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ES2702318T3 - Emulsiones catiónicas de aceite en agua - Google Patents

Emulsiones catiónicas de aceite en agua Download PDF

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ES2702318T3
ES2702318T3 ES12743273T ES12743273T ES2702318T3 ES 2702318 T3 ES2702318 T3 ES 2702318T3 ES 12743273 T ES12743273 T ES 12743273T ES 12743273 T ES12743273 T ES 12743273T ES 2702318 T3 ES2702318 T3 ES 2702318T3
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ES
Spain
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oil
mol
emulsion
rna
cationic
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English (en)
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Luis Brito
Michelle Chan
Andrew Geall
Derek O'hagan
Manmohan Singh
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Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersan en una fase acuosa continua, en la que el diámetro promedio de dichas partículas es de 80 nm a 150 nm; la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, y en la que: (i) la relación de aceite:lípido (mol:mol) es de al menos 8:1 (mol:mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos 2,5 mM; y (iii) el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB).

Description

DESCRIPCIÓN
Emulsiones catiónicas de aceite en agua
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/505.109, presentada el 6 de julio de 2011, la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/545.936, presentada el 11 de octubre de 2011, y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/585.641, presentada el 11 de enero de 2012.
Listado de secuencias
La presente solicitud un listado de secuencias que se ha enviado en formato ASCII a través de EFS-Web. Dicha copia ASCII, creada el 5 de julio de 2012, se denomina PAT54691.txt y tiene un tamaño de 424.203 bytes.
Antecedentes de la divulgación
Los productos terapéuticos de ácido nucleico son prometedores para tratar enfermedades que varían desde trastornos heredados hasta trastornos adquiridos tales como cáncer, trastornos infecciosos (SIDA), cardiopatía, artritis y trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, Parkinson y Alzheimer). No solo pueden suministrarse genes funcionales para reparar una deficiencia genética o inducir la expresión de productos genéticos exógenos, sino que también puede suministrarse ácido nucleico para inhibir la expresión de genes endógenos para proporcionar un efecto terapéutico. La inhibición de la expresión de genes puede estar mediada, por ejemplo, por oligonucleótidos antisentido, ARN bicatenarios (por ejemplo, ARNip; miARN) o ribozimas.
Una etapa clave para dicha terapia es suministrar moléculas de ácido nucleico al interior de células in vivo. Sin embargo, el suministro in vivo de moléculas de ácido nucleico, en particular moléculas de ARN, afronta diversos obstáculos técnicos. Primero, debido a las nucleasas celulares y séricas, la semivida del ARN inyectado in vivo es solo de aproximadamente 70 segundos (véase, por ejemplo, Kurreck, Eur. J. Bioch. 270:1628-44 (2003)). Se han hecho esfuerzos por aumentar la estabilidad del ARN inyectado utilizando modificaciones químicas; sin embargo, hay varios casos en los que las alteraciones químicas llevaron a aumentar los efectos citotóxicos o a la pérdida o disminución de la función. En un ejemplo específico, las células fueron intolerantes a dosis de un dúplex de ARNi en el cual cada segundo fosfato se reemplazó por fosforotioato (Harborth, y col., Antisense Nucleic Acid Drug Rev.
13(2): 83-105 (2003)). De esta manera, existe la necesidad de desarrollar sistemas de suministro que puedan suministrar in vivo cantidades suficientes de moléculas de ácido nucleico (en particular moléculas de ARN) para provocar una respuesta terapéutica, pero que no sean tóxicas para el hospedador.
Las vacunas basadas en ácido nucleico son una estrategia atractiva para la vacunación. Por ejemplo, la inmunización intramuscular (IM) de ADN plasmídico que codifica antígenos, puede inducir respuestas inmunitarias celulares y humorales y proteger contra la exposición. Las vacunas de ADN ofrecen ciertas ventajas sobre las vacunas tradicionales que usan antígenos de proteínas, o patógenos atenuados. Por ejemplo, en comparación con las vacunas de proteínas, las vacunas de ADN pueden ser más eficaces para producir un antígeno adecuadamente plegado en su conformación nativa, y para generar una respuesta inmunitaria celular. Las vacunas de ADN tampoco tienen algunos de los problemas de seguridad asociados con patógenos eliminados o atenuados. Por ejemplo, una preparación de virus eliminados puede contener virus vivos residuales, y un virus atenuado puede mutar y volver a un fenotipo patógeno.
Una limitación de las vacunas basadas en ácido nucleico es que generalmente se requieren grandes dosis de ácido nucleico para obtener fuertes respuestas inmunitarias en primates no humanos y en seres humanos. Por lo tanto, para aumentar la fuerza de las vacunas basadas en ácido nucleico se requieren sistemas de suministro y adyuvantes. Se han desarrollado varios procedimientos para introducir moléculas de ácido nucleico en las células, tales como transfección con fosfato de calcio, transfección de polipreno, fusión de protoplastos, electroporación, microinyección y lipofección.
Los lípidos catiónicos se han formulado como liposomas para suministrar genes al interior de las células. Además, se han desarrollado emulsiones catiónicas de lípidos para suministrar moléculas de ADN al interior de las células. Véase, por ejemplo, Kim, y col., International Journal of Pharmaceutics, 295, 35-45 (2005).
Ott y col. (Journal of Controlled Release, volumen 79, páginas 1-5, 2002) describen una estrategia que implica una emulsión catiónica submicrométrica como un sistema de suministro/adyuvante para ADN. La estrategia de emulsión submicrométrica se basa en MF59, un potente escualeno en adyuvante de agua que es un componente del producto Fluad® autorizado para su comercialización. Para facilitar el suministro intracelular de ADN plasmídico se utilizó 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).
Yi y col. (Pharmaceutical Research, 17, 314-320 (2000)) desvelan emulsiones catiónicas de aceite en agua que utilizan aceite de soja y DOTAP como el lípido catiónico. También se incluyó colesterol, DOPE y lípidos poliméricos en algunas de las emulsiones. Las emulsiones mostraron potenciar la eficacia de la transfección de ADN in vitro en presencia de un porcentaje de suero de hasta un 90 %. El tamaño promedio de las partículas de la emulsión varió de 181 nm a 344 nm, y el tamaño de las partículas aumentó después de diluir las emulsiones en tampón PBS.
Kim y col. (Pharmaceutical Research, vol. 18, páginas 54-60, 2001) y Chung y col. (Journal of Controlled Release, volumen 7, páginas 339-350, 2001) desvelan varias emulsiones de aceite en agua que se utilizaron para potenciar la eficacia de transfección de moléculas de ADN in vitro e in vivo. Entre los lípidos catiónicos que se sometieron a ensayo, fue DOTAP el que formó la emulsión más estable y eficiente para el suministro de ADN. Entre los aceites sometidos a ensayo, el escualeno, el aceite mineral ligero y el aceite de semilla de jojoba, formaron emulsiones estables con partículas pequeñas. Las eficacias de la transfección in vitro mostraron correlacionarse con la estabilidad de las emulsiones (por ejemplo, la emulsión formulada por escualeno a 100 mg/ml y DOTAP a 24 mg/ml mostró alta eficacia de transfección in vitro). Las emulsiones se prepararon mezclando primero el lípido catiónico con agua para formar una suspensión de liposomas (por ultrasonido). Después, se añadieron liposomas al aceite (tal como escualeno) y la mezcla se sometió a ultrasonido para formar una emulsión de aceite en agua.
Las moléculas de ARN que codifican un antígeno o un derivado del mismo también pueden utilizarse como vacunas. Las vacunas de ARN ofrecen ciertas ventajas en comparación con las vacunas de ADN. Sin embargo, en comparación con las vacunas basadas en ADN, se ha prestado una atención relativamente menor a las vacunas basadas en ARN. Las moléculas de ARN son muy susceptibles a la degradación por nucleasas cuando se administran como un agente terapéutico o vacuna. Además, las moléculas de ARN no se transportan activamente al interior de las células. Véase, por ejemplo, Vajdy, M., y col., Mucosal adjuvants and delivery systems for protein-, DNA- and RNA-based vaccines, Immunol Cell Biol, 2004, 82(6): páginas 617-27.
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar sistemas de suministro para moléculas de ácido nucleico u otras moléculas cargadas negativamente. Los sistemas de suministro son útiles para vacunas basadas en ácido nucleico, en particular vacunas basadas en ARN.
Sumario de la divulgación
La divulgación se refiere a emulsiones catiónicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y que tienen una relación de aceite:lípido definida. El aceite y el lípido catiónico son componentes separados de las emulsiones, y de preferentemente el aceite no es iónico. El lípido catiónico puede interactuar con la molécula cargada negativamente anclando de esta manera la molécula a las partículas de emulsión. Las emulsiones catiónicas descritas en el presente documento son útiles para suministrar a las células, moléculas cargadas negativamente, tales como moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN que codifique un antígeno) y para formular vacunas basadas en ácido nucleico.
En un aspecto, la divulgación proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersas en una fase acuosa continua, en la que la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de dichas partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en la que (i) la relación de aceite:lípido catiónico (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 2,5 mM, y (iii) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol. Preferentemente, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas realizaciones, la relación de aceite:lípido (mol:mol) es de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol). La emulsión de aceite en agua puede contener un porcentaje de aceite de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (p/v). En algunas realizaciones, el aceite es escualeno o escualano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersas en una fase acuosa continua, en la que la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en la que (i) la relación de aceite:lípido catiónico (mol:mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 2,5 mM, (iii) el aceite está presente de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (p/v); y (iv) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol. Preferentemente, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas realizaciones, la relación de aceite:lípido (mol:mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol). En algunas realizaciones, el aceite es escualeno o escualano. En algunas realizaciones, el aceite está presente de 0.6% a 4% (p/v). En algunas realizaciones, el aceite está presente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 3,2 % (p/v).
La emulsión de aceite en agua de este aspecto puede comprender además un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico. Preferentemente, el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG)-lípido. El tensioactivo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2,5 % (p/v). En algunas realizaciones, el tensioactivo es SPAN85 (trioleato de sorbitán), Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la emulsión de aceite en agua contiene las mismas cantidades de SPAN85 (trioleato de sorbitán) y de Tween 80 (polisorbato 80), por ejemplo, 0,5 % (p/v) de cada uno.
Preferentemente el grupo que encabeza el lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. Por ejemplo, en algunas realizaciones el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC) y cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA).
En algunas realizaciones, la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas de emulsión es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y DOTAP, en la que (i) la relación de aceite:DOTAP (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), y (ii) la concentración de DOTAP en la emulsión es de al menos aproximadamente 2,58 mM (1,8 mg/ml), o de aproximadamente 2,58 mM (1.8 mg/ml) a aproximadamente 7,16 mM (5 mg/ml). El aceite puede ser escualeno o escualano.
En algunas realizaciones, la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas de la emulsión es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y DOTAP, en la que (i) la relación de aceite:DOTAP (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de DOTAP en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 2,58 mM (1,8 mg/ml) y (iii) el aceite está presente de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (p/v). En algunas realizaciones, el aceite es escualeno o escualano. En algunas realizaciones, la concentración de DOTAP es de aproximadamente 2,58 mM (1,8 mg/ml) a aproximadamente 7,16 mM (5 mg/ml). En algunas realizaciones, el aceite está presente a un porcentaje de 0,6 % a 4 % (p/v). En algunas realizaciones, el aceite está presente a un porcentaje de aproximadamente 1 % a aproximadamente 3,2 % (p/v).
La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersas en una fase acuosa continua, en la que la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en la que (i) la relación de aceite:lípido catiónico (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2,5 mM, y (iii) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol, el procedimiento comprende (a) disolver directamente el lípido catiónico en el aceite para formar una fase oleaginosa; (b) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (c) dispersar la fase oleaginosa en la fase acuosa por homogeneización. El aceite puede calentarse a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °C para facilitar la disolución del lípido catiónico en el aceite. También pueden utilizarse temperaturas más altas, siempre y cuando no haya degradación significativa del aceite o del lípido catiónico.
La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que se dispersan en una fase acuosa continua, en la que la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en la que (i) la relación de aceite:lípido catiónico (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de a menos aproximadamente 2,5 mM, (iii) el aceite está presente a un porcentaje de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (p/v); y (iv) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol, el procedimiento comprende (a) disolver directamente el lípido catiónico en el aceite para formar una fase oleaginosa; (b) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (c) dispersar la fase oleaginosa en la fase acuosa por homogeneización. El aceite puede calentarse a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °C para facilitar la disolución del lípido catiónico en el aceite. También pueden utilizarse temperaturas más altas, siempre y cuando no haya degradación significativa del aceite o del lípido catiónico.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (preferentemente una molécula de ARN) formando un complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en la que la partícula comprende un aceite que está en fase líquida a 25 °C, y un lípido catiónico; y (i) la relación de aceite:lípido (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en dicha composición es de al menos aproximadamente 1,25 mM; y (iii) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol. Preferentemente, el diámetro promedio de las partículas de emulsión es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, o de aproximadamente 80 nm a 150 nm, o de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 130 nm, y la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1, o de aproximadamente 4:1 a aproximadamente de 20:1, o de aproximadamente 4:1 a aproximadamente de 15:1. En ciertas realizaciones, la relación de aceite:lípido (mol:mol) es de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a aproximadamente de 43:1 (mol:mol). La emulsión de aceite en agua puede contener un porcentaje de aceite de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 5 % (p/v). En algunas realizaciones, el aceite es escualeno o escualano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (preferentemente una molécula de ARN) formando un complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en la que la partícula comprende un aceite que está en fase líquida a 25 °C, y un lípido catiónico; y (ii) la relación de aceite:lípido (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en la composición es de al menos aproximadamente 1,25 mM; (iii) el aceite está presente en un porcentaje de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 4% (p/v); y (iv) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol. Preferentemente, el diámetro promedio de las partículas de emulsión es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, o de aproximadamente 80 nm a 150 nm, o de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 130 nm, y la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1, o de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 20:1, o de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 15:1. En ciertas realizaciones, la relación aceite:lípido (mol:mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol). En algunas realizaciones, el aceite es escualeno o escualano. En algunas realizaciones, el aceite está presente a un porcentaje de 0,6 % a 4 % (p/v). En algunas realizaciones, el aceite está presente a un porcentaje de aproximadamente 1 % a aproximadamente 3,2 % (p/v).
La emulsión de aceite en agua de este aspecto, puede comprender además un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico. Preferentemente, el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG)-lípido. El tensioactivo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,005 % a aproximadamente 1,25 % (p/v). En algunas realizaciones, el tensioactivo es SPAN85 (trioleato de sorbitán), Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la emulsión de aceite en agua contiene las mismas cantidades de SPAN85 (trioletato de sorbitán) y Tween 80 (polisorbato 80), por ejemplo, 0,25% o 0,5 % (p/v) de cada uno.
Preferentemente el grupo que encabeza el lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. Por ejemplo, en algunas realizaciones el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1,2-dioleoxiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC) y cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (preferentemente una molécula de ARN) formando un complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en la que la partícula comprende un aceite que está en fase líquida a 25 °C y DOTAP; y (i) la relación de aceite:DOTAP (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol); (ii) la concentración de DOTAP en dicha composición es de al menos aproximadamente 1,29 mM, o de aproximadamente 1,29 mM (0,9 mg/ml) a aproximadamente 3,58 mM (2.5 mg/ml). El aceite puede ser escualeno o escualano. Opcionalmente, la relación N/P es de al menos 4:1.
En realizaciones preferidas, la composición está tamponada (por ejemplo, con un tampón de citrato, succinato, acetato) y tiene un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, preferentemente de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,8. La composición puede comprender además una sal inorgánica, y preferentemente la concentración de la sal inorgánica no es mayor que 30 mM. Opcionalmente la composición puede comprender además un agente tonificante no iónico, y preferentemente es isotónica.
La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprenda una molécula de ácido nucleico (preferentemente una molécula de ARN) formando un complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, que comprende: (i) proporcionar una emulsión de aceite en agua como la descrita en el presente documento; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprende la molécula de ARN; y (iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (ii), preparando de esta manera la composición. En algunas realizaciones, la emulsión catiónica de aceite en agua y solución de ARN se combinan a una relación de aproximadamente 1:1 (v/v). Preferentemente, la solución acuosa que comprende la molécula de ARN está tamponada (por ejemplo, con un tampón de citrato, succinato, acetato), puede contener una sal inorgánica (por ejemplo, NaCl), que está preferentemente presente a una concentración de aproximadamente 20 mM o menor. En una realización, la solución acuosa que comprende la molécula de ARN contiene tampón de citrato 2 mM y NaCl 20 mM. Opcionalmente, la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende además un agente tonificante no iónico, y es isotónica. En una realización, la solución acuosa comprende además sacarosa a una concentración de aproximadamente 560 mM. Opcionalmente, la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende además un polímero o tensioactivo no iónico, tal como Pluronic® F127, a de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 20 % (p/v).
En otro aspecto, la divulgación proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersas en una fase acuosa continua, en la que la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, el diámetro promedio de dichas partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, el aceite está presente de 0,6 % a 4 % (p/v); y la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 1,25 mM. Preferentemente, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas realizaciones, la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 2,5 mM. En algunas realizaciones, el aceite es escualeno o escualano.
La emulsión de aceite en agua de este aspecto puede comprender además un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico. Preferentemente, el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG)-lípido. El tensioactivo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2,5 % (p/v). En algunas realizaciones, el tensioactivo es SPAN85 (trioleato de sorbitán), Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la emulsión de aceite en agua contiene las mismas cantidades de SPAN85 (trioleato de sorbitán) y Tween 80 (polisorbato 80), por ejemplo, 0,25 % o 0,5 % (p/v) de cada uno.
Preferentemente el grupo que encabeza el lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. Por ejemplo, en algunas realizaciones el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), cloruro de N,N-dioleoil-N,Ndimetilamonio (DODAC) y cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA).
La divulgación proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (preferentemente una molécula de ARN) formando un complejo con una partícula de una emulsión de aceite en agua que contiene partículas que están dispersas en una fase acuosa continua, en la que la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, el diámetro promedio de dichas partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, el aceite está presente de 0,6 % a 4 % (p/v); y la concentración del lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 1,25 mM. Preferentemente, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas realizaciones, la concentración del lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 2,5 mM. En algunas realizaciones, el aceite es escualeno o escualano. Preferentemente, la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1.
En realizaciones preferidas, la composición está tamponada (por ejemplo, con un tampón de citrato, succinato, acetato) y tiene un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, preferentemente de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,8. La composición puede comprender además una sal inorgánica, y la concentración de sal inorgánica es preferentemente no mayor que 30 mM. Opcionalmente, la composición puede comprender además un agente tonificante, y es, preferentemente, isotónica.
La divulgación también se refiere a un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar, a un sujeto que lo necesite, la composición que se describe en el presente documento. Preferentemente, la cantidad del lípido catiónico administrada al sujeto (como un componente de la composición) en una sola administración, no es mayor que aproximadamente 30 mg. En realizaciones particulares, el lípido catiónico es DOTAP y la cantidad total de DOTAP administrada al sujeto en una sola administración no es mayor que aproximadamente 24 mg, o no es mayor que aproximadamente de 4 mg.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un esquema de replicones de ARN pentacistrónico, A526, A527, A554, A555 y A556, que codifican cinco proteínas de CMV. Los promotores subgenómicos se muestran con flechas, otros elementos de control están marcados.
La figura 2 es un histograma de fluorescencia que muestra que células BHKV transfectadas con el replicón de ARN A527 expresan el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131. Utilizando un anticuerpo que se unía a un epítopo de conformación presente en el complejo pentamérico, se llevó a cabo la tinción celular.
La figura 3 es un esquema y una gráfica. El esquema muestra replicones de ARN bicistrónico, A160 y A531-A537, que codifican las proteínas gH y gL de CMV. La gráfica muestra la actividad neutralizante de sueros inmunes de ratones inmunizados con las VRP que contenían los replicones.
La figura 4 es una gráfica que muestra las respuestas del anticuerpo contra proteínas del VZV en sueros inmunes de ratones inmunizados con replicones de ARN monocistrónico que codifican proteínas del VZV o replicones de ARN bicistrónicos que codificaban las proteínas gE y gI, o gH y gL del VZV. Los ratones se inmunizaron con 7 |jg de ARN formulado con CMF32.
Descripción detallada de la divulgación
1. Perspectiva general
La divulgación se refiere, en general, a emulsiones catiónicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y que tienen una relación de aceite:lípido catiónico definida. El aceite y el lípido catiónico son componentes separados de las emulsiones, y preferentemente el aceite no es iónico. El lípido catiónico puede interactuar con una molécula cargada negativamente, tal como un ácido nucleico, anclando de esta manera la molécula cargada negativamente a las partículas de la emulsión. Las emulsiones catiónicas descritas en el presente documento, son útiles para suministrar in vivo a las células, moléculas cargadas negativamente, tales como moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN que codifique una proteína o péptido, ARN de interferencia pequeño, ARN autorreplicante, y similares) y para formular vacunas basadas en ácido nucleico.
En particular, la presente divulgación se basa en el descubrimiento de que pueden elaborarse satisfactoriamente emulsiones catiónicas de aceite en agua, estables, que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y que tienen una relación de aceite:lípido catiónico definida. Las emulsiones que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos permiten que más moléculas cargadas negativamente (tales como moléculas de ARN) se formulen con partículas de emulsión, aumentando así la eficacia del suministro. En particular, para la administración de muchos agentes terapéuticos, tales como vacunas, se prefieren pequeños volúmenes (por ejemplo, 0,5 ml por dosis). Las emulsiones que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y que tienen una relación de aceite:lípido catiónico definida, como las descritas en la presente, permitirán el suministro de una dosis más alta de ARN dentro de un volumen especificado.
En realizaciones preferidas, una molécula de ARN está formando un complejo con una partícula de la emulsión de aceite en agua. La molécula de ARN formando un complejo está estabilizada y protegida contra la degradación mediada por RNasa, y las células la absorbe de manera más eficaz con relación al ARN libre (“desnudo”).
Además, cuando el ARN se suministra para inducir la expresión de una proteína codificada, tal como en el contexto de una vacuna de ARN, las emulsiones que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos pueden incrementar la cantidad de moléculas de ARN que están formando complejo con partículas de la emulsión. Cuantas más moléculas de ARN se suministren a las células hospedadoras, más alta será la cantidad del antígeno de proteína codificado que se produzca, lo cual a su vez realza la fuerza y la inmunogenicidad de la vacuna de ARN. Finalmente, la inmunogenicidad de la proteína codificada puede potenciarse debido a los efectos adyuvantes de la emulsión. Por lo tanto, además de suministrar de manera más eficaz una molécula cargada negativamente (por ejemplo, una molécula de ARN que codifica un antígeno), las emulsiones catiónicas también pueden potenciar la respuesta inmunitaria a través de su actividad adyuvante. Por ejemplo, como se describe e ilustra en el presente documento, formulaciones en las que las moléculas de ARN (que codifica la proteína F del virus respiratorio sincicial (RSV)) formaron complejo con emulsiones de alto contenido de DOTAP, generaron respuestas inmunitarias más altas en un modelo de ratón y en un modelo de rata algodonera de RSV, en comparación con moléculas de ARN que formaban complejo con emulsiones de bajo contenido de DOTAP.
En consecuencia, en un aspecto, la divulgación proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersas en una fase acuosa continua, en la que la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de dichas partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en la que (i) la relación de aceite:lípido catiónico (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos aproximadamente 2,5 mM, y (iii) el lípido catiónico no es DC-colesterol.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersas en una fase acuosa continua, en la que la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de dichas partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en la que (i) la relación de aceite:lípido catiónico (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM, (iii) el aceite está presente a un porcentaje de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (p/v); y (iv) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol.
La emulsión catiónica puede comprender además un tensioactivo (por ejemplo, Tween 80, SPAN85, o una combinación de los mismos).
En otro aspecto, la divulgación también proporciona varias formulaciones específicas de emulsiones catiónicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y que pueden utilizarse para suministrar moléculas cargadas negativamente.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar una emulsión de aceite en agua, que comprende: (1) disolver directamente un lípido catiónico en un aceite para formar una fase oleaginosa; (2) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (3) dispersar la fase oleaginosa en la fase acosa (por ejemplo, para homogeneización). Si se desea, el aceite puede calentarse a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °C para facilitar la disolución de lípido en el aceite. Preferentemente, la relación de aceite:lípido catiónico (mol:mol) en la fase oleaginosa es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), y como alternativa o además, el diámetro promedio de dichas partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, y/o la concentración de lípido catiónico en la fase oleaginosa es de al menos aproximadamente 5 mM.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprende una molécula cargada negativamente (tal como una molécula de ARN) formando complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, que comprende: (i) proporcionar una emulsión de aceite en agua como la descrita en el presente documento; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprenda la molécula de ARN; y (iii) combinar la solución acuosa de (ii) y la emulsión de aceite en agua de (i), preparando así la composición. Si se desea, la solución acuosa que comprende la molécula de ARN puede comprender una sal (por ejemplo, NaCl), un tampón (por ejemplo, un tampón de citrato), un agente tonificante no iónico (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, sorbitol o dextrosa), un polímero (por ejemplo, Pluronic® F127), o cualquier combinación de los mismos.
Las emulsiones catiónicas de la divulgación pueden utilizarse para suministrar una molécula cargada negativamente, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, ARN). Las composiciones pueden administrarse a un sujeto que lo necesite para generar o potenciar una respuesta inmunitaria. Las composiciones también pueden suministrarse conjuntamente (cosuministrarse) con otra molécula inmunogénica, composición o vacuna inmunogénica, para potenciar la eficacia de la respuesta inmunitaria inducida.
2. Definiciones
El término “aproximadamente”, como se usa en el presente documento, se refiere a /- 5 % de un valor.
Un “antígeno” se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (ya sea lineales, conformacionales o ambos).
Un “tampón” se refiere a una solución acuosa que resiste a cambios en el pH de la solución.
Como se usa en el presente documento, “análogo de nucleótido” o “nucleótido modificado” se refiere a un nucleótido que contiene una o más modificaciones químicas (por ejemplo, sustituciones) en o sobre la base nitrogenada del nucleósido (por ejemplo, citosina (C), timina (T) o uracilo (U)), adenina (A) o guanina (G)).
Como se usa en el presente documento, una “partícula” de emulsión se refiere a una gotilla de aceite suspendida en la fase acuosa (continua) de una emulsión de aceite en agua. La partícula comprende además un lípido catiónico, y opcionalmente componentes adicionales, tales como un tensioactivo.
El término “polímero” se refiere a una molécula que consiste en porciones químicas individuales, que pueden ser iguales o diferentes, que están unidas entre sí. Como se usa en el presente documento, el término “polímero” se refiere a porciones químicas individuales que están unidas extremo con extremo para formar una molécula lineal, así como a porciones químicas individuales unidas entre sí en forma de una estructura ramificada (por ejemplo, de “varios brazos” o “forma de estrella”). Los ejemplos de polímeros incluyen, por ejemplo, poloxámeros. Los poloxámeros son copolímeros de tres bloques no iónicos que tienen una cadena hidrófoba central de polioxipropileno (óxido de poli(propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno (óxido de poli(etileno)).
Como se usa en el presente documento, “sacárido” abarca monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos en forma de cadena recta o anillo, o una combinación de las mismas, para formar una cadena de sacáridos. Los oligosacáridos son sacáridos que tienen dos o más restos de monosacáridos. Los ejemplos de sacáridos incluyen glucosa, maltosa, maltotriosa, maltotetraosa, sacarosa y trehalosa.
Una emulsión es “estable” cuando las partículas de la emulsión permanecen separadas sin aglomeración o coalescencia significativa durante al menos un mes, preferentemente durante al menos dos meses, a 4 °C. El diámetro de partícula promedio (diámetro en número promedio) de una emulsión estable no cambia en más de 10 % cuando la emulsión se conserva a 4 °C durante un mes, o preferentemente, durante dos meses.
El término “tensioactivo” es un término de la técnica y se refiere generalmente a cualquier molécula que tenga tanto un grupo hidrófilo (por ejemplo, un grupo polar), el cual prefiere energéticamente solvatación por agua, como un grupo hidrófobo el cual no es bien solvatado por agua. La expresión “tensioactivo no iónico” es una expresión conocida en la técnica y se refiere generalmente a una molécula de tensioactivo cuyo grupo hidrófilo (por ejemplo, grupo polar) no está cargado electrostáticamente.
El “potencial zeta” de una emulsión se determina por la movilidad electroforética de las partículas de emulsión. La velocidad de una partícula en un campo eléctrico unitario se conoce como su movilidad electroforética. El potencial zeta está relacionado con la movilidad electroforética por la ecuación de Henry:
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en la que Ue = movilidad electroforética, z = potencial zeta, e = constante dieléctrica, rj = viscosidad y f(ka) = función de Henry. El potencial zeta se mide típicamente utilizando un aparato de movilidad electroforética, tal como un Zetasizer Nano Z (Malven Instruments Ltd., Reino Unido).
3. Emulsiones catiónicas de aceite en agua
Las emulsiones catiónicas de aceite en agua desveladas en el presente documento, generalmente se describen de una manera que es convencional en la técnica, por concentraciones de componentes que se utilizan para preparar las emulsiones. En la técnica se entiende que, durante el proceso de producción de emulsiones, incluyendo esterilización y otros procesos aguas abajo, pueden perderse pequeñas cantidades de aceite (por ejemplo, escualeno), lípido catiónico (por ejemplo, DOTAP), u otros componentes, y que las concentraciones reales de estos componentes en el producto final (por ejemplo, una emulsión esterilizada y envasada que esté lista para su administración) podrían ser ligeramente inferiores a las cantidades de partida, algunas veces en hasta aproximadamente 10 %, hasta aproximadamente 20 %, hasta aproximadamente 25 %, o hasta aproximadamente 35 %.
Esta divulgación se refiere, en general, a emulsiones catiónicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y una relación aceite:lípido catiónico definida. Las emulsiones son particularmente adecuadas para suministrar a una célula moléculas cargadas negativamente, tales como una molécula de ARN. El lípido catiónico puede interactuar con la molécula cargada negativamente, por ejemplo, a través de fuerzas electrostáticas e interacciones hidrófobas/hidrófilas, anclando de esta manera la molécula a las partículas de la emulsión. Las emulsiones catiónicas descritas en el presente documento son útiles para suministrar a las células, in vivo, una molécula cargada negativamente, tal como una molécula de ARN que codifique un antígeno o ARN de interferencia pequeño. Por ejemplo, las emulsiones catiónicas descritas en el presente documento proporcionan ventajas para suministrar, como vacunas, moléculas de ARN que codifiquen uno o más antígenos, incluyendo ARN autorreplicantes.
La fase diferenciada (o fase dispersa) de la emulsión, comprende un aceite y un lípido catiónico, en la que el lípido catiónico facilita la dispersión del aceite en la fase acuosa (continua). Como se describe más adelante, en la emulsión puede haber uno o más componentes opcionales, tales como tensioactivos (por ejemplo, tensioactivos no iónicos).
Las partículas de las emulsiones de aceite en agua tienen un diámetro promedio (es decir, diámetro en número promedio) de 1 micrómetro o inferior. Es particularmente deseable que el diámetro de partícula promedio de las emulsiones catiónicas sea de aproximadamente 180 nm o menor, de aproximadamente 170 nm o menor, de aproximadamente 160 nm o menor, de aproximadamente 150 nm o menor, de aproximadamente 140 nm o menor, de aproximadamente 130 nm o menor, de aproximadamente 120 nm o menor, de aproximadamente 110 nm o menor, o de aproximadamente 100 nm o menor; por ejemplo, de aproximadamente 80 nm a 180 nm, de aproximadamente 80 nm a 170 nm, de aproximadamente 80 nm a 160 nm, de aproximadamente 80 nm a 150 nm, de aproximadamente 80 nm a 140 nm, de aproximadamente 80 nm a 160 nm, de aproximadamente 80 nm a 150 nm, de aproximadamente 80 nm a 140 nm, de aproximadamente 80 nm a 130 nm, de aproximadamente 80 nm a 120 nm, de aproximadamente 80 nm a 110 nm, o de aproximadamente 80 nm a 100 nm. Un diámetro de partícula promedio que se prefiere particularmente es de aproximadamente 100 nm, o de aproximadamente 100 nm a aproximadamente de 130 nm.
El tamaño (diámetro promedio) de las partículas de la emulsión puede modificarse cambiando la relación de tensioactivo con respecto a aceite (al aumentar la relación disminuye el tamaño de partícula), la presión operativa de homogeneización (al aumentar la presión operativa de la homogeneización típicamente disminuye el tamaño de partícula), la temperatura (al aumentar la temperatura disminuye el tamaño de partícula), cambiando el tipo de aceite, incluyendo ciertos tipos de tampones en la fase acuosa, y otros parámetros de proceso, como se describe con detalle más adelante. En algunos casos, el tamaño de las partículas de la emulsión puede afectar a la inmunogenicidad del complejo ARN-emulsión, como se ilustra en el presente documento.
Las emulsiones de aceite en agua descritas en el presente documento, son estables.
Las partículas de las emulsiones descritas en el presente documento pueden ser formar complejo con una molécula cargada negativamente. Antes de la formación del complejo con la molécula cargada negativamente, la carga neta total de las partículas (medida típicamente como potencial zeta) debe ser positiva (catiónica). La carga neta total de las partículas puede variar, dependiendo del tipo de lípido catiónico y de la cantidad del lípido catiónico en la emulsión, la cantidad de aceite en la emulsión (por ejemplo, un porcentaje más alto de aceite se traduce típicamente en menos carga sobre la superficie de las partículas), y también se puede ver afectada por un componente adicional (por ejemplo, uno o más tensioactivos) que esté presente en la emulsión. Preferentemente, el potencial zeta de las partículas antes de la formación del complejo no es mayor que aproximadamente 50 mV, no más de aproximadamente 45 mV, no más de aproximadamente 40 mV, no más de aproximadamente 35 mV, no más de aproximadamente 30 mV, no más de aproximadamente 25 mV, no más de aproximadamente 20 mV; de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 45 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 35 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 25 mV, o de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 20 mV. El potencial zeta puede verse afectado por (i) el pH de la emulsión, (ii) la conductividad de la emulsión (por ejemplo, salinidad) y (iii) la concentración de los diferentes componentes de la emulsión (polímero, tensioactivos no iónicos, etc.). El potencial zeta de las emulsiones catiónicas de aceite en agua se mide utilizando un Malvern Nanoseries Zetasizer (Westborough, MA). La muestra se diluye a 1:100 en agua (viscosidad: 0.8872 cp, RI: 1.330, constante dieléctrica: 78.5) y se añade a una celda capilar de látex de poliestireno (Malvern, Westborough, MA). El potencial zeta se mide a 25 °C con un tiempo de equilibrio de 2 minutos y se analiza utilizando el modelo de Smoluchowski (F(Ka) valor = 1,5). Los datos se indican en mV.
En el presente documento, un ejemplo de emulsión catiónica de la divulgación recibe el nombre de “CMF32”. El aceite de CMF32 es escualeno (a 4,3 % p/v) y el lípido catiónico es DOTAP (a 3,2 mg/ml). El CMF32 también incluye los tensioactivos SPAN85 (trioleato de sorbitán al 0,5 % v/v) y Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilen sorbitán; al 0,5 % v/v). Por tanto, las partículas de la emulsión de CMF32 comprenden escualeno, SPAN85, Tween80 y DOTAP. Las moléculas de ARN mostraron formar complejos con partículas de CMF32 eficientemente a relaciones N/P de 4:1, 6:1, 8:1, 10:1, 12:1 y 14:1. Otros ejemplos de emulsiones catiónicas incluyen, por ejemplo, las emulsiones denominadas en el presente documento “CMF34” (4,3 % p/v de escualeno, 0,5 % de Tween 80, 0,5 % de SPAN85 y 4,4 mg/ml de DOTAP), “CMF35” (4.3% p/v de escualeno, 0.5% de Tween 80, 0.5% de SPAN85, 5.0 mg/ml de DOTAP), y otras emulsiones descritas en el presente documento.
Ciertos ejemplos de emulsiones catiónicas de aceite en agua de la divulgación comprenden DOTAP y escualeno a concentraciones que varían de 2,1 mg/ml a 2,84 mg/ml (preferentemente de 2,23 mg/ml a 2,71 mg/ml), y de 30,92 mg/ml a 41,92 mg/ml (preferentemente de 32,82 mg/ml a aproximadamente 40,02 mg/ml), respectivamente, y comprenden además las mismas cantidades de SPAN85 y Tween 80 (por ejemplo, aproximadamente 0,5 % de cada uno de ellos). Otros ejemplos de emulsiones catiónicas de aceite en agua de la divulgación comprenden DOTAP y escualeno a concentraciones que varían de 2,78 mg/ml a 3,76 mg/ml (preferentemente de 2,94 mg/ml a 3,6 mg/ml), y de 18,6 mg/ml a 25,16 mg/ml (preferentemente de 19,69 mg/ml a aproximadamente 24,07 mg/ml), respectivamente, y comprenden además las mismas cantidades de SPAN85 y Tween80 (por ejemplo, aproximadamente 0,5 % cada uno de ellos). Preferentemente, las partículas de estas emulsiones tienen un diámetro promedio de 80 nm a 180 nm.
En la técnica se conocen componentes individuales de las emulsiones de aceite en agua de la presente divulgación, aunque dichas composiciones no se han combinado de la manera descrita en el presente documento. En consecuencia, en la técnica se conocen bien componentes individuales, aunque se describen más adelante tanto en líneas generales como con cierto detalle para realizaciones preferidas y el experto en la materia conoce los términos utilizados en el presente documento, tales como aceite, tensioactivo, etc., sin tener que hacer una descripción adicional. Además, aunque se proporcionan los intervalos preferidos de la cantidad de los componentes individuales de las emulsiones, las relaciones reales de los componentes de una emulsión particular pueden tener que ajustarse de tal manera que las partículas de la emulsión de un tamaño y propiedad física deseadas, se formen adecuadamente. Por ejemplo, si se utiliza una cantidad particular de aceite (por ejemplo, 5 % v/v de aceite), entonces la cantidad de tensioactivo debe estar a un nivel que sea suficiente para dispersar la partícula de aceite en la fase acuosa para formar una emulsión estable. La cantidad real de tensioactivo requerida para dispersar el aceite en la fase acuosa depende del tipo de tensioactivo y del tipo de aceite utilizado para la emulsión; y la cantidad de aceite también puede variar de acuerdo con el tamaño de la partícula deseado (ya que esto cambia el área superficial entre las dos fases). Un experto en la materia puede determinar fácilmente las cantidades reales y las proporciones relativas de los componentes de una emulsión deseada.
A. Aceite
Las partículas de las emulsiones catiónicas de aceite en agua comprenden un aceite.
El aceite está preferentemente en la fase líquida a una temperatura de 1 °C o superior, y es inmiscible en agua. Preferentemente, el aceite es un aceite no tóxico metabolizable; muy preferentemente es uno de aproximadamente 6 a aproximadamente de 30 átomos de carbono incluyendo, pero sin limitación, alcanos, alquenos, alquinos y sus ácidos y alcoholes correspondientes, los éteres y ésteres de los mismos, y mezclas de los mismos. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite preparado sintéticamente que pueda metabolizar el cuerpo de un sujeto al cual se administrará la emulsión, y que no sea tóxico para el sujeto. El sujeto puede ser un animal, típicamente un mamífero, y preferentemente un ser humano.
En ciertas realizaciones, el aceite está en fase líquida a 25 °C. El aceite está en fase líquida a 25 °C, cuando presenta las propiedades de un fluido (según se distingue de sólido y gas; y con un volumen definido pero no una forma definida) cuando se conserva a 25 °C. Sin embargo, la emulsión, puede conservarse y utilizarse a cualquier temperatura adecuada. Preferentemente, el aceite está en fase líquida a 4 °C.
El aceite puede ser un alcano, alqueno o alquino de cadena larga, o un ácido derivado de alcohol del mismo ya sea como el ácido libre, su sal o un éster tal como un mono- o di- o triéster, tal como los triglicéridos y ésteres de 1,2-propanodiol o alcoholes poli-hidroxílicos similares. Los alcoholes pueden ser acilados empleando un ácido mono- o poli-funcional, por ejemplo, ácido acético, ácido propanoico, ácido cítrico o similares. También pueden utilizarse éteres derivados de alcoholes de cadena larga que sean aceites y que cumplan los demás criterios mostrados en el presente documento.
La porción de alcano, alqueno o alquino individual y sus derivados de ácido o alcohol, generalmente tendrán de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. La porción puede tener una estructura de cadena recta o ramificada. Puede estar completamente saturada o tener uno o más dobles o triples enlaces. Cuando se empleen aceites basados en mono o poliéster o éter, la limitación de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 carbonos se aplica a las porciones de ácido graso o alcohol graso individuales, no al recuento de carbonos total. Puede utilizarse cualquier aceite adecuado que proceda de una fuente animal, de pescado o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen aceite de nueces, semillas y granos, y aceites adecuados, aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite de coco, aceite de oliva y similares. Otros aceites de semilla adecuados incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de ajonjolí y similares. En el grupo de granos, también puede utilizarse el aceite de maíz y el aceite de otros granos de cereal, tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares. La tecnología para obtener aceites vegetales está muy desarrollada y se conoce muy bien. Las composiciones de éstos y otros aceites similares pueden encontrarse, por ejemplo, en el índice Merck, y los materiales de origen en alimentos, nutrición y tecnología de alimentos.
Aunque no se presentan de manera natural en los aceites de semilla, pueden prepararse ésteres de ácido graso de aproximadamente seis a aproximadamente de diez carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales adecuados comenzando a partir de los aceites de nuez y semilla. Estos productos están disponibles en el comercio con el nombre de NEOBEES de PVO International, Inc., Chemical Specialties División, 416 División Street, Boongon, N.J., y otros.
Los aceites y las grasas animales comúnmente están en fase sólida a temperaturas fisiológicas ya que existen como triglicéridos y tienen un grado de saturación más alto que el de los aceites de pescado o vegetales. Sin embargo, los ácidos grasos pueden obtenerse de grasas animales por saponificación de triglicéridos parcial o completa la cual proporciona los ácidos grasos libres. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y por lo tanto pueden utilizarse en la práctica de esta divulgación. En la técnica se conocen bien procedimientos de separación, purificación, saponificación, y otros medios necesarios, para obtener aceites puros a partir de fuentes animales.
La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, aceite de hígado de tiburón y aceite de ballena, tal como de esperma de ballena, son ejemplos de varios de los aceites de pescado que pueden utilizarse en el presente documento. Diversos aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades isopreno de 5 carbonos y se conocen generalmente como terpenoides. El escualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno), un terpenoide ramificado e insaturado, es particularmente preferido en el presente documento. Una fuente principal de escualeno es el aceite de hígado de tiburón, aunque también son fuentes adecuadas los aceites de plantas (principalmente aceites vegetales), incluyendo aceites de semilla de amaranto, de salvado de arroz, de germen de trigo y de oliva. El escualeno también puede obtenerse de levadura u otros microbios adecuados. En algunas realizaciones, el escualeno se obtiene preferentemente de fuentes no animales, tales como de aceitunas, aceite de oliva o levadura. También se prefiere el escualano, el análogo saturado del escualeno. Los aceites de pescado, incluyendo el escualeno y el escualano, están disponibles fácilmente de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la técnica.
En ciertas realizaciones, el aceite comprende un aceite que se selecciona del grupo que consiste en: aceite de resino, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de onagra, aceite de pescado, aceite de jojoba, aceite de manteca, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de cacahuate, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de soja, escualeno, escualano, aceite de girasol y aceite de germen de trigo. En realizaciones ejemplares, el aceite comprende escualeno o escualano.
El componente oleaginoso de la emulsión puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 10% (v/v). Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 10 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 7 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 6 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 5 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,3 % a aproximadamente 10 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,4 % a aproximadamente 10 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 10% (v/V de aceite, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10% (v/v) de aceite, de aproximadamente 2% a aproximadamente 10% (v/v) de aceite, de aproximadamente 3 % a aproximadamente 10 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 4 % a aproximadamente 10 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 % (v/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 10% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 9% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 10 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 9 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 7 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 6 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 5 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 4,3 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,6 % a aproximadamente 4 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,7 % a aproximadamente 4 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,8 % a aproximadamente 4 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,9 % a aproximadamente 4 % (p/v) de aceite, de aproximadamente 1,0 % a aproximadamente 4% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,6% a aproximadamente 3,5% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0,6 % a aproximadamente 3 % (p/v) de aceite, aproximadamente 0,5 % (v/v) de aceite, aproximadamente 0,6 % (v/v) de aceite, aproximadamente 0,7 % (v/v) de aceite, aproximadamente 0,8 % (v/v) de aceite, aproximadamente 0,9 % (v/v) de aceite, aproximadamente 1 % (v/v) de aceite, aproximadamente 1,5 % (v/v) de aceite, aproximadamente 2 % (v/v) de aceite, aproximadamente 2,5 % (v/v) de aceite, aproximadamente 3 % (v/v) de aceite, aproximadamente 3.5 % (v/v) de aceite, aproximadamente 4 % (v/v) de aceite, aproximadamente 5 % (v/v) de aceite, aproximadamente 10% (v/v) de aceite, aproximadamente 0,5% (p/v) de aceite, aproximadamente 1% (p/v) de aceite, aproximadamente 1,5% (p/v) de aceite, aproximadamente 2% (p/v) de aceite, aproximadamente 2,5% (p/v) de aceite, aproximadamente 3 % (p/v) de aceite, aproximadamente 3,5 % (p/v) de aceite, aproximadamente 4 % (p/v) de aceite, aproximadamente 4,3 % (p/v) de aceite, aproximadamente 5 % (p/v) de aceite, aproximadamente 5,5 % (p/v) de aceite, aproximadamente 6% (p/v) de aceite, aproximadamente 6,5 % (p/v) de aceite, aproximadamente 7 % (p/v) de aceite, aproximadamente 7,5 % (p/v) de aceite, o aproximadamente 8 % (p/v) de aceite.
La emulsión catiónica de aceite en agua también puede comprender de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 8 % (v/v) de aceite, por ejemplo, de 0,6 % (p/v) a 4 % (p/v), de aproximadamente 1 % (p/v) a aproximadamente 3,2% (p/v), aproximadamente 1 % (p/v), aproximadamente 1,1 % (p/v), aproximadamente 1,2% (p/v), aproximadamente 1,3 % (p/v), aproximadamente 1,4 % (p/v), aproximadamente 1,5 % (p/v), aproximadamente 1.6 % (p/v), aproximadamente 1,7 % (p/v), aproximadamente 1,8 % (p/v), aproximadamente 1,9% (p/v), aproximadamente 2,0% (p/v), aproximadamente 2,1 % (p/v), aproximadamente 2,15% (p/v), aproximadamente 2,2 % (p/v), aproximadamente 2,3 % (p/v), aproximadamente 2,4 % (p/v), aproximadamente 2,5 % (p/v), aproximadamente 2,6 % (p/v), aproximadamente 2,7 % (p/v), aproximadamente 2,8 % (p/v), aproximadamente 2,9 % (p/v), 3.0% (p/v), aproximadamente 3,1% (p/v), aproximadamente 3,2% (p/v), aproximadamente 3,3% (p/v), aproximadamente 3,4 % (p/v), aproximadamente 3,5 % (p/v), aproximadamente 3,6 % (p/v), aproximadamente 3,7 % (p/v), aproximadamente 3,8 % (p/v), aproximadamente 3,9 % (p/v), o aproximadamente 4,0 % (p/v) de aceite.
En una realización ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende aproximadamente 5 % (v/v) de aceite. En otra realización ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende aproximadamente 4,3 % (p/v) de escualeno. En otras realizaciones ejemplares, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de 0,6 % (p/v) a 4 % (p/v) de escualeno, por ejemplo, de aproximadamente 1 % (p/v) a aproximadamente 3,2 % (p/v) de escualeno, tal como 1,08 % (p/v), 2,15 % (p/v) o 3,23 % (p/v) de escualeno, como se muestra en los ejemplos. Como se indicó anteriormente, el porcentaje de aceite descrito anteriormente se determina basándose en la cantidad inicial del aceite que se utiliza para preparar las emulsiones. Se entiende en la técnica, que la concentración real del aceite en el producto final (por ejemplo, una emulsión envasada y esterilizada, que está lista para su administración) puede ser ligeramente más baja, algunas veces en hasta aproximadamente 10 %, en hasta aproximadamente 20 %, en hasta aproximadamente 25 % o en hasta aproximadamente 35 %.
B. Lípidos catiónicos
Las partículas de la emulsión descrita en el presente documento, comprenden un lípido catiónico que puede interactuar con la molécula cargada negativamente, anclando así la molécula a las partículas de la emulsión.
Puede utilizarse cualquier lípido catiónico adecuado. Generalmente, el lípido catiónico contiene un átomo de nitrógeno que, en condiciones fisiológicas, está cargado positivamente. El grupo que encabeza el lípido catiónico puede comprender una amina terciaria o, preferentemente, una amina cuaternaria. Ciertos lípidos catiónicos adecuados comprenden dos cadenas de ácido graso saturadas o insaturadas (por ejemplo, cadenas laterales que tienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 átomos de carbono).
El lípido catiónico puede tener una carga positiva a un pH de aproximadamente 12, aproximadamente 11, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7 o aproximadamente 6.
Los lípidos catiónicos adecuados incluyen, cloruro de benzalconio (BAK), cloruro de benzetonio, cetrimida (que contiene bromuro de tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC), aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, incluyendo pero sin limitación, N,N',N'-polioxietileno (10)-N-sebo-1,3-diaminopropano, otras sales de amina cuaternaria, incluyendo pero si limitación, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de alquiltrimetilamonio mixto, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecilamonio, metóxido de benciltrimetilamonio, bromuro de cetildimetilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), cloruro de metilbenzetonio, cloruro de decametonio, cloruro de trialquilamonio mixto, cloruro de metiltrioctilamonio), cloruro de N,N-dimetil-N-[2-(2-metil-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxi)etil]-bencenometanaminio (DEBDA), sales de dialquildimetilamonio, cloruro de [1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio, 1,2-diacil-3-(trimetilamonio)propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1,2-diacil-3 (dimetilamonio)propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleioilo), 1,2-dioleioil-3-(4'-trimetil-amonio)butanoil-sn-glicerol, éster 3-succinil-sn-glicerol colina 1,2-dioleoilo, coloesteril(4'-trimetilamonio)butanoato), sales de N-alquilpiridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio), sales de N-alquilpiperidinio, electrolitos bolaformes dicatiónicos (C12Me6; C-i2Bu6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a dioleoilfosfatidiletanolamina, éster colínico de colesterol hemisuccinato, lipopoliaminas, incluyendo pero sin limitación, dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), dipalmitoil fosfatidiletanol-amidoespermina (DPPES), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli(L (o D)-lisina conjugada a N-glutarilfosfatidiletanolamina, éster de didodecil glutamato con un grupo amino colgante (C-i2GluPhCnN+), éster de ditetradecil glutamato con grupo amino colgante (C-MGluCnN+), derivados catiónicos de colesterol, incluyendo pero sin limitación, sal de colesteril-3 p-oxisuccinamidoetilentrimetilamonio, colesteril-3 poxisuccinamidoetilendimetilamina, sal de colesteril-3 p-carboxiamidoetilentrimetilamonio, colesteril-3 poxisuccinamidoetilendimetilamina, sal de colesterol-3 p-carboxiamidoetilentrimetilamonio, colesterol-3 pcarboxiamidoetilendimetilamina y 3y-[n-(N',N-dimetilaminoetancarbomoil]colesterol) (DC-colesterol), 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), dimetildiocadecilamonio (DDA), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamoniopropano (DMTAP), dipalmitoil(C16-ü)trimetil amonio propano (DPTAP), distearoiltrimetilamonio propano (DSTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (dOdAC), 1,2-dioleioil-snglicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLinDMA), y combinaciones de los mismos.
En realizaciones preferidas, el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (d OdAC) y cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA). En ciertas realizaciones, el lípido catiónico no es DC-colesterol.
Preferentemente, el lípido catiónico seleccionado para la emulsión es soluble en el aceite que se selecciona para la emulsión. Esto permite obtener altas concentraciones de lípidos catiónicos en la emulsión, al disolver directamente el lípido en el aceite antes de su dispersión en la fase móvil. Está dentro del conocimiento en la técnica, determinar si un lípido particular es soluble en el aceite y por consiguiente seleccionar una combinación adecuada de aceite y lípido. Por ejemplo, la solubilidad puede predecirse basándose en las estructuras del lípido y del aceite (por ejemplo, la solubilidad de un lípido puede determinarse por la estructura de su cola). Por ejemplo, lípidos que tengan una o dos cadenas de ácido graso insaturado (por ejemplo, colas de oleoilo o colas de linolilo), tales como DOTAP, DOEPC, DODAC, DOTMA, son solubles en escualeno o escualano. Como alternativa, la solubilidad puede determinarse de acuerdo con la cantidad del lípido que se disuelva en una cantidad dada del aceite para formar una solución saturada. Dichos procedimientos se conocen en la técnica. En los ejemplos también se proporciona la solubilidad en escualeno de los ácidos grasos saturados o insaturados ejemplares. Preferentemente, la concentración de saturación del lípido en el aceite es de al menos aproximadamente 1 mg/ml, de al menos aproximadamente 5 mg/ml, de al menos aproximadamente 10 mg/ml, de al menos aproximadamente 25 mg/ml, de al menos aproximadamente 50 mg/ml o de al menos aproximadamente 100 mg/ml.
Preferentemente, la concentración de lípido catiónico en la emulsión antes de que la molécula cargada negativamente forme complejo, es de al menos aproximadamente 1,25 mM, al menos aproximadamente 1,5 mM, al menos aproximadamente 1,75 mM, al menos aproximadamente 2.0 mM, al menos aproximadamente 2.25 mM, al menos aproximadamente 2,5 mM, al menos aproximadamente 2,75 mM, al menos aproximadamente 3,0 mM, al menos aproximadamente 3,25 mM, al menos aproximadamente 3,5 mM, al menos aproximadamente 3,75 mM, al menos aproximadamente 4.0 mM, al menos aproximadamente 4.25 mM, al menos aproximadamente 4.5 mM, al menos aproximadamente 4,75 mM, al menos aproximadamente 5,0 mM, al menos aproximadamente 5,25 mM, al menos aproximadamente 5,5 mM, al menos aproximadamente 5,75 mM, al menos aproximadamente 6 mM, al menos aproximadamente 6,25 mM, al menos aproximadamente 6,5 mM, al menos aproximadamente 6,75 mM, al menos aproximadamente 7 mM, al menos aproximadamente 7,25 mM, al menos aproximadamente 7,5 mM, al menos aproximadamente 7,75 mM, al menos aproximadamente 8 mM, al menos aproximadamente 8,25 mM, al menos aproximadamente 8,5 mM, al menos aproximadamente 8,75 mM, al menos aproximadamente 9 mM, al menos aproximadamente 9,25 mM, al menos aproximadamente 9,5 mM, al menos aproximadamente 9,75 mM, o al menos aproximadamente 10 mM.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DOTAP. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTAP de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTAP de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 1.8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 2,2 mg/ml, aproximadamente 2,4 mg/ml, aproximadamente 2,6 mg/ml, aproximadamente 2,8 mg/ml, aproximadamente 3,0 mg/ml, aproximadamente 3,2 mg/ml, aproximadamente 3,4mg/ml, aproximadamente 3,6 mg/ml, aproximadamente 3,8 mg/ml, aproximadamente 4,0 mg/ml, aproximadamente 4,2 mg/ml, aproximadamente 4,4 mg/ml, aproximadamente 4,6 mg/ml, aproximadamente 4.8 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,2 mg/ml, aproximadamente 5,5 mg/ml, aproximadamente 6,0 mg/ml, al menos aproximadamente 0,8 mg/ml, al menos aproximadamente 0,85 mg/ml, al menos aproximadamente 0,9 mg/ml, al menos aproximadamente 1,0 mg/ml, al menos aproximadamente 1,1 mg/ml, al menos aproximadamente 1,2 mg/ml, al menos aproximadamente 1,3 mg/ml, al menos aproximadamente 1,4 mg/ml, al menos aproximadamente 1,5 mg/ml, al menos aproximadamente 1,6 mg/ml, al menos aproximadamente 1,7 mg/ml, etc.
En una realización ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende DOTAP de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 5,0 mg/ml.
En ciertas realizaciones, el líquido catiónico es DOEPC. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOEPC de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOEPC de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4.8 mg/ml a aproximadamente 1o mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 1.8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml, de aproximadamente 1, mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 2,2 mg/ml, aproximadamente 2,4 mg/ml, aproximadamente 2,6 mg/ml, aproximadamente 2,8 mg/ml, aproximadamente 3,0 mg/ml, aproximadamente 3,2 mg/ml, aproximadamente 3,4 mg/ml, aproximadamente 3,6 mg/ml, aproximadamente 3,8 mg/ml, aproximadamente 4.0 mg/ml, aproximadamente 4,2 mg/ml, aproximadamente 4,4 mg/ml, aproximadamente 4,6 mg/ml, aproximadamente 4,8 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,2 mg/ml, aproximadamente 5.5 mg/ml, aproximadamente 6,0 mg/ml, al menos aproximadamente 0,8 mg/ml, al menos aproximadamente 0,85 mg/ml, al menos aproximadamente 0,9 mg/ml, al menos aproximadamente 1,0 mg/ml, al menos aproximadamente 1,1 mg/ml, al menos aproximadamente 1,2 mg/ml, al menos aproximadamente 1,3 mg/ml, al menos aproximadamente 1,4 mg/ml, al menos aproximadamente 1,5 mg/ml, al menos aproximadamente 1,6 mg/ml, al menos aproximadamente 1,7 mg/ml, etc.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DODAC. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DODAC de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DODAC de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 1.8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml, de aproximadamente 1, mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 2,2 mg/ml, aproximadamente 2,4 mg/ml, aproximadamente 2.6 mg/ml, aproximadamente 2,8 mg/ml, aproximadamente 3,0 mg/ml, aproximadamente 3,2 mg/ml, aproximadamente 3,4 mg/ml, aproximadamente 3,6 mg/ml, aproximadamente 3,8 mg/ml, aproximadamente 4.0 mg/ml, aproximadamente 4,2 mg/ml, aproximadamente 4,4 mg/ml, aproximadamente 4,6 mg/ml, aproximadamente 4,8 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,2 mg/ml, aproximadamente 5.5 mg/ml, aproximadamente 6,0 mg/ml, al menos aproximadamente 0,8 mg/ml, al menos aproximadamente 0,85 mg/ml, al menos aproximadamente 0,9 mg/ml, al menos aproximadamente 1,0 mg/ml, al menos aproximadamente 1,1 mg/ml, al menos aproximadamente 1,2 mg/ml, al menos aproximadamente 1,3 mg/ml, al menos aproximadamente 1,4 mg/ml, al menos aproximadamente 1,5 mg/ml, al menos aproximadamente 1,6 mg/ml, al menos aproximadamente 1,7 mg/ml, etc.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DOTMA. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTMA de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTMA de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3,6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4,4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml, de aproximadamente 1,8 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 1.8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml, de aproximadamente 1, mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 2,2 mg/ml, aproximadamente 2,4 mg/ml, aproximadamente 2.6 mg/ml, aproximadamente 2,8 mg/ml, aproximadamente 3,0 mg/ml, aproximadamente 3,2 mg/ml, aproximadamente 3,4 mg/ml, aproximadamente 3,6 mg/ml, aproximadamente 3,8 mg/ml, aproximadamente 4.0 mg/ml, aproximadamente 4,2 mg/ml, aproximadamente 4,4 mg/ml, aproximadamente 4,6 mg/ml, aproximadamente 4,8 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,2 mg/ml, aproximadamente 5,5 mg/ml, aproximadamente 6,0 mg/ml, al menos aproximadamente 0,8 mg/ml, al menos aproximadamente 0,85 mg/ml, al menos aproximadamente 0,9 mg/ml, al menos aproximadamente 1,0 mg/ml, al menos aproximadamente 1,1 mg/ml, al menos aproximadamente 1,2 mg/ml, al menos aproximadamente 1,3 mg/ml, al menos aproximadamente 1,4 mg/ml, al menos aproximadamente 1,5 mg/ml, al menos aproximadamente 1,6 mg/ml, al menos aproximadamente 1,7 mg/ml, etc.
Como se indicó anteriormente, la concentración de un lípido descrito anteriormente se determina basándose en la cantidad inicial del lípido que se usa para preparar las emulsiones. Se entiende en la técnica que la concentración real del aceite en el producto final (por ejemplo, una emulsión envasada y esterilizada lista para su administración) podría ser ligeramente más baja, algunas veces en hasta aproximadamente 10 %, hasta aproximadamente 20 %, hasta aproximadamente 25 %, o hasta aproximadamente 35 %.
C. Relación de aceite a lípido
Las emulsiones catiónicas de aceite en agua de la divulgación tienen una relación de aceite:lípido definida. Por ejemplo, la relación de aceite:lípido (mol:mol) de la emulsión puede ser de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 8,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 9:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 9,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 10:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 10,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 11:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 11,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 12:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 12,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 13:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 13,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 14:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 14,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 15:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 15,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 16:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 16,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 17:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de aproximadamente 9:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 49:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 48:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 47:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 46:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 45:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 44:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 42:1 (mol:mol), de aproximadamente 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 41:1 (mol:mol), de aproximadamente 9:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 11:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 12:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 13:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 14:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 15:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 16:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 17:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), etc.
Si se desea, la relación de aceite:lípido (mol:mol) de la emulsión puede ser de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 4,2:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 4,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 5,5:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 6:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 6,5:1 (mol:mol), 7:1 (mol:mol), de al menos aproximadamente 7,5:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de aproximadamente 5:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de aproximadamente 6:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de aproximadamente 7:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 49:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 48:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 47:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 46:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 45:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 44:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 42:1 (mol:mol), de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 41:1 (mol:mol), de aproximadamente 5:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 6:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de aproximadamente 7:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), etc.
Algunas veces, puede ser necesario lograr un equilibrio entre el deseo de aumentar la concentración de un lípido catiónico (aumentando de esta manera la cantidad de moléculas de ácido nucleico cargadas en la partícula de emulsión), y la toxicidad o tolerabilidad del lípido cuando se administre in vivo. Por ejemplo, se ha indicado que altas dosis de DOTAP pueden tener efectos tóxicos. Véase, por ejemplo, Lappalainen y col., Pharm. Res. Volumen 11(8):1127-31 (1994). El intervalo óptimo de dosis de lípidos en una emulsión particular puede determinarse de acuerdo con el conocimiento de un médico experto.
Si el aceite comprende una mezcla de moléculas, la concentración molar del aceite puede calcularse basándose en el peso molecular promedio del aceite. Por ejemplo, el peso molecular promedio del aceite de soja (292,2) puede calcularse de acuerdo con la distribución de ácido graso promedio (un porcentaje de 12 % en peso de ácido palmítico; un porcentaje de 52 % en peso de ácido linolénico; etc.), y el peso molecular de cada componente.
C. Componentes adicionales
Las emulsiones catiónicas de aceite en agua descritas en el presente documento pueden comprender además componentes adicionales. Por ejemplo, las emulsiones pueden comprender componentes que puedan promover la formación de partículas, mejorar la formación de complejos entre las moléculas cargadas negativamente y las partículas catiónicas, o aumentar la estabilidad de la molécula cargada negativamente (por ejemplo, para impedir la degradación de una molécula de ARN). Si se desea, la emulsión catiónica de aceite en agua puede contener un antioxidante, tal como citrato, ascorbato o sales de los mismos.
Tensioactivos
En ciertas realizaciones, la emulsión catiónica de aceite en agua como la descrita en el presente documento comprende además un tensioactivo.
Se ha utilizado un número sustancial de tensioactivos en las ciencias farmacéuticas. Estos incluyen materiales obtenidos de manera natural, tales como gomas de árboles, proteína vegetal, polímeros basados en azúcar, tales como alginatos, y similares. Ciertos oxipolímeros o polímeros que tienen un hidróxido u otro sustituyente hidrófilo en el esqueleto de carbono tienen actividad tensioactiva, por ejemplo, povidona, alcohol polivinílico y compuestos mono- y polifuncionales basados en éter glicólico. En la presente divulgación también pueden utilizarse detergentes iónicos o no iónicos y compuestos derivados de ácidos grasos de cadena larga.
Como ejemplos específicos de tensioactivos adecuados se incluyen los siguientes:
1. Jabones hidrosolubles, tales como las sales sodio, potasio, amonio y alcanolamonio de ácidos grasos superiores (C10-C22), en particular jabones de potasio de sebo y coco.
2. Tensioactivos sintéticos y aniónicos que no son de jabón, los cuales pueden representarse por las sales hidrosolubles de productos de reacción con ácido sulfúrico orgánico que tengan en su estructura molecular un radical alquilo que contenga aproximadamente de 8 a 22 átomos de carbono y un radical seleccionado del grupo que consiste en radicales éster de ácido sulfúrico y ácido sulfúrico. Son ejemplos de éstos los alquil sulfatos de sodio o potasio, derivados de aceite de sebo o coco; alquil benceno sulfonatos de sodio o potasio; éter sulfonatos de alquil glicerilo de sodio; sulfonatos y sulfatos de monoglicéridos de ácido graso de aceite de coco de sodio; sales de sodio o potasio de ésteres de ácido sulfúrico del producto de reacción de un mol de un alcohol graso superior y aproximadamente 1 a 6 moles de óxido de etileno; éter sulfonatos de óxido de etileno de alquil fenol de sodio o potasio, con de 1 a 10 unidades de óxido de etileno por molécula y en los que los radicales alquilo contienen de 8 a 12 átomos de carbono; el producto de reacción de ácidos grasos esterificados con ácido isetiónico y neutralizados con hidróxido de sodio; sales de sodio o potasio de amida de ácido graso de una metil taurida; y sales de sodio y potasio de a-olefinas de C10-C24 sulfonadas con SO3.
3. Tensioactivos sintéticos no iónicos formados por la condensación de grupos de óxido de alquileno con un compuesto hidrófobo orgánico. Los grupos hidrófobos típicos incluyen productos de condensación de óxido de propileno con propilenglicol, alquil fenoles, productos de condensación de óxido de propileno y etilendiamina, alcoholes alifáticos que tengan de 8 a 22 átomos de carbono y amidas de ácidos grasos.
4. Tensioactivos no iónicos, tales como óxidos de amina, óxidos de fosfina y sulfóxidos, que tengan características semipolares. Ejemplos específicos de óxidos de amina terciaria de cadena larga incluyen óxido de dimetildodecilamina y bis(2-hidroxietil)dodecilamina. Ejemplos específicos de óxidos de fosfina se encuentran en la patente de E.U.A. No. 3.304.263, expedida el 14 de febrero de 1967, e incluyen óxido de dimetildodecilfosfina y óxido de dimetil-(2-hidroxidodecil) fosfina.
5. Sulfóxidos de cadena larga, incluyendo aquellos que correspondan a la fórmula R1-SO-R2 en la que R1 y R2 son radicales alquilo sustituidos o no sustituidos, el primero conteniendo de aproximadamente 10 a aproximadamente 28 átomos de carbono, mientras que R2 contiene de 1 a 3 átomos de carbono. Ejemplos específicos de estos sulfóxidos incluyen sulfóxido de dodecil metilo y sulfóxido de 3-hidroxi tridecil metilo.
6. Tensioactivos sintéticos anfolíticos, tales como 3-dodecilaminopropionato de sodio y 3-dodecilaminopropansulfonato de sodio.
7. Tensioactivos sintéticos zwitteriónicos, tales como 3-(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio)propan-1-sulfonato y 3-(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio)-2-hidroxipropan-1-sulfonato.
Además, en una composición de la presente divulgación pueden utilizarse todos los siguientes tipos de tensioactivos: (a) jabones (es decir, sales alcalinas) de ácidos grasos, ácidos de colofonia y aceite de sebo; (b) alquilaren sulfonatos; (c) alquil sulfatos, incluyendo tensioactivos con grupos hidrófobos tanto de cadena ramificada como de cadena recta, así como grupos sulfato primarios y secundarios; (d) sulfatos y sulfonatos que contengan un enlace intermedio entre los grupos hidrófobos e hidrófilos, tales como las metil tauridas aciladas grasas y los monoglicéridos grasos sulfatados; (e) ésteres de ácido de cadena larga de polietilenglicol, especialmente los ésteres de aceite de sebo; (f) éteres de polietilenglicol de alquilfenoles; (g) éteres de polietilenglicol de alcoholes y mercaptanos de cadena larga; y (h) acil dietanolamidas grasas. Ya que los tensioactivos pueden clasificarse de más de una manera, diversas clases de tensioactivos expuestas en este párrafo se superponen con las clases de tensioactivos descritas previamente.
Existen diversos tensioactivos que están diseñados específicamente para situaciones biológicas y normalmente utilizados para las mismas. Dichos tensioactivos se dividen en cuatro tipos básicos: aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos (anfotéricos) y no iónicos. Como ejemplos de tensioactivos aniónicos se incluyen, por ejemplo, perfluorooctanoato (PFOA o PFO), perfluorooctansulfonato (PFOS), sales de alquilsulfato tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) o lauril sulfato de amonio, laureth sulfato de sodio (conocido también como lauril éter sulfato de sodio, SLES), alquil benceno sulfonato y sales de ácido graso. Como ejemplos de tensioactivos catiónicos se incluyen, por ejemplo, sales de alquiltrimetilamonio tales como bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB, o bromuro de hexadecil trimetil amonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de sebo polietoxilada (POEA), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT). Los ejemplos de tensioactivos zwitteriónicos (anfotéricos) incluyen, por ejemplo, dodecil betaína, cocamidopropil betaína y coco anfoglicinato. Ejemplos de tensioactivos no iónicos incluyen, por ejemplo, óxido de alquil polietileno, óxido de alquilfenol polietileno, copolímeros de óxido de polietileno y óxido de polipropileno (llamados comercialmente poloxámeros o poloxaminas), acil oliglucósidos (por ejemplo, octil glucósido o decil maltósido), alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetílico o alcohol oleílico), cocamida MEA, cocamida DEA, Pluronic® F-68 (copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno) y polisorbatos, tales como Tween 20 (polisorbato 20), Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán), óxido de dodecil dimetilamina y succinato de propilenglicol de tocoferol de vitamina E (TPGS de vitamina E).
Un grupo de tensioactivos particularmente útil son los tensioactivos no iónicos basados en sorbitán. Estos tensioactivos se preparan por la deshidratación de sorbitol para dar 1,4-sorbitán, que después se hace reaccionar con uno o más equivalentes de un ácido graso. Además, la porción sustituida con ácido graso puede hacerse reaccionar con óxido de etileno para dar un segundo grupo de tensioactivos.
Los tensioactivos de sorbitán sustituidos con ácidos grasos se forman al hacer reaccionar 1,4-sorbitán con un ácido graso, tal como ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, o con un ácido graso de cadena larga similar para dar el monoéster de 1,4-sorbitán, sesquiéster de 1,4-sorbitán o triéster de 1,4-sorbitán. Los nombres comunes de estos tensioactivos incluyen, por ejemplo, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, sesquioleato de sorbitán y trioleato de sorbitán. Estos tensioactivos están disponibles comúnmente con el nombre SPAN® o ARLACEL®, normalmente con una designación de una letra o número que los distingue entre los diferentes sorbitanos sustituidos con mono, di- y triéster.
Los tensioactivos SPAN® y ARLACEL® son hidrófilos y generalmente son solubles o dispersables en aceite. También son solubles en la mayoría de los solventes orgánicos. En agua son generalmente insolubles pero dispersables. Generalmente, estos tensioactivos tendrán un número de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) entre 1,8 a 8,6. Dichos tensioactivos pueden elaborarse fácilmente a través de medios conocidos en la técnica o están disponibles en el comercio.
Un grupo relacionado de tensioactivos comprende monoésteres de olioxietilensorbitán y triésteres de olioxietilensorbitán. Estos materiales se preparan a través de la adición de óxido de etileno a un monoéster o triéster de 1,4-sorbitán. La adición de polioxietileno convierte al tensioactivo de mono- o triéster de sorbitán lipófilo en un tensioactivo hidrófilo, generalmente soluble o dispersable en agua y soluble a grados variables en líquidos orgánicos.
Estos materiales, disponibles en el comercio con la marca TWEEN®, son útiles para preparar emulsiones y dispersiones de aceite en agua, o para la solubilización de aceites y la elaboración de pomadas anhidras hidrosolubles o lavables. Los tensioactivos TWEEN® pueden combinarse con tensioactivos de monoéster o triéster de sorbitán relacionados para promover estabilidad en la emulsión. Los tensioactivos TWEEN® generalmente tienen un valor HLB que se encuentra entre 9,6 a 16,7. Los tensioactivos TWEEN® están disponibles en el comercio.
Un tercer grupo de tensioactivos no iónicos que podrían utilizarse solos o junto con tensioactivos SPANS, ARLACEL® y TWEEN®, son los ácidos grasos de polioxietileno elaborados mediante la reacción de óxido de etileno con un ácido graso de cadena larga. El tensioactivo de este tipo más comúnmente disponible se comercializa con el nombre MYRJ® y es un derivado de polioxietileno de ácido esteárico. Los tensioactivos NYRJ® son hidrófilos y solubles o disp 1ersables en ® ag ^ua al îgual q 1ue los tensioactivos TWEEN®. ® Los ten ®sioactivos MYR ®J® p 1ueden mezclarse con tensioactivos TWEEN o con mezclas de te®nsioactivos TWEEN /SPAN o ARLACEL para utilizarse en la formación de emulsiones. Los tensioactivos MYRJ pueden elaborarse por procedimientos conocidos en la técnica o están disponibles en el comercio.
Un cuarto grupo de tensioactivos no iónicos basados en polioxietileno son los éteres de ácido graso de polioxietileno derivados de alcoholes laurílicos, acetílicos, estearílicos y oleílicos. Estos materiales se preparan como se ha indicado anteriormente mediante la adición de óxido de etileno a un alcohol graso. El nombre comercial de estos tensioactivos es BRIJ®. Los tensioactivos BRIJ® pueden ser hidrófilos o lipófilos dependiendo del tamaño de la porción de polioxietileno en el tensioactivo. Aunque la preparación de estos compuestos está disponible en la técnica, también están fácilmente disponibles en fuentes comerciales.
Otros tensioactivos no iónicos que posiblemente podrían utilizarse son, por ejemplo, polioxietileno, ésteres de ácido graso de poliol, éter de polioxietileno, éteres grasos de polioxipropileno, derivados de cera de abeja que contienen polioxietileno, derivado de lanolina de polioxietileno, glicéridos grasos de polioxietileno, ésteres de ácido graso glicerólicos u otros derivados de alcohol o éter de ácido de polioxietileno de ácidos de cadena larga de 12-22 átomos de carbono.
Ya que las emulsiones y formulaciones de la divulgación están destinadas a ser sistemas de varias fases, es preferible seleccionar un tensioactivo no iónico formador de emulsión que tenga un valor HLB en el intervalo de aproximadamente 7 a 16. Este valor puede obtenerse utilizando un solo tensioactivo no iónico, tal como un tensioactivo TWEEN® o puede obtenerse utilizando una mezcla de tensioactivos, tal como con un tensioactivo basado en mono- di- o triéster de sorbitán; un ácido graso de polioxietileno de éster de sorbitán; un éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo derivado de lanolina de polioxietileno; un tensioactivo de éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo de éter graso de polioxietileno de alto HLB; o un tensioactivo de éter graso de polietileno o ácido graso de polioxietilensorbitán.
En ciertas realizaciones, la emulsión comprende un solo tensioactivo no iónico, más particularmente, un tensioactivo TWEEN®, como el tensioactivo no iónico estabilizador de la emulsión. En una realización ejemplar, la emulsión comprende TWEEN® 80, conocido de otra manera como polisorbato 80 o monooleato de polioxietilen sorbitán 20. En otras re fafislizaciones, la emulsión ffis comprende dos o más tensioactivos no iónicos, en particu ffislar un tensi fofisactivo TWEEN y un tensioactivo SPAN . En una realización ejemplar, la emulsión comprende TWEEN 80 y SPAN 85. Las emulsiones de aceite en agua pueden contener de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2,5 % de tensioactivo (p/v), de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2 % de tensioactivo, de 0,01 % a aproximadamente 1,5% de tensioactivo, de 0,01% a aproximadamente 1% de tensioactivo, de 0,01% a aproximadamente 0,5 % de tensioactivo, de 0,05 % a aproximadamente 0,5 % de tensioactivo, de 0,08 % a aproximadamente 0,5% de tensioactivo, aproximadamente 0,08% de tensioactivo, aproximadamente 0,1 % de tensioactivo, aproximadamente 0,2 % de tensioactivo, aproximadamente 0,3 % de tensioactivo, aproximadamente 0,4% de tensioactivo, aproximadamente 0,5% de tensioactivo, aproximadamente 0,6% de tensioactivo, aproximadamente 0,7 % de tensioactivo, aproximadamente 0,8 % de tensioactivo, aproximadamente 0,9 % de tensioactivo, o aproximadamente 1 % de tensioactivo.
Como alternativa, o además, las emulsiones de aceite en agua pueden contener de 0,05 % a aproximadamente 1 %, de 0,05% a aproximadamente 0,9 %, de 0,05 % a aproximadamente 0,8 %, de 0,05 % a aproximadamente 0,7%, de 0,05 % a aproximadamente 0,6%, de 0,05 % a aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,08 %, aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,6 %, aproximadamente 0,7 %, aproximadamente 0,8 %, aproximadamente 0,9 %, o aproximadamente 1 % (p/v) de Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán).
En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua contiene 0,08 % (p/v) de Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán).
Como alternativa, o además, las emulsiones de aceite en agua pueden contener de 0,05 % a aproximadamente 1 %, de 0,05% a aproximadamente 0,9 %, de 0,05 % a aproximadamente 0,8 %, de 0,05 % a aproximadamente 0,7%, de 0,05 % a aproximadamente 0,6%, de 0,05 % a aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,08 %, aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,6 %, aproximadamente 0,7 %, aproximadamente 0,8 %, aproximadamente 0,9 %, o aproximadamente 1 % (p/v) de SPAN85 (trioleato de sorbitán).
Las emulsiones de aceite en agua pueden contener una combinación de tensioactivos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede utilizarse una combinación de Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán) y SPAN85 (trioletato de sorbitán). Las emulsiones pueden contener varias cantidades de Tween 80 y SPAN85 (por ejemplo, las indicadas en ejemplos anteriores) o las mismas cantidades. Por ejemplo, las emulsiones de aceite en agua pueden contener (p/v) aproximadamente 0,05 % de Tween 80 y aproximadamente 0,05% de SPAN85, aproximadamente 0,1% de Tween 80 y aproximadamente 0,1% de SPAN85, aproximadamente 0,2 % de Tween 80 y aproximadamente 0,2 % de SPAN85, aproximadamente 0,3 % de Tween 80 y aproximadamente 0,3 % de SPAN85, aproximadamente 0,4 % de Tween 80 y aproximadamente 0,4 % de SPAN85, aproximadamente 0,5 % de Tween 80 y aproximadamente 0,5 % de SPAN85, aproximadamente 0,6 % de Tween 80 y aproximadamente 0,6 % de SPAN85, aproximadamente 0,7 % de Tween 80 y aproximadamente 0,7 % de SPAN85, aproximadamente 0,8 % de Tween 80 y aproximadamente 0,8 % de SPAN85, aproximadamente 0,9 % de Tween 80 y aproximadamente 0,9 % de SPAN85, o aproximadamente 1 % de Tween 80 y aproximadamente 1,0 % de SPAN85.
En ciertas realizaciones, el tensioactivo es un lípido de polietilenglicol(PEG). En otras realizaciones, la emulsión no comprende un lípido de PEG. Los lípidos de PEG, tales como PEG acoplado a dialquiloxipropilos (PEG-DAA), PEG acoplado a diacilglicerol (PEG-DAG), PEG acoplado a fosfatidiletanolamina (PE) (PEG-PE) o algunos otros fosfolípidos (PEG-fosfolípidos), PEG conjugado a ceramidas (PEG-Cer), o una combinación de los mismos, también pueden utilizarse como tensioactivos (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5.885.613; las publicaciones de solicitud de patente de E.U.A. Nos. 2003/0077829, 2005/0175682 y 2006/0025366). Otros lípidos de PEG adecuados incluyen, por ejemplo, lípidos de PEG-dialquiloxipropilo (dAa ) o lípidos de PEG-diacilglicerol (DAG).
Ejemplos de lípidos de PEG-DAG incluyen, por ejemplo, lípidos de PEG-dilauroilglicerol (C12), lípidos de PEG-dimiristoilglicerol (C14), lípidos de PEG-dipalmitoilglicerol (C16) o lípidos de PEG-distearoilglicerol (C18). Ejemplos de lípidos de PEG-DAA incluyen, por ejemplo, lípidos de PEG-dilauriloxipropilo (C12), lípidos de PEG-dimiristoiloxipropilo (C14), lípidos de PEG-dipalmitoiloxipropilo (C16), o lípidos de PEG-distearoiloxipropilo (C18).
Los PEG se clasifican por sus pesos moleculares; por ejemplo, PEG 2000 tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2.000 daltons, y PEG 5000 tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 5.000 daltons. Los PEG están disponibles en el comercio de Sigma Chemical Co., así como de otras compañías e incluyen, por ejemplo, los siguientes: monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), succinato de monometoxipolietilenglicol (MePEG-S), succinimidil succinato de monometoxipolietilenglicol (MePEG-S NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), tresilato de monometoxipolietilenglicol (MePEG-TRESD), y monometoxipolietilenglicol-imidazolilcarbonilo (MePEG-IM). Además, el monometoxipolietilenglicol-ácido acético (MePEG-CH2COOH), es particularmente útil para preparar los conjugados de PEG-lípido incluyendo, por ejemplo, conjugados de PEG-DAA.
D. Fase acuosa (fase continua)
La fase acuosa (fase continua) de las emulsiones de aceite en agua es el agua, o una solución acuosa que puede contener una sal (por ejemplo, NaCl), un tampón (por ejemplo, un tampón de citrato), un agente tonificador no iónico (por ejemplo, un sacárido), un polímero, un tensioactivo o cualquier combinación de los mismos. La fase acuosa de las emulsiones antes de la formación del complejo (emulsiones de aceite en agua antes de la adición de las moléculas cargadas negativamente) puede diferir de la fase acuosa de las emulsiones después de la formación del complejo (emulsiones de aceite en agua en las que las moléculas cargadas negativamente forman un complejo con las partículas de la emulsión). En general, antes de la formación del complejo, las emulsiones se preparan en un disolvente acuoso que promueve la formación de partículas con propiedades deseadas (por ejemplo, diámetro promedio, y similares). Antes de la formación del complejo las emulsiones se diluyen con una solución acuosa que contiene la molécula cargada negativamente, y otros componentes deseados, para producir la emulsión catiónica final de aceite en agua, que contiene la fase acuosa final con la osmolaridad y tonicidad deseadas. La fase acuosa puede contener un antioxidante, tal como citrato, ascorbato o sales de los mismos.
Cuando las emulsiones se formulan para la administración in vivo, es preferible constituir la solución final de tal manera que la tonicidad y la osmolaridad de la emulsión sean sustancialmente iguales que las de los fluidos fisiológicos normales para impedir así que se produzcan consecuencias no deseadas después de la administración, tales como hinchazón o rápida absorción de la composición. También es preferible regular el pH de la fase acuosa para mantener un pH compatible con las condiciones fisiológicas normales. Asimismo, en ciertos casos, puede ser deseable mantener el pH a un nivel particular para así garantizar la estabilidad de ciertos componentes de la emulsión. Por ejemplo, puede ser deseable preparar una emulsión que sea isotónica e isoosmótica. Para controlar la tonicidad, la emulsión puede comprender una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Puede utilizarse, por ejemplo, cloruro de sodio (NaCl), a un porcentaje de aproximadamente 0,9 % (p/v) (solución salina fisiológica). Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato disódico, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc. También pueden utilizarse agentes tonificantes no iónicos para controlar la tonicidad. Los expertos habituales en la técnica conocen diversos agentes modificadores de tonicidad no iónicos. Estos son típicamente hidratos de carbono de varias clasificaciones (véase, por ejemplo, Voet y Voet (1990) Biochemistry (John Wiley & Sons, Nueva York). Los monosacáridos clasificados como aldosas, tales como, glucosa, manosa, arabinosa y ribosa, así como aquellos clasificados como cetosas, tales como, fructosa, sorbosa y xilulosa, pueden utilizarse como agentes tonificantes no iónicos en la presente divulgación. También pueden utilizarse disacáridos, tales como, sacarosa, maltosa, trehalosa y lactosa. Además, los alditoles (polihidroxi alcoholes acíclicos, también denominados alcoholes de azúcar) tales como glicerol, manitol, xilitol y sorbitol son agentes tonificantes no iónicos útiles en la presente divulgación. Los agentes modificadores de tonicidad no iónicos pueden estar presentes a una concentración de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % o de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, dependiendo del agente que se utilice.
La fase acuosa puede estar tamponada. En el presente documento puede utilizarse cualquier tampón fisiológicamente aceptable, tal como agua, tampones de citrato, fosfato, acetato, tris, bicarbonato, carbonato, succinato o similares. El pH del componente acuoso estará preferentemente en el intervalo de 6,0-8,0, más preferentemente en el intervalo de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,8. En una realización ejemplar, el tampón es tampón de citrato 10 mM con un pH a 6,5. En otra realización ejemplar, la fase acuosa es, o el tampón se prepara utilizando, agua sin RNasa o agua tratada con DEPC. En algunos casos, una alta concentración de sal en el tampón podría interferir con la formación del complejo de la molécula cargada negativamente con la partícula de la emulsión, por lo tanto se evita. En otros casos, puede incluirse cierta cantidad de sal en el tampón.
En una realización ejemplar, el tampón es tampón de citrato 10 mM con un pH a 6,5. Si se desea la fase acuosa es, o el tampón se prepara utilizando, agua sin RNasa o agua tratada con DEPC.
La fase acuosa también puede comprender componentes adicionales tales como moléculas que cambien la osmolaridad de la fase acuosa o moléculas que estabilicen la molécula cargada negativamente después de la formación del complejo. Preferentemente, la osmolaridad de la fase acuosa se ajusta utilizando un agente tonificante no iónico, tal como un azúcar (por ejemplo, trehalosa, sacarosa, dextrosa, fructosa, palatinosa reducida, etc.), un alcohol de azúcar (tal como manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, maltitol, glicerol, etc.). Si se desea puede utilizarse un polímero de polímero no iónico (por ejemplo, un poli(alquilglicol) tal como polietilenglicol, polipropilenglicol o polibutilenglicol) o un tensioactivo no iónico.
En ciertas realizaciones, la fase acuosa de la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender un polímero o un tensioactivo, o una combinación de los mismos. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua contiene un poloxámero. Los poloxámeros son copolímeros de tres bloques no iónicos que tienen una cadena hidrófoba central de óxido de polioxipropilen(poli(propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de óxido de polioxietilen(poli(etileno)). Los poloxámeros también se conocen con el nombre comercial de polímeros Pluronic®.
Los polímeros de poloxámero pueden conducir a una mayor estabilidad y a una resistencia a RNasa aumentada de la molécula de ARN después de la formación del complejo de ARN.
Como alternativa, o además, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender polímero de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 20 % (p/v), o de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 10 %
(p/v). Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender un porcentaje de polímero (por ejemplo, un poloxámero tal como Pluronic® F127 ((copolímero de bloques de óxido de etileno/óxido de propileno:
H(OCH2CH2)x(OCH3CHCH3))y(OCH2CH2)2OH)) de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20% (p/v), de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10% (p/v), de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 10%
(p/v), o de aproximadamente 0,05 % aproximadamente 5 % (p/v).
En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua comprende un porcentaje de Pluronic® F127 de aproximadamente 4 % (p/v), o de aproximadamente 8 % (p/v).
La cantidad del componente acuoso empleada en estas composiciones será aquella cantidad necesaria para llevar el valor de la composición a la unidad. Es decir, una cantidad de componente acuoso suficiente para hacer que el
100 % se mezcle con los demás componentes indicados anteriormente para llevar las composiciones a volumen.
4. Moléculas cargadas negativamente
Cuando se va a suministrar una molécula cargada negativamente, esta puede formar un complejo con las partículas de las emulsiones catiónicas de aceite en agua. La molécula cargada negativamente forma un complejo con las partículas de la emulsión, por ejemplo, mediante interacciones entre la molécula cargada negativamente y el lípido catiónico sobre la superficie de las partículas, así como mediante interacciones hidrófobas/hidrófilas entre la molécula cargada negativamente y la superficie de las partículas. Aunque sin desear quedar limitado por ninguna teoría particular, se cree que las moléculas cargadas negativamente interactúan con el lípido catiónico a través de interacciones de carga iónica no covalentes (fuerzas electrostáticas), y la fuerza del complejo así como la cantidad de compuesto cargado negativamente que puede formar complejo con una partícula están relacionadas con la cantidad de lípido catiónico en la partícula. Además, las interacciones hidrófobas/hidrófilas entre la molécula cargada negativamente y la superficie de las partículas también puede jugar un papel.
Los ejemplos de moléculas cargadas negativamente incluyen péptidos, polipéptidos o proteínas, moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN mono y bicatenario), moléculas pequeñas (por ejemplo, potenciadores inmunitarios de molécula pequeña (SMIP), fosfonato, fluorofosfonato, etc.) y similares, cargados negativamente,. En aspectos preferidos, la molécula cargada negativamente es una molécula de ARN, tal como un ARN que codifica un péptido, polipéptido o proteína, incluyendo moléculas de ARN autorreplicantes, o ARN de interferencia pequeño.
El complejo puede formarse utilizando técnicas conocidas en la materia, ejemplos de las cuales se describen en la presente memoria. Por ejemplo, un complejo de ácido nucleico-partícula puede formarse al mezclar una emulsión catiónica con la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, mediante agitación vorticial. La cantidad de la molécula cargada negativamente y de lípido catiónico en las emulsiones puede ajustarse u optimizarse para proporcionar la fuerza de unión y capacidad de unión deseadas. Por ejemplo, como se describe y se ilustra en el presente documento, se produjeron ejemplos de complejos de ARN-partículas al variar las relaciones de ARN:lípido catiónico
(según se mide por la “relación N/P”). La expresión relación N/P se refiere a la cantidad (moles) de átomos de nitrógeno protonables en el lípido catiónico dividida entre la cantidad (moles) de fosfatos en el ARN.
Las relaciones de N/P que se prefieren varían de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 18:1, de aproximadamente 3:1 a 16:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 14:1, de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 12:1, de aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 11:1, aproximadamente 12:1, aproximadamente
13:1, aproximadamente 14:1, aproximadamente 15:1, o de aproximadamente 16:1. Como alternativa, las relaciones de N/P que se prefieren son de al menos aproximadamente 3:1, de al menos aproximadamente 4:1, de al menos aproximadamente 5:1, de al menos aproximadamente 6:1, de al menos aproximadamente 7:1, de al menos aproximadamente 8:1, de al menos aproximadamente 9:1, de al menos aproximadamente 10:1, de al menos aproximadamente 11:1, de al menos aproximadamente 12:1, de al menos aproximadamente 13:1, de al me aproximadamente 14:1, de al menos aproximadamente 15:1 o de al menos aproximadamente 16:1. Una relación de
N/P que más se prefiere es de aproximadamente 4:1 o más alta.
Cada emulsión puede tener su propia relación de N/P óptima o preferida para producir los efectos deseados (por ejemplo, nivel de expresión deseado del ARN formado complejo), lo cual puede determinarse experimentalmente (por ejemplo, utilizando los ensayos descritos en el presente documento u otras técnicas conocidas en la materia, tales como medir el nivel de expresión de una proteína codificada por el ARN, o medir el porcentaje de las moléculas de ARN que se liberan del complejo en presencia de heparina). Generalmente, la relación de N/P debe estar en un valor en el que al menos aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 % de las moléculas de ARN se libere de los complejos de ARN-partícula cuando los complejos de ARN-partícula sean absorbidos por las células. En algunas realizaciones, la relación de N/P es un valor que proporciona una liberación de al menos el 0,5 % o una liberación de al menos el 1 % de las moléculas de ARN de los complejos de ARN-partículas cuando los complejos de ARN-partículas son absorbidos por las células.
El nivel de expresión de un antígeno codificado por la molécula de ARN podría no estar necesariamente correlacionado con la inmunogenicidad del antígeno. En dichos casos, una relación de N/P preferida u óptima para inmunogenicidad puede determinarse, por ejemplo, midiendo los títulos de anticuerpo específicos.
Las emulsiones catiónicas de aceite en agua descritas en el presente documento son particularmente adecuadas para formular vacunas basadas en ácido nucleico (por ejemplo, vacunas de ADN, vacunas de ARN). La formación de un complejo de ácido nucleico-partícula de emulsión, facilita la absorción del ácido nucleico al interior de las células hospedadoras, y protege a la molécula de ácido nucleico contra la degradación por nucleasas. Después, las células transfectadas pueden expresar el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico, la que puede producir una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Al igual que los virus vivos o atenuados, las vacunas basadas en ácido nucleico pueden acoplar efectivamente las rutas tanto de MHC-1 como de MHC-II permitiendo la inducción de respuestas de células T CD8+ y CD4+, mientras que el antígeno presente en forma soluble, tal como proteína recombinante, generalmente induce solo respuestas de anticuerpo.
En ciertas realizaciones, la molécula cargada negativamente descrita en el presente documento, es una molécula de ARN. En ciertas realizaciones, la molécula de ARN codifica un antígeno (péptido, polipéptido o proteína) y la emulsión catiónica de aceite en agua es adecuada para su uso como una vacuna basada en ARN. La composición puede contener más de una especie de molécula de ARN que codifique un antígeno, por ejemplo, dos, tres, cinco o diez especies diferentes de moléculas de ARN que estén formando complejo con las partículas de la emulsión. Es decir, la composición puede contener una o más especies diferentes de moléculas de ARN, codificando cada una de ellas un antígeno diferente. Como alternativa, o además, una molécula de ARN también puede codificar más de un antígeno, por ejemplo, una molécula de ARN bicistrónica o tricistrónica que codifique antígenos diferentes o idénticos. En consecuencia, la emulsión catiónica de aceite en agua es adecuada para su uso como una vacuna basada en ARN, que sea monovalente o multivalente. Si se desea, la molécula de ARN puede ser policistrónica. La secuencia de la molécula de ARN puede optimizarse o desoptimizarse con codones para su expresión en un hospedador deseado, tal como una célula humana.
La secuencia de la molécula de ARN puede modificarse si se desea, por ejemplo, para aumentar la eficacia de la expresión o replicación del ARN, o para proporcionar estabilidad adicional o resistencia a la degradación. Por ejemplo, la secuencia de ARN puede modificarse con respecto a su uso de codones, por ejemplo, para aumentar la eficacia de la traducción y la semivida del ARN. Una cola poli A (por ejemplo, de aproximadamente 30 restos de adenosina o más) (SEQ ID NO: 28) puede unirse al extremo 3' del ARN para aumentar su semivida. El extremo 5' del ARN puede protegerse con un ribonucleótido modificado con la estructura m7G (5') ppp (5') N (estructura de caperuza 0) o con un derivado del mismo, el cual puede incorporarse durante la síntesis de ARN o puede modificarse enzimáticamente después de la transcripción de ARN (por ejemplo, utilizando una enzima de caperuza del virus de la variolovacuna (VCE, siglas de vaccinia virus capping enzyme) que consiste en ARNm trifosfatasa, guanilil-transferasa y guanina-7-metiltransferasa, la cual cataliza la construcción de estructuras de caperuza 0 N7-monometiladas). La estructura de caperuza 0 juega un papel importante en el mantenimiento de la estabilidad y eficacia de traducción de la molécula de a Rn . La caperuza 5' de la molécula de ARN puede modificarse adicionalmente por una 2'-O-metiltransferasa lo cual da como resultado la generación de una estructura de caperuza 1 [m7Gppp[m2'-O]N), que puede aumentar más la eficacia de la traducción.
Si se desea, la molécula de ARN puede comprender uno o más nucleótidos modificados además de cualquier estructura de caperuza en 5'. Hay más de 96 modificaciones de nucleósidos de origen natural que se encuentran en ARN de mamífero. Véase, por ejemplo, Limbach y col., Nucleic Acids Research, 22(12):2183-2196 (1994). La preparación de nucleótidos y de nucleótidos y nucleósidos modificados se conoce bien en la técnica, por ejemplo, de las patentes de E.U.A. Números 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679,5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642 y muchos nucleósidos modificados y nucleótidos modificados están disponibles en el comercio. Las nucleobases modificadas que pueden incorporarse en nucleósidos y nucleótidos modificados y estar presentes en las moléculas de ARN incluyen: m5C (5-metilcitidina), m5U (5-metiluridina), m6A (N6-metiladenosina), s2U (2 tiouridina), Um (2'-O-metiluridina), m1A (1-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am (2-1-O-metiladenosina); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina); i6A (N6-isopentiladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina); io6A (N6-(c/s-hidroisopentenil)adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6-[cis-hidroxiisopentenil)adenosina); g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonil carbamoiladenosina); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A (N6-hidroxinorvalilcarbamoil adenosina); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); m il (1-metilinosina); m'Im (1,2'-O-dimetilinosina); m3C (3-metilcitidina); Cm (2T-O-metilcitidina); s2C (2-tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5-fonilcitidina); m5CM (5,2-O-dimetilcitidina); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina); k2C (lisidina); mIG (1-metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7-metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2-dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanosina); Grt(p) (2'-O-ribosilguanosina (fosfato)); yW (wybutosina); o2yW (peroxiwibutosina); OHyW (hidroxiwibutosina); OHyW* (hidroxiwibutosina no modificada); imG (wiosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (manosil-queuosina); preQo (7-ciano-7-desazaguanosina); preQi (7-aminometil-7-desazaguanosina); G* (arcaeosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5-metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido 5-oxiacético de uridina); mcmo5U (éster metílico de ácido 5-oxiacético de uridina); chm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina)); mchm5U (éster metílico de (5-(carboxihidroximetil)uridina); mem5U (5-metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-O-metiluridina); mem5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina); mm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); mcm5U (5-carbamoilmetil uridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina); cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximetil aminometil-2L-Ometil uridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2'-O-metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3-metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina); m62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenosina); m2'7G (N2,7-dimetilguanosina); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-O-dimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O-metilcitidina); mIGm (1,2'-O-dimetilguanosina); m'Am (1,2-O-dimetiladenosina) irinometiluridina); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-demetilguanosina); imG2 (isoguanosina); ac6A (N6-acetiladenosina); hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, 7- derivados sustituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquiluracilo de (C-i-Ca), 5-metiluracilo, 5-alqueniluracilo de (C2-Ca), 5-alquiniluracilo de (C2-Ca), 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquilcitosina de (Ci -Ca), 5-metilcitosina, 5-alquenilcitosina de (C2-Ca), 5-alquinilcitosina de (C2-Ca), 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-desdazaguanina, 8-azaguanina, 7-desaza-7-guanina sustituida, 7-desaza-7-alquinilguanina de (C2-C6), 7-desaza-8-guanina sustituida, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-desazapurina sustituida, 7-desaza-7-purina sustituida, 7-desaza-8-purina sustituida, hidrógeno (residuo abásico), m5C, m5U, m6A, s2U, W, o 2'-O-metil-U. Muchas de estas nucleobases modificadas y sus ribonucleósidos correspondientes están disponibles de proveedores comerciales. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/005799.
Si se desea, la molécula de ARN puede contener enlaces de fosforoamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no incluye nucleótidos modificados, por ejemplo, no incluye nucleobases modificadas, y todos los nucleótidos en la molécula de ARN son ribonucleótidos estándar convencionales A, U, G y C, con la excepción de una caperuza en 5' opcional que puede incluir, por ejemplo, 7-metilguanosina. En otras realizaciones, el ARN puede incluir una caperuza en 5' que comprende una 7'-metilguanosina, y los 1, 2 o 3 primeros ribonucleótidos en 5' pueden estar metilados en la posición 2' de la ribosa.
A. ARN autorreplicante
En algunos aspectos, la emulsión catiónica de aceite en agua contiene una molécula de ARN autorreplicante. En ciertas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante procede de un alfavirus, o se basa en un alfavirus.
Moléculas de ARN autorreplicante se conocen bien en la técnica y pueden producirse utilizando elementos de replicación procedentes, por ejemplo, de alfavirus, y sustituyendo las proteínas víricas estructurales con una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína de interés. Células transfectadas con ARN autorreplicante producen brevemente antígeno antes de sufrir muerte apoptótica. Esta muerte es probablemente resultado de los productos intermedios de ARN bicatenario (bc) necesarios, los cuales también han mostrado súper activar células dendríticas. Así, la inmunogenicidad aumentada de ARN autorreplicante puede ser el resultado de la producción de ARN bc proinflamatorio, el cual imita una infección por virus de a Rn de células hospedadoras.
Ventajosamente, las moléculas de ARN autorreplicante utilizan la maquinaria de la célula para generar un aumento exponencial de productos génicos codificados, tales como proteínas o antígenos, que pueden acumularse en las células o secretarse de las mismas. La sobreexpresión de proteínas o antígenos por moléculas de ARN autorreplicante aprovecha los efectos adyuvantes inmunoestimuladores, incluyendo la estimulación de receptores de tipo Toll (TLR), 3, 7 y 8 y rutas no TLR (por ejemplo, RIG-1, MID-5) por los productos de replicación y amplificación de ARN, y traducción que induce la apoptosis de la célula transfectada.
El ARN autorreplicante generalmente contiene al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en replicasas, proteasas, helicasas y otras proteínas víricas no estructurales, y también comprende secuencias de replicación en c/s-activas del extremo 5' y 3', y si se desea, secuencias heterólogas que codifican secuencias de aminoácidos deseadas (por ejemplo, un antígeno de interés). Un promotor subgenómico que dirija la expresión de la secuencia heteróloga puede incluirse en el ARN autorreplicante. Si se desea, la secuencia heteróloga (por ejemplo, un antígeno de interés) puede fusionarse en marco con otras regiones codificantes en el ARN autorreplicante y/o puede estar bajo el control de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, Internal R/bosome Entry Site).
En ciertas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante no está encapsulada en una partícula de tipo virus. Las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación pueden diseñarse de tal manera que la molécula de ARN autorreplicante no pueda inducir la producción de partículas víricas infecciosas. Esto se puede lograr, por ejemplo, al omitir uno o varios genes víricos que codifiquen proteínas estructurales que sean necesarias para la producción de partículas víricas en el ARN autorreplicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN autorreplicante se basa en un alfavirus, tal como virus Sindbis (SIN), virus del bosque Semliki y virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), pueden omitirse uno o más genes que codifiquen proteínas estructurales víricas, tales como glicoproteínas de cápside y/o envoltura.
Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación también pueden diseñarse para inducir la producción de partículas víricas infecciosas que sean atenuadas o virulentas, o para producir partículas víricas que sean capaces de realizar una sola ronda de infección posterior.
Cuando se suministre a una célula de vertebrado, una molécula de ARN autorreplicante puede conducir a la producción de varias moléculas de ARN hijas por transcripción a partir de sí misma (o a partir de una copia antisentido de ella misma). El ARN autorreplicante puede traducirse directamente después de su suministro a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que después produce transcritos a partir del ARN suministrado. Por tanto, el ARN suministrado conduce a la producción de varias moléculas de ARN hijas. Estos transcritos son antisentido con relación al ARN suministrado y pueden traducirse ellos mismos para proporcionar la expresión in s/tu de un producto génico, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN suministrado que sean traducidos para proporcionar la expresión /n s/tu del producto génico.
Un sistema adecuado para lograr autorreplicación es utilizar un replicón de ARN basado en alfavirus. Los alfavirus comprenden un conjunto de virus transmitidos por artrópodos, genética, estructural y serológicamente relacionados, de la familia Togav/r/dae. Dentro del género Alfavirus, se han clasificado veintiséis virus y subtipos de virus conocidos, incluyendo, virus Sindbis, virus del bosque de Semliki, virus del río Ross y virus de la encefalitis equina venezolana. De esta manera, el ARN autorreplicante de la divulgación puede incorporar una ARN replicasa derivada del virus del bosque Semliki (SFV), virus Sindbis (SIN), virus de la encefalitis equina venezolana (v Ee ), virus del río Ross (RRV) u otros virus pertenecientes a la familia de los alfavirus.
En la divulgación pueden utilizarse vectores de expresión de “replicón” basados en alfavirus. Los vectores de replicón pueden utilizarse en varios formatos, incluyendo ADN, ARN y partículas de replicón recombinantes. Dichos vectores de replicón han sido derivados de alfavirus que incluyen, por ejemplo, virus Sindbis (Xiong y col. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky y col., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan y col. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo y col. (1999) PNAS 96:4598-4603), virus del bosque Semliki (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund y col. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), y virus de la encefalitis equina venezolana (Pushko y col. (1997) Virology 239:389-401). Los replicones derivados de alfavirus generalmente son muy similares en características similares (por ejemplo, estructura, replicación), los alfavirus individuales pueden exhibir cierta propiedad particular (por ejemplo, unión a receptores, sensibilidad a interferón y perfil de enfermedad) que sea única. Por lo tanto, también pueden utilizarse replicones de alfavirus quiméricos creados a partir de familias de virus divergentes.
Los replicones basados en alfavirus son replicones de cadena (+) que pueden traducirse después de su suministro a una célula para dar una replicasa (o replicasa-transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de cadena (-) genómicas del ARN suministrado de cadena . Estos transcritos de cadena (-) pueden auto transcribirse para dar copias adicionales del ARN progenitor de cadena (+) y también para dar un transcrito subgenómico que codifique el producto génico deseado. La traducción del transcrito subgenómico conduce por tanto a la expresión in s/tu del producto génico deseado por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden utilizar una replicasa de un virus Sindbis, un virus del bosque Semliki, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc.
Por tanto, una molécula de ARN autorreplicante preferida codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN a partir de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un antígeno de polipéptido. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprenda la proteína de alfavirus nsP4.
Mientras que los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas de virión estructurales además de la replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN autorreplicante basada en alfavirus de la divulgación, no codifique proteínas estructurales de alfavirus. De esta manera el ARN autorreplicante puede conducir a la producción de copias de ARN genómicas de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones de alfavirus que contengan ARN. La incapacidad de producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN autorreplicante no puede perpetuarse a sí misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para perpetuación en virus de tipo silvestre están ausentes de las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación y su lugar es tomado por uno o más genes que codifican el producto génico deseado, de tal manera que el transcrito subgenómico codifique el producto génico deseado en lugar de las proteínas estructurales de viriones de alfavirus.
Por tanto, una molécula de ARN autorreplicante útil con la divulgación puede tener dos marcos abiertos de lectura. El primer marco abierto de lectura (5') codifica una replicasa; el segundo marco abierto de lectura (3') codifica un antígeno de polipéptido. En algunas realizaciones el a Rn puede tener marcos abiertos de lectura adicionales (hacia el extremo 3'), por ejemplo, que codifiquen otros productos génicos deseados. Una molécula de ARN autorreplicante puede tener una secuencia 5' que sea compatible con la replicasa codificada.
En otros aspectos, la molécula de ARN autorreplicante procede de, o se basa en, un virus distinto de alfavirus, preferentemente, un virus de ARN de cadena positiva, y más preferentemente un picornavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus o coronavirus. Las secuencias de alfavirus de tipo silvestre adecuadas se conocen bien y están disponibles en depósitos de secuencias, tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md. Ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), virus de la encefalomielitis equina oriental (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), virus del río Ross (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926) y Y-62-33 (ATC VR-375).
Las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación son más grandes que otros tipos de ARN (por ejemplo, ARNm). Típicamente, las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación contienen al menos aproximadamente 4 kb. Por ejemplo, el ARN autorreplicante puede contener al menos aproximadamente 5kb, al menos aproximadamente 6kb, al menos aproximadamente 7kb, al menos aproximadamente 8kb, al menos aproximadamente 9kb, al menos aproximadamente 10kb, al menos aproximadamente 11kb, al menos aproximadamente 12kb o más de 12kb. En ciertos ejemplos, el ARN autorreplicante tiene aproximadamente 4kb a aproximadamente de12kb, aproximadamente 5kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 6kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 7kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 8kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 9kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 11kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 5kb a aproximadamente de 11kb, aproximadamente 5kb a aproximadamente de 10kb, aproximadamente 5kb a aproximadamente de 9kb, aproximadamente 5kb a aproximadamente de 8kb, aproximadamente 5kb a aproximadamente de 7kb, aproximadamente 5kb a aproximadamente de 6kb, aproximadamente 6kb a aproximadamente de 12kb, aproximadamente 6kb a aproximadamente de 11kb, aproximadamente 6kb a aproximadamente de 10kb, aproximadamente 6kb a aproximadamente de 9kb, aproximadamente 6kb a aproximadamente de 8kb, aproximadamente 6kb a aproximadamente de 7kb, aproximadamente 7kb a aproximadamente de 11kb, aproximadamente 7kb a aproximadamente de 10kb, aproximadamente 7kb a aproximadamente de 9kb, aproximadamente 7kb a aproximadamente de 8kb, aproximadamente 8kb a aproximadamente de 11kb, aproximadamente 8kb a aproximadamente de 10kb, aproximadamente 8kb a aproximadamente de 9kb, aproximadamente 9kb a aproximadamente de 11kb, aproximadamente 9kb a aproximadamente de 10kb, o aproximadamente 10kb a aproximadamente de 11kb.
Las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación pueden comprender uno o más nucleótidos modificados (por ejemplo, pseudouridina, N6-metiladenosina, 5-metilcitidina, 5-metiluridina).
La molécula de ARN autorreplicante puede codificar un solo antígeno de polipéptido u, opcionalmente, dos o más antígenos de polipéptidos ligados entre sí de tal manera que cada una de las secuencias conserve su identidad (por ejemplo, ligados en serie) cuando se exprese como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos generados a partir de ARN autorreplicante pueden producirse después como un polipéptido de fusión o modificarse por ingeniería genética de tal manera que den como resultado secuencias de polipéptidos o de péptidos distintas.
El ARN autorreplicante de la divulgación puede codificar uno o más antígenos de polipéptidos que contengan una gama de epítopos. Preferentemente epítopos capaces de provocar ya sea una respuesta de células T auxiliares o una respuesta de células T citotóxicas o ambas.
Las moléculas de ARN autorreplicante descritas en el presente documento pueden modificarse por ingeniería genética para expresar secuencias de nucleótidos múltiples, a partir de dos o más marcos abiertos de lectura, permitiendo así la expresión conjunta (coexpresión) de proteínas, tal como dos o más antígenos junto con citocinas u otros inmunomoduladores, lo que puede potenciar la generación de una respuesta inmunitaria. Dicha molécula de ARN autorreplicante puede ser particularmente útil, por ejemplo, en la producción de varios productos génicos (por ejemplo, proteínas) al mismo tiempo, por ejemplo, como una vacuna bivalente o multivalente.
Las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento adecuado. En la técnica se conocen varios procedimientos adecuados para la producción de moléculas de ARN que contienen nucleótidos modificados. Por ejemplo, puede prepararse una molécula de ARN autorreplicante que contenga nucleótidos modificados transcribiendo (por ejemplo, transcripción in vitro) un ADN que codifique la molécula de ADN autorreplicante utilizando una a Rn polimerasa dependiente de ADN adecuada, tal como ARN polimerasa de fago T7, ARN polimerasa de fago SP6, ARN polimerasa de fago T3, y similares, o mutantes de estas polimerasas que permitan la incorporación eficiente de nucleótidos modificados en moléculas de ARN. La reacción de transcripción contendrá nucleótidos y nucleótidos modificados, y otros componentes que soporten la actividad de la polimerasa seleccionada, tal como un tampón adecuado, y sales adecuadas. La incorporación de análogos de nucleótido en un ARN autorreplicante puede modificarse por ingeniería genética, por ejemplo, para alterar la estabilidad de dichas moléculas de ARN, para aumentar resistencia contra RNasas, para establecer replicación después de la introducción en células hospedadoras adecuadas (“infectividad” del ARN), y/o para inducir o reducir respuestas inmunitarias innatas y adaptivas.
Los procedimientos sintéticos adecuados pueden utilizarse solos, o en combinación con uno o más procedimientos distintos (por ejemplo, tecnología de ADN o ARN recombinante), para producir una molécula de ARN autorreplicante de la divulgación. En la técnica se conocen bien procedimientos adecuados para la síntesis de novo y pueden adaptarse para aplicaciones particulares. Como ejemplos de procedimientos se incluyen, por ejemplo, síntesis química utilizando grupos protectores adecuados, tales como CEM (Masuda y col., (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51:3-4), el procedimiento de p-cianoetil fosforamidita (Beaucage S L y col. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); el procedimiento de nucleósido H-fosfonato (Garegg P y col. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler B C y col. (1986) Nucl Acid Res 14:5399-407; Garegg P y col. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney B L y col. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22). Estas síntesis químicas pueden llevarse a cabo o adaptarse para utilizarse con sintetizadores de ácido nucleico automáticos que están disponibles en el comercio. Se describen procedimientos sintéticos adecuados adicionales en Uhlmann y col. (1990) Chem Rev 90:544-84, y Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. La síntesis de ácido nucleico también se puede llevar a cabo utilizando procedimientos recombinantes adecuados que se conozcan bien y sean convencionales en la técnica, incluyendo clonación, procesamiento y/o expresión de polinucleótidos y productos génicos codificados por tales polinucleótidos. El barajado de ADN por fragmentación aleatoria y reensamblado por PCR de fragmentos génicos y polinucleótidos sintéticos, son ejemplos de técnicas conocidas que pueden utilizarse para diseñar y modificar por ingeniería genética secuencias de polinucleótidos. Puede utilizarse mutagénesis dirigida para alterar ácidos nucleicos y las proteínas codificadas, por ejemplo, para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar preferencias de codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones y similares. Se conocen procedimientos adecuados para la transcripción, traducción y expresión de secuencias de ácido nucleico y son convencionales en la técnica. (Véase, en líneas generalrs,Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, y col., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; Bitter, y col., in Methods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern y col., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982; and Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989.)
La presencia y/o cantidad de uno o más nucleótidos modificados en una molécula de ARN autorreplicante pueden determinarse utilizando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, un ARN autorreplicante puede digerirse a monofosfatos (por ejemplo, utilizando nucleasa P1) y desfosforilarse (por ejemplo, utilizando una fosfatasa adecuada tal como CIAP), y los nucleósidos resultantes pueden analizarse por HPLC de fase inversa (por ejemplo, utilizando una columna YMC Pack ODS-AQ (5 micras, 4.6 X 250 mm) y eluirse utilizando un gradiente, 30 % B (0-5 min) a 100% B (5-13 min) y a 100% B (13-40) min, caudal (0,7 ml/min), detección UV (longitud de onda: 260 nm), temperatura de columna (30 °C). Tampón A (ácido acético 20 mM - acetato de amonio, pH 3,5), tampón B (ácido acético 20 mM - acetato de amonio, pH 3,5 / metanol [90/10])).
Opcionalmente, las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación pueden incluir uno o más nucleótidos modificados de tal manera que la molécula de ARN autorreplicante tenga menos actividad inmunomoduladora después de su introducción o entrada en una célula hospedadora (por ejemplo, una célula humana) en comparación con la molécula de ARN autorreplicante correspondiente que no contenga nucleótidos modificados.
Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante pueden explorarse o analizarse para confirmar sus propiedades terapéuticas o profilácticas utilizando varios procedimientos de ensayo in vitro o in vivo conocidos por expertos en la técnica. Por ejemplo, vacunas que comprendan molécula de ARN autorreplicante pueden someterse a ensayo para determinar su efecto en la inducción de proliferación o función efectora del tipo de linfocito particular de interés, por ejemplo, células B, células T, líneas de células T y clones de células T. Por ejemplo, pueden aislarse esplenocitos de ratones inmunizados y determinar la capacidad de los linfocitos T citotóxicos para causar la lisis de células diana autólogas que contengan una molécula de ARN autorreplicante que codifique un antígeno de polipéptido. Además, la diferenciación de células T auxiliares puede analizarse midiendo la proliferación o producción de citocinas TH1 (IL-2 e IFN-y) y/o TH2 (IL-4 e IL-5) por ELISA o directamente en células T CD4+ por tinción con citocinas citoplasmáticas y citometría de flujo.
Las moléculas de ARN autorreplicante que codifican un antígeno de polipéptido también pueden ensayarse para determinar la capacidad para inducir respuestas inmunitarias humorales, como se evidencia, por ejemplo, por la inducción de la producción de células B de anticuerpos específicos para un antígeno de interés. Estos ensayos pueden llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, linfocitos B periféricos de individuos inmunizados. Los expertos en la materia conocen dichos procedimientos de ensayo. Otros ensayos que pueden utilizarse para caracterizar las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación pueden implicar detectar la expresión del antígeno codificado por las células diana. Por ejemplo, puede utilizarse FACS para detectar la expresión de antígenos en la superficie de la célula o intracelularmente. Otra ventaja de la selección por FACS es que se pueden clasificar diferentes niveles de expresión; pudiendo algunas veces desear una menor expresión. Otro procedimiento adecuado para identificar células que expresen un antígeno particular, incluye la selección utilizando anticuerpos monoclonales en una placa o la captura utilizando esferas magnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales.
B. Antígenos
En ciertas realizaciones, la molécula cargada negativamente descrita en el presente documento es una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN) que codifica un antígeno. Los antígenos adecuados incluyen, pero sin limitación, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno fúngico, un antígeno protozoario, un antígeno vegetal, un antígeno de cáncer o una combinación de los mismos.
Los antígenos adecuados incluyen proteínas y péptidos de un patógeno tal como un virus, una bacteria, una hongo, un protozoo, una planta o de un tumor. Los antígenos víricos e inmunógenos que pueden ser codificados por la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero sin limitación, proteínas y péptidos del género Orthomyxovirus, tales como virus de la gripe A, B y C; virus del género Paramyxoviridae, tales como neumovirus (RSV), paramixovirus (PIV), metaneumovirus y morbilivirus (por ejemplo, sarampión); Pneumovirus, tales como el virus respiratorio sincicial (RSV), virus respiratorio sincitial bovino, virus de la neumonía de ratones y virus de la rinotraqueítis del pavo; Paramyxovirus, tales como virus paragripal de los tipos 1-4 (PIV), virus de las paperas, virus Sendai, virus 5 de simio, virus paragripal bovino, nipavirus, henipavirus y virus de la enfermedad de Newcastle; virus de la viruela, incluyendo un ortopoxvirus tal como Varióla vera (incluyendo pero sin limitación, Varióla major y Varióla minor); metaneumovirus tales como metaneumovirus humano (hMPV) y metaneumovirus aviar (aMPV); morbilivirus, tales como sarampión; picornavirus, tales como enterovirus, rinovirus, heparnavirus, parecovirus, cardiovirus y aftovirus; enterovirus, tales como virus de la polio de los tipos 1, 2 o 3, virus de coxsackie A de los tipos 1 a 22 y 24, virus de coxsackie B de los tipos 1 a 6, ecovirus (ECHO) de los tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 y enterovirus 68 a 71, bunyavirus, incluyendo un ortobunyavirus tal como virus de la encefalitis de California; un flebovirus, tal como virus de fiebre del Valle Rift; un nairovirus, tal como virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo; heparnavirus, tal como virus de la hepatitis A (HAV); togavirus (rubeola), tal como rubivirus, un alfavirus o un arterivirus; flavivirus, tales como virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), virus del dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus del bosque Kyasanur, virus de la encefalitis del Nilo Occidental, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis rusa que aparece en primavera-verano, virus de la encefalitis de Powassan; pestivirus, tales como virus de la diarrea viral bovina (BVDV), fiebre porcina clásica (CSFV) o enfermedad de Border (BDV); hepadnavirus, tales como virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C; rhabdovirus, tales como lisavirus (virus de la rabia) y vesiculovirus (VSV), Caliciviridae, tales como virus de Norwalk y virus de tipo Norwalk, tales como virus de Hawai y virus de la Montaña Nevada; coronavirus, tales como SARS, coronavirus respiratorio humano, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis de ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible por porcinos (TGEV); retrovirus tales como un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus; reovirus, como un ortorreovirus, un rotavirus, un orbivirus, o un coltivirus; parvovirus, tales como parvovirus B19; virus de la hepatitis delta (HDV); virus de la hepatitis E (HEV); virus de la hepatitis G (HGV); virus del herpes humano, tales como, por medio de virus del herpes simple (HSV), virus de la varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (HHV6), virus del herpes humano 7 (HHV7) y virus del herpes humano 8 (HHV8); papovavirus, tales como virus del papiloma y virus del polioma, adenovirus y arenavirus.
En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta peces, tal como: virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), virus del bagre de canal (CCV); virus de la enfermedad linfocistis de peces (FLDV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), virus del herpes koi, virus tipo picorna de salmón (conocido también como virus tipo picorna del salmón del Atlántico), virus del salmón sin litoral (LSV), rotavirus del salmón del Atlántico (ASR), virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (TSD), virus del tumor de salmón plateado (CSTV) o virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malarie o P. ovale. Por tanto, la divulgación puede utilizarse para inmunizar contra el paludismo. En algunas realizaciones el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente aquellos de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, piojos de mar tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
Los antígenos e inmunógenos bacterianos que puede codificar la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero sin limitación, proteínas y péptidos de Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Burkholderia sp. (por ejemplo, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei y Burkholderia cepacia), Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Haemophilus influenzae, Clostridium tetani (tétanos), Clostridium perfringens, Clostridium botulinums (botulismo), Cornynebacterium diphtheriae (difteria), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella sp. (por ejemplo, B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis y B. pinnipediae,), Francisella sp. (por ejemplo, F. novicida, F. philomiragia y F. tularensis), Streptococcus agalactiae, Neiserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum (Syphilis), Haemophilus ducreyi, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Helicobacter pylori, Staphylococcus saprophyticus, Yersinia enterocolitica, E. coli (tal como E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. coli de adherencia difusa (DAEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli patógena extraintestinal (ExPEC; tal como E. coli uropatógena (UPEC) y E. coli asociada a meningitis/septicemia (MNEC)) y/o E. coli enterohemorrágica (EHEC), Bacillus anthracis (ántrax), Yersinia pestis (plaga), Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia, Listeria monocytogenes, Chlamydia pneumoniae, Vibrio cholerae, Salmonella typhi (fiebre tifoidea), Borrelia burgdorfer, Porphyromonas gingivalis, Klebsiella, Mycoplasma pneumoniae, etc.
Los antígenos e inmunógenos fúngicos que puede codificar la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero sin limitación, proteínas y péptidos de dermatófitos, incluyendo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
Los antígenos e inmunógenos protozoarios que puede codificar la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero sin limitación, proteínas y péptidos de Entamoeba histolytica, Giardia lambli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis y Toxoplasma.
Los antígenos e inmunógenos vegetales que puede codificar la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero sin limitación, proteínas y péptidos de Ricinus communis.
Los antígenos adecuados incluyen proteínas y péptidos de un virus tal como, por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus del herpes simple (HSV), citomegalovirus (CMV), virus gripal (influenza), virus respiratorio sincicial (RSV), parvovirus, norovirus, virus del papiloma humano (HPV), rinovirus, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia, virus de la fiebre dengue, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubeola, virus de la varicela zóster, enterovirus (por ejemplo, enterovirus 71), virus del ébola y virus de la diarrea bovina. Preferentemente, la sustancia antigénica se selecciona del grupo que consiste en glicoproteína gD de HSV, glicoproteína gp120 de VIH, glicoproteína gp40 de VIH, p55 gag de VIH y polipéptidos de las regiones pol y tat. En otras realizaciones preferidas de la divulgación, el antígeno es una proteína o péptido derivado de una bacteria tal como, por ejemplo, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, Vibrio cholerae (cólera), C. diphtheriae (difteria), C. tetani (tétanos), Neisseria meningitidis, B. pertussis, Mycobacterium tuberculosis, y similares.
Los antígenos de VIH que pueden codificar las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación se describen en la solicitud de E.U.A. No. de serie 490.858, presentada el 9 de marzo de 1990 y solicitud europea publicada No.
181150 (14 de mayo de 1986), así como solicitudes de E.U.A. Nos. de serie 60/168,471, 09/475,515, 09/475,504 y 09/610,313.
Los antígenos de citomegalovirus que pueden codificar las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación se describen en la patente de E.U.A. No. 4,689,225, solicitud de E.U.A. No. De serie 367,363, presentada el 16 de junio de 1989 y publicación de PCT WO 89/071243.
Los antígenos de la hepatitis C que pueden codificar las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación se describen en el documento PCT/US88/04125, solicitud europea publicada número 318216 (31 de mayo de 1989), solicitud japonesa publicada número 1-500565 presentada el 18 de noviembre de 1988, solicitud canadiense 583,561 y EPO 388,232. Un conjunto diferente de antígenos de HCV se describe en la solicitud de patente europea 90/302866.0, presentada el 16 de marzo de 1990 y solicitud de E.U.A. No. de serie 456,637, presentada el 21 de diciembre de 1989, y PCT/UJS90/01348.
En algunas realizaciones, el antígeno procede de un alérgeno, tal como alérgeno del polen (alérgenos del polen de árboles, hierbas, malezas y céspedes); alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos inhalantes, de saliva y veneno, por ejemplo, alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y mosquitos, alérgenos de veneno de himenópteros); alérgenos de pelaje animal y caspa (por ejemplo, de perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos de alimentos (por ejemplo, una gliadina). Los alérgenos de polen importantes de árboles, céspedes y hierbas son los que se originan de los órdenes taxonómicos Fagales, Oleales, Piñales y Platanaceae, pero sin limitación, el abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), hojarazo (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), plátano de sombra (Platanus), el orden de Poales incluyendo gramíneas de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y sorgo, los órdenes de Asterales y Urticales incluyendo hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son los de los ácaros del polvo doméstico de los géneros Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de almacenamiento por ejemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, los de las cucarachas, mosquitos y pulgas, por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y los de mamíferos como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno incluyendo aquellos procedentes de los insectos que pican o que muerden, como los del orden taxonómico de Hymenoptera, incluyendo abejas (Apidae), avispas (Vespidea) y hormigas (Formicoidae).
En ciertas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante puede codificar un inmunógeno o antígeno tumoral, o inmunógeno o antígeno de cáncer. En ciertas realizaciones, los inmunógenos y antígenos tumorales son antígenos tumorales que contienen péptidos, tales como un antígeno tumoral de polipéptido o antígenos tumorales de glicoproteínas.
Los inmunógenos y antígenos tumorales adecuados para utilizarse en el presente documento abarcan una amplia variedad de moléculas, tales como (a) antígenos tumorales que contienen polipéptidos, incluyendo polipéptidos (que pueden variar, por ejemplo, de 8-20 aminoácidos de longitud, aunque longitudes fuera de este intervalo también son comunes), lipopolipéptidos y glicoproteínas.
En ciertas realizaciones, los inmunógenos tumorales son, por ejemplo, (a) moléculas de longitud completa asociadas a células de cáncer, (b) homólogos y formas modificadas de los mismos, incluyendo moléculas con porciones suprimidas, añadidas y/o sustituidas, y (c) fragmentos de los mismos. Los inmunógenos tumorales incluyen, por ejemplo, antígenos restringidos de clase I reconocidos por linfocitos CD8+ o antígenos restringidos de clase II reconocidos por linfocitos CD4+.
En ciertas realizaciones, los inmunógenos tumorales incluyen, pero sin limitación, (a) antígenos de cáncer de testículo tales como NY-ESO-I, SSX2, SCPI así como los polipéptidos de las familias rAg E, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (los cuales pueden utilizarse, por ejemplo, para tratar melanoma, tumores de pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, mamarios, gastrointestinales y de vejiga), (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociados a varios tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, pulmonar, cabeza y cuello), p21/Ras (asociado, por ejemplo, a melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal), CDK4 (asociado, por ejemplo, a melanoma), MUM1 (asociado, por ejemplo, a melanoma), caspasa-8 (asociado, por ejemplo, a cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado, por ejemplo, a cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociado, por ejemplo, a melanoma), TCR (asociado, por ejemplo, a linfoma no Hodgkin de células T), BCR-abl (asociado, por ejemplo, a leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT, (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, galectina 4 (asociada, por ejemplo, a cáncer colorrectal), galectina 9 (asociada, por ejemplo, a enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada, por ejemplo, a leucemia mielógena crónica), WT 1 (asociado, por ejemplo, a varias leucemias), anhidrasa carbónica (asociada, por ejemplo, a cáncer renal), aldolasa A (asociada, por ejemplo, a cáncer pulmonar), PRAME (asociado, por ejemplo, a melanoma), HER-2/neu (asociado, por ejemplo, a cáncer de mama, colon, pulmón y ovario), alfafetoproteína (asociada, por ejemplo, a hepatoma), KSA (asociado, por ejemplo, a cáncer colorrectal), gastrina (asociada, por ejemplo, a cáncer pancreático y gástrico), proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociada, por ejemplo, a cáncer de mama y ovario), G-250 (asociado, por ejemplo, a carcinoma de células renales), p53 (asociado, por ejemplo, a cáncer de mama y colon), y antígeno carcinoembrionario (asociado, por ejemplo, a cáncer de mama, cáncer pulmonar y cánceres del tracto gastrointestinal tales como cáncer colorrectal), (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación melanoma-melanocítica, tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de hormona estimuladora de melanocitos, tirosinasa, proteína relacionada con tirosinasa-1/TRP1 y proteína relacionada con tirosinasa-2/TRP2 (asociada, por ejemplo, a melanoma), (e) antígenos asociados a próstata, tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados, por ejemplo, a cáncer de próstata, (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados a mieloma y linfomas de células B, por ejemplo).
En ciertas realizaciones, los inmunógenos tumorales incluyen, pero sin limitación, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRI, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos de virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos de virus del papiloma humano (HPV), incluyendo E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de células T humanas, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29/BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-O-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y similares.
C. Formulaciones para la molécula cargada negativamente
La molécula cargada negativamente (tal como ARN) se proporciona generalmente en forma de una solución acuosa, o una forma que pueda disolverse fácilmente en una solución acuosa (por ejemplo, liofilizada). La solución acuosa puede ser agua, o una solución acuosa que comprenda una sal (por ejemplo, NaCl), un tampón (por ejemplo, un tampón de citrato), un agente tonificante no iónico (por ejemplo, un sacárido), un polímero, un tensioactivo o una combinación de los mismos. Si la formulación está destinada para administración in vivo, es preferible que la solución acuosa sea un tampón fisiológicamente aceptable que mantenga un pH que sea compatible con las condiciones fisiológicas normales. Asimismo, en ciertos casos, puede ser deseable mantener el pH a un nivel particular para volver a garantizar la estabilidad de ciertos componentes de la formulación.
Por ejemplo, puede ser deseable preparar una solución acuosa que sea isotónica y/o isosmótica. Las soluciones hipertónicas e hipotónicas algunas veces podrían causar complicaciones y efectos no deseables cuando se inyectan, tales como hinchazón o rápida absorción después de la administración de la composición, debido a concentraciones iónicas diferenciales entre la composición y los fluidos fisiológicos. Para controlar la tonicidad, la emulsión puede comprender una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Por ejemplo, puede utilizarse cloruro de sodio (NaCl) a aproximadamente 0,9% (p/v) (solución salina fisiológica). Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc. En una realización ejemplar, la solución acuosa comprende NaCl 10 mM y otras sales o agentes tonificantes no iónicos. Como se describe en el presente documento, para controlar la tonicidad también puede utilizarse agentes tonificantes no iónicos.
La solución acuosa puede tamponarse. En el presente documento puede utilizarse cualquier tampón fisiológicamente aceptable, tal como tampones de citrato, de fosfato, de acetato, de succinato, de Tris, de bicarbonato, de carbonato o similares. El pH de la solución acuosa será preferentemente de entre 6,0-8,0, muy preferentemente aproximadamente de 6,2 a aproximadamente 6,8. En algunos casos, en el tampón puede incluirse cierta cantidad de sal. En otros casos, la sal en el tampón podría interferir con la formación de complejos de la molécula cargada negativamente con la partícula de emulsión, y por lo tanto se evita.
La solución acuosa puede comprender también componentes adicionales tales como moléculas que cambien la osmolaridad de la solución acuosa o moléculas que estabilicen la molécula cargada negativamente después de la formación de complejos. Por ejemplo, la osmolaridad puede ajustarse utilizando un agente tonificante no iónico, que son generalmente hidratos de carbono, aunque también pueden ser polímeros. (Véase, por ejemplo, Voet y Voet (1990) Biochemistry (John Wiley & Sons, Nueva York). Los ejemplos de agentes tonificantes no iónicos adecuados incluyen azúcares (por ejemplo, un monosacárido, un disacárido o un polisacárido, tales como trehalosa, sacarosa, dextrosa, fructosa), alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, maltitol, glicerol, palatinosa reducida), y combinaciones de los mismos. Si se desea, puede utilizarse un polímero no iónico (por ejemplo, un poli(alquilglicol), tal como polietilenglicol, polipropilenglicol o polibutilenglicol), o tensioactivo no iónico. Estos tipos de agentes, en particular azúcar y alcoholes de azúcar, también son crioprotectores que pueden proteger al ARN, y a otras moléculas cargadas negativamente, cuando se liofilizan. En realizaciones ejemplares, el tampón comprende trehalosa, sacarosa, sorbitol o dextrosa a una concentración de aproximadamente 560 nM a 600 mM. En otras realizaciones ejemplares, el tampón comprende trehalosa, sacarosa, sorbitol o dextrosa a una concentración de aproximadamente 500 nM a 600 mM.
En algún caso, puede ser preferible preparar una solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente como una solución hipertónica, y preparar la emulsión catiónica utilizando agua no adulterada o un tampón hipotónico. Cuando la emulsión y la molécula cargada negativamente se combinan, la mezcla se vuelve isotónica. Por ejemplo, una solución acuosa que comprenda ARN puede ser una solución hipertónica 2X, y la emulsión catiónica puede prepararse utilizando tampón de citrato 10 mM. Cuando la solución de ARN y la emulsión se mezclan a una relación 1:1 (v/v), la composición se vuelve isotónica. Basándose en cantidades relativas deseadas de la emulsión con respecto a la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente (por ejemplo, mezcla 1:1 (v/v), mezcla 2:1 (v/v), mezcla 1:2 (v/v), etc.), se puede determinar fácilmente la tonicidad de la solución acuosa que se requiera para poder obtener una mezcla isotónica.
De manera similar, para la administración in vivo, pueden ser deseables composiciones que tengan una osmolaridad fisiológica. La osmolaridad fisiológica es de aproximadamente 255 mOsm/kg de agua a aproximadamente de 315 mOsm/kg de agua. Algunas veces, puede ser preferible preparar una solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente como una solución hiperosmolar, y preparar la emulsión catiónica utilizando agua no adulterada o un tampón hipoosmolar. Cuando la emulsión y la molécula cargada negativamente se combinan, se obtiene una osmolaridad fisiológica. Basándose en cantidades relativas de la emulsión con respecto a la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente (por ejemplo, mezcla 1:1 (v/v), mezcla 2:1 (v/v), mezcla 1:2 (v/v), etc.), se puede determinar fácilmente la osmolaridad de la solución acuosa que se requiera para poder obtener una mezcla isoosmolar.
En ciertas realizaciones, la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente puede comprender además un polímero o un tensioactivo, o una combinación de los mismos. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua contiene un poloxámero. En particular, los inventores han observado que la adición de Pluronic® F127 a la solución acuosa de ARN, antes de la formación del complejo con las partículas de la emulsión catiónica, llevó a una mayor estabilidad y a una resistencia a RNasa aumentada de la molécula de ARN. También se descubrió que la adición de Pluronic F127 a la solución acuosa de ARN, reducía el tamaño de partícula del complejo ARN/CNE. Los polímeros de poloxámero pueden facilitar también la destrucción de complejos/liberación adecuada de la molécula de ARN, impedir la agregación de las partículas de la emulsión y tienen un efecto inmunomodulador. Otros polímeros que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, Pluronic® F68 o PEG300.
Como alternativa o además, la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente puede comprender un porcentaje de polímero de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 20 % (p/v). Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender un porcentaje de polímero (por ejemplo, un poloxámero tal como Pluronic® F127, Pluronic® F68 o PEG300) de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 10% (p/v), tal como de 0,05%, 0,5 %, 1 % o 5 %.
El sistema tampón puede comprender cualquier combinación de dos o más moléculas descritas anteriormente (sal, tampón, sacárido, polímero, etc.). En una realización preferida, el tampón comprende sacarosa 560 mM, NaCl 20 mM y citrato 2 m, los cuales pueden mezclarse con una emulsión catiónica de aceite en agua descrita en el presente documento para producir una fase acuosa final que comprenda sacarosa 280 mM, NaCl 10 mM y citrato 1 mM.
5. Procedimientos de preparación
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar las emulsiones de aceite en agua como las descritas en el presente documento, que comprende: (1) combinar el aceite y el lípido catiónico para formar la fase oleaginosa de la emulsión; (2) proporcionar una solución acuosa para formar la fase acuosa de la emulsión; y (3) dispersar la fase oleaginosa en la fase acuosa, por ejemplo, por homogeneización. La homogeneización puede realizarse de cualquier forma adecuada, por ejemplo, utilizando un homogeneizador comercial (por ejemplo, un homogeneizador IKA T25, disponible en VWR International (West Chester, PA).
En ciertas realizaciones, las emulsiones de aceite en agua se preparan (1) disolviendo directamente el lípido catiónico en el aceite para formar una fase oleaginosa; (2) proporcionando la fase acuosa de la emulsión; y (3) dispersando la fase oleaginosa en la fase acuosa por homogeneización. El procedimiento no utiliza un disolvente orgánico (tal como cloroformo (CHCh), diclorometano (DCM), etanol, acetona, tetrahidrofurano (THF), 2,2,2-trifluoroetanol, acetonitrilo, acetato de etilo, hexano, dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetilo (DMSO), etc.), para solubilizar el lípido catiónico primero antes de añadir el lípido al aceite.
Puede ser deseable calentar el aceite a una temperatura de entre aproximadamente 37 °C a aproximadamente 65 °C para facilitar la disolución del lípido. La cantidad deseada del lípido catiónico (por ejemplo, DOTAP) puede medirse y añadirse directamente al aceite hasta alcanzar una concentración final deseada.
Si la emulsión comprende uno o más tensioactivos, los tensioactivos pueden incluirse en la fase oleaginosa o en la fase acuosa de acuerdo con la práctica convencional en la técnica. Por ejemplo, puede disolverse SPAN85 en la fase oleaginosa (por ejemplo, escualeno), y puede disolverse Tween 80 en la fase acuosa (por ejemplo, en un tampón de citrato).
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprende una molécula cargada negativamente (tal como ARN) formado complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, que comprende: (i) proporcionar una emulsión catiónica de aceite en agua como la descrita en el presente documento; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente (tal como ARN); y (iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (iii), de tal manera que la molécula cargada negativamente forme complejo con la partícula de la emulsión.
Por ejemplo, una emulsión catiónica de aceite en agua puede combinarse con una solución de ARN acuosa en cualquiera de las cantidades relativas deseadas, por ejemplo, de aproximadamente 1:1 (v/v), aproximadamente 1,5:1 (v/v), aproximadamente 2:1 (v/v), aproximadamente 2,5:1 (v/v), aproximadamente 3:1 (v/v), aproximadamente 3,5:1 (v/v), aproximadamente 4:1 (v/v), aproximadamente 5:1 (v/v), aproximadamente 10:1 (v/v); aproximadamente 1:1,5 (v/v), aproximadamente 1:2 (v/v), aproximadamente 1:2,5 (v/v), aproximadamente 1:3 (v/v), aproximadamente 1:3,5 (v/v), aproximadamente 1:4 (v/v), aproximadamente 1:1,5 (v/v), o aproximadamente 1:1,10 (v/v), etc.
Se pueden incluir otras etapas opcionales para promover la formación de partículas, para mejorar la formación de complejo entre las moléculas cargadas negativamente y las partículas catiónicas, para aumentar la estabilidad de la molécula cargada negativamente (por ejemplo, para prevenir la degradación de una molécula de ARN), para facilitar la destrucción de complejos/liberación adecuada de las moléculas cargadas negativamente (tal como una molécula de ARN), o para prevenir la agregación de las partículas de emulsión. Por ejemplo, puede añadirse un polímero (por ejemplo, un polímero (por ejemplo, Pluronic® F127) o un tensioactivo a la solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente (tal como ARN).
El tamaño de las partículas de la emulsión puede modificarse cambiando la relación de tensioactivo con respecto a aceite (el aumento de la relación reduce el tamaño de partícula), la presión operativa (el aumento de la presión operativa reduce el tamaño de partícula), la temperatura (el aumento de la temperatura reduce el tamaño de partícula), y otros parámetros del proceso. El tamaño de partícula real también variará con el tensioactivo, el aceite y el lípido catiónico particular utilizado, y con las condiciones operativas particulares seleccionadas. El tamaño de la partícula de emulsión puede verificarse utilizando instrumentos de dimensionamiento, tales como el analizador de partículas en submicras comercial (modelo N4MD) fabricado por Coulter Corporation, y los parámetros pueden modificarse utilizando las directrices establecidas anteriormente hasta que el diámetro promedio de las partículas sea menor que aproximadamente 200 nm, menor que aproximadamente 150 nm o menor que aproximadamente 100 nm. Preferentemente, las partículas tienen un diámetro promedio de aproximadamente 180 nm o menor, de aproximadamente 150 nm o menor, de aproximadamente 140 nm o menor o de aproximadamente 130 nm o menor, de aproximadamente 120 nm o menor, o de aproximadamente 100 nm o menor, de aproximadamente 50 nm a 200 nm, de aproximadamente 80 nm a 200 nm, de aproximadamente 50 nm a 180 nm, de aproximadamente 60 nm a 180 nm, de aproximadamente 70 a 180 nm, o de aproximadamente 80 nm a 180 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 170 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 160 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 140 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente80 nm a aproximadamente 110 nm, o de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 100 nm. Las emulsiones en las que el tamaño de partícula medio sea de aproximadamente 200 nm o menor permiten la filtración estéril.
Los procesos opcionales para preparar la emulsión catiónica de aceite en agua (emulsión previa a la formación del complejo), o el complejo molécula cargada negativamente-emulsión, incluyen, por ejemplo, esterilización, selección de tamaño de partícula (por ejemplo, eliminación de partículas grandes), relleno, envasado y marcado, etc. Por ejemplo, si la emulsión previa a la formación del complejo, o el complejo molécula cargada negativamente-emulsión se formula para administración in vivo, se puede esterilizar. Por ejemplo, la formulación puede esterilizarse al filtrarla a través de un filtro de calidad de esterilización (por ejemplo, a través de un filtro de 0,22 micrómetros). Otras técnicas de esterilización incluyen un proceso térmico, o un proceso de esterilización con radiación, o el uso de luz pulsada para producir una composición estéril.
La emulsión catiónica de aceite en agua descrita en el presente documento puede utilizarse para fabricar vacunas. Pueden prepararse emulsiones de aceite en agua catiónicas estériles y/o de calidad clínica utilizando procedimientos similares a los descritos para MF59. Véase, por ejemplo, Ott y col., Methods in Molecular Medicine, 2000, volumen 42, 211-228, en VACCiNe ADJUVANTS (O'Hagan ed.), Humana Press. Por ejemplo, de manera similar al proceso de fabricación de MF59, la fase oleaginosa y la fase acuosa de la emulsión pueden combinarse y procesarse en un homogeneizador estator giratorio, o un homogeneizador en línea, para producir una emulsión gruesa. La emulsión gruesa puede después suministrarse a un microfluidizador, donde puede procesarse adicionalmente para obtener una emulsión submicrométrica estable. La emulsión gruesa puede pasarse a través de la cámara de interacción del microfluidizador varias veces hasta obtener el tamaño de partícula deseado. La emulsión global puede filtrarse después (por ejemplo, a través de un filtro de 0,22 pm con nitrógeno) para retirar partículas grandes, produciendo un volumen de emulsión que pueda llenarse en recipientes adecuados (por ejemplo, frascos de vidrio). Para antígenos de vacuna que hayan demostrado estabilidad prolongada en presencia de la emulsión de aceite en agua para auto-conservación, el antígeno y la emulsión pueden combinarse y filtrarse de modo estéril (por ejemplo, a través de una membrana de filtración de 0,22 pm). La vacuna combinada en un solo frasco puede llenarse en recipientes de una sola dosis. Para antígenos de vacuna en los que aún no se ha demostrado una estabilidad prolongada, la emulsión puede proporcionarse como un vial distinto. En dichos casos, el volumen de la emulsión puede filtrarse y esterilizarse (por ejemplo, a través de una membrana de filtración de 0,22 pm), llenarse y envasarse en viales finales de una sola dosis.
El control de calidad puede llevarse a cabo opcionalmente en una muestra pequeña del volumen de emulsión o vacuna mezclada, y el volumen o vacuna mezclada se envasará en dosis solo si la muestra pasa la prueba de control de calidad.
6. Kits, composiciones farmacéuticas y administración
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula cargada negativamente (tal como ARN) formando complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, como la descrita en el presente documento, y puede comprender además uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica es una composición inmunogénica que puede utilizarse como una vacuna.
Como alternativa, las composiciones descritas en el presente documento pueden utilizarse para suministrar una molécula cargada negativamente a células. Por ejemplo, pueden suministrarse moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) a células para una variedad de fines, tales como para inducir la producción de un producto génico deseado (por ejemplo, proteína), para regular la expresión de un gen, para terapia génica y similares. Las composiciones descritas en el presente documento también pueden utilizarse para suministrar una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) a células con efectos terapéuticos, tal como para tratar una enfermedad tal como cánceres o trastornos proliferativos, enfermedades metabólicas, enfermedades cardiovasculares, infecciones, alergias, para inducir una respuesta inmunitaria y similares. Por ejemplo, para inhibir la expresión de un gen diana pueden suministrarse moléculas de ácido nucleico a las células. Estas moléculas de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, moléculas de ARN bicatenario, tales como moléculas de ARN de interferencia pequeños y similares. Las moléculas de ARN bicatenario, tales como moléculas de ARN de interferencia pequeñas, pueden desencadenar la interferencia de ARN, lo cual silencia específicamente al gen diana correspondiente (supresión génica). Los oligonucleótidos antisentido son cadenas individuales de ADN o ARN que son complementarias a una secuencia seleccionada. Generalmente, el ARN antisentido puede impedir la traducción de proteínas de ciertas cadenas de ARN mensajero al unirse a ellas. ADN antisentido puede utilizarse para dirigirse a un ARN complementario y específico (codificante o no codificante). Por lo tanto, las emulsiones catiónicas descritas en el presente documento son útiles para suministrar oligonucleótidos antisentido o moléculas de ARN bicatenario para el tratamiento, por ejemplo, de cáncer, inhibiendo la producción de una diana oncológica.
La divulgación también proporciona kits, en los que la molécula cargada negativamente (tal como ARN) y la emulsión catiónica de aceite en agua están en recipientes distintos. Por ejemplo, el kit puede contener un primer recipiente que comprenda una composición que comprenda la molécula cargada negativamente (tal como ARN), y un segundo recipiente que comprenda la emulsión catiónica de aceite en agua. Los dos componentes pueden mezclarse antes de su administración, por ejemplo, en aproximadamente 72 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 5 minutos antes de su administración. Los dos componentes también pueden mezclarse aproximadamente 1 minuto o inmediatamente antes de su administración.
La molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) puede estar en forma líquida o puede estar en forma sólida (por ejemplo, liofilizada). Si está en forma sólida, el kit puede comprender un tercer recipiente que comprenda una solución acuosa adecuada para rehidratar la molécula cargada negativamente. Soluciones acuosas adecuadas incluyen tampones farmacéuticamente aceptables tales como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa o cualquiera de las soluciones acuosas descritas anteriormente. En ciertas realizaciones, para la rehidratación puede utilizarse agua estéril como solución acuosa, en particular, en casos en los que se liofilicen componentes adicionales, tales como agentes tonificantes y/o agentes ajustadores de osmolaridad, junto con la molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN). Como alternativa, la molécula liofilizada cargada negativamente (por ejemplo, ARN) puede mezclarse directamente con la emulsión catiónica. Si la composición (por ejemplo, una vacuna) comprende una molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) y un componente adicional, tal como un inmunógeno de proteína, ambos componentes pueden congelarse y liofilizarse (ya sea por separado, o como una mezcla), y reconstituirse y mezclarse con la emulsión catiónica antes de su administración.
El kit puede comprender además otros materiales útiles para el usuario final, incluyendo otras soluciones de formulación farmacéuticamente aceptables tales tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas u otro dispositivo de suministro. Por ejemplo, el kit puede incluir una jeringa de doble cámara que contenga agua o la emulsión en una cámara, y la molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) se proporciona en forma sólida (por ejemplo, liofilizada) en la otra cámara.
El kit puede incluir además otro recipiente que comprenda un adyuvante (tal como un adyuvante que contenga aluminio o MF59). En general, no se prefieren adyuvantes que contienen aluminio porque pueden interferir con la formación del complejo de la molécula cargada negativamente con la emulsión catiónica.
Los recipientes adecuados para las composiciones incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales, incluyendo vidrio o plástico. Un recipiente puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser un bolsa para solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). También puede utilizarse una jeringa de doble cámara, en la que la molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) está liofilizada, y reconstituida con agua en la jeringa, o reconstituida directamente con una emulsión catiónica descrita en el presente documento.
El kit también puede comprender un prospecto con instrucciones por escrito de los procedimientos de inducción de inmunidad o para el tratamiento de infecciones. El prospecto puede ser un prospecto de borrador no aprobado o puede ser prospecto aprobado por la administración de alimentos y fármacos (FDA) u otra entidad reguladora. La divulgación también proporciona un dispositivo de suministro previamente cargado con las composiciones descritas anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas provistas en el presente documento pueden administrarse individualmente o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El procedimiento de administración incluye, pero sin limitación, administración oral, administración rectal, administración parenteral, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intravítrea, administración intramuscular, inhalación, administración intranasal, administración tópica, administración oftálmica o administración ótica.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones descritas en el presente documento variará dependiendo, entre otras cosas, de la enfermedad indicada, de la gravedad de la enfermedad, de la edad y salud relativa del sujeto, de la fuerza del compuesto administrado, del modo de administración y del tratamiento deseado. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales pueden incluir, pero sin limitación, antibióticos o agentes antibacterianos, agentes antieméticos, agentes antifúngicos, agentes antiinflamatorios, agentes antivíricos, agentes inmunomoduladores, citocinas, antidepresivos, hormonas, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, agentes antimitóticos, inhibidores de topoisomerasa, agentes citostáticos, agentes antiinvasión, agentes antiangiogénicos, inhibidores de la función de factor de crecimiento, inhibidores de replicación de virus, inhibidores de enzimas de virus, agentes contra el cáncer, ainterferones, p-interferones, ribavirina, hormonas y otros moduladores de receptores de tipo Toll, inmunoglobulinas (Ig), y anticuerpos que modulen la función de Ig (tales como anti-IgE (omalizumab)).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento, se utilizan en el tratamiento de enfermedades infecciosas incluyendo, pero sin limitación, enfermedad causada por los patógenos desvelados en el presente documento, incluyendo enfermedades víricas, tales como verrugas genitales, verrugas comunes, verrugas plantares, rabia, virus respiratorio sincicial (RSV), virus de la hepatitis B, hepatitis C, virus del dengue, fiebre amarilla, virus del herpes simple (solo como ejemplo, HSV-I, hSV-II, CMV o VZV), molusco contagioso, virus de la variolovacuna, viruela, lentivirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma humano (HPV), virus de la hepatitis (virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis A), citomegalovirus (CMV), virus de la varicela zoster (VZV), rinovirus, enterovirus (por ejemplo, EV71), adenovirus, coronavirus (por ejemplo, SARS), virus gripal, paragripal, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubeola, papovavirus, hepadnavirus, flavivirus, retrovirus, arenavirus (solo como ejemplo, LCM, virus Junin, virus Machupo, virus Guanarito y de la fiebre de Lassa) y filovirus (solo como ejemplo, virus del ébola o virus de marburg).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se utilizan en el tratamiento de infecciones bacterianas, fúngicas y protozoarias incluyendo, pero sin limitación, paludismo, tuberculosis y Mycobacterium avium, lepra; Pneumocystis camii, criptosporidiosis, histoplasmosis, toxoplasmosis, infección por tripanosomas, leishmaniasis, infecciones causadas por bacterias de los géneros Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus y Chlamydia, e infecciones fúngicas tales como candidiasis, aspergilosis, histoplasmosis y meningitis criptocócica.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se utilizan en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos respiratorios, trastornos dermatológicos, enfermedades y/o trastornos oculares, enfermedades y/o trastornos genitourinarios incluyendo rechazo de aloinjertos, enfermedades autoinmunitarias y alérgicas, cáncer o piel dañada o envejecimiento, tal como cicatrización y arrugas.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para generar o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo requiera, tal como un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición como la descrita en el presente documento. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora e implica preferentemente anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria primaria y/o para reforzar una respuesta inmunitaria.
En ciertas realizaciones, las composiciones desveladas en el presente documento pueden utilizarse como un medicamento, por ejemplo, para utilizarse provocando o potenciando una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo requiera, tal como un mamífero.
En ciertas realizaciones, las composiciones desveladas en el presente documento, pueden utilizarse en la fabricación de un medicamento para generar o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo requiera, tal como un mamífero.
El mamífero es preferentemente un ser humano, pero puede ser, por ejemplo, una vaca, un cerdo, un pollo, un gato o un perro, ya que los patógenos incluidos en el presente documento pueden ser problemáticos en toda una amplia variedad de especies. Cuando la vacuna sea para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o bebé), un adolescente o un adulto; cuando la vacuna sea para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada para niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica controlar la infección por patógenos después de la administración de las composiciones o vacunas descritas en el presente documento. Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunitarias, por vía sistémica (tal como controlando el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o por vía mucosa (tal como controlando el nivel de producción de IgA), contra el antígeno. Típicamente, las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno en suero, se determinan después de la inmunización aunque antes de la exposición, mientras que las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno en la mucosa se determinan después de la inmunización y de la exposición. Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones o vacunas descritas en el presente documento en la que la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, el ARN) codifica un antígeno de proteína, es la de expresar el antígeno de proteína de manera recombinante para analizar sueros o secreciones mucosas de pacientes por inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha generado una respuesta inmunitaria contra la proteína en cuestión. Este procedimiento también puede utilizarse para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de los antígenos de proteína. La eficacia de las composiciones también se puede determinar in vivo exponiendo modelos animales adecuados del patógeno de infección de interés.
La dosificación puede realizarse a través de un solo programa de dosis o de un programa de dosis múltiples. En un programa de inmunización primario y/o en un programa de inmunización de refuerzo pueden utilizarse dosis múltiples. En un programa de dosis múltiples, las diferentes dosis pueden administrarse a través de la misma o diferentes vías, por ejemplo, una primera por vía parenteral y un refuerzo por vía mucosa, una primera por vía mucosa y un refuerzo por vía parenteral, etc. Normalmente se administrarán dosis múltiples con una diferencia de al menos 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente de 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente de 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente de 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente de 16 semanas, etc.).
En ciertas realizaciones, la cantidad total de lípido catiónico, tal como DOTAP, que se administra al sujeto en una sola administración no es mayor que aproximadamente 30 mg, o que aproximadamente 24 mg.
En ciertas realizaciones, la cantidad total de lípido catiónico, tal como DOTAP, que se administra al sujeto en una sola administración no es mayor que 4 mg.
Las composiciones desveladas en el presente documento, que incluyen uno o más antígenos o que se utilizan junto con uno o más antígenos, pueden utilizarse para tratar tanto a niños como a adultos. Por tanto, un sujeto humano puede tener menos de 1 año, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años o al menos 55 años. Los sujetos preferidos para recibir las composiciones son personas mayores (por ejemplo, > 50 años, > 60 años y preferentemente > 65 años), jóvenes (por ejemplo, < 5 años), pacientes hospitalizados, sanitarios, personal de las fuerzas armadas y militar, mujeres embarazadas, pacientes con enfermedad crónica o inmunodeficientes. Sin embargo, las composiciones no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden utilizarse más generalmente en una población.
Las composiciones desveladas en el presente documento, que incluyen uno o más antígenos o que se utilizan junto con uno o más antígenos, pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta o visita médica a un profesional sanitario o centro de vacunación) que otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubeola, una vacuna contra SPR (Sarampión, paperas, rubéola), una vacuna contra la varicela, una vacuna contra SPRV (sarampión, paperas, rubéola y varicela), una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tosferina, una vacuna contra DTP (difteria , tétanos y tosferina) , una vacuna contra H. influenzae de tipo b conjugada, una vacuna contra poliovirus inactivada, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada meningocócica (tal como una vacuna A C W135 Y tetravalente), una vacuna contra el virus respiratorio sincicial, etc.
En ciertas realizaciones, las composiciones provistas en el presente documento incluyen o incluyen opcionalmente uno o más agentes inmunorreguladores tales como adyuvantes. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero sin limitación, un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, descritos más adelante. En ciertas realizaciones, los adyuvantes utilizados en las composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento incluyen, pero sin limitación:
1. Composiciones que contienen minerales;
2. Emulsiones de aceite;
3. Formulaciones de saponina;
4. Virosomas y partículas de tipo virus;
5. Derivados bacterianos o microbianos;
6. Bioadhesivos y mucoadhesivos;
7. Liposomas;
8. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno;
9. Polifosfaceno (PCPP);
10. Péptidos de muramilo;
11. Compuestos de imidazoquinolona;
12. Compuestos de tiosemicarbazona;
13. Compuestos de triptantrina;
14. Inmunomoduladores humanos
15. Lipopéptidos;
16. Benzonaftiridinas;
17. Micropartículas;
18. Polinucleótido imunoestimulador (tal como ARN o ADN; por ejemplo, oligonucleótidos que contengan CpG).
Ejemplos
Habiéndose descrito ahora la divulgación, en líneas generales, esta se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen simplemente con fines ilustrativos de ciertos aspectos y realizaciones de la presente divulgación y no pretenden limitarla.
Ejemplo 1: Desarrollo de emulsiones catiónicas de aceite en agua
En este ejemplo, para el suministro de ARN autorreplicante, se desarrollaron nanoemulsiones catiónicas (denominadas en el presente documento “CNE”) que contienen altas concentraciones de lípido catiónico (DOTAP). Las formulaciones CNE se resumen en la siguiente tabla 1, y se modificaron basándose en la CNE01. Como muestras de referencia para estudios comparativos se utilizaron las siguientes nanoemulsiones catiónicas: CNE01, CMF40, CNE16, CNE02 y CNE17.
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continuación
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Se prepararon CNE de manera similar a MF59 cargado como se describió previamente (Ott y col., Journal of Controlled Release, volumen 79, páginas 1-5, 2002), con una modificación principal. Se disolvió DOTAP en el escualeno directamente, y no se usó disolvente orgánico. Se descubrió que la inclusión de un disolvente en emulsiones que contenían más de 1,6 mg/ml de DOTAP, producía una materia prima espumosa que no podía microfluidizarse para producir una emulsión. El calentamiento de escualeno a 37 °C permitió que DOTAP se disolviera directamente en escualeno, y después, la fase oleaginosa pudo dispersarse satisfactoriamente en la fase acuosa (por ejemplo, por homogeneización) para producir una emulsión. DOTAP es soluble en escualeno y pueden obtenerse concentraciones más altas de DOTAP en escualeno que las enumeradas en la tabla 1. Sin embargo, se ha comunicado que altas dosis de DOTAP pueden tener efectos tóxicos. Véase, por ejemplo, Lappalainen y col., Pharm. Res., vol. 11(8):1127-31 (1994).
Resumiendo, se calentó escualeno a 37 °C y, en presencia de SPAN85, DOTAP se disolvió directamente en escualeno. La fase oleaginosa resultante se combinó después con la fase acuosa (Tween 80 en tampón citrato) e inmediatamente se homogeneizó durante 2 minutos utilizando un homogeneizador IKA T25 a 24K RPM para producir una materia prima homogénea (emulsiones primarias). Las emulsiones primarias se pasaron de 3 a 5 veces a través de un microfluidizador M-110S o un microfluidizador M-110P (Microfluidics, Newton, MA) con una bobina de enfriamiento por baño de hielo a una presión de homogeneización de aproximadamente 1,054-1,406 kg/cm2 (15K-20K PSI). Las muestras de lote de 20 ml se retiraron de la unidad y se conservaron a 4 °C.
Debe observarse que las concentraciones de los componentes de las CNE, como las descritas en la tabla 1, son concentraciones calculadas según las cantidades iniciales de estos componentes que se utilizaron para preparar las emulsiones. Se entiende que durante el proceso de producción de emulsiones, o durante el proceso de esterilización en filtro, pueden perderse pequeñas cantidades de escualeno, DOTAP u otros componentes y que las concentraciones reales de estos componentes en el producto final (por ejemplo, una emulsión envasada y esterilizada que esté lista para su administración) debe ser ligeramente más baja, normalmente en hasta aproximadamente de 20 %, algunas veces en hasta aproximadamente de 25 %, o hasta aproximadamente 35 %. Sin embargo, la práctica convencional en la técnica es describir la concentración de un componente particular basándose en la cantidad inicial que se utilice para preparar la emulsión, en lugar de la concentración real en el producto final.
La siguiente tabla 2 muestra la diferencia entre las concentraciones “teóricas” de escualeno y DOTAP (calculadas según las cantidades iniciales de escualeno y DOTAP que se utilizaron para preparar las emulsiones), y las concentraciones reales de escualeno y DOTAP medidas en el producto final.
Tabla 2
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continuación
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Ejemplo 2: Preparación de complejos ARN-partícula
1. Síntesis de ARN
Como molde para la síntesis de ARN in vitro se utilizó ADN plasmídico que codificaba un replicón de alfavirus (ARN autorreplicante). Cada replicón contiene los elementos genéticos necesarios para la replicación de ARN pero carece de secuencias que codifican productos génicos que son necesarios para el ensamble de partículas. Los genes estructurales del genoma de alfavirus se reemplazaron por secuencias que codifican una proteína heteróloga (cuya expresión es conducida por el promotor subgenómico de alfavirus). Después del suministro de los replicones a células eucarióticas, el ARN de cadena positiva se traduce para producir cuatro proteínas no estructurales, que conjuntamente replican el ARN genómico y transcriben abundantes moléculas de a Rn subgenómicas que codifican la proteína heteróloga. Debido a la falta de expresión de las proteínas estructurales de alfavirus, los replicones son incapaces de generar partículas infecciosas. Un promotor de bacteriófago T7 se ubica hacia el extremo 5' del ADNc de alfavirus para facilitar la síntesis del ARN de replicón in vitro, y la ribozima del virus delta de la hepatitis (HDV) ubicada inmediatamente hacia el extremo 3' de la cola poli(A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad de auto escisión.
Después de la linearización del ADN plasmídico hacia el extremo 3' de la ribozima del HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, se sintetizaron in vitro transcritos de tipo run-off, utilizando ARN polimerasa dependiente de ARN derivada de bacteriófago T7 o SP6. Las transcripciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37 °C en presencia de una concentración final de 7,5 mM (ARN polimerasa de T7) o 5 mM (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion, Austin, TX). Después de la transcripción, el ADN molde se digirió con TURBO DNasa (Ambion, Austin, TX). El ARN de replicón se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua sin nucleasa. El ARN desprotegido (sin caperuza, uncapped) se protegió (con caperuza, capped) postranscripcionalmente con enzima protectora de variolovacuna (VCE, Vaccinia Capping Enzyme) utilizando el sistema de protección con caperuza (capping) ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) como se detalla en el manual del usuario. El ARN desprotegido postranscripcionalmente se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua sin nucleasa. Como alternativa, los replicones pueden protegerse complementando las reacciones de transcripción con m7G(5')ppp(5')G, 6 mM (para la ARN polimerasa de T7) o 4 mM (para la ARN polimerasa de SP6), un análogo estructural de tipo caperuza irreversible (New England Biolabs, Beverly, MA) y reduciendo la concentración de trifosfato de guanosina a 1,5 mM (para la ARN polimerasa de T7) o 1 mM (para la ARN polimerasa de SP6). Los transcritos pueden purificarse después por digestión con TURBO DNasa (Ambion, Austin, TX) seguido de precipitación con LiCL y de un lavado en etanol al 75 %.
La concentración de las muestras de ARN se determinó midiendo la densidad óptica a 260 nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmó por electroforesis en gel con agarosa desnaturalizante para determinar la presencia de la construcción de longitud completa.
2. Formación de complejos de ARN
El término relación N/P se refiere a la cantidad de nitrógeno (Nitrogen) en el lípido catiónico en relación con la cantidad de fosfatos (Phosphates) en el ARN. El nitrógeno es el elemento portador de carga dentro de los lípidos catiónicos analizados. El fosfato puede encontrarse en el esqueleto del ARN. Una relación de carga N/P de 10/1 indica que hay 10 nitrógenos cargados positivamente en el lípido catiónico por cada fosfato cargado negativamente en el ARN.
El número de nitrógenos en solución se calculó a partir de la concentración de lípido catiónico, DOTAP por ejemplo tiene un nitrógeno que puede protonarse por molécula. La concentración de ARN se utilizó para calcular la cantidad de fosfato en solución utilizando una estimación de 3 nmoles de fosfato por microgramo de ARN. Al variar la cantidad de ARN:Lípido, la relación N/P puede modificarse. El ARN formo complejo con las CNE en un intervalo de relaciones nitrógeno/fosfato (N/P). El cálculo de la relación N/P se realizó calculando el número de moles de nitrógenos protonables en la emulsión por mililitro. Para calcular el número de fosfatos, se utilizó una constante de 3 nmoles de fosfato por microgramo de ARN. Una vez que se determinaron los valores, se añadió la relación adecuada de la emulsión al ARN. Utilizando estos valores, el ARN se eluyó a la concentración adecuada y se añadió directamente a un mismo volumen de emulsión mientras se agitaba ligeramente en un vórtex. La solución se dejó asentar a temperatura ambiente durante aproximadamente de 2 horas. Una vez formado el complejo, la solución resultante se diluyó a la concentración adecuada y se utilizó al cabo de 1 hora.
3. Ensayo de tamaño de partícula
El tamaño de partícula de la emulsión se midió utilizando un Zetasiser Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, RU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los tamaños de partícula se indican como el promedio Z (PrmZ) con el índice de polidispersidad (ipd). Antes de realizar las mediciones, todas las muestras se diluyeron en agua. Además, el tamaño de partícula de la emulsión se midió utilizando un dimensionador de partículas Horiba LA-930 (Horiba Scientific, E.U.A.). Antes de realizar las mediciones, las muestras se diluyeron en agua. El potencial Z se midió utilizando Zetasizer Nano ZS utilizando muestras diluidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Partículas de replicones de virus (VRP)
Para comparar estrategias de vacunas de ARN con las tradicionales de vectores de ARN, para lograr la expresión in vivo de genes indicadores o antígenos, utilizamos partículas de replicones de virus (VRP, del inglés viral replicon particles) producidas en células BHK mediante los procedimientos descritos por Perri y col., J. Virol. 77:10394-10403 (2003)). En este sistema, los replicones de antígeno (o gen indicador) consistieron en replicones quiméricos de alfavirus (VCR, del inglés alphavirus chimeric replicons) derivados del genoma del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) modificado por ingeniería genética para contener las secuencias 3' terminales (3' UTR) del virus Sindbis y una señal de empaquetado (PS, packaging signal) del virus Sindibs (véase la figura 2 de Perri S., y col., J Virol 77:10394-10403 (2003)). Estos replicones se empaquetaron en VRP (partículas de replicones de virus) electroporándolos conjuntamente en células renales de cría de hámster (BHK, baby hamster kidney) junto con moléculas de ARN auxiliares defectuosas que codificaban la cápside del virus Sindbis y genes de glucoproteína (véase la figura 2 de Perri y col.). Después, las VRP se recogieron y titularon mediante procedimientos estándar y se inocularon en animales en fluido de cultivo u otros tampones isotónicos.
Ejemplo 3: El efecto de la concentración de DOTAP sobre la inmunogenicidad
Este ejemplo muestra que las emulsiones catiónicas de aceite en agua preparadas con altas concentraciones de DOTAP, aumentaron la inmunogenicidad de un replicón de ARN que codifica el antígeno F del RSV (virus respiratorio sincicial) en un modelo de ratón.
1. Materiales y procedimientos
Ensayo de unión a heparina
El ARN formó complejo como se describió anteriormente. El complejo ARN/CNE se incubó con varias concentraciones de sulfato de heparina (Alfa Aesar, Ward Hill MA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, las soluciones resultantes se pusieron en una centrífuga de alta velocidad Airfuge (Beckman Coulter, Brea, CA) durante 15 minutos. Los tubos de centrífuga se perforaron con una jeringa de tuberculina y el sobrenadante se retiró. La solución se ensayó después para determinar la concentración de ARN utilizando el ensayo Ribogreen (Invitrogen, Carlsbad CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron en un lector de placa fluorescente Biotek Synergy 4 (Winooski, VT). Los valores de ARN libre se calcularon utilizando una curva patrón.
2. El efecto de la concentración de DOTAP sobre partículas-ARN
La tabla 3 muestra el efecto de la concentración de DOTAP sobre interacciones entre partículas-ARN (según lo determina el ensayo de unión a heparina, que mide la firmeza de las interacciones entre partículas-ARN) e inmunogenicidad.
Tabla 3
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continuación
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Como se muestra en la tabla 3, las moléculas de ARN se unieron con fuerza a las partículas de la emulsión preparada con atas concentraciones de DOTAP (1,8 mg/ml o más altas).
3. El efecto de la concentración de DOTAP sobre la carga de ARN
La tabla 4 muestra el efecto de la concentración de DOTAP sobre la carga de ARN. El aumento de la concentración de DOTAP se tradujo en que en los complejos de partículas-ARN se formulaba una mayor cantidad de moléculas de ARN.
Tabla 4
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4. El efecto de la concentración de DOTAP sobre la inmunogenicidad
La tabla 5 muestra el efecto de la concentración de DOTAP sobre la inmunogenicidad del antígeno F del RSV en un modelo de ratón in vivo.
En este estudio se utilizó el replicón vA317 que expresa la glucoproteína de fusión de superficie del RSV (RSV-F). Ratones BALB/c, de 8-10 semanas de vida y con un peso de aproximadamente 20 g, 10 animales por grupo, recibieron vacunas intramusculares bilaterales. Todos los animales recibieron la administración mediante inyección en el cuádriceps en las dos patas traseras recibiendo cada uno de ellos un volumen equivalente (50 pl por pata) los días 0 y 21 con ARN autorreplicante desnudo que expresaba RSV-F (vA317, 1 pg), 1 pg de A317 formulado en un liposoma que contenía DlinDMA al 40 %, DSPC al 10 %, Chol al 48 %, PEG DMG 2000 al 2 % (RV01 (15)), o ARN autorreplicante formulado en las CNE indicadas (1 pg de vA317). Para cada administración, las formulaciones se prepararon recientes. Se extrajo suero para efectuar el análisis de anticuerpos los días 14 (2wp1) y 35 (2wp2).
Tabla 5
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Como se muestra en la tabla 5, el aumento de la concentración de DOTAP se tradujo en que en las partículas de la emulsión se cargada una mayor cantidad de ARN, lo que a su vez aumentó la respuesta inmunitaria del hospedador. Se observó un aumento de 3 veces en el título del anticuerpo (a 2wp2) para CMF31 en comparación con CNE17. En este modelo, se observó una estabilidad en cuanto a la inmunogenicidad a 2,6 mg/ml de DOTAP (CMF31).
Cuando las cantidades de ARN y DOTAP administradas a cada ratón se mantuvieron constantes (lo que significa que para emulsiones con concentraciones más altas de DOTAP, se utilizaron volúmenes más pequeños de emulsión para preparar el complejo ARN/emulsión; después, antes de la inmunización, las formulaciones de ARN/emulsión se diluyeron de tal manera que los volúmenes de las formulaciones de ARN/emulsión inyectados a los ratones fueran iguales), los títulos de IgG totales específicos de F fueron comparables con diferentes formulaciones de CNE (tabla 6). Se usó el replicón de vA317 para todas las formulaciones de CEN. Las moléculas de ARN se prepararon con el kit Ambion. Los datos de GMT reflejan media geométrica del título de ratones individuales en cada grupo (8 ratones/grupo). El resultado demuestra que para emulsiones con concentraciones más altas de DOTAP se necesitaba una menor cantidad de las formulaciones.
Tabla 6
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Cuando la cantidad de escualeno y relación N/P (DOTAP:ARN) administrada a cada ratón se mantuvieron constantes, los títulos de IgG total específicos de F aumentaban a medida que aumentaba la cantidad de ARN y DOTAP en las formulaciones (tabla 7). Se utilizó el replicón vA317 para todas las formulaciones de CNE. Las moléculas de ARN se prepararon con el kit de Ambion. Los datos de GMT reflejan la media geométrica del título de ratones individuales en cada grupo (8 ratones/grupo). El resultado muestra que el aumento de la concentración de DOTAP se tradujo en que en las partículas de la emulsión se cargada una mayor cantidad de ARN, lo que a su vez aumentó la respuesta inmunitaria del hospedador.
Tabla 7
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Las formulaciones CMF32 y CMF34 se estudiaron más utilizando diferentes relaciones N/P. La tabla 8 muestra los títulos de IgG total específicos de F de las formulaciones. Las relaciones N/P teóricas reflejan las relaciones N/P calculadas de acuerdo con las cantidades iniciales de DOTAP y ARN que se utilizaron para preparar las formulaciones. Las relaciones N/P reales fueron ligeramente más bajas que las relaciones N/P teóricas debido a que durante la preparación de las emulsiones se perdieron pequeñas cantidades de DOTAP. El replicón vA317 se utilizó en todas las formulaciones de CNE y CMF. Los datos de GMT reflejan el título log-10 medio de ratones individuales en cada grupo (8 ratones/grupo). Todas las formulaciones se ajustaron con sacarosa a 300 mOsm/kg. No se observaron problemas de tolerabilidad obvios (por ejemplo, peso corporal, citocinas tempranas en suero) con ninguna de las formulaciones de CMF32 o de CMF34.
Las relaciones N/P reales se determinaron cuantificando el contenido de DOTAP en lotes de CNE o CMF utilizando HPLC con un detector de aerosol cargado (Corona Ultra. Chelmsford, MA). Las muestras de CNE y CMF se diluyeron en isopropanol y se inyectaron en una columna XTera C18 de 4,6 x 150 mm, 3,5 um (Waters, Milford, MA). El área bajo la curva se tomó a partir del pico de DOTAP en el cromatograma y la concentración se interpoló fuera de una curva DOTAP patrón. Utilizando la concentración de DOTAP real, se calculó una relación N/P real.
Tabla 8
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continuación
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Ejemplo 4: El efecto de la concentración de DOTAP sobre la inmunogenicidad
Este ejemplo demuestra que las emulsiones catiónicas de aceite en agua preparadas con altas concentraciones de DOTAP aumentan la inmunogenicidad de un replicón de ARN que codifica el antígeno F del RSV en un modelo de rata algodonera.
1. Materiales y procedimientos
Replicón de ARN. La secuencia del replicón de ARN, vA142 RSV-F-delFP-ribozima completa.
Vacunación de ratas algodoneras. Se adquirieron ratas algodoneras (Sigmodon hispidis) hembra, en Harlan Laboratories. Todos los estudios se aprobaron y llevaron a cabo de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Novartis. Los grupos de animales se inmunizaron por vía intramuscular (i.m., 100 pl) con las vacunas indicadas el día 0. Tres semanas después de cada inmunización se extrajeron muestras de suero. Animales de control inmunizados o no vacunados se expusieron por vía intranasal (i.n.) con 1x105 UFP de RSV, 4 semanas después de la inmunización final.
Vacuna de subunidad del trímero RSV-F. El trímero RSV F es una proteína recombinante que comprende el ectodominio de RSV F con una supresión de la región de péptido de fusión que impide la asociación con otros trímeros. La construcción resultante forma un trímero homogéneo, según se observa por cromatografía de exclusión de tamaño, y tiene un fenotipo esperado consistente con una conformación de F posfusión como se observa por microscopia electrónica. La proteína se expresó en células de insecto o células CHO y se purificó en virtud de una etiqueta de HIS en fusión con el extremo C-terminal de la construcción seguido por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando técnicas convencionales. La muestra de proteína resultante exhibe una pureza mayor del 95 %. Para la evaluación in vivo de la vacuna de subunidad F, 100 pg/ml de proteína de trímero se adsorbieron en 2 mg/ml de alumbre utilizando tampón de histidina 10 mM, pH 6,3 y la isotonicidad se ajustó con cloruro de sodio a 150 mM. La proteína de subunidad F se adsorbió en alumbre durante la noche con agitación suave a 2-8 °C.
ELISA específico de RSV F. Muestras de suero individuales se ensayaron para determinar presencia de IgG específica de RSV F por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Placas de ELISA (MaxiSorp de 96 pocillos, Nunc) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 1 pg/ml de RSV F purificado (delp23-furdel-trunc no escindido) en PBS. Después de lavar (PBS con Tween-20 al 0,1 %), las placas se bloquearon con tampón de bloqueo Superblock en PBS (Thermo Scientific) durante al menos 1,5 horas a 37 °C. Después, las placas se lavaron, se añadieron diluciones en serie de suero en diluyente de ensayo (PBS con Tween-20 al 0,1 % y suero de cabra al 5 %) de ratas algodoneras de control o experimentales, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Después de lavar, las placas se incubaron con anti-IgG de rata algodonera de pollo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Immunology Consultants Laboratory, Inc. diluido 1:5,000 en diluyente de ensayo) durante 1 hora a 37 °C. Finalmente, las placas se lavaron y a cada pocillo se añadieron 100 pl de solución de substrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc). Las reacciones se detuvieron por la adición de 100 pl de H3PO41M, y la absorbancia se leyó a 450 nm utilizando un lector de placa. Para cada muestra de suero, se generó una gráfica de densidad óptica (DO) frente al logaritmo de la dilución de suero recíproca por regresión no lineal (GraphPadPrism). Los títulos se definieron como la dilución en suero recíproca a una Do de aproximadamente 0,5 (normalizada a un patrón, sueros agrupados de ratas algodoneras infectadas con RSV con un título definido de 1:2,500, que se incluyó en cada placa).
Ensayo de microneutralización. Se analizaron muestras de suero para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante un ensayo de neutralización de reducción de placa (PRNT). Se añadieron diluciones en serie con factor dos de suero HI (en PBS con HI-FBS al 5 %) a un mismo volumen de RSV largo previamente titulado para dar aproximadamente 115 UFP/25 pl. Las mezclas de suero/virus se incubaron durante 2 horas a 37 °C y con CO2 al 5 %, para permitir que se produjera la neutralización del virus, y después 25 pl de esta mezcla (que contenía aproximadamente 115 UFP) se inocularon en pocillos duplicados de células HEp-2 en placas de 96 pocillos. Después de 2 horas a 37 °C y con CO2 al 5 %, las células se cubrieron con metilcelulosa 0,75 %/EMEM 5% HI-FBS y se incubaron durante 42 horas. El número de partículas de virus infecciosas se determinó por la detección de la formación de sincicios por inmunotinción seguida de recuento automático. El título de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero que produce al menos una reducción del 60 % en el número de sincicios por pocillo, en relación con los controles (sin suero).
2. El efecto de la concentración de DOTAP sobre la inmunogenicidad
La tabla 9 muestra el efecto de la concentración de DOTAP sobre la inmunogenicidad del antígeno F del RSV en un modelo de rata algodonera in vivo. Las dos primeras vacunaciones utilizaron las formulaciones de ARN/CNE como las mostradas en la tabla 9. Para la tercera vacunación, se utilizaron 3 pg de proteína de la subunidad F del RSV (en alumbre) para todos los animales excepto para el grupo no expuesto (naive).
Tabla 9
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continuación
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Los datos de la tabla 9 muestran que todas las formulaciones de CNE-ARN indujeron respuestas inmunitarias dependientes de dosis en los hospedadores (títulos de IgG totales así como títulos de anticuerpos neutralizantes). La administración de formulaciones de CMF31-ARN y CMF34-ARN produjo títulos de IgG totales específicos de F, y cada uno fue mayor que el de CNE17 a cada una de las dosis de ARN indicadas. Además, todas las formulaciones de CNE-ARN indujeron buenos títulos de anticuerpos neutralizantes a 10 pg de ARN. Los títulos de anticuerpos neutralizantes para los grupos CMF31-ARN, CMF34-ARN y CNE17-ARN fueron similares, excepto por un título sorprendentemente alto para el grupo de ARN/CMF31 a 1 pg.
Ejemplo 5: Evaluación de los efectos de composiciones tampón sobre la inmunogenicidad
En este ejemplo, se prepararon varias emulsiones basadas en CMF34 pero con diferentes componentes tampón. La tabla 10 resume los resultados de estudios de inmunogenicidad en murinos cuando moléculas de ARN formuladas con CMF34 se prepararon utilizando diferentes sistemas tampón.
Tabla 10
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Ejemplo 6: Estabilidad de las emulsiones
La estabilidad de CMF34 se evaluó al medir el diámetro promedio de las partículas de emulsión y la polidispersidad después de producirse la emulsión (T = 0) y después de 1 mes a 4 °C (T = 1 mes) y después de 2 meses a 4 °C (T = I mes). La estabilidad también se evaluó después de 3, 6 y 12 meses a 4 °C. Los resultados presentados en la tabla I I muestran que la emulsión fue estable durante al menos 12 meses.
Tabla 11
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Ejemplo 7: Inmunogenicidad de replicones que codifican proteínas del virus del herpes
A. Proteínas de CMV
Se prepararon replicones de alfavirus bicistrónico y pentacistrónico que expresaban complejos de glucoproteína de citomegalovirus humano (CMVH) y se muestran esquemáticamente en las figuras 1 y 3. Los replicones de alfavirus se basaron en el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). Los replicones se empaquetaron en partículas de replicones de virus (VRP), se encapsularon en nanopartículas lipídicas (LNP), o se formularon con CMF34. La expresión de las proteínas de CMVh codificadas y complejos de proteínas de cada uno de los replicones se confirmó por inmunotransferencia, coinmunoprecipitación, y citometría de flujo. La citometría de flujo se utilizó para verificar la expresión del complejo gH/gL/UL128/UL130/UL131 pentamérico a partir de replicones pentaméricos que codificaban los componentes de proteínas del complejo, utilizando anticuerpos monoclonales humanos específicos para epítopos conformacionales presentes en el complejo pentamérico (Macagno y col. (2010), J. Virol. 84(2):1005-13). La figura 2 muestra que estos anticuerpos se unen a células BHKV transfectadas con ARN de replicón que expresaba el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131 de CMVH (A527). Se obtuvieron resultados similares cuando las células se infectaron con VRP fabricadas a partir de la misma construcción de replicón. Esto demuestra que los replicones diseñados para expresar el complejo pentamérico expresan realmente el antígeno deseado y no el subproducto potencial gH/gL.
Las VRP, el ARN encapsulado en LNP y el ARN formulado con CMF34, se utilizaron para inmunizar ratones Balb/c por inyecciones intramusculares en el cuádriceps posterior. Los ratones se inmunizaron tres veces, con una diferencia de tres semanas y se recogieron muestras de suero antes de cada inmunización así como tres semanas después de la tercera y final inmunización. Los sueros se evaluaron en ensayos de microneutralización y para medir la fuerza de la respuesta del anticuerpo neutralizante que se provocó con las vacunas. Los títulos se expresan como título neutralizante al 50 %.
Se evaluó la inmunogenicidad de diversas configuraciones diferentes de un casete de expresión bicistrónico para un complejo gH/gL de CMVH soluble en las VRP. La figura 3 muestra que las VRP que expresaban el complejo gH/gL de longitud completa anclado a membrana, provocaron fuertes anticuerpos neutralizantes a títulos ligeramente más altos que los del complejo soluble (gHsol/gL) expresado a partir de un casete de expresión bicistrónico similar. Cambiar el orden de los genes que codifican las proteínas gHsol y gL o reemplazar uno de los promotores subgenómicos con un IRES o un sitio FMDV 2A, no mejoró sustancialmente la inmunogenicidad.
Para ver si los replicones bicistrónicos y pentacistrónicos que expresaban los complejos gH/gL y pentaméricos, podrían provocar anticuerpos neutralizantes en diferentes formulaciones, ratas algodoneras se inmunizaron con replicones bicistrónicos o pentacistrónicos mezclados con CMF34. La tabla 12 muestra que los replicones en CMF34 provocaron títulos de anticuerpo neutralizante comparables a los mismos replicones encapsulados en las LNP.
Tabla 12
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continuación
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B. Proteínas del VZV
Ácidos nucleicos que codificaban proteínas del VZV se clonaron en un vector de replicón VEE para producir replicones monocistrónicos que codificaban gB, gH, gL, gE y gI, y para producir replicones bicistrónicos que codificaban gH/gL o gE/gI. En los replicones bicistrónicos, la expresión de cada marco abierto de lectura del VZV se condujo mediante un promotor subgenómico distinto.
Para preparar ARN de replicón, el plásmido que codificaba el replicón se linearizó por digestión por PmeI, y el plásmido linearizado se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, se precipitó en acetato de sodio/etanol y resuspendió en 20 pl de agua sin RNasa.
Utilizando el kit MEGAscript T7 (AMBION # AM1333), se preparó ARN por transcripción in vitro de 1 pg de ADN linearizado. Se estableció una reacción de 20 pl de acuerdo con las instrucciones del fabricante sin análogo de caperuza (cap) y se incubó durante 2 horas a 32 °C. Se añadió TURBO DNasa (1 pl) a la mezcla y se incubó durante 30 minutos a 32 °C. Se añadió agua sin RNasa (30 pl) y solución de acetato de amonio (30 pl). La solución
se mezcló y enfrió durante al menos 30 minutos a -20 °C. Después, la solución se centrifugó a velocidad durante 25 minutos a 4 °C. El sobrenadante se desechó, y el sedimento se aclaró con etanol al 70 % y se centrifugó
de nuevo a velocidad máxima durante 10 minutos a 4 °C. El sedimento se secó al aire y se resuspendió en agua sin
RNasa 50 pl. La concentración de ARN se midió y la calidad se comprobó en un gel desnaturalizante.
El ARN se protegió con caperuza utilizando el sistema de protección ScriptCap m7G Capping System (Epicentre #SCCE0625). La reacción se graduó combinando el ARN y el agua sin RNasa. Después, el ARN se desnaturalizó durante 5-10 minutos a 65 °C. El ARN desnaturalizado se transfirió rápidamente a hielo y se añadieron los siguientes reactivos añadidos en el siguiente orden. Tampón de protección ScriptCap, GTP 10 mM, SAM 2 mM, recién preparado, inhibidor de RNasa ScriptGuard y enzima de protección con caperuza ScriptCap. La mezcla se incubó durante 60 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo añadiendo agua sin RNasa y LiCl 7,5M, se mezcló bien y la mezcla se conservó durante al menos 30 minutos a -20 °C. Después, la mezcla se centrifugó a velocidad máxima durante 25 minutos a 4 °C, el sedimento se aclaró con etanol al 70 %, se centrifugó de nuevo a vel durante 10 minutos a 4 °C y el sedimento se secó al aire. El sedimento se resuspendió en agua sin RN concentración de ARN se midió y la calidad se comprobó en un gel desnaturalizante.
Transfección de ARN
Se sembraron células (células BHK-V) en placas de 6 pocillos llevadas a una confluencia de 90-95 % en el momento
de la transfección. Para cada transfección 3 pg de ARN se diluyeron en 50 ml de medio OPTIMEM en un primer tubo. Se añadió Lipofectamine 2000 a un segundo tubo que contenía 50 ml de medio OPTIMEM. El primer y segundo tubos se combinaron y se conservaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los medios de cultivo
en las placas de 6 pocillos se reemplazaron con medio reciente, y el complejo ARN-Lipofectamine se puso sobre las células, y se mezcló meciendo suavemente la placa. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una incubadora con CO2.
Para la inmunofluorescencia, las células transfectadas se recogieron y se sembraron en una placa de 96 pocillos, y
se llevó a cabo tinción intracelular utilizando Acm (anticuerpos monoclonales) de ratón disponibles en el comercio (intervalo de dilución 1:100 1:400). Los sedimentos celulares se fijaron y permeabilizaron con soluciones Citofix-Citoperm. Se utilizó un reactivo secundario, anticuerpo de cabra anti-F(ab')2 de ratón marcado con alexa488 (dilución
final 1:400).
La expresión de las proteínas gE y gI del VZV se detectó en células transfectadas con construcciones monocistrónicas (gE o gI), y la expresión tanto de gE como de gI se detectó en células transfectadas con una construcción bicistrónica gE/gI en transferencias Western utilizando anticuerpos de ratón, 13B1 para gB y 8C4 para
gI, disponibles en el comercio. La expresión de la proteína gB de VZV se detectó por inmunofluorescencia en células transfectadas con una construcción monocistrónica que codificaba a gB, utilizando el anticuerpo 10G6 disponible en
el comercio. La expresión del complejo de las proteínas gH/gL del VZV (virus de la varicela zóster), se detectó por inmunofluorescencia en células transfectadas con gH monocistrónico y gL monocistrónico, o con una construcción
gH/gL bicistrónica. El complejo gH/gL se detectó utilizando el anticuerpo SG3 disponible en el comercio.
Estudios de inmunogenicidad en murinos
Grupos de 8 ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de vida y con un peso de aproximadamente 20 g se inmunizaron por vía intramuscular con 7,0 o 1,0 |jg de ARN de replicón formulado con CMF32 o LNP (RV01) los días 0, 21 y 42. Se tomaron muestras de sangre de los animales inmunizados 3 semanas después de la 2a inmunización y 3 semanas después de la 3a inmunización. Los grupos se muestran en la tabla 13.
Tabla 13
Figure imgf000049_0001
Se analizaron muestras de suero para determinar la presencia de anticuerpos contra gB, por tinción intracelular de células MRC-5 transfectadas con replicón de VZV. Las células MRC-5 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 10 %. Se utilizó un inóculo de la cepa Oka de VZV (obtenido en la ATCC) para infectar un cultivo de células MRC-5 y se utilizaron células enteras infectadas para el subpase de virus. La relación entre células infectadas y no infectadas fue de 1:10. Treinta horas después de la infección, las células se dispersaron con tripsina para sembrarlas en una placa de 96 pocillos para llevar a cabo una tinción intracelular con grupos de sueros de ratón (intervalo de dilución 1:200 a 1:800) obtenidos después de la inmunización. Para cuantificar el nivel de infección, como controles, se utilizaron anticuerpos monoclonales comerciales. Los sedimentos celulares se fijaron y se permeabilizaron con soluciones Citofix-Citoperm. Se utilizó un reactivo secundario, anticuerpo de cabra anti-F(ab')2 de ratón marcado con Alexa488 (dilución final 1:400).
Como controles positivos se utilizaron anticuerpos comerciales contra gB (10G6), gH (SG3) y gE (13B1 (SBA) 8612 (Millipore) y cada una de las células MRC-5 infectadas se tiñó intracelularmente. Los sueros inmunitarios obtenidos 3 semanas después de la tercera inmunización, ya sea con 1 o 7 jg de ARN formulado con CMF32, se diluyeron a 1/200, 1/400 y 1/800 y se utilizaron para teñir intracelularmente las células MRC-5 infectadas. Los resultados se muestran en la figura 4 (estudio 1, grupos 1, 5, 7, 9, 11, 13 y 15, formulación de CMF32).
Ensayo de neutralización
Cada suero de ratón inmunizado se diluyó en serie mediante aumentos de factor dos iniciando a 1:20 en medio de cultivo estándar, y se añadieron a un mismo volumen de suspensión VZV en presencia de complemento de cobaya. Después de incubación durante 1 hora a 37 °C, se añadió la línea de células epiteliales humanas A549. Las células infectadas pueden medirse después de una semana de cultivo contando al microscopio las placas formadas en el cultivo. A partir del número de placa se calculó el % de inhibición a cada dilución en suero. Se realizó una gráfica para cada muestra de suero que representaba el valor de % de inhibición contra la escala logarítmica del factor de dilución. Posteriormente se dibujó una línea de relación aproximada entre el factor de dilución y el % de inhibición. Después, se determinó el título de neutralización al 50 % como el factor de dilución cuando la línea cruzó el valor de 50 % de inhibición.
La tabla 14 muestra que los sueros obtenidos de ratones inmunizados con gE monocistrónico, gE/gI bicistrónico y gH/gL bicistrónico, contenían títulos contundentes de anticuerpos neutralizantes.
Figure imgf000050_0001
Ejemplo 8: La solubilidad de ácidos grasos en escualeno
En este ejemplo, se examinó la solubilidad de varios ácidos grasos en escualeno, y se muestra en la tabla 15. Los ácidos grasos se mezclaron con escualeno a las cantidades indicadas (40, 20, 10 o 5 mg/ml) a una temperatura de 60 °C. En la tabla 15, (V) significa que el ácido graso fue soluble en escualeno a la concentración especificada; “x” significa que el ácido graso no fue soluble en escualeno a la concentración especificada; y “-” significa que la solubilidad del ácido graso a la concentración especificada no se analizó (debido a que el ácido graso era soluble a una concentración más alta). Una vez que los ácidos grasos se disolvieron en escualeno, las soluciones se dejaron a 4 °C durante la noche. La columna marcada a 4 °C durante la noche muestra la solubilidad de las soluciones en las cuales cada ácido graso estuvo en su concentración más superior. Por ejemplo, el ácido oleico fue soluble en escualeno a 40 mg/ml y permaneció soluble en escualeno a 4 °C durante la noche.
Tabla 15
Figure imgf000050_0002
continuación
Figure imgf000051_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que están dispersan en una fase acuosa continua, en la que el diámetro promedio de dichas partículas es de 80 nm a 150 nm; la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, y en la que:
(i) la relación de aceite:lípido (mol:mol) es de al menos 8:1 (mol:mol);
(ii) la concentración de lípido catiónico en dicha emulsión es de al menos 2,5 mM; y
(iii) el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Do EpC), cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (Do DAC), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB).
2. La emulsión de aceite en agua de la reivindicación 1, en la que el diámetro promedio no cambia en más de 10 % cuando la emulsión se conserva a 4 °C durante un mes.
3. La emulsión de aceite en agua de la reivindicación 1, en la que el diámetro promedio de dichas partículas es de 80 nm a 130 nm.
4. La emulsión de aceite en agua de la reivindicación 1, en la que la relación de aceite:lípido es de 10:1 (mol:mol) a 43:1 (mol:mol).
5. La emulsión de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha emulsión de aceite en agua comprende de 0,2 % a 8 % (p / v) de aceite, por ejemplo, en la que el aceite está presente de 0,6 % a 4 % (p/v) o de 1 % a 3,2 % (p/v), opcionalmente en la que el aceite es escualeno o escualano.
6. La emulsión de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas partículas comprenden además un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico, por ejemplo, en el que el tensioactivo es trioleato de sorbitán (SPAN85), polisorbato 80 (Tween 80), o una combinación de los mismos, opcionalmente en la que la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de 0,01 % a 2,5 % (v/v) de tensioactivo y opcionalmente en la que el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG)-lípido.
7. La emulsión de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho lípido catiónico es DOTAP y la concentración de DOTAP en dicha emulsión es de al menos 2,58 mM (1,8 mg/ml), por ejemplo, en la que la concentración de DOTAP en dicha emulsión es de 2,58 mM (1,8 mg/ml) a 7,16 mM (5 mg/ml).
8. Un procedimiento de preparación de la emulsión de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende: (a) disolver directamente el lípido catiónico en el aceite para formar una fase oleaginosa; (b) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (c) dispersar la fase oleaginosa en la fase acuosa por homogeneización, opcionalmente en el que la etapa (a) comprende además calentar el aceite a una temperatura entre 30 °C a 65 °C.
9. La emulsión de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende una molécula de ARN formando complejo con una partícula de la emulsión catiónica de aceite en agua.
10. La emulsión de aceite en agua de la reivindicación 9, en la que: (i) la relación N/P de la composición es de al menos 4: 1, por ejemplo, de 4: 1 a 20: 1 o de 4: 1 a 15: 1; (ii) la composición está tamponada y tiene un pH de 6,0 a 8,0; (iii) la composición comprende además una sal inorgánica, y la concentración de la sal inorgánica no es superior a 30 mM; (iv) la composición comprende además un agente tonificante no iónico, y es isotónico; y/o (v) la composición comprende además un antioxidante.
11. La emulsión de aceite en agua de la reivindicación 9 o 10, en la que la molécula de ARN es una molécula de ARN autorreplicante que codifica un antígeno.
12. Un procedimiento de preparación de una composición que comprende una molécula de ARN formando complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, que comprende:
(i) proporcionar una emulsión de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7;
(ii) proporcionar una solución acuosa que comprende la molécula de ARN; y
(iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (ii),
preparando así la composición, opcionalmente en la que la emulsión catiónica de aceite en agua de (i) y la solución de ARN de (ii) se combinan a una relación 1: 1 (v/v), opcionalmente en la que: (i) la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende una sal; (ii) la solución acuosa que comprende la molécula de ARN es un tampón; (iii) la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende un agente tonificante no iónico, tal como un azúcar o alcohol de azúcar; y/o (iv) la solución acuosa comprende del 0,05 % al 20 % (p/v) de polímero, por ejemplo, Pluronic® F127 al 1 % (p/v).
13. La emulsión de aceite en agua de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en la que la molécula de ARN es un ARN policistrónico que codifica dos o más antígenos, por ejemplo,
en la que el ARN policistrónico contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica un primer antígeno y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un segundo antígeno, en la que la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están unidas operativamente a elementos de control, opcionalmente en la que la primera secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un primer elemento de control y la segunda secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un segundo elemento de control, comprendiendo opcionalmente además una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína o fragmento de la misma,
en la que la tercera secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control, opcionalmente en la que la tercera secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un tercer elemento de control, comprendiendo opcionalmente además un cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína o fragmento de la misma,
en la que la cuarta secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control, opcionalmente en la que la cuarta secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un cuarto elemento de control, comprendiendo opcionalmente además una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína o fragmento de la misma,
en la que la quinta secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control, opcionalmente en la que la quinta secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un quinto elemento de control, por ejemplo en la que los elementos de control se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un promotor subgenómico, un IRES, y un sitio vírico 2A.
14. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico formando complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-11 o 13.
15. Una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 14, para su uso como un medicamento.
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