ES2763118T3 - Terapia contra el cáncer con parvovirus H-1 combinado con un anticuerpo anti-PD1 o anticuerpo anti Pd-L-1 - Google Patents

Abstract

Una combinación farmacéutica que contiene (a) parvovirus H-1 y (b) un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti- PD-L1.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia contra el cáncer con parvovirus H-1 combinado con un anticuerpo anti-PD1 o anticuerpo anti Pd-L-1

La presente invención se refiere a una combinación farmacéutica donde un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD-L-1 se combina con parvovirus H-1 y el uso de dicha combinación para el tratamiento de cáncer.

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en todo el mundo. Se ha estimado que la mitad de los hombres y un tercio de las mujeres serán diagnosticados con algún tipo de cáncer durante su vida. Además, debido a que el cáncer es predominantemente una enfermedad del envejecimiento, se predice que el número de muertes por cáncer en todo el mundo aumentará alrededor del 45 % de 2007 a 2030 (de 7,9 millones a 11,5 millones de muertes) debido al aumento de la proporción de personas mayores (estimaciones de la OMS, 2008). El cáncer también es la enfermedad más costosa. Las últimas estimaciones del National Cancer Institute mostraron que el coste económico general del cáncer en los EE. UU. en 2007 fue de 226,8 mil millones de dólares y, a menos que se desarrollen intervenciones preventivas más exitosas, detección temprana y tratamientos más eficientes, se espera que esta ya enorme carga económica crezca aún más durante las próximas dos décadas. A pesar de los avances significativos en la prevención, detección, diagnóstico y tratamiento de muchas formas de cáncer, lo que se demuestra por un aumento del porcentaje de supervivientes de cáncer a 5 años en los Estados Unidos y en Europa en los últimos treinta años, algunos tipos de tumores, tal como pancreático, de hígado, de pulmón, de cerebro permanecen huérfanos de tratamientos eficaces que requieren el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas. Los virus oncolíticos, que explotan las vulnerabilidades específicas del cáncer para destruir células cancerosas mientras evitan las células normales, están emergiendo rápidamente como herramientas prometedoras para combatir el cáncer (Breitbach et al, 2011; Russell et al, 2012). Actualmente, no menos de doce virus oncolíticos diferentes se están sometiendo a ensayos clínicos de fase I-III contra diversos tumores malignos (Russell et al, 2012) utilizados solos o en combinación con otros agentes anticancerosos. Entre ellos, el parvovirus de rata oncolítico H-1PV se evalúa actualmente para determinar la seguridad y los primeros signos de eficacia en un ensayo clínico de fase I/IIa en pacientes que tienen glioblastoma multiforme recurrente (GBM) (Geletneky et al, 2012).

H-1PV es una partícula icosaédrica pequeña (-25 nm de diámetro), sin envoltura, que contiene un genoma de ADN monocatenario de 5,1 kb de longitud (Cotmore y Tattersall, 2007). La organización genómica de H-1PV consiste en dos unidades transcripcionales bajo el control de dos promotores, el promotor temprano P4 y el promotor tardío P38. P4 regula la expresión del gen que codifica las proteínas no estructurales (NS por sus siglas e inglés) (NS1 y NS2) y el P38 el uno que codifica las proteínas de la cápside (VP) (VP1, VP2, VP3) (Cotmore y Tattersall, 2Ó07). El virus se multiplica preferentemente en células cancerosas de división rápida. Esta oncoselectividad no se basa en una mejor captación del virus por las células cancerosas, sino que se debe al hecho de que las células cancerosas sobreexpresan factores tales como ciclina A, E2F o CREB/ATF requeridos para la replicación del ADN del virus. Asimismo, con frecuencia, las células cancerosas son defectuosas en su capacidad para montar una respuesta inmunitaria antivírica eficaz que favorezca la multiplicación vírica (Nuesch et al, 2012). Se sabe que el virus activa múltiples vías de muerte celular. Dependiendo del tipo de célula y de las condiciones de cultivo, H-1PV puede inducir la apoptosis (Hristov et al, 2010; Ohshima et al, 1998; Rayet et al, 1998; Ueno et al, 2001), necrosis (Ran et al, 1999), o muerte celular dependiente de catepsina B (Di Piazza et al, 2007). El virus fue capaz de inducir la oncólisis incluso en células cancerosas resistentes a TRAIL (por sus siglas en inglés, Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand, Ligando Inductor de Apoptosis Relacionado con el Factor de Necrosis Tumoral), cisplatino e incluso cuando se sobreexpresaba Bcl-2 (di Piazza et al., 2007). Los últimos resultados sugieren que Bcl-2 no es un modulador negativo de la citotoxicidad por parvovirus. Recientemente se ha descrito la terapia contra el cáncer usando un parvovirus y su combinación con quimioterapia o un inhibidor de HDAC (documentos WO 2009/083232 A1; WO 2011/113600 A1).

La principal proteína no estructural NS1 es el regulador maestro de la replicación del ADN, la expresión del gen vírico y la citotoxicidad. La expresión única de NS1, de manera similar al virus completo, es suficiente para inducir la detención del ciclo celular, la apoptosis y la lisis celular a través de la acumulación de especies reactivas de oxígeno y daños en el ADN (Hristov et al, 2010). Como resultado de sus actividades oncolíticas, se ha demostrado que el virus posee propiedades oncosupresoras demostradas en varios modelos animales que sientan las bases para el lanzamiento del ensayo clínico contra GBM (Geletneky et al, 2012).

Durante los últimos años, además de los conceptos de terapia basados en virus oncolíticos, el campo de la inmunooncología se ha convertido en un enfoque valioso en la lucha contra el cáncer. Uno de los enfoques prometedores más recientes para activar la inmunidad antitumoral terapéutica es el bloqueo de los puntos de control inmunitario. Los puntos de control inmunitarios se refieren a una gran cantidad de vías inhibitorias conectadas al sistema inmunitario que son cruciales para mantener la autotolerancia y modular la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas en los tejidos periféricos para minimizar el daño tisular colateral. Ahora está claro que los tumores cooptan ciertas vías de puntos de control inmunitario como un mecanismo principal de resistencia inmunitaria, particularmente contra linfocitos T que son específicos para antígenos tumorales. Debido a que muchos de los puntos de control inmunitarios se ponen en marcha por interacciones ligando-receptor, se pueden bloquear fácilmente por anticuerpos o modular por formas recombinantes de ligandos o receptores.

La gran cantidad de cambios genéticos y epigenéticos que son inherentes a la mayoría de las células cancerosas proporcionan muchos antígenos asociados a tumores que el sistema inmunitario del hospedador puede reconocer, lo que requiere que los tumores desarrollen mecanismos específicos de resistencia inmunitaria. Un importante mecanismo de resistencia inmunitaria implica vías inmunoinhibidoras, denominadas puntos de control inmunitario, que normalmente median la tolerancia inmunitaria y mitigan el daño tisular colateral. Un receptor de puntos de control inmunitario particularmente importante es el antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4, por sus siglas en inglés), que modula negativamente la amplitud de la activación de linfocitos T. En fisiología normal, los linfocitos T se activan mediante dos señales: la unión del receptor de linfocitos T a un complejo antígeno-MHC y la unión del receptor de linfocitos T CD28 a CD80 y CD86 sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno. CTLA4 se une a CD80 o CD86, lo que impide la unión de CD28 a estas proteínas de superficie y, por lo tanto, regula negativamente la activación de los linfocitos T. Los linfocitos T citotóxicos activos son necesarias para que el sistema inmunitario ataque las células cancerosas, mientras que los linfocitos T reguladores inhiben otros linfocitos T que pueden beneficiar al tumor. El bloqueo de anticuerpos de CTLA4 en la inmunidad antitumoral inducida por cáncer en vista de un cambio en la proporción de linfocitos T reguladores a linfocitos T citotóxicos. Por consiguiente, el aumento de la cantidad de linfocitos T citotóxicos y la disminución de los linfocitos T reguladores aumenta la respuesta antitumoral. Los estudios clínicos con anticuerpos de CTLA4 antagonistas demostraron actividad en melanoma. A pesar de la alta frecuencia de toxicidad relacionada con el sistema inmunitario, esta terapia potenció la supervivencia en dos ensayos aleatorizados de Fase III. La terapia anti-CTLA4 fue el primer agente en demostrar un beneficio de supervivencia en pacientes con melanoma avanzado y fue aprobada por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA por sus siglas en inglés) en 2010 (Pardoll, D., Nature Reviews Cancer, Vol. 12, págs. 252-264, (2012)). El anticuerpo anti-CTLA4 aprobado se conoce con el nombre de "ipilimumab" y se comercializa con el nombre de marca "Yervoy®" por Bristol Myers Squibb (BMS).

Algunos receptores de puntos de control inmunitario, tal como la proteína de muerte celular programada 1(PD1), limitan las funciones efectoras de los linfocitos T dentro de los tejidos. Al regular positivamente los ligandos para PD1, las células tumorales bloquean las respuestas inmunitarias antitumorales en el microambiente tumoral. Los hallazgos clínicos con bloqueadores de proteínas de puntos de control inmunitario adicionales, tales como la proteína de muerte celular programada 1(PD1), indican amplias y diversas oportunidades para potenciar la inmunidad antitumoral con la posibilidad de producir respuestas clínicas duraderas. Los ensayos clínicos sugieren que el bloqueo de la vía de PD1 induce una regresión tumoral sostenida en varios tipos de tumores. Las respuestas al bloqueo de PD1 pueden correlacionarse con la expresión de ligandos de PD1 por las células tumorales.

El 4 de septiembre de 2015, la FDA aprobó el anticuerpo monoclonal humanizado pembrolizumab (también conocido como MK-3575 o Keytruda® comercializado por Merck Sharp Dohme); MSD) que se dirige contra la diana PD-1 bajo el Programa de Desarrollo Fast Track de la FDA. Está aprobado para su uso después del tratamiento con ipilimumab (que se dirige contra CTLA4), o después del tratamiento con ipilimumab y un inhibidor de BRAF en pacientes con melanoma avanzado que portan una mutación BRAF.

El 30 de septiembre de 2015, la FDA otorgó la aprobación acelerada de otro anticuerpo anti-PD1 (nivolumab; Inyección Opdivo® comercializado por Bristol Myers Squibb; BMS) en combinación con el anticuerpo anti-CTLA4 ipilimumab para el tratamiento de pacientes con BRAF V 600 de tipo silvestre, melanoma irresecable o metastásico.

Múltiples receptores y ligandos de puntos de control inmunitario adicionales, algunos de los cuales se regulan positivamente de forma selectiva en varios tipos de células tumorales, son dianas principales para el bloqueo, particularmente en combinación con enfoques que potencian la activación de las respuestas inmunitarias antitumorales, tales como vacunas.

Los anticuerpos anti-PD-L1 y los métodos para producirlos son conocidos en la técnica. Tales anticuerpos contra PD-L1 pueden ser policlonales o monoclonales, y/o recombinantes, y/o humanizados. Ejemplos de anticuerpos contra PD-L1 se divulgan en la Patente de Estados Unidos N.° 8,.217.149, Solicitud de Estados Unidos N.° 13/511.538, Solicitud de Estados Unidos N.° 13/478.511.

Agentes ejemplares que se dirigen a las vías de los puntos de control inmunitario se muestran la siguiente Tabla 1 (modificada de Pardoll, D., Nature Reviews Cancer, Vol. 12, págs. 252-264, (2012):

continuación

Aunque para algunos tipos de tumores (p. ej., melanoma, de pulmón) el tratamiento con inhibidores de puntos de control muestra resultados prometedores, se ha reconocido que los pacientes con otros tumores (p. ej., colon, páncreas) no se benefician de dicho tratamiento.

Por lo tanto, es el objeto de la presente invención proporcionar medios para una terapia contra el cáncer mejorada y producir una gama más amplia de tumores susceptibles al tratamiento con inhibidores de puntos de control.

De acuerdo con la invención, esto se logra mediante las materias objeto definidas en las reivindicaciones.

En el estudio resultante de la presente invención, se preguntó si un inhibidor de puntos de control, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1 como pembrolizumab, establece sinergias con un virus oncolítico, por ejemplo, un parvovirus similar a H-1PV o un parvovirus de roedor relacionado, al destruir células cancerosas. Se demostró que la administración de pembrolizumab potencia la actividad oncolítica del virus de manera sinérgica en varios pacientes.

La presente invención proporciona una combinación farmacéutica que contiene (a) el parvovirus oncolítico H-1 en combinación con (b) los inhibidores de puntos de control, anticuerpo anti-PD1 o anticuerpo anti-PD-L-1. La presente invención también proporciona el uso de dicha combinación farmacéutica para tratar cáncer.

Preferentemente, en dicha combinación farmacéutica, el virus oncolítico y el inhibidor de puntos de control están presentes en una dosis eficaz y se combinan con un transportador farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "agente" significa una sustancia que produce un efecto deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero, ser humano u otro sujeto.

En consecuencia, se entiende que la expresión "agente antineoplásico" significa una sustancia que produce un efecto antineoplásico deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero, ser humano u otro sujeto. También debe entenderse que un "agente" puede ser un único compuesto o una combinación o composición de dos o más compuestos.

Por el término "tratar" y derivados del mismo, como se usan en el presente documento, se entiende la terapia terapéutica. En referencia a una afección particular, tratar significa: (1) mejorar la afección o una o más de las manifestaciones biológicas de las afecciones, (2) interferir con (a) uno o más puntos en la cascada biológica que conduce o es responsable de la afección o (b) una o más de las manifestaciones biológicas de la afección (3) para aliviar uno o más de los síntomas, efectos o efectos secundarios asociados con la afección, o (4) retrasar la progresión de la afección o una o más de las manifestaciones biológicas de la afección.

Como se usa en el presente documento, se entiende que "prevención" se refiere a la administración profiláctica de un fármaco para disminuir sustancialmente la probabilidad o gravedad de una afección o manifestación biológica de la misma, o para retrasar el inicio de dicha afección o manifestación biológica de la misma. El experto en la materia apreciará que "prevención" no es un término absoluto. La terapia profiláctica es apropiada, por ejemplo, cuando se considera que un sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar cáncer, como cuando un sujeto tiene antecedentes familiares fuertes de cáncer o cuando un sujeto ha estado expuesto a un carcinógeno.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" significa que la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que se busca, por ejemplo, por un investigador o especialista clínico. Asimismo, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa cualquier cantidad que, en comparación con un sujeto correspondiente que no ha recibido tal cantidad, da como resultado una mejora en el tratamiento, curación, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o efecto secundario. La expresión también incluye dentro de su alcance cantidades eficaces para potenciar la función fisiológica normal. Una "dosis eficaz" útil para tratar y/o prevenir estas enfermedades o trastornos puede determinarse usando métodos conocidos por un experto en la materia.

La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de las combinaciones de la invención es ventajosa sobre los compuestos componentes individuales porque las combinaciones proporcionan una o más de las siguientes propiedades mejoradas en comparación con la administración individual de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto componente: i) un mayor efecto anticanceroso que el agente único más activo, ii) actividad anticancerosa sinérgica o altamente sinérgica, iii) un protocolo de dosificación que proporciona una actividad anticancerosa potenciada con un perfil de efectos secundarios reducido, iv) una reducción en el efecto tóxico, perfil, v ) un aumento en la ventana terapéutica o vi) un aumento en la biodisponibilidad de uno o ambos compuestos componentes.

"Farmacéuticamente aceptable" pretende abarcar cualquier transportador, que no interfiera con la efectividad de la actividad biológica de los principios activos y que no sea tóxico para el paciente al que se administra. Ejemplos de transportadores farmacéuticamente adecuados son conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones estériles. Dichos transportadores pueden formularse mediante métodos convencionales y pueden administrarse al sujeto a una dosis eficaz. Los transportadores farmacéuticamente compatibles adicionales pueden incluir geles, materiales de matriz bioadsorbibles, elementos de implantación que contienen el agente terapéutico, o cualquier otro vehículo o medio o material(es) de suministro o dispensación adecuado(s).

Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a un crecimiento anormal de células o tejidos y se entiende que incluye crecimientos neoplásicos malignos. El término "neoplásico" significa o está relacionado con una neoplasia. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, es decir, cáncer de cerebro (particularmente gliomas: ependimomas, astrocitomas [por ejemplo, glioblastoma multiforme], oligodendrogliomas, glioma del tronco encefálico, oligoastrocitomas); cáncer de colon (en particular CCR no MSI), cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de mama (particularmente cáncer de mama doble o triple negativo), cáncer de riñón, carcinoma de células escamosas de cabeza/cuello, cáncer de pulmón (particularmente carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLS, por sus siglas en inglés), cáncer de pulmón microcítico(SCLC, por sus siglas en inglés)), melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de células renales o cáncer de estómago. El término "cáncer" también abarca metástasis de los tumores mencionados en varios órganos. En una realización preferida, estos tumores son resistentes a la toxicidad de parvovirus. En una realización preferida adicional, estos tumores a tratar son tumores recurrentes. Una ventaja particular de la composición farmacéutica de la presente invención es que incluso las células madre iniciadoras de cáncer pueden tratarse con éxito. Esto tiene un efecto positivo en cuanto a evitar la recurrencia de los tumores y la formación de metástasis.

En otras realizaciones, el cáncer es una neoplasia de la sangre, es decir, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), LDLBG EBV-positivo, linfoma primario mediastinal de linfocitos B grandes,), linfoma de linfocitos B grandes rico en linfocitos T (histiocitos), linfoma folicular, linfoma de Hodgkin(LH), linfoma de células del manto (LCM), mieloma múltiple (MM), proteína de leucemia-1 de células mieloides (Mcl-1), síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma no Hodgkin (LNH) o linfoma linfocítico de células pequeñas (LLP).

"Inhibidor de puntos de control" significa cualquier agente que provoque un bloqueo de los puntos de control inhibitorios del sistema inmunitario. El bloqueo de los puntos de control inmunitarios inhibitorios activa la función del sistema inmunitario. Las dianas y agentes adecuados se mencionan en la Tabla 1 a la que se hace referencia. La interacción ligando-receptor como diana para el tratamiento del cáncer es la interacción entre la proteína de muerte celular programada 1 transmembrana (PDCD1, PD-1, también conocida como CD279) y su ligando, ligando de PD-1 (PD-L1, CD274). En fisiología normal, PD-L1 en la superficie celular se une a PD-1 en una superficie celular inmunitaria, lo que inhibe la actividad celular inmunitaria.

La regulación positiva de PD-L1 en la superficie de las células cancerosas puede permitirles evadir el sistema inmunitario del paciente al inhibir los linfocitos T que de otro modo podrían atacar a las células tumorales. Los anticuerpos que se unen bien a PD-1 o a PD-L1 y, por lo tanto, bloquean la interacción, permiten que los linfocitos T ataquen el tumor. Por consiguiente, en una realización preferida, los anticuerpos de PD-1 se usan como inhibidor de puntos de control. "Antagonista de PD-1" significa cualquier compuesto químico o molécula biológica que bloquea la unión de PD-L1 expresado en una célula cancerosa a PD-1 expresada en una célula inmunitaria (linfocito T, linfocito B o linfocito NKT) y preferentemente también bloquea la unión de PD-L2 expresado en una célula cancerosa a la PD-1 expresada en células inmunitarias. Los nombres alternativos o sinónimos para PD-1 y sus ligandos incluyen: PDCD1, PD1, CD279 y SLEB2 para PD-1; PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 y B7-H para PD-L1; y PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc y CD273 para PD-L2. En cualquiera de los métodos de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención en los que se trata a un individuo humano, el anticuerpo de PD-1 bloquea la unión de PD-L1 humano a PD-1 humana, y preferentemente, bloquea la unión tanto de PD-L1 como de PD-L2 humano a PD-1 humana. Se pueden encontrar secuencias de aminoácidos de PD-1 humana en NCBI Locus N.: NP_054862 y NP_079515, respectivamente.

Los anticuerpos de PD-1 útiles en cualquiera de los métodos de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención incluyen un anticuerpo monoclonal (mAb), o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 o PD-L1, y preferentemente se une específicamente a PD-1 humana o PD-L1 humano. El mAb puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico, y puede incluir una región constante humana. En algunas realizaciones la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 y en realizaciones preferidas, la región constante humana es una región constante de IgG1 o IgG4. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv y Fv.

Ejemplos de mAb que se unen a PD-1 humana, y útiles en el método de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención, se describen en los documentos US 7.521.051, US 8.008.449 y US 8.354.509. Los mAb anti-PD-1 humana específicos útiles como antagonistas de PD-1 en el método de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención incluyen: MK-3475 (pembrolizumab), un mAb de IgG4 humanizado con la estructura descrita en Información de fármacos de la OMS, Vol. 27, N.° 2, páginas 161-162 (2013); nivolumab (BMS-936558), un mAb de IgG4 humanizado con la estructura descrita en Información de fármacos de la OMS, Vol. 27, No.1, páginas 68-69 (2013); los anticuerpos humanizados h409A11, h409A16 y h409A17, que se describen en el documento WO2008/156712 A1.

Los expertos en la materia se darán cuenta de que el parvovirus H-1, que es potencialmente citotóxico para las células tumorales, puede emplearse en la combinación de la presente invención. La replicación de virus tóxicos competentes puede afectar a la destrucción del tumor por lisis, es decir, ser oncolítico, o puede destruir las células tumorales a través de un mecanismo diferente.

El virus para su uso en la práctica de la invención es el parvovirus H-1.

La expresión "virus oncolítico" y particularmente "parvovirus" o "parvovirus H-1" tal como se usa en el presente documento comprende de tipo silvestre o derivados con replicación competente modificados de los mismos, así como virus relacionados o vectores basados en dichos virus o derivados. Virus oncolíticos adecuados, derivados, etc. así como las células que se pueden usar para producir activamente dichos virus y que son útiles para la terapia, son fácilmente determinables dentro de la habilidad de la técnica en base a la divulgación del presente documento, sin un esfuerzo empírico indebido.

La administración de los compuestos puede realizarse por diferentes vías, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intratumoral o intradérmica. La vía de administración, por supuesto, depende del tipo de terapia y el tipo de compuestos contenidos en la composición farmacéutica. El régimen posológico del virus y el inhibidor de puntos de control es fácilmente determinable dentro de la habilidad de la técnica, por el médico a cargo basado en los datos de un paciente, observaciones y otros factores clínicos, que incluyen, por ejemplo, el tamaño del paciente, el área superficial corporal, edad, sexo, el virus particular, el inhibidor particular, etc., a administrar, el tiempo y la vía de administración, el tipo y las características del tumor, la salud general del paciente y otras terapias farmacológicas a las que se somete al paciente. En lo que respecta a los inhibidores de puntos de control, se hace referencia al prospecto y a la hoja de información del paciente que se incorporan con el presente documento como referencia. La selección de un régimen posológico (también denominado en el presente documento un régimen de administración) para una terapia de combinación de la invención depende de varios factores, que incluyen la tasa de renovación de suero o tejido de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad de la entidad y la accesibilidad de las células, tejidos u órganos diana en el individuo que se está tratando. Preferentemente, un régimen posológico maximiza la cantidad de cada agente terapéutico suministrado al paciente de manera consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. En consecuencia, la cantidad de dosis y la frecuencia de dosificación de cada agente terapéutico en la combinación depende en parte del agente terapéutico particular, la gravedad del cáncer que se está tratando y las características del paciente. La directriz es seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos, citocinas y moléculas pequeñas disponibles. Véase, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd. Oxfordshire, RU; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.)(1193) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcek Dekker, New York, NY; Bear^ et al, (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl.J. Med 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343;1594-1602; Physicians'Desk Reference 2003 (Physicians'Desk Reference, 57th ed); Medical Economics Company; ISBN; 1563634457; 57a edición (Noviembre de 2002). El médico puede determinar el régimen posológico apropiado, por ejemplo, utilizando parámetros o factores conocidos o sospechosos en la técnica que afectan al tratamiento o que se predice que afectan al tratamiento, y dependerá, por ejemplo, del historial clínico del paciente (por ejemplo, terapia previa), el tipo y el estadio del cáncer a tratar y los biomarcadores de respuesta a uno o más de los agentes terapéuticos en la terapia de combinación.

Debido a que el virus en la combinación con el inhibidor de puntos de control de acuerdo con la invención comprende partículas de virus infecciosas con la capacidad de penetrar a través del sistema sanguíneo, el tratamiento puede realizarse o al menos iniciarse por inyección intravenosa del virus. Sin embargo, una vía de administración preferida es la administración intratumoral.

Debido a que el tratamiento intravenoso a largo plazo es susceptible de volverse ineficaz como resultado de la formación de anticuerpos neutralizantes contra el virus, se pueden adoptar diferentes modos de administración después de un régimen inicial de administración vírica intravenosa, o pueden usarse alternativamente dichas técnicas de administración diferentes, por ejemplo, administración de virus intratumoral, durante todo el curso del tratamiento vírico.

Como otra técnica de administración específica, el virus (virus, vector y/o agente celular) puede administrarse al paciente desde una fuente implantada en el paciente. Por ejemplo, se puede conectar un catéter, por ejemplo, de silicona u otro material biocompatible, a un pequeño reservorio subcutáneo (reservorio de Rickham) instalado en el paciente durante la extracción del tumor o mediante un procedimiento por separado, para permitir que la composición de parvovirus se inyecte localmente en varios momentos sin intervención quirúrgica adicional. El virus o los vectores derivados también se pueden inyectar en el tumor mediante técnicas quirúrgicas estereotácticas o mediante técnicas de direccionamiento por navegación.

La administración del virus también se puede realizar mediante infusión continua de partículas víricas o fluidos que contienen partículas víricas a través de catéteres implantados a caudales bajos utilizando sistemas de bombeo adecuados, por ejemplo, bombas de infusión peristálticas o bombas de suministro potenciado por convección (CED por sus siglas en inglés).

Otro método más de administración de la parte de combinación vírica es a partir de un artículo implantado construido y dispuesto para dispensar el parvovirus al tejido canceroso deseado. Por ejemplo, se pueden emplear obleas que se han impregnado con el virus, particularmente el parvovirus H-1, en donde la oblea se une a los bordes de la cavidad de resección al concluir la extirpación quirúrgica del tumor. Se pueden emplear múltiples obleas en dicha intervención terapéutica. Las células que producen activamente el virus, o vectores basados en virus, pueden inyectarse en el tumor o en la cavidad tumoral después de la extracción del tumor.

También puede permitir el uso clínico del virus y/o el inhibidor de puntos de control a dosis terapéuticas más bajas, conservando o incluso potenciando la eficacia anticancerosa al tiempo que aumenta la seguridad y reduce y/o evita los efectos secundarios. En vista del fuerte efecto sinérgico entre el virus y el inhibidor de puntos de control, es posible prever la reducción de las dosis terapéuticas, por ejemplo, la mitad o un tercio de las dosis de un solo componente usadas previamente conservan el efecto terapéutico deseado. En vista de las dosis reducidas (drástica), los efectos secundarios pueden reducirse o incluso evitarse.

En el caso del parvovirus, los efectos de la infección destruyen las células tumorales pero no dañan las células normales y dicha infección puede, por ejemplo, llevarse a cabo mediante el uso intratumoral de un parvovirus adecuado, por ejemplo, el parvovirus H-1, o un virus relacionado o vectores basados en dichos virus, para efectuar una terapia específica de tumor sin efectos neurológicos u otros efectos secundarios adversos.

Se puede usar una terapia de combinación de la invención antes o después de la cirugía para extraer un tumor y se puede usar antes, durante o después de la radioterapia.

Una terapia de combinación de la invención generalmente se usa para tratar un tumor que es lo suficientemente grande como para encontrarse por palpación o por técnicas de obtención de imágenes bien conocidas en la técnica, tal como MRI (por sus siglas en inglés), ultrasonido o exploración por tomografía computarizada. En algunas realizaciones preferidas, una terapia de combinación de la invención se usa para tratar un tumor en estadio avanzado que tiene dimensiones de al menos aproximadamente 200 mm3, 300 mm3, 400 mm3, 500 mm3, 750 mm3 o hasta 1000 mm3. La composición farmacéutica también puede comprender uno o más agentes terapéuticos adicionales. El agente terapéutico adicional puede ser, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente bioterapéutico (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos contra VEGF, EGFR, Her2/neu, receptores de VEGF, otros receptores de factores de crecimiento, CD20, CD40, CD40L, CTLA-4, OX-40 4-1BB e ICOS), un agente inmunogénico (por ejemplo, células cancerosas atenuadas, antígenos tumorales, células presentadoras de antígeno, tal como células dendríticas pulsadas con antígenos o ácidos nucleicos derivados del tumor, citocinas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF) y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes (como, por ejemplo, GM-CSF).

Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como ciclosfosfamida, busulfán, una camptotecina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, antibióticos, bleomicinas, caminomicina, dactinomicina, daunorrubicina, idarrubicina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato, citarabina, análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina, platino; etopósido (VP-16); ifosfamida, mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina, xeloda; ibandronato; inhibidores de topoisomerasas; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno o inhibidores de aromatasas.

La presente invención también se refiere al uso de (a) un parvovirus H-1 y (b) anticuerpo anti-PD1 o anticuerpo anti-PD-L-1 para la preparación de (a) composiciones o combinación farmacéuticas para el tratamiento del cáncer.

El modo de administración de (a) y (b) puede ser simultáneo o secuencial, en donde, preferentemente, (a) y (b) se administran secuencialmente (o por separado). Esto significa que (a) y (b) pueden proporcionarse en una única forma de dosificación unitaria para tomarse juntos o como entidades separadas (por ejemplo, en recipientes separados) para administrarse simultáneamente o con una determinada diferencia de tiempo. Esta diferencia de tiempo puede ser de entre 1 hora y 1 semana, preferentemente entre 12 horas y 3 días. Además, es posible administrar el virus a través de una vía de administración diferente al inhibidor de puntos de control. A este respecto, puede ser ventajoso administrar bien el virus o el inhibidor de puntos de control por vía intratumoral y el otro por vía sistémica u oral. En una realización preferida particular, el virus se administra por vía intratumoral y el inhibidor de puntos de control por vía intravenosa. Preferentemente, el virus y el inhibidor de puntos de control se administran como compuestos separados. También es posible el tratamiento conjunto con los dos agentes.

Cada agente terapéutico en una terapia de combinación de la invención puede administrarse bien solo o en un medicamento (también denominado en el presente documento composición farmacéutica) que comprende el agente terapéutico y uno o más transportadores, excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables, de acuerdo con una práctica farmacéutica convencional. Cada agente terapéutico en una terapia de combinación de la invención puede administrarse simultáneamente (es decir, en el mismo medicamento), de manera conjunta (es decir, en medicamentos separados administrados uno después del otro en cualquier orden) o secuencialmente en cualquier orden. La administración secuencial es particularmente útil cuando los agentes terapéuticos en la terapia de combinación están en diferentes formas de dosificación (un agente es un comprimido o cápsula y otro agente es un líquido estéril) y/o se administran en diferentes programas posológicos, por ejemplo, un agente quimioterapéutico que se administra al menos diariamente y un agente bioterapéutico que se administra con menos frecuencia, tal como una vez a la semana, una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas.

En algunas realizaciones, al menos uno de los agentes terapéuticos en la terapia de combinación se administra usando el mismo régimen posológico (dosis, frecuencia y duración del tratamiento) que se emplea generalmente cuando el agente se usa como monoterapia para tratar el mismo cáncer. En otras realizaciones, el paciente recibe una cantidad total menor de al menos uno de los agentes terapéuticos en la terapia de combinación que cuando el agente se usa como monoterapia, por ejemplo, dosis más pequeñas, dosis menos frecuentes y/o una duración más corta del tratamiento. El inhibidor de puntos de control y el virus oncolítico descritos en el presente documento pueden proporcionarse como un kit que comprende un primer envase y un segundo envase y un prospecto. El primer envase contiene al menos una dosis de un medicamento que comprende un inhibidor de puntos de control, preferentemente un antagonista anti-PD-1, el segundo envase contiene al menos una dosis de un medicamento que comprende un virus oncolítico y el prospecto o etiqueta, que comprende instrucciones para tratar a un paciente con cáncer usando los medicamentos. Los envases primero y segundo pueden estar compuestos de la misma o diferente forma (por ejemplo, viales, jeringas y bolos) y/o material (por ejemplo, plástico o vidrio). El kit puede comprender además otros materiales que pueden ser útiles en la administración de los medicamentos, tales como diluyentes, filtros, bolsas IV y revestimientos, agujas y jeringas. En algunas realizaciones preferidas del kit, el antagonista anti-PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 y las instrucciones indican que los medicamentos están destinados para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene un cáncer que da positivo para la expresión de PD-L1 mediante un ensayo IHC.

En la presente invención, se ha demostrado por primera vez que el uso combinatorio de un parvovirus H-1PV y el inhibidor de puntos de control pembrolizumab, puede ser un enfoque válido contra el cáncer, en particular contra tumor cerebral, carcinoma de colon y carcinomas pancreáticos. Como se describe más detalladamente en los ejemplos, fue sorprendentemente posible reducir el tamaño de metástasis en un tipo de tumor (CCR) que normalmente no responde al tratamiento con inhibidores de puntos de control. Incluso más sorprendentemente, se obtuvo una reducción considerable del tamaño del tumor en un glioblastoma multiforme primario inoperable.

Sin pretender quedar ligado a una teoría, como se mencionó anteriormente, los tumores se esconden de los ataques del sistema inmunitario mediante el uso de vías de puntos de control inmunitario, por ejemplo, a través de la unión de PD-L1 en el lado del tumor al receptor PD-1 en el lado de los linfocitos T. Esto da como resultado una tolerancia inmunitaria del cuerpo al tumor. Los inhibidores de puntos de control inmunitario son anticuerpos que bloquean las vías de puntos de control inmunitario (p. ej., Anticuerpos anti-PD-L1 o anti-PD1). Como resultado, la tolerancia inmunitaria se destruye y las células inmunitarias pueden reconocer el tumor y atacarlo. Sin embargo, esto no funciona para todos los tipos de tumor, ya que, con frecuencia, los tumores tienen un microambiente que hace imposible que las células inmunitarias activadas invadan el tumor. Esta invasión al tumor ahora es posible mediante el uso del virus oncolítico, en particular un parvovirus, más particularmente el parvovirus H-1, que ataca al tumor y cambia su microambiente. En otras palabras, el virus oncolítico es capaz de "desnudar" el tumor a través de la oncólisis y las células inmunitarias que se han "armado" utilizando el inhibidor de puntos de control son capaces de iniciar la invasión al tumor. El virus oncolítico puede verse como un agente de apertura de puerta para una respuesta inmunitaria exitosa. Con este concepto, debería ser posible tratar cualquier tipo de tumor, también aquellos en los que el tratamiento con inhibidores de puntos de control falló en el pasado ya que el tratamiento con virus oncolíticos transforma un tumor no inmunogénico en uno inmunogénico. En vista del principio general, esto funciona con cualquier virus oncolítico siempre que cambie el microambiente tumoral y con cualquier inhibidor de puntos de control. Esto podría conducir a efectos a largo plazo en la prevención de la recaída de la enfermedad, lo que podría aumentar la oncólisis inicial. Esta combinación de efectos hace que el tumor sea más susceptible al sistema inmunitario, en particular después de una terapia previa con el virus. Ejemplos de pacientes muestran que esta terapia combinada conduce bien a remisión o a enfermedad estable.

Al examinar la progresión del cáncer, se ha descubierto que se utiliza una interferencia evolutiva entre diferentes células, que implica especialmente a las células cancerosas y las células inmunitarias. Las células cancerosas pueden alterar el microambiente inmunitario y la función de las células inmunitarias, lo que conduce a la inmunosupresión y la evasión inmunitaria. (Fridman et al., 2012; Gabrilovich et al., 2012; Halama et al., 2011(a), 2011(b)). Por ejemplo, en el caso de las metástasis hepáticas de un cáncer colorrectal (CCR), se ha demostrado que el margen invasivo de las metástasis hepáticas por cáncer colorrectal es un microambiente inmunitario de sus propias dimensiones. Este entorno induce la migración de linfocitos T al margen invasivo después de un gradiente de quimiocinas distinto. Los linfocitos T infiltrantes ejercen efectos estimulantes tumorales a través de su propia producción de CCL5. El microambiente en las metástasis hepáticas de cáncer colorrectal no muestra un medio Th1, Th2 o Th17, sino que está optimizado para ^{la inflamación promotora de tumores que implica quimiocinas y factores de crecimiento tales como} VEGf, ^{HGF y MIF.} (Halama et al., 2016). En este artículo se han resaltado a) un panorama inmunosupresor, b) un posible mecanismo de protección tumoral de metástasis de cáncer colorrectal y c) las propiedades promotoras de tumores de subconjuntos de células inmunitarias específicas en tumores y metástasis. En esta publicación también se ha demostrado que las células tumorales son PD-L1 negativas en el margen invasivo. Esto puede ser una explicación de por qué el tratamiento con inhibidores de puntos de control no tuvo tanto éxito en varias entidades tumorales hasta el momento. Como se menciona previamente, el microambiente debe cambiarse por el virus oncolítico antes de que las células inmunitarias puedan ingresar con éxito al tumor y atacarlo. A este respecto, se hace referencia al Ejemplo 2 y las Figuras 1-9 que muestran que después del tratamiento con parvovirus H-1 y anticuerpo de PD1 se observó un aumento significativo en la densidad de linfocitos T en el tumor y que la mayoría de los linfocitos T son PD1 positivos.

A continuación se describirá la invención a modo de ilustración solo por referencia a los siguientes Ejemplos, Métodos y Figuras no limitantes.

Figuras

Fig. 1: La inmunofluorescencia de la Biopsia 1 de metástasis hepáticas (CD3) muestra áreas vitales tumorales, claro infiltrado de células CD3 positivas. Los infiltrados son heterogéneos

Fig. 2: La inmunofluorescencia de la Biopsia 1 de metástasis hepáticas (CD8) muestra un infiltrado claro de linfocitos T efectores, de nuevo, heterogéneo. De forma interesante, hay proximidad de linfocitos T CD8+ con epitelio tumoral, lo cual es raro de observar

Fig. 3: La inmunofluorescencia de la Biopsia 1 de metástasis hepáticas (PD-1) muestra que predominantemente el compartimento del estroma es rico en linfocitos T. La mayoría de ellos son PD1 positivos

Fig. 4: La inmunofluorescencia de la Biopsia 2 de metástasis hepáticas (CD3) muestra que después de la primera ^{infusión de H-1 PV anticuerpo de p}D-1 ^{se observó un aumento significativo en la densidad de linfocitos T} (aproximadamente 30-50 %). De nuevo patrón heterogéneo

Fig. 5: La inmunofluorescencia de la Biopsia 2 de metástasis hepáticas (CD8) muestra un aumento significativo en la densidad de linfocitos T CD8+. Muy heterogéneo. Contacto cercano de linfocitos T CD8 con células tumorales

Fig. 6: La inmunofluorescencia de la Biopsia 2 de metástasis hepáticas (PD-1) muestra que la mayoría de los linfocitos T son PD-1 positivos

Fig 7: La inmunofluorescencia de la Biopsia 3 de metástasis hepáticas (CD3) muestra que después de la segunda infusión de H-1 PV anticuerpo de PD-1 todavía hay un aumento en la densidad de linfocitos T. De nuevo muy heterogéneo.

Fig. 8: La inmunofluorescencia de la Biopsia 3 de metástasis hepáticas (CD8) muestra infiltrados de linfocitos T densos, similares a la biopsia 2

Fig. 9: La inmunofluorescencia de la Biopsia 3 de metástasis hepáticas (PD-1) muestra que todavía la mayoría de los linfocitos T son PD-1 positivos

Fig. 10-15: Perfiles de citocinas

Datos de la cuantificación de Múltiples Citocinas

Referencia para cuantificación de proteínas

Cantidades iguales de proteínas para cada biopsia

Se muestran las proporciones (las columnas punteadas tienen cantidades de proteínas demasiado bajas para ser fuertes)

Fig. 10: Proteínas Aumentadas/Reguladas Positivamente:

CTACK-CCL27, IL-16, SDF-1 alfa, IP-10, MIP-1b

Fig. 11: Proteínas Reducidas/Reguladas Negativamente:

G-CSF, IL-5, IL-7, IL-13, IL-12p40, FGF básico, MIF, SCGF-p, IL-1 alfa

Fig. 16: MRI de glioblastoma multiforme progresivo recurrente antes del tratamiento y durante el tratamiento (55 y 101 días después de la administración de H-1 PV pembrolizumab)

Fila superior: Antes del tratamiento con H-1 PV Pembrolizumab

Fila media: 55 días después de la administración de H-1 PV Pembrolizumab

Fila inferior: 101 días después de la administración de H-1 PV Pembrolizumab

Ejemplos

Ejemplo 1: Métodos Generales

(a) hibridación in situ fluorescente (FISH)

Ensayo FISH: El procedimiento del método se realizó esencialmente según lo descrito por Silahtaroglu et al (Molecular and Cellular Probes. 2003; 17:165-169) y Nehmé et al (J Neurosci Methods. 2011; 196:281-288). El ensayo FISH se estableció primero en células NBK humanas cultivadas in vitro y se extendió a tejido tumoral embebido en parafina derivado de xenoinjertos de glioma humano en ratas inmunodeficientes. El protocolo de ensayo se aplicó después para la detección de secuencias de ADN y ARN de H-1PV en material tumoral derivado de pacientes embebido en parafina o crioconservado.

Controles positivos y negativos: En cada ensayo FISH, se utilizaron tejidos tumorales embebidos en parafina que derivan de xenoinjertos de glioma humano tratados con H-1 PV o simulados en ratas como controles positivos o negativos, respectivamente. Tampoco se incluyeron controles de sonda (control negativo de sustitución de reactivo; sonda de hibridación específica de diana omitida) y de falta de coincidencia (sonda de hibridación específica de diana con 3-5 nucleótidos intercambiados).

Sondas de Hibridación: Las sondas de hibridación específicas para la diana se diseñaron a medida por Exiqon (Vedbaek, Dinamarca) para reconocer secuencias codificantes de proteínas no estructurales (NS, por sus siglas en inglés) y estructurales (VP, por sus siglas ne inglés) de H-1PV y se representaron oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado (ANB) con especificidad de diana aumentada y enlace de alta potencia (para una referencia, véase www.exigon.com). Las sondas se sintetizaron por complementación inversa ya sea a ADN de cadena negativa (en sentido) o positivo (antisentido) de H-1PV y se marcaron con digoxina doble (DIGN) en sus extremos 3' y 5'. Se aplicaron sondas específicas tanto de NS como de VP como una mezcla de cantidades iguales, para aumentar la señal de hibridación.

NSI-antisentido:

5DIGN/TCAGCACACAACAGATGGCAT/3DIGN

VP-antisentido:

5DIGN/TACTATCCAGAGCAACCATCAT/3DIGN

NS1-en sentido:

5DIGN/AATTCGCTAGGTTCAATGCGCT/3DIGN

VP-en sentido:

5DIGN/TGACCTACCAACATCAGATACA/3DIGN

Señal de visualización: La visualización de la señal se logró mediante incubación secuencial con anticuerpo anti-DIGN conjugado con peroxidasa de rábano picante (Roche, Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) y el reactivo de amplificación de señal de Tyramide (TSA)/cianina (Cy) 3 (Perkin Elmer, Alemania). La adquisición de imágenes se realizó utilizando un microscopio Zeiss Cell Observer y el software ZEN.

Cuantificación de la señal:. Para el análisis cuantitativo de señales positivas, se usó el software Fiji ImageJ y se realizó un análisis automatizado utilizando macros personalizadas especialmente desarrolladas (Dr. D. Krunic, Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg, Alemania) y configuraciones de procesamiento constantes. Los resultados se presentaron como intensidad promedio de señales positivas por campo de observación de microscopio (dFOV = 1,000 |jm) y/o como intensidad promedio de señales positivas por célula marcada. El valor de la fluorescencia de fondo (señales positivas falsas generadas por la sonda no coincidente) definió el límite entre las señales positivas y negativas. La intensidad de la señal se expresó en unidades arbitrarias (u.a.).

(b) Ensayos de cultivo Celular y Proliferación

Los linfocitos T se extrajeron de donantes sanos y después de un breve período de descanso se estimularon en placas de 96 pocilios recubiertas con CD3/CD28 (anti-CD3 de BioLegend, EE.UU., anti-CD8 de BD, Alemania) durante la noche. Los medios de cultivo de linfocitos T contenían RPMI 1640 (PAA, EE. UU.), suero humano al 10 % (inactivado por calor durante 30 minutos a 56 °C), Glutamina al 1 % (PAA, EE. UU.), penicilina/estreptomicina al 1 % (PAA, EE. UU.), aminoácidos no esenciales al 1 % (PAA, EE. UU.) y HEPES al 1 % (PAA, EE. UU.). Las líneas celulares tumorales comerciales se cultivaron de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. La cuantificación de las células se realizó por triplicado con mediciones dobles con el contador celular automatizado TC10 (BioRad, Alemania), especialmente directamente después de la siembra (es decir, 0.5 * 105 células/ml para ensayos de proliferación, células igualmente sembradas en placas) y después de la incubación/tratamiento. Las líneas celulares primarias se autenticaron mediante la Autenticación de Células Múltiples por Multiplexación (Heidelberg, Alemania) como se describió recientemente (Castro et al., 2013). Los perfiles SNP que coincidían con los perfiles conocidos eran únicos, consistentes con una línea celular de tumor epitelial humano. Todas las líneas celulares se analizaron para detectar contaminación por Mycoplasma por PCR.

La preparación de líquido ascítico (de pacientes con cáncer colorrectal) y la extracción de macrófagos y linfocitos se realizó de la siguiente manera. Adaptado de informes anteriores, se recogió líquido ascítico en bolsas de plástico estériles. La cánula de salida de cada bolsa se preparó mediante desinfección con alcohol al 70 % y la primera fracción de líquido ascítico se descarta mientras que el líquido ascítico restante se distribuye en tubos Falcon de 50 ml. Centrifugación a 1500 rpm durante 10 min. Los sobrenadantes se mezclaron con medio RPMI (1:2) y se usaron como medio acondicionado (CM, por sus siglas en inglés). Para las poblaciones de macrófagos (a), los sedimentos se resuspendieron después en medio RPMI y se ejecutaron por un gradiente de Ficoll (30 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente). La interfase se recogió después en RPMI, se lavó y se centrifugó (1800 rpm durante 10 min) y los sedimentos resultantes se sembraron en matraces de células con RPMI. Para las poblaciones de macrófagos, los sobrenadantes se cosecharon después de una etapa de adherencia de 1,5 h (37 °C), las células adherentes restantes se lavaron después con PBS (tres veces) y luego se complementaron con CM. Para linfocitos (b), Los sedimentos se resuspendieron después en medio RPMI centrifugado de nuevo y los sedimentos se sembraron en matraces de células con RPMI. Después de la adherencia, el sobrenadante se utilizó para extraer linfocitos. Después de los experimentos bien con macrófagos o linfocitos, se midió el sobrenadante para detectar citocinas y las células se cosecharon y analizaron con tinciones (doble tinción CD163 y CD68 para macrófagos, CEA para células tumorales y CD3 para linfocitos) y se controló para detectar la pureza del contenido celular (> 95 %). La extracción de las células tumorales se realizó después de la disociación del tejido tumoral y de las etapas de adhesión.

(c) Cuantificación de Citocinas y Quimiocinas

Un lector de matriz de dos láseres cuantifica simultáneamente todas las citocinas y quimiocinas de interés. Las curvas y concentraciones patrón se calcularon con Bio-Plex Manager 4.1.1 basándose en la fórmula de regresión logística de 5 parámetros de la gráfica. Brevemente, se transfirieron pequeños trozos de tejido congelado disecado en 150 pl de tampón de lisis frío, se agitó vorticialmente, se congeló a -80 °C (10 min) y se descongeló en hielo. Después de la incubación en un baño ultrasónico frío (10 min), las muestras se congelaron de nuevo a -80 °C, se descongelaron en hielo y se centrifugaron (13,000 rpm, 20 min, 4 °C). Se determinó la concentración de proteína del sobrenadante y la concentración de lisados se ajustó a 1000 pg/ml (300 pg/ml para biopsias) utilizando diluyente de suero humano (BioRad) y las concentraciones de citocinas/quimiocinas en los lisados de tejidos se cuantificaron mediante matrices de proteínas múltiples, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioRad Laboratories, Hércules, CA, EE.UU.). La sensibilidad de detección de los analitos varió de 1 pg/ml a 100 ng/ml. Los valores que la plataforma identificó como "Fuera de intervalo" se extrapolaron en función de las curvas patrón únicas que se generaron para cada analito. Como las curvas patrón mostraron desviaciones típicas mínimas, se usó la concentración patrón más alta concentrada para la extrapolación. Para formar clases de citocinas (en orden descendente, por ejemplo, TH1, TH2, TH17, etc.), se utilizó la base de datos AMIGO (hftp: //amigo.geneontology.org/) para evaluar términos específicos (por ejemplo, GO:0043030: regulación de la activación de macrófagos, GO:0042104: regulación positiva de la proliferación de linfocitos T activados o GO:0006935: quimiotaxis) o búsquedas bibliográficas. Se utilizaron para el análisis los controles positivos de las muestras con citocinas dominadas por TH1, TH2 o TH17.

La reproducibilidad general (precisión) del enfoque de cuantificación de proteínas múltiples en secciones en serie mostró una excelente reproducibilidad (correlación de rango de Spearman con r = 0,975 y p = 0,0001, diferencia de medianas de 70 pg/ml). La precisión se evaluó en mediciones de soluciones con concentraciones conocidas de la citocina, por ejemplo, CCL5 a 25,000 pg/ml que mostró una desviación típica de 628,92 pg/ml, correspondiente al 2,5 % del valor esperado y CCL5 a 100 pg/ml que mostró una desviación típica de 2,7 pg/ml, correspondiente al 2,7 % del valor esperado. La calibración de los analitos investigados se realiza según lo recomendado por el fabricante (BioRad, Alemania) y los presentes inventores se refieren a la página de inicio del fabricante para obtener material de referencia adicional sobre exactitud y precisión (http://www.biorad.com/web-root/web/pdf/lsr/literature/Bulletin 5803A.pdf).

La comparación entre diferentes cuantificaciones de proteínas de margen invasivo de sección en serie también reveló una excelente reproducibilidad (correlación de rango de spearman rho = 0,922, p=0,0001). Finalmente, la comparación de las proporciones de material microdisecado asistido por láser con material macrodisecado reveló que el margen invasivo es de hecho una región separada con precisión con perfiles de citocinas reproducibles y distintos. Además, las diferencias con el hígado adyacente circundante o la metástasis hepática son tan pronunciadas que la muestra macrodisecada se parece completamente a los patrones encontrados en la muestra microdisecada.

La generación de datos de citocinas y quimiocinas a partir de material de biopsia se realizó como se describe anteriormente. Debido a las limitaciones en la cantidad de material disponible, las concentraciones de proteínas utilizadas para los ensayos se establecieron en 300 mg. Histológicamente, el hígado adyacente de los pacientes permaneció sin cambios durante el tratamiento en comparación con antes del tratamiento, con respecto a la morfología y la presencia de células inmunitarias. Por lo tanto, como control para la precisión de la medición de citocinas (y para evaluar los efectos de la dilución, etc.), se usaron los niveles de citocinas del hígado adyacente antes y durante el tratamiento y mostraron una excelente concordancia (correlación de rango de Spearman rho = 0,991 y p = 0,0001, diferencia de medianas de 5 pg/ml). Esto también hace que los efectos de la cicatrización de heridas (que ya no deberían estar presentes después del día 8 después de la biopsia) no interfieran con los efectos de la inhibición de CCR5. El porcentaje de células tumorales apoptóticas se determinó contando los núcleos apoptóticos (según la morfología nuclear) y las células tumorales intactas en secciones teñidas con hemalaun y/o H&E como se describe anteriormente (Duan et al., 2003).

(d) Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia

Los tejidos FFPE se desparafinaron y rehidrataron (BOND Dewax Solution, Leica, Alemania). Después de la recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) a 100 °C (BOND Epitope Retrieval Solution 1 o 2, Leica, Alemania), la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó mediante incubación con un 3 % de bloqueo de peróxido durante 20 minutos (BOND Polymer Refine Detection System, Leica, Alemania). Las secciones se bloquearon con suero de cabra normal al 10 % (Vector, EE. UU.). A continuación se puede encontrar una lista de los anticuerpos y las diluciones usadas. Estos se aplicaron como anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón de conejo, Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Alemania) durante 8 minutos a temperatura ambiente. Se logró una mayor amplificación de la señal mediante incubación con un tercer anticuerpo, conjugado con peroxidasa de rábano picante y acoplado a moléculas de dextrano en grandes cantidades, durante 8 minutos a temperatura ambiente (Poli-HRP-ratón-anti-IgG de conejo, Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Alemania). La detección del antígeno se realizó mediante una reacción de color con 3,3-di-amino-bencidina (cromógeno DAB, Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Alemania). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina (Bond Polymer Refine Detection System, Leica, Alemania) y se montaron con Aquatex (Merck, Alemania). Los controles de isotipo emparejado se usaron como control negativo y el tejido normal adyacente o las células positivas conocidas se usaron como control positivo.

La doble tinción de inmunofluorescencia se realizó en criosecciones usando una anti-IgG de ratón de burro marcada con colorante Alexa Fluor 594 de fluorescencia roja (Life Technologies, Alemania) y una anti-IgG de conejo de cabra marcada con colorante Alexa 488 de fluorescencia verde (Life Technologies, Alemania) secuencialmente para las tinciones dobles de quimiocinas (o en el caso de anti-IgG de ratón de cabra marcada con colorante Alexa 488 de fluorescencia verde, se omitió el segundo anticuerpo primario para el control). Para el análisis de CD68, PD-L1, CD4, CD8 y CCL5 se usaron simultáneamente una anti-IgG de conejo de burro marcada con colorante Alexa Fluor 594 de fluorescencia roja (Invitrogen, Alemania) y una anti-IgG de ratón de cabra marcada con colorante Alexa 488 de fluorescencia verde (Life Technologies, Alemania). Para el análisis de CD3 y CCL5 se utilizaron las sondas moleculares de anti-IgG de ratón de cabra con Alexa Fluor 555 (H+L) A21422 y anti-IgG de conejo de cabra con Alexa Fluor 488. Las criosecciones se fijaron con PFA al 4 % o acetona al 33 % en metanol antes de la tinción de acuerdo con las recomendaciones de anticuerpos. Después de la incubación del primer anticuerpo primario durante la noche a 4 °C, se aplicó Alexa Fluor 594 (dilución 1:100) durante 1 hora. El segundo anticuerpo primario se aplicó durante 3 horas a temperatura ambiente y se detectó con Alexa Fluor 488 (dilución 1:100) durante 1 hora durante la doble tinción secuencial. Para la tinción simultánea, ambos anticuerpos primarios se incubaron durante la noche después de ambos anticuerpos con Alexa Fluor (dilución 1:100 cada uno) durante 1 hora. Las secciones se montaron usando Vectashield con DAPI (Vector, EE. UU.) para la contratinción. Se obtuvieron imágenes confocales en un sistema de microscopio confocal Nikon C2 Plus.

Anticuerpos monoclonales de ratón que reconocen CD3épsilon humana (dilución 1:100 y HIER1 para FFPE, fijación con PFA al 4 % y HIER2 para criosecciones, clon PS1, Novocastra, RU y anti-CD3 de conejo monoclonal, clon Sp7 de Abcam), CD8 (dilución 1:50 y HIER2 para FFPE, dilución 1:100 y fijación con PFA al 4 % y para criosecciones, clon 4B11, Novocastra, RU), CCR5 (dilución 1:50 y HIER1 para FFPE, dilución 1:100, fijación con PFA al 4 % y HIER1 para criosecciones, clon MM0065-6H20, abcam, RU), CCL5 (dilución 1:50 y fijación con PFA al 4 % para criosecciones, clon VL1, BioLegend, E.E.U.U.), PD1 (dilución 1:50 y HIER1 para FFPE, fijación con acetona al 33 % en metanol para criosecciones, clon NAT, abcam, RU), CD68 (dilución 1:200 y HIER1 para FFPE, dilución 1:700 y fijación con acetona al 33 % en metanol para criosecciones, clon KP1, abcam, RU), CD163 (dilución 1:500 y HIER2 para FFPE, fijación con acetona al 33 % en metanol para criosecciones, clon EDHu-1, AbD Serotec, RU), CD44 (dilución 1:9000 y HIER1 para FFPE, dilución 1:5000, fijación con PFA al 4 % y HIER2 para criosecciones, clon 156-3C11, abcam, RU), CD74 (dilución 1:50 y HIER 1 para FFPE, dilución 1:75, fijación con PFA al 4 % y HIER2 para criosecciones, clon LN2, abcam, RU), Ki67 (dilución 1:200, fijación con PFA, clon MIB-1, DAKO, E.E.U.U.). CCR1 (dilución 1:50 y HIER1 para FFPE, fijación con PFA al 4 % y HIER1 para criosecciones, clon MM0061-7B17, abcam, E.E.U.U.), CXCL9 (dilución 1:100 y fijación con acetona al 33 % en metanol para criosecciones, clon MM0220-7F11, abcam, RU), CD11b (dilución 1:50 y fijación con acetona al 33 % en metanol para criosecciones, clon 2Q902, abcam, RU) y CXCL10 (dilución 1:50 y fijación con acetona al 33 % en metanol para criosecciones, clon 6D4, abcam, RU), interferón-alpha2 (dilución 1:50, clon EBI-1, eBioscience) e interferón-gamma (dilución 1:00, clon B27, BioLegend). Anticuerpos de conejo que reconocen PD-L1 humana (dilución 1:50 y HIER2 para FFPE, dilución 1:150 y fijación con PFA al 4 % y para criosecciones, policlonal, abcam, RU), CCR3 (dilución 1:800, HIER1 y fijación con PFA al 4 % para criosecciones, clon Y31, abcam, RU), CD4 (dilución 1:150 y fijación con PFA al 4 % para criosecciones, clon SP35, Zytomed Systems, Alemania), CD11b (dilución 1:500 y fijación con PFA al 4 %, clon EP1345Y, abcam, RU), CD8 (dilución 1:150 y fijación con PFA al 4 % para criosecciones, clon SP16, Zytomed Systems, Alemania) y CEACAM5 (dilución 1:100, clon 327, Sino Biological). La tinción clásica con H&E y TUNEL se realizó de acuerdo con la descripción del fabricante (kit de detección de muerte celular in situ, Roche, Alemania) y se usaron secciones en serie para cuantificar las células tumorales muertas comparando TUNEL frente a análisis morfológico. Como la comparación lado a lado de las secciones de tejido confirmó el excelente valor diagnóstico del análisis morfológico como se publicó anteriormente (Duan et al., 20Ó3). el análisis morfológico fue el método preferido para la evaluación.

(e) Cuantificación Completa de Células (Inmunitarias) de los Portaobjetos

El número de células inmunitarias teñidas se contó usando un sistema de análisis de imagen informatizado que consiste en un Nanozoomer NDP (Hamamatsu Photonics, Japón) conectado a un ordenador personal. Se obtuvieron automáticamente imágenes microscópicas completas de secciones de tejido completas (microscopía virtual) y se usó para el análisis la densidad celular promedio en la región medida. Los recuentos de células se generaron con un programa de software desarrollado específicamente (VIS software suite, Visiopharm, Dinamarca) a lo largo de una región de interés dada (en promedio 10 mm2, con hasta 40 mm2) como se informó anteriormente (Halama et al., 2011b; Halama et al., 2010; Halama et al., 2009b). Todas las evaluaciones se verificaron visualmente para examinar su consistencia.

(f) Citometría de flujo

Para cada experimento, el tejido del margen invasivo de las metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (hasta 10 g) se disocia por corte y múltiples etapas de lavado utilizando un filtro de células de 40 pm y medio RPMI. Las células extraídas se colocaron después en una placa de 24 pocillos con medio RPMI (complementado con FCS al 10 %) durante la noche y después se bloquearon opcionalmente con Monensina (BD Biosciences, Alemania) durante tres horas. A continuación, las células se cosecharon, centrifugaron y analizaron para determinar CD3, CD8, CD4 y CCL5 utilizando protocolos convencionales de citometría de flujo.

La tinción superficial se llevó a cabo de la siguiente forma: por cada 100 pl de tampón FACS se utilizaron 2,5 pl de CD3-V450 (560365, BD, Alemania), 1,25 pl de CD4-PerCP-Cy5.5 (560650, BD, Alemania) y 2,5 pl de CD8-APC-H7 ( 641400, BD Biosciences, Alemania), seguido de 20 minutos de incubación en hielo (protegido de la luz) y centrifugación. La tinción intracelular se realizó después tomando células en PFA al 1 % e incubación durante 15 minutos, seguido de tres etapas de lavado con tampón de Saponina al 0,1 % (y centrifugación). La tinción de CCL5 se realizó de la siguiente manera: por cada 100 pl de tampón de Saponina al 0,1 %, se usaron 5 pl de anti-RANTES humanos (CCL5)-eFluor660 (AF647, eBioscience, Reino Unido) o IgG2bk de ratón de control de isotipo-eFluor660 con 1,25 pl (AF647, eBioscience, Reino Unido), seguido de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente (protegido de la luz) y dos etapas de lavado con tampón de Saponina al 0,1 %. Las células marcadas se sometieron después a FACS usando un citómetro BD Biosciences FACS Canto II (Harvard Stem Cell Institute), seleccionado contra controles negativos.

Para establecer el control positivo antes de medir el tejido tumoral e identificar las poblaciones de linfocitos, los linfocitos de donantes sanos se trataron como se describe anteriormente.

Ejemplo 2: Tratamiento de modalidad combinada con parvovirus H-1 e inhibidor de puntos de control en un paciente que tiene un CCR (cáncer colorrectal) metastatizando

Un paciente que padecía cáncer colorrectal (adenocarcinoma de colon transversal poco diferenciado; estado de ^mutación: KRAs Ts, ^{NRAS TS, MSS; primera cirugía 2013) con metástasis hepáticas progresivas (progresión en} tamaño y número) se trató con una dosis acumulativa de 1,2 x 109 UFP de parvovirus H-1 aplicado en tres infusiones diarias consecutivas (4 x 108 ufp; día 1-3), seguido de tratamiento con el inhibidor de puntos de control inmunitario pembrolizumab (Keytruda®) de acuerdo con la posología del fabricante (2 mg/Kg/PC, día 1). Este tratamiento con el mismo régimen posológico se repitió después de 5 semanas.

Las biopsias realizadas en la metástasis hepática se tomaron antes del tratamiento y en varios momentos durante el tratamiento con los siguientes hallazgos sorprendentes: en comparación con la primera biopsia anterior al tratamiento con H-1PV pembrolizumab, se observó infiltración linfocítica que aumentó en biopsias posteriores (segunda y tercera biopsias). Asimismo, el análisis de imágenes (ultrasonido, CT, MRI) reveló una reducción masiva de las metástasis hepáticas.

Se hace referencia a las figuras 1-9 que muestran que durante el tratamiento se observó un aumento significativo en la densidad de linfocitos T, con una población dominante de linfocitos T CD8+. Los infiltrados de linfocitos T son heterogéneos con proximidad sorprendente de linfocitos T con células tumorales. La mayoría de los linfocitos T son PD1 positivos.

La cuantificación de citocinas y quimiocinas se ha realizado utilizando el método descrito en el Ejemplo 1 anterior. Los perfiles se muestran en las Fig. 10 a 15. Parece que prevalecen los aumentos de IP10 y CCL5. No hubo aumento en IL-2 y solo incrementos leves en interferón gamma.

Se realizó un análisis FISH como se describe en el Ejemplo 1 (a) anterior. Esto muestra que el virus activo (H-1 PV) se puede determinar en la biopsia 2. Esta es una clara indicación de que el virus migró al tumor/metástasis.

Ejemplo 3: Tratamiento de modalidad combinada con parvovirus H-1 e inhibidor de puntos de control en un paciente con GBM (glioblastoma multiforme) primario inoperable

Un paciente con glioblastoma multiforme inoperable fue tratado con una dosis acumulada de 1,2 x 109 UFP de parvovirus H-1 aplicado en tres infusiones diarias consecutivas, seguido de tratamiento con pembrolizumab (Keytruda®) de acuerdo con la posología del fabricante (2 mg/Kg/PC, 3 días después de la administración de H1-PV). La MRI se tomó antes de la terapia y durante el tratamiento con H-1 PV inhibidor de puntos de control pembrolizumab. Esta reveló una reducción de tamaño del tumor superior al 30 % después de 55 días de tratamiento y una remisión casi completa en el día 101. El paciente está bien y no requiere ningún medicamento adicional. Las m R i se muestran en la Fig. 16.

Lista de Referencias:

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Deutsches Krebsforschungszentrum

<120>Terapia contra el cáncer con un virus oncolítico combinado con un inhibidor de puntos de control <130> K3612EP

<140> EP16020193.58

<141> 27/05/2016

<160> 4

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sonda NS1 antisentido

<400> 1

tcagcacaca acagatggca t 21

<210> 2

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> VP antisentido

<400>2

tactatccag agcaaccatc at 22

<210>3

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> sonda NS-1 en sentido

<400> 3

aattcgctag gttcaatgcg ct 22

<210> 4

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> VP en sentido

<400> 4

tgacctacca acatcagata ca 22

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación farmacéutica que contiene (a) parvovirus H-1 y (b) un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD-L1.

2. La combinación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD1 es pembrolizumab o nivolumab.

3. La combinación farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados de agentes quimioterapéuticos, agentes bioterapéuticos, unos agentes inmunogénicos, citocinas inmunoestimulantes y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes.

4. La combinación farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en un método para tratar cáncer.

5. La combinación farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde (a) el parvovirus H-1 y (b) el anticuerpo anti-PD1 o el anticuerpo anti-PD-L1 se administran secuencialmente.

6. La combinación farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde el uso es para tratar tumores sólidos, cáncer hematológico y/o células madre iniciadoras de cáncer.

7. La combinación farmacéutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el cáncer es cáncer cerebral, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñón, carcinoma de células escamosas de cabeza/cuello, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de células renales o cáncer de estómago.

8. La combinación farmacéutica para el uso de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 7, en donde el cáncer cerebral es glioblastoma multiforme.

9. La combinación farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde (a) el parvovirus H-1 y (b) el anticuerpo anti-PD1 o el anticuerpo anti-PD-L1 se administran mediante administración intratumoral o intravenosa.

10. Un kit que comprende un primer envase, un segundo envase y un prospecto, en donde el primer envase comprende al menos una dosis de una composición farmacéutica que contiene parvovirus H-1, el segundo envase comprende al menos una dosis de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD -L1 y el prospecto comprende instrucciones para tratar a un individuo que tiene cáncer usando las composiciones farmacéuticas.

11. El kit de la reivindicación 10, en donde el cáncer es cáncer cerebral, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñón, carcinoma de células escamosas de cabeza/cuello, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de células renales o cáncer de estómago.

12. El kit de la reivindicación 11, en donde el cáncer cerebral es glioblastoma multiforme.