ES2706899T3 - Vectores de terapia génica y citosina desaminasas - Google Patents

Abstract

Un vector que comprende un polinucleótido que comprende los pares de bases 8877 a 9353 de la SEQ ID NO: 19, que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa (CD).

Description

d e s c r ip c ió n

Vectores de terapia génica y citosina desaminasas

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a citosina desaminasas modificadas (CD). La divulgación se refiere además a las células que expresan tales CD modificadas y a los procedimientos para usar dichas CD modificadas en el tratamiento de enfermedades y trastornos.

Antecedentes

La citosina desaminasa de levadura o bacteriana convierte el inocuo profármaco antibiótico 5-FC en el agente quimioterapéutico citotóxico 5-fluorouracilo (5-FU). No se sabe que los seres humanos (y los mamíferos en general) posean un gen natural que codifica una enzima con una actividad citosina desaminasa significativa. La citosina desaminasa bacteriana y de levadura han ganado reconocimiento en el tratamiento de los cánceres mediante la liberación de genes y vectores virales para el suministro de la enzima seguido del tratamiento con 5-FC, que luego se convierte mediante la enzima en un fármaco citotóxico (Miller et al., Can Res 62:773-7802002; Kievit et al., Can Res 59:1417-1421 1999).

Korkegian et al, (2005), Nature, ^voI.308, pp. 857-860 describen la termoestabilización computacional de una enzima. Stolworthy et al. (2008), J. Mol Bío, voI. 377, pp. 854-869 indican que Ios mutantes de la citosina desaminasa de levadura con mayor termoestabilidad imparten sensibilidad a la 5-fluorocitosina. Khatri et al (2006), J. Gene Med voI.

8, pp. 1086-1096 indican que la combinación de citosina desaminasa con uracil fosforribosil transferasa conduce a efectos secundarios locales y distantes contra el cáncer de próstata RMⁱ en ratones.

El documento W02006 / 05831 desvela un virus competente para la replicación que codifica plásmidos para su uso en terapia, más particularmente para ^{su uso} en el tratamiento de una enfermedad de proliferación celular, una enfermedad inmunológica, una infección adquirida e inflamación.

Kei, H. et al (Cáncer Research, voI. 67, no. 11, 5345-5353) desvela la eficacia terapéutica de la terapia génica suicida mediada por vector de retrovirus con replicación competente en un modelo de metástasis de cáncer colorrectal multifocal.

Xing, L. et al. (International Journal of Radiation, voI.69, n.03, S617-S618) desvela que una combinación de citosina desaminasa con uracil fosforribosil transferasa con 5-fluorocitosina radiosensibiliza las células de cáncer de próstata de rata. El documento W02005086922 desvela composiciones y procedimientos para tratar el cáncer usando un adenovirus mutante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido terapéutico que está dirigido a células con una ruta de retinoblastoma mutante. El adenovirus mutante es capaz de matar las células tumorales sin dañar las células con una ruta de retinoblastoma de tipo salvaje.

Sumario

En un aspecto, la presente invención proporciona un vector según la reivindicación 1. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado según la reivindicación 8. En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado según la reivindicación 14. En el presente documento se proporcionan polipéptidos que convierten 5-FC en 5-FU. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos, células que expresan tales polipéptidos, vectores que contienen dichos polinucleótidos y polipéptidos y procedimientos para sintetizar 5-FU o derivados de Ios mismos a partir de un uso adecuado de tales polipéptidos. Por consiguiente, en diversos aspectos de la divulgación, se proporcionan polipéptidos aislados ^o recombinantes que comprenden una citosina desaminasa que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de la divulgación, Ios polipéptidos comprenden la SEQ ID NO: 2 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en A23L, V ⁱ 08I, I140L y cualquier combinación de I^os mismos. En aún otro aspecto de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 4 e incluye hasta 50, 25, 10 o 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos, excluyendo Ios restos: (a) 23, 108 y 140. En general, L^os polipéptidos proporcionados en el presente documento muestran la actividad de citosina desaminasa útil para convertir 5-FC en 5-FU.

La divulgación también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ^o 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 4, donde el polipéptido tiene una leucina en la posición 23, una isoleucina en la posición 108 y una leucina en la posición 140, y donde el polipéptido tiene actividad citosina desaminasa. En aún otro aspecto de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4.

La divulgación proporciona además construcciones de fusión que comprenden uno cualquiera de I^os polipéptidos anteriores unidos operativamente a una uracil fosforribosiltransferasa (Up RT) o una orotato fosforribosiltransferasa (OPRT). En un aspecto de la divulgación, la construcción de fusión comprende un primer polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en A23L, V108I, I140l y cualquier combinación de las mismas unidas a un segundo polipéptido que tiene actividad UPRT ^u OPRT. En aún otro aspecto de la divulgación, la construcción de fusión comprende un primer polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4 e incluye hasta 50, 25, 10 o 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos, excluyendo Ios restos: 23, 108 y 140, donde el primer polipéptido está unido a un segundo polipéptido que tiene actividad UPRT ^u OPRT. La divulgación también proporciona una construcción de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa y que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 4, donde el polipéptido tiene una leucina en la posición 23, una isoleucina en la posición 108 y una leucina en la posición 140, y donde el primer polipéptido está unido a un segundo polipéptido que comprende actividad UPRT o o PrT. En un aspecto de la divulgación, Ios polipéptidos que tienen actividad UPRT u OPRT comprenden una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 8 y lO, respectivamente, o variantes de Ios mismos. En aún otro aspecto de la divulgación, un primer polipéptido que comprende actividad citosina desaminasa está unido a un polipéptido que tiene actividad UPRT ^{u o} P^rT, donde I^os polipéptidos están separados por un enlazador peptídico. En otro aspecto de la divulgación, la construcción de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 14, 16 o 18.

La divulgación proporciona además polinucleótidos que codifican cualquiera de Ios polipéptidos anteriores. Por ejemplo, la divulgación proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en A23L, V1O8I, I14OL y cualquier combinación de I^os mismos. En aún otro aspecto de la divulgación, El polinucleótido codifica un polipéptido que comprende una secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 4 e incluye hasta 50, 25, 10 o 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos, excluyendo Ios restos: (a) 23, 1O8 y 14O. En un aspecto adicional de la divulgación, la divulgación proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la SEQ iD nO: 4, donde el polipéptido tiene una leucina en la posición 23, una isoleucina en la posición 1O8 y una leucina en la posición l4o, y donde el polipéptido tiene actividad citosina desaminasa. En aún otro aspecto de la divulgación, el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 4. En un aspecto adicional de la divulgación, el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 11, 12 o 13.

La divulgación proporciona un polinucleótido optimizado por codones humano que codifica una citosina desaminasa. En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido optimizado por codones humano comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 3. En aún otro aspecto de la divulgación, el polinucleótido comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, 7 ^o 9.

En otros aspectos de la divulgación, una citosina desaminasa ^o construcción de fusión de la divulgación se libera usando un sistema de liberación de genes (GDS). En otro aspecto, el polinucleótido que codifica una citosina desaminasa se libera con un GDS que es un vector viral ^o derivado de virus. El vector viral puede ser replicante ^o no replicante, y puede ser un vector adenoviral, un vector de sarampión, un vector de herpes, un vector retroviral (incluido un vector lentiviral), un vector rabdoviral, tal como un vector viral de estomatitis vesicular, un vector de reovirus, un vector del virus del valle de Séneca, un vector de poxvirus (incluyendo vectores derivados de la viruela animal o vaccinia), un vector de parvovirus (incluyendo un vector de AAV), un vector de alfavirus u otro vector viral conocido por un experto en la técnica. En un aspecto de la divulgación, el vector viral puede ser un vector retroviral competente para la replicación capaz de infectar células de mamíferos en replicación. El vector retroviral competente para la replicación puede comprender un ortoretrovirus o más típicamente un vector de retrovirus gamma. En un aspecto, un vector retroviral competente para la replicación comprende un sitio interno de entrada al ribosoma interno (IRES) en 5' al polinucleótido que codifica una citosina desaminasa de la divulgación. En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido que codifica una citosina desaminasa está en 3' a un polinucleótido ENV de un vector retroviral.

En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan células huésped transfectadas con una citosina desaminasa o construcción de fusión de la divulgación, o un vector que incluye un polinucleótido o construcción de fusión de la divulgación. Las células huésped incluyen células eucariotas, tales como células de levadura, células de insecto ^o células de animales. Las células huésped también incluyen células procariotas, tales como células bacterianas.

La divulgación también proporciona procedimientos para tratar un trastorno de proliferación celular que incluye un cáncer que comprende administrar un polinucleótido o polipéptido de la divulgación a un sujeto y ponerlo en contacto con un fármaco citotóxico que comprende 5-fluorocitosina (5-FC).

La divulgación proporciona un retrovirus competente para la replicación recombinante (RCR) que comprende: una proteína GAG retroviral; una proteína POL retroviral; una cubierta retroviral; un polinucleótido retroviral que comprende secuencias de repetición terminales largas (LTR) en el extremo 3' de la secuencia de polinucleótido retroviral, una secuencia promotora en el extremo 5' del polinucleótido retroviral, siendo dicho promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero, un dominio de ácido nucleico gag, un dominio de ácido nucleico pol y un dominio de ácido nucleico env; un casete que comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) unido operativamente a un polinucleótido heterólogo, donde el casete está posicionado en 5' a 3' LTR y 3' al dominio de ácido nucleico env que codifica la cubierta retroviral; y secuencias que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, empaquetamiento e integración en una célula objetivo, donde el RCR mantiene una mayor competencia de replicación después de 6 pases en comparación con un vector pACE (SEQ ID NO: 21). En un aspecto de la divulgación, la secuencia polinucleotídica retroviral deriva del virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), el virus de la leucemia felina o virus de la leucemia del mono de Gibbon (GALV). En otro aspecto de la divulgación, el MLV es un MLV anfotrópico. En aún otro aspecto de la divulgación, el retrovirus es un oncoretrovirus. En aún otro aspecto de la divulgación, la célula objetivo es una célula que tiene un trastorno proliferativo celular. El trastorno de proliferación celular puede seleccionarse del grupo que consiste en, aunque no de forma limitativa, cáncer de pulmón, cáncer de colon y recto, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer de útero, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, melanoma, cáncer de estómago y cáncer de ovarios, artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes. En un aspecto de la divulgación, el promotor puede comprender un promotor de CMV que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO:19, 2^{o o} 22 desde el nucleótido 1 a aproximadamente el nucleótido 582 y puede incluir una modificación en una ^o más bases de ácidos nucleicos y que es capaz de dirigir e iniciar la transcripción. En aún un aspecto adicional de la divulgación, el promotor comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19, 20 o 22 desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 582. En un aspecto adicional de la divulgación, el promotor comprende un polinucleótido de dominio CMV-R-U5. En un aspecto de la divulgación, el dominio CMV-R-U5 comprende el promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano unido a una región MLV R-U5. En aún otro aspecto de la divulgación, el polinucleótido del dominio CMV-R-U5 comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19, 20, o 22 desde aproximadamente el nucleótido 1 a aproximadamente el nucleótido 1202 o las secuencias que son al menos un 95 % idénticas a una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19, 20 o 22, donde el polinucleótido promueve la transcripción de una molécula de ácido nucleico unida operativamente a la anterior. En otro aspecto de la divulgación, el gag y pol del polinucleótido derivan de un oncoretrovirus. El dominio gag de ácido nucleico puede comprender una secuencia desde aproximadamente el nucleótido número 1203 a aproximadamente el nucleótido 2819 de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia que tiene al menos un 95%, 98 %, 99 % o 99,8 % de identidad con la anterior. El dominio pol comprende una secuencia desde aproximadamente el nucleótido número 2820 a aproximadamente el nucleótido 6358 de la SEQ ID NO:19 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad con la anterior. En un aspecto de la divulgación, el dominio env codifica una proteína env anfótera. El dominio env comprende una secuencia desde aproximadamente el número 6359 a aproximadamente el nucleótido 8323 de las SEQ ID NO: 19 ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98%, 99% o 99,8% de identidad con la anterior. El dominio IRES del vector puede ser cualquier IRES, sin embargo, en un aspecto de la divulgación, el IRES deriva de un virus de encefalomiocarditis. En un aspecto adicional de la divulgación, el IRES comprende una secuencia desde aproximadamente el número 8327 a aproximadamente el nucleótido 8876 de la S^e Q ID NO: 19 ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 % ^o 99% de identidad con la misma. En aún un aspecto adicional de la divulgación, el polinucleótido heterólogo comprende un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15 ^o 17. En un aspecto adicional de la divulgación, la secuencia heteróloga codifica un polipéptido que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO:4. El ácido nucleico heterólogo es un codón humano optimizado y codifica un polipéptido como se expone en la SEQ ID NO: 4. En un aspecto adicional de la divulgación, el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19, desde aproximadamente el nucleótido 8877 hasta aproximadamente el nucleótido 9353. En un aspecto de la divulgación, la L^t R en 3' deriva de un oncoretrovirus. En un aspecto adicional de la divulgación, la 3' Lt R comprende un dominio U3-R-U5. En aún un aspecto adicional de la divulgación, la LTR en 3' comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 desde aproximadamente el nucleótido 9405 a aproximadamente el nucleótido 9998 ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 % ^o 99,5 % de identidad con la misma.

La divulgación proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO:19, 20 o 22.

La divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende de 5' a 3': una fusión CMV-R-U5 del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano en una región R-U5 del VLM; un PBS, un sitio de unión al cebador para la transcriptasa inversa; un sitio 5' de corte y empalme; una señal de empaquetamiento y ; una secuencia de codificación gag para el antígeno específico del grupo del VLM; una secuencia de codificación pol para la poliproteína de la polimerasa de VLM; un sitio 3' de corte y empalme; una secuencia de codificación de env 4070a para la proteína de la cubierta de la cepa 4070a del MLV; un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis; una secuencia codificante de citosina desaminasa modificada; un tracto de polipurina; y una repetición terminal larga U3-R-U5 del MLV.

La divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto con un trastorno de proliferación celular que comprende poner en contacto al sujeto con un polinucleótido, un polipéptido de la divulgación que tiene actividad citosina desaminasa en condiciones tales que el polinucleótido se expresa y poner en contacto al sujeto con 5-fluorocitosina.

La divulgación también proporciona un procedimiento para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto que comprende poner en contacto al sujeto con un retrovirus de la divulgación, donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica una proteína terapéutica que inhibe la proliferación de una célula neoplásica. En una realización, el retrovirus comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 4, 12, 14, 16 o 18.

Los detalles de una o más realizaciones de la divulgación se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y Ios dibujos, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de I^os dibujos

La Figura 1A-D muestra (a) un esquema del vector retroviral recombinante de la divulgación; (b) un mapa plasmídico de un polinucleótido de la divulgación; (c y d) una secuencia de un polinucleótido de la divulgación (SEQ ID NO: 19).

La Figura 2A-D muestra esquemas para la generación de varias realizaciones de la divulgación que comprenden polipéptidos con actividad c D, OPRT y UPRT.

La Figura 3 muestra que se observan niveles más altos de proteína yCD2 en comparación con la proteína yCD de tipo salvaje en las células U-87 infectadas.

La Figura 4 muestra la estabilidad de un vector que comprende un polipéptido CD de la divulgación y la comparación con otros vectores de la divulgación.

La Figura 5A-B muestra que la actividad de citosina desaminasa y el vector de la divulgación proporcionan una expresión comparable o mejor, y por lo tanto, la destrucción, de células RG2 (5A) o U87 de rata infectadas (5B) en comparación con la actividad de yCD de tipo salvaje (T5.0007), cuando las células infectadas se exponen a niveles crecientes de 5-FC.

La Figura 6 muestra que la actividad específica en células U87 infectadas de T5.0002 (yCD2) es mayor que T5.0001 (yCD parcialmente optimizada) que es mayor que T5.0007 (yCD salvaje).

Símbolos de referencia similares en I^os diversos dibujos indican elementos similares.

Descripción detallada

Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/a", "y", y “el/la” incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el agente" incluye una referencia a uno o más agentes conocidos por Ios expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Asimismo, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se indique otra cosa. De forma similar, "comprende", "comprenden", "que comprende" "incluye", "incluyen" y "que incluye", es indistinto y no se pretende que sea limitante.

Debe entenderse además que, cuando las descripciones de diversas realizaciones utilizan el término "que comprende", I^os expertos en la materia entenderán que, en algunos casos específicos, una realización puede describirse alternativamente utilizando el lenguaje "consiste esencialmente en" ^o "consiste en".

A no ser que se defina de otra forma, todos I^os términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la materia a la cual pertenece esta divulgación. Aunque I^os procedimientos y materiales similares ^o equivalentes a I^os descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica de Ios procedimientos y composiciones descritos, en el presente documento se describen Ios procedimientos, dispositivos y materiales de ejemplo.

Las publicaciones tratadas anteriormente y a lo largo del texto se proporcionan ricamente para ^su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud.

Una citosina desaminasa (EC 3.5.4.1) es una enzima que cataliza la

reacción química citosina H2O -> uracilo NH3

Por lo tanto, I^os dos sustratos de esta enzima son citosina y H2O, mientras que ^sus dos productos son uracilo y NH3. Esta enzima pertenece a la familia de las hidrolasas, las que actúan sobre enlaces carbono-nitrógeno distintos de Ios enlaces peptídicos, específicamente en amidinas cíclicas. El nombre sistemático de esta clase de enzima es citosina aminohidrolasa. Esta enzima también se llama isocitosina desaminasa. Esta enzima participa en el metabolismo de las pirimidinas.

Más particularmente, la citosina desaminasa es una enzima involucrada en la ruta metabólica de las pirimidinas, a través de la cual se transforma la citosina exógena, mediante desaminación hidrolítica, en uracilo. Se han demostrado actividades de la citosina desaminasa (CDasa o CD) en procariotas y eucariotas inferiores, pero están ausentes en mamíferos (Koechlin et al., 1966, Biochem. Pharmacol. 15, 435-446; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22, 137-153). El gen FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) y el gen coda de E. ^coIÍ, que codifican, respectivamente, la CDasa de estos dos organismos, se conocen y sus secuencias están publicadas (documento EP 4^o2108; Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6; documento WO 93/01281). La CDasa también desamina un análogo de la citosina, 5-fluorocitosina (5-FC) a 5-fluorouracilo (5-FU), que es un compuesto altamente citotóxico, en particular cuando se convierte a 5-fluoro-UMP (5-FUMP). Las células que carecen de actividad CDasa, debido a una mutación inactivadora del gen que codifica la enzima o a su deficiencia natural para esta enzima (por ejemplo, células de mamífero) son resistentes al 5-FC (Jund y Lacroute, 1970, J. Bacteriol. l02, 607-615; Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol., 171, 2124-2127). Por otro lado, se ha demostrado que es posible transmitir la sensibilidad a 5-FC a células de mamífero a las que se ha transferido la secuencia que codifica una actividad de CDasa (Huber et al., 1993, Cáncer Res. 53, 4619-4626; Mullen et al., 1992, Proc. Nati. Acad. S^cí. USA 89, 33-37; documento WO 93/01281). Por consiguiente, el ^uso de CD es ventajoso en el contexto de la terapia génica, en particular, de la terapia génica contra el cáncer.

Sin embargo, la sensibilidad al 5-FC varía mucho dependiendo de las líneas celulares. Se observa baja sensibilidad, por ejemplo, en las líneas tumorales humanas PANC-1 (carcinoma de páncreas) y SK-BR-3 (adenocarcinoma de mama) transducidas con un retrovirus que expresa el gen coda de E. coIÍ (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170­ 175). Este fenómeno se explica por la ausencia o mala conversión endógena del 5-FU formado por la acción enzimática de la CDasa, al 5-FU^m P citotóxico. Esta etapa, que normalmente se lleva a cabo en células de mamíferos mediante orotato fosforibosiltransferasa (OPRTasa), puede estar ausente en ciertos tumores y, por lo tanto, hacer que la terapia génica basada en la CDasa sea inefectiva. En procariotas y eucariotas inferiores, el uracilo se transforma en UMP a través de la acción de la uracil fosforribosiltransferasa (actividad UPRTasa). Esta enzima también convierte 5-FU en 5-FUMP. E^s importante destacar que, la uracil fosforribosiltransferasa bacteriana (UPRT) es funcionalmente equivalente a la orotato fosforribosiltransferasa (OPRT) ^o uridina-5' -monofosfato sintasa de células de mamífero. Estas enzimas median la conversión de 5-fluorouracilo (5-FU) (un análogo fluorado de uracilo) en monofosfato de 5-fluorouridina 5' (5-FU^m P). El 5-fluorouridina 5' monofosfato se convierte posteriormente en 5-FdUDP y FdUTP a través de la ruta de las pirimidinas de novo de los mamíferos. Cada 5-FdUTP es un inhibidor irreversible de la timidilato sintasa (Thy-A) y da como resultado la inanición de dTTP. Está ampliamente aceptado que esta conversión es una de las vías necesarias para lograr los efectos citotóxicos del 5-fluorouracilo y que la uracil fosforribosiltransferasa bacteriana de origen bacteriano es capaz de convertir el 5-fluorouracilo en el mismo metabolito activo que la orotato fosforibosiltransferasa. En ausencia de actividad UPRTasa o actividad OPRTasa, el 5-FU, originado de la desaminación del 5-FC por la CDasa, no se transforma en 5-FUMP citotóxico (Jund y Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615).

Como se describe en el presente documento, la divulgación proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos y polipéptidos que comprenden una fusión de un primer polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa y un segundo polipéptido que comprende actividad UPRT o o PrT. Tales construcciones de fusión son útiles para convertir uracilo, ^o un derivado del mismo, en un análogo monofosfato, y en particular 5-FU en 5-FUMP.

Como se describirá con más detalle a continuación, la divulgación se basa, al menos en parte, en la generación y expresión de nuevos polipéptidos que catalizan la conversión 5-FC a 5-FU. En un aspecto de la divulgación, se proporcionan nuevos polipéptidos que han sido diseñados para tener propiedades catalíticas mejoradas para la conversión de 5-FC a 5-FU. Tales polipéptidos incluyen variantes que se han alterado para incluir sustituciones de aminoácidos en residuos específicos. Si bien estas variantes se describirán con más detalle a continuación, se entiende que los polipéptidos de la divulgación pueden contener uno ^o más aminoácidos modificados. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa en, por ejemplo, (a) aumentar la semivida in vivo del polipéptido, (b) reducir ^o aumentar la antigenicidad del polipéptido, y (^c) aumentar la estabilidad de almacenamiento del polipéptido. Los aminoácidos son modificados, por ejemplo, co-traduccionalmente o post-traduccionalmente durante la producción recombinante (por ejemplo, glicosilación ligada a N en los motivos N - X - S / T durante la expresión en células de mamífero) ^o modificada por medios sintéticos. Por consiguiente, una proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula "mutante", "variante" o "modificada" significa una proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula, que ha sido alterado ^o derivado, ^o que es de alguna manera diferente ^o ha cambiado, respecto de una proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula original. Una proteína o enzima mutante o modificada suele, aunque no necesariamente, expresarse a partir de un polinucleótido o gen mutante.

Una "mutación" significa cualquier proceso ^o mecanismo que resulta en una proteína, enzima, polinucleótido, gen, ^o célula mutante. Esto incluye cualquier mutación en la que una proteína, enzima, polinucleótido o secuencia génica está alterada y cualquier cambio detectable en una célula que surja de tal mutación. Típicamente, una mutación se produce en un polinucleótido o secuencia génica, mediante mutaciones puntuales, deleciones o inserciones de residuos de nucleótidos simples o múltiples. Una mutación incluye alteraciones polinucleotídicas que surgen dentro de una región codificadora de proteínas de un gen, así como alteraciones en regiones fuera de una secuencia codificadora de proteínas, tal como, pero sin limitación, secuencias reguladoras ^o promotoras. Una mutación en un gen puede ser "silenciosa", es decir, no se refleja en una alteración de aminoácidos en la expresión, lo que conduce a una variante "conservadora de secuencia" del gen. Esto generalmente surge cuando un aminoácido corresponde a más de un codón.

L^os ejemplos no limitantes de un aminoácido modificado incluyen un aminoácido glicosilado, un aminoácido sulfatado, un aminoácido prenilado (por ejemplo, aminoácido farnesilado, geranilgeranilado), un aminoácido acetilado, un aminoácido acilado, un aminoácido pegilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido carboxilado, un aminoácido fosforilado, y similares. Las referencias adecuadas para guiar a un experto en la modificación de aminoácidos están repletas en toda la literatura. Ejemplos de protocolos se encuentran en Walker (1998) Protein Protocols en CD-ROM (Humana Press, Towata, N.J.).

En el presente documento se describen procedimientos recombinantes para la producción, el aislamiento y el uso de I^os polipéptidos y polinucleótidos de CD modificados de la divulgación. Además de la producción recombinante, los polipéptidos pueden producirse por síntesis peptídica directa utilizando técnicas en fase sólida (por ejemplo, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis (w H Freeman Co, San Francisco); y Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc.

85: 2149-2154). La síntesis de péptidos se puede realizar utilizando técnicas manuales ^o por automatización. Se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo, utilizando el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

A modo de ilustración, las secuencias de ácido nucleico que codifican las UPRTasas de E. ^coIÍ (Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204, 51-56), de Lactococcus lactis (Martinussen y Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457­ 6463), de Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol. Int 41, 1117-1124) y de Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 271-274) se puede utilizar en el contexto de la divulgación. Sin embargo, se prefiere el uso de una UPRTasa de levadura y, en particular, la codificada por el gen FUR1 de S. cerevisiae, cuya secuencia se desvela en Kern et al. (1990, Gene 88, 149-157). A modo de indicación, las secuencias de I^os genes y las de las UPRTasas correspondientes se pueden encontrar en la literatura y en I^os bancos de datos especializados (SWISSPROT, EMBL, Genbank Medline, etc.).

Una "proteína" ^o "polipéptido", términos que se usan indistintamente en el presente documento, comprende una ^o más cadenas de bloques componentes químicos denominados aminoácidos que están unidos entre ^sí por enlaces químicos llamados enlaces peptídicos. Una "enzima" significa cualquier sustancia, preferentemente compuesta en ^su totalidad o en gran parte por proteínas, que cataliza o promueve, más o menos específicamente, una o más reacciones químicas o bioquímicas. El término "enzima" también puede referirse a un polinucleótido catalítico (por ejemplo, ARN o ADN). Una proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula "nativa" o "tipo salvaje", significa una proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula, significa una proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula que se produce en la naturaleza.

Por consiguiente, se proporcionan polipéptidos aislados ^o recombinantes que comprenden la SEQ ID NO: 2 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en A23L, V108I, I140L y cualquier combinación de las mismas. En aún otro aspecto de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 4 e incluye hasta 50, 25, 10 o 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos, excluyendo Ios restos: (a) 23, 108 y 140. En general, Los polipéptidos proporcionados en el presente documento muestran la actividad de citosina desaminasa útil para convertir 5-FC en 5-FU.

La divulgación también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 4, donde el polipéptido tiene una leucina en la posición 23, una isoleucina en la posición 108 y una leucina en la posición 140, y donde el polipéptido tiene actividad citosina desaminasa. En aún otro aspecto de la divulgación, el polipéptido comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4.

La divulgación proporciona además construcciones de fusión que comprenden uno cualquiera de Ios polipéptidos anteriores unidos operativamente a una uracil fosforribosiltransferasa (UPRT) ^o una oratato fosforibosiltransferasa (OPRT). En un aspecto de la divulgación, la construcción de fusión comprende un primer polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en A23L, V108I, I140l y cualquier combinación de las mismas unidas a un segundo polipéptido que tiene actividad UPRT ^u OPRT. En aún otro aspecto de la divulgación, la construcción de fusión comprende un primer polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4 e incluye hasta 50, 25, 10 ^o 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos, excluyendo I^os restos: 23, 108 y 140, donde el primer polipéptido está unido a un segundo polipéptido que tiene actividad UPRT ^u OPRT. La divulgación también proporciona una construcción de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa y que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 4, donde el polipéptido tiene una leucina en la posición 23, una isoleucina en la posición 108 y una leucina en la posición 140, y donde el primer polipéptido está unido a un segundo polipéptido que comprende actividad UPRT o OPRT. En un aspecto de la divulgación, Ios polipéptidos que tienen actividad UPRT u OPRT comprenden una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 8 y lO, respectivamente, ^o variantes de I^os mismos. En aún otro aspecto de la divulgación, un primer polipéptido que comprende actividad citosina desaminasa está unido a un polipéptido que tiene actividad UPRT u o PrT, donde Ios polipéptidos están separados por un enlazador peptídico. En otro aspecto de la divulgación, la construcción de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 12 o 13.

La expresión "unido operativamente" o "asociado operativamente" se refiere a un enlace o asociación funcional entre una secuencia reguladora y el polinucleótido regulado por la secuencia reguladora o entre dos polipéptidos o polinucleótidos diferentes que codifican tales polipéptidos.

Una construcción de fusión que comprende un polipéptido que tiene actividad de CD y un polipéptido que comprende actividad UPRT u Op RT puede modificarse para que contenga un sitio de escisión para ayudar en la recuperación de proteínas u otro resto enlazador. Típicamente, un enlazador será un resto enlazador peptídico. La longitud del resto enlazador se elige para optimizar la actividad biológica del polipéptido CD y el polipéptido UPRT ^u OPRT y puede determinarse empíricamente sin experimentación excesiva. El resto enlazador debe ser lo suficientemente largo y flexible para permitir que un sustrato interaccione con el polipéptido CD y un sustrato con el polipéptido UPRT o OPRT. Un resto enlazador es un péptido de entre aproximadamente uno y 30 residuos de aminoácidos de longitud, típicamente entre aproximadamente dos y 15 residuos de aminoácidos. Ejemplos de grupos enlazadores son --Gly - Gly--, GGGGS (SEQ ID NO:22), (GGGGS)ⁿ (SEQ ID NO:23), (SGGGG)ⁿ (SEQ ID NO: 24), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:25), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:26), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 27), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:28) o EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:29). Los restos de unión se describen, por ejemplo, en Huston et al., Proc. Nat'l (Acad. Sci 85:5879, 1988; Whitlow et al., Protein Engineering 6: 989, 1993; y Newton et al., Biochemistry 35:545, 1996. Otros enlazadores peptídicos adecuados son los descritos en las patentes de Estados Unidos n.04.751.18o y 4.935.233. Una secuencia de ADN que codifica un enlazador peptídico deseado puede insertarse entre, y en el mismo marco de lectura que un polinucleótido que codifica un polipéptido CD seguido de un polipéptido UPRT ^o OPRT, utilizando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica el enlazador puede ligarse entre dos polinucleótidos codificantes. En aspectos particulares de la divulgación, un polipéptido de fusión comprende de dos a cuatro dominios separados (por ejemplo, un dominio CD y un UPRT ^u OPRT) están separados por enlazadores peptídicos.

"Sustitución conservadora de aminoácidos" ^o, simplemente, "variaciones conservadoras" de una secuencia particular se refiere al reemplazo de un aminoácido, ^o serie de aminoácidos, con secuencias de aminoácidos esencialmente idénticas. Un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones ^o adiciones individuales que alteran, añaden ^o eliminan un solo aminoácido o un porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada dan lugar a "variaciones conservadoras" donde las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.

Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un grupo de sustitución conservadora incluye alanina (A), serina (S) y treonina (T). Otro grupo de sustitución conservadora incluye ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E). Otro grupo de sustitución conservadora incluye asparagina (N) y glutamina (Q). Aún otro grupo de sustitución conservadora incluye arginina (R) y lisina (K). Aún otro grupo de sustitución conservadora incluye isoleucina, (I), leucina (L), metionina (M) y valina (V). Otro grupo de sustitución conservadora incluye fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

Por lo tanto, "sustituciones de aminoácidos conservadoras" de una secuencia polipeptídica enumerada (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, etc.) incluyen sustituciones de un porcentaje, típicamente menos del lO %, de los aminoácidos de la secuencia polipeptídica, con un aminoácido seleccionado de forma conservadora del mismo grupo de sustitución conservadora. Por consiguiente, una variación sustituida de forma conservadora de un polipéptido de la divulgación puede contener 1OO, 75, 50, 25 o 1O sustituciones con una variación sustituida de forma conservadora del mismo grupo de sustitución conservadora.

La "actividad" de una enzima es una medida de ^su capacidad para catalizar una reacción, es decir, para "funcionar", y puede expresarse como la velocidad a la que se produce el producto de la reacción. Por ejemplo, la actividad enzimática se puede representar como la cantidad de producto producido por unidad de tiempo ^o por unidad de enzima (por ejemplo, concentración o peso), o en términos de afinidad o constantes de disociación. Como se usa indistintamente en el presente documento, una "actividad citosina desaminasa", "actividad biológica de la citosina desaminasa" ^o "actividad funcional de una citosina desaminasa", se refiere a una actividad ejercida por una proteína citosina desaminasa, o polipéptido de la divulgación, en un sustrato de citosina desaminasa, según lo determinado in ^{vivo o} in vitro, de acuerdo con las técnicas estándar. L^os ensayos para medir la actividad de la citosina desaminasa son conocidos en la técnica. Por ejemplo, una actividad de citosina desaminasa puede medirse determinando la tasa de conversión de 5-FC en 5-FU ^o de citosina en uracilo. La detección de 5-FC, 5-FU, citosina y uracilo se puede realizar por cromatografía y otros procedimientos conocidos en la técnica.

Un experto en la técnica apreciará que muchas variaciones conservadoras de las construcciones de ácido nucleico que se describen producen una construcción funcionalmente idéntica. Por ejemplo, tal como se ha tratado anteriormente, debido a la degeneración del código genético, "sustituciones silenciosas "(es decir, sustituciones en una secuencia de ácido nucleico que no producen una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido. Los expertos en la técnica apreciarán que, debido a la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de citosina desaminasa modificada de la divulgación, algunas de las cuales tienen una identidad sustancial con las secuencias de ácido nucleico desveladas explícitamente en el presente documento. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todos el aminoácido arginina. Por lo tanto, en cada posición en los ácidos nucleicos de la divulgación, donde una arginina está especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente sin alterar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN corresponde a T en una secuencia de ADN.

De forma similar, "sustituciones conservadoras de aminoácidos" en uno ^o unos pocos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos están sustituidos con diferentes aminoácidos con propiedades altamente similares, también se identifican fácilmente como muy similares a una construcción desvelada. Dichas variaciones conservadoras de cada secuencia desvelada son una característica de Ios polipéptidos proporcionados en el presente documento.

Las "variantes conservadoras" son proteínas o enzimas en las que un residuo de aminoácido dado se ha modificado sin alterar la conformación y función general de la proteína ^o enzima, incluyendo, pero sin limitación, la sustitución de un aminoácido por uno con propiedades similares, incluyendo caracteres polares ^o no polares, tamaño, forma y carga. Los aminoácidos distintos de Ios indicados como conservados pueden diferir en una proteína o enzima, de modo que el porcentaje de similitud de la secuencia de la proteína o aminoácido entre cualquiera de las dos proteínas de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, al menos el 30 %, al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, ^o al menos el 90 %, según lo determinado de acuerdo con un esquema de alineación. Como se cita en el presente documento, "similitud de secuencia" significa el grado en que las secuencias de nucleótidos o de proteínas están relacionadas. El grado de similitud entre dos secuencias puede basarse en el porcentaje de identidad de secuencia y / o conservación. La "identidad de secuencia" en el presente documento significa el grado en que dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos son invariables. "Alineación de secuencias" significa el proceso de alinear dos o más secuencias para lograr niveles máximos de identidad (y, en el caso de secuencias de aminoácidos, conservación) con el fin de evaluar el grado de similitud. Se conocen numerosos procedimientos para alinear secuencias y evaluar la similitud / identidad en la técnica, tales como, por ejemplo, el procedimiento de Cluster, donde la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN, así como BLASTN, BlaSt P y FASTA (Lipman y Pearson, 1985; Pearson y Lipman, 1988). Al usar todos estos programas, las configuraciones preferidas son aquellas que resultan en la mayor similitud de secuencia. Por ejemplo, la "identidad" o "porcentaje de identidad" con respecto a un par particular de secuencias de aminoácidos alineadas puede referirse al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos que se obtiene mediante análisis ClustalW (versión W 1.8 disponible en el Instituto Europeo de Bioinformática, Cambridge, Reino Unido), contando el número de coincidencias idénticas en la alineación y dividiendo dicho número de coincidencias idénticas por la mayor de (i) la longitud de las secuencias alineadas, y (ii) 96, y utilizando I^os siguientes parámetros ClustalW predeterminados para lograr alineaciones pareadas lentas / precisasGap Penalización abierta: 10; penalización por extensión huecos: 0,10; matriz del peso de la proteína: serie Gonnet; matriz del peso del ADN: IUB; alternar alineaciones pareadas lentas / rápidas = alineación le n ta o c o m p l e t a .

Dos secuencias están "alineadas de manera óptima" cuando están alineadas para una puntuación de similitud utilizando una matriz de sustitución de aminoácidos definida (por ejemplo, BLOSUM62), la penalización de existencia de brecha y la penalización de extensión de brecha para llegar a la puntuación más alta posible para ese par de secuencias. Las matrices de sustitución de aminoácidos y ^{su uso} para cuantificar la similitud entre dos secuencias son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Dayhoff et al. (1978) "A model of evolutionary change in proteins" en "Atlas of Protein Sequence and structure," V^oI. 5, Suppl. 3 (ed. M. ^o . Dayhoff), pp. 345-352. Nati Biomed. Res. Found., Washington, D.C. y Henikoffet al. (1992) Proc. Nat'l. Acad. Scí. USA 89: 109i 5-10919. La matriz BLOSUM62 (FIG. 10) se utiliza a menudo como una matriz de sustitución de puntuación predeterminada en I^os protocolos de alineación de secuencias como Gapped BLAST 2.0. La penalización por existencia de brecha se impone por la introducción de una brecha de un solo aminoácido en una de las secuencias alineadas, y la penalización por extensión de brecha se impone por cada posición de aminoácido vacía adicional insertada en una brecha ya abierta. La alineación se define por las posiciones de Ios aminoácidos de cada secuencia donde la alineación comienza y termina, y, opcionalmente, por la inserción de una brecha ^o múltiples brechas en una ^o ambas secuencias para llegar a la puntuación más alta posible. Si bien la alineación y puntuación óptimas se pueden lograr manualmente, el proceso se facilita mediante el uso de un algoritmo de alineación implementado por ordenador, por ejemplo, BLAST 2.0 con huecos, descrito en Altschul et al. (1997) N^ucí. Acids Res. 25: 3389-3402, y se puso a disposición del público en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Las alineaciones óptimas, incluyendo múltiples alineaciones, se puede preparar utilizando, por ejemplo, PSI-BLAST, disponible a través del sitio web de NCBI y descrito por Altschul et al. (i 997) Nucí. Acids Res. 25:3389-3402.

Con respecto a una secuencia de aminoácidos que está alineada de manera óptima con una secuencia de referencia, un residuo de aminoácido "corresponde a" la posición en la secuencia de referencia con la cual el residuo está emparejado en la alineación. La "posición" se denota mediante un número que identifica secuencialmente cada aminoácido en la secuencia de referencia en función de ^su posición en relación con el extremo N-terminal. Debido a las deleciones, inserciones, truncamientos, fusiones, etc., que deben tenerse en cuenta al determinar una alineación óptima, en general, el número de residuos de aminoácidos en una secuencia de prueba como se determina simplemente contando desde el N-terminal no será necesariamente el mismo que el número de su posición correspondiente en la secuencia de referencia. Por ejemplo, en un caso en el que hay una deleción en una secuencia de prueba alineada, no habrá ningún aminoácido que corresponda a una posición en la secuencia de referencia en el sitio de la deleción. Cuando hay una inserción en una secuencia de referencia alineada, dicha inserción no corresponderá a ninguna posición de aminoácido en la secuencia de referencia. En el caso de truncamientos o fusiones, puede haber tramos de aminoácidos en la secuencia de referencia o alineada que no corresponden a ningún aminoácido en la secuencia correspondiente.

Las modificaciones no conservadoras de un polipéptido particular son aquellas que sustituyen cualquier aminoácido no caracterizado como una sustitución conservadora. Por ejemplo, cualquier sustitución que cruce Ios límites de Ios seis grupos establecidos anteriormente. Estos incluyen sustituciones de aminoácidos básicos o ácidos por aminoácidos neutros (por ejemplo, Asp, GI^u, Asn ^o Gln por Val, lle, Leu ^o Met), aminoácidos aromáticos por aminoácidos básicos o ácidos (por ejemplo, Phe, Tyr o Trp por Asp, Asn, GIu o Gln) o cualquier otra sustitución que no reemplace un aminoácido con un aminoácido similar. Las cadenas laterales básicas incluyen lisina (K), arginina (R), histidina (H); las cadenas laterales ácidas incluyen ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); las cadenas laterales polares sin carga incluyen glicina (G), asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), cisteína (C); las cadenas laterales no polares incluyen alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (l), prolina (P), fenilalanina (F), metionina (M), triptófano (W); las cadenas laterales beta-ramificadas incluyen treonina (T), valina (V), isoleucina (l); las cadenas laterales aromáticas incluyen tirosina (Y), fenilalanina (F), triptófano (W), histidina (H). Por consiguiente, algunos residuos de aminoácidos en posiciones específicas en un polipéptido están "excluidos" de las sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, la divulgación proporciona un polipéptido que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO:4. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido puede alterarse con sustituciones conservadoras de aminoácidos como se ha descrito anteriormente, sin embargo, es deseable que ciertos residuos queden sin sustituir, como I^os residuos en las posiciones 23, 108 y 140. Una proteína, enzima, polinucleótido, gen o célula original es cualquier proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula, de la cual cualquier otra proteína, enzima, polinucleótido, gen, o célula, deriva o se fabrica, utilizando cualquier procedimiento, herramienta o técnica, y si el padre es o no nativo o mutante. Un gen o polinucleótido original codifica una proteína ^o enzima original.

Un polinucleótido, polipéptido ^u otro componente está "aislado" cuando está parcial ^o completamente separado de I^os componentes con I^os que normalmente está asociado (otras proteínas, ácidos nucleicos, células, reactivos sintéticos, etc.). Un ácido nucleico o polipéptido es "recombinante" cuando es artificial o está modificado, o deriva de una proteína ^o ácido nucleico artificial ^o modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que se inserta en un vector ^o en cualquier otra ubicación heteróloga, por ejemplo, en un genoma de un organismo recombinante, de modo que no se asocia con secuencias de nucleótidos que normalmente flanquean al polinucleótido, ya que se encuentra en la naturaleza, es un polinucleótido recombinante. Una proteína expresada in vitro ^o in ^vivo a partir de un polinucleótido recombinante es un ejemplo de un polipéptido recombinante. Del mismo modo, una secuencia de polinucleótidos que no aparece en la naturaleza, por ejemplo, una variante de un gen de origen natural, es recombinante.

En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de citosina desaminasa o construcción de fusión de la divulgación. En un aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado ^o recombinante referido en el presente documento como "polinucleótidos optimizados para CD", "polinucleótidos CD" o "polinucleótidos de fusión CD". Los términos "polinucleótido", "secuencia de nucleótidos" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan para referirse a un polímero de nucleótidos (A, C, T, U, G, etc. o análogos de nucleótidos artificiales o naturales), por ejemplo, ADN o ARN, o una representación de Ios mismos, por ejemplo, una cadena de caracteres, etc., dependiendo del contexto relevante. Un polinucleótido dado o un polinucleótido complementario se puede determinar a partir de cualquier secuencia de nucleótidos especificada.

Un aspecto de la divulgación se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una citosina desamina o un polipéptido de citosina desaminasa mutante ^o partes biológicamente activas del mismo. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" ^o "polinucleótido" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria ^o bicatenaria. En un aspecto de la divulgación, un polinucleótido CD optimizado o polinucleótido CD comprende formas recombinantes, modificadas o aisladas de ácidos nucleicos de origen natural aislados de un organismo, por ejemplo, una cepa bacteriana ^o de levadura. L^os polinucleótidos de CD de ejemplo incluyen aquellos que codifican I^os polipéptidos de tipo salvaje expuestos en la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto de la divulgación, Ios polinucleótidos de CD se producen mediante diversificación, por ejemplo, recombinación y / o mutación de uno o más polinucleótidos de CD de origen natural, aislados ^o recombinantes. Como se describe con más detalle en otra parte del presente documento, es posible generar polinucleótidos de CD diversificados que codifican polipéptidos de CD con características funcionales superiores, por ejemplo, aumento de la función catalítica, mayor estabilidad ^o mayor nivel de expresión, que un polinucleótido de CD utilizado como sustrato o padre en el proceso de diversificación. Los polinucleótidos de ejemplo incluyen las SEQ ID NO : 3 y 5 y aquellos que codifican Ios polipéptidos variantes de CD de la divulgación.

Los polinucleótidos de la divulgación tienen diversos de usos en, por ejemplo, la producción recombinante (es decir, expresión) de Ios polipéptidos de CD de la divulgación y como sustratos para una mayor generación de diversidad, por ejemplo, reacciones de recombinación o reacciones de mutación para producir homólogos de CD nuevos y / o mejorados, y similares.

Es importante tener en cuenta que ciertas utilidades específicas, sustanciales y creíbles de Ios polinucleótidos de CD no requieren que el polinucleótido codifique un polipéptido con actividad de CD sustancial ^o incluso actividad de CD variante. Por ejemplo, Ios polinucleótidos de CD que no codifican enzimas activas pueden ser fuentes valiosas de polinucleótidos originales para su uso en procedimientos de diversificación para llegar a variantes de polinucleótidos de CD, ^o polinucleótidos que no son de CD, con propiedades funcionales deseables (por ejemplo, kcat alta ^o kcat/Km, Km baja, alta estabilidad frente al calor u otros factores ambientales, altas tasas de transcripción o traducción, resistencia a la escisión proteolítica, etc.).

L^os polinucleótidos de CD, incluyendo las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de CD y variantes de los mismos, fragmentos de polipéptidos de CD, proteínas de fusión relacionadas o equivalentes funcionales de los mismos, se utilizan en moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión de los polipéptidos de CD en las células huésped apropiadas, tales como células bacterianas. Debido a la degeneración inherente del código genético, También se pueden usar otras secuencias de ácido nucleico que codifican sustancialmente la misma ^o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente para clonar y expresar los polinucleótidos de CD. La expresión "célula huésped", como se usa en el presente documento, incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación con una construcción de ácido nucleico. El término "transformación" significa la introducción de un gen (es decir, extrínseco ^o extracelular), secuencia de ADN ^o ARN extraños en una célula huésped, de modo que la célula huésped expresará el gen o secuencia introducidos para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducidos. El gen o secuencia introducidos pueden incluir secuencias reguladoras ^o de control, tales como las secuencias de inicio, terminación, promotor, señal, secreción u otras secuencias utilizadas por la maquinaria genética de la célula. Una célula huésped que recibe y expresa el ADN ^o ARN introducido se ha "transformado" y es un "transformante" ^o un "clon". El ^a D^{n o} ARN introducido en una célula huésped puede provenir de cualquier fuente, incluidas las células del mismo género ^o especie que la célula huésped, ^o las células de un género ^o especie diferente.

Como apreciarán los expertos en la materia, puede ser ventajoso modificar una secuencia de codificación para mejorar ^su expresión en un huésped particular. El código genético es redundante con 64 codones posibles, pero la mayoría de los organismos utilizan preferentemente un subconjunto de estos codones. L^os codones que se utilizan con mayor frecuencia en una especie se llaman codones óptimos y los que no se utilizan muy a menudo se clasifican como codones raros ^o de bajo ^uso (consulte, por ejemplo, Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72). L^os codones se pueden sustituir para reflejar el uso de codones preferido del huésped, un proceso a veces llamado "optimización de codones" ^o "control del sesgo de codones de especies".

Se pueden preparar secuencias codificantes optimizadas que contienen codones preferidos por un huésped procariótico ^o eucariótico particular (véase también Murray et al. (1989) N^ucI. Acids Res. 17: 477-508), por ejemplo, para aumentar la velocidad de traducción o para producir transcritos de ARN recombinante que tengan propiedades deseables, como una vida media más larga, en comparación con I^os transcritos producidos a partir de una secuencia no optimizada. Los codones de terminación de la traducción también pueden modificarse para reflejar las preferencias del huésped. Por ejemplo, Ios codones de terminación preferidos para S. cerevisiae y mamíferos son UAA y UGA, respectivamente. El codón de terminación preferido para plantas monocotiledóneas es UGA, mientras que Ios insectos y E. coli prefieren usar UAA como el codón de terminación (Dalphin et al. (1996) NucI. Acids Res.

24: 216-218).

El sesgo del uso del codón se refiere a las diferencias entre Ios organismos en la frecuencia de aparición de Ios codones en las secuencias de ADN de codificación genética (genes). Un codón es una serie de tres nucleótidos (tripletes) que codifica un residuo de aminoácido específico en una cadena polipeptídica. Porque hay cuatro nucleótidos en el ADN, adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T), hay 64 posibles tripletes que codifican 20 aminoácidos y tres codones de terminación de la traducción (sin sentido). Debido a esta redundancia, todos menos dos aminoácidos están codificados por más de un triplete. L^os diferentes organismos a menudo muestran preferencias particulares para uno de Ios varios codones que codifican el mismo aminoácido. Cómo surgen estas preferencias es un área muy debatida de la evolución molecular.

En general, se reconoce que las preferencias de codón reflejan un equilibrio entre I^os sesgos mutacionales y la selección natural para la optimización de la traducción. Los codones óptimos en microorganismos de rápido crecimiento, como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), reflejan la composición de su respectivo conjunto de ARNt genómico. Se cree que Ios codones óptimos ayudan a lograr velocidades de traducción más rápidas y una alta precisión. Como resultado de estos factores, se espera que la selección traduccional sea más fuerte en genes altamente expresados, como es de hecho el caso de Ios organismos antes mencionados. En otros organismos que no muestran altas tasas de crecimiento ^o que presentan genomas pequeños, la optimización del uso de codones normalmente está ausente y las preferencias de codones están determinadas por I^os sesgos mutacionales característicos observados en ese genoma en particular. Ejemplos de esto son Homo sapiens (humano) y Helicobacter pylori. L^os organismos que muestran un nivel intermedio de optimización del ^uso de codones incluyen Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), Caenorhabditis elegans (gusano nematodo) ^o Arabidopsis thaliana (berro de pared).

El término "secuencias optimizadas de codones" generalmente se refiere a secuencias de nucleótidos que se han optimizado para una especie de huésped en particular al reemplazar cualquier codón que tenga una frecuencia de uso de menos de aproximadamente el 20%. Las secuencias de nucleótidos que se han optimizado para la expresión en una especie huésped dada mediante la eliminación de secuencias de poliadenilación espurias, eliminación de señales de empalme de exón / Intrón, eliminación de repeticiones similares a transposones y / u optimización del contenido de GC además de la optimización de codones se denominan en el presente documento "secuencias mejoradas de expresión".

Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, un polinucleótido comprende un codón de molécula optimizado para la traducción en una célula humana. Por ejemplo, las SEQ ID NO: 3 y 5 comprenden secuencias que se han optimizado para producir citosina desaminasa en una célula huésped humana.

La divulgación proporciona así un polinucleótido optimizado en codón humano que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa. Un polinucleótido optimizado por codones humanos de la divulgación (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5) puede incluir además mutaciones adicionales que dan como resultado una sustitución conservadora de aminoácidos y / o una actividad o estabilidad mejoradas del polipéptido codificado. Por ejemplo, las mutaciones en las posiciones 23, 108 y 140 del polipéptido que comprende la SEQ ID NO:6 proporcionan una mayor termoestabilidad. Por consiguiente, la divulgación proporciona un polinucleótido optimizado en codón humano que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa y una mayor termoestabilidad. En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido optimizado en codón humano comprende una secuencia que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 4, donde los codones que codifican los aminoácidos del polipéptido se han optimizado para la expresión en una célula humana. En otro, un polinucleótido de la divulgación comprende las SEC ⁱD NO: 3 ^o 5.

La divulgación proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido de citosina desaminasa ^o un polinucleótido o mutante optimizado de codón unido a un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad UPRT u OPRT.

Un polinucleótido de la divulgación que comprende, por ejemplo, una secuencia que codifica el polipéptido de las SEQ ID NO: 4, 8, 10, 12, 14, 16 o 18; o que tiene la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 o 17, o una porción de los mismos, se puede aislar y generar utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en el presente documento.

Un polinucleótido de la divulgación puede amplificarse utilizando ADN^c, ARNm ^o, como alternativa, ADN genómico, como molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación por PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencia de ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos correspondientes a secuencias de nucleótidos pueden prepararse mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automático. En algunos aspectos de la divulgación, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación comprende una molécula de ácido nucleico que es complementaria de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido expuesto en cualquiera de las SEQ ID ⁿO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, ^o 18, ^o que tiene la secuencia nucleotídica expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO :1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, ^o 17.

En otro aspecto de la divulgación, un polinucleótido aislado de la divulgación comprende una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido expuesto en cualquiera de las SEQ NO: 4, l2, 14, 16 ^o 18, ^o que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO:3, 5, 11, 13, 15 ^o 17. En otros aspectos de la divulgación, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 o 600 nucleótidos de longitud. Las moléculas de ácido nucleico son "hibridables" entre ^sí cuando al menos una hebra de un polinucleótido puede unirse a otro polinucleótido en condiciones de rigurosidad definidas. Se determina la rigurosidad de la hibridación, por ejemplo, por (a) la temperatura a la que se realiza la hibridación y / o lavado, y (b) la fuerza iónica y la polaridad (por ejemplo, formamida) de las soluciones de hibridación y lavado, así como otros parámetros. La hibridación requiere que los dos polinucleótidos contienen secuencias sustancialmente complementarias; dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, sin embargo, se pueden tolerar emparejamientos erróneos. Típicamente, la hibridación de dos secuencias en alta rigurosidad (como, por ejemplo, por ejemplo, en una solución acuosa de 0,5 X SSC a 650C) se requiere que las secuencias exhiban un alto grado de complementariedad en toda ^su secuencia. Las condiciones de rigurosidad intermedia (tales como, por ejemplo, una solución acuosa de 2 X SSC a 65 ° C) y baja rigurosidad (como, por ejemplo, una solución acuosa de 2 X SSC a 55 oc), requieren correspondientemente menos complementariedad global entre las secuencias de hibridación (1 X SSC es NaCl 0,15 M, citrato Na 0,015 M). Las moléculas de ácido nucleico que hibridan incluyen aquellas que hibridan en condiciones de rigurosidad adecuadas y que codifican polipéptidos o enzimas que tienen la misma función, tal como la capacidad de catalizar la conversión de 5-fluorocitosina (5-F^c ) en 5-flurouracilo (5-FU), de la divulgación. Además, la expresión "hibrida en condiciones rigurosas" pretende describir las condiciones para la hibridación y el lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos al menos el 30 %, 40 %, 50%, o el 60% de homólogos entre sí, típicamente permanecen hibridados entre ^sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente al menos aproximadamente 80 %, incluso más preferentemente, al menos aproximadamente el 85 % o 90 % de los homólogos entre sí, típicamente permanecen hibridados entre sí. En algunos casos, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido expuesto en cualquiera de las SEC ID NO: 4, 12, 14, 16 o 18, o que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15 o 17. Tal como se utiliza en el presente documento, una molécula de ácido nucleico "de origen natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).

El experto en la materia apreciará que pueden introducirse cambios por mutación en las secuencias de nucleótidos de cualquier polinucleótido que codifica un polipéptido expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 , 14, 16 ^o 18, ^o que tienen la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 o 17, conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas. En algunos casos, la alteración conducirá a una función alterada del polipéptido. En otros casos, el cambio no alterará la capacidad funcional del polipéptido codificado. En general, Las sustituciones que no alteran la función de un polipéptido incluyen sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos "no esenciales". Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que puede alterarse de la secuencia original sin alterar la actividad biológica del polipéptido resultante, por ejemplo, catalizando la conversión de 5-FC en 5-FU.

También se contemplan las situaciones en las que es deseable alterar la actividad de un polipéptido original de manera que el polipéptido tenga una actividad nueva o aumentada sobre un sustrato particular o una mayor estabilidad o una menor degradación. Se entiende que estas sustituciones de aminoácidos generalmente no constituirán sustituciones "conservadoras". En cambio, estas sustituciones constituyen sustituciones no conservadoras introducidas en una secuencia para obtener una actividad nueva ^o mejorada. Por ejemplo, la SEQ ID NO:1 proporciona la secuencia de ácido nucleico original para la citosina desaminasa de S. cerevisae (la SEC ID NO: 2 proporciona el polipéptido correspondiente). La SEQ ID NO: 3 proporciona la secuencia de ácido nucleico de una secuencia mutante que incluye sustituciones de aminoácidos que imparten mayor estabilidad al polipéptido. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 proporciona una molécula "original" de ácido nucleico a partir de la cual se pueden hacer mutaciones para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido modificado que incluye sustituciones de aminoácidos.

También se entiende que un polipéptido modificado puede constituir un polipéptido "original" a partir del cual se pueden realizar sustituciones adicionales. Por consiguiente, un polipéptido original y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido original, incluye polipéptidos modificados y no solo secuencias "de tipo salvaje". Por ejemplo, el polinucleótido de la SEQ ID NO: 5 es un polinucleótido modificado con respecto a la s Eq ID nO: 1 (es decir, el polinucleótido "original"). De manera similar, el polinucleótido de la SEQ ID NO: 3 es un polinucleótido modificado con respecto a la SEQ ID NO: 5. Por consiguiente, la SEQ ID NO: 5 es la secuencia original de SEQ ID NO: 3.

Los métodos mutacionales de generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "ln vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein y Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Cárter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J.

237:1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis utilizando moldes que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Nati. Acad. Scí. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; y Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245); oligonucleotide-directed mutagenesis (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller y Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller y Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zoller & Smith (1987) "Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate" Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" N^ucí. Acids Res. 13: 8749­ 8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" N^ucí. Acids Res. 13: 8765-8787; Nakamaye y Eckstein (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" N^ucí. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" N^ucí. Acids Res. 16:791-802; y Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" N^ucí. Acids Res. 16: 803-814); mutagénesis utilizando ADN dúplex con huecos (Kramer et al. (1984) "The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucí. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer y Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA" 154:350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucí. Acids Res. 16: 7207; y Fritz et al. (1988) "Oligonucleotidedirected construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucí. Acids Res. 16: 6987-6999).

Métodos adecuados adicionales incluyen reparación de desajúste de puntos (Kramer et al. (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), mutagénesis usando cepas de hospedador deficientes en la reparación (Cárter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucí. Acids Res. 13: 4431-4443; y Cárter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382­ 403), mutagénesis por deleción (Eghtedarzadeh & Henikoff (1986) "Use of oligonucleotides to genérate large deletions" NucI. Acids Res. 14: 5115), selección de restricción y purificación de restricción (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. S^oc. Lond. A 317: 415-423), mutagénesis por síntesis génica total (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" N^ucI. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323; y Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis" N^ucI. Acids Res. 13: 3305-3316); reparación de rotura de doble hebra (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinión in Biotechnology 4:450-455; y "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Nati. Acad. Scí. USA, 83:7177-7181). Se pueden encontrar detalles adiciónales sobre muchos de Ios métodos anteriores en Methods in Enzymology Volume 154, que también describe controles útiles para solucionar problemas con varios métodos de mutagénesis.

Se pueden encontrar detalles adiciónales sobre varios métodos de generación de diversidad en las siguientes patentes de Estados Unidos, publicaciones del PCT, y publicaciones de la EPO: patente de Estados Unidos n.05.605.793 concedida a Stemmer (Feb. 25, 1997), "Methods for In vitro Recombination;" patente de Estados Unidos n.o 5.811.238 concedida a Stemmer et al. (Sep. 22, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" patente de Estados Unidos n.o 5.830.721 concedida a Stemmer et al. (Nov.3, 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" patente de Estados Unidos n.o 5.834.252 concedida a Stemmer et al. (Nov. 10, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction;" patente de Estados Unidos n.o 5.837.458 concedida a Minshull, et al. (N^ov. l7, 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" el documento WO 96/33207 de Stemmer y Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction;" el documento WO 97/20078 de Stemmer and Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" documento WO 97/35966 de Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" documento WO 99/41402 de Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors;" el documento WO 99/41383 de Punnonen et al. "Antigen Library Immunization;" documento WO 99/41369 de Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering;" documento WO 99/41368 de Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines;" documento EP 752008 de Stemmer and Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" documento EP 093267^o de Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;" el documento WO 99/23107 de Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;" el documento WO 99/21979 de Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors;" el documento WO 98/31837 de del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination;" el documento WO 98/27230 de Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering;" el documento WO 98/13487 de Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection;" el documento WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries;" el documento WO 00/09679, "Methods for Obtaining in vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences;" el documento WO 98/42832 de Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers;" el documento WO 99/29902 de Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences;" documento WO 98/41653 de Vind, "An in vitro Method for Construction of a DNA Library;" documento w O 98/41622 de Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling;" documento WO 98/42727 de Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination;" documento WO 00/18906 de Patten et al., "shuffling of Codon-Altered Genes;" el documento WO 00/04190 de del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Recombination;" el documento WO 00/42561 de Crameri et al., "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination;" el documento WO 00/42559 de Selifonov and Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations;" documento WO 00/42560 de Selifonov et al., "Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics;" el documento WO 01/23401 de Welch et al., "Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling;" y documento WO 01/64864 "Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation" de Affholter.

También se proporcionan construcciones recombinantes que comprenden úna ^o más de las secuencias de ácido nucleico como se describe ampliamente en lo que antecede. Las construcciones comprenden un vector, tal como, un plásmido, un cósmido, un fago, virus, un cromosoma bacteriano artificial (CBA), un cromosoma de levadura artificial (CBA), un vector viral ^o similar, en el que se ha insertado un polinucleótido de la divulgación, en úna orientación hacia adelante o hacia atrás. Los expertos en la técnica conocen un número elevado de vectores y promotores adecuados y comercialmente disponibles. En un aspecto de la divulgación, el vector viral es un vector retroviral.

L^os términos "vector", "construcción de vector" y "vector de expresión" significan el vehículo por el cual úna secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extrañó) se puede introducir en úna célula huésped, con el fin de transformar el huésped y promover la expresión (por ejemplo, la transcripción y la traducción) de la secuencia introducida. Los vectores comprenden normalmente el ADN de un agente transmisible, dónde el ADN extrañó que codifica úna proteína se inserta mediante la tecnología de la enzima de restricción. Un tipo común de vector es un "plásmido", que generalmente es úna molécula de ADN bicatenario autocontenida que puede aceptar fácilmente el ADN (extraño) adicional y que se puede introducir fácilmente en una célula hospedadora adecuada. Se ha descrito un gran número de vectores, incluyendo vectores plasmídicos y fúngicos, para la replicación y / ^o expresión en una variedad de huéspedes eucarióticos y procarióticos. Los ejemplos no limitantes incluyen plásmidos pKK (Clonetech), plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc., Madison, W ís.), plásmidos pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, Calif ), ^o plásmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), y muchas células huésped adecuadas, utilizando los métodos divulgados ^o citados en el presente documento ^o conocidos de otra manera por los expertos en la materia en la técnica relevante. Los vectores de clonación recombinantes incluirán a menudo uno o más sistemas de replicación para la clonación o la expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedador, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno ^o más casetes de expresión.

Los términos "expresa" y "expresión" significan permitir u ocasionar que la información en un gen o secuencia de ADN llegue a manifestarse, por ejemplo, producir una proteína activando las funciones celulares implicadas en la transcripción y la traducción de un gen o secuencia de ADN correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en ^o mediante una célula para formar un "producto de expresión" tal como una proteína. El producto de expresión por ^sí mismo, por ejemplo, la proteína resultante, también puede decirse que se "expresa" por la célula. Un polinucleótido o polipéptido se expresa de forma recombinante, por ejemplo, cuando se expresa o produce en una célula hospedadora extraña bajo el control de un promotor extraño ^o nativo, ^o en una célula hospedadora nativa bajo el control de un promotor extraño.

L^os polinucleótidos proporcionados en el presente documento pueden incorporarse en uno cualquiera de diversos vectores de expresión adecuados para expresar un polipéptido. Los vectores adecuados incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral, tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorabia, adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus y muchos otros. Cualquier vector que transduce material genético en una célula y, si se desea replicación, que es replicable y viable en el huésped relevante puede usarse. Estos vectores de ácido nucleico pueden liberarse utilizando un sistema de administración no viral tal como se describe en et al. Brit J Pharm 157: 166-178 2009 o Kamimura y Liu J AAPS 10:589-595 (2008) o un sistema vírico como se describe a continuación.

En otro aspecto, el polinucleótido que codifica una citosina desaminasa o mutante de la misma se libera con un sistema de administración de genes que es un vector vírico derivado de virus. El vector viral puede ser replicante o no replicante, y puede ser un vector adenoviral, un vector de sarampión, un vector de herpes, un vector retroviral (incluido un vector lentiviral), un vector rabdoviral, tal como un vector viral de estomatitis vesicular, un vector de reovirus, un vector del virus del valle de Séneca, un vector de poxvirus (incluyendo vectores derivados de la viruela animal o vaccinia), un vector de parvovirus (incluyendo un vector de AAV), un vector de alfavirus u otro vector vírico conocido por un experto en la técnica (véase también, por ejemplo, Concepts in Genetic Medicine, ed. Boro Dropulic and Barrie Cárter, Wiley, 2008, Hoboken, NJ.; The Development of Human Gene Therapy, ed. Theodore Friedmann, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold springs Harbor, Nueva York, 1999; Gene and Cell Therapy, ed. Nancy Smyth Templeton, Marcel Dekker Inc., Nueva York, Nueva York, 2000 y Gene Therapy: Therapeutic Mechanism and Strategies, Nancy Smyth Templetone y Danilo D Lasic, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, 2000).

En un aspecto de la divulgación, el vector vírico puede ser un vector retroviral competente para la replicación capaz de infectar solo células de mamífero en replicación. L^os retrovirus se han clasificado de diversas maneras, pero la nomenclatura se ha normalizado en la última década (véase ICTVdB - The Universal Virus Database, v 4 en la World Wide Web (^www) en ncbi.nIm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/ y el libro de texto "Retroviruses" Eds Coffin, Hughs y Varmus, Cold Spring Harbor Press 1997. El vector retroviral competente para la replicación puede comprender un ortoretrovirus o más típicamente un vector de retrovirus gamma. En un aspecto, un vector retroviral competente para la replicación comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) en 5' al polinucleótido que codifica una citosina desaminasa. En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido que codifica una citosina desaminasa se encuentra en 3' con respecto a un polinucleótido env de un vector retroviral.

Por consiguiente, en otros aspectos de la divulgación, se proporcionan vectores que incluyen un polinucleótido de la divulgación. En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan células huésped transfectadas con una molécula de ácido nucleico de la divulgación, ^o un vector que incluye un polinucleótido de la divulgación. Las células huésped incluyen células eucarióticas tales como células de levadura, células de insecto ^o células de animales. Las células huésped también incluyen células procariotas tales como células bacterianas.

Como se ha tratado anteriormente, textos generales que describen técnicas de biología molecular útiles en el presente documento, incluyendo el uso de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes, incluyen a Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) ("Berger"); Sambrook et al., Molecular CIoning--A Laboratory Manual, 2a ed., VoI. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. ^y ., 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado hasta 1999) ("Ausubel"). Ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a personas expertas a través de procedimientos de amplificación in vitro, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (^lC^r ), la amplificación de la Qp-replicasa y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), por ejemplo, para la producción de Ios ácidos nucleicos homólogos de la divulgación se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel, así como en Mullís et al. (1987) patente de Estados Unidos n.04.683.202; Innis et al., eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.) ("Innis"); Arnheim y Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35: 1826; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077­ 1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Los procedimientos mejorados para la clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro se describen en Wallace et al., la patente de Estados Unidos n.o 5.426.039. L^os procedimientos mejorados para amplificar ácidos nucleicos grandes mediante PCR se resumen en Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 y en las referencias citadas en el mismo, donde se generan amplicones de PCR de hasta 40 kb. Un experto apreciará que esencialmente cualquier ARN puede convertirse en un ADN de doble cadena adecuado para la digestión de restricción, expansión de p Cr y secuenciación utilizando transcriptasa inversa y una polimerasa. Véase, por ejemplo, Ausubel, Sambrook y Berger, todos citados anteriormente.

También se proporcionan células huésped modificadas que se transducen (transforman ^o transfectan) con un vector proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión), así como la producción de polipéptidos de la divulgación mediante técnicas recombinantes. el vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped modificadas pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para activar Ios promotores, seleccionar transformantes, o amplificar un polinucleótido codificante. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son aquellas utilizadas anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para una persona normalmente experta en la técnica y en las referencias citadas en el presente documento, que incluyen, por ejemplo, Sambrook, Ausubel y Berger, así como, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3a ed. (Wiley-Liss, Nueva York) y las referencias citadas en Ios anteriores.

Pueden emplearse vectores para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese una proteína o polipéptido. Ejemplos de huéspedes de expresión apropiados incluyen: células bacterianas, como E. coIÍ, B. subtilis, estreptomices y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Neurospora crassa; células de insectos tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda; células de mamífero, tales como CHO, células COS, BHK, HEK 293 o melanoma de Bowes; o células vegetales o explantes, etc.

En I^os sistemas bacterianos, puede seleccionarse una serie de vectores de expresión dependiendo del ^uso del polipéptido de citosina desaminasa previsto. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de polipéptido de CD ^o fragmentos del mismo para la producción comercial ^o para la inducción de anticuerpos, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitaciones, vectores multifuncionales de clonación y expresión de E. coli como BLUESCRIPT (Stratagene), donde la secuencia codificante del polipéptido de CD se puede ligar en el vector en el marco con secuencias para la Met amino terminal y I^os 7 residuos posteriores de beta-galactosidasa de modo que se produzca una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster (1989) J. BIoI. Chem. 264: 5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison WI^s.); y similares.

De forma similar, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, una serie de vectores que contienen promotores constitutivos ^o inducibles, como el factor alfa, la alcohol oxidasa y la PGH se pueden usar para la producción de I^os polipéptidos deCD de la divulgación. Para una revisión, véase Ausubel (Citado anteriormentê y Grant et al. (1987) Methods in Enzymology 153:516-544.

La divulgación también proporciona vectores retrovirales competentes para la replicación que tienen estabilidad incrementada en relación con vectores retrovirales anteriores. Este aumento de la estabilidad durante la infección y la replicación es importante para el tratamiento de trastornos de proliferación celular. La combinación de la eficacia de transducción, la estabilidad del transgén y la selectividad diana se proporciona por el retrovirus competente para la replicación. Las composiciones y I^os métodos proporcionan una estabilidad de inserción y mantiene la actividad de la transcripción del transgén y la viabilidad de la traducción del polipéptido codificado.

L^os retrovirus pueden transmitirse horizontal y verticalmente. La transmisión Infecciosa eficaz de I^os retrovirus requiere la expresión sobre la célula diana de receptores que reconocen específicamente las proteínas de la envoltura vírica, aunque Ios virus pueden usar receptores independientes, rutas de entrada no específicas de baja eficiencia. Además, el tipo de célula diana debe ser capaz de soportar todas las etapas del ciclo de replicación una vez que el virus se ha unido y penetrado. La transmisión vertical se produce cuando el genoma vírico queda integrado en la línea germinal del hospedador. A continuación, el provirus pasará de una generación a otra como si fuera un gen celular. Por tanto, se establecen provirus endógenos que a menudo se encuentran latentes, pero que pueden activarse cuando el hospedador se expone a Ios agentes adecuados.

Como se ha mencionado anteriormente, el ADN intermedio integrado se denomina provirus. La terapia génica ^o I^os sistemas de administración de genes anteriores utilizan procedimientos y retrovirus que requieren la transcripción del provirus y el ensamblaje en virus infecciosos en presencia de un virus auxiliar apropiado o en una línea celular que contiene secuencias apropiadas que permiten la encapsidación sin la producción coincidente de un virus auxiliar contaminante. Como se describe a continuación, no se requiere un virus auxiliar para la producción del retrovirus recombinante de la divulgación, ya que se proporcionan secuencias para la encapsidación en el genoma proporcionando de esta forma un vector retrovírico competente para la replicación para la administración o el tratamiento génico.

Un genoma retroviral útil en los procedimientos y composiciones de la divulgación comprende un ADN proviral que tiene al menos tres genes: el gag, el pol, y el env, estos genes pueden estar flanqueados por una ^o dos repeticiones terminales largas (LTR) o, en el provirus, están flanqueados por dos repeticiones terminales largas (LTR) y las secuencias que contienen las secuencias que actúan en cis tales como psi. El gen gag codifica las proteínas estructurales internas (matriz, cápside, y nucleocápside); el gen pol codifica la ADN polimerasa dirigida al ARN (transcriptasa inversa), la proteasa y la integrasa; y el gen env codifica las glicoproteínas de la envoltura vírica. Las LTR 5' y/o 3' promueven la transcripción y la poliadenilación del ARN de los viriones. La LTR contiene el resto de secuencias que actúan en cis necesarias para la replicación vírica. L^os lentivirus tienen genes adicionales que incluyen vif, vpr, tat, rev, vpu, nef y vpx (en HIV-1, HIV-2 y/o SIV).

Adyacentes a las LTR 5' se encuentran las secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión al cebador del ARNt) y para la encapsidación eficaz del ARN vírico en partículas (el sitio P^sí). Si las secuencias necesarias para la encapsidación (^o el empaquetamiento del ARN retrovírico en el virión infeccioso) desaparecen del genoma vírico, el resultado es un defecto en cis que evita la encapsidación del ARN vírico genómico. Este tipo de vector modificado es lo que se ha utilizado típicamente en sistemas de administración de genes anteriores (es decir, sistemas que carecen de elementos que son necesarios para la encapsidación del virión).

En un aspecto de la divulgación, la divulgación proporciona un retrovirus recombinante capaz de infectar una célula que no está en división, una célula en división, ^o una célula que tiene un trastorno de proliferación celular. El retrovirus competente para la replicación recombinante de la divulgación comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un GAG vírico, un POL vírico, un ENV viral, un polinucleótido heterólogo precedido por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) encapsulado dentro de un virión.

La secuencia de ácido nucleico heteróloga está unida operativamente a un IRES. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "heterólogo" en la secuencia de ácido nucleico ^o transgén se refiere a (i) una secuencia que no existe normalmente en un retrovirus natural, (ii) una secuencia que se origina de una especie extraña, o (iii) si procede de la misma especie, puede modificarse sustancialmente a partir de ^su forma original. Como alternativa, una secuencia de ácido nucleico sin cambiar que no se expresa normalmente en una célula es una secuencia de ácido nucleico heteróloga. En una realización específica, el polinucleótido heterólogo es un polipéptido de la divulgación que tiene actividad citosina desaminasa.

La frase célula "que no se dividen" se refiere a una célula que no sufre mitosis. Las células que no se dividen pueden bloquearse en cualquier punto del ciclo celular, (por ejemplo, G^o/Gⁱ , Gⁱ/^s, G2/^m), siempre que la célula no se esté dividiendo activamente. Para la infección ex vivo, una célula en división puede tratarse para bloquear la división celular mediante técnicas estándar utilizadas por los expertos en la técnica, que incluyen, irradiación, tratamiento con afidocolina, inanición sérica e inhibición por contacto. Sin embargo, debe entenderse que la infección ex vivo a menudo se realiza sin bloquear las células ya que muchas células ya están detenidas (por ejemplo, células madre). Por ejemplo, un vector de lentivirus recombinante es capaz de infectar cualquier célula que no se divide, independientemente del mecanismo utilizado para bloquear la división celular ^o el punto en el ciclo celular donde se bloquea la célula. L^os ejemplos de células que no se dividen preexistentes en el cuerpo incluyen células neuronales, musculares, hepáticas, de la piel, cardíacas, pulmonares y de la médula ósea, y sus derivados. Para las células que se dividen se pueden utilizar vectores onco-retrovirales.

Por células "que se dividen" se entiende una célula que sufre mitosis activa o meiosis. Tales células en división incluyen células madre, células de la piel (por ejemplo, fibroblastos y queratinocitos), gametos y otras células que se dividen conocidas en la técnica. De particular interés y abarcadas por el término célula en división están las células que tienen trastornos de proliferación celular, como las células neoplásicas. La expresión "trastorno de proliferación celular" se refiere a una afección caracterizada por un número anormal de células. La afección puede incluir tanto el crecimiento celular hipertrófico (la multiplicación continua de células que resulta en un crecimiento excesivo de una población celular dentro de un tejido) como el hipotrópico (una falta ^o deficiencia de células dentro de un tejido) ^o un influjo excesivo o migración de células a un área de un cuerpo. Las poblaciones celulares no son necesariamente células tumorigénicas ^o malignas transformadas, pero también puede incluir células normales. L^os trastornos de proliferación celular incluyen trastornos asociados con un crecimiento excesivo de tejidos conectivos, tales como diversas afecciones fibróticas, incluyendo esclerodermia, artritis y cirrosis hepática. L^os trastornos de proliferación celular incluyen trastornos neoplásicos, tales como carcinomas de cabeza y cuello. L^os carcinomas de cabeza y cuello incluyen, por ejemplo, carcinoma de la boca, esófago, garganta, laringe, glándula tiroides, lengua, labios, glándulas salivales, nariz, senos paranasales, nasofaringe, tumores de la bóveda nasal superior y sinusales, etesioneuroblastoma, cáncer de células escamosas, melanoma maligno, carcinoma sinonasal indiferenciado (SNUC), neoplasia de cerebro (incluyendo glioblastomas) ^o sanguínea. También se incluyen los carcinomas de los ganglios linfáticos regionales, incluidos Ios ganglios linfáticos cervicales, ganglios linfáticos prelaríngeos, ganglios linfáticos yuxtaesofágicos pulmonares y ganglios linfáticos submandibulares (Harrison's Principies of Internal Medicine (eds., Isselbacher, et al., McGraw-Hill, Inc., 13a edición, pp 1850-1853, 1994). Otros tipos de cáncer incluyen, pero sin limitaciones, cáncer de pulmón, cáncer de colon y recto, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, linfoma de cáncer uterino, cáncer oral, cáncer pancreático, leucemia, melanoma, cáncer de estómago, cáncer de piel y cáncer de ovario.

En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido heterólogo dentro del vector comprende una citosina desaminasa que se ha optimizado para la expresión en una célula humana. En un aspecto adicional de la divulgación, la citosina desaminasa comprende una secuencia que se ha optimizado por codones humanos y comprende mutaciones que aumentan la estabilidad de la citosina desaminasa (por ejemplo, degradación reducida ^o termoestabilidad aumentada) en comparación con una citosina desaminasa de tipo salvaje. En aún otro aspecto de la divulgación, el polinucleótido heterólogo codifica una construcción de fusión que comprende una citosina desaminasa (codón humano optimizado ^o no optimizado, ya sea mutado ^o no mutado) unida operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad UPRT u OPRT. En otro aspecto de la divulgación, el polinucleótido heterólogo comprende un polinucleótido de CD o una construcción de fusión de la divulgación (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15 o 17).

En otro aspecto de la divulgación, el vector retroviral competente para la replicación puede comprender un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que comprende una citosina desaminasa (como se describe en el presente documento) y puede comprender además un polinucleótido que comprende una molécula de ARNip o ARNip unida a un promotor específico de tipo celular o DE tejido.

La expresión "secuencia reguladora de ácido nucleico" se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, potenciadores y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula receptora. N^o es necesario que todas estas secuencias de control estén presentes siempre que la secuencia de codificación seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula huésped apropiada. Un experto en la materia puede identificar fácilmente la secuencia reguladora de ácido nucleico a partir de bases de datos y materiales públicos. Adicionalmente, un experto en la técnica puede identificar una secuencia reguladora que sea aplicable para el uso previsto, por ejemplo, in vivo, ex vivo o in vitro.

La expresión "región promotora" se usa en el presente documento en su sentido ordinario para referirse a una región nucleotídica que comprende una secuencia reguladora de ADN, donde la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (dirección 3 '). La secuencia reguladora puede ser homóloga ^o heteróloga a la secuencia génica deseada. Por ejemplo, se puede utilizar una amplia gama de promotores, incluyendo promotor viral ^o de mamífero como se ha descrito anteriormente.

Un sitio interno de entrada al ribosoma ("IRES") se refiere a un segmento de ácido nucleico que promueve la entrada ^o retención de un ribosoma durante la traducción de una secuencia de codificación generalmente 3' al IRES. En algunos aspectos de la divulgación, el IRES puede comprender un sitio de aceptor / donante de corte y empalme, sin embargo, I^os IRES preferidos carecen de un sitio aceptor / donante de corte y empalme. Normalmente, la entrada de ribosomas en el ARN mensajero se realiza a través de la caperuza ubicada en el extremo 5' de todos I^os ARNm eucarióticos. Sin embargo, hay excepciones a esta regla universal. La ausencia de una caperuza en algunos ARNm virales sugiere la existencia de estructuras alternativas que permiten la entrada de ribosomas en un sitio interno de estos ARN. Hasta la fecha, una serie de estas estructuras, designadas IRES por ^su función, se han identificado en la región no codificadora 5' de Ios ARNm virales sin protección, tal como, en particular, de picornavirus como el virus de la poliomielitis (Pelletier et al., 1988, MoI. Cell. BíoI., 8, 1103-1112) y el virus EMCV (virus de la encefalo-miocarditis (Jang et al., J. Virol., 1988, 62, 2636-2643). La divulgación proporciona el uso de un IRES en el contexto de un vector retroviral competente para la replicación.

La secuencia heteróloga de ácido nucleico está típicamente bajo el control de las señales potenciadoras del promotor LTR viral ^o de un promotor interno, y las señales retenidas dentro de la LTR retroviral todavía pueden lograr una integración eficiente del vector en el genoma de la célula huésped. Por consiguiente, Ios vectores retrovirales recombinantes de la divulgación, las secuencias deseadas, I^os genes y / ^o fragmentos de genes pueden insertarse en varios sitios y bajo diferentes secuencias reguladoras. Por ejemplo, un sitio para la inserción puede ser el sitio proximal del potenciador / promotor viral (es decir, el Iocus del gen dirigido por LTR en 5'). Como alternativa, las secuencias deseadas pueden insertarse en un sitio distal (por ejemplo, la secuencia IRES 3' al gen env) ^o cuando están presentes dos o más secuencias heterólogas, una secuencia heteróloga puede estar bajo el control de una primera región reguladora y una segunda secuencia heteróloga bajo el control de una segunda región reguladora. Otros sitios distales incluyen secuencias promotoras virales, donde la expresión de la secuencia ^o secuencias deseadas es a través del corte y empalme del cistrón proximal del promotor, se puede usar un promotor heterólogo interno como SV40 ^o CMV, ^o un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).

En un aspecto de la divulgación, el genoma retroviral de la divulgación contiene un IRES que comprende un sitio de clonación para la Inserción de una secuencia de polinucleótidos deseada. En un aspecto de la divulgación, el IRES está ubicado 3' al gen env en el vector retroviral, pero 5' al deseado ácido nucleico heterólogo. Por consiguiente, una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica un polipéptido deseado puede unirse operativamente al IRES.

En otro aspecto de la divulgación, se incluye una secuencia de polinucleótidos dirigidos como parte del vector retroviral recombinante de la divulgación. La secuencia del polinucleótido de direccionamiento es un ligando de direccionamiento (por ejemplo, hormonas peptídicas como la heregulina, un anticuerpo de cadena única, un receptor o un ligando para un receptor), un elemento regulador específico de tejido o de tipo celular (por ejemplo, un promotor ^o potenciador específico de tejido ^o específico de tipo celular), ^o una combinación de un ligando dirigido y un elemento regulador específico de tejido / específico de tipo celular. Preferiblemente, el ligando de direccionamiento está unido operativamente a la proteína env del retrovirus, creando una proteína env retroviral quimérica. Las proteínas virales GAG, POL y ^e N^v pueden derivarse de cualquier retrovirus adecuado (por ejemplo, derivado de MLV ^o lentivirus). En otro aspecto de la divulgación, la proteína ENV viral no deriva de retrovirus (por ejemplo, CMV o VSV).

El retrovirus recombinante de la divulgación se modifica genéticamente de tal manera que el virus se dirige a un tipo de célula en particular (por ejemplo, células del músculo liso, células hepáticas, células renales, fibroblastos, queratinocitos, células madre mesenquimales, células de médula ósea, condrocitos, células epiteliales, células intestinales, células neoplásicas, células del glioma, células neuronales y otras conocidas en la técnica) de manera que el genoma del ácido nucleico se libera a un objetivo que no se divide, una célula que se divide en un objetivo, ^o una célula diana que tiene un trastorno de proliferación celular. El direccionamiento se puede lograr de dos maneras. La primera forma dirige el retrovirus a una célula diana uniéndose a las células que tienen una molécula en la superficie externa de la célula. Este procedimiento para atacar al retrovirus utiliza la expresión de un ligando de direccionamiento en la capa del retrovirus para ayudar a dirigir el virus a las células o tejidos que tienen un receptor o molécula de unión que interacciona con el ligando de direccionamiento en la superficie del retrovirus. Después de la infección de una célula por el virus, el virus inyecta ^su ácido nucleico en la célula y el material genético del retrovirus puede integrarse en el genoma de la célula huésped. El segundo procedimiento de direccionamiento utiliza elementos reguladores específicos de células o tejidos para promover la expresión y la transcripción del genoma viral en una célula específica que utiliza activamente los elementos reguladores, como se describe más completamente a continuación. El material genético retrovirus transferido luego se transcribe y se traduce en proteínas dentro de la célula huésped. El elemento regulador diana está típicamente vinculado a la L^t R en 5' y / ^o 3', creando una LTR quimérica.

Al insertar una secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés en el vector viral de la divulgación, junto con otro gen que codifica, por ejemplo, el ligando para un receptor en una célula diana específica, el vector ahora es objetivo específico. L^os vectores virales se pueden hacer específicos del objetivo mediante la unión, por ejemplo, de un azúcar, un glicolípido, ^o una proteína. El direccionamiento se puede lograr usando un anticuerpo para dirigirse al vector viral. Los expertos en la técnica sabrán, o pueden determinar fácilmente, secuencias polinucleotídicas específicas que pueden insertarse en el genoma viral o proteínas que pueden unirse a una envoltura viral para permitir la administración específica del objetivo del vector viral que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés.

Por lo tanto, la divulgación incluye una proteína env quimérica que comprende una proteína env retroviral unida operativamente a un polipéptido de direccionamiento. El polipéptido de direccionamiento puede ser una molécula receptora específica de la célula, un ligando para un receptor celular específico, un anticuerpo ^o fragmento de anticuerpo para un epítopo antigénico específico de célula o cualquier otro ligando fácilmente identificable en la técnica que sea capaz de unirse ^o interaccionar con una célula diana. L^os ejemplos de polipéptidos ^o moléculas dirigidas a la enfermedad incluyen anticuerpos bivalentes que usan biotina-estreptavidina como enlazadores (Etienne-Julan et al., J. Of General Virol., 73: 3251-3255 (1992); Roux et al., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 86:9079-9083 (1989)), virus recombinante que contiene en ^su envoltura una secuencia que codifica una región variable de anticuerpo de cadena única contra un hapteno (Russell et al., Nucleic Acids Research, 21,1081-1085 (1993)), clonación de ligandos de hormonas peptídicas en la envoltura del retrovirus (Kasahara et al., Science, 266, 1373­ 1376 (1994)), construcciones de EPO / env quiméricas (Kasahara et al., 1994), anticuerpo de cadena única contra el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en la envoltura MLV ecotrópica, dando como resultado una infección específica de células HeLa que expresan el receptor de LDL (Somia et al., Proc. Natl. Acad. ScI USA, 92, 7570-7574 (1995)), de manera similar, el rango de ALV del huésped se puede alterar mediante la incorporación de un ligando de integrina, permitiendo que el virus ahora cruce especies para infectar específicamente células de glioblastoma de rata (Valsesia-Wittmann et al., J. Virol. 68, 4609-4619 (1994)), y Dornberg y colaboradores (Chu y Dornburg, J. Virol 69, 2659-2663 (1995)) han informado sobre el objetivo específico del tejido del virus de la necrosis del bazo (SNV), un retrovirus aviar, utilizando cubiertas que contienen anticuerpos de cadena única dirigidos contra marcadores tumorales.

La divulgación proporciona un procedimiento para producir un retrovirus recombinante capaz de infectar una célula diana que comprende transfectar una célula huésped adecuada con lo siguiente: un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una gag viral, una pol viral y una env viral, donde el vector contiene un sitio de clonación para la introducción de un gen heterólogo, ligado operativamente a una secuencia reguladora de ácido nucleico, y recuperando el virus recombinante.

Los retrovirus y métodos de la divulgación proporcionan un retrovirus competente para la replicación que no requiere un virus auxiliar o una secuencia de ácido nucleico o proteínas adicionales a fin de propagar y producir el virión. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico del retrovirus de la divulgación codifican, por ejemplo, un antígeno específico de grupo y una transcriptasa inversa, (y las enzimas integrasa y proteasa necesarias para la maduración y la transcripción inversa), respectivamente, como se ha descrito anteriormente. Los gag y pol víricos pueden derivarse de un lentivirus, como el VIH o un oncovirus como MoMLV. Además, el genoma de ácido nucleico del retrovirus de la divulgación incluye una secuencia que codifica una proteína de la envoltura vírica (ENV). El gen env puede derivarse de cualesquiera retrovirus. La env puede ser una proteína de envoltura anfotrópica que permite la transducción de células de humanos y otras especies, ^o puede ser una proteína de envoltura ecotrópica, que es capaz de transducir solo ratas de ratas y ratones. Además, puede ser deseable apuntar al virus recombinante mediante la unión de la proteína de la envoltura con un anticuerpo ^o un ligando particular para apuntar a un receptor de un tipo de célula particular. Como se ha mencionado anteriormente, los vectores retrovirales se pueden hacer específicos del objetivo insertando, por ejemplo, un glicolípido, o una proteína. A menudo, el direccionamiento se realiza mediante el ^uso de un anticuerpo para dirigir el vector retroviral a un antígeno en un tipo de célula particular (por ejemplo, un tipo de célula que se encuentra en un determinado tejido o un tipo de célula cancerosa). Los expertos en la técnica sabrán, ^o pueden determinar fácilmente sin experimentación indebida, procedimientos específicos para lograr la liberación de un vector retroviral a un objetivo específico. En un aspecto de la divulgación, el gen env deriva de un no retrovirus (por ejemplo, CMV o VSV). Ejemplos de genes env derivados de retrovirus incluyen, aunque no de forma limitativa: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor de mama de murino (MuMTV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del sarcoma de R^ous (RSV). También se pueden usar otros genes env, como el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (proteína G), ^o la envoltura de citomegalovirus (CMV) ^o el virus de la gripe con hemaglutinina (HA).

En un aspecto de la divulgación, el genoma retroviral deriva de un onco-retrovirus ^o gammaretrovirus, y más particularmente un onco-retrovirus de mamíferos o gamma retrovirus. Por "derivado" se entiende que la secuencia polinucleotídica principal es un oncovirus de tipo salvaje que se ha modificado mediante la inserción o eliminación de secuencias naturales (por ejemplo, la inserción de un IRES, inserción de un polinucleótido heterólogo que codifica, por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa de la divulgación y similares).

En otro aspecto de la divulgación, la divulgación proporciona vectores retrovirales que se dirigen utilizando secuencias reguladoras. Se pueden utilizar secuencias reguladoras específicas de células ^o tejidos (por ejemplo, promotores) para dirigir la expresión de secuencias de genes en poblaciones de células específicas. Los promotores de mamíferos y virales adecuados para la divulgación se describen en otra parte del presente documento. Por consiguiente, en un aspecto de la divulgación, la divulgación proporciona un retrovirus que tiene elementos promotores específicos de tejido en el extremo 5' del genoma retroviral. Preferiblemente, los elementos / secuencias reguladores específicos del tejido se encuentran en la región U3 de la LTR del genoma retroviral, incluyendo, por ejemplo, promotores y potenciadores específicos de células ^o tejidos para células neoplásicas (por ejemplo, potenciadores y promotores específicos de células tumorales), y promotores inducibles (por ejemplo, tetraciclina).

En algunas circunstancias, puede ser conveniente regular la expresión. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes promotores virales con diferentes fuerzas de actividad dependiendo del nivel de expresión deseado. En células de mamíferos, el promotor temprano inmediato de CMV se usa a menudo para proporcionar una fuerte activación transcripcional. También se han utilizado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas, se pueden usar promotores retrovirales, como los LTR de MLV ^o MMTV. Otros promotores virales que pueden usarse incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus tales como de la E1A, E2A ^o región MLP, AAV ^lT^r , virus del mosaico de la coliflor, HSV-TK, y el virus del sarcoma aviar.

De manera similar, se pueden usar promotores selectivos o específicos de tejidos para efectuar la transcripción en tejidos o células específicos a fin de reducir la toxicidad potencial o Ios efectos indeseables para los tejidos no dirigidos. Por ejemplo, Ios promotores como el PSA, probasina, fosfatasa ácida prostática o calicreína glandular específica de la próstata (hK2) se pueden usar para dirigir la expresión génica en la próstata. Otros promotores / dominios reguladores que pueden usarse se establecen en la Tabla 1.

En ciertas indicaciones, puede ser deseable activar la transcripción en momentos específicos después de la administración del vector de terapia génica. Esto se puede hacer con promotores como Ios que son hormonales o citocinas regulables. Por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas donde la indicación es un tejido gonadal donde se producen o envían esteroides específicos, el uso de andrógenos o estrógenos regulados promotores puede ser ventajoso. Tales promotores que son regulables por hormonas incluyen MMTV, MT-1, ecdisona y R^uBI^sco. Otros promotores regulados por hormonas, como Ios que responden a la tiroides, se pueden usar hormonas hipofisarias y suprarrenales. Citocinas y promotores sensibles a proteínas inflamatorias que podrían usarse incluyen K y T Kininogen (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-alfa, proteína C reactiva (Arcone et al., 1988), haptoglobina (Oliviero et al., 1987), suero amiloide A2, C / EBP alfa, IL-1, IL-6 (PoII y Córtese, 1989), complemento C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, glicoproteína ácida alfa-1 (Prowse y Baumann, 1988), antitripsina alfa-1, lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1988), angiotensinógeno (Ron et al., 1990), fibrinógeno, c-Jun (inducible por los ásteres de forbol, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por los ásteres de forbol y el ácido retinoico), metalotioneína (inducible por metales pesados y glucocorticoides), estromelisina (inducible por áster de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2 macroglobulina y la alfa-1 antihimotrotripsina. Promotores específicos de tumores como la osteocalcina, elemento sensible a la hipoxia (HRE), MAGE-4, CEA, alfa-fetoproteína, Gr P78 / BiP y la tirosinasa tambián se pueden usar para regular la expresión gánica en cálulas tumorales.

Además, esta lista de promotores no debe interpretarse como exhaustiva ^o limitante, los expertos en la tácnica conocerán otros promotores que pueden usarse Junto con los promotores y procedimientos descritos en el presente documento.

t a b la i p r o m o to r e s e s p e c íf ic o s de t e jid o s

Tejido Promotor

Páncreas Insulina Elastina Amilasa pdr-1 pdx-1 glucoquinasa

Hígado Albúmina PEPCK Potenciador de VHB a fetoproteína apolipoproteína C a-1 antitripsina vitelogenina, NF-AB Transtiretina

Músculo esque Cadena h de miosina creatina quinasa de músculo Distrofina Calpaína p94 alfa-actina troponina 1 rápida de músculo esquelático

Piel Queratina K6 Queratina K1

Pulmón CFTR citoqueratina humana 18 (K18) proteínas surfactantes pulmonares A, B y C CC-10 P1 Músculo liso sm22 a SM-alfa-actina

Endotelio Endotelina-1 E-selectina Factor de von Willebrand TIE, KDR / flk-1 Melanocitos Tirosinasa Tejido adiposo

Lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1988) Adipsina (Spiegelman et al., 1989) acetil-CoA carboxilasa (Pape and Kim, 1989) glicerofosfato deshidrogenasa (Dani et al., 1989) adipocito P2 (Hunt et al., 1986)

Mama Proteína ácida del suero de leche (WAP) (Andrés et al. PNAS 84:1299-13031987) Sangre p-globina

Los "elementos reguladores específicos de tejido" son elementos reguladores (por ejemplo, promotores) que son capaces de dirigir la transcripción de un gen en un tejido mientras permanecen en gran parte "silenciosos" en otros tipos de tejidos. Se entenderá, sin embargo, que los promotores específicos de tejido pueden tener una cantidad detectable de actividad "de fondo" ^o "base" en los tejidos donde están en silencio. El grado en que un promotor se activa selectivamente en un tejido diana puede expresarse como una relación de selectividad (actividad en un tejido diana / actividad en un tejido de control). A este respecto, un promotor específico de tejido útil en la práctica de la divulgación tiene, normalmente, una relación de selectividad mayor que aproximadamente 5. Preferiblemente, la relación de selectividad es mayor que aproximadamente 15.

Se entenderá además que ciertos promotores, si bien no tiene actividad restringida a un solo tipo de tejido, Sin embargo, pueden mostrar selectividad porque pueden estar activos en un grupo de tejidos y menos activos ^o silenciosos en otro grupo. Dichos promotores tambián se denominan "específicos de tejido" y se contemplan para su ^uso con la divulgación. Por consiguiente, los elementos reguladores específicos del tejido utilizados en la divulgación, tienen aplicabilidad a la regulación de las proteínas heterólogas, tales como los polipáptidos que tienen actividad citosina desaminasa de la divulgación, así como una aplicabilidad como una secuencia polinucleotídica de direccionamiento en vectores retrovirales.

L^os vectores retrovirales y los polinucleótidos y polipáptidos de CD de la divulgación se pueden usar para tratar una amplia gama de enfermedades y trastornos que incluyen varias enfermedades y trastornos de proliferación celular (váase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.04.405.712 y 4.650.764; Friedmann, 1989, Science, 244:1275-1281; Mulligan, 1993, Science, 260: 926-932, R. Crystal, 1995, Science 270:404-410, váase tambián, The Development of Human Gene Therapy, Theodore Friedmann, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. ISBN 0-87969-528-5.

La divulgación tambián proporciona terapia gánica para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares. Dicha terapia lograría su efecto terapáutico mediante la introducción de una secuencia polinucleotídica terapáutica apropiada (por ejemplo, un polipáptido de la divulgación que tiene actividad citosina desaminasa), en las cálulas del sujeto que tiene el trastorno proliferativo. El suministro de construcciones polinucleotídicas se puede lograr usando el vector retroviral recombinante de la divulgación.

Además, los procedimientos terapáuticos (por ejemplo, la terapia gánica ^o I^os procedimientos de administración de genes) tal como se describen en el presente documento pueden realizarse in vivo o ex vivo. Por ejemplo, en Ios procedimientos para el tratamiento de enfermedades o trastornos de proliferación celular puede ser útil eliminar la mayoría de un tumor antes de la terapia génica, por ejemplo quirúrgicamente o por radiación. En algunos aspectos de la divulgación, la terapia retroviral puede ser precedida ^o seguida por quimioterapia.

Por lo tanto, l divulgación proporciona un retrovirus recombinante capaz de infectar una célula que no está en división, una célula en división ^o una célula neoplásica, donde el retrovirus recombinante comprende un GAG viral; un POL viral; un ENV viral; un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, que comprende un polipéptido de la divulgación que tiene actividad citosina desaminasa) unido operativamente a un IRES; y las secuencias de ácido nucleico que actúan en cis necesarias para el empaquetamiento, la transcripción inversa e integración. El retrovirus recombinante puede ser un lentivirus, como el VIH, ^o puede ser un oncovirus. Como se ha descrito anteriormente para el procedimiento de producción de un retrovirus recombinante, el retrovirus recombinante de la divulgación puede incluir además al menos uno de VPR, VIF, NEF, VPX, TAT, REV, y la proteína VPU. Si bien no queriendo estar limitado por una teoría particular, se cree que uno o más de estos productos de genes / proteínas son importantes para aumentar el título viral del retrovirus recombinante producido (por ejemplo, NEF) o pueden ser necesarios para la infección y el empaquetamiento del virión.

La divulgación también proporciona un procedimiento de transferencia de ácido nucleico a una célula diana para proporcionar la expresión de un ácido nucleico particular (por ejemplo, una secuencia heteróloga tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa). Por lo tanto, En otro aspecto de la divulgación, la divulgación proporciona un procedimiento para la introducción y expresión de un ácido nucleico heterólogo en una célula diana que comprende infectar la célula diana con el virus recombinante de la divulgación y expresar el ácido nucleico heterólogo en la célula diana. Como se ha mencionado anteriormente, la célula diana puede ser cualquier tipo de célula, incluyendo células que se dividen, que no se dividen, neoplásicas, inmortalizadas, modificadas y de otros tipos reconocidos por los expertos en la técnica, siempre que sean capaces de infectarse por un retrovirus.

La divulgación también proporciona terapia génica para el tratamiento de trastornos de proliferación celular o inmunológicos. En un aspecto de la divulgación, un trastorno de proliferación celular se trata introduciendo un polinucleótido de CD de la divulgación, expresando el polinucleótido para producir un polipéptido que comprende actividad citosina desaminasa y poner en contacto la célula con 5-fluorocitosina en una cantidad y durante un período de tiempo para producir una cantidad citotóxica de 5-FU.

Además, la divulgación proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector retrovírico recombinante de la divulgación. La secuencia del polinucleótido puede incorporarse en diversas partículas víricas. Por ejemplo, varios vectores virales que se pueden usar para terapia génica incluyen adenovirus, virus del herpes, vaccinia ^o, preferentemente, un virus de ARN, tal como un retrovirus y, más particularmente, un oncovirus de mamíferos. El vector retroviral puede ser un derivado de un retrovirus murino, de simio o humano. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que se puede insertar un gen extraño (por ejemplo, una secuencia polinucleotídica heteróloga) incluyen, aunque no de forma limitativa: derivados del virus de la leucemia murina Moloney (M^oM^uLV), del virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), del virus del tumor mamario murino (M^uMTV) y del virus del sarcoma de Rous (RSV). Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable para que las células transducidas puedan identificarse y generarse. En aún otro aspecto de la divulgación, la divulgación proporciona plásmidos que comprenden una construcción derivada de un retrovirus recombinante. El plásmido se puede introducir directamente en una célula diana o en un cultivo celular, tal como NIH 3T3, HT1080 (humano), CF2 (perro) u otras células de cultivo de tejidos. Las células resultantes liberan el vector retrovírico en el medio de cultivo. La divulgación proporciona una construcción de polinucleótido que comprende, desde 5' a 3': un promotor ^o región reguladora útil para iniciar la transcripción; una señal de empaquetamiento psi; una secuencia de ácido nucleico que codifica gag, una secuencia de ácido nucleico que codifica pol; una secuencia de ácido nucleico que codifica env; una secuencia de ácido nucleico interna de entrada al ribosoma; un polinucleótido heterólogo que codifica un marcador, terapéutico (por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa) o polipéptido de diagnóstico; y una secuencia de ácido nucleico de LTR. En aspectos específicos de la divulgación, un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa puede comprender además un dominio que codifica un polipéptido que comprende actividad UPRT o OPRT.

Como se describe en otra parte en el presente documento y como sigue, los diversos segmentos de la construcción polinucleotídica de la divulgación (por ejemplo, un polinucleótido retroviral competente para la replicación recombinante) se modifican dependiendo en parte de la célula huésped deseada, el momento ^o la cantidad de expresión y el polinucleótido heterólogo. Una construcción retroviral competente para replicación de la divulgación se puede dividir en una serie de dominios que pueden modificarse individualmente por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, el promotor puede comprender un promotor del CMV que tiene una secuencia como se expone en las SEQ ID No : 19, 20, o 22 desde el nucleótido 1 a aproximadamente el nucleótido 582 y puede incluir la modificación de una ^o más (por ejemplo, 2-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100 ^o más bases de ácidos nucleicos) siempre que el promotor modificado sea capaz de dirigir e iniciar la transcripción. En un aspecto de la divulgación, el promotor o la región reguladora comprende un polinucleótido del dominio CMV-R-U5. El dominio CMV-R-U5 comprende el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano en una región R-U5 del VLM. En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido del dominio CMV-R-U5 comprende una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19, 20, ^o 22 desde aproximadamente el nucleótido 1 a aproximadamente el nucleótido 1202 ^o las secuencias que son al menos un 95% idénticas a una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 19, 20 o 22, donde el polinucleótido promueve la transcripción de una molécula de ácido nucleico unida operativamente a la anterior. El dominio gag del polinucleótido puede derivarse de cualquier número de retrovirus, pero típicamente se derivará de un oncoretrovirus y, más particularmente, de un oncoretrovirus de mamífero. En un aspecto de la divulgación, el dominio gag comprende una secuencia desde aproximadamente el nucleótido número 1203 a aproximadamente el nucleótido 2819 o una secuencia que tiene al menos 95%, 98%, 99% o 99,8% (redondeado a la décima más cercana) de identidad con la anterior. El dominio pol del polinucleótido puede derivarse de cualquier número de retrovirus, pero típicamente se derivará de un oncoretrovirus y, más particularmente, de un oncoretrovirus de mamífero. En un aspecto de la divulgación, el dominio pol comprende una secuencia desde aproximadamente el nucleótido número 2820 a aproximadamente el nucleótido 6358 o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % (redondeado a la décima más cercana) de identidad con la anterior. El dominio env del polinucleótido puede derivarse de cualquier número de retrovirus, pero típicamente se derivará de un oncoretrovirus y, más particularmente, de un oncoretrovirus de mamífero. En algunos aspectos de la divulgación, el dominio de codificación env comprende un dominio env anfotrópico. En un aspecto de la divulgación, el dominio env comprende una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótidos 6359 hasta aproximadamente el nucleótido 8323 ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,8 % (redondeado a la décima más cercana) de identidad con la anterior. El dominio IRES del polinucleótido se puede obtener a partir de cualquier número de sitios internos de entrada al ribosoma. En un aspecto de la divulgación, el IRES deriva de un virus de la encefalomiocarditis. En un aspecto de la divulgación, el dominio IRES comprende una secuencia desde aproximadamente el número de nucleótido 8327 hasta aproximadamente el nucleótido 8876 ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 % ^o 99 % (redondeado a la décima más próxima) de identidad, siempre y cuando el dominio permita la entrada de un ribosoma. El dominio heterólogo puede comprender una citosina desaminasa de la divulgación. En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido de CD comprende una secuencia optimizada de codones humanos. En aún otro aspecto de la divulgación, el polinucleótido de CD codifica un polipéptido mutante que tiene citosina desaminasa, donde las mutaciones confieren un aumento de la estabilización térmica que aumenta la temperatura de fusión (Tm) en 100C, lo que permite una actividad cinética sostenida en un intervalo de temperatura más amplio y mayores niveles acumulados de proteína. En un aspecto de la divulgación, la citosina desaminasa comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 desde aproximadamente el nucleótido número 8877 hasta aproximadamente 9353. El dominio heterólogo puede ir seguido de un dominio rico en polipurina. La 3' LTR puede derivarse de cualquier número de retrovirus, normalmente, un oncoretrovirus y, preferentemente, un oncoretrovirus de mamífero. En un aspecto de la divulgación, la 3' LTR comprende un dominio U3-R-U5. En aún otro aspecto de la divulgación, la LTR comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 desde aproximadamente el nucleótido 9405 hasta aproximadamente 9998 ^o una secuencia que es al menos un 95 %, 98 % o 99,5 % (redondeado a la más cercana 10o) de identidad con la anterior.

La divulgación también proporciona un vector retroviral recombinante que comprende de 5 'a 3' un CMV-R-U5, fusión del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano a la región R-U5 del MLV; un PBS, un sitio de unión al cebador para la transcriptasa inversa; un sitio 5' de corte y empalme; una señal de empaquetamiento y ; un gag, un antígeno específico del grupo de ORF del VLM; un pol, un poliproteína del ORF de la polimerasa del V^lM; un sitio 3' de corte y empalme; un 4070a env, un ORF de la proteína de la envoltura de la cepa 4070a del VLM; un IRES, sitio interno de entrada al ribosoma del virus de la encefalomiocarditis; una citosina desaminasa modificada (termoestable y de codones optimizados); un PPT, un tracto de polipurina; y U3-R-U5, una repetición terminal larga del VLM. Esta estructura se representa gráficamente además en la Figura 1.

La divulgación también proporciona un vector retroviral que comprende una secuencia como se expone en la SEC ID NO:19, 20 o 22.

En otro aspecto de la divulgación, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene un trastorno de proliferación celular. El sujeto puede ser cualquier mamífero y es, preferentemente, un ser humano. El sujeto se pone en contacto con un vector retroviral competente para replicación recombinante de la divulgación. El contacto puede ser in vivo o ex vivo. Los procedimientos de administración del vector retroviral de la divulgación son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, administración sistémica, administración tópica, administración intraperitoneal, administración intramuscular, intracraneal, cerebroespinal, así como la administración directamente en el sitio de un tumor ^o trastorno de proliferación celular. Otras vías de administración conocidas en la técnica.

Por lo tanto, la divulgación incluye diversas composiciones farmacéuticas útiles para tratar un trastorno de proliferación celular. Las composiciones farmacéuticas según la divulgación se preparan llevando un vector retroviral que contiene una secuencia polinucleotídica heteróloga útil para tratar o modular un trastorno de proliferación celular según la divulgación a una forma adecuada para la administración a un sujeto usando vehículos. excipientes y aditivos ^o auxiliares. L^os vehículos ^o auxiliares de ^uso frecuente incluyen carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteínas de la leche, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales, polietilenglicoles y disolventes, tales como agua estéril, alcoholes, glicerol y alcoholes polihídricos. L^os vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes. L^os conservantes incluyen antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares, como se describe, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed. Easton: Mack Publishing C^o., 1405-1412, 1461-1487 (1975) y el Formulario Nacional XIV., 14a ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con las habilidades de rutina en la técnica. Véase Goodman y Gilman en The Pharmacological Basis for Therapeutics (7a ed.).

Por ejemplo, y no a modo de limitación, un vector retroviral útil en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular incluirá una proteína ENV anfotrópica, las proteínas GAG y POL, una secuencia promotora en el genoma retroviral de la región U3, y todas las secuencias que actúan en cis necesarias para la replicación, empaquetamiento e integración del genoma retroviral en la célula diana.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, la divulgación. Si bien estos ejemplos son típicos de los que podrían usarse, como alternativa, pueden utilizarse otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Ejemplos

Ejemplo 1 Construcción de genes de CD modificados e inserción en vectores plasmídicos.

Se han hecho mejoras genéticas al gen de la citosina desaminasa de levadura de tipo salvaje para incluir: (1) tres mutaciones posicionales que cambian tres aminoácidos (A23L, I140L y V108I) para aumentar la estabilidad térmica de la proteína de la citosina desaminasa de levadura y (2) modificaciones en la secuencia génica adicional para mejorar las secuencias de uso de codones humanos para mejorar la eficiencia de la traducción de proteínas en células humanas sin más cambios en la secuencia de aminoácidos.

Diseño de secuencia para incluir CD de codones optimizados, CD-UPRT (+ / enlazador) y CD-OPRTasa (+/-enlazador). La secuencia de codificación final de la citosina desaminasa puede comprender en el extremo 5' un sitio PSI1 (de longitud completa) y en el extremo 3' un sitio Notl más una cola poli A para la estrategia basada en casete PSI1 / Notl.

La siguiente secuencia que comprende una citosina desaminasa de levadura se usó para la clonación, optimización y mutación (los ácidos nucleicos en recuadro comprenden los sitios de restricción utilizados en los procedimientos posteriores para la clonación:

La siguiente tabla resume los genes y los vectores plasmídicos resultantes que se fabricaron y sus nombres.

Tabla: Construcciones de vectores y nombres

El vector retroviral de replicación competente descrito por Kasahara et al. Se usó pACE-CD (patente de Estados Unidos N06.899.871) como base para modificaciones adicionales. Se modificó un vector (pAC3-yCD) para expresar un gen de la citosina desaminasa de levadura modificado como se describe en el presente documento y se ^usó en las construcciones. Consulte 1A a continuación para ver un diagrama de la construcción del vector para el retrovirus competente para la replicación transfectado inicial. El CMV es el promotor temprano inmediato del CMV humano, U3, R y U5 son las regiones correspondientes de la repetición terminal larga viral (LTR). Gag, pol y env son las regiones codificantes de proteínas virales. IB y ID muestran la estructura del plásrnido y una secuencia de la divulgación. Después de sintetizar los genes por contrato (Bío Basic Inc., Markham, Ontario, Canadá) se insertaron en el sitio Psil -Notl del esqueleto del vector pAC3 (Figura 1). El esqueleto del plásmido se generó normalmente cortando el plásmido pAC3-eGFP con Psil y Notl y purificando el fragmento grande (aproximadamente 11 kb) que codifica el plásmido y el esqueleto retroviral)

A. Gen de CD optimizado con codones humanizados (CDopt, también conocido como CD1, T5.0001) Una comparación de una citosina desaminasa optimizada con codones humano de Conrad et al. y PCT WO 99/60008 indica 91 codones totales optimizados en ambos, 36 codones idénticos, 47 codones tenían cambios en el tercer par de bases (todos codifican el mismo aminoácido) y 9 codones fueron diferentes (sin embargo, codificaban el mismo aminoácido). De los 9 codones que diferían:

AGC (Ser) a TCC (Ser)

CGT (Arg) a AGG (Arg)

CCA (Pro) a CCT (Pro)

Todos tienen un contenido de GC equivalente y codifican el mismo aminoácido.

La secuencia del gen de levadura nativa anterior se optimizó por codones por separado para proporcionar el siguiente gen de CD (CD1) y se denominó T5.0001 cuando se insertó en el vector plasmídico pAC3 que codifica el retrovirus competente para la replicación (RCR) con IRES.

B. Gen de CD estabilizado con calor. Se realizaron modificaciones adicionales para mejorar la estabilidad de la citosina desaminasa. Se realizaron mejoras genéticas en el gen de la citosina desaminasa de levadura de tipo salvaje para incluir tres mutaciones posicionales que cambian tres aminoácidos (A23L, I140L y V108I) para aumentar la estabilidad térmica de la proteína citosina desaminasa de levadura.

L^os siguientes pares de cebadores se utilizaron en la generación del gen para el polipéptido de la citosina desaminasa de la divulgación: sentido: 5'-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc-3' (SEQ ID NO:25) antisentido: 5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3'(SEQ ID NO:26)

sentido: 5'tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctecggcggcggcgcctecggcggcggcgccaacccgttatt-3'(SEQ ID NO:27)

antisentido: 5'-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggatcactcgccga-3'(SEQ ID NO:28)

Para aumentar la estabilidad de la CD de levadura nativa, se realizaron tres sustituciones de aminoácidos en la proteína. Estas sustituciones se realizaron solas o en combinación con optimización de codones humanos.

Las tres sustituciones de aminoácidos son: A23L, V108I, I140L. A continuación se muestra una secuencia que codifica estas sustituciones.

ATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAAGTGGGATCAGAAGGGTATGGACATTGCCTATGAGGA

GGCGT T A TTAGGTTACAAAGAGGGTGGTGTTCCTATTGGCGGATGTCTTATCAATAACAAAG

ACGGAAGTGTTCTCGGTCGTGGTCACAACATGAGATTTCAAAAGGGATCCGCCACACTACAT

GGTGAGATCTCCACTTTGGAAAACTGTGGGAGATTAGAGGGCAAAGTGTACAAAGATACCAC

TTTGTATACGACGCTGTCTCCATGCGACATGTGTACAGGTGCCATCATCATGTATGGTATTC

CACGCTGTGTCATC GGTGAGAACGTTAATTTCAAAAGTAAGGGCGAGAAATATTTACAAACT

AGAGGTCACGAGGTTGTTGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAAAAGTTAATGAAACAATTTAT

CGATGAAAGACCTCAGGATTGGTTTGAAGATATTGGTGAGTAGÍ ^{T ^ '-O v _ . ^ O ^} GCCATAGATAA AATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG (SEQ ID N O :33)

El polipéptido codificado comprende la siguiente secuencia (aminoácidos sustituidos en negrita subrayados):

1 MVTGGMASKWDQKGMDIAYEEALLGYKEGGVPIGGCLINNKDGSVLGRGHNMRFQKGSAT

61 LHGEISTLENCGRLEGKVYKDTTLYTTLSPCDMCTGAIIMYGIPRCVIGENVNFKSKGEK

121 YLQTRGHEWVVDDERCKKLMKQFIDERPQDWFEDIGE-

El diseño final de la construcción que integra 3 sustituciones de aminoácidos A23L / V108I / I140L utilizando codones preferidos y utiliza el uso de codones humanos preferidos para la secuencia completa (este gen se llama CDopt 3pt [también conocido como CD2] y T5.0002 cuando se inserta en el vector plasmídico pAC3, que codifica el RCR con IRES) (SEQ ID NO: 34):

1 ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAG

61 GAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAAC

121 AAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACC

181 CTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAG

241 GACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATG

301 TACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAG

361 TACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTG

421 ATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTGATAA

Los codones subrayados denotan codones preferidos para sustituciones de aminoácidos.

Diseño de secuencia CD optimizada (preferencia de codones humanos 3 sustituciones de aminoácidos)

AACACGATTATAAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATA TCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTG ATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTC CGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGT ACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATC ATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAA GTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGA TGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTAAGCGGCC

GC GCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG (SEQ ID

N O :35 )

C. Construcción del gen de fusión CD-UPRT (CDopt 3pt-UPRT. [también conocido como CDopt-UPRT y CD2-UPRT1. T5.0003 en el vector de RCR del plásmido pAC3) También se desarrolló una construcción de fusión que comprende un polipéptido de CD como se ha descrito anteriormente unido a un polipéptido UPRT para generar una secuencia UPRT CD optimizada utilizando el Esquema I como se muestra en la Figura 2A. Los siguientes cebadores se utilizaron para delecionar el inicio-terminación entre CD y UPRT.

Secuencia del cebador:

El polinucleótido de fusión resultante comprende 1296 pb y la secuencia expuesta inmediatamente a continuación:

D. Construcción del gen de fusión de CD-enlazador UPRT (CDopt 3pt-LINK-UPRT [también conocido como CDopt-ENLAZADOR-UPRT y CD2-L-UPRT])._También se desarrolló una construcción de fusión mediante la clonación de un dominio enlazador (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4 dentro y en el marco con el polipéptido de CD y el polipéptido de UPRT para generar una secuencia de UPR^t enlazador CDoptimizado utilizando el Esquema II como se representa en 2B. Los siguientes cebadores se utilizaron para insertar el enlazador.

La construcción resultante tiene el tamaño: 1356 pb y la secuencia inmediatamente a continuación:

E. Construcción del gen de fusión CD-OPRT (CDopt 3pt-OPRT [también conocido como CDopt-OPRT y CD2-OPRTI, T5.0004 cuando se inserta en el vector RCR del plásrnido pAC3) También se desarrolló una construcción de fusión que comprende un polipéptido de CD como se ha descrito anteriormente unido a un polipéptido OPRT para generar una OPRTasa de CD optimizada (CD humanizada mutación 3pt OPRTasa dominio funcional humano) usando el Esquema III como se muestra en la Figura 2C.

La construcción resultante comprende un tamaño de 1269 pb y la secuencia inmediatamente a continuación:

AACACGA TTATAAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTT

ACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAG

GACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGA

GATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCA

CCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGC

GAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGT

TGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGG

A TA TC G G C G AG G C G G TC G C TC G TG cagctttggggcca ttgg tgacgggtc tg tacgacg tgcaggc t t t c a a g t t t g g g g a c t t c g t g c t g a a g a g c g g g c t t t c c t c c c c c a t c t a c a t c g a t c t g c g g g g c a t

c g t g t c t c g a c c g c g t c t t c t g a g t c a g g t t g c a g a t a t t t t a t t c c a a a c t g c c c a a a a t g c a g g c a t c a g t t t t g a c a c c g t g t g t g g a g t g c c t t a t a c a g c t t t g c c a t t g g c t a c a g t t a t c t g t t c a a c c a a t c a a a t t c c a a t g c t t a t t a g a a g g a a a g a a a c a a a g g a t t a t g g a a c t a a g c g t c t t g t a g a a g g a a c t a t t a a t c c a g g a g a a a c c t g t t t a a t c a t t g a a g a t g t t g t c a c c a g t g g a t c t a g t g t t t t g g a a a c t g t t g a g g t t c t t c a g a a g g a g g g c t t g a a g g t c a c t g a t g c c a t a g t g c t g t t g g a c a g a g a g c a g g g a g g c a a g g a c a a g t t g c a g g c g c a c g g g a t c c g c c t c c a c t c a g t g t g t a c a t t g t c c a a a a t g c t g g a g a t t c t c g a g c a g c a g a a a a a a g t t g a t g c t g a g a c a g t t g g g a g a g t g a a g a g g t t t a t t c a g g a g a a t g t c t t t g t g g c a g c g a a t c a t a a t g g t t c t c c c c t t t c t a t a a a g g a a g c a c c c a a a g a a ctcaGCTTCGGTGCACGTGCAGAGCTGCCCAGGATCCACCCAGTTGCATCGAAGTAA|GCGGCCGC|GCC ATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG (SEQ ID NO :42)

F. Construcción del gen de fusión CP-enlazador-QPRT (CDopt 3pt-LINK-OPRT. [también conocido como CDopt-ENLAZADOR-OPRT ^y CD2-L-0PRT1, T5.0005 en el vector RCR plasmídico pAC3) También se desarrolló una construcción de fusión mediante la clonación de un dominio enlazador (Ser-GlY-GlY-GlY-GlY)4) entre ^y en el marco con el polipeptídico de CD ^y el polipéptido OPRT para generar una secuencia de CDoptimizada -enlazador-OPRT utilizando el Esquema IV como se muestra en la Figura 2D.

La construcción resultante comprende un tamaño de 1329 pb ^y la secuencia inmediatamente a continuación:

AACACGA TTATAAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTT

ACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAG

GACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGA

GATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCA

CCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGC

GAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGT

TGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGG

ATATCGGCGAGTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGC

G C C G C G G T C G C T C G T G c a g c t t t g g g g c c a t tg g tg a c g g g tc tg ta c g a c g tg c a g g c t t t c a a g t t t g g g g a c t t c g t g c t g a a g a g c g g g c t t t c c t c c c c c a t c t a c a t c g a t c t g c g g g g c a t c g t g t c t c g a c c g c g t c t t c t g a g t c a g g t t g c a g a t a t t t t a t t c c a a a c t g c c c a a a a t g c a g g c a t c a g t t t t g a c a c c g t g t g t g g a g t g c c t t a t a c a g c t t t g c c a t t g g c t a c a g t t a t c t g t t c a a c c a a t c a a a t t c c a a t g c t t a t t a g a a g g a a a g a a a c a a a g g a t t a t g g a a c t a a g c g t c t t g t a g a a g g a a c t a t t a a t c c a g g a g a a a c c t g t t t a a t c a t t g a a g a t g t t g t c a c c a g t g g a t c t a g t g t t t t g g a a a c t g t t g a g g t t c t t c a g a a g g a g g g c t t g a a g g t c a c t g a t g c c a t a g t g c t g t t g g a c a g a g a g c a g g g a g g c a a g g a c a a g t t g c a g g c g c a c g g g a t c c g c c t c c a c t c a g t g t g t a c a t t g t c c a a a a t g c t g g a g a t t c t c g a g c a g c a g a a a a a a g t t g a t g c t g a g a c a g t t g g g a g a g t g a a g a g g t t t a t t c a g g a g a a t g t c t t t g t g g c a g c g a a t c a t a a t g g t t c t c c c c t t t c t a t a a a g g a a g c a c c c a a a g a a c t c a G C T T

CGGTGCACGTGCAGAGCTGCCCAGGATCCACCCAGTTGCATCGAAGTAA|GCGGCCGC|GCCATAGATAA

AATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG. (SEQ ID N O :43)

Ejemplo 2 Producción de vectores infecciosos

El vector se puede producir de varias maneras. pero la primera etapa es introducir el vector de ADN plasmídico en las células para permitir la producción de partículas infecciosas. que luego se pueden recoger del sobrenadante celular. Una vez que se han generado partículas infecciosas. los expertos en la técnica pueden implementar otros procedimientos de producción. Las partículas del vector se generaron por transfección transitoria de células 293T Pear et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:8392-8396 1993). Las células 293T se descongelaron y se pusieron en cultivo. luego se pasaron dos veces en matraces T-75 que contenían 15 ml del medio DMEM que se preparó mezclando medio DMEM rico en glucosa (Hyclone # 30081, 500 mi) con FBS (Hyclone # SH30070, 50 mi), L-Glutamlna (Cellgro # 25-005-Cl, 5 mi), NE^aA (Hyclone # SH30238, 5 mi) y Penicilina-estrep (Cellgro # 30-002-C^í, 5 mi). L^os matraces se Incubaron a 370C y 5 % de CO2. Después del tercer paso, las células se sembraron en 6 T-25, conteniendo cada 5 mi del medio, a una densidad celular de 1,8 x 106 células / T-25 (o 7,2 x 104 células / cm2). Un día después de sembrar los T-25, las células se transfectaron con el plásrnido T5.0002 que expresaba el vector viral utilizando el kit de transfección de fosfato de calcio de Promega (N.^o de cat. E1200). Dieciocho horas después de la transfección, los medios en un conjunto de matraces (3 matraces cada conjunto) se reemplazaron con medio fresco que contenía NaB 10 mM. Los medios en el segundo conjunto de los matraces no fueron reemplazados, sirvieron como control (NaB cero). Ocho horas después del tratamiento con NaB, los medios en todos los matraces se reemplazaron con el medio fresco que no contenía NaB. Se permitió que la expresión continuara para ambos conjuntos de matraces hasta el día siguiente (22 horas de duración). Los sobrenadantes de ambos conjuntos de matraces se recolectaron y analizaron para determinar sus títulos mediante qPCR expresados en Unidades de Transducción (UT) / mi (véase el ejemplo 3).

Los resultados del título se muestran en la siguiente tabla.

Las preparaciones de vector posteriores se produjeron de esta manera, sin butirato de sodio. L^os otros plásmidos vectores se han utilizado de la misma manera para generar preparaciones de vectores con títulos entre 10e5 UT / mi y 10e7 UT / mi. Tal material puede purificarse adicionalmente y concentrarse, si se desea, como se describe a continuación y véase también: documento US 5792643; T. Rodriguez et al. J Gene Med 9:233 2007; solicitud de Estados Unidos 61218063. En ciertas realizaciones de la divulgación, la dosificación se calculó por gramos de peso de cerebro. En dichas realizaciones, la dosificación de un vector retroviral competente para la replicación de la divulgación útil en los procedimientos para el tratamiento puede variar de 103 a 107 uT por gramo de peso de cerebro.

Ejemplo 3 Ensayo cuantitativo de titulación por PCR

La concentración del vector funcional, ^o título, se determinó utilizando un método basado en la PCR cuantitativa (qPCR). En este método, el vector se titula infectando una línea de células huésped transducible (por ejemplo, células PC-3 de carcinoma prostático humano, ATCC n.o de cat. CRL-1435) con un volumen normalizado de vector y midiendo la cantidad resultante de provirus presente en las células huésped tras la transducción. Las células y el vector se incubaron en condiciones de cultivo normalizadas (37 °C, 5 % de CO2) durante 24 horas para permitir una infección completa antes de la adición del AZT antirretroviral para detener la replicación del vector.

A continuación, las células se recogieron de la placa de cultivo y el ADN genómico (ADNg) se purificó utilizando un kit de purificación del ADNg Purelink de Invitrogen y se eluyeron de la columna de purificación con agua estéril exenta de ARNasa/ADNasa. La relación de absorbancia A260 / A280 se mide en un espectrofotómetro para determinar la concentración y la pureza relativa de la muestra. Las concentraciones de ADNg se normalizaron con agua exenta de ARNasa/ADNasa adicional hasta la concentración más baja de cualquier conjunto dado de preparaciones de ADNg de tal manera que la entrada de ADN para la qPCR es constante para todas las muestras analizadas. Se evaluó además la pureza del ADN genómico mediante la electroforesis de una alícuota de cada muestra en un gel de agarosa al 0,8 % teñido con bromuro de etidio. Si la muestra pasa un intervalo de absorbancia A260 / A280 de 1,8-2,0 y muestra una sola banda de ADNg, a continuación, la muestra está lista para el análisis de la qPCR del número de copias províricas del vector. Utilizando cebadores que interrogan la región LTR del provirus (vector de ADN transcrito de forma inversa y vector de ADN que se integra en el ADNg hospedador), se llevó a cabo la qPCR para estimar el número total de eventos de transducción producidos cuando el volumen conocido del vector se utilizó para transducir el número de células conocido. El número de eventos de transducción por reacción se calcula a partir de una curva estándar que utiliza un plásmido portador de diana del número de copia conocido que se diluye en serie de 1E7 a 1E1 copias y se mide en condiciones de qPCR idénticas a las muestras. A partir del conocimiento de cuántos equivalentes genómicos se utilizaron para cada reacción de la qPCR (a partir de la concentración previamente determinada) y cuántos eventos de transducción se produjeron por reacción, los inventores determinaron el número total de eventos de transducción que se produjeron basándose en el número total de células que estuvieron presentes en el momento de la transducción. Este valor es el título del vector tras la dilución en el medio que contiene las células durante la transducción inicial. Para calcular el valor del título corregido, la dilución se corrige multiplicando por el rendimiento del volumen del cultivo y el volumen del título dividido por el volumen del título. Estos experimentos se llevaron a cabo en cultivos replicados y se analizaron mediante la qPCR utilizando mediciones por triplicado para cada condición para determinar un título promedio y con ^su desviación estándar y el coeficiente de la varianza asociada.

Ejemplo 4 Niveles de expresión medidos por transferencia de tipo Western

La Figura 3 demuestra que se observan niveles más altos del codón humano optimizado con las tres mutaciones para una mayor estabilidad en comparación con la proteína yCD de tipo salvaje en un análisis de transferencia Western de células U-87 infectadas con virus que codifican los genes de citosina desaminasa de tipo salvaje (ACE-yCD) ^o completamente optimizados (AC3-yCD2).

Ejemplo 5 Estabilidad genética de vectores virales.

Se reconoce que después de la transcripción inversa y el primer evento de integración en las células tratadas, el provirus de ADN y cualquier retrovirus de progenie posterior tiene una estructura de LTR convencional de MLV en cada extremo. Se ha demostrado que esta configuración es estable después de múltiples ciclos de infección (consulte la Figura 4 a continuación).

AproximadamentelO6 células U-87 intactas se infectaron inicialmente con el vector viral a una MOI de 0,01 y se cultivaron hasta que se infectaron completamente para completar un solo ciclo de infección. El sobrenadante se recalienta en células no infectadas y se repite el ciclo. La estabilidad genómica de la secuencia de yCD2 se evaluó mediante amplificación por PCR del provirus integrado de las células infectadas utilizando cebadores específicos de MLV que flanquean el sitio de inserción del transgén. Para cada conjunto de infecciones, También se realizó amplificación del plásmido vector (pAC3-yCD2 y el vector pACE-CD de Kasahara et al.) para rastrear el tamaño del amplicón de longitud completa en el gel. La aparición de cualquier banda más pequeña que un amplicón de longitud completa sería un indicador de la inestabilidad del vector. Dichos experimentos demostraron que un vector de la divulgación (T5.OOO2, que comprende el vector modificado y el polinucleótido heterólogo CDopt 3pt (CD2) mantuvo la estabilidad de más pasajes que pACE-CD o T5.OO7, Ios cuales llevan la levadura de tipo salvaje.

Ejemplo 6 Experimentos de destrucción celular

En experimentos de cultivo celular in vitro, Ios experimentos demuestran que la citosina desaminasa en las células que expresan la proteína yCD2 es al menos tan activa como la de las células que expresan la proteína yCD de tipo salvaje, realizando valoraciones de 5-FC en células de rata RG2 (Figura 5A) ^o células U-87 (Figura 5B) infectadas, ya sea con virus creado a partir de pAC3-yCD2 / T5.OOO2) [AC3-yCD2 (V)] a partir de pAc3-yCD / T5.OOO7 [AC3-yCD (V)] ^o I^os otros vectores. En resumen, para células ^u-87, 5 días después de la infección a una multiplicidad de infección de 0,1 (es decir, 1OO % infectada) con el vector AC3-yCD (CD de tipo salvaje) o el vector AC3-yCD2 (termoestabilizado y codón optimizado) se sometieron a cantidades crecientes de 5-FC ^o 0,1 mM de 5-FU como control positivo durante 8 días. El día 8 del tratamiento 5-FC, se evaluó la viabilidad de Ios cultivos celulares utilizando un ensayo MTS (Promega CellTiter 96 AQUEOUS One Solution Proliferation Assay). Los datos muestran una destrucción comparable entre Ios dos vectores retrovirales a dosis crecientes de tratamiento con 5-FC. Los cultivos de RG2 se trataron de manera similar y también muestran, en todo caso, un ligero cambio en la curva de destrucción hacia la concentración más baja de 5-FC para el virus del ensayo de expresión T5.OOO2CD. Las células U87 se transdujeron a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1, se cultivaron durante 5 días para permitir la propagación viral y se recolectaron las células a partir del día 5 posterior a la transducción. Las células se recogieron luego por centrifugación a 8OO ^x g durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró del sedimento celular y se lavó con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugó nuevamente a 8OO x g durante 5 minutos. El sedimento celular resultante se recogió en 1,5 ml de PBS, se resuspendió mediante el paso a través de una punta de pipeta y se coloca en un congelador a -200C. Las células se lisaron mediante un procedimiento de congelación / descongelación. Las células previamente resuspendidas se dejaron descongelar a temperatura ambiente, se pasaron a través de una punta de pipeta, se mezclaron con un cóctel inhibidor de proteasa y nuevamente se congelaron a -20 oc. Previo al ensayo enzimático, la muestra se descongeló de nuevo a temperatura ambiente y se pasó a través de una punta de pipeta. A continuación, la suspensión se centrifugó a 14.OOO rpm en una centrífuga de mesa durante 5 minutos. El sobrenadante se decantó del sedimento y se coIocó en un tubo eppendorf nuevo y se ^coI^ocó en hielo. La actividad de la enzima yCD se evaluó utilizando un ensayo de HPLC.

El ensayo de HPLC se realizó en una unidad Shimadzu LC2OAT conectada en serie con un detector de fotomatriz y un autoinyector. La fase sólida fue una columna de HPLC Hypersil BDS C18 con un tamaño de esfera de 5 um y dimensiones de columna de 4,0 x 25O mm. La fase móvil fue fosfato de amonio 50 mM, pH 2,1, que contiene O,O1 % de perclorato de terc-butilamonio y 5 % de metanol; el sistema se equilibró a 22 ^oc. Todos I^os reactivos fueron de calidad ACS y I^os disolventes fueron de calidad HPLC. Se hizo una mezcla de reacción que consistía en 8OO |^jI con una concentración final de 0,125 mg / ml de 5FC (1 mM) en PBS y se coIocó en un vial de automuestreador de 1,5 ml. A continuación, la reacción se inició añadiendo 2OO ^uI de cada lisado celular. L^os viales de reacción / automuestreador se colocaron en el automuestreador y se inyectaron 5 j l de la mezcla de reacción. Los puntos de tiempo se tomaron periódicamente recuperando una alícuota de 5 ul de cada vial de reacción y analizando en la columna de HPLC. Las tasas de conversión de 5FC en 5FU se calcularon comparando las áreas de I^os picos con cantidades conocidas de una curva estándar generada previamente de 5FU. La tasa de conversión de 5FC en 5FU se derivó trazando la cantidad de 5FU (en nmol) generada contra ^su intervalo de tiempo correspondiente. Se derivó la concentración de proteína para la muestra de células y la actividad específica de las muestras de lisado celular se calculó dividiendo la tasa de conversión (nmol / min) por la cantidad de proteína utilizada en el ensayo en mg. La

Claims (15)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Un vector que comprende un polinucleótido que comprende Ios pares de bases 8877 a 9353 de la SEQ ID NO: 19, que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa (CD).

2. El vector de la reivindicación 1, donde el polinucleótido comprende además un polinucleótido UPRT ^u OPRT que codifica un polipéptido que tiene actividad UPRT u OPRT unida operativamente al polipéptido que tiene actividad CD, preferentemente donde el polinucleótido UPRT u OPRT está optimizado por codones y / o separado del polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad CD por un enlazador.

3. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 1 o la reivindicación 2,

donde la célula huésped es una célula humana, preferentemente una célula humana transformada de manera estable y / o donde la célula huésped es una célula que comprende un trastorno de proliferación celular, preferentemente glioblastoma multiforme.

4. El vector de la reivindicación 1 ^o la reivindicación 2, donde el vector es un vector de expresión y / ^o en donde el vector es un plásmido o un vector viral, preferentemente donde el vector viral es un retrovirus competente para la replicación.

5. El vector de la reivindicación 4, donde el retrovirus competente para la replicación (RCR) comprende:

una proteína GAG retroviral;

una proteína POL retroviral;

una cubierta retroviral;

un polinucleótido retroviral que comprende secuencias de repetición terminales largas (LTR) en el extremo 3' de la secuencia de polinucleótido retroviral, una secuencia promotora en el extremo 5' del polinucleótido retroviral, siendo dicho promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero, un dominio de ácido nucleico gag, un dominio de ácido nucleico pol y un dominio de ácido nucleico env;

un casete que comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo que comprende un polinucleótido que comprende I^os pares de bases 8877 a 9353 de la SEQ ID NO: 19, donde T es U, donde el casete está posicionado en 5' a 3' LTR y 3' al dominio de ácido nucleico env que codifica la cubierta retroviral; y secuencias que actúan en cis necesarias para la transcripción inversa, empaquetamiento e integración en una célula objetivo, opcionalmente, donde la célula diana es una célula neoplásica y / o una célula que tiene un trastorno de proliferación celular, preferentemente, donde el trastorno de proliferación celular se selecciona de cáncer de pulmón, cáncer de colon y recto, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer de útero, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, melanoma, cáncer de estómago y cáncer de ovarios, Artritis reumatoide u otra enfermedad autoinmune.

6. El vector de la reivindicación 5, donde el retrovirus tiene una secuencia polinucleotídica derivada del virus de la leucemia murina (MLV), opcionalmente donde el MLV es un MLV anfotrópico, el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus de la leucemia felina o virus de la leucemia del simio de Gibbon (GALV),

y / o donde el retrovirus es un gammaretrovirus,

y / ^o donde la secuencia promotora está asociada con un gen regulador del crecimiento,

y / ^o donde la secuencia promotora comprende:

a) una secuencia promotora específica de tejido, preferentemente donde la secuencia promotora específica de tejido comprende al menos un elemento de respuesta a andrógenos (ARE), preferentemente donde el elemento de respuesta a andrógenos deriva del promotor de probasina y, opcionalmente, donde la secuencia promotora específica de tejido es un promotor de probasina; o

b) comprende un promotor del CMV que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19, 20 o 22 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 582, donde T es U, y que es capaz de dirigir e iniciar la transcripción; o ^c) comprende un polinucleótido del dominio CMV-R-U5, preferentemente donde el dominio CMV-R-U5 comprende el promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano unido a una región R-U5 del MLV, preferentemente, donde el polinucleótido del dominio CMV-R-U5 comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19, 20 ^o 22 desde el nucleótido 1 al nucleótido 1202 ^o secuencias que son al menos un 95 % idénticas a una secuencia como se expone en la SEQ. ID NO: 19, 20 ^o 22, donde el polinucleótido promueve la transcripción de una molécula de ácido nucleico unida operativamente a la anterior.

7. El vector de acuerdo con la reivindicación 6, donde el gag del polinucleótido deriva de un gammaretrovirus, preferentemente, donde el dominio de ácido nucleico gag comprende una secuencia desde el número de nucleótido 1203 hasta el nucleótido 2819 de la SEQ ID NO: 19, donde T es U, o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % o 99,8 % de identidad con la anterior,

y / ^o donde el dominio pol del polinucleótido se deriva de un gammaretrovirus, preferentemente en donde el dominio pol comprende una secuencia desde el número de nucleótido 2820 hasta el nucleótido 6358 de la SEQ ID NO: 19, donde T es U, ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 %, 99 % ^o 99,9 % de identidad con la anterior, y / o donde el dominio env comprende una secuencia desde el número de nucleótido 6359 hasta el nucleótido 8323 de la SEQ ID NO: 19, donde T es U, ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98%, 99 % ^o 99,8 % de identidad, y / o donde el IRES deriva de un virus de encefalomiocarditis, preferentemente donde el IRES comprende una secuencia desde el número de nucleótido 8327 hasta aproximadamente el nucleótido 8876 de la SEQ ID NO: 19, donde T es U, ^o una secuencia que tiene al menos un 95 %, 98 % ^o 99 % de identidad con el mismo, y / ^o donde el LTR en 3' deriva de un gammaretrovirus, preferentemente, donde la LTR en 3' comprende un dominio U3-R-U5, o comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 desde el nucleótido 9405 hasta el 9998 ^o una secuencia que es al menos un 95 %, 98 % ^o 99,5 % idéntico al mismo,

y / ^o donde el polinucleótido retroviral comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19, 20 ^o 22, donde T es U.

8. Un polinucleótido aislado que comprende de 5' a 3':

una fusión CMV-R-U5 del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano en una región R-U5 del VLM; un PBS, un sitio de unión al cebador para la transcriptasa inversa;

un sitio 5' de corte y empalme;

una señal de empaquetamiento ^y ;

una secuencia de codificación gag para el antígeno específico del grupo del VLM;

una secuencia de codificación pol para la poliproteína de la polimerasa de VLM;

un sitio 3' de corte y empalme;

una secuencia de codificación de env 4070a para la proteína de la cubierta de la cepa 4070a del MLV;

un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis;

un polinucleótido que comprende los pares de bases 8877 a 9353 de la SEQ ID NO:19, que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa; un tracto de polipurina; y

una repetición terminal larga U3-R-U5 del MLV.

9. El polinucleótido de la reivindicación 8, donde el polinucleótido retroviral comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 ^o 22,

y / ^o donde la secuencia de polinucleótidos retroviral deriva del virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la leucemia murina de Moloney (M^oMLV), el virus de la leucemia felina ^o el virus de la leucemia de simio de Gibbon (GALV), preferentemente donde el M^oMLV es un M^oMLV anfotrópico.

10. Un polinucleótido como se define en la reivindicación 8 ^o la reivindicación 9 para ^{su uso} en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno de proliferación celular en combinación con 5-fluorocitosina en condiciones tales que se expresa el polinucleótido.

11. El polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 10,

donde las condiciones son tales que el polinucleótido está integrado en la célula del sujeto, y / ^o donde el polinucleótido está comprendido en un vector retroviral, preferentemente donde el vector retroviral comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 o 22,

y / o donde el trastorno de proliferación celular se selecciona de cáncer de pulmón, cáncer de colon y recto, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer de útero, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, melanoma, cáncer de estómago y cáncer de ovarios, artritis reumatoide ^u otra enfermedad autoinmune, opcionalmente, donde el trastorno de proliferación celular es glioblastoma multiforme.

12. Un vector como se define en la reivindicación 5, para ^{su uso} en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno de proliferación celular en combinación con 5-fluorocitosina.

13. El vector para ^{su uso} de acuerdo con la reivindicación 12, donde el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4, 12, 14, 16, o 18,

y / o donde el polinucleótido retroviral comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 19 o 22.

14. Un polinucleótido aislado que comprende:

una primera secuencia de codificación que comprende los pares de bases 8877 a 9353 de la SEQ ID NO: 19 que codifica un polipéptido que tiene actividad citosina desaminasa; y

una segunda secuencia de codificación que codifica un polipéptido que tiene actividad UPRT ^u OPRT, donde la primera secuencia de codificación está unida operativamente a la segunda secuencia de codificación.

15. El polinucleótido aislado de la reivindicación 14, donde la primera y la segunda secuencia de codificación están separadas por una secuencia que codifica un enlazador peptídico,

y / o donde el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 12, 14 o 16.