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CN103796639A - 阳离子水包油乳液 - Google Patents

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CN103796639A CN201280033539.6A CN201280033539A CN103796639A CN 103796639 A CN103796639 A CN 103796639A CN 201280033539 A CN201280033539 A CN 201280033539A CN 103796639 A CN103796639 A CN 103796639A
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Abstract

本发明涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:脂质比例。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述的阳离子乳液可用于递送带负电分子如核酸分子至细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。

Description

阳离子水包油乳液
相关申请
本申请要求2011年7月6日提交的美国临时申请61/505,109，2011年10月11日提交的美国临时申请61/545,936，和2012年1月11日提交的美国临时申请61/585,641的权益，上述申请各自的全部内容通过引用纳入本文。
序列表
本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。所述ASCII副本创建于2012年7月5日，命名为PAT54691.txt，大小为424,203字节。
背景技术
核酸治疗在治疗从遗传紊乱到获得性病症的疾病中具有前景，所述疾病如癌症、感染性紊乱（AIDS）、心脏病、关节炎、和神经变性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）。不仅可递送功能基因来修复遗传缺陷或诱导外源基因产物表达，而且还可递送核酸来抑制内源基因表达以提供治疗效果。基因表达的抑制可通过例如反义寡核苷酸、双链RNA（如siRNAs、miRNAs）或核酶来介导。
该治疗的关键步骤是体内递送核酸分子到细胞中。然而，体内递送核酸分子，尤其是RNA分子，面临许多技术障碍。首先，由于细胞和血清核酸酶，体内注入的RNA的半衰期仅约70秒（参见例如Kurreck,Eur.J.Bioch.270:1628-44(2003)）。已试图通过使用化学修饰来提高注射RNA的稳定性；然而，数个化学变化的例子导致细胞毒性效果增强或功能丧失或降低。在一个具体示例中，细胞不耐受RNAi双链的剂量，该双链中每个第二磷酸被替换为硫代磷酸酯(Harborth等,Antisense Nucleic Acid Drug Rev.13(2):83-105(2003))。因此，需要开发能体内递送足量核酸分子(尤其是RNA分子)以引起治疗响应，但对宿主没有毒性的递送系统。
基于核酸的疫苗是疫苗的诱人替代方案。例如，肌肉内（IM）免疫接种编码抗原的质粒DNA可诱导细胞和体液免疫响应并保护抵御攻击。DNA疫苗比使用蛋白抗原或减毒病原体的传统疫苗具有一些优势。例如，与蛋白疫苗相比，DNA疫苗可更有效地产生具有天然构型的适当折叠抗原和产生细胞免疫响应。DNA疫苗还不具有灭活或减毒病原体相关的一些安全问题。例如，灭活的病毒制剂可包含残留的活病毒，且减毒病毒可变异并回复为致病表型。
基于核酸的疫苗的一个限制是通常需要大剂量的核酸以在非人灵长类和人中获得有效的免疫响应。因此，需要递送系统和佐剂来提高基于核酸的疫苗的效力。已开发各种方法用于将核酸分子导入细胞，如磷酸钙转染、聚戊二烯转染、原生质体融合、电穿孔、微注射和脂质转染。
阳离子脂质已被配制为脂质体来递送基因到细胞中。此外，已开发阳离子脂质乳液来递送DNA分子到细胞中。参见例如，Kim等，International Journal ofPharmaceutics,295,35-45(2005)。
Ott等(Journal of Controlled Release，79卷，1-5页，2002)描述了用阳离子亚微米乳液作为DNA的递送系统/佐剂的方案。该亚微米乳液是基于MF59，一种水佐剂中的有效鲨烯，其是市售批准产品
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的组分。1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)用于促进质粒DNA的胞内递送。
Yi等(Pharmaceutical Research,17,314-320(2000))公开了使用豆油和DOTAP为阳离子脂质的阳离子水包油乳液。胆固醇、DOPE和聚合脂质也包括在一些乳液中。所述乳液显示能在最多至90%血清存在下增强DNA的体外转染效率。乳液颗粒的平均粒度在181nm到344nm，且所述粒度在乳液稀释于PBS缓冲液后有增大。
Kim等(Pharmaceutical Research，18卷，54-60页，2001)和Chung等(Journalof Controlled Release，71卷，339-350页，2001)描述了用于提高DNA分子体外和体内转染效力的各种水包油乳液。在经测试的阳离子脂质中，就DNA递送而言，DOTAP形成的乳液最稳定、有效。在经测试的油中，鲨烯、轻质矿物油和霍霍巴豆油形成小颗粒的稳定乳液。体外转染的效率显示为与乳液的稳定性相关(例如，100mg/mL的鲨烯和24mg/mL的DOTAP配制的乳液显示高体外转染效率)。乳液的制备首先经混合阳离子脂质和水来形成脂质体悬液(通过超声处理)。脂质体随后被加入油(如鲨烯)中并超声处理混合物以形成水包油乳液。
编码抗原或其衍生物的RNA分子也可用作疫苗。RNA疫苗比DNA疫苗具有某些优势。然而，与基于DNA的疫苗相比，基于RNA的疫苗收到的关注相对较少。在作为治疗剂或疫苗给予时，RNA极易被核酸酶降解。此外，RNA不能主动运输到细胞中。参见，例如Vajdy,M.等，Mucosal adjuvants and deliverysystemsfor protein-,DNA-and RNA-based vaccines(基于蛋白、DNA和RNA的疫苗的胃肠道外佐剂和递送系统)，Immunol Cell Biol，2004(6):617-27页。
因此，需要提供用于核酸分子或其它带负电分子的递送系统。所述递送系统可用于基于核酸的疫苗，尤其是基于RNA的疫苗。
发明内容
本发明涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:脂质比例。所述油和阳离子脂质是乳液的单独组分，并优选所述油不是离子型的。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述的阳离子乳液可用于递送带负电分子如核酸分子(例如编码抗原的RNA分子)至细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，且(iii)前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。所述水包油乳液可含约0.2%-约8%(w/v)的油。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。
另一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在；且(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。在一些实施方式中，所述油以0.6%至4%(w/v)存在。在一些实施方式中，所述油以约1%至约3.2%(w/v)存在。
这方面的所述水包油乳液还可包含表面活性剂如非离子型表面活性剂。优选所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。表面活性剂存在量可为约0.01到约2.5%(w/v)。在一些实施方式中，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。在一些实施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐温80(聚山梨酯80)，例如各0.5%(w/v)。
优选所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。例如，在一些实施方式中所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
在一些实施方式中，所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和DOTAP，其中(i)油:DOTAP的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，且(ii)所述乳液中DOTAP的浓度为至少约2.58mM(1.8mg/mL)，或从约2.58mM(1.8mg/mL)到约7.16mM(5mg/mL)。所述油可为鲨烯或角鲨烷。
在一些实施方式中，所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和DOTAP，其中(i)油:DOTAP的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中DOTAP的浓度为至少约2.58mM(1.8mg/mL)，且(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。在一些实施方式中，DOTAP的浓度从约2.58mM(1.8mg/mL)到约7.16mM(5mg/mL)。在一些实施方式中，所述油以0.6%至4%(w/v)存在。在一些实施方式中，所述油以约1%至约3.2%(w/v)存在。
本发明还提供一种制备水包油乳液的方法，所述乳液含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，且(iii)前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇，所述方法包括(a)直接将阳离子脂质溶解于油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；以及(c)通过均质化将所述油相分散在水相中。所述油可加热到温度约30℃～约65℃以促进所述阳离子脂质分散在油中。也可使用更高的温度，只要油或者阳离子脂质没有显著降解。
本发明还提供一种制备水包油乳液的方法，所述乳液含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在，且(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇，所述方法包括(a)直接将阳离子脂质溶解于油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；以及(c)通过均质化将所述油相分散在水相中。所述油可加热到温度约30℃～约65℃以促进所述阳离子脂质分散在油中。也可使用更高的温度，只要油或者阳离子脂质没有显著降解。
另一方面，本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，其中所述颗粒含有阳离子脂质和在25℃下为液相的油,且(i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；(ii)所述组合物中阳离子脂质的浓度为至少约1.25mM；以及(iii)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选所述乳液颗粒的平均直径在约80nm至180nm，或约80nm至150nm，或约80nm至约130nm，以及所述组合物的N/P比例至少约4:1，或从约4:1至约20:1，或从约4:1至约15:1。在某些实施方式中，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。所述水包油乳液可含约0.1%-约5%(w/v)的油。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。
另一方面，本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，其中所述颗粒含有阳离子脂质和在25℃下为液相的油,且(i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约4:1(摩尔:摩尔)；(ii)所述组合物中阳离子脂质的浓度为至少约1.25mM；(iii)所述油以约0.1%至约4%(w/v)存在；以及(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选所述乳液颗粒的平均直径在约80nm至180nm，或约80nm至150nm，或约80nm至约130nm，以及所述组合物的N/P比例至少约4:1，或从约4:1至约20:1，或从约4:1至约15:1。在某些实施方式中，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。在一些实施方式中，所述油以0.6%至4%(w/v)存在。在一些实施方式中，所述油以约1%至约3.2%(w/v)存在。
这方面的所述水包油乳液还可包含表面活性剂如非离子型表面活性剂。优选地，表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。表面活性剂存在量可为约0.005到约1.25%(w/v)。在一些实施方式中，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。在一些实施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐温80(聚山梨酯80)，例如各0.25%或0.5%(w/v)。
优选所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。例如，在一些实施方式中所述阳离子脂质是选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
在一些实施方式中，本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，其中所述颗粒含有DOTAP和在25℃下为液相的油,且(i)油:DOTAP的比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；(ii)所述组合物中DOTAP的浓度为至少约1.29mM，或从1.29mM(0.9mg/mL)到约3.58mM(2.5mg/mL)。所述油可为鲨烯或角鲨烷。可选的，N/P比为至少4:1。
在优选实施方式中，所述组合物带缓冲(例如，含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂)且pH在约6.0到约8.0，优选约6.2到约6.8。所述还可包含无机盐，且无机盐浓度优选不超过30mM。可选地，所述组合物还可含有非离子型等张剂，并优选是等渗的。
本发明还提供制备含核酸分子(优选RNA分子)组合物的方法，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，所述方法包括(i)提供本文所述的水包油乳液；(ii)提供含所述RNA分子的水溶液；以及(iii)组合(i)的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液和RNA溶液以约1:1(v/v)的比例组合。所述含RNA分子的水溶液优选带缓冲(例如，含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂)，可含有无机盐(例如NaCl)，所述盐优选以约20mM存在或更少。在一种实施方式中，所述含RNA分子的水溶液含有2mM柠檬酸盐缓冲剂和20mM NaCl。可选地，所述含RNA分子的水溶液还含有非离子型等张剂，并且是等渗的。在一种实施方式中，所述水溶液还含有约560mM蔗糖。可选地，所述含RNA分子的水溶液还含有聚合物或非离子型表面活性剂，如F127，含量从约0.05%到约20%(w/v)。
另一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相的颗粒，所述乳液含有油和阳离子脂质，所述颗粒的平均直径从约80nm到180nm，所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。
这方面的所述水包油乳液还可包含表面活性剂如非离子型表面活性剂。优选地，表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。表面活性剂存在量可为约0.01到约2.5%(w/v)。在一些实施方式中，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。在一些实施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐温80(聚山梨酯80)，例如各0.25%或0.5%(w/v)。
优选所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。例如，在一些实施方式中所述阳离子脂质是选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，所述乳液含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液含有油和阳离子脂质，所述颗粒的平均直径从约80nm到180nm，所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。优选地，所述组合物的N/P比至少约4:1。
在优选实施方式中，所述组合物带缓冲(例如，含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂)且pH在约6.0到约8.0，优选约6.2到约6.8。所述还可包含无机盐，且无机盐浓度优选不超过30mM。可选地，所述组合物还可含有非离子型等张剂，并优选是等渗的。
本发明还涉及在对象中产生免疫响应的方法，所述方法包括给予有需要的对象本文所述的组合物。优选在单次给药中给予所述对象的阳离子脂质(作为所述组合物的成分)的量不超过约30mg。在具体实施方式中，所述阳离子脂质是DOTAP且单次给药中给予对象的DOTAP总量不超过约24mg，或者不超过约4mg。
附图说明
图1是编码5种CMV蛋白的五顺反子RNA复制子A526、A527、A554、A555和A556的示意图。亚基因组启动子用箭头表示，标记了其它控制元件。
图2的荧光柱状图显示用A527RNA复制子转染的BHKV细胞表达gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物。用抗体进行细胞染色，所述抗体结合五聚体复合物上所呈递的构象表位。
图3是示意图和图表。该示意图显示编码CMV gH和gL的双顺反子RNA复制子A160和A531-A537。该图表显示免疫血清的中和活性，所述免疫血清来自用含有复制子的VRP免疫的小鼠。
图4显示免疫血清中抗VZV蛋白的抗体应答，所述免疫血清来自用编码VZV蛋白的单顺反子RNA复制子或编码VZV gE和gI、或gH和gL的双顺反子RNA复制子免疫的小鼠。所述小鼠经7μg RNA免疫，该RNA以CMF32配制。
具体实施方式
1.概述
本发明一般涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:阳离子脂质比例。所述油和阳离子脂质是乳液的单独组分，并优选所述油不是离子型的。所述阳离子脂质可与带负电分子如核酸相互作用，从而将所述带负电分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述阳离子乳液可用于体内递送带负电分子，例如核酸分子(如编码蛋白或肽的RNA分子，小干扰RNA，自复制RNA等）到细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
具体地，本发明是基于以下发现：能成功制得含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:阳离子脂质比例的阳离子水包油稳定乳液。含有高浓度阳离子脂质的乳液使得能够用乳液颗粒配制更多带负电的分子(如RNA分子)，从而提高递送效率。具体地，对于很多治疗剂如疫苗，优选小体积(例如，每剂0.5mL)给药。如本文所述的含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:阳离子脂质比例的乳液将能在特定的体积内递送更高剂量的RNA。
在优选实施方式中，RNA分子与所述水包油乳液的颗粒复合。相对于游离（“裸露”）RNA，复合的RNA分子稳定且受保护免于RNA酶介导的降解，并且能被细胞更有效摄入。
此外，当所述RNA被递送以诱导编码蛋白的表达时，例如在RNA疫苗的情况中，含有高浓度阳离子脂质的乳液能提高与乳液颗粒复合的RNA分子的量。由于更多RNA分子被递送至宿主细胞，所编码蛋白抗原的产生量更高，继而增强所述RNA疫苗的效力和免疫原性。最后，所编码蛋白的免疫原性可由于乳液的佐剂效应而得以增强。因此，除了更有效递送带负电分子(如编码抗原的RNA分子)之外，阳离子乳液还可通过佐剂活性增强免疫响应。例如，如本文所述和示例的，与低DOTAP乳液复合的RNA分子相比，RNA分子(编码呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白)和高DOTAP乳液复合的制剂在RSV小鼠模型和棉鼠模型中产生更高的免疫响应。
因此，一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，且(iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
另一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在；且(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
所述阳离子乳液还可含有表面活性剂(例如，吐温80、SPAN85、或其组合)。
在另一方面，本发明还提供阳离子水包油乳液的数种具体制剂，其含有高浓度阳离子脂质并可用于递送带负电分子。
另一方面，本发明提供一种制备水包油乳液的方法，所述方法包括：(1)直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(2)提供所述乳液的水相；和(3)将所述油相分散在所述水相中(例如，通过均质化)。若需要，所述油可加热到温度约30℃～约65℃以促进所述阳离子脂质溶解在油中。优选地，油相的油:阳离子脂质比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)，并且可选或补充地，所述颗粒的平均直接从约80nm到180nm和/或油相中的阳离子脂质浓度至少约5mM。
另一方面，本发明提供制备包含带负电分子(如RNA分子)的组合物的方法，所述带负电分子与阳离子水包油乳液颗粒复合，所述方法包括：(i)提供本文所述的水包油乳液；(ii)提供含所述RNA分子的水溶液；以及(iii)组合(ii)的水溶液和(i)的水包油溶液，从而制备所述组合物。若需要，含所述RNA分子的水溶液可含有盐(NaCl)、缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲液)、非离子型等张剂(例如蔗糖、海藻糖、山梨糖醇或右旋糖)、聚合物(例如F127)、或其组合物。
本发明所述阳离子乳液可用于递送带负电分子，如核酸(如RNA)。所述组合物可给予有需要的对象来产生或增强免疫响应。所述组合物还可与另一免疫原性分子、免疫原性组合物或疫苗共递送以增强所诱发免疫响应的效能。
2.定义
本文所用的术语“约”指某数值的+/-5%。
“抗原”指含一个或多个表位(线性、构象或兼有)的分子。
“缓冲液”指抗拒溶液pH变化的水溶液。
本文所用“核苷酸类似物”或“修饰的核苷酸”指在核苷的含氮碱基(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))中或其上含一种或多种化学修饰(如取代)的核苷酸。
如本文所用，乳液“颗粒”指悬浮在水包油乳液的水(连续)相中的油滴。所述颗粒还包含阳离子液体，和可选的其它组分，如表面活性剂。
术语“聚合物”指由相同或不同的个体化学部分连接在一起所组成的分子。如本文所用，术语“聚合物”指那些首尾相连而形成线性分子的个体化学部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)结构形式连接在一起的个体化学部分。示例性聚合物包括，例如，泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。
如本文所述，“糖(saccharide)”涵盖单糖、寡糖或以直链或环形或其组合的形式形成糖链的多糖。寡糖是具有2种或更多单糖残基的糖。糖的示例包括葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、蔗糖和海藻糖。
当乳液颗粒在4℃下至少1个月，优选至少2个月保持分散而没有显著聚集或聚结时，乳液是“稳定的”。当乳液于4℃保存1个月，或优选2个月时，稳定乳液的平均颗粒直径(数量平均直径)的改变不超过10%。
术语“表面活性剂”是本领域术语并通常指同时具有亲水基团(如极性基团)和疏水基团的任何分子，亲水基团在能量上倾向于被水溶剂化，而疏水基团不能被水良好溶剂化。术语“非离子表面活性剂”是本领域已知术语并通常指其亲水基团(如极性基团)不带静电荷的表面活性剂分子。
乳液的“ζ电势”通过乳液颗粒的电泳迁移率来确定。颗粒在单位电场内的速度被称作其电泳迁移率。ζ电势通过亨利方程与电泳迁移率关联：
U E = 2 ϵzf ( ka ) 3 η
其中UE=电泳迁移率，z=ζ电势，ε=介电常数，η=粘度而f(ka)=亨利函数。ζ电势通常使用电泳迁移率装如置Zetasizer Nano Z(英国马尔文仪表公司(Malvern Instruments Ltd))测量。
3.水包油乳液
本文公开的阳离子水包油乳液一般以本领域常见方法，通过用于制备所述乳液的组分的浓度来描述。本领域应理解在乳液生产工艺中，包括灭菌和其它下游过程中，少量油(如鲨烯)、阳离子脂质(如DOTAP)、或其它组分可能有损失，且这些组分在最终产物（如待给予的包装灭菌乳液）中的实际浓度可稍低于起始含量，有时相差最多达约10%、或最多达约20%、或最多达约25%、或最多达约35%。
本发明一般涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:阳离子脂质比例。所述乳液特别适于递送带负电分子如RNA分子至细胞。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，例如通过静电力和疏水/亲水相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒上。本文所述的阳离子乳液可用于体内递送带负电分子如编码抗原的RNA分子或小干扰RNA到细胞中。例如，本文所述阳离子乳液提供在递送编码一种或多种抗原的RNA分子作为疫苗中的优势，所述RNA包括自复制RNA。
乳液的离散相(或分散相)含油和阳离子装置，其中所述阳离子装置促进所述油分散在水(连续)相中。所述乳液中可存在一种或多种任选组分，如下述表面活性剂(例如，非离子型表面活性剂)。
水包油乳液的颗粒具有1微米或更小的平均直径(即数量平均直径)。特别需要所述阳离子乳液的平均颗粒直径为约180nm或更小、约170nm或更小、约160nm或更小、约150nm或更小、约140nm或更小、约130nm或更小、约120nm或更小、约110nm或更小、或约100nm或更小；例如约80nm-180nm、约80nm-170nm、约80nm-160nm、约80nm-150nm、约80nm-140nm、约80nm-130nm、约80nm-120nm；约80nm-110nm、或约80nm-100nm。特别优选的平均颗粒直径是约100nm，或约100nm到约130nm。
所述乳液颗粒的大小(平均直径)可通过改变表面活性剂与油的比例(提高比例则降低液滴大小)，均质化的操作压力(升高均质化的操作压力通常降低液滴大小)，温度(升高温度则降低液滴大小)，改变油的类型，在水相纳入某些类型的缓冲液，和其它工艺参数而变化，如下所详述。在以下情况中，所述乳液颗粒的大小可影响RNA-乳液复合物的免疫原性，如本文示例。
本文所述的水包油乳液是稳定的。
本文所述乳液的颗粒可与带负电分子复合。与带负电分子复合前，所述颗粒的总净电荷(通常测量为ζ电势)应为正(阳离子)。颗粒的总净电荷可变化，取决于乳液中阳离子脂质的种类和阳离子脂质的含量、乳液中油的含量(如更高百分比的油通常造成颗粒表面电荷较低)，且可受到乳液中存在的任何其它组分(如表面活性剂)的影响。复合前颗粒的ζ电势优选不超过约50mV、不超过约45mV、不超过约40mV、不超过约35mV、不超过约30mV、不超过约25mV、不超过约20mV；约5mV-约50mV、约10mV-约50mV、约10mV-约45mV、约10mV-约40mV、约10mV-约35mV、约10mV-约30mV、约10mV-约25mV、或约10mV-约20mV。ζ电势可受(i)乳液的pH，(ii)乳液导电率(如盐度)，和(iii)乳液中各种组分(聚合物、非离子表面活性剂等)的浓度的影响。阳离子水包油乳液的ζ电势用马尔文(Malvern)Nanoseries Zetasizer(麻萨诸塞州韦斯特伯勒)测量。样品1:100稀释在水中(粘度:0.8872cp，RI:1.330，介电常数:78.5)并添加到聚苯乙烯胶乳毛细管池中(马尔文公司，麻萨诸塞州韦斯特伯勒)。ζ电势用2分钟平衡时间在25℃测量并用Smoluchowski模型(F(Ka)值=1.5)分析。数据报道为mV。
本发明的示例性阳离子乳液在本文中称为“CMF32”。CMF32的油是鲨烯(4.3%w/v)且阳离子脂质是DOTAP(3.2mg/mL)。CMF32还包括表面活性剂SPAN85((失水山梨糖醇三油酸酯)0.5%v/v)和吐温80((聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)0.5%v/v)。因此，CMF32的乳液颗粒包含有鲨烯、SPAN85、吐温80和DOTAP。RNA分子显示在N/P比4:1、6:1、8:1、10:1、12:1和14:1下与CMF32颗粒有效复合。其它示例性阳离子乳液包括，例如，本文称为“CMF34”(4.3%w/v鲨烯、0.5%吐温80、0.5%SPAN85和4.4mg/mLDOTAP)，“CMF35”(4.3%w/v鲨烯、0.5%吐温80、0.5%SPAN85、5.0mg/mLDOTAP)的乳液和本文描述的其它乳液。
本发明的某些示例性阳离子水包油乳液含有DOTAP和鲨烯，其浓度分别为2.1mg/ml到2.84mg/ml(优选2.23mg/ml到2.71mg/ml)和30.92mg/ml到41.92mg/ml(优选32.82mg/ml到约40.02mg/ml)，且还含有等量的SPAN85和吐温80(例如，各约0.5%)。本发明的其它示例性阳离子水包油乳液含有DOTAP和鲨烯，其浓度分别为2.78mg/ml到3.76mg/ml(优选2.94mg/ml到3.6mg/ml)和18.6mg/ml到25.16mg/ml(优选19.69mg/ml到约24.07mg/ml)，且还含有等量的SPAN85和吐温80(例如，各约0.5%)。优选这些乳液的颗粒具有80nm-180nm的平均直径。
本发明水包油乳液的单独组分为本领域已知，尽管未以本文所述的方式组合出此类组合物。因此，尽管下面就优选实施方式对单独组分有一般和一些细节的描述，但所述单独组分为本领域熟知，且本文所用术语如油、表面活性剂、磷脂等为本领域技术人员充分熟知而不需进一步描述。此外，虽然提供了乳液单独组分的优选含量范围，具体乳液中组分的实际比例可能需要调节以使具有所需大小和物理性质的乳液颗粒得以适当地形成。例如，若使用具体含量的油(如5%v/v油)，则表面活性剂的含量应为足以将油粒分散在水相中以形成稳定乳液的水平。将油分散在水相中所需的表面活性剂的实际量取决于乳液所用的表面活性剂的类型和油的类型；且油的量还可根据所需粒度而变化(因为这会改变两相之间的表面积)。所需乳液中组分的实际含量和相对比例可由技术人员容易地确定。
A.油
阳离子水包油乳液的颗粒包含油。
所述油优选在1℃或以上为液相，并且与水不互溶。
优选地，所述油是可代谢、无毒的油；更优选一种约6-约30个碳原子的，包括但不限于烷烃、烯烃、炔烃及其相应的酸和醇、其醚和酯、及其混合物。所述油可以是可被给予所述乳液的对象身体所代谢，且对所述对象无毒的任何植物油、鱼油、动物油或合成制备油。所述对象可为动物，通常是哺乳动物，并优选人。
在某些实施方式中，所述油在25℃时为液相。所述油在25℃时为液相，当保存于25℃时其表现出液体特性(不同于固体和气体；且具有确定体积但没有确定形状)。然而所述乳液可在任何合适温度储存和使用。优选所述油在4℃时为液相。
所述油可为任何长链烷烃、烯烃或炔烃，或其酸或醇衍生物，无论是游离酸、其盐或酯如单或双或三酯，例如1,2-丙二醇或类似的多羟基醇的甘油三酯和各种酯。醇可用单或多官能酸例如乙酸、丙酸、柠檬酸等来酰化。还可使用是油并满足本文所述其它标准的长链醇衍生醚。
单独的烷烃、烯烃或炔烃部分及其酸或醇衍生物通常具有约6-约30个碳原子。所述部分可具有直链或支链结构。其可完全饱和或具有一个或多个双键或三键。在使用单或聚酯或醚基油时，约6-约30个碳的限制适用于个体脂肪酸或脂肪醇部分，并非所有碳计数。
可使用来自动物、鱼或植物来源的任何合适油。植物油的来源包括坚果、种子和谷物，和合适的油花生油、大豆油、椰油和橄榄油等。其它合适的种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组中还可采用玉米油和其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草、黑小麦等的油。获取植物油的技术已充分开发且熟知。这些和其它相似油的组合物可参见例如《默克索引》（the Merck Index），以及食品、营养品和食品技术的原始资料。
甘油和1,2-丙二醇的约6-约10碳脂肪酸酯尽管不是种籽油中天然产生的，但可以从坚果和种籽油开始，通过对合适材料进行水解、分离和酯化而制得。这些产品市售可得，以名称NEOBEES出自新泽西州Boongon迪威臣街416号的PVO国际公司（PVO International,Inc.）化学专业部及其它产品。
动物油和脂肪通常由于以甘油三酯存在且比来自鱼或植物的油有更高的饱和度而在生理温度下为固相。然而，脂肪酸可获自动物脂肪，通过部分或完全甘油三酯皂化提供游离脂肪酸。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。
大多数鱼类含有易于回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡的是本文可使用的几种鱼油的示例。以5-碳异戊二烯单元生化合成了多种支链油，它们总称为萜类。鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是分支未饱和萜类，为本文所特别优选。鲨烯的主要来源是鲨鱼肝油，尽管包括苋菜种籽、米糠、小麦胚芽和橄榄油在内的植物油(主要是植物油)也是合适的来源。鲨烯也可获自酵母或其它合适的微生物。在一些实施方式中，鲨烯优选获自非动物来源，例如橄榄、橄榄油或酵母。鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的。包括鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得或可以通过本领域已知的方法获得。
在某些实施方式中，所述油包含选自下组的油：蓖麻油、椰子油、玉米油、棉籽油、月见草油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻子油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油、鲨烯、角鲨烷、葵花子油、小麦胚芽油。在示例性实施方式中，所述油包含鲨烯或角鲨烷。
所述乳液的油组分可以约0.2%-约10%(v/v)的含量存在。例如，所述阳离子水包油乳液可含有约0.2%到约10%(v/v)油，约0.2%到约9%(v/v)油，约0.2%到约8%(v/v)油，约0.2%到约7%(v/v)油，约0.2%到约6%(v/v)油，约0.2%到约5%(v/v)油，约0.3%到约10%(v/v)油，约0.4%到约10%(v/v)油，约0.5%到约10%(v/v)油，约1%到约10%(v/v)油，约2%到约10%(v/v)油，约3%到约10%(v/v)油，约4%到约10%(v/v)油，约5%到约10%(v/v)油，约0.2%到约10%(w/v)油，约0.2%到约9%(w/v)油，约0.2%到约8%(w/v)油，约0.2%到约7%(w/v)油，约0.2%到约6%(w/v)油，约0.2%到约5%(w/v)油，约0.2%到约4.3%(w/v)油，约0.6%到约4%(w/v)油，约0.7%到约4%(w/v)油，约0.8%到约4%(w/v)油，约0.9%到约4%(w/v)油，约1.0%到约4%(w/v)油，约0.6%到约3.5%(w/v)油，约0.6%到约3%(w/v)油，约0.5%(v/v)油，约0.6%(v/v)油，约0.7%(v/v)油，约0.8%(v/v)油，约0.9%(v/v)油，约1%(v/v)油，约1.5%(v/v)油，约2%(v/v)油，约2.5%(v/v)油，约3%(v/v)油，约3.5%(v/v)油，约4%(v/v)油，约5%(v/v)油，约10%(v/v)油，约0.5%(w/v)油，约1%(w/v)油，约1.5%(w/v)油，约2%(w/v)油，约2.5%(w/v)油，约3%(w/v)油，约3.5%(w/v)油，约4%(w/v)油，约4.3%(w/v)油，约5%(w/v)油，约5.5%(w/v)油，约6%(w/v)油，约6.5%(w/v)油，约7%(w/v)油，约7.5%(w/v)油，或约8%(w/v)油。
所述阳离子水包油乳液也可含有约0.2%到约8%(v/v)油，例如，0.6%(w/v)到4%(w/v)，约1%(w/v)到约3.2%(w/v)，约1%(w/v)，约1.1%(w/v)，约1.2%(w/v)，约1.3%(w/v)，约1.4%(w/v)，约1.5%(w/v)，约1.6%(w/v)，约1.7%(w/v)，约1.8%(w/v)，约1.9%(w/v)，约2.0%(w/v)，约2.1%(w/v)，约2.15%(w/v)，约2.2%(w/v)，约2.3%(w/v)，约2.4%(w/v)，约2.5%(w/v)，约2.6%(w/v)，约2.7%(w/v)，约2.8%(w/v)，约2.9%(w/v)，3.0%(w/v)，约3.1%(w/v)，约3.2%(w/v)，约3.3%(w/v)，约3.4%(w/v)，约3.5%(w/v)，约3.6%(w/v)，约3.7%(w/v)，约3.8%(w/v)，约3.9%(w/v)，或约4.0%(w/v)油。
在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约5%(v/v)油。在另一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约4.3%(w/v)鲨烯。在另一示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含0.6%(w/v)到4%(w/v)鲨烯，例如约1%(w/v)到约3.2%(w/v)鲨烯，如1.08%(w/v)、2.15%(w/v)、或3.23%(w/v)鲨烯，如实施例中所示。
如上所述，上述油的百分比根据制备乳液所用油的起始含量确定。本领域应理解终产物(如待给予的包装、灭菌乳液)中油的实际浓度可能稍低，有时相差最多达约10%，最多达约20%，最多达约25%，或最多达约35%。
B.阳离子脂质
本文所述乳液颗粒包含阳离子脂质，其可与所述带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。
可以使用任意合适的阳离子脂质。通常，阳离子脂质含生理条件下带正电的氮原子。阳离子脂质的头部基团可含有叔胺，或优选季胺。某些合适的阳离子脂质包含两条饱和或不饱和的脂肪酸链(例如，具有约10到约30个碳原子的侧链)。
所述阳离子脂质可在pH约12、pH约11、pH约10、pH约9、pH约8、pH约7、或pH约6下带正电。
合适的阳离子脂质包括苯扎氯铵(BAK)、氯化苄乙铵、溴棕三甲铵（其含十四烷基三甲基溴化铵和可能的少量十二烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵）、十六烷基氯化吡啶(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、伯胺、仲胺、叔胺，包括但不限于N,N',N'-聚氧乙烯(10)-N-牛油-l,3-二氨基丙烷、其它季胺盐包括但不限于十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、混合的烷基-三甲基-溴化铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十六烷基-氯化铵、苄基三甲基甲醇铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、二甲基十八烷基溴化铵(DDAB)、甲基氯化苄乙铵、氯化十烃季铵、甲基混合的三烷基氯化铵、甲基三辛基氯化铵)、N,N-二甲基-N-[2(2-甲基-4-(l,l,3,3四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基)乙基]-苯甲烷-氯化铵(DEBDA)、二烷基二甲基铵盐、[l-(2,3-二油烯基氧基)-丙基]-N,N,N,三甲基氯化铵、1,2-二酰基-3-(三甲基铵)丙烷(酰基基团=二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二酰基-3(二甲基铵)丙烷(酰基基团=二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二油酰-3-(4'-三甲基-铵)丁酰-sn-甘油、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、(4'-三甲基铵)丁酸胆固醇)、N-烷基吡啶盐(如溴化十六烷基吡啶
Figure BDA0000453594540000172
和氯化十六烷基吡啶
Figure BDA0000453594540000173
)、N-烷基哌叮
Figure BDA0000453594540000174
盐、双阳离子bola型电解质(C12Me6；C12BU6)、二烷基甘油基磷酸胆碱、溶血卵磷脂、L-α二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇半琥珀酸胆碱酯、脂聚胺，包括但不限于十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二棕榈酰磷脂酰乙醇-酰氨基精胺(DPPES)、脂聚-L(或D)-赖氨酸(LPLL、LPDL)、聚(L(或D)-赖氨酸偶联N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有侧接氨基基团的双十二烷基谷氨酸(C12GluPhCnN+)、具有侧接氨基基团的双十四烷基谷氨酸酯(C14GluCnN+)、胆固醇的阳离子衍生物，包括但不限于胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基三甲基铵盐、胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基-二甲基铵、胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基三甲基铵盐、胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基二甲基铵盐、和3γ-[N-(N',N-二甲基氨基乙基氨甲酰基]胆固醇)(DC-胆固醇)、1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、二甲基双十八烷基铵(DDA)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、二棕榈酰(C16:0)三甲基铵丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲基铵丙烷(DSTAP)、N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、1,2-二油酰-3-二甲氨基-丙烷(DODAP)、1,2-二亚油氧基-3-二甲基氨丙烷(DLinDMA)，及其组合。
在优选实施方式中，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。在某些实施方式中，所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
优选地，为所述乳液选择的阳离子脂质可溶于为所述乳液选择的油。这允许在分散入流动相前通过直接将脂质溶解在油中实现乳液中的高阳离子脂质浓度。确定具体脂质可溶于油以及相应选择合适的油和脂质组合是在本领域认识范围内的。例如，溶解度可根据所述脂质和油的结构来预测(如脂质的溶解度可通过其尾部的结构来确定)。例如，具有一或两条不饱和脂肪酸链(例如，油酰尾部或亚麻酰尾部)的脂质如DOTAP、DOEPC、DODAC、DOTMA可溶于鲨烯或角鲨烷。或者，溶解度可根据溶于给定量油以形成饱和溶液的脂质的量来确定。此类方法是本领域已知的。示例性饱和或不饱和脂肪酸在鲨烯中的溶解度也已提供在实施例中。优选脂质在油中的饱和浓度至少约1mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约25mg/ml、至少约50mg/ml或至少约100mg/ml。
优选地，在复合所述带负电分子前，所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM，至少约1.5mM，至少约1.75mM，至少约2.0mM，至少约2.25mM，至少约2.5mM，至少约2.75mM，至少约3.0mM，至少约3.25mM，至少约3.5mM，至少约3.75mM，至少约4.0mM，至少约4.25mM，至少约4.5mM，至少约4.75mM，至少约5.0mM，至少约5.25mM，至少约5.5mM，至少约5.75mM，至少约6mM，至少约6.25mM，至少约6.5mM，至少约6.75mM，至少约7mM，至少约7.25mM，至少约7.5mM，至少约7.75mM，至少约8mM，至少约8.25mM，至少约8.5mM，至少约8.75mM，至少约9mM，至少约9.25mM，至少约9.5mM，至少约9.75mM，或至少约10mM。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质为DOTAP。所述阳离子水包油乳液可含约0.8mg/ml-约10mg/ml的DOTAP。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DOTAP可为约1.7mg/ml至约10mg/ml，约1.8mg/ml至约10mg/ml，约2.0mg/ml至约10mg/ml，约2.2mg/ml至约10mg/ml，约2.4mg/ml至约10mg/ml，约2.6mg/ml至约10mg/ml，约2.8mg/ml至约10mg/ml，约3.0mg/ml至约10mg/ml，约3.2mg/ml至约10mg/ml，约3.4mg/ml至约10mg/ml，约3.6mg/ml至约10mg/ml，约4.0mg/ml至约10mg/ml，约4.4mg/ml至约10mg/ml，约4.8mg/ml至约10mg/ml，约5mg/ml至约10mg/ml，约1.7mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约6mg/ml，约1.8mg/ml至约7mg/ml，约1.8mg/ml至约8mg/ml，约1.8mg/ml至约9mg/ml，约1.7mg/ml，约1.8mg/ml，约2.0mg/ml，约2.2mg/ml，约2.4mg/ml，约2.6mg/ml，约2.8mg/ml，约3.0mg/ml，约3.2mg/ml，约3.4mg/ml，约3.6mg/ml，约3.8mg/ml，约4.0mg/ml，约4.2mg/ml，约4.4mg/ml，约4.6mg/ml，约4.8mg/ml，约5.0mg/ml，约5.2mg/ml，约5.5mg/ml，约6.0mg/ml，至少约0.8mg/ml，至少约0.85mg/ml，至少约0.9mg/ml，至少约1.0mg/ml，至少约1.1mg/ml，至少约1.2mg/ml，至少约1.3mg/ml，至少约1.4mg/ml，至少约1.5mg/ml，至少约1.6mg/ml，至少约1.7mg/ml等。
在示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约1.8mg/ml-约5.0mg/ml DOTAP。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质为DOEPC。所述阳离子水包油乳液可含约0.8mg/ml-约10mg/ml的DOEPC。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DOEPC可为约1.7mg/ml至约10mg/ml，约1.8mg/ml至约10mg/ml，约2.0mg/ml至约10mg/ml，约2.2mg/ml至约10mg/ml，约2.4mg/ml至约10mg/ml，约2.6mg/ml至约10mg/ml，约2.8mg/ml至约10mg/ml，约3.0mg/ml至约10mg/ml，约3.2mg/ml至约10mg/ml，约3.4mg/ml至约10mg/ml，约3.6mg/ml至约10mg/ml，约4.0mg/ml至约10mg/ml，约4.4mg/ml至约10mg/ml，约4.8mg/ml至约10mg/ml，约5mg/ml至约10mg/ml，约1.7mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约6mg/ml，约1.8mg/ml至约7mg/ml，约1.8mg/ml至约8mg/ml，约1.8mg/ml至约9mg/ml，约1.7mg/ml，约1.8mg/ml，约2.0mg/ml，约2.2mg/ml，约2.4mg/ml，约2.6mg/ml，约2.8mg/ml，约3.0mg/ml，约3.2mg/ml，约3.4mg/ml，约3.6mg/ml，约3.8mg/ml，约4.0mg/ml，约4.2mg/ml，约4.4mg/ml，约4.6mg/ml，约4.8mg/ml，约5.0mg/ml，约5.2mg/ml，约5.5mg/ml，约6.0mg/ml，至少约0.8mg/ml，至少约0.85mg/ml，至少约0.9mg/ml，至少约1.0mg/ml，至少约1.1mg/ml，至少约1.2mg/ml，至少约1.3mg/ml，至少约1.4mg/ml，至少约1.5mg/ml，至少约1.6mg/ml，至少约1.7mg/ml等。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质为DODAC。所述阳离子水包油乳液可含约0.8mg/ml-约10mg/ml的DODAC。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DODAC可为约1.7mg/ml至约10mg/ml，约1.8mg/ml至约10mg/ml，约2.0mg/ml至约10mg/ml，约2.2mg/ml至约10mg/ml，约2.4mg/ml至约10mg/ml，约2.6mg/ml至约10mg/ml，约2.8mg/ml至约10mg/ml，约3.0mg/ml至约10mg/ml，约3.2mg/ml至约10mg/ml，约3.4mg/ml至约10mg/ml，约3.6mg/ml至约10mg/ml，约4.0mg/ml至约10mg/ml，约4.4mg/ml至约10mg/ml，约4.8mg/ml至约10mg/ml，约5mg/ml至约10mg/ml，约1.7mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约6mg/ml，约1.8mg/ml至约7mg/ml，约1.8mg/ml至约8mg/ml，约1.8mg/ml至约9mg/ml，约1.7mg/ml，约1.8mg/ml，约2.0mg/ml，约2.2mg/ml，约2.4mg/ml，约2.6mg/ml，约2.8mg/ml，约3.0mg/ml，约3.2mg/ml，约3.4mg/ml，约3.6mg/ml，约3.8mg/ml，约4.0mg/ml，约4.2mg/ml，约4.4mg/ml，约4.6mg/ml，约4.8mg/ml，约5.0mg/ml，约5.2mg/ml，约5.5mg/ml，约6.0mg/ml，至少约0.8mg/ml，至少约0.85mg/ml，至少约0.9mg/ml，至少约1.0mg/ml，至少约1.1mg/ml，至少约1.2mg/ml，至少约1.3mg/ml，至少约1.4mg/ml，至少约1.5mg/ml，至少约1.6mg/ml，至少约1.7mg/ml等。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质为DOTMA。所述阳离子水包油乳液可含约0.8mg/ml-约10mg/ml的DOTMA。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DOTMA可为约1.7mg/ml至约10mg/ml，约1.8mg/ml至约10mg/ml，约2.0mg/ml至约10mg/ml，约2.2mg/ml至约10mg/ml，约2.4mg/ml至约10mg/ml，约2.6mg/ml至约10mg/ml，约2.8mg/ml至约10mg/ml，约3.0mg/ml至约10mg/ml，约3.2mg/ml至约10mg/ml，约3.4mg/ml至约10mg/ml，约3.6mg/ml至约10mg/ml，约4.0mg/ml至约10mg/ml，约4.4mg/ml至约10mg/ml，约4.8mg/ml至约10mg/ml，约5mg/ml至约10mg/ml，约1.7mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约5mg/ml，约1.8mg/ml至约6mg/ml，约1.8mg/ml至约7mg/ml，约1.8mg/ml至约8mg/ml，约1.8mg/ml至约9mg/ml，约1.7mg/ml，约1.8mg/ml，约2.0mg/ml，约2.2mg/ml，约2.4mg/ml，约2.6mg/ml，约2.8mg/ml，约3.0mg/ml，约3.2mg/ml，约3.4mg/ml，约3.6mg/ml，约3.8mg/ml，约4.0mg/ml，约4.2mg/ml，约4.4mg/ml，约4.6mg/ml，约4.8mg/ml，约5.0mg/ml，约5.2mg/ml，约5.5mg/ml，约6.0mg/ml，至少约0.8mg/ml，至少约0.85mg/ml，至少约0.9mg/ml，至少约1.0mg/ml，至少约1.1mg/ml，至少约1.2mg/ml，至少约1.3mg/ml，至少约1.4mg/ml，至少约1.5mg/ml，至少约1.6mg/ml，至少约1.7mg/ml等。
如上所述，上述脂质的浓度根据制备乳液所用脂质的初始量确定。本领域应理解终产物(如待给予的包装、灭菌乳液)中油的实际浓度可能稍低，有时相差最多达约10%，最多达约20%，最多达约25%，或最多达约35%。
C.油:脂质比例
本发明所述阳离子水包油乳液具有限定的油:脂质比例。例如，所述乳液的油:脂质的比例(摩尔:摩尔)可为至少约8:1(摩尔:摩尔)，至少约8.5:1(摩尔:摩尔)，至少约9:1(摩尔:摩尔)，至少约9.5:1(摩尔:摩尔)，至少约10:1(摩尔:摩尔)，至少约10.5:1(摩尔:摩尔)，至少约11:1(摩尔:摩尔)，至少约11.5:1(摩尔:摩尔)，至少约12:1(摩尔:摩尔)，至少约12.5:1(摩尔:摩尔)，至少约13:1(摩尔:摩尔)，至少约13.5:1(摩尔:摩尔)，至少约14:1(摩尔:摩尔)，至少约14.5:1(摩尔:摩尔)，至少约15:1(摩尔:摩尔)，至少约15.5:1(摩尔:摩尔)，至少约16:1(摩尔:摩尔)，至少约16.5:1(摩尔:摩尔)，至少约17:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约50:1(摩尔:摩尔)，约9:1(摩尔:摩尔)到约50:1(摩尔:摩尔)，约10:1(摩尔:摩尔)到约50:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约49:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约48:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约47:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约46:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约45:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约44:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约42:1(摩尔:摩尔)，约8:1(摩尔:摩尔)到约41:1(摩尔:摩尔)，约9:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约11:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约12:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约13:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约14:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约15:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约16:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约17:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)等。
需要时，所述乳液的油:脂质比例(摩尔:摩尔)可为至少约4:1(摩尔:摩尔)，至少约4.2:1(摩尔:摩尔)，至少约4.5:1(摩尔:摩尔)，至少约5:1(摩尔:摩尔)，至少约5.5:1(摩尔:摩尔)，至少约6:1(摩尔:摩尔)，至少约6.5:1(摩尔:摩尔),7:1(摩尔:摩尔)，至少约7.5:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约50:1(摩尔:摩尔)，约5:1(摩尔:摩尔)到约50:1(摩尔:摩尔)，约6:1(摩尔:摩尔)到约50:1(摩尔:摩尔)，约7:1(摩尔:摩尔)到约50:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约49:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约48:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约47:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约46:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约45:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约44:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约42:1(摩尔:摩尔)，约4:1(摩尔:摩尔)到约41:1(摩尔:摩尔)，约5:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约6:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)，约7:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)等。
有时候，会需要在提高阳离子脂质浓度(从而提高乳液颗粒所加载核酸分子的量)和体内给予时所述脂质的毒性或耐受性之间取得平衡。例如，已有报道高剂量的DOTAP可能具有毒性作用。参见例如Lappalainen等，Pharm.Res.，卷11(8):1127-31(1994)。特定乳液中脂质剂量的最优范围可用根据熟练临床医师的认识来确定。
若油含有多种分子的混合物，所述油的摩尔浓度可根据油的平均分子量来计算。例如，大豆油的平均分子量(292.2)可按照平均脂肪酸分布(棕榈酸重量百分比为12%；亚麻酸重量百分比为52%；等等)，以及各组分的平均分子量来算出。
C.其它组分
本文所述阳离子水包油乳液还可包含其它组分。例如，所述乳液可包含能促进颗粒形成、改善带负电分子和阳离子颗粒之间的复合、或增强带负电分子稳定性（如防止RNA分子降解）的组分。需要时，所述阳离子水包油乳液可含有抗氧化剂，如柠檬酸盐、抗坏血酸或其盐。
表面活性剂
在某些实施方式中，本文所述阳离子水包油乳液还包含表面活性剂。
大量表面活性剂已用于药物科学。这些包括天然衍生的材料如树胶、植物蛋白、基于糖的聚合物如海藻酸盐等。在碳主链上具有氢氧根或其它亲水取代基的某些氧聚合物或聚合物具有表面活性剂活性，例如聚维酮、聚乙烯醇和基于醇醚的单和多官能化合物。离子型或非离子型去污剂和长链脂肪酸衍生化合物也可用于本发明。
合适表面活性剂的特定例子包括下列：
1.水溶性皂如高级脂肪酸(C10-C22)的钠、钾、铵和烷醇铵的盐，尤其是钠和钾牛脂和椰子皂。
2.阴离子合成非皂表面活性剂，其可由有机硫磺酸反应产物的水溶性盐代表，其分子结构中具有含约8-22碳原子的烷基基团和选自磺酸和硫酸酯基团的基团。这些的示例是源自牛脂或椰子油的烷基硫酸钠或钾；烷基苯磺酸钠或钾；烷基甘油醚磺酸钠；椰子油脂肪酸甘油单磺酸或硫酸钠；1摩尔高级脂肪醇和约1-6摩尔环氧乙烷的反应产物的硫酸酯的钠或钾盐；烷基苯酚环氧乙烷醚磺酸钠或钾，每分子具有1-10单元的环氧乙烷且其中所述烷基基团含8-12个碳原子；脂肪酸以羟乙基磺酸酯化并以氢氧化钠中和的反应产物；甲基牛磺酸的脂肪酸酰胺的钠或钾盐；和SO3-磺化C10-C24α-烯烃的钠和钾盐。
3.环氧烷基团与有机疏水化合物缩合产生的非离子合成表面活性剂。典型疏水基团包括环氧丙烷与丙二醇、烷基酚的缩合产物，环氧丙烷和乙二胺的缩合产物，具有8-22个碳原子的脂族醇和脂肪酸的酰胺。
4.具有半极性特征的非离子表面活性剂，如氧化胺、氧化膦和亚砜。长链氧化叔胺的具体示例包括二甲基十二烷基氧化胺和二(2-羟乙基)-十二烷基胺。氧化膦的具体示例参见1967年2月14日授权的美国专利号3,304,263，且包括二甲基十二烷基氧化膦和二甲基-(2羟基十二烷基)氧化膦。
5.长链亚砜，包括对应化学式R1—SO—R2的那些，其中R1和R2由烷基基团取代或未取代，前者含约10-约28碳原子，而R2含1-3碳原子。这些亚砜的具体示例包括十二烷基甲基亚砜和3-羟基十三烷基甲基亚砜。
6.两性合成表面活性剂如3-十二烷基氨基丙酸钠和3-十二烷基氨基丙烷磺酸钠。
7.两性离子合成表面活性剂，如3-(N,N-二甲基-N-十六烷基胺基)丙烷-1-磺酸盐和3-(N,N-二甲基-N-十六烷基胺基)-2-羟丙烷-1-磺酸盐。
此外，下述类型的表面活性剂都可用于本发明的组合物：(a)脂肪酸、松香酸和妥尔油的皂(即碱性盐)；(b)烷基芳烃磺酸盐；(c)烷基硫酸盐，包括具有支链和直链疏水基团以及一代和二代硫酸基团的表面活性剂；(d)疏水与亲水基团之间含中间连接的硫酸盐/酯和磺酸盐/酯，如脂肪酰基化的甲基牛磺酸和硫酸化的脂肪甘油单酯；(e)聚乙二醇的长链酸酯，尤其是妥儿油酯；(f)烷基酚的聚乙二醇醚；(g)长链醇和硫醇的聚乙二醇醚；和(h)脂肪酰基二乙醇氨。由于表面活性剂可用多于一种方法分类，本段所列的许多表面活性剂类别与前述的表面活性剂类别有重叠。
有许多为生物条件特别设计且常用于生物条件的表面活性剂。此类表面活性剂分为四种基本类型：阴离子、阳离子、两性离子(两性)和非离子。示例性阴离子表面活性剂包括例如，全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)，烷基硫酸盐如十二烷基硫酸钠(SDS)或月桂基硫酸铵，月桂醇聚醚硫酸钠(也称月桂基醚硫酸钠，SLES)，烷基苯磺酸盐和脂肪酸盐。示例性阳离子表面活性剂包括例如，烷基三甲基铵盐如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB，或十六烷基溴化三甲基铵)，氯化鲸蜡基吡啶
Figure BDA0000453594540000241
(CPC)，聚乙氧基化牛油胺(POEA)，苯扎氯铵(BAC)和苄索氯铵(BZT)。示例性两性离子(两性)表面活性剂包括例如，十二烷基甜菜碱，椰油酰胺丙基甜菜碱和椰油两性甘氨酸盐。示例性非离子型表面活性剂包括例如，烷基聚(环氧乙烷)、烷基苯酚聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物[商品名为泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine)]、烷基聚葡萄糖苷(如辛基葡萄糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(例如鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA，
Figure BDA0000453594540000242
F68(聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)和聚山梨醇酯，如吐温(Tween)-20(聚山梨醇酯20)、吐温-80(聚山梨醇酯80)、十二烷基二甲基氧化胺和琥珀酸维生素E生育酚丙二醇(维生素ETPGS)。
一组特别有用的表面活性剂是基于去水山梨糖醇的非离子表面活性剂。这些表面活性剂通过山梨糖醇脱水产生1,4-去水山梨糖醇，然后与一种或多种脂肪酸等价物反应来制得。脂肪酸取代的部分还可与环氧乙烷反应产生第二组表面活性剂。
制备脂肪酸取代的去水山梨糖醇表面活性剂是通过1,4-去水山梨糖醇和脂肪酸如月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸或相似长链脂肪酸反应，产生1,4-去水山梨糖醇单酯、1,4-去水山梨糖醇倍半酯或1,4-去水山梨糖醇三酯。这些表面活性剂的常用名包括例如去水山梨糖醇单月桂酸酯、去水山梨糖醇单棕榈酯、去水山梨糖醇单硬脂酸酯、去水山梨糖醇单油酸酯、去水山梨糖醇倍半油脂和去水山梨糖醇三油酸酯。这些表面活性剂市售可得，名为
Figure BDA0000453594540000243
或
Figure BDA0000453594540000244
，通常有字母或数字标号来区别各种单、双和三酯取代去水山梨糖醇。
和
Figure BDA0000453594540000246
表面活性剂是亲水的并通常可溶或可分散在油中。它们还可溶于大多数有机溶剂。在水中它们通常不可溶但可分散。通常这些表面活性剂的亲水-亲脂平衡(HLB)数为1.8-8.6。此类表面活性剂可通过本领域已知的手段方便地制得或市售可得。
一组相关表面活性剂包含聚氧乙烯(olyoxyethylene)去水山梨糖醇单酯和聚氧乙烯去水山梨糖醇三酯。这些材料通过添加环氧乙烷到1,4-去水山梨糖醇单酯或三酯中来制备。添加聚氧乙烯将亲酯去水山梨糖醇单或三酯表面活性剂转变为亲水表面活性剂，后者通常可溶或可分散在水中并以不同程度可溶于有机液体中。
这些材料以商标
Figure BDA0000453594540000251
市售可得，可用于制备水包油乳液和分散体，或用于溶解油并使无水药膏变为水溶性或可清洗。
Figure BDA0000453594540000252
表面活性剂可与相关去水山梨糖醇单酯或三酯表面活性剂组合以促进乳液稳定性。
Figure BDA0000453594540000253
表面活性剂的HLB值通常落在9.6-16.7之间。表面活性剂可市售购得。
可单独使用或与SPANS、
Figure BDA0000453594540000255
和
Figure BDA0000453594540000256
表面活性剂联用的第三组非离子表面活性剂是通过环氧乙烷与长链脂肪酸反应制得的聚氧乙烯脂肪酸。该类型的最常见表面活性剂是名为
Figure BDA0000453594540000257
的固体并且是硬脂酸的聚氧乙烯衍生物。
Figure BDA0000453594540000258
表面活性剂是亲水的且可溶或可分散在水中，类似
Figure BDA0000453594540000259
表面活性剂。表面活性剂可与
Figure BDA00004535945400002510
表面活性剂或与
Figure BDA00004535945400002512
或
Figure BDA00004535945400002513
表面活性剂混合物相混用于形成乳液。
Figure BDA00004535945400002514
表面活性剂可通过本领域已知方法制备或市售购得。
第四组基于聚氧乙烯的非离子表面活性剂是衍生自月桂酰、乙酰、硬脂酰、和油酰醇的聚氧乙烯脂肪酸醚。这些材料如上通过添加环氧乙烷到脂肪醇中来制备。这些表面活性剂的商品名为
Figure BDA00004535945400002515
表面活性剂可为亲水或亲酯，取决于所述表面活性剂中聚氧乙烯部分的大小。这些化合物的制备在本领域可得，同时其还可容易地获自商业来源。
可潜在使用的其它非离子表面活性剂是例如，聚氧乙烯、多元醇脂肪酸酯、聚氧乙烯醚、聚氧丙烯脂肪醚、含聚氧乙烯的蜂蜡衍生物、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯脂肪甘油酯、丙三醇脂肪酸酯或12-22碳原子长链脂肪酸的其他聚氧乙烯酸醇或醚衍生物。
由于本发明的乳液和制剂意在为多相系统，优选选择形成乳液的非离子表面活性剂，其HLB值在约7-16范围内。该值可通过使用单一非离子表面活性剂如
Figure BDA00004535945400002516
表面活性剂来获得，或可通过使用表面活性剂混合物来实现例如有基于去水山梨糖醇单、双或三酯的表面活性剂；去水山梨糖醇酯聚氧乙烯脂肪酸；去水山梨糖醇酯与聚氧乙烯羊毛脂衍生表面活性剂组合；去水山梨糖醇酯表面活性剂与高HLB聚氧乙烯脂肪醚表面活性剂组合；或聚乙烯脂肪醚表面活性剂或聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸。
在某些实施方式中，乳液含单一非离子表面活性剂，最具体的是
Figure BDA0000453594540000261
表面活性剂，因为所述乳液稳定非离子表面活性剂。在示例性实施方式中，乳液含
Figure BDA0000453594540000262
80，或称为聚山梨酯80或聚氧乙烯20去水山梨糖醇单酯。在其它实施方式中，乳液含两种或多种非离子表面活性剂，尤其是
Figure BDA0000453594540000263
表面活性剂和
Figure BDA0000453594540000265
表面活性剂。在示例性实施方式中，乳液含
Figure BDA0000453594540000264
80和
Figure BDA0000453594540000266
水包油乳液可包含约0.01%-约2.5%表面活性剂(w/v)，约0.01%-约2%表面活性剂，0.01%-约1.5%表面活性剂，0.01%-约1%表面活性剂，0.01%-约0.5%表面活性剂，0.05%-约0.5%表面活性剂，0.08%-约0.5%表面活性剂，约0.08%表面活性剂，约0.1%表面活性剂，约0.2%表面活性剂，约0.3%表面活性剂，约0.4%表面活性剂，约0.5%表面活性剂，约0.6%表面活性剂，约0.7%表面活性剂，约0.8%表面活性剂，约0.9%表面活性剂，或约1%表面活性剂。
替换或补充地，所述水包油乳液可包含0.05%-约1%、0.05%-约0.9%、0.05%-约0.8%、0.05%-约0.7%、0.05%-约0.6%、0.05%-约0.5%、约0.08%、约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、或约1%(w/v)吐温80(聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油脂)。
在一个示例性实施方式中，所述水包油乳液含0.08%(w/v)吐温80(聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油脂)。
替换或补充地，所述水包油乳液可包含0.05%-约1%、0.05%-约0.9%、0.05%-约0.8%、0.05%-约0.7%、0.05%-约0.6%、0.05%-约0.5%、约0.08%、约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、或约1%(w/v)SPAN85(去水山梨糖醇三油脂)。
所述水包油乳液可包含本文所述表面活性剂的组合。例如，可使用吐温80(聚山梨酯80，聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)和SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)的组合。所述乳液可含不同量的吐温80和SPAN85(如上面示例的那些)或包括等量的这些表面活性剂。例如，所述水包油乳液可含(w/v)约0.05%Tween80和约0.05%SPAN85，约0.1%Tween80和约0.1%SPAN85，约0.2%Tween80和约0.2%SPAN85，约0.3%Tween80和约0.3%SPAN85，约0.4%Tween80和约0.4%SPAN85，约0.5%Tween80和约0.5%SPAN85，约0.6%Tween80和约0.6%SPAN85，约0.7%Tween80和约0.7%SPAN85，约0.8%Tween80和约0.8%SPAN85，约0.9%Tween80和约0.9%SPAN85，或约1%Tween80和约1.0%SPAN85。
在某些实施方式中，所述表面活性剂是聚乙二醇(PEG)-脂质。在其它实施方式中，所述乳液不含PEG-脂质。PEG-脂质，如PEG偶联二烷氧基丙基(PEG-DAA)、PEG偶联二酰甘油(PEG-DAG)、PEG偶联磷脂酰乙醇胺(PE)(PEG-PE)或一些其它磷脂(PEG-磷脂)、PEG偶联神经酰胺(PEG-Cer)、或其组合也可用作表面活性剂(参见例如美国专利号5,885,613；美国专利申请公开号2003/0077829、2005/0175682和2006/0025366)。其它合适的PEG-脂质包括例如PEG-二烷氧基丙基(DAA)脂质或PEG-二酰甘油(DAG)脂质。示例性PEG-DAG脂质包括例如PEG-二月桂酰甘油(C12)脂质、PEG-二肉豆蔻酰甘油(C14)脂质、PEG-二棕榈酰甘油(C16)脂质、或PEG-二硬脂酰甘油(C18)脂质。示例性PEG-DAA脂质包括例如PEG-二月桂酰丙基(C12)脂质、PEG-二肉豆蔻酰丙基(C14)脂质、PEG-二棕榈酰丙基(C16)脂质、或PEG-二硬脂酰丙基(C18)脂质。
PEG根据其分子量分类；例如，PEG2000平均分子量为约2,000道尔顿，PEG5000平均分子量为约5,000道尔顿。PEG可从西格玛化学公司(SigmaChemical Co.)以及其它公司市售获得，包括例如下列：单甲氧基聚乙烯醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙烯醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙烯醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙烯醇-氨基(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙烯醇-三氟乙基磺酸酯(tresylate)(MePEG-TRES)、和单甲氧基聚乙烯醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。此外，单甲氧基聚乙烯醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)对于制备PEG-脂质偶联物，包括例如PEG-DAA偶联物特别有用。
D.水相(连续相)
所述水包油乳液的水相(连续相)是水或水溶液，可包含盐(如NaCl)的水溶液、缓冲剂(如柠檬酸盐缓冲剂)、非离子型等张剂(如糖)、聚合物、表面活性剂或其任意组合。复合前乳液(添加带负电分子前的水包油乳液)的水相可不同于复合后乳液(带负电分子前已与乳液颗粒复合的水包油乳液)的水相。通常，在能促进形成具有所需特性(例如，平均直径，等)颗粒的水性溶剂中制备复合前的乳液。复合前的乳液用水溶液稀释以产生最终的阳离子水包油乳液，所述水溶液含有所述带负电的分子和其它所需组分，所得乳液含有具备所需渗透压和张力的最终水相。所述水相可含有抗氧化剂，如柠檬酸盐、抗坏血酸或其盐。
乳液配制为用于体内给药时，优选补充最终溶液以使所述乳液的张力和渗透压与正常生理液体基本相同，以防止不需要的给药后结果，如肿胀或组合物快速吸收。还优选缓冲所述水相以维持与正常生理条件相容的pH。而且，在某些情况中，可能需要将pH维持在特定水平从而确保乳液中某些组分的稳定性。例如，可能需要制备等张和等渗的乳液。为了控制张力，乳液可包含生理盐如钠盐。例如可使用约0.9%(w/v)的氯化钠(NaCl)(生理盐水)。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。非离子等张剂还可用于控制张力。本领域通常已知许多非离子张力调节剂。这些通常为各种类型的碳水化合物(参见例如Voet和Voet(1990)Biochemistry(《生物化学》)(纽约威立公司(John Wiley&Sons))。分类为醛醣的单糖如葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和核糖，以及分类为酮醣的单糖如果糖、山梨糖和木酮糖可在本发明中用作非离子等张剂。也可使用二糖如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖。此外，醛糖醇(无环多羟基醇，也称为糖醇)如丙三醇、甘露醇、木糖醇和山梨糖醇是本文可用的非离子等张剂。非离子等张调节剂可根据所用试剂以约0.1%-约10%或约1%-约10%的浓度存在。
水相可带缓冲。本文可用任何生理上可接受的缓冲液，如水、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液等。水性组分的pH优选为6.0-8.0，更优选约6.2-约6.8。在示例性实施方式中，所述缓冲液为pH6.5的10mM柠檬酸盐缓冲液。在另一示例性实施方式中，所述水相为无RNA酶的水或DEPC处理水或所述缓冲液由其制备。在一些情况中，缓冲液中的高盐可干扰带负电分子与所述乳液颗粒的复合因此需避免。在其它情况中，缓冲液中可包括一定量的盐。
在示例性实施方式中，所述缓冲液为pH6.5的10mM柠檬酸盐缓冲液。需要时所述水相为无RNA酶的水或DEPC处理水或所述缓冲液由其制备。
所述水相还可包含其它组分如改变水相渗透压的分子或稳定复合后带负电分子的分子。优选地，所述水相的渗透压用非离子等张剂调节，所述等张剂如糖(如海藻糖、蔗糖、右旋糖、果糖、还原帕拉金糖等)、糖醇(如甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、丙三醇等)。需要时可使用非离子聚合物(如聚(烷基醇)例如聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丁烯醇)或非离子表面活性剂。
在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液的水相可包括聚合物或表面活性剂或其组合。在示例性实施方式中，所述水包油乳液含泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。泊洛沙姆又称为商品名聚合物。泊洛沙姆聚合物可导致RNA复合后RNA分子的更高稳定性并增强对RNA酶的抗性。
替代或补充地，所述阳离子水包油乳液可包含约0.1%-约20%(w/v)聚合物、或约0.05%-约10%(w/v)聚合物。例如，所述阳离子水包油乳液可含有聚合物(例如泊洛沙姆如
Figure BDA0000453594540000292
F127((环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物：H(OCH2CH2)x(OCH3CH(CH3))y(OCH2CH2)zOH))约0.1%到约20%(w/v)，约0.1%到约10%(w/v)，约0.05%到约10%(w/v)，或约0.05%到约5%(w/v)。
在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约4%(w/v)、或约8%(w/v)
Figure BDA0000453594540000293
F127。
这些组合物中使用的水性组分的量为使组合物的值合一所需的量。即，足以配至100%的水性组分量与上述其它组分混合，从而将组合物定容。
4.带负电分子
带负电分子被递送时，其可与阳离子水包油乳液的颗粒复合。带负电分子与乳液颗粒通过例如下述方式复合：带负电分子和颗粒表面上阳离子脂质之间的相互作用，以及带负电分子和颗粒表面的疏水/亲水相互作用。尽管不希望受限于任何具体理论，据信带负电分子通过非共价、离子电荷相互作用(静电力)与所述阳离子脂质相互作用，而且复合物的强度以及可与颗粒复合的带负电化合物量与颗粒中阳离子脂质的含量有关。此外，带负电分子和颗粒表面的疏水/亲水相互作用也可发挥作用。
带负电分子的示例包括带负电肽、多肽或蛋白质、核酸分子(如单或双链RNA或DNA)、小分子(如小分子免疫增强剂(SMIP)、膦酸盐、氟代膦酸盐等)等。在优选的方面，带负电分子是RNA分子，如编码肽、多肽或蛋白质的RNA，包括自复制RNA分子或小干扰RNA。
可使用本领域已知的技术形成复合物，其示例在本文中有描述。例如，核酸-颗粒复合物可通过混合阳离子乳液与核酸分子来形成，例如通过涡旋。乳液中带负电分子和阳离子脂质的含量可调节或优化以提供所需的结合强度和结合容量。例如，如本文所述和所示例，示例性RNA-颗粒复合物通过改变RNA:阳离子脂质的比例(按“N/P比”所测得)来产生。术语N/P比指可质子化氮原子在阳离子脂质中的含量(摩尔)除以RNA上磷酸盐的含量(摩尔)。
优选的N/P比为约1:1-约20:1、约2:1-约18:1、约3:1to16:1、约4:1-约14:1、约6:1-约12:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1或约16:1。或者，优选的N/P比为至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约11:1、至少约12:1、至少约13:1、至少约14:1、至少约15:1或至少约16:1。更优选的N/P比为约4:1或更高。
各乳液可具有其自身最优或优选的N/P比来产生所需效果(如表达所复合RNA所需要的水平)，这可通过实验确定(例如使用本文所述试验或本领域已知的其他技术，如通过检测RNA所编码蛋白的表达水平或检测肝素存在时从复合物中释放的RNA分子百分比)。通常，N/P比的值应使RNA-颗粒复合物被细胞摄取时，从RNA-颗粒复合物中释放至少约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%的RNA分子。在一些实施方式中，N/P比的值使RNA-颗粒复合物被细胞摄取时，从RNA-颗粒复合物中释放至少0.5%或至少1%的RNA分子。
RNA分子所编码抗原的表达水平不一定与所述抗原的免疫原性相关联。此类情况中，就免疫原性而言的最优或优选N/P比可通过例如测定具体抗体效价来确定。
本文所述阳离子水包油乳液尤其适于配制基于核酸的疫苗(如DNA疫苗，RNA疫苗)。核酸-乳液颗粒复合物的形成有利于宿主细胞摄入核酸，并保护所述核酸分子免受核酸酶降解。转染的细胞随后可表达所述核酸分子编码的抗原，其可产生对所述抗原的免疫应答。与活或减毒病毒类似，基于核酸的疫苗可有效参与MHC-I和MHC-II通路，能诱导CD8+和CD4+T细胞响应，而以可溶形式存在的抗原如重组蛋白通常仅诱导抗体响应。
在某些实施方式中，本文所述的带负电分子为RNA分子。在某些实施方式中，RNA分子编码抗原(肽、多肽或蛋白)且阳离子水包油乳液适于用作基于RNA的疫苗。组合物可包含多于一种编码抗原的RNA分子，例如，与乳液颗粒复合的2、3、5或10种不同RNA分子。即，所述组合物可含一种或多种不同种类的RNA分子，每个RNA分子编码不同的抗原。替代或补充地，一种RNA分子还可编码多于一种抗原，例如，编码不同或相同抗原的双顺反子或三顺反子RNA分子。因此，所述阳离子水包油乳液适用作基于RNA的单价或多价疫苗。需要时，所述RNA分子可以是多顺反子。
RNA分子的序列可经密码子优化或去优化以在需要的宿主如人细胞中表达。
RNA分子的序列可按需修饰，例如为了提高RNA表达或复制的效力或提供对于降解的额外稳定性或抗性。例如，RNA序列可针对其密码子使用来修饰，例如用于提高RNA的翻译效力和半衰期。聚A尾(如具有约30个或更多个腺嘌呤残基)(SEQ ID NO:28)可连接在RNA的3'末端以提高其半衰期。RNA的5'末端可用修饰的核糖核苷酸加帽，所述修饰的核糖核苷酸具有结构m7G(5')ppp(5')N(帽0结构)或其衍生物，其可在RNA合成中纳入或可在RNA转录后用酶促方法工程改造(如通过使用由mRNA三磷酸酶、鸟苷酰基-转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成的痘苗病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构在维持RNA分子的稳定性和翻译效力中起重要作用。RNA分子的5'帽还可由2'-O-甲基转移酶修饰，该修饰生成帽1结构(m7Gppp[m2'-O]N)，其可进一步提高翻译效力。
需要时，RNA分子可在任何5’帽结构外还包括一种或多种修饰的核苷酸。哺乳动物RNA上发现有超过96种天然产生的核苷酸修饰。参见例如，Limbach等，Nucleic Acids Research,22(12):2183-2196(1994)。核苷酸和经修饰核苷酸及核苷的制备为本领域熟知，例如美国专利号4373071、4458066、4500707、4668777、4973679、5047524、5132418、5153319、5262530、5700642，其都通过引用全文纳入本文，并且许多修饰的核苷和修饰的核苷酸市售可得。
经修饰核苷和核苷酸中可纳入且存在于RNA分子中的经修饰核碱基包括：m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫尿苷)、Um(2'-O-甲基尿苷)、m1A(l-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2-1-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲基硫-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲基硫-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲基硫-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲基硫-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲基硫-N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基腺苷)；Ar(p)(2'-O-核糖基腺苷(磷酸盐))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m'Im(1,2'-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2T-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫胞苷)；ac4C(N4-乙酰胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4乙酰2TO甲基胞苷)；k2C(赖胞苷)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2'-O-甲基鸟苷)；m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2'-O-二甲基鸟苷)；m22Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐))；yW(怀丁苷(wybutoxosine))；o2yW(过氧化怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不足的羟基怀丁苷)；imG(丫苷)；mimG(甲基鸟苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖-辫苷)；preQo(7-氰基-7-脱氮(deaza)鸟苷)；preQi(7-氨甲基-7-脱氮鸟苷)；G*(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫尿苷)；s2Um(2-硫-2'-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-氧乙酸)；mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨甲基-2-硒尿苷)；ncm5U(5-氨甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)；cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-O甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷)；m62A(N6,N6-二甲基腺苷)；Tm(2'-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧甲基尿苷)；m6Am(N6,T-O-二甲基腺苷)；rn62Am(N6,N6,O-2-三甲基腺苷)；m2'7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2'2'7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2T-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2'-O-二甲基鸟苷)；m'Am(1,2-O-二甲基腺苷)伊立(irino)甲基尿苷)；tm5s2U(S-牛磺(taurino)甲基-2-硫尿苷))；imG-14(4-去甲基鸟苷)；imG2(异鸟苷)；ac6A(N6-乙酰腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、其7-取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-氮杂-7-取代的嘌呤、7-氮杂-8-取代的嘌呤、氢(脱碱基残基)、m5C、m5U、m6A、s2U、W、或2'-O-甲基-U。许多这些经修饰核碱基和其对应的核糖核苷从市场供应商可得。参见例如WO2011/005799，其通过引用全文纳入本文。
需要时，RNA分子可含有氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯连接。
在一些实施方式中，RNA分子不包括修饰的核苷酸，如不包括修饰的核碱基，且RNA分子中所有核苷酸均为常规标准核糖核苷酸A、U、G和C，除了可包括的任选5'帽，例如7-甲基鸟苷。在其他实施方式中，该RNA可包括含7-甲基鸟苷的5'帽，且起始1、2或3个5'核糖核苷酸可在核糖的2'位置被甲基化。
A.自复制RNA
在一些方面，阳离子水包油乳液含自复制RNA分子。在某些实施方式中，所述自复制RNA分子源自或基于α病毒。
自复制RNA分子为本领域熟知且可通过使用源自例如α病毒的复制元件并用编码感兴趣蛋白的核苷酸序列取代结构病毒蛋白来产生。用自复制RNA转染的细胞简短生成抗原后经历细胞凋亡性死亡。此类死亡可能是必需双链(ds)RNA中间体的结果，这在超活化的树突细胞中也观察到。因此，自复制RNA的免疫原性增强可能是促炎dsRNA生成的结果，所述促炎dsRNA生成模仿RNA病毒感染宿主细胞。
有利地，细胞机制被自复制RNA分子用于产生指数式增长的编码基因产物，如蛋白质或抗原，其可在细胞中积累或从细胞分泌。通过自复制RNA分子过表达蛋白质或抗原可利用免疫刺激佐剂效应，包括通过RNA复制和扩增以及翻译的产物刺激toll样受体(TLR)3、7和8和非TLR通路(如RIG-1、MD-5)，其诱导转染细胞的凋亡。
所述自复制RNA通常含至少一种或多种选自下组的基因：病毒复制酶、病毒蛋白酶、病毒解旋酶和其他非结构性病毒蛋白，还含有5’-和3’-末端顺式激活复制序列，和若需要时，编码所需氨基酸序列(如感兴趣的抗原)的异源序列。引导所述异源序列表达的亚基因组启动子可包括在所述自复制RNA中。如果需要，所述异源序列(如感兴趣的抗原)可与其他编码区域框内融合在所述自复制RNA中和/或可在内部核糖体进入位点(IRES)的控制下。
在某些实施方式中，所述自复制RNA分子未包封在病毒样颗粒中。本发明的自复制RNA分子可设计成使得所述自复制RNA分子不能诱导感染性病毒颗粒生成。这可通过例如省略所述自复制RNA中病毒颗粒生成所必需的编码结构蛋白的一种或多种病毒基因来实现。例如，在所述自复制RNA分子基于α病毒如辛德毕斯病毒(SIN)、西门利克森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)时，可省略编码病毒结构蛋白如衣壳和/或包膜糖蛋白的一种或多种基因。
如果需要，本发明的自复制RNA分子可设计成诱导生成减毒或毒性的感染性病毒颗粒，或生成能进行单轮后续感染的病毒颗粒。
在递送到脊椎动物细胞时，自复制RNA分子能通过其自身(或其自身的反义拷贝)转录导致生成多个子RNA。所述自复制RNA递送到细胞后能直接翻译，且该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，所述酶然后从所递送的RNA生成转录本。因此所递送RNA引起多个子RNA的生成。这些转录本相对所递送RNA为反义且其自身可翻译以提供基因产物的原位表达，或可转录以进一步提供与所递送RNA同义的转录本，其经翻译提供基因产物的原位表达。
实现自复制的一种合适系统为使用基于α病毒的RNA复制子。α病毒包括披盖病毒科的一组遗传、结构和血清学上相关的节肢动物媒介病毒。α病毒属内已鉴定26种已知的病毒和病毒亚型，包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、西门利克森林病毒(Semliki Forest virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)。因此，本发明的自复制RNA可纳入源自西门利克森林病毒(SFV)、辛德毕斯病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、罗斯河病毒(RRV)、或其它属于α病毒科病毒的RNA复制酶。
基于α病毒的“复制子”表达载体可用于本发明。复制子载体可以数种形式利用，包括DNA、RNA和重组复制子颗粒。这类复制子载体源自包括例如下列的α病毒：辛德毕斯病毒(Xiong等(1989)Science243:1188-1191；Dubensky等，(1996)J.Virol.70:508-519；Hariharan等(1998)J.Virol.72:950-958；Polo等(1999)PNAS96:4598-4603)、西门利克森林病毒(Liljestrom(1991)Bio/Technology9:1356-1361；Berglund等(1998)Nat.Biotech.16:562-565)、和委内瑞拉马脑炎病毒(Pushko等(1997)Virology239:389-401)。α病毒来源的复制子通常整体特征(如结构、复制)非常相似，个体α病毒可表现一些独特的具体特性(如受体结合、干扰素敏感性和疾病概况)。因此，采用不同病毒科制备的嵌合α病毒复制子也可是有用的。
基于α病毒的复制子是(+)链复制子，可在递送到细胞后翻译以得到复制酶(或复制酶-转录酶)。这些复制酶翻译为能自切割产生复制复合物的聚蛋白，该复合物形成该(+)链递送RNA的基因组(–)链拷贝。这些(-)链转录本可自身转录以得到所述(+)链亲本RNA的其他拷贝和产生编码所需基因产物的亚基因组转录本。所述亚基因组转录本的翻译因此引起所述感染细胞原位表达所需基因产物。合适的α病毒复制子可使用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。
因此优选的自复制RNA分子编码(i)可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)多肽抗原。所述聚合酶可为α病毒复制酶例如包括α病毒蛋白nsP4。
尽管除了所述非结构复制酶，天然α病毒基因组还编码结构病毒体蛋白，但本发明中基于α病毒的自复制RNA分子优选不编码α病毒结构蛋白。因此所述自复制RNA可引起细胞中基因组RNA拷贝的自我生成，但不引起含RNA的α病毒病毒体的生成。不能生成这些病毒体说明，不同于野生型α病毒，自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。野生型病毒永存必需的α病毒结构蛋白在本发明的自复制RNA中缺失，且他们的位置被编码所需基因产物的基因占据，从而所述亚基因组转录本编码所需要的基因产物而不是所述结构α病毒病毒体蛋白。
因此，本发明有用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码多肽抗原。在一些实施方式中，所述RNA可具有额外的(下游)开放阅读框如编码其它需要的基因产物。自复制RNA分子可具有与所编码复制酶相容的5'序列。
在其他方面，所述自复制RNA分子源自或基于α病毒以外的病毒，优选正链RNA病毒，更优选小RNA病毒、黄病毒、风疹病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼状病毒或冠状病毒。合适的野生型α病毒序列熟知且可从序列保藏机构如马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)获得。合适α病毒的代表性示例包括奥拉病毒(ATCC VR-368)、贝巴鲁病毒(ATCC VR-600、ATCC VR-1240)、犰狳病毒(ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒(ATCC VR-64、ATCC VR-1241)、东方马脑脊髓炎病毒Eastern equineencephalomyelitis virus)(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒(ATCCVR-924)、格塔病毒(ATCC VR-369、ATCC VR-1243)、克泽拉格齐病毒(ATCCVR-927)、马亚罗(Mayaro)(ATCC VR-66)、马亚罗病毒(ATCC VR-1277)、米德尔堡病毒(Middleburg)(ATCC VR-370)、穆坎博病毒(ATCC VR-580、ATCCVR-1244)、恩杜姆病毒(Ndumu)(ATCC VR-371)、皮春纳病毒(ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、罗斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、西门利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德比斯病毒(ATCC VR-68、ATCCVR-1248)、托纳特(ATCC VR-925)、特里尼蒂病毒(ATCC VR-469)、乌纳病毒(ATCC VR-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-69、ATCC VR-923、ATCC VR-1250ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西马脑脊髓炎病毒(ATCCVR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、沃达罗河病毒(ATCCVR-926)和Y-62-33(ATCC VR-375)。
本发明的自复制RNA分子比其它类型RNA(如mRNA)更大。通常，本发明的自复制RNA分子含至少约4kb。例如，自复制RNA可含至少约5kb、至少约6kb、至少约7kb、至少约8kb、至少约9kb、至少约10kb、至少约11kb、至少约12kb或多于12kb。在某些示例中，自复制RNA为约4kb-约12kb、约5kb-约12kb、约6kb-约12kb、约7kb-约12kb、约8kb-约12kb、约9kb-约12kb、约10kb-约12kb、约11kb-约12kb、约5kb-约11kb、约5kb-约10kb、约5kb-约9kb、约5kb-约8kb、约5kb-约7kb、约5kb-约6kb、约6kb-约12kb、约6kb-约11kb、约6kb-约10kb、约6kb-约9kb、约6kb-约8kb、约6kb-约7kb、约7kb-约11kb、约7kb-约10kb、约7kb-约9kb、约7kb-约8kb、约8kb-约11kb、约8kb-约10kb、约8kb-约9kb、约9kb-约11kb、约9kb-约10kb或约10kb-约11kb。
本发明的自复制RNA分子可包括一种或多种修饰核苷酸(如假尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷)。
自复制RNA分子可编码单一多肽抗原，或可选地，以各自序列在表达为氨基酸序列保持其特性的方式连接在一起(如顺序连接)的两种或更多种多肽抗原。从自复制RNA产生的多肽随后可生成为融合多肽或以产生分开多肽或肽序列的方法被工程改造。
本发明的自复制RNA可编码一种或多种含一定范围表位的多肽抗原。优选能引起辅助T细胞响应或细胞毒性T细胞响应或二者的表位。
本文所述自复制RNA分子可进行工程改造以从两个或更多开放阅读框表达多个核苷酸序列，从而使共表达蛋白，例如两种或更多抗原和细胞因子或其它免疫调节剂一起表达，这可增强免疫应答的产生。该自复制RNA分子可能特别有用，例如用于同时生成不同的基因产物(如蛋白)，如作为二价或多价疫苗。
本发明的自复制RNA分子可用任何合适方法制备。本领域已知生产含修饰核苷酸的RNA分子的数种合适方法。例如，含修饰核苷酸的自复制RNA分子可通过用合适的DNA依赖性RNA聚合酶转录(如体外转录)编码自复制RNA分子的DNA来制得，所述酶例如T7噬菌体RNA聚合酶、SP6噬菌体RNA聚合酶、T3噬菌体RNA聚合酶等，或能将经修饰核苷酸有效纳入RNA分子的这些聚合酶的突变体。所述转录反应将包含核苷酸和修饰的核苷酸，和支持所选聚合酶活性的其它组分，如合适的缓冲液和合适的盐。将核苷酸类似物纳入自复制RNA可经工程改造以(例如)改变此类RNA分子的稳定性、提高对RNA酶的抗性、在导入合适宿主细胞后确立复制(RNA的“感染性”)、和/或诱导或降低先天和适应性免疫应答。
合适的合成方法可单独使用，或与一种或多种其它方法(如重组DNA或RNA技术)联用来生产本发明的自复制RNA分子。合适的从头合成方法为本领域熟知且可调整适用于具体应用。示例性方法包括例如：化学合成，使用合适保护基团例如CEM(Masuda等(2007)Nucleic Acids Symposium Series51:3-4)、β-氰乙基亚磷酸胺方法(Beaucage S L等(1981)Tetrahedron Lett22:1859)；核苷H-磷酸酯方法(Garegg P等(1986)Tetrahedron Lett27:4051-4；Froehler B C等(1986)Nucl Acid Res14:5399-407；Garegg P等(1986)Tetrahedron Lett27:4055-8；Gaffney B L等(1988)Tetrahedron Lett29:2619-22)。这些化学法能运行或调整适用于市售可得的自动核酸合成仪。额外的合适合成方法公开于Uhlmann等(1990)Chem Rev90:544-84，和Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem1:165。核酸合成还可用本领域熟知和常规的合适重组方法进行，所述方法包括多核苷酸和该多核苷酸所编码基因产物的克隆、加工和/或表达。通过随机片段化的DNA改组以及基因片段和合成多核苷酸的PCR重组装是能用于设计和工程改造多核苷酸序列的已知技术示例。可采用定点诱变来改变核酸和所编码的蛋白，例如用于插入新的限制性位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好、产生剪接变体、导入突变等。转录、翻译和表达核酸序列的合适方法为本领域已知且常规。（通常参见，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》),第2卷，Ausubel等编，格林出版集团和威力出版公司(Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience),第13章，1988；Glover，DNA Cloning(《DNA克隆》)，第II卷，华盛顿特区IRL出版社(IRL Press)，第3章，1986；Bitter等，Methodsin Enzymology(《酶学方法》)153:516-544(1987)；The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces(《酿酒酵母分子生物学》)，Strathern等编，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，卷I和II，1982；和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)。冷泉港出版社，1989)。
可用任何合适的方法确定自复制RNA分子中一种或多种经修饰核苷酸的存在和/或含量。例如，自复制RNA可消化成单磷酸酯(如使用核酸酶P1)并去磷酸化(如使用合适的磷酸酶如CIAP)，得到的核苷用反相HPLC分析(例如使用YMC Pack ODS-AQ柱(5微米,4.6X250mm)，且使用梯度洗脱，30%B(0-5分钟)-100%B(5–13分钟)和100%B(13-40)分钟，流速(0.7毫升/分钟)，UV检测(波长:260nm)，柱温(30℃))。缓冲液A（20mM乙酸-乙酸铵，pH3.5），缓冲液B(20mM乙酸-乙酸铵，pH3.5/甲醇[90/10]))。
任选地，本发明的自复制RNA分子可包括一种或多种修饰的核苷酸从而所述自复制RNA分子在引入或进入宿主细胞(如人类细胞)后相比不含修饰核苷酸的对应自复制RNA分子具有更小的免疫调节活性。
若需要，自复制RNA分子可用本领域技术人员已知的各种体外或体内测试方法筛选或分析以确定其治疗和预防特性。例如，含自复制RNA分子的疫苗可就其诱导感兴趣的具体淋巴细胞类型的增殖或效应功能的影响进行测试，所述淋巴细胞类型如B细胞、T细胞、T细胞系和T细胞克隆。例如，可分离经免疫小鼠的脾细胞并分析细胞毒性T淋巴细胞裂解自体靶细胞的能力，所述靶细胞含编码多肽抗原的自复制RNA分子。此外，可通过测量增殖或用ELISA测定TH1(IL-2和IFN-γ)和/或TH2(IL-4和IL-5)细胞因子的生成或直接在CD4+T细胞中通过胞质细胞因子染色和流式细胞术来分析T辅助细胞分化。
还可编码多肽抗原的的自复制RNA分子测试其诱导体液免疫应答的能力，通过例如诱导B细胞产生对感兴趣抗原特异的抗体来证实。这些试验可用例如来自免疫个体的外周B淋巴细胞进行。此类试验方法为本领域技术人员已知。能用于表征本发明自复制RNA分子的其它试验可涉及检测靶细胞所编码抗原的表达。例如，FACS可用于检测细胞表面或胞内的抗原表达。FACS选择的另一优势是可就不同表达水平进行分选；有时可能需要较低的表达。鉴定表达具体抗原的细胞的其它合适方法涉及用平板上的单克隆抗体淘选或用包被有单克隆抗体的磁珠捕获。
B.抗原
在某些实施方式中，本文所述带负电分子是编码抗原的核酸分子(如RNA分子)。合适的抗原包括但不限于细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、原生动物抗原、植物抗原、癌抗原或其组合。
合适的抗原包括来自病原体如病毒、细菌、真菌、原生动物、植物或肿瘤的蛋白和肽。可由自复制RNA分子编码的病毒抗原和免疫原包括但不限于来自下述病毒的蛋白质和肽：正粘病毒如流感病毒A、B和C；副粘病毒科病毒、如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、偏肺病毒和麻疹病毒(如麻疹)；肺炎病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒；副粘病毒如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎病毒、仙台病毒、猴病毒5、牛副流感病毒、尼帕病毒、亨尼帕病毒和新城疫病毒；痘病毒科，包括正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花病毒(Variola vera)(包括但不限于，重型天花(Variolamajor)和轻型天花(Variola minor))；偏肺病毒、如人偏肺病毒(hMPV)和禽偏肺病毒(aMPV)；麻疹病毒如麻疹；小核糖核酸病毒、如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、副肠孤病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒；肠道病毒、如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22型和24型柯萨奇病毒A、1-6型柯萨奇病毒B、1-9、11-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和肠道病毒68-71型、布尼亚病毒、包括正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亚脑炎病毒；白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷热病毒；内罗病毒(Nairovirus)如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagic fever)；嗜肝RNA病毒如甲肝病毒(HAV)；披膜病毒(风疹病毒)、如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒；抗黄病毒、如蜱媒脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、开萨诺森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、国春夏脑炎病毒、波瓦生脑炎病毒的抗原；瘟病毒、如牛病毒性腹泻(BVDV)、经典猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)；肝DNA病毒、如乙肝病毒、丙肝病毒；弹状病毒、如恐水病病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)、杯状病毒、如诺沃克病毒、和诺沃克样病毒、如夏威夷病毒和雪山病毒；冠状病毒，如SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)；逆转录病毒如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒；呼吸道肠道病毒、如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒、或科罗拉多壁虱热病毒(Coltivirus)；细小病毒、如细小病毒B19；丁肝病毒(HDV)；戊肝病毒(HEV)；庚肝病毒(HGV)；人疱疹病毒、如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)、和人疱疹病毒8(HHV8)；乳头状多瘤空泡病毒、如乳头瘤病毒和多瘤病毒、腺病毒和沙粒病毒。
在一些实施方式中，抗原引起的免疫应答针对感染鱼的病毒，如：传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鱼淋巴囊肿病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小RNA样病毒(又称为大西洋鲑鱼小RNA样病毒)、陆封鲑鱼病毒(LSV)、大西洋鲑鱼轮状病毒(ASR)、鳟鱼草莓病病毒(TSD)、银鲑鱼肿瘤病毒(CSTV)、或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。
在一些实施方式中，所述抗原引起的免疫应答针对来自疟原虫(Plasmodium)属的寄生虫，如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵圆疟原虫(P.ovale)。因此本发明可用于针对疟疾的免疫。在一些实施方式中，所述抗原引起的免疫应答针对来自鱼虱科的寄生虫，特别是来自疮痂鱼虱属和鱼虱属的那些，如海虱例如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利鱼虱(Caligus rogercresseyi)。
可由自复制RNA分子编码的细菌抗原和免疫原包括但不限于来自下述的蛋白质和肽：脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)(如鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、破伤风梭菌(Clostridium tetani(破伤风))、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinums(肉毒杆菌))、白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae(白喉))、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetii)、布鲁氏菌(Brucella sp.)(如流产布鲁氏菌(B.abortus)、狗布鲁氏菌(B.canis)、马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)、木鼠布鲁氏菌(B.neotomae)、羊布鲁氏菌(B.ovis)、猪布鲁氏菌(B.suis)和鳍足类海洋布鲁氏菌(B.pinnipediae,))、弗朗西斯氏菌(Francisella sp.)(如新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃楼弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)和土拉热弗朗西斯氏菌(F.tularensis))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、淋病奈瑟球菌(Neiserriagonorrhoeae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum(梅毒))、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、大肠杆菌(E.coli)如产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散性粘着大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC；如尿致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/败血症-相关大肠杆菌(MNEC))、和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)，炭疽杆菌(Bacillus anthracis(炭疽))、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis(鼠疫))、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、立克次体(Rickettsia)、单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi(伤寒))、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorfer)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、克雷伯菌(Klebsiella)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)等。
可由自复制RNA分子编码的真菌抗原和免疫原包括但不限于来自皮肤真菌的蛋白质和肽，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophyton floccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，犬小孢子菌(Microsporum canis)，扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，麦格尼毛癣菌(Trichophyton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，昆克毛癣菌(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)白变种（var.album）、盘状变种（var.discoides）、赭黄变种（var.ochraceum），紫色毛癣菌(Trichophytonviolaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)；或来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微孢子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、肠间隔微孢子虫(Septataintestinalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)；较不常见的是短粒虫属(Brachiola spp.)、微胞子虫属(Microsporidium spp.)、微孢子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophora spp)、气管普孢虫属(Trachipleistophora spp.)、条孢虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌属(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaeaspp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被孢霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)、瓶霉属(Saksenaea spp.)、链格孢菌属(Alternaria spp.)、弯孢菌属(Curvularia spp.)、长蠕孢菌属(Helminthosporium spp.)、镰胞菌属(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、链核盘菌属(Monolinia spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝孢属(Cladosporium spp.)。
可由自复制RNA分子编码的原生动物抗原和免疫原包括但不限于来自痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、贾第鞭毛虫(Giardia lambli)、小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、卡宴环孢子球虫(Cyclospora cayatanensis)和弓形虫(Toxoplasma)的蛋白质和肽。
可由自复制RNA分子编码的植物抗原和免疫原包括但不限于来自蓖麻(Ricinus communis)的蛋白质和肽。
合适的抗原包括来自例如下述病毒的蛋白质和肽：人体免疫缺陷病毒(HIV)、甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、流感病毒(flu)、呼吸道合胞病毒(RSV)、细小病毒、诺如病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、鼻病毒、黄热病毒、狂犬病病毒、登革热病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒(如肠道病毒71)、埃博拉病毒、和牛性腹泻病毒。优选地，抗原物质选自下组：HSV糖蛋白gD、HIV糖蛋白gp120、HIV糖蛋白gp40、HIV p55gag、和来自pol和tat区域的多肽。在本发明其它优选实施方式中，抗原是源自细菌的蛋白质或肽，所述细菌例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae(霍乱))、白喉棒状杆菌(C.diphtheriae(白喉))、破伤风梭菌(C.tetani(破伤风))、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、百日咳博德特菌(B.pertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)等。
可由本发明的自复制RNA分子编码的HIV抗原描述于1990年3月9日提交的美国申请序列号490,858和公开的欧洲申请号181150(1986年5月14日)，以及美国申请序列号60/168,471；09/475,515；09/475,504；和09/610,313，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。
可由本发明的自复制RNA分子编码的巨细胞病毒抗原描述于美国专利号4,689,225，1989年6月16日提交的美国申请序列号367,363和PCT公开WO89/07143，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。
可由本发明的自复制RNA分子编码的丙肝病毒抗原描述于PCT/US88/04125，公开的欧洲申请号318216(1989年5月31日)，1988年11月18日提交的公开日本申请号1-500565，加拿大申请583,561，和EPO388,232，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。一组不同的HCV抗原描述于1990年3月16日提交的欧洲专利申请90/302866.0和1989年12月21日提交的美国申请序列号456,637，和PCT/US90/01348，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中，抗原源自变应原，如花粉变应原(树、草本、杂草和草花粉变应原)；昆虫或蜘蛛变应原(吸入、唾液和毒液变应原如螨虫变应原、蟑螂和蠓变应原、膜翅目昆虫毒液变应原)；动物毛发和皮屑变应原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；和食物变应原(如麸朊)。来自树、草和草本的重要花粉变应原是那些源自分类目壳斗目、木犀目、松杉目和悬铃木目的，包括但不限于白桦(桦属)，赤杨(桤木)，榛子(榛属)，鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)，柳杉(柳杉属和圆柏属)，悬铃木(法国梧桐)，禾本目包括黑麦属、猫尾属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、子虉草属、黑麦属和高粱属的草，菊目和荨麻目包括草本植物豚草属、蒿属和欧蓍草属。其它重要的吸入变应原是来自尘螨属和欧尘螨属的屋尘螨、仓储螨如害嗜鳞螨、食甜螨和食酪螨，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如德国小蠊、大蠊、摇蚊和猫栉头蚤的那些，以及来自哺乳动物如猫、狗和马的那些，毒液变应原包括源自针昆虫或咬虫的那些如源自膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、黄蜂(胡蜂科(Vespidea))和蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原或抗原或者癌免疫原或抗原可由所述自复制RNA分子编码。在某些实施方式中，肿瘤免疫原和抗原是含肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。
适用于本文的肿瘤免疫原和抗原包括各种分子，如(a)含多肽的肿瘤抗原，包括多肽(长度范围可以是(例如)8-20个氨基酸，虽然超出此范围以外的长度也常见)、脂多肽和糖蛋白。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原是例如：(a)与癌细胞相关的全长分子，(b)其同源物和修饰形式，包括含有缺失、添加和/或取代部分的分子，以及(c)其片段。肿瘤免疫原包括例如：CD8+淋巴细胞识别的I型-限制性抗原或CD4+淋巴细胞识别的II型-限制性抗原。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于(a)睾丸癌抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(其可用于例如，检测黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、NSCLC瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌有关)、p21/Ras(例如，与黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4(例如，与黑色素瘤有关)、MUM1(例如，与黑色素瘤有关)、胱冬酶-8(例如，与头颈癌有关)、CIA0205(例如，与膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(例如，与黑色素瘤有关)、TCR(例如，与T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-abl(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)过表达抗原，例如半乳糖凝集素4(例如，与结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9(例如，与霍奇金病有关)、蛋白酶3(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、WT1(例如，与多种白血病有关)、碳酸酐酶(例如，与肾癌有关)、醛缩酶A(例如，与肺癌有关)、PRAME(例如，与黑色素瘤有关)、HER-2/neu(例如，与乳腺癌、结肠癌、肺癌与卵巢癌有关)、甲胎蛋白(例如，与肝细胞癌有关)、KSA(例如，与结直肠癌有关)、胃泌素(例如，与胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(例如，与乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250(例如，与肾细胞癌有关)、p53(例如，与乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(例如，与乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)，(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(例如，与黑色素瘤有关)，(e)前列腺相关抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，例如与前列腺癌有关，(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人嗜T淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。
C.用于带负电分子的制剂
带负电分子(如RNA)通常以水溶液或可易溶于水溶液中的形式(如冻干)来提供。水溶液可为水或包含盐(如NaCl)、缓冲剂(如柠檬酸盐缓冲剂)、非离子等张剂(如糖)、聚合物、表面活性剂或其组合的水溶液。若所述制剂旨在体内给予，优选所述水溶液为保持与正常生理条件相容性pH的生理上可接受的缓冲液。而且，在某些情况中，可能需要将pH维持在特定水平从而确保制剂中某些组分的稳定性。
例如，可能需要制备等张和/或等渗的水溶液。高渗和低渗溶液有时会在注射时引起并发症和不良影响，如组合物和生理液体之间不同离子浓度引起的给药后肿胀或组合物快速吸收。为了控制张力，乳液可包含生理盐如钠盐。例如可使用约0.9%(w/v)的氯化钠(NaCl)(生理盐水)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。在示例性实施方式中，水溶液含10mM NaCl和其它盐或非离子等张剂。如前所述，非离子等张剂还可用于控制张力。
水溶液可经缓冲。本文可用任何生理上可接受的缓冲剂，如柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂等。水溶液的pH优选为6.0-8.0，更优选约6.2-约6.8。在一些情况中，缓冲液中可包括一定量的盐。在其它情况中，缓冲液中的盐可能干扰带负电分子与所述乳液颗粒的复合，并因此需避免。
所述水溶液还可包含其它组分如改变水溶液渗透压的分子或稳定复合后带负电分子的分子。例如，可用非离子等张剂调节渗透压，所述等张剂通常为碳水化合物但也可为聚合物。(参见例如，Voet和Voet(1990)Biochemistry(纽约John Wiley&Sons公司)。合适非离子等张剂的示例包括糖(如，单糖、二糖、或多糖，例如海藻糖、蔗糖、右旋糖、果糖)、糖醇(如甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、丙三醇、还原帕拉金糖等)，及其组合。需要时，可使用非离子聚合物(如聚(烷基醇)例如聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丁烯醇)或非离子表面活性剂。这些类型的试剂，尤其是糖和糖醇，也是能在冻干时保护RNA和其它带负电分子的冷冻保护剂。在示例性实施方式中，所述缓冲液包括约560nM–600mM海藻糖、蔗糖、山梨糖醇或右旋糖。在其它示例性实施方式中，所述缓冲液包括约500nM–600mM海藻糖、蔗糖、山梨糖醇或右旋糖。
在一些情况中，优选将含带负电分子的水溶液制备为为高渗溶液，并用无杂质的水或低渗溶液制备阳离子乳液。当乳液和带负电分子组合时，所述混合物变为等渗的。例如，含RNA的水溶液可为2X高渗溶液，且阳离子乳液可用10mM柠檬酸盐缓冲液制备。RNA溶液和乳液1:1(v/v)混合时，组合物变为等渗。根据乳液与含带负电分子的水溶液的所需相对量(如1:1(v/v)混合、2:1(v/v)混合、1:2(v/v)混合等)，可容易地确定实现等张混合物所需的水溶液的张力。
相似地，具有生理渗透压的组合物可能是体内给予所需。生理渗透压为约255mOsm/kg水-约315mOsm/kg水。有时，优选将含带负电分子的水溶液制备为高渗溶液，并用无杂质的水或低渗溶液制备阳离子乳液。当乳液和带负电分子组合时，实现生理渗透压。根据乳液与含带负电分子的水溶液的所需相对量(如1:1(v/v)混合,2:1(v/v)混合,1:2(v/v)混合等)，可容易地确定实现等渗混合物所需的水溶液的渗透压。
在某些实施方式中，含带负电分子的水溶液还包括聚合物或表面活性剂或其组合。在示例性实施方式中，所述水包油乳液含泊洛沙姆。具体地，发明人发现与阳离子乳液颗粒复合前添加
Figure BDA0000453594540000481
F127到RNA水溶液中引起RNA分子的稳定性增强和对RNA酶的抗性增强。还发现添加普朗尼克(pluronic)F127到RNA水溶液中会降低RNA/CNE复合物的粒度。泊洛沙姆聚合物还可促进RNA分子的恰当去复合/释放，防止乳液颗粒聚集，并具有免疫调节效应。可用的其它聚合物包括例如
Figure BDA0000453594540000482
F68或PEG300。
替代或补充地，含带负电分子的水溶液可包括约0.05%-约20%(w/v)聚合物。例如，阳离子水包油乳液可包括约0.05%-约10%(w/v)，如0.05%、0.5%、1%或5%的聚合物(如泊洛沙姆例如
Figure BDA0000453594540000483
F127、F68，或PEG300)。
缓冲系统可包括两种或更多上述分子(盐、缓冲液、糖、聚合物等)的任何组合。在优选的实施方式中，所述缓冲液包括560mM蔗糖、20mM NaCl、和2mM柠檬酸盐，其可与本文所述阳离子水包油乳液混合以产生包含280mM蔗糖、10mM NaCl和1mM柠檬酸盐的最终水相。
5.制备方法
另一方面，本发明提供一种制备本文所述水包油乳液的方法，所述方法包括：(1)组合所述油和所述阳离子脂质，形成所述乳液的油相；(2)提供水相来形成所述乳液的水相；和(3)将所述油相分散在所述水相中，例如通过均质化。可用任何合适方法实现均质化，例如使用市售的均质机(如IKA T25均质机，可获自VWR国际公司(VWR International)(宾夕法尼亚州西切斯特))。
在某些实施方式中，所述水包油乳液如下制得：(1)直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(2)提供所述乳液的水相；和(3)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。在将脂质加入油前，所述方法不使用有机溶剂(如氯仿(CHCl3)、二氯甲烷(DCM)、乙醇、丙酮、四氢呋喃(THF)、2,2,2三氟乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等来先溶解所述阳离子脂质。
可能需要将所述油加热到约37℃–约65℃温度以有利于所述脂质的溶解。可测定阳离子脂质(如DOTAP)的需要量并直接添加至油以达到所需的终浓度。
若乳液含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可根据本领域常规实践包括在油相或水相中。例如，SPAN85可溶于油相(如鲨烯)，吐温80可溶于水相(如在柠檬酸盐缓冲液中)。
在另一方面，本发明提供制备组合物的方法，所述组合物包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子(如RNA)，所述方法包括：(i)提供本文所述阳离子水包油乳液；(ii)提供含带负电分子(如RNA)的水溶液；和(iii)组合(i)的水包油乳液和(iii)的水溶液，从而所述带负电分子与乳液颗粒复合。
例如，阳离子水包油乳液可与水性RNA溶液以任何需要的相对量组合，如约1:1(v/v)、约1.5:1(v/v)、约2:1(v/v)、约2.5:1(v/v)、约3:1(v/v)、约3.5:1(v/v)、约4:1(v/v)、约5:1(v/v)、约10:1(v/v)、约1:1.5(v/v)、约1:2(v/v)、约1:2.5(v/v)、约1:3(v/v)、约1:3.5(v/v)、约1:4(v/v)、约1:1.5(v/v)、或约1:1.10(v/v)等。
可包括其它任选步骤以促进颗粒形成、改善带负电分子和阳离子颗粒之间的复合、增加带负电分子的稳定性(如防止RNA分子降解)、促进带负电分子(如RNA分子)的合适去复合/释放、或防止乳液颗粒的聚集。例如，聚合物(如
Figure BDA0000453594540000491
F127)或表面活性剂可加入含带负电分子(如RNA)的水溶液中。
所述乳液颗粒的大小可通过改变表面活性剂与油的比例(增加比例则降低粒度)、操作压力(增加操作压力则降低粒度)、温度(提高温度则降低粒度)、和其它工艺参数而变化。实际粒度还随着所用的具体表面活性剂、油和阳离子脂质以及所选的具体操作条件而变化。乳液粒度可通过利用分粒仪器来证实，此类仪器如库尔特公司(Coulter Corporation)生产的市售亚微米颗粒分析仪(N4MD型)，且可利用上述指导改变参数直至颗粒的平均直径小于约200nm，小于约150nm，或小于约100nm。优选地，上述颗粒的平均直径为约180nm或更小，约150nm或更小，约140nm或更小，或约130nm或更小，约120nm或更小，或约100nm或更小，约50nm到200nm，约80nm到200nm，约50nm到180nm，约60nm到180nm，约70到180nm，或约80nm到180nm，约80nm到约170nm，约80nm到约160nm，约80nm到约150nm，约80nm到约140nm，约80nm到约130nm，约80nm到约120nm，约80nm到约110nm，或约80nm到约100nm.平均粒度为约200nm或更小的乳液可以进行无菌过滤。
制备阳离子水包油乳液(复合前乳液)或带负电分子-乳液复合物的可选过程包括例如灭菌、粒度选择(如移除大颗粒)、填充、包装和标记等。例如，若复合前乳液或带负电分子-乳液复合物是配制用于体内给予，则可以进行灭菌。例如，所述制剂可以通过经无菌级过滤器(例如，经0.22微米过滤器)过滤来灭菌。其它灭菌技术包括热方法或放射灭菌方法或使用脉冲光来产生灭菌组合物。
本文所述阳离子水包油乳液可用于生产疫苗。灭菌和/或临床级阳离子水包油乳液可用与MF59相似的方法制备。参见例如，Ott等，Methods in MolecularMedicine(《分子医学方法》)，2000年，卷42，211-228,收录于Vaccine Adjuvants(《疫苗佐剂》)，(O’Hagan编辑)，胡马纳出版公司(Humana Press)。例如，与MF59的生产方法相似，可将乳液的油相和水相在转子定子匀浆器或内联均质器中混合并加工以产生粗乳液。粗乳液然后可加入微流化床中，可在其中进一步加工获得稳定的亚微米乳液。粗乳液可重复通过微流化床的相互作用室直到获得需要的粒度。批量乳液此后可以过滤(如氮气下通过0.22μm滤器)以移除大颗粒，产生可填充入合适容器(如玻璃瓶)的散装乳液。对于在水包油乳液存在下自储存已证明有长期稳定性的疫苗抗原，可将抗原和乳液组合并灭菌过滤(如通过0.22μm滤膜)。已组合的单一药瓶疫苗可填充入单剂量的容器中。对于未证实长期稳定性的疫苗抗原，乳液可作为单独药瓶提供。在此类情况中，散装乳液可过滤灭菌(如通过0.22μm滤膜)、填充、并包装在最终的单剂量药瓶中。
任选在散装乳液或混合疫苗的小样品上进行质量控制，只有在样品通过质量控制检测后才将散装或混合疫苗包装成药剂。
6.药盒、药物组合物和给药
另一方面，本发明提供包含如本文所述与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子(如RNA)的药物组合物，并且还可包括一种或多种药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂。在优选的实施方式中，药物组合物是能用作疫苗的免疫原性组合物。
或者，本文所述组合物可用于递送带负电分子到细胞。例如，核酸分子(如DNA或RNA)可递送到细胞以用于各种目的，如诱导生成所需基因产物(如蛋白质)、调节基因表达、用于基因治疗等。本文所述组合物还可用于递送核酸分子(如DNA或RNA)到细胞以用于治疗目的，如治疗疾病如癌症或增殖性紊乱、代谢疾病、心血管疾病、感染、过敏，诱导免疫应答等。例如，核酸分子可递送到细胞以抑制靶基因表达。此类核酸分子包括例如反义寡核苷酸、双链RNA如小干扰RNA等。双链RNA分子如小干扰RNA可引起RNA干扰，其使对应靶基因特异沉默(基因敲减)。反义寡核苷酸是与选定序列互补的单链DNA或RNA。通常，反义RNA可通过结合某些信使RNA链来阻止其蛋白翻译。反义DNA可用于靶向特定的互补(编码或非编码)RNA。因此，本文所述阳离子乳液可用于递送反义寡核苷酸或双链RNA以治疗，例如通过抑制肿瘤靶标生成来治疗癌症。
本发明还提供药盒，其中所述带负电分子(如RNA)和所述阳离子水包油乳液在不同的容器中。例如，所述药盒可含有第一容器和第二容器，第一容器含有包含所述带负电分子(如RNA)的组合物，而第二容器含有阳离子水包油乳液。这两个组分可在给药前混合，例如，给药前约72小时内，约48小时，约24小时，约12小时，约10小时，约9小时，约8小时，约7小时，约6小时，约5小时，约4小时，约3小时，约2小时，约1小时，约45分钟，约30分钟，约15分钟，约10分钟，或约5分钟。这两个组分也可在给药前1分钟或临给药时混合。
带负电分子(如RNA)可以是液体形式或可是固体形式(例如，冻干)。若为固体形式，则药剂可含有第三容器，其含有合适的水溶液用以再水化所述带负电分子。合适的水溶液包括药学上可接受的缓冲液如磷酸缓冲盐水，林格氏溶液，右旋糖溶液，或上述水溶液中任一种。在某些实施方式中，无菌水可用作再水化的水溶液，在其它成分如等张剂和/或渗透压调节剂已和带负电分子(如RNA)一同冻干的情形中尤其如此。或者，冻干的带负电分子(如RNA)可以直接与阳离子乳液混合。
若所述组合物(如疫苗)含有带负电分子(如RNA)和其它成分如蛋白这质抗原，两种成分都可冷冻并冻干(单独或作为混合物)，再在给药前重溶并与所述阳离子乳液混合。
所述药盒还可包括用于最终使用者的其它材料，包括其它药学上可接受的配制溶液，如缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器或其他递送设备。例如，所述药盒可包括双室注射器，在一个腔室中含有水或所述乳液，而带负电分子(如RNA)在另一腔室中以固体(如冻干)形式提供。
所述药盒还可以包括含有佐剂(例如含铝佐剂或MF59)的另一容器。通常，含铝佐剂不是优选的，因为它们可能干扰带负电分子与阳离子乳液的复合。
合适的组合物容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料形成，包括玻璃或塑料。容器可具有无菌进入端口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿塞子的静脉输液袋或小瓶)。也可使用双室注射器，其中带负电分子(如RNA)是冻干的，而且或者用水在注射器内重溶或者直接用本文所述的阳离子乳液重溶。
所述药盒还可包括包装插页，其包含对诱导免疫或者用于治疗传染的方法的书面指导。所述包装插页可以是未经批准的包装插页草案，或可以是经食品药物管理局(FDA)或其他管理机构批准的包装插页。
本发明还提供了一种预填充有如上所述组合物的递送装置。
本文提供的药物组合物可以单独给药或与一种或多种其他治疗试剂联合给药。给药的方法包括但不限于口服给药、直肠给药、胃肠外给药、皮下给药、静脉内给药、玻璃体内给药、肌肉内给药、吸入、鼻内给药、局部给药、眼部给药或耳部给药。
本文所述组合物的治疗有效量根据所示疾病、疾病严重度、对象年龄和相对健康状况、给予化合物的效力、给药方式和所需治疗等而会不同。
在其它实施方式中，本发明所述药物组合物可与一种或多种其它治疗剂联合给药。其他治疗试剂可包括但不限于抗生素或抗细菌剂，止吐剂，抗真菌剂，消炎剂，抗病毒剂，免疫调节剂，细胞因子，抗抑郁药，激素，烷化剂，抗代谢物，抗肿瘤抗生素，抗有丝分裂剂，拓扑异构酶抑制剂，细胞生长抑制剂，抗入侵剂，抗血管新生剂，生长因子功能抑制剂，病毒复制抑制剂，病毒酶抑制剂，抗肿瘤剂，α干扰素，β干扰素，利巴韦林，激素，和其他Toll样受体调节剂，免疫球蛋白(Ig)，和调节Ig功能的抗体(例如抗IgE(奥马珠单抗))。
在某些实施方式中，本文提供的药物组合物用于治疗传染病，包括但不限于：本文公开的病原体引起的疾病，包括病毒疾病如生殖器疣、寻常疣、脚底疣、狂犬病、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、登革病毒、黄热病、单纯疱疹病毒(仅举示例来说，HSV-I、HSV-II、CMV、或VZV)、传染性软疣、牛痘、天花、慢病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(丙肝病毒、乙肝病毒、甲肝病毒)、巨细胞病毒(CMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、鼻病毒、肠病毒(如EV71)、腺病毒、冠状病毒(如SARS)、流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、黄病毒、逆转录病毒、沙粒病毒(仅举例来说，LCM、胡宁病毒、马丘博病毒、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)和拉沙热)和纤丝病毒(仅举例来说，埃博拉病毒或马尔堡病毒)。
在某些实施方式中，本文提供的药物组合物用于治疗细菌、真菌和原生动物感染，包括但不限于：疟疾、肺结核和鸟分枝杆菌病，麻疯病；卡氏肺囊虫肺炎(pneumocystis carnii)，隐孢子虫病，组织胞浆菌病，弓形体病，锥虫病感染，利什曼病，埃希氏菌属(Escherichia)、肠细菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、克氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)和衣原体属(Chlamydia)的细菌引起的感染，和真菌感染如念珠菌病(candidiasis)、曲霉病(aspergillosis)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、隐球菌脑膜炎(cryptococcalmeningitis)。
某些实施方式中，本文提供的药物组合物用于治疗呼吸疾病和/或紊乱、皮肤病、眼睛疾病和/或紊乱、泌尿生殖系统疾病和/或紊乱，包括同种异体移植物排斥，自身免疫和过敏，癌症，或皮肤损伤或老化如疤痕和皱纹。
另一方面，本发明提供在所需对象如哺乳动物中产生或增强免疫应答的方法，包括给予有效量的本文所公开组合物。所述免疫应答优选为保护性，并优选涉及抗体和/或细胞介导免疫。本方法可用于诱导初级免疫应答和/或加强免疫应答。
在某些实施方式中，本文所述组合物可用作药物，如用于在有需要的对象如哺乳动物中引起或增加免疫应答。
在某些实施方式中，本文所述组合物也可以用于生产在有需要的对象如哺乳动物中引起或增强免疫应答的药物。
所述哺乳动物优选人，但可以是如牛、猪、鸡、猫或狗，因为本文涵盖的病原体可能在广泛的物种中是问题。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)、青少年或成人；当疫苗用于治疗性用途时，人优选为青少年或成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如，以评估其安全性、剂量、免疫原性等。
检测治疗性处理功效的一种方式包括在给予本发明所述组合物或疫苗后监测病原体感染。检测预防性处理功效的一种方式包括监测针对抗原的全身免疫应答(如监测IgG1和IgG2a生成水平)和/或粘膜免疫应答(如监测IgA生成水平)。通常，在免疫后但在刺激前测定抗原特异性血清抗体应答，而在免疫后且刺激后测定抗原特异性粘膜抗体应答。
在核酸分子(如RNA)编码蛋白抗原时，评价本文所述组合物或疫苗的免疫原性的另一方法是重组表达所述蛋白抗原以通过免疫印迹和/或微阵列筛查患者血清或粘膜分泌。蛋白质和患者样品间的阳性反应表明患者已经产生对受试蛋白的免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或蛋白抗原内的表位。
所述组合物的功效还可通过攻击感兴趣病原体感染的合适动物模型来体内确定。
可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径给予各剂量，例如胃肠道外初免和粘膜加强、粘膜初免和胃肠道外加强等。多个剂量的给予一般间隔至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)。
在某些实施方式中，在单次给药中给予对象的阳离子脂质如DOTAP的总量不超过约30mg，或者不超过约24mg。
在某些实施方式中，在单次给药中给予对象的阳离子脂质如DOTAP的总量不超过约4mg。
包括一种或多种抗原或者与一种或多种抗原联用的本文所述组合物可用于治疗儿童和成人。因此，人类对象可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受所述组合物的对象优选老年人(如>50岁，>60岁并优选>65岁)，年轻人(如<5岁)，住院病人、保健护理人员、武装部队和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。然而所述组合物不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
包括一种或多种抗原或者与一种或多种抗原联用的本文所述组合物可与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时给药。
在某些实施方式中，本文提供的组合物包括或任选包括一种或多种免疫调节剂如佐剂。示例性佐剂包括但不限于TH1佐剂和/或TH2佐剂，其在下文中进一步讨论。在某些实施方式中，用于本文所提供免疫原性组合物的佐剂包括但不限于：
1.含矿物质的组合物；
2.油乳剂；
3.皂苷制剂；
4.病毒体和病毒样颗粒；
5.细菌或微生物衍生物；
6.生物粘着剂和粘膜粘着剂；
7.脂质体；
8.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；
9.聚磷腈(PCPP)；
10.胞壁酰肽；
11.咪唑并喹诺酮化合物；
12.缩氨基硫脲化合物；
13.色胺酮化合物；
14.人免疫调节剂；
15.脂肽；
16.苯并萘啶；
17.微粒
18.免疫刺激多核苷酸(如RNA或DNA；如含CpG的寡核苷酸)
实施例
现已总体描述了本发明，参考以下实施例更易于理解本发明，这些实施例只是用于说明本发明的某些方面与实施方式，而非意在限制本发明。
实施例1：阳离子水包油乳液的开发
本实施例中，开发了含有高浓度阳离子脂质(DOTAP)的阳离子纳米乳液(在此称为“CNE”)用于递送自复制RNA。
CNE制剂小结于以下表1，并基于CNE01改变得到。CNE01、CMF40、CNE16、CNE02和CNE17用作对照研究的参比样品。
表1
Figure BDA0000453594540000561
Figure BDA0000453594540000571
CNE的制备类似于此前所述带电MF59的制备(Ott等，Journal of ControlledRelease，79卷，1-5页，2002)，但有一项主要改变。DOTAP直接溶解于鲨烯，而没有使用有机溶剂。发现在含有超过1.6mg/ml DOTAP的乳液中纳入溶剂产生泡沫状料液，无法微流体化产生乳液。加热鲨烯至37℃使得DOTAP能直接溶解于鲨烯，且此后油相能成功分散在水相中(例如，通过均质化)以产生乳液。DOTAP可溶于鲨烯，且能在鲨烯中实现比表1所示更高的DOTAP浓度。但是，已有报道高剂量的DOTAP可能具有毒性作用。参见例如Lappalainen等，Pharm.Res.，卷11(8):1127-31(1994)。
简要来说，鲨烯被加热到37℃，且在SPAN85存在下DOTAP直接溶于鲨烯。所得油相随后与水相(含吐温80的柠檬酸盐缓冲液)混合并立即用IKA T25匀浆机在24K RPM下均质化2分钟以产生均质料液(初步乳液)。所述初步乳液3-5次通过带冰浴冷却盘管的M-110S微流化器或M-110P微流化器(微流化公司(Microfluidics)，马萨诸塞州牛顿市)，均质压力为约15k-20k PSI。从单元中移出20ml批料样品并存于4℃。
需要注意，表1所述的CNE的成分浓度是按照制备乳液所用这些成分的初始用量计算所得浓度。应理解在乳液生产工艺中，或者过滤灭菌过程中，少量鲨烯、DOTAP、或其它成分可能有损伤，且这些成分在最终产物(如待给予的包装灭菌乳液)中的实际浓度可稍有降低，通常降低最多约20%，有时最多约25%或最多至约35%。但是，本领域的常规实践是基于制备乳液所用成分的初始用量来描述特定成分的浓度，而不是最终产物中的实际浓度。
下表2显示了鲨烯和DOTAP的"理论"浓度(按鲨烯和DOTAP用于制备乳液的初始用量计算得到)与最终产物中测定所得鲨烯和DOTAP的实测浓度之间的差异。
表2
Figure BDA0000453594540000581
实施例2：制备RNA-颗粒复合体
1.RNA合成
编码α病毒复制子(自复制RNA)的质粒DNA用作体外合成RNA的模板。各复制子含RNA复制所需的遗传元件但缺少编码颗粒装配所需基因产物的序列。α病毒基因组的结构基因被替换为编码异源蛋白(其表达由α病毒亚基因组启动子驱动)的序列。在所述复制子递送给真核细胞后，正义链RNA翻译产生4种非结构性蛋白，它们一起复制基因组RNA并转录大量编码异源蛋白的亚基因组mRNA。由于缺少α病毒结构蛋白的表达，复制子不能产生感染性颗粒。噬菌体T7启动子定位于所述α病毒cDNA上游以促进所述复制子RNA体外合成，且位置紧邻聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通过其自切割活性产生正确的3’末端。
所述HDV核酶下游的质粒DNA用合适的限制性内切核酸酶线性化后，用T7或SP6噬菌体衍生DNA依赖性RNA聚合酶体外合成失控(run-off)转录本。按照生产商(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司(Ambion))提供的说明，在各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)终浓度7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)存在时于37oC进行2小时转录。转录后，用TURBO DNA酶(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司)消化模板DNA。用LiCl沉淀所述复制子RNA并在无核酸酶的水中重建。如用户手册所述，未加帽的RNA通过牛痘加帽酶(VCE)用ScriptCap m7G加帽系统(威斯康星州麦迪逊的艾比森得(Epicentre)生物技术公司)在转录后加帽。用LiCl沉淀转录后加帽的RNA并在无核酸酶的水中重建。或者，复制子的加帽可通过向转录反应补充不可逆帽结构类似物m7G(5’)ppp(5’)G(NEB公司(New England Biolabs)，马萨诸塞州贝弗利)6mM(用于T7RNA聚合酶)或4mM(用于SP6RNA聚合酶)并降低三磷酸鸟苷的浓度到1.5mM(用于T7RNA聚合酶)或1mM(用于SP6RNA聚合酶)来进行。然后转录物可用TURBO DNA酶(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司(Ambion))消化后用LiCL沉淀并在75%乙醇中清洗得以纯化。
RNA样品的浓度通过测量260nm下的光密度来确定。体外转录本的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳全长构建体的存在来确认。
2.RNA复合
术语N/P比指阳离子脂质中氮的含量相对RNA上磷酸的含量。氮是所测试阳离子脂质中的荷电元素。磷酸根可见于RNA主链上。N/P电荷比10/1表明就RNA上每个带负电磷酸根而言，阳离子脂质中存在有10个带正电的氮。
溶液中氮的数量从所述阳离子脂质浓度来计算，例如每分子DOTAP有1个可质子化的氮。所述RNA浓度用于计算溶液中磷酸根的量，所用估值为每微克RNA约3nmol磷酸根。通过改变RNA:脂质的量，N/P比可得以调节。RNA在一定范围的氮/磷酸根比(N/P)下与CNE复合。N/P比的计算通过计算每毫升乳液中可质子化氮的摩尔数来进行。为了计算磷酸根的数量，使用每微克RNA3nmol磷酸根这一常数。确定值后，将合适比例的乳液加入RNA。利用这些值，所述RNA被稀释到合适的浓度，并在轻微涡旋时直接加入等体积乳液中。使该溶液在室温静置约2小时。一旦复合后，将得到的溶液稀释到合适的浓度并在1小时内使用。
3.粒度试验
乳液的粒度用Zetasizer Nano ZS(英国伍斯特郡的马尔文仪器公司(MalvernInstruments))根据生产商说明来测量。颗粒大小报道为含多分散性指数(pdi)的Z-平均值(ZAve)。所有样品于测量前稀释在水中。此外，乳液的粒度用HoribaLA-930粒度仪(Horiba科学仪器事业部(Horiba Scientific)，美国)来测量。样品于测量前稀释在水中。ζ电势根据生产商说明用Zetasizer Nano ZS测量，使用稀释的样品。
4.病毒复制子颗粒（VRP）
为了就实现体内报告基因或抗原的表达来比较RNA疫苗和传统RNA载体方法，我们利用按Perri等J.Virol,77:10394-10403(2003)所述方法所得BHK细胞生产的病毒复制子颗粒(VRP)。本系统中，抗原(或报告基因)复制子由源自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)基因组的α病毒嵌合复制子(VCR)组成，所述基因组经遗传工程改造以包含辛德毕斯病毒的3’末端序列(3’UTR)和辛德毕斯病毒包装信号(PS)(参见Perri等，J Virol77:10394-10403(2003)的图2)。通过将这些复制子与编码辛德毕斯病毒衣壳和糖蛋白基因的缺陷性辅助RNA一起共同电穿孔入幼仓鼠肾(BHK)细胞来把它们包装入VRP(参见Perri等的图2)。然后收获所述VRP并用标准方法滴定，并在培养液体或其他等渗缓冲液中接种到动物内。
实施例3：DOTAP浓度对免疫原性的影响
本实施例在小鼠模型中显示以高浓度DOTAP制备的阳离子水包油乳液提高了编码RSV-F抗原的RNA复制子的免疫原性。
1.材料和方法
肝素结合实验
如上所述复合RNA。RNA/CNE复合物与各种浓度的硫酸肝素(马萨诸塞州沃德希尔市阿法埃莎公司(Alfa Aesar))在室温下孵育30分钟。所得溶液然后置于Airfuge高速离心机(加利福尼亚州布利市的贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter)15分钟。离心管用结核菌素注射器刺穿并移除下层。然后分析溶液的RNA浓度，按照生产商指导使用Ribogreen RNA分析试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。在伯腾(BioTek)Synergy4(佛蒙特州威努斯基)荧光酶标仪上分析样品。游离的RNA值用标准曲线计算。
2.DOTAP浓度对RNA-颗粒相互作用的影响
表3显示DOTAP浓度对RNA-颗粒相互作用(按肝素结合实验测定，该实验测量RNA-颗粒相互作用的紧密性)和免疫原性的影响。
表3
Figure BDA0000453594540000601
Figure BDA0000453594540000611
NT＝未测试。
如表3所示，RNA分子强烈结合于以高浓度DOTAP(1.8mg/mL或更高)制得的乳液颗粒
3.DOTAP浓度对RNA加载的影响
表4显示DOTAP浓度对RNA加载的影响。提高DOTAP的浓度导致更大量的RNA分子被配制入RNA-颗粒复合体。
表4
Figure BDA0000453594540000621
4.DOTAP浓度对免疫原性的影响
表5显示体内小鼠模型中DOTAP浓度对RSV F抗原的免疫原性的影响。
本研究使用表达RSV表面融合糖蛋白(RSV-F)的vA317复制子。8-10周龄、体重约20g的BALB/c小鼠以每组10只动物进行双侧肌肉内免疫接种。所有小鼠第0和21天在其两个后肢的四头肌中接受注射，各接受等体积注射(每条腿50μL)，含有表达RSV-F的自复制裸RNA(vA317,1μg)，配制于含40%DlinDMA、10%DSPC、48%Chol、2%PEG DMG2000的脂质体中的1μg A317(RV01(15))，或是配制在所示CNE中的自复制RNA(1μg vA317)。对于每次给予，制剂为新鲜配制。在第14天(2wp1)和35天(2wp2)收集血清用于抗体分析。
表5
Figure BDA0000453594540000622
Figure BDA0000453594540000631
如表5所示，提高DOTAP浓度导致更大量的RNA被加载到乳液颗粒，进而提高宿主免疫应答。与CNE17相比，CMF31观察到抗体效价的3倍升高(在2wp2天)。该模型中，在2.6mg/mL DOTAP(CMF31)观察到免疫原性的平台。
当每个小鼠的RNA和DOTAP给予量保持恒定(意味着乳液的DOTAP浓度越高，用来制备RNA/乳液复合物的乳液体积越小；随后，在免疫接种前，稀释RNA/乳化制剂使得注射给小鼠的RNA/乳液制剂的体积相同)，不同CNE制剂的F-特异性总IgG效价相当(表6)。vA317复制子用于所有CNE制剂。RNA用Ambion试剂盒制得。GMT数据反映各组内个体小鼠的几何平均效价(每组8只小鼠)。结果显示，对于有较高浓度DOTAP的乳液，需要较少量的制剂。
表6
Figure BDA0000453594540000632
免疫前的血清含有不可检测的效价。
当给予每个小鼠的鲨烯量和N/P比(DOTAP:RNA)保持恒定，F-特异性总IgG效价随制剂中RNA和DOTAP含量的升高而升高(表7)。vA317复制子用于所有CNE制剂。RNA用Ambion试剂盒制得。GMT数据反映各组内个体小鼠的几何平均效价(每组8只小鼠)。结果显示，提高DOTAP浓度导致更大量的RNA被加载到乳液颗粒，进而提高宿主免疫应答。
表7
Figure BDA0000453594540000641
用不同N/P比进一步研究CMF32和CMF34。表8显示制剂的F-特异性总IgG效价。理论N/P比反映按制备制剂所用DOTAP和RNA的初始用量计算的所得N/P比。实测N/P比稍低于理论N/P比，因为在乳液制备过程中损失少量的DOTAP。vA317用于所有CNE和CMF制剂。GMT数据反映各组内个体小鼠的平均log10效价(每组8只小鼠)。所有制剂用蔗糖调节至300mOsm/kg。用CMF32或CMF34均未见明显的耐受性问题(例如，体重、早期血清细胞因子)。
实测N/P比通过用带荷电气溶胶检测器(Corona Ultra，马萨诸塞州切姆斯福德)的HPLC对CNE或CMF批次中的DOTAP成分进行定量来测定。CNE和CMF样品稀释于异丙醇中，并上样至XTera C184.6x150mm3.5um柱(沃特世公司(Waters)，马萨诸塞州米尔福德)。取色谱图中DOTAP峰的曲线下面积并弄DOTAP标准曲线内插出浓度。用实测DOTAP浓度计算得到实测N/P比。
表8
Figure BDA0000453594540000642
Figure BDA0000453594540000651
实施例4：DOTAP浓度对免疫原性的影响
本实施例在棉鼠模型中显示以高浓度DOTAP制备的阳离子水包油乳液提高了编码RSV-F抗原的RNA复制子的免疫原性。
1.材料和方法
RNA复制子RNA复制子的序列，vA142RSV-F-delFP-全长核酶
棉鼠免疫接种雌性棉鼠(刚毛棉花鼠(Sigmodon hispidis))获自哈伦实验室(Harlan Laboratories)。所有实验依照诺华动物保护和使用委员会批准和进行。在第0天，各组动物肌肉内免疫接种(肌内(i.m.)100μl)指定的疫苗。每次免疫接种后3周收集血清样品。第一次免疫后4周用1x105PFU RSV鼻内(i.n.)攻击经免疫或未免疫接种的对照动物。
RSV F三聚体亚基疫苗所述RSV F三聚体是含RSV F胞外域的重组蛋白，该RSV F胞外域缺失融合肽区域以阻止结合其他三聚体。如尺寸排阻色谱所观察，得到的构建体形成均匀的三聚体，且具有与电子显微镜观察到的融合后F构型一致的预期表型。所述蛋白在昆虫细胞或CHO细胞中表达并利用融合于所述构建体C末端的HIS标记纯化，然后用常规技术进行尺寸排阻色谱。得到的蛋白样品表现出超过95%的纯度。对于F亚基疫苗的体内评价，100μg/mL三聚体蛋白使用pH6.3的10mM组氨酸缓冲液吸附在2mg/mL明矾上，并用氯化钠调节至与150mM等渗。2-8℃温和搅拌过夜使F亚基蛋白吸收到明矾上。
RSV F-特异性ELISA通过酶联免疫吸附实验(ELISA)分析个体血清样品中RSV F特异IgG的存在。ELISA板(MaxiSorp96孔，纽恩克公司(Nunc))用溶于PBS的1μg/ml纯化RSV F(delp23-furdel-截短未切割)在4℃包被过夜。清洗(含0.1%吐温-20的PBS)后，平板用溶于PBS的Superblock封闭缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific))在37℃封闭至少1.5小时。然后清洗所述板，加入实验或对照棉鼠的血清在实验稀释剂(含0.1%吐温-20和5%山羊血清的PBS)中的连续稀释物，再将板在37℃孵育2小时。清洗后，所述板用马辣根过氧化物酶(HRP)偶联的鸡抗棉鼠IgG(ICL公司(Immunology Consultants Laboratory,Inc)，1:5,000稀释于实验稀释剂中)在37℃孵育1小时。最后，清洗所述板并在各孔中加入100μl TMB过氧化物酶底物溶液(KPL公司(Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc))。通过添加100μl1M H3PO4终止反应，并用读板仪读取450nm的吸光度。对各血清样品，通过非线性回归(GP公司(GraphPad Prism))产生光密度(OD)与血清稀释度倒数的对数曲线。效价定义为约0.5OD时血清稀释度的倒数(根据来自经RSV感染棉鼠的标准、合并血清归一化，该血清具有1:2500的限定效价，其包括在每个板上)。
微中和实验。用空斑减少中和试验(PRNT)检测血清样品中中和抗体的存在。将HI血清的2倍连续稀释物(在含5%HI-FBS的PBS中)加入经预先滴定的等体积RSV Long中，以达到约115PFU/25μl。血清/病毒混合物在37℃和5%CO2下孵育2小时以发生病毒中和，然后将25μl该混合物(含约115PFU)一式两份接种到96孔板中HEp-2细胞的孔上。37℃和5%CO2下2小时后，细胞用0.75%甲基纤维素/EMEM5%HI-FBS覆盖并孵育42小时。通过用免疫染色然后自动计数来检测合胞体的形成从而确定感染性病毒颗粒的数量。中和效价定义为相对对照(无血清)，产生每孔合胞体数量至少减少60%的血清稀释度的倒数。
2.DOTAP浓度对免疫原性的影响
表9显示体内棉鼠模型中DOTAP浓度对RSV F抗原的免疫原性的影响。表9中显示使用RNA/CNE制剂的最初两次免疫接种。对于第三次免疫接种，除未免疫组外的所有动物采用3μg of RSV F亚基蛋白(在铝佐剂中)
表9
Figure BDA0000453594540000661
Figure BDA0000453594540000671
Ambion MegaScript RNA和公司内部合成的RNA用不同方法制得。
表9的数据显示CNE-RNA制剂在宿主中诱发剂量依赖性免疫应答(总IgG效价和中和抗体效价)。给予CMF31-RNA和CMF34-RNA制剂产生类似的F-特异性总IgG效价，且每个都超出CNE17在所标RNA剂量下的结果。此外，所有CNE-RNA制剂都在10μg RNA下诱发良好的中和抗体效价。CMF31-RNA、CMF34-RNA和CNE17-RNA组的中和抗体效价类似，但1μgRNA/CMF31组的惊人高效价是个例外。
实施例5：评估缓冲液组成对免疫原性的影响
本实施例中，制备各种基于CMF34但有不同缓冲液组分的乳液。
表10概括了用不同缓冲系统制备CMF34-配制的RNA时鼠免疫原性研究的结果。
表10
Figure BDA0000453594540000672
*vA375复制子。
实施例6：乳液的稳定性
通过在乳液产生后(T=0)和在4℃下1个月后(T=1月)和在4℃下2个月后(T=1月)测定乳液颗粒的平均直径和多分散性来评估CMF34的稳定性。还在4℃下3、6和12个月后评估稳定性。表11所示结果表明所述乳液至少稳定12个月。
表11
T=0 T=1月 T=2月 T=3月 T=6月 T=12月
NanoZS(nm) 101.4 100.6 99.76 99.23 101.0 101.0
多分散性 0.109 0.102 0.096 0.103 0.080 0.094
实施例7编码疱疹病毒蛋白的复制子的免疫原性
A.CMV蛋白
制备表达人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白复合物的双顺反子和五顺反子α病毒复制子，示意图见图1和3。所述α病毒复制子是基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)。所述复制子包装入病毒复制子颗粒(VRP)中、包封于脂质纳米颗粒(LNP)或用阳离子纳米乳液配制(CNE)。通过免疫印迹、免疫共沉淀和流式细胞术证实每个复制子所编码HCMV蛋白和蛋白复合物的表达。采用流式细胞仪验证五聚gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物的表达，所述表达来自编码所述复合物的蛋白组分的五聚体复制子，利用了对五聚体复合物上所存在构象表位特异的人单克隆抗体(Macagno等(2010),J.Virol.84(2):1005-13)。图2显示这些抗体结合到用表达HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物的复制子RNA(A527)转染的BHKV细胞。当用相同复制子构建体制备的VRP感染细胞时获得相似结果。这表明设计成表达五聚体复合物的复制子确实表达所需抗原而不是可能的副产物gH/gL。
通过在后方四头肌的肌内注射，使用VRP、包埋在LNP中的RNA、和用CNE配制的RNA免疫接种Balb/c小鼠。所述小鼠免疫三次，相隔三周，每次免疫接种前以及第三次且最终免疫接种后三周收集血清样品。用微中和试验评估所述血清并以测定疫苗接种所引发的中和抗体应答效力。所述效价表示为50％中和效价。
对VRP中的可溶性HCMV gH/gL复合物，评估许多不同构型双顺反子表达盒的免疫原性。图3显示表达膜锚定、全长gH/gL复合物的VRP引发强效中和抗体，效价略高于相似双顺反子表达盒所表达的可溶复合物（gHsol/gL）。改变编码gHsol和gL的基因顺序或用IRES或FMDV2A位点取代一个亚基因组启动子没有显著改善免疫原性。
为观察表达gH/gL和五聚体复合物的双顺反子和五顺反子复制子在不同制剂中是否引发中和抗体，将双顺反子或五顺反子复制子与CMF34混合来免疫接种棉鼠。表12显示在CMF34中的复制子引起的中和抗体效价与相同复制子包封在LNP中时相当。
Figure BDA0000453594540000691
B.VZV蛋白
将编码VZV蛋白的核酸克隆入VEE复制子载体以产生编码gB、gH、gL、gE、和gI的单顺反子复制子，并产生编码gH/gL或gE/gI的双顺反子复制子。在双顺反子复制子中，每个VZV开放阅读框的表达由单独亚基因组启动子驱动。
为制备复制子RNA，通过PmeI消化来使编码所述复制子的质粒线性化，且所述线性化质粒经苯酚/氯仿/异戊醇提取，在乙酸钠/乙醇中沉淀并重悬于20μl的无RNA酶水。
通过使用MEGAscript T7试剂盒(AMBION#AM1333)体外转录1μg线性化DNA来制备RNA。根据生产商的说明在没有加帽类似物的情况下设定20μl反应并在32℃下孵育2小时。加入TURBO DNA酶(1μl)并使混合物在32℃孵育30分钟。加入无RNA酶水(30μl)和乙酸铵溶液(30μl)。混合所述溶液并在-20℃下冷冻至少30分钟。然后所述溶液在4℃下以最大速度离心25分钟。弃上清液，团块用70%乙醇洗涤并再次在4℃以最大速度离心10分钟。将所述团块空气干燥并重悬在50μl无RNA酶水中。测定所述RNA浓度并在变性凝胶中检测质量。
所述RNA采用ScriptCap m7G加帽系统(Epicentre#SCCE0625)来加帽。通过混合RNA和无RNA酶水来调整该反应。所述RNA然后在65℃变性5-10分钟。将已变性的RNA快速转移到冰上并按以下顺序加入下列试剂：ScriptCap加帽缓冲液、10mM GTP、2mM新鲜制备的SAM、ScriptGuard RNA酶抑制剂和ScriptCap加帽酶。混合物在37℃孵育60分钟。通过加入无RNA酶水和7.5M LiCl终止该反应，充分混合该混合物并在-20℃储存至少30分钟。然后，所述混合物在4℃以最大速度离心至少25分钟，团块用70%乙醇冲洗并再次在4℃以最大速度离心，并将团块空气干燥。所述团块重悬于无RNA酶的水。测定所述RNA浓度并在变性凝胶中检测质量。
RNA转染
细胞(BHK-V细胞)接种到6孔板上，在转染时达到90-95%融合。对于每次转染，将3μg RNA在第一试管内稀释于50mL OPTIMEM培养基中。将Lipofectamine2000加入含有50mL OPTIMEM培养基的第二试管中。合并第一和第二试管并在室温维持20分钟。6孔板中的培养基替换为新鲜培养基，将RNA-Lipofectamine复合物置于细胞上，通过温和振动平板进行混合。该平板在CO2培养箱中37℃孵育24小时。
对于免疫荧光，收集转染细胞并接种入96孔板，使用市售可得的小鼠mAb(稀释度范围在1:1001:400)进行胞内染色。固定细胞团块并用Citofix-Citoperm溶液透化处理。使用第二试剂即标记Alexa488的羊抗鼠F(ab’)2(1:400最终稀释度)。
检测用单顺反子构建体(gE或gI)转染的细胞中VZV蛋白gE和gI的表达，并在蛋白质印迹中使用市售可得的小鼠抗体，用13B1针对gE，用8C4针对gI，检测用双顺反子gE/gI构建体转染的细胞中的gE和gI表达。通过免疫荧光测试使用市售可得的抗体10G6检测用编码gB的单顺反子构建体转染的细胞中VZV蛋白gB的表达。通过免疫荧光检测用单顺反子gH和单顺反子gL、或用双顺反子gH/gL构建体转染的细胞中VZV蛋白复合物gH/gL的表达使用市售可得的抗体SG3检测gH/gL复合物。
鼠免疫原性研究
8只体重约20g的6-8周龄雌性BALB/c小鼠组在第0、第21和第42天用CMF32或LNP(RV01)配制的7.0或1.0μg复制子RNA进行肌内免疫接种。在第2次免疫3周后和第3次免疫3周后从免疫动物抽取血液样品。所述组示于表13。
Figure BDA0000453594540000711
对VZV抗原的免疫应答
通过对VZV复制子转染的MRC-5细胞进行胞内染色来测试血清样品是否存在针对gB的抗体。MRC-5细胞维持在含有10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基中。使用VZV Oka株接种物(获自ATCC)感染MRC-5细胞培养物并将感染的全细胞用于病毒的继代传代。感染和未感染细胞之比是1:10。感染后30小时的细胞经胰蛋白酶分散用以接种在96孔板上，用免疫后获得的小鼠血清池(稀释度为1:200-1:800)进行胞内染色。市售单克隆抗体用作对照来定量感染水平。固定细胞团块并用Citofix-Citoperm溶液透化处理。使用第二试剂即标记Alexa488的羊抗鼠F(ab’)2(1:400最终稀释度)。
将针对gB的市售抗体(10G6)、针对gH的市售抗体(SG3)和针对gE的市售抗体(13B1(SBA)以及8612(密理博(Millipore))用作阳性对照，且各自胞内染色感染的MRC-5细胞。用CMF32或LNP配制的1或7gRNA进行第3次免疫后三周获得免疫血清，将该血清稀释1/200、1/400和1/800并用于胞内染色受感染的MRC-5细胞。结果示于图4(研究1，组1、5、7、9、11、13和15，CMF32制剂)。
中和试验
在标准培养基中从1:20开始以两倍增幅连续稀释各免疫小鼠血清，并加至存在豚鼠补体的等体积VZV悬液。在37℃孵育1小时后，加入人上皮细胞系A549。培养一周后通过显微镜下计数培养中形成的空斑来测定感染的细胞。根据空斑数计算每个血清稀释度的%抑制。通过将%抑制值相对稀释因子的对数标度作图得到每个血清样品的图。然后绘制出稀释因子和%抑制间关系的大致曲线。然后将50%中和效价确定为曲线与50%抑制值相交时的稀释因子。
表14显示从单顺反子gE、双顺反子gE/gI和双顺反子gH/gL免疫小鼠获
得的血清含有强中和抗体效价。
Figure BDA0000453594540000731
实施例8：脂肪酸在鲨烯中的溶解性
本实施例中，检查了多种脂肪酸在鲨烯中的溶解性，并示于表15。指定量(40、20、10或5mg/mL)的脂肪酸与鲨烯在60℃下混合。表15中，(√)表示该脂肪酸在该特定浓度下可溶于鲨烯；“x”表示该脂肪酸在该特定浓度下不溶于鲨烯；而“-”表示该脂肪酸在该特定浓度下的溶解度未经测试(由于该脂肪酸在更高浓度下可溶)。在脂肪酸溶于鲨烯后，将溶液于4℃过夜。标为4℃过夜的一列显示各脂肪酸在其最高浓度下溶液的溶解性。例如，油酸可以40mg/ml溶于鲨烯，并在4℃过夜时仍保持可溶于鲨烯。
表15
Figure BDA0000453594540000732
Figure BDA0000453594540000741
序列
编码vA317RNA(编码RSV-F抗原)的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
编码vA142RNA的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
编码vA375RNA的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
A526载体：SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-2A-UL130-2Amod-UL131(SEQ IDNO:4)。
A527载体：SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-EMCV-UL130-EV71-UL131(SEQID NO:5)。
A531载体：SGP-gHsol-SGP-gL(SEQ ID NO:6)。
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A533载体：SGP-gHsol-EV71-gL(SEQ ID NO:8)。
A534载体：SGP-gL-EV71-gH(SEQ ID NO:9)。
A535载体：SGP-342-EV71-gHsol-2A-gL(SEQ ID NO:10)。
A536载体：SGP-342-EV71-gHsol-EMCV-gL(SEQ ID NO:11)。
A537载体：SGP-342-EV71-gL-EMCV-gHsol(SEQ ID NO:12)。
A554载体：SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131(SEQ IDNO:13)。
A555载体：SGP-gHsol-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131(SEQID NO:14)。
A556载体：SGP-gHsol6His-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131(SEQ ID NO:15)。
VZV gB(SEQ ID NO:16)。
VZV gH(SEQ ID NO:17)。
VZV gL(SEQ ID NO:18)。
VZV gI(SEQ ID NO:19)。
VZV gE(SEQ ID NO:20)。
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VZV VEERep.SGPgH-SGPgL(SEQ ID NO:24).
VZV VEERep.SGPgE(SEQ ID NO:25)。
VZV VEERep.SGPgI(SEQ ID NO:26)。
VZV VEErep.SGPgE-SGPgI(SEQ ID NO:27)。
可根据说明书内所引用参考文献的讲述最充分理解本说明书。说明书内的实施方式提供本发明实施方式的说明，并且不会对本发明范围构成限制。技术人员容易认识到本发明也包括许多其他实施方式。本公开引用的所有发表物和专利通过引用全文纳入本文。通过引用纳入的材料与本说明书冲突或不一致时，本说明书取代任何此类材料。本文引用任何参考文献并不视作承认这些文献是本发明的在先技术。
本领域技术人员应了解或能够确定仅采用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。这类等同形式应包含在下列实施方式的范围内。
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Claims (163)

1.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到180nm，所述乳液含有油和阳离子脂质，并且
其中：
(i)油:脂质(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM；且
(iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
2.如权利要求1所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约150nm。
3.如权利要求1或2所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约130nm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液含有约0.2%到约8%(w/v)的油。
7.如权利要求1-6中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
8.如权利要求1-7中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒还含有表面活性剂。
9.如权利要求8所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
10.如权利要求8或9所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
11.如权利要求8-10中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
12.如权利要求8-11中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。
13.如权利要求12所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.5%(v/v)吐温80和约0.5%(v/v)SPAN85。
14.如权利要求1-13中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
15.如权利要求1-13中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
16.如权利要求15所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是DOTAP。
17.如权利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是至少约2.58mM(1.8mg/mL)。
18.如权利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是约2.58mM(1.8mg/mL)到约7.16mM(5mg/mL)。
19.制备权利要求1-18中任一所述的水包油乳液的方法，所述方法包括：(a)直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；和(c)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括加热所述油至温度在约30℃到约65℃之间。
21.一种组合物，其包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的RNA分子，其特征在于，所述颗粒包括在25℃时为液相的油，和阳离子脂质，其中：
(i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM；且
(iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约180nm。
23.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约150nm。
24.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约130nm。
25.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比至少约4:1。
26.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1到约20:1。
27.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1到约15:1。
28.如权利要求21-27中任一项所述的组合物，其特征在于，所述油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
29.如权利要求21-28中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.1%-约5%(w/v)的油。
30.如权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
31.如权利要求21-30中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒还包含表面活性剂。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
33.如权利要求31或32所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
34.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.005%到约1.25%(v/v)的表面活性剂。
35.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.25%(v/v)吐温80和约0.25%(v/v)SPAN85。
37.如权利要求21-36中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
38.如权利要求21-36中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质是DOTAP。
40.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓度是至少约1.29mM(0.9mg/mL)。
41.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓度是约1.29mM(0.9mg/mL)到约3.58mM(2.5mg/mL)。
42.如权利要求21-41中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码抗原的自复制RNA分子。
43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒衍生的RNA复制子。
44.一种制备组合物的方法，所述组合物包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子，所述方法包括：
(i)提供权利要求1-18中任一项所述的水包油乳液；
(ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及
(iii)组合(i)的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，(i)的所述阳离子水包油乳液和(ii)的所述RNA溶液以约1:1(v/v)的比例组合。
46.如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液含有盐。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述盐是NaCl。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约20mM NaCl。
49.如权利要求44-48中任一项所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液是缓冲液。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包含约2mM柠檬酸盐。
52.如权利要求44-51中任一项所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液包含非离子型等张剂。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂是糖或糖醇。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂选自下组：蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、右旋糖和其组合。
55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂是蔗糖。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约560mM蔗糖。
57.如权利要求44-56中任一项所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液包含聚合物。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述聚合物是
Figure FDA0000453594530000051
F127。
59.如权利要求57或58所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约0.05%到约20%(w/v)的聚合物。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约1%(w/v)F127。
61.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相的颗粒，其特征在于，所述乳液含有油和阳离子脂质，所述颗粒的平均直径从约80nm到180nm，所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM。
62.如权利要求61所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。
63.如权利要求61或62所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的阳离子脂质浓度至少约2.5mM。
64.如权利要求61-63中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
65.如权利要求61-64中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒还含有表面活性剂。
66.如权利要求65所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
67.如权利要求66所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
68.如权利要求65-67中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
69.如权利要求65-68中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。
70.如权利要求61-69中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
71.如权利要求61-69中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
72.如权利要求71所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是DOTAP。
73.一种组合物，其包含与权利要求61-72中任一项所述的阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子。
74.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比至少约4:1。
75.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比为约4:1到约20:1。
76.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比为约4:1到约15:1。
77.如权利要求73-76中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码抗原的自复制RNA分子。
78.如权利要求77所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒衍生的RNA复制子。
79.如权利要求73-78中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm到约180nm。
80.如权利要求21-43和73-79中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物经缓冲且pH为约6.0-约8.0。
81.如权利要求21-43和73-80中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含无机盐，且无机盐浓度不超过30mM。
82.如权利要求21-43和73-81中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含非离子型等张剂并且为等渗的。
83.如权利要求1-20中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。
84.一种组合物，其包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子，其特征在于，所述组合物用下述过程制得：
(i)提供权利要求61-72中任一项所述的水包油乳液；
(ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及
(iii)组合(i)的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
85.如权利要求21-43、73-82和84中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码两个或更多抗原的多顺反子RNA。
86.如权利要求85所述的组合物，其特征在于，所述多顺反子RNA是α病毒复制子。
87.如权利要求86所述的组合物，其特征在于，所述α病毒复制子含有编码第一抗原的第一核苷酸序列和编码第二抗原的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列操作性连接于控制元件。
88.如权利要求87所述的组合物，其特征在于，所述第一核苷酸序列操作性连接于第一控制元件且所述第二核苷酸序列操作性连接于第二控制元件。
89.如权利要求87或88所述的组合物，其特征在于，还包含编码第三蛋白或其片段的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列操作性连接于控制元件。
90.如权利要求89所述的组合物，其特征在于，所述第三核苷酸序列操作性连接于第三控制元件。
91.如权利要求89或90所述的组合物，其特征在于，还包含编码第四蛋白或其片段的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列操作性连接于控制元件。
92.如权利要求91所述的组合物，其特征在于，所述第四核苷酸序列操作性连接于第四控制元件。
93.如权利要求91或92所述的组合物，其特征在于，还包含编码第五蛋白或其片段的第五核苷酸序列，其中所述第五核苷酸序列操作性连接于控制元件。
94.如权利要求93所述的组合物，其特征在于，所述第五核苷酸序列操作性连接于第五控制元件。
95.如权利要求87-94中任一项所述的组合物，其特征在于，所述控制元件独立选自下组：亚基因组启动子、IRES、和病毒2A位点。
96.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求21-43、73-82和84-95中任一项所述的组合物给予有需要的对象。
97.如权利要求96所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的阳离子脂质总量不超过约30mg。
98.如权利要求96所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约24mg。
99.如权利要求96所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约4mg。
100.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其特征在于，所述颗粒的平均粒径为约80nm到180nm，所述乳液含有油和阳离子脂质，并且
其中：
(i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约4:1(摩尔:摩尔)；
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM；
(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在；且
(iv)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
101.如权利要求100所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约0.6%到4%
(w/v)存在。
102.如权利要求100或101所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约1%到约3.2%(w/v)存在。
103.如权利要求100-102中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约150nm。
104.如权利要求100-103中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约130nm。
105.如权利要求100-104中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。
106.如权利要求100-105中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
107.如权利要求100-106中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
108.如权利要求100-107中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒还含有表面活性剂。
109.如权利要求108所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
110.如权利要求108或109所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
111.如权利要求108-110中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
112.如权利要求108-111中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。
113.如权利要求112所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.5%(v/v)吐温80和约0.5%(v/v)SPAN85。
114.如权利要求100-113中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
115.如权利要求100-113中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
116.如权利要求115所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是DOTAP。
117.如权利要求116所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是至少约2.58mM(1.8mg/mL)。
118.如权利要求116所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是约2.58mM(1.8mg/mL)到约7.16mM(5mg/mL)。
119.制备权利要求100-118中任一所述的水包油乳液的方法，所述方法包括：(a)直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；和(c)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。
120.如权利要求119所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括加热所述油至温度在约30℃到约65℃之间。
121.一种组合物，其包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的RNA分子，其特征在于，所述颗粒包括在25℃时为液相的油，和阳离子脂质，其中：
(i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约4:1(摩尔:摩尔)；
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM；且
(iii)所述油以约0.1%至约4%(w/v)存在；且
(iv)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
122.如权利要求121所述的组合物，其特征在于，所述油以约0.3%到2%(w/v)存在。
123.如权利要求121或122所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约0.5%到约1.6%(w/v)存在。
124.如权利要求121-123中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到180nm。
125.如权利要求121-124中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到150nm。
126.如权利要求121-125中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约130nm。
127.如权利要求121-126中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比至少约4:1。
128.如权利要求121-126中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1到约20:1。
129.如权利要求121-126中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1到约15:1。
130.如权利要求121-129中任一项所述的组合物，其特征在于，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
131.如权利要求121-130中任一项所述的组合物，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
132.如权利要求121-131中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒还包含表面活性剂。
133.如权利要求132所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
134.如权利要求132或133所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
135.如权利要求132-134中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.005%到约1.25%(v/v)的表面活性剂。
136.如权利要求132-135中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组合。
137.如权利要求136所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.25%(v/v)吐温80和约0.25%(v/v)SPAN85。
138.如权利要求121-137中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
139.如权利要求121-138中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
140.如权利要求139所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质是DOTAP。
141.如权利要求140所述的组合物，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是至少约1.29mM(0.9mg/mL)。
142.如权利要求140所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓度是约1.29mM(0.9mg/mL)到约3.58mM(2.5mg/mL)。
143.如权利要求121-142中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码抗原的自复制RNA分子。
144.如权利要求143所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒衍生的RNA复制子。
145.一种制备组合物的方法，所述组合物包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子，所述方法包括：
(i)提供权利要求100-118中任一项所述的水包油乳液；
(ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及
(iii)组合(i)的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
146.如权利要求145所述的方法，其特征在于，(i)的所述阳离子水包油乳液和(ii)的所述RNA溶液以约1:1(v/v)的比例组合。
147.如权利要求61所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约1%到约3.2%(w/v)存在。
148.如权利要求121-144中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码两个或更多抗原的多顺反子RNA。
149.如权利要求148所述的组合物，其特征在于，所述多顺反子RNA是α病毒复制子。
150.如权利要求149所述的组合物，其特征在于，所述α病毒复制子含有编码第一抗原的第一核苷酸序列和编码第二抗原的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列操作性连接于控制元件。
151.如权利要求150所述的组合物，其特征在于，所述第一核苷酸序列操作性连接于第一控制元件且所述第二核苷酸序列操作性连接于第二控制元件。
152.如权利要求150或151所述的组合物，其特征在于，还包含编码第三蛋白或其片段的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列操作性连接于控制元件。
153.如权利要求152所述的组合物，其特征在于，所述第三核苷酸序列操作性连接于第三控制元件。
154.如权利要求152或153所述的组合物，其特征在于，还包含编码第四蛋白或其片段的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列操作性连接于控制元件。
155.如权利要求154所述的组合物，其特征在于，所述第四核苷酸序列操作性连接于第四控制元件。
156.如权利要求154或155所述的组合物，其特征在于，还包含编码第五蛋白或其片段的第五核苷酸序列，其中所述第五核苷酸序列操作性连接于控制元件。
157.如权利要求156所述的组合物，其特征在于，所述第五核苷酸序列操作性连接于第五控制元件。
158.如权利要求150-157中任一项所述的组合物，其特征在于，所述控制元件独立选自下组：亚基因组启动子、IRES、和病毒2A位点。
159.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求121-144任一项所述的组合物给予有需要的对象。
160.如权利要求159所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的阳离子脂质总量不超过约30mg。
161.如权利要求159所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约24mg。
162.如权利要求159所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约4mg。
163.如权利要求1-18、21-43、61-83、85-95、100-118、121-144或147-158中任一项所述的水包油乳液或组合物，其还包含抗氧化剂。
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