
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 82
ctttaaattt gcccacagaa c 21
<210> SEQ ID NO 83
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 83
ggttgtccaa gatagaatct 20
<210> SEQ ID NO 84
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 84
acaaacctac cgagcctgg 19
<210> SEQ ID NO 85
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 85
aagatttata ggtagaggcg 20
<210> SEQ ID NO 86
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 86
cccgtctatg tagcaaaata 20
<210> SEQ ID NO 87
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 87
acctaagaac agctaaaaga 20
<210> SEQ ID NO 88
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 88
taagaccccc gaaaccagac 20
<210> SEQ ID NO 89
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 89
ataactttgc aaggagagcc 20
<210> SEQ ID NO 90
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 90
cttctgcata atgaattaac 20
<210> SEQ ID NO 91
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 91
atatagcaag gactaacccc 20
<210> SEQ ID NO 92
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 92
agatgaaaaa ttataaccaa 20
<210> SEQ ID NO 93
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 93
caatagatat agtaccgcaa 20
<210> SEQ ID NO 94
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 94
aggcgataga aattgaaacc 20
<210> SEQ ID NO 95
<211> LONG ITUD : 20
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 95
tagccaaacc atttacccaa 20
<210> SEQ ID NO 96
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 96
caccttacta ccagacaacc 20
<210> SEQ ID NO 97
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 97
ctaaacctag ccccaaacc 19
<210> SEQ ID NO 98
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 98
ctagcatcac cagtattaga 20
<210> SEQ ID NO 99
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 99
ttaccaaaaa catcacctct 20
<210> SEQ ID NO 100
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 100
gaactcggca aatcttaccc 20
<210> SEQ ID NO 101
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido sentido <400> SECUENCIA: 101
gggtaagatt tgccgagttc 20
<210> SEQ ID NO 102
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENC IA : 102
gctca taagg aaagg ttaaa a 21
<210> SEQ ID NO 103
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 103
gtcaacccaa cacaggc 17
<210> SEQ ID NO 104
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 104
accaacaagt cattattacc c 21
<210> SEQ ID NO 105
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido sentido <400> SECUENCIA: 105
ggttgattgt agatattggg ct 22
<210> SEQ ID NO 106
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 106
attaacagcc caatatctac 20
<210> SEQ ID NO 107
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 107
tgcgtcagat taaaacactg 20
<210> SEQ ID NO 108
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 108
aaaacattct cctccgcata 20
<210> SEQ ID NO 109
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 109
gttagtataa gtaacatg 18
<210> SEQ ID NO 110
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 110
tggaccaatc tatcaccct 19
<210> SEQ ID NO 111
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 111
acatataact gaactcctca 20
<210> SEQ ID NO 112
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 112
cacccactac ctaaaaaatc 20
<210> SEQ ID NO 113
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 113
caccaattaa gaaagcgttg 20
<210> SEQ ID NO 114
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 114
taggcctaaa agcagccacc aa 22
<210> SEQ ID NO 115
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido sentido <400> SECUENCIA: 115
ttggtggctg cttttaggcc ta 22
<210> SEQ ID NO 116
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 116
taacacccat agtaggcct 19
<210> SEQ ID NO 117
<211> LONG ITUD : 20
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 117
aaccttgtag agagagtaaa 20
<210> SEQ ID NO 118
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 118
aacagctctt tggacactag 20
<210> SEQ ID NO 119
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 119
aactgttagt ccaaagag 18
<210> SEQ ID NO 120
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 120
ctctaaatcc ccttgtaaa 19
<210> SEQ ID NO 121
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 121
actttaaatt tgcccacag 19
<210> SEQ ID NO 122
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 122
ggttgtccaa gatagaatc 19
<210> SEQ ID NO 123
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 123
acaaacctac cgagcctcc 19
<210> SEQ ID NO 124
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENC IA : 124
a ttta tagg t tagaggcg 18
<210> SEQ ID NO 125
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 125
atgtagcaaa atagtgggaa 20
<210> SEQ ID NO 126
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 126
taagaacagc taaaagagca c 21
<210> SEQ ID NO 127
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 127
cgaaaccaga cgagctac 18
<210> SEQ ID NO 128
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido sentido <400> SECUENCIA: 128
ggggtcttag ctttggctct cc 22
<210> SEQ ID NO 129
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 129
taactttgca aggagagcca 20
<210> SEQ ID NO 130
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 130
accttctgca taatgaat 18
<210> SEQ ID NO 131
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 131
atatagcaag gactaaccc 19
<210> SEQ ID NO 132
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 132
gatgaaaaat tataaccaag 20
<210> SEQ ID NO 133
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 133
aatagatata gtaccgcaag 20
<210> SEQ ID NO 134
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 134
cgatagaaat tgaaacc 17
<210> SEQ ID NO 135
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido sentido <400> SECUENCIA: 135
tactttattt gggtaaatgg 20
<210> SEQ ID NO 136
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 136
ccatttaccc aaataaagta 20
<210> SEQ ID NO 137
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 137
ttagccaaac catttaccca 20
<210> SEQ ID NO 138
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 138
aaggtggagt gggtttgggg c 21
<210> SEQ ID NO 139
<211> LONG ITUD : 17
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 139
gctaaggttg tctggta 17
<210> SEQ ID NO 140
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 140
atcgcctata ctttatttgg 20
<210> SEQ ID NO 141
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 141
atctattgcg ccaggtttca 20
<210> SEQ ID NO 142
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 142
ttttcatctt tcccttg cg 19
<210> SEQ ID NO 143
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 143
tccttgctat attatgcttg 20
<210> SEQ ID NO 144
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 144
cattatgcag aaggtatagg 20
<210> SEQ ID NO 145
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 145
tctccttgca aagttatt 18
<210> SEQ ID NO 146
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENC IA : 146
tttcggggg t cttagctttg 20
<210> SEQ ID NO 147
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 147
ctgttcttag gtagctcg 18
<210> SEQ ID NO 148
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 148
tgctacatag acgggtgtg 19
<210> SEQ ID NO 149
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 149
cctctaccta taaatcttcc 20
<210> SEQ ID NO 150
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 150
gctatcacca ggctcgg 17
<210> SEQ ID NO 151
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 151
aagttgaact aagattc 17
<210> SEQ ID NO 152
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 152
gagggttctg tgggcaaatt 20
<210> SEQ ID NO 153
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 153
acagttaaat ttacaaggg 19
<210> SEQ ID NO 154
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 154
gtgtccaaag agctgttcc 19
<210> SEQ ID NO 155
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 155
tactctctct acaaggtttt 20
<210> SEQ ID NO 156
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 156
taggcctact atgggtgtta 20
<210> SEQ ID NO 157
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 157
aacgctttct taattggtgg c 21
<210> SEQ ID NO 158
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 158
ttttaggtag tgggtgttga 20
<210> SEQ ID NO 159
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 159
ggagttcagt tatatgtttg 20
<210> SEQ ID NO 160
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 160
tgatagattg gtccaattgg 20
<210> SEQ ID NO 161
<211> LONG ITUD : 21
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 161
ctaacattag ttcttctata g 21
<210> SEQ ID NO 162
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 162
atgcggagga gaatgttt 18
<210> SEQ ID NO 163
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 163
tcagtgtttt aatctgacg 19
<210> SEQ ID NO 164
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:_
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido antisentido <400> SECUENCIA: 164
gtagatattg ggctgttaatt 21
<210> SEQ ID NO 165
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotide
<400> SECUENCIA: 165
gtgagggtaa taatgacttg 20
<210> SEQ ID NO 166
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotide
<400> SECUENCIA: 166
atgagcatgc ctgtgttggt 20
<210> SEQ ID NO 167
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotide
<400> SECUENCIA: 167
ggtaagattt gccgagttc 19
<210> SEQ ID NO 168
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotide <400> SECUENC IA : 168
tgg tga tgc t agaggtga tg 20
<210> SEQ ID NO 169
<211> LONGITUD: 15
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotide <400> SECUENCIA: 169
gcggtgcctc taata 15
<210> SEQ ID NO 170
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 170
ggccgttaaa catgtgtcac 20
<210> SEQ ID NO 171
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 171
tgattatgct acctttgcac 20
<210> SEQ ID NO 172
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 172
ttaaggaaca agtgattatg 20
<210> SEQ ID NO 173
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 173
tggagccatt catacaggtc 20
<210> SEQ ID NO 174
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 174
aaaagtaaga gacagctgaa 20
<210> SEQ ID NO 175
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 175
cacgggcagg tcaatttcac 20
<210> SEQ ID NO 176
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 176
gtcttgctgt gttatgcccg 20
<210> SEQ ID NO 177
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 177
aattaaagct ccatagggt 19
<210> SEQ ID NO 178
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 178
gtttgttagg tactgtttgc a 21
<210> SEQ ID NO 179
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 179
aggtttggta gtttaggac 19
<210> SEQ ID NO 180
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 180
gccccaaccg aaatttttaa 20
<210> SEQ ID NO 181
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 181
ctcggaggtt gggttctgct 20
<210> SEQ ID NO 182
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 182
ctggtgaagt cttagcatgt 20
<210> SEQ ID NO 183
<211> LONG ITUD : 20
<212> TIPO : ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 183
caattgagta tagtagttcg 20
<210> SEQ ID NO 184
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 184
tgttccgttg gtcaagtta 19
<210> SEQ ID NO 185
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 185
aataggattg cgctgttatc 20
<210> SEQ ID NO 186
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 186
attgttgata tggactctag 20
<210> SEQ ID NO 187
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 187
atccaacatc gaggtcgtaa 20
<210> SEQ ID NO 188
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 188
gcggctgcac catcgggat 19
<210> SEQ ID NO 189
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 189
ttgaacaaac gaaccttta 19
<210> SEQ ID NO 190
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENC IA : 190
aactcaga tc acg taggac t 20
<210> SEQ ID NO 191
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 191
aaaccgacct ggattactc 19
<210> SEQ ID NO 192
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 192
agggaggaat ttgaaggtag 20
<210> SEQ ID NO 193
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 193
ggccttattt ctcttgtcct 20
<210> SEQ ID NO 194
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 194
ggaaggcgct ttgtgaagta 20
<210> SEQ ID NO 195
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 195
aagttgagat gatatcattt 20
<210> SEQ ID NO 196
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 196
cctgttcttg ggtgggt 17
<210> SEQ ID NO 197
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 197
gtcctaaact accaaacc 18
<210> SEQ ID NO 198
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 198
caccctctaa cctagagaag 20
<210> SEQ ID NO 199
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleotido <400> SECUENCIA: 199
aggtggagtg gattgggg 18
<210> SEQ ID NO 200
<211> LONGITUD: 2374
<212> TIPO: ARN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens <400> SECUENCIA: 200
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
<210> SEQ ID NO 201
<211> LONGITUD: 1679
<212> TIPO: ARN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 201
Figure imgf000069_0002
Figure imgf000070_0001
<210> SEQ ID NO 202
<211> LONGITUD: 1635
<212> TIPO: ARN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 202
Figure imgf000070_0002
Figure imgf000071_0001
<210> SEQ ID NO 203
<211> LONGITUD: 1921
<212> TIPO: ARN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 203
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000072_0001
<210> SEQ ID NO 204
<211> LONGITUD: 1744
<212> TIPO: ARN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 204
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
<210> SEQ ID NO 205
<211> LONGITUD: 1854
<212> TIPO: ARN
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<400> SECUENCIA: 205
Figure imgf000073_0002
Figure imgf000074_0001

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleotido para su uso en un metodo:
(a) de supresion de la metastasis de un cancer en un individuo; o
(b) para el tratamiento del cancer metastasico en un individuo;
en el que el oligonucleotido es complementary a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante antisentido (ARNmtncAS) o complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante sentido (ARNmtncS), y en el que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con la molecula de ARN mitocondrial quimerico para formar un duplex estable, y en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia.
2. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido es suficientemente complementario a una molecula de ARN mitocondrial quimerico no codificante humano que comprende:
a. un ARN ribosomico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida o
b. un ARN ribosomico mitocondrial l6 s sentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleotido con una secuencia de repeticion invertida.
3. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el oligonucleotido es complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6.
4. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el oligonucleotido es al menos un 85 % complementario a la molecula de ARNmtncAS codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6.
5. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el uno o mas oligonucleotidos comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-198.
6. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el oligonucleotido se administra en combinacion con al menos un agente antineoplasico;
opcionalmente en el que el al menos un agente antineoplasico se selecciona entre el grupo que consiste en remicade, docetaxel, celecoxib, melfalan, dexametasona, esteroides, gemcitabina, cisplatino, temozolomida, etoposido, ciclofosfamida, temodar, carboplatino, procarbazina, gliadel, tamoxifeno, topotecan, metotrexato, gefitinib, taxol, taxotere, fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, xeloda, CPT-11, interferon alfa, interferon alfa pegilado, capecitabina, cisplatino, tiotepa, fludarabina, carboplatino, daunorrubicina liposomica, citarabina, doxetaxol, paclitaxel, vinblastina, IL-2, GM-CSF, dacarbazina, vinorelbina, acido zoledronico, palmitronato, biaxina, busulfan, prednisona, bortezomib, bifosfonato, trioxido de arsenico, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel, ganciclovir, adriamicina, fosfato de sodio de estramustina, sulindaco y etoposido.
7. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el oligonucleotido y el al menos un agente antineoplasico se administran secuencialmente o simultaneamente.
8. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el oligonucleotido se administra en combinacion con:
(a) una radioterapia;
(b) cirugfa;
(c) una terapia de trasplante alogeno de celulas madre; y/o
(d) una terapia de trasplante autologo de celulas madre.
9. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el individuo se ha tratado anteriormente contra el cancer con una terapia que comprende quimioterapia, radioterapia, cirugfa o combinaciones de los mismos.
10. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el cancer o el cancer metastasico en el individuo recayo despues del tratamiento con uno o mas de entre bortezomib, ciclofosfamida, dexametasona, doxorrubicina, interferon alfa, lenalidomida, melfalan, interferon alfa pegilado, prednisona, talidomida y vincristina.
11. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el cancer es un cancer solido;
opcionalmente, en el que el cancer solido es cancer de vejiga, cancer de cerebro, cancer de mama, cancer de cuello uterino, cancer de colon, cancer de endometrio, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer de v^as biliares, cancer de pulmon, melanoma, cancer de boca, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de faringe, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de testiculo o cancer de tiroides.
12. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el cancer es un cancer no solido;
opcionalmente en el que el cancer no solido es mieloma multiple, leucemia o linfoma.
13. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el oligonucleotido reduce el numero de celulas madre cancerosas en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
14. El oligonucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el oligonucleotido inhibe el crecimiento tumoral y/o la metastasis en el individuo en comparacion con un individuo al que no se le administra el oligonucleotido.
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