ES2754271T3 - Polipéptidos escindibles por enteroquinasa - Google Patents
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Abstract
Método para producir un polipéptido diana, dicho método que comprende las etapas: a) expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula: Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1 en donde Z1 es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos; X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M; X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I; X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente; Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional; en donde dicho polipéptido diana es Z1 en la fórmula (I); b) poner en contacto dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa con una Enteroquinasa en condiciones que facilitan la escisión; y c) aislar opcionalmente dicho polipéptido diana; en donde al menos uno de X4 y X5 es E o D.
Description
DESCRIPCIÓN
Polipéptidos escindibles por enteroquinasa
La presente invención se refiere a los campos técnicos de la expresión de proteínas y la química de proteínas donde una proteína madura se libera de una proteína de fusión.
Antecedentes de la invención
Las técnicas de la expresión de proteínas recombinantes permiten la producción de grandes cantidades de proteínas convenientes que pueden usarse por ejemplo por su actividad biológica. Dichas proteínas se expresan frecuentemente como proteínas de fusión recombinantes en células huésped microbianas. La proteína de interés se une frecuentemente a una proteína pareja de fusión o una extensión más pequeña de amino ácidos para aumentar el nivel de expresión, facilitar la secreción, aumentar la solubilidad, promover el plegamiento de la proteína, para proteger la proteína contra la proteólisis no intencionada o para facilitar la purificación de la proteína de interés. La proteína pareja de fusión debe eliminarse de la proteína de fusión mediante proteólisis para obtener la proteína de interés.
Una proteasa usada para tal procesamiento es la enteroquinasa (E.C. 3.4.21.9). La función biológicamente natural de esta proteasa es convertir tripsinógeno en tripsina mediante la escisión en un sitio de procesamiento DDDDK (SEQ ID NO: 2, de aquí en adelante D4K) en el zimógeno (Biochim. Biophys Acta 20 (1956) 443-434).
De manera similar, para permitir la eliminación catalizada por la enteroquinasa de una proteína pareja de fusión se inserta un sitio de procesamiento D4K entre la proteína pareja de fusión y la proteína de interés. La especificidad y eficiencia del procesamiento catalizado por la enteroquinasa de la proteína de fusión depende ahora de las velocidades de hidrólisis relativas del sitio D4K y de los sitios potenciales de degradación internos en la proteína de interés. La enteroquinasa tiene actividad no solo para el sitio D4K sino también para muchas otras secuencias, véase por ejemplo Anal. Biochem. 106 (1980) 199-206.
Se ha usado una serie de enfoques para remediar las desventajas de la enteroquinasa que tiene especificidad limitada del sustrato.
El documento US6906176 describe una serie de secuencias peptídicas que se escinden más eficientemente por la enteroquinasa con relación al sitio D4K.
El documento PNAS 103 (2006) 7583-7588 describe secuencias de péptidos que se escinden más rápidamente por la enteroquinasa que el sitio D4K.
El documento Protein Expr. Purif. 41 (2005) 332-340 describe una proteína que comprende la secuencia peptídica LKGDR (SEQ ID NO: 3) como más efectiva que el sitio D4K para la escisión por la enteroquinasa.
El documento Protein Expr. Purif. 59 (2008) 314-319 describe el aumento de la especificidad de la escisión de la enteroquinasa mediante la realización de la reacción de escisión en presencia de urea.
Existe la necesidad de reacciones de escisión de enteroquinasa más específicas para eliminar una proteína pareja de fusión sin escindir sitios internos en la proteína madura y sin dejar ninguna extensión de aminoácido en la proteína madura. Preferentemente, esta reacción de escisión de la enteroquinasa es adecuada para llevarse a cabo durante un proceso industrial para la fabricación de la proteína madura. Existe además la necesidad de una reacción de escisión de enteroquinasa más específica que pueda usarse para muchas proteínas diferentes en condiciones de proceso leve de manera que no se produzcan cambios químicos y físicos no intencionados en la proteína madura. Breve descripción de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden un sitio de escisión de Enteroquinasa que se hidroliza significativamente más rápido que cualquier sitio de escisión secundario que pueda estar presente en dichos polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa. También es un objetivo de la presente invención proporcionar polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden un sitio de escisión de Enteroquinasa que es químicamente estable.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un método para producir un polipéptido diana, dicho método que comprende las etapas:
a) expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula: Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Zi es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente;
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional;
en donde dicho polipéptido diana es Z1 en la fórmula (I);
b) poner en contacto dicho polipéptido escindible por Enteroquinasa con una Enteroquinasa en condiciones que facilitan la escisión; y
c) opcionalmente aislar dicho polipéptido diana,
en donde al menos uno de X4 y X5 es E o D.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona un polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Z1 es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente; y
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional; y
en donde i) Z1 comprende un polipéptido funcional, tal como un polipéptido farmacéuticamente activo o una enzima, o ii) dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa consiste en la fórmula (I) y Z2 comprende 40 o menos residuos de aminoácidos, tales como Z2 está ausente, Z2 es un residuo de aminoácido o Z2 es un polipéptido que comprende de 2-40 residuos de aminoácidos;
en donde al menos uno de X4 y X5 es E o D.
En una modalidad X4 es D. En una modalidad X4 es E. En otra modalidad X5-X4 es DE. En otra modalidad X5-X4 es DD.
En otra modalidad Z1 es un péptido de GLP-1.
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la fórmula (I).
De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la fórmula (I), cuya secuencia de ADN se une operativamente a un promotor corriente arriba y un terminador corriente abajo.
De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped que comprende el vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la fórmula (I), cuya secuencia de ADN se une operativamente a un promotor corriente arriba y un terminador corriente abajo.
Descripción
En una modalidad, la invención se refiere a un polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula (I):
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Zi es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente; y
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional. En una modalidad, el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa consiste en la fórmula (I);
en donde al menos uno de X4 y X5 es E o D.
El término “Enteroquinasa” como se usa en la presente se refiere a una hidrolasa pancreática que cataliza la activación por escisión del tripsinógeno en tripsina como parte de la cascada catalítica involucrada en el proceso digestivo. “Enteroquinasa” incluye la enzima nativa aislada de cualquier fuente así como también la enzima producida por la expresión recombinante. Un ejemplo no limitante de Enteroquinasa es el dímero de origen natural que comprende una cadena pesada unida por disulfuro de aproximadamente 115 kDa y una cadena ligera más pequeña de aproximadamente 35 kDa. Otro ejemplo no limitante de Enteroquinasa es la cadena ligera sola que comprende el dominio catalítico. La cadena ligera sola así como también sus variantes funcionales se han descrito para funcionar bien como enzima Enteroquinasa, c.f. WO2013/092855A1.
El término “polipéptido de fusión” como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que comprende dos o más polipéptidos fusionados juntos tal como para constituir un polipéptido de origen no natural. El tamaño de los polipéptidos fusionados puede variar y depende del propósito del polipéptido de fusión. Los polipéptidos de fusión se usan frecuentemente durante la expresión recombinante de proteínas por razones de aumentar la expresión, facilitar el mantenimiento de un producto de expresión soluble, facilitar la excreción del polipéptido de fusión o parte de este al medio extracelular, proteger al polipéptido de que se procese no intencionalmente por proteasas o peptidasas y similares. En tales polipéptidos de fusión uno de al menos dos polipéptidos constituyentes se designa frecuentemente como el “polipéptido diana” o “proteína madura”, es decir, es el polipéptido que debe fabricarse mediante el proceso de expresión recombinante.
El término “polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa” como se usa en la presente se refiere a un polipéptido de fusión que comprende dos polipéptidos fusionados juntos en cada extremo de un sitio de escisión de Enteroquinasa tal como para constituir un polipéptido de origen no natural que en las condiciones adecuadas puede escindirse por una Enteroquinasa en el sitio de escisión de Enteroquinasa que une los dos polipéptidos. Por lo tanto, el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa es un polipéptido de origen no natural. Debe comprenderse que cada uno de los dos polipéptidos comprendidos por el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa puede contener sitios secundarios que también se reconocen y escinden por Enteroquinasa. Sin embargo, tales sitios de escisión secundarios experimentarán escisión por Enteroquinasa a una velocidad menor que la velocidad a la que la Enteroquinasa escinde el sitio de escisión pretendido de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, todos los sitios secundarios de escisión de Enteroquinasa en el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa se escinden por Enteroquinasa a una velocidad que es menor que la velocidad de escisión de un sitio D4K correspondiente.
En el presente contexto los términos “proteína”, “polipéptido” y “péptido” pueden usarse indistintamente para designar un polipéptido. Debe entenderse que el término en particular utilizado no tiene limitación con relación al tamaño de la molécula (a menos que se indique directamente en el contexto particular).
Los residuos de aminoácidos se designan de acuerdo con una abreviatura de una única letra de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC, por ejemplo D significa ácido aspártico (Asp) y G significa glicina (Gly).
“Aminoácidos codificados genéticamente” como se usa en la presente está destinado a referirse al grupo que consiste en los siguientes aminoácidos: G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, T así como cualquier modificación biológica de estos. En una modalidad los aminoácidos adecuados para su uso en la presente invención comprenden isoésteres de los aminoácidos codificados genéticamente. Ejemplos no limitantes de tales modificaciones biológicas son por ejemplo amidación, glicosilación y formación de enlaces disulfuro.
“Análogos” como se usa en la presente está destinado a referirse a proteínas que se derivan de otra proteína mediante sustitución, deleción y/o adición de uno o más residuos de aminoácidos a partir de la proteína. Un ejemplo no limitante de análogos de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 4) son K34R-GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 5) donde el residuo 34 se ha sustituido por un residuo de arginina y K34R-GLP-1(9-37) (SEQ ID NO: 6) donde el residuo 34 se ha sustituido con un residuo de arginina y los residuos de aminoácidos 7-8 se han eliminado (mediante el uso de la
numeración común de residuos de aminoácidos para los péptidos de GLP-1). En una modalidad GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 4) es HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG.
“Variante funcional” como se usa en la presente está destinado a referirse a una variante química de una cierta proteína que conserva sustancialmente la misma función principal que la proteína original. Por tanto una variante funcional típicamente es una versión modificada de una proteína en donde se introducen pocas modificaciones según sea necesario para que la proteína modificado obtenga alguna propiedad conveniente a la vez que conserva sustancialmente la misma función principal de la proteína original. Los ejemplos no limitantes de variantes funcionales son, por ejemplo, proteínas extendidas, proteínas truncadas, proteínas de fusión y análogos. Los ejemplos no limitantes de variantes funcionales de la cadena ligera de la Enteroquinasa bovina son por ejemplo, la cadena ligera de la Enteroquinasa bovina C112A. Un ejemplo no limitante de una variante funcional de GLP-1(7-37) es K34R-GLP-1 (7-37).
En una modalidad, una variante funcional de una proteína comprende de 1-2 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con dicha proteína. En otra modalidad, una variante funcional comprende de 1-5 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con dicha proteína. En otra modalidad, una variante funcional comprende de 1-15 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos con relación a la proteína de origen natural correspondiente o a la subsecuencia de una proteína de origen natural.
En una modalidad Z2 comprende un dominio de solubilización. "Dominio de solubilización", como se usa en la presente descripción, pretende significar una proteína que es parte de una proteína de fusión y que hace que dicha proteína de fusión sea más soluble que la proteína pareja de fusión en sí bajo ciertas condiciones. Los ejemplos no limitantes de dominios de solubilización que pueden usarse como Z2 en la fórmula (I) son DsbC (proteína de intercambio de tiol:disulfuro), RL9 (proteína ribosomal L9) como se describió en el documento WO2008/043847, MPB (proteína de unión a maltosa), NusA (proteína de terminación/antiterminación de la transcripción) y Trx (Tiorredoxina).
“Polipéptido de origen no natural” como se usa en la presente descripción pretende referirse a un polipéptido que no se conoce que se produzca o que no se produce en la naturaleza sin la intervención del hombre. Un ejemplo no limitante de un polipéptido de origen no natural es, por ejemplo, un polipéptido de fusión donde dos proteínas de diferentes fuentes se fusionan juntas como un polipéptido.
El término “péptido de GLP-1”, como se usa en la presente, está destinado para designar a GLP-1 (7-37), GLP-1 (7 36) amida así como análogos de estos, que puedan producirse mediante técnicas convencionales de ADN recombinante así como métodos sintéticos convencionales. Dichos péptidos de GLP-1 incluyen pero no se limitan al péptido 1 nativo similar al glucagón, que también puede referirse como GLP-1 humano, por ejemplo los fragmentos peptídicos que comprenden GLP-1 (7-37) y variantes funcionales de estos como las descritas en el documento WO 87/06941; los fragmentos peptídicos que comprenden GLP-1 (7-36) y derivados funcionales de estos como se describe en el documento w O 90/11296; los análogos de los péptidos activos de GLP-1 7-34, 7-35, 7-36, y 7-37 como se describe en el documento WO 91/11457; los fragmentos de GLP-1 truncados en el extremo N-terminal como se describe en el documento EP 0699686-A2; y los análogos y derivados de GLP-1 que incluyen un grupo imidazol N-terminal como se describe en el documento EP 0708179-A2. Ejemplos no limitantes de un péptido de GLP-1 es GLP-1(7-37), y K34R-GLP-1(7-37) y exendina-4(1-39) (SEQ ID NO: 7). En una modalidad exendina-4(1-39) (SEQ ID NO: 7) es HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS.
“Péptido de glucagón” como se usa en la presente descripción se refiere a un polipéptido de la familia de preproglucagón que tiene afinidad por el receptor de glucagón. Los ejemplos no limitantes de un péptido de glucagón son glucagón(1-29) (SEQ ID NO: 8) y sus análogos. En una modalidad glucagón(1-29) (SeQ ID NO: 8) es HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT.
“Precursor de insulina” como se usa en la presente descripción se refiere a un polipéptido que comprende la cadena A y la cadena B de una insulina y opcionalmente un C-péptido intermedio. Debe entenderse que la insulina puede ser insulina humana o una variante funcional de la misma, tal como un análogo o una versión truncada. Un ejemplo no limitante de un precursor de insulina es, por ejemplo, A(1-21)-AAK-B(1-29)-insulina humana (SEQ ID NO: 9). A(1-21)-AAK-B(1-29)-insulina humana (SEQ ID NO: 9) es GIVEQCCTSICSLYQLENYCNAAKFVN QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK.
El término “exendina” como se usa en la presente descripción, pretende designar exendina así como también variantes funcionales de la misma, que incluyen análogos y fragmentos de esta, por ejemplo, exendina-3 y -4. La exendina, así como también los análogos y fragmentos de la misma, se describen en, por ejemplo, el documento WO 99/43708, cuyos contenidos se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.
Se prefiere que el sitio de Enteroquinasa en el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa sea un sitio que también es robusto en términos de estabilidad química. Dado que ciertas subsecuencias de los residuos de aminoácidos en el sitio de Enteroquinasa son más propensas a ser menos estables químicamente, generalmente se
prefiere que la secuencia del sitio de Enteroquinasa (X6-X5-X4-GDR sea una que es químicamente estable bajo las condiciones previstas.
En los polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa de acuerdo con la fórmula (I) X4 en una modalidad se selecciona de E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W o T. En otra modalidad X4 se selecciona de E, Q, L, D, G o A. X4 puede ser E. X4 puede ser Q o L. X4 puede ser D. X4 puede ser D, G o A. En otra modalidad X5 es D o E. En aún otra modalidad X5 es D. En una modalidad X5 no es S o I. En una modalidad X5-X4 se selecciona del grupo que consiste en DD, DE, DL, DQ, EE, y EQ. En otra modalidad X5-X4 es DE o DD. X5-X4 puede ser DL, DQ o dG. X5-X4 pueden ser DA, DS o EE. X5-X4 pueden ser EQ, EL o ED. X5-X4 pueden ser EG, eA o ES. X5-X4 puede ser QE, h E, NE o ME. La presencia e identidad de X6 es poco estricta. En una modalidad X6 es I, G, L, T, R o S. En otra modalidad X6 está ausente. X6 puede ser I, G, L, T, R, S, M, H, F, P, V, W, K, E, Y o Q. X6 puede ser I, G, L, T, R, S, M, H, F, P, V o W. X6 pueden ser I o G.
En una modalidad Z2 está ausente. En otra modalidad Z2 es un polipéptido que tiene de 0-10 residuos de aminoácidos o que tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 200 residuos de aminoácidos. Los polipéptidos de Z2 más pequeños se usan frecuentemente cuando Z2 es un polipéptido que facilita la expresión del polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa en una célula huésped, o cuando Z2 es para proteger un polipéptido que se expresa de ser procesado proteolíticamente en el N-terminal. En una modalidad Z2 se selecciona del grupo que consiste en EEK, EEAEK, HK, EEAHK, E(EA)2HK, E(EA)3HK, EEGHK, EHPK, EEGEPK, EEAHELK, EEAHEVK, EEAHEMK, EEAHEFK, EEAHEYK, EEAHEWKEEGNTTPK y EELDARLEALK. Z2 puede comprender la secuencia EEK, EEAEK o HK. Z2 puede comprender la secuencia EeAh K, E(EA)2HK o E(EA)3HK. Z2 puede comprender la secuencia EEGHK, EHPK o EEGEPK. Z2 puede comprender la secuencia EEAHELK, EEAHEVK o EEAHEMK. Z2 puede comprender la secuencia EEAHEFK, EEAHEYK, EEAHEWKEEGNTTPK o EELDARLEALK. En otra modalidad Z2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DV, DVKPGQPLA, DVKPGQPEY, DVKPGEPLY, DVKPGQPLY, DVKPGQPLE y DVKPGQPMY. En otra modalidad Z2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DVKPGQPLY, DVKPGQELY, DVKPGEPLY, DVKPEQPLY, DVKPGQPEY, DVKEGQPLY, DVKPGQPLA, DVKPGQPLE y DVEPGQPLY. Z2 puede comprender la secuencia DVKPGQPLY, DVKPGQELY o DVKPGEPLY. Z2 puede comprender la secuencia DVKPEQPLY, DVKPGQPEY o DVKEGQPLY. Z2 puede comprender la secuencia DVKPGQPLA, DVKPGQPLE o DVEPGQPLY. En otra modalidad Z2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en QPMYKR, GQPMYK, PGQPMY, KPGQPM, LKPGQP, QLKPGQ, LQLKPG, WLQLKP, HWLQLK, WHWLQL, AWHWLQ, EAWHWL, AEAWHW y EAEAWH.Z2 puede comprender la secuencia QPMYKR, GQPMYK o PGQPMY. Z2 puede comprender la secuencia KPGQPM, LKPGQP o QLKPGQ. Z2 puede comprender la secuencia LQLKPG, WLQLKP o HWLQLK. Z2 puede comprender la secuencia WHWLQL, AWHWLQ o EAWHWL. Z2 puede comprender la secuencia AEAWHW o EAEAWH. Z2 puede ser un polipéptido que facilita la expresión de dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa en una célula huésped. En una modalidad Z2 es un polipéptido que tiene de 2 a 50 residuos de aminoácidos, tal como de 3 a 40, de 4 a 30 o de 5 a 20 residuos de aminoácidos. Z2 puede ser un polipéptido que tiene de 2 a 8 residuos de aminoácidos. Z2 puede ser un polipéptido que tiene al menos 8 residuos de aminoácidos. Z2 puede comprender o consistir en 40 o menos residuos de aminoácidos. Z2 puede ser un polipéptido que tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos.
En una modalidad la invención se refiere a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos Z2-X8-X7 , en donde Z2 es como se define en la presente descripción; X8 está ausente o es un péptido que comprende un sitio de escisión de enteroquinasa; y X7 es un polipéptido que comprende al menos 1 aminoácido. En una modalidad Z2 aumenta la expresión recombinante de Z2-X8-X7 , facilita el mantenimiento de un producto de expresión soluble Z2-X8-X7 , facilita la excreción de Z2-X8-X7 o parte de este al medio extracelular, protege X7 o parte de este de ser procesado no intencionalmente por proteasas o peptidasas, y/o proporciona propiedades mejoradas para la captura de Z2-X8-X7 (por ejemplo mediante purificación por cromatografía, tal como HPLC). X8 puede estar ausente. X8 puede comprender al menos 2 aminoácidos, tal como al menos 3 aminoácidos, al menos 4 aminoácidos o al menos 5 aminoácidos. X8 puede comprender 1-30 aminoácidos, tal como 3-20 aminoácidos, 4-15 aminoácidos o al menos 5 10 aminoácidos. X7 puede comprender al menos 5 aminoácidos, al menos 10 aminoácidos o al menos 15 aminoácidos. X7 puede comprender 1-100 aminoácidos, tal como 10-70 aminoácidos o 20-50 aminoácidos. X7 puede ser Z1 como se define en la presente descripción. Por ejemplo, Z1 puede ser un péptido de GLP-1 o una variante funcional de este. En una modalidad Z2-X8-X7 es un polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa. X8 puede comprender la secuencia de aminoácidos X6-X5-X4-G-D-R, en donde X6 , X5 , y X4 son como se define en la presente descripción. X8 puede comprender la secuencia de aminoácidos DDGDR o DEGDR.
En los polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa de acuerdo con la fórmula (I) Z1 es a menudo el polipéptido diana a fabricar mediante la expresión recombinante. En una modalidad Z1 es un polipéptido farmacéuticamente activo, o un precursor de un polipéptido farmacéuticamente activo. En una modalidad Z1 es un polipéptido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos. Aún en otra modalidad Z1 es un polipéptido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. En otra modalidad Z1 es un péptido de GLP-1 o una variante funcional de este, tal como K34R-GLP-1(7-37) o K34R-GLP-1(9-37). En una modalidad K34R-GLP-1(7-37) es HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG. En una modalidad K34R-GLP-1(9-37) es EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG. Z1 puede comprender la secuencia N-terminal HAEGT o EGTFT. Z1 puede comprender la secuencia N-terminal HAEGTFTSDVSSYLE,
EGTFTSDVSSYLE, o un fragmento de estas que comprende al menos 5 aminoácidos. En otra modalidad Zi es un péptido de glucagón o una variante funcional de este. Z1 puede ser un péptido de glucagón o una variante funcional de este que comprende la secuencia N-terminal HGTFT. Z1 puede ser un análogo de GLP-1 (7-37) seleccionado del grupo que consiste en: (des7-8, 31H, 34Q, 37K); (des7-8, 34R, 37K, 38E); (des7-8, 34R, 37K); (des7-8, 9G, 34R, 37K); (des7-8, 23R, 34R, 37K); (31H, 34Q, 37K); (9Q, 34R, 37K); (30E, 34R, 37K); (34R, 37K, 38G); (34R, 36G, 37K); y (34R, 37K, 38E). Z1 puede ser un análogo de GLP-1 (7-37) seleccionado del grupo que consiste en: (i) des7-8, 18K, 34R; (ii) des7-8, 18K, 34Q; (iii) des7-8, 18K, 22E, 34R; (iv) des7-8, 18K, 22E, 34Q; (v) des7-8, 12L, 18K, 34Q; (vi) des7, 18K, 22E, 34Q; (vii) 18K, 34R; (iix) 18K, 34Q; (ix) 18K, 22E, 34R; (x) 18K, 22E, 34Q; (xi) 18K, 26R, 31K, 34R; (xii) 18K, 26H, 31K, 34R; (xiii) 18K, 26H, 27K, 34Q; (xiv) 18K, 22K, 26R, 34Q; (xv) 18K, 25V, 26R, 31K, 34R; (xvi) 18K, 22E, 26R, 31K, 34R; (xvii) 18K, 22E, 26H, 27K, 34R; (iixx) 18K, 22E, 26H, 27K, 34Q; (ixx) 18K, 22E, 26H, 27K, 31H, 34R; (xx) 18K, 22E, 26H, 27K, 31H, 34Q; (xxi) 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34R; (xxii) 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34Q; (xxiii) 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34G; (xxiv) 18K, 22E, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxv) 18K, 22E, 25V, 26R, 27K, 34Q; (xxvi) 18K, 22E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxvii) 18K, 22E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; (iixxx) 18K, 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 34R; (ixxx) 18K, 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 34Q; (xxx) 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34G, des35-37; (xxxi) 18K, 22E, 25V, 26R, 31H, des35-37; (xxxii) 18K, 22E, 25V, 26R, 30K, 34G, des35-37; (xxxiii) 18K, 22E, 25V, 26R, 30K, 31H, 34G, des35-37; (xxxiv) 18K, 22E, 25V, 26R, 27L, 30K, 34G, des35-37); (xxxv) 18K, 22E, 26R, 31K, 34G, des35-37; (xxxvi) 18K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxxvii) des7, 18K, 22E, 26R, 34R, 37K; (iixxxx) des7, 18K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (ixxxx) 7Imp, 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34G, des35-37; (xxxx) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34G, des35-37; (xxxxi) 8S, 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34G, des35-37; (xxxxii) des7-8, 18K, 26V, 27K, 34R; (xxxxiii) des7-8, 18K, 26H, 30K, 34R, des36-37; (xxxxiv) des7-8, 18K, 25V, 26R, 31K, 34R; (xxxxv) des7-8, 18K, 22E, 34R, des36-37; (xxxxvi) des7-8, 18K, 22E, 26R, 34R, 37K; (xxxxvii) des7-8, 18K, 22E, 26R, 31K, 34R; (iixxxxx) des7-8, 18K, 22E, 26R, 31K, 34G, des35-37; (ixxxxx) des7-8, 18K, 22E, 26R, 30K, 34R, des36-37; (xxxxx) des7-8, 18K, 22E, 26R, 30K, 34R; (xxxxxi) des7-8, 18K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34R, des36-37; (xxxxxii) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, des34-37; (xxxxxiii) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34R; (xxxxxiv) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 31K, 34G, des35-37; (xxxxxv) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 30E, 31K, 34G, des35-37; (xxxxxvi) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 27L, des35-37; (xxxxxvii) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 27K, 34Q; (iixxxxxx) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (ixxxxxx) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26R, 27H, 31K, 34G, des35-37; (xxxxxx) des7-8, 18K, 22E, 25V, 26H, 31K, 34G, des35-37; (xxxxxxi) des7-8, 18K, 22E, 23R, 25V, 26R, 31K, 34G, des35-37; (xxxxxxii) 18K, 22E, 25V, 26R, 27L, 30K, 34G, des35-37; (xxxxxxiii) des7, 18K, 22E, 26R, 27K, 34Q; (xxxxxxiv) 34H; y (xxxxxxv) des7-8, 18K, 34H. Z1 puede ser un análogo de GLP-1 (7-37) seleccionado del grupo que consiste en: (i) 22E, 26R, 27K, 34R, 37K; (ii) 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G; (iii) 22E, 26R, 27K, 34R, 36K, des37; (iv) 22E, 25V, 26R, 27K, 34R, 37K; (v) des7-8, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37; (vi) 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (vii) des7-8, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (iix) des7-8, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des35-37; (ix) des7-8, 22K, 25V, 26R, 27K, 34R, des36-37; (x) 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xi) 22K, 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q; (xii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38Q; (xiii) 25V, 26R, 27K, 30E, 34Q, 36K, 38E; (xiv) 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xv) des7-8, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvi) 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (xvii) 22E, 23E, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q, 37K; (iixx) des7-8, 12K, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q; (ixx) des7-8, 22K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xx) 22E, 26H, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E; (xxi) 22E, 24K, 26R, 27K, 31H, 34G, des35-37; (xxii) 25V, 26R, 27K, 34Q, 36K; (xxiii) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R; (xxiv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34G, des35-37; (xxv) 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 34R; (xxvi) des7-8, 22E, 24K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34Q; y (xxvii) des7-8, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G. Z1 puede ser GLP-1 (7-37) o un análogo de GLP-1 (9-37) seleccionado del grupo que consiste en (iii) (22E) y (iv) 22E, 30E. Z1 puede ser un análogo de GLP-1 (9-37) seleccionado del grupo que consiste en: i) (22E, 26R, 27K, 34R, 38G, 39G, 40G, 41S, 42K); ii) (22E, 26R, 31K, 34R, 38G, 39G, 40G, 41S, 42K); iii) (22E, 26R, 34R, 38K, 39G, 40G, 41S, 42K); iv (22E, 23K, 26R, 34R, 38G, 39G, 40G, 41S, 42K); v) (22E, 26R, 34R, 36K, 38G, 39G, 40G, 41S, 42K); y vi) (18K, 22E, 26R, 34R, 38G, 39G, 40G, 41S, 42K). Aún en otra modalidad Z1 es un precursor de insulina o una variante funcional de esta, tal como A(1-21)-AAK-B(1-29)-insulina humana. En otra modalidad Z1 se selecciona del grupo que consiste en exendina, PYY, leptina y la variante funcional de esta.
En una modalidad Z1 y Z2 se derivan de diferentes orígenes, es decir, de diferentes especies y/o de origen sintético.
Fabricación del polipéptido de fusión
El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa puede producirse por medio de técnicas recombinantes de ácidos nucleicos. En general, las secuencias de ácido nucleico que codifican Z2, X6-X5-X4-GDR y Z1 se obtienen sintéticamente (para polipéptidos más pequeños) o como ADN clonado modificado para codificar el polipéptido deseado. La secuencia de ácido nucleico que codifica Z2 a menudo puede obtenerse al clonar el a Dn de tipo salvaje, pero cuando Z2 es un polipéptido de tamaño limitado también puede obtenerse sintéticamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio de Enteroquinasa, X6-X5-X4-GDR que es un polipéptido de solo 5-6 residuos de aminoácidos, usualmente se obtendrá sintéticamente. Incluso puede codificarse por la misma secuencia de ácido nucleico que codifica Z2 , en particular en las situaciones donde Z2 es un polipéptido bastante pequeño. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las diferentes partes de Z2 , X6-X5-X4-GDR y Z1 , se fusionan en marco, tal como para constituir una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de la fórmula (I). Tal polipéptido de fusión puede ser el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa, con o sin las extensiones N- o C-terminales (como o dentro de Z1 y Z2 ) tal como una etiqueta o similar, por ejemplo, una etiqueta His o un dominio de solubilización (tal como DsbC, RL9, MBP, NusA o Trx). Esta
secuencia de ácido nucleico modificada después se inserta en un vector de expresión, que a su vez se transforma o se transfecta en las células huésped de expresión.
La construcción de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa puede ser adecuadamente de origen genómico, ADNc o sintético. A menudo, comprenderá secuencias de ácido nucleico con orígenes diferentes. Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos se llevan a cabo mediante la modificación del código genético por técnicas bien conocidas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de la invención.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa usualmente se inserta en un vector recombinante que puede ser cualquier vector, que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que se va a introducir. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector, que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) donde se ha integrado.
El vector es, preferentemente, un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica al polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa se une operativamente a segmentos adicionales necesarios para la transcripción del ADN. El término, “unido operativamente” indica que los segmentos están dispuestos de manera que funcionan coordinadamente para sus propósitos previstos, por ejemplo la transcripción inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido hasta que termina dentro de un terminador.
Por lo tanto, los vectores de expresión para usar en la expresión del polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa comprenderán un promotor capaz de iniciar y dirigir la transcripción de un gen clonado o ADNc. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivarse de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas para la célula huésped. Adicionalmente, los vectores de expresión para la expresión del polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa comprenderán, además, una secuencia terminadora, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora se une operativamente al extremo terminal 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección puede usarse en la presente invención.
La expresión del polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa puede dirigirse a la expresión intracelular en el citosol de la célula huésped o dirigirse a la vía secretora para la expresión extracelular en el medio de cultivo. Alternativamente, la expresión del polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa puede dirigirse a un organelo. La expresión intracelular es la vía predeterminada y requiere un vector de expresión con una secuencia de ADN que comprende un promotor seguido por la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa seguido por un terminador.
Para dirigir el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa a la vía secretora de las células huésped, se necesita una secuencia señal secretora (conocida también como péptido señal o una secuencia previa) como una extensión N-terminal del polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa. Una secuencia de a Dn que codifica el péptido señal se une al extremo 5' de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa en el marco de lectura correcto. El péptido señal puede ser el asociado normalmente con la proteína o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada.
Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican el polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa, el promotor, el terminador y/o la secuencia señal de secreción, respectivamente, y para insertarlas en los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).
La célula huésped en la que se introduce la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa puede ser cualquier célula que sea capaz de expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa ya sea intracelular o extracelularmente. Si se necesitan modificaciones postraduccionales, las células huésped adecuadas incluyen levadura, hongos, insectos y células eucariotas superiores tales como células de mamíferos.
Expresión bacteriana:Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos en una célula huésped bacteriana son, para la expresión en E. coli, los promotores obtenidos del operón Lac, el operón trp e híbridos de estos trc y tac, todos de, E. coli (DeBoer y otros, 1983, Proceedings of the
National Academy of Sciences EE.UU 80: 21-25). Otros promotores incluso más fuertes para usar en E. coli son los promotores de bacteriófagos de los fagos T7 y T5. El promotor T7 requiere la presencia de la polimerasa T7 en el huésped E. coli (Studier y Moffatt, J. Mol. Biol. 189, 113, (1986)). Todos estos promotores se regulan por inducción con IPTG, lactosa o triptófano para iniciar la transcripción en puntos estratégicos en el período del crecimiento bacteriano. E. coli también tiene promotores fuertes para la expresión continua, por ejemplo, el promotor sintético usado para expresar hGH en Dalb0 ge y otros 1987, Biotechnology 5, 161-164.
Para la expresión en Bacillus, son ejemplos adecuados los promotores del gen de levansacarasa de Bacillus subtilis (sacB), del gen alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amylM), del gen alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), del gen de penicilininasa de Bacillus licheniformis (penP), de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis. Los promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American 1980, 242: 74-94; y en Sambrook y otros, 1989, más arriba.
Las regiones codificantes de péptidos señal efectivos para las células huésped bacterianas son, para E. coli, los péptidos señal obtenidos de los genes DegP, OmpA, OmpF, OmpT, PhoA y Enterotoxina STII, todos de E. coli. Para Bacillus las regiones del péptido señal se obtienen de Bacillus NCIB 11837 amilasa maltogénica, Bacillus stearothermophilus alfa-amilasa, Bacillus licheniformis subtilisina Bacillus licheniformis beta-lactamasa, Bacillus stearothermophilus proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) y Bacillus subtilis prsA. Los péptidos señal adicionales se describen por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. Para ambos E. coli y Bacillus, pueden crearse los péptidos señal de novo de acuerdo con las reglas señaladas en el algoritmo SignalP (Nielsen y otros, 1997, Protein Eng. 10, 1-6., Emanuelsen y otros, 2007, Nature Protocols 2, 953-971). Las secuencias señales se adaptan al contexto dado y se verifican para la puntuación de SignalP.
Los ejemplos de terminadores fuertes para la transcripción son la aspartasa asp como en el Sistema de Expresión de Tiofusión, el terminador de T7 del gen 10 en los vectores de pET (Studier y otros) y los terminadores de los genes de ARN ribosomal rrnA, rrnD.
En una modalidad, la invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la fórmula (I). En una modalidad la célula huésped que comprende el vector de expresión es una levadura, una bacteria o un hongo. En otra modalidad la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces spp., Pichia spp, Hansenula spp. y Kluyveromyces spp. La célula huésped puede ser Saccharomyces cerevisiae. En una modalidad adicional, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli y Bacillus spp. Los ejemplos de huéspedes de expresión preferidos son E. coli K12 W3110, E. coli K12 con un trazo de B, MC1061 y E. coli B BL21 DE3, que alberga la polimerasa T7 mediante lisogenización con bacteriófago □. Estos huéspedes son seleccionables con antibióticos cuando se transforman con plásmidos para la expresión. Para la selección libre de antibióticos, el huésped preferido es por ejemplo. E. coli B b L21 DE3 3xKO con deleción de los 2 genes de D,L-alanina racemasa alr, dadX, y deleción de la agrupación de genes capsulares del Grupo II (kpsM-kpsF), específico para E. coli B y frecuentemente asociado con el comportamiento patogénico. La eliminación de la agrupación de genes del Grupo II trae a E. coli B BL21 DE33xKO a la misma categoría de seguridad que E. coli K12. La selección se basa en el no requisito de D-alanina proporcionado por el gen de alr insertado en el plásmido de expresión en lugar del gen AmpR.
Una vez que el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa se ha expresado en un organismo huésped, puede recuperarse y purificarse a la pureza requerida mediante técnicas convencionales. Los ejemplos no limitantes de tales técnicas de recuperación y purificación convencionales son centrifugación, solubilización, filtración, precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC), RP-HPLC, filtración en gel y liofilización.
Los ejemplos de expresión y purificación recombinante de HRV14 3C pueden encontrarse en, por ejemplo, Cordingley y otros, J. Virol. 1989, 63, pp5037-5045, Birch y otros, Protein Expr Purif., 1995, 6, pp609-618 y en el documento WO2008/043847.
Los ejemplos de expresión microbiana y purificación de XaaProDAP de Lactococcus lactis puede encontrarse en, por ejemplo, Chich y otros, Anal. Biochem, 1995, 224, páginas 245-249 y Xin y otros, Protein Expr. Purif. 2002, 24, pp530-538.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para escindir un polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa, dicho método que comprende las etapas:
a) expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Zi es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente;
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional;
en donde dicho polipéptido diana es Z1 en la fórmula (I);
b) poner en contacto dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa con una Enteroquinasa en condiciones que facilitan la escisión;
en donde al menos uno de X4 y X5 es E o D.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido diana, dicho método que comprende las etapas:
a) expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la presente invención, en donde dicho polipéptido diana es Z1 en la fórmula (I),
b) poner en contacto dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa con una Enteroquinasa en condiciones que facilitan la escisión, y
c) aislar dicho polipéptido diana;
en donde al menos uno de X4 y X5 es E o D.
Las enteroquinasas útiles para este método son cualquier Enteroquinasa de mamífero, tal como Enteroquinasa bovina, Enteroquinasa humana o sus variantes funcionales. Las enteroquinasas también pueden denominarse enteropeptidasas. Dado que la cadena ligera de la Enteroquinasa comprende el dominio catalítico y es activa en ausencia de la cadena pesada, otras Enteroquinasas útiles son la cadena ligera bovina o sus variantes funcionales. Tales variantes de la cadena ligera bovina se describen en por ejemplo el documento WO2013/092855A1, por ejemplo la variante (C112A) y la variante (C112A, L134K, I135K).
La escisión por la Enteroquinasa de acuerdo con el método anterior puede realizarse en un número de condiciones de escisión. En una modalidad el método se lleva a cabo en donde el contacto en la etapa b) se lleva a cabo en una solución acuosa que comprende un solvente orgánico. Este solvente orgánico puede, por ejemplo, seleccionarse de metanol, etanol, i-propanol, n-propanol, acetona, glicerol o una mezcla de estos. En una modalidad dicho solvente orgánico es etanol en una concentración de aproximadamente 10 % p/p a aproximadamente 25 % p/p. En una modalidad, dicho solvente orgánico es metanol, etanol, i-propanol, n-propanol, acetona, glicerol o una mezcla de estos en una concentración de aproximadamente 10 % p/p a aproximadamente de 25 % p/p.
Modalidades de la invención
La invención se describe adicionalmente mediante las siguientes modalidades no limitantes:
1. Polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Z1 es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente;
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional.
2. Polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Z1 es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente;
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional; y
en donde i) Z1 comprende un polipéptido funcional, tal como un polipéptido farmacéuticamente activo o una enzima, ii) dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa consiste en la fórmula (I) y Z2 comprende 40 o menos residuos de aminoácidos, o iii) Z2 comprende un dominio de solubilización.
3. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 1 o 2, en donde X5 es G, P, A, V, L, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D y T.
4. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-3, en donde X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W o T.
5. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-4, en donde X4 es E, Q, L, D, G o A.
6. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X4 es E.
7. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X4 es Q.
8. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X4 es L.
9. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X4 es D.
10. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X4 es G.
11. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X4 es A.
12. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5 es D o E.
13. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5 es D.
14. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5 es E.
15. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es DE.
16. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es DD.
17. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es DL.
18. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es DQ.
19. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es DG.
20. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es DA.
21. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es DS.
22. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es EE.
23. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es EQ.
24. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es EL.
25. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es ED.
26. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es EG.
27. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es EA.
28. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es ES.
29. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es QE.
30. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es HE.
31. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es NE.
32. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde X5-X4 es ME.
33. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde X6 es I, G, L, T, R, S, M, H, F, P, V, W, K, E, Y o Q.
34. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 33, en donde X6 es I, G, L, T, R, S, M, H, F, P, V o W.
35. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 34, en donde X6 es I, G, L, T, R o S.
36. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 35, en donde X6 es I. 37. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 35, en donde X6 es G. 38. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-32, en donde X6 está ausente.
39. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z2 es un polipéptido que facilita la expresión de dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa en una célula huésped.
40. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 39, en donde dicha célula huésped es E. coli.
41. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 39, en donde dicha célula huésped es una levadura.
42. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con las modalidades 39-40, en donde dicha célula huésped es Saccharomyces cerevisiae.
43. El polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z2 está ausente.
44. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z2 es un polipéptido que tiene de 0 a 10 residuos de aminoácidos.
45. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 es un polipéptido que tiene de 2 a 8 residuos de aminoácidos.
46. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 es un polipéptido que tiene al menos 8 residuos de aminoácidos.
47. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 comprende 40 o menos residuos de aminoácidos.
48. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 es un residuo de aminoácido o Z2 es un polipéptido que comprende 2-40 residuos de aminoácidos.
49. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 es un polipéptido que tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 200 residuos de aminoácidos. 50. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 es un polipéptido que tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. 51. El polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 se selecciona del grupo que consiste en EEK, EEAEK, HK, EEAHK, E(EA)2HK, E(EA)3HK, EEGHK, EHPK, EEGEPK, EEAHELK, EEAHEVK, EEAHEMK, EEAHEFK, EEAHEYK, EEAHEWKEEGNTTPK y EELDARLEALK.
52. polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 se selecciona del grupo que consiste en DV, DVKPGQPLA, DVKPGQPEY, DVKPGEPLY, DVKPGQPLY, DVKPGQPLE y DVKPGQPMY.
53. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 se selecciona del grupo que consiste en DVKPGQPLY, DVKPGQELY, DVKPGEPLY, DVKPEQPLY, DVKPGQPEY, DVKEGQPLY, DVKPGQPLA, DVKPGQPLE y DVEPGQPLY.
54. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-42, en donde Z2 se selecciona del grupo que consiste en QPMYKR, GQPMYK, PGQPMY, KPGQPM, LKPGQP, QLKPGQ, LQLKPG, WLQLKP, HWLQLK, WHWLQL, AWHWLQ, EAWHWL, AEAWHW y EAEAWH.
55. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z2 comprende un dominio de solubilización.
56. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z1 comprende el polipéptido funcional, tal como un polipéptido farmacéuticamente activo o una enzima.
57. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z1 es un polipéptido farmacéuticamente activo, una enzima, o un precursor de la misma.
58. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z1 es un péptido de GLP-1 o una variante funcional de este.
59. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la modalidad 58, en donde Z1 es K34R-GLP-1(7-37) o K34R-GLP-1 (9-37).
60. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-57, en donde Z1 es un péptido de glucagón o una variante funcional de este.
61. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-57, en donde Z1 es un precursor de insulina o una variante funcional de esta.
62. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-57, en donde Z1 se selecciona del grupo que consiste en exendina, PYY, leptina y sus variantes funcionales.
63. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z1 es un polipéptido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos.
64. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z1 es un polipéptido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos.
65. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, que es un polipéptido de origen no natural.
66. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde Z1 y Z2 se derivan de diferentes orígenes, es decir, diferentes especies o sintéticos.
67. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa consiste en la fórmula (I).
68. Secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-67.
69. Vector de expresión que comprende la secuencia de ADN de acuerdo con la modalidad 68 unida operativamente a un promotor corriente arriba y un terminador corriente abajo.
70. Célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con la modalidad 69.
71. La célula huésped de acuerdo con la modalidad 70, que es una levadura, una bacteria o un hongo.
72. La célula huésped de acuerdo con cualquiera de las modalidades 70-71, que se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces spp., Pichia spp., Hansenula spp. y Kluyveromyces spp.
73. La célula huésped de acuerdo con cualquiera de las modalidades 70-72, que es Saccharomyces cerevisiae.
74. La célula huésped de acuerdo con cualquiera de las modalidades 70-71, que se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli y Bacillus spp.
75. Método para escindir un polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa, dicho método que comprende las etapas:
a) expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Z1 es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente;
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional;
en donde dicho polipéptido diana es Z1 en la fórmula (I);
b) poner en contacto dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa con una Enteroquinasa en condiciones que facilitan la escisión.
76. Método para producir un polipéptido diana, dicho método que comprende las etapas:
a) expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-67 en donde dicho polipéptido diana es Zi en la fórmula (I),
b) poner en contacto dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa con una Enteroquinasa en condiciones que facilitan la escisión, y
c) aislar dicho polipéptido diana.
77. El método de acuerdo con la modalidad 75 o 76, en donde dicha Enteroquinasa usada en la etapa b) se selecciona de Enteroquinasa bovina, la cadena ligera de Enteroquinasa bovina o una variante funcional de esta. 78. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 75-78, en donde dicha Enteroquinasa es la variante de la cadena ligera de Enteroquinasa bovina (C112A), (C112A, L134K, I135K) o una variante funcional de esta. 79. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 75-77, en donde dicho contacto en la etapa b) se lleva a cabo en una solución acuosa que comprende un solvente orgánico.
80. El método de acuerdo con la modalidad 78, en donde dicho solvente orgánico se selecciona de metanol, etanol, i-propanol, n-propanol, acetona, glicerol o una mezcla de estos.
81. El método de acuerdo con la modalidad 79, en donde dicho solvente orgánico es etanol en una concentración de aproximadamente 10 % p/p a aproximadamente 25 % p/p.
82. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 76-80, en donde dicha etapa c) es opcional.
83. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos Z2-X8-X7 , en donde Z2 es como se define en cualquiera de las modalidades anteriores; Xs está ausente o es un péptido que comprende un sitio de escisión de enteroquinasa; y X7 es un polipéptido que comprende al menos 1 aminoácido.
84. Un péptido de acuerdo con la modalidad 83, en donde X8 está ausente.
85. Un péptido de acuerdo con la modalidad 83, en donde X8 comprende al menos 2 aminoácidos, tal como al menos 3 aminoácidos, al menos 4 aminoácidos o al menos 5 aminoácidos.
86. Un péptido de acuerdo con la modalidad 83, en donde X8 comprende 1-30 aminoácidos, tal como 3-20 aminoácidos, 4-15 aminoácidos o al menos 5-10 aminoácidos.
87. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 83-86, en donde X7 comprende al menos 5 aminoácidos, al menos 10 aminoácidos o al menos 15 aminoácidos.
88. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 83-86, en donde X7 comprende 1-100 aminoácidos, tal como 10-70 aminoácidos o 20-50 aminoácidos.
89. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 83-86, en donde X7 es Z1 como se define en cualquiera de las modalidades anteriores.
90. Un péptido de acuerdo con la modalidad 89, en donde Z1 es un péptido de GLP-1 o una variante funcional de este.
91. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 83-90, en donde Z2-X8-X7 es un polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa.
92. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 83-91, en donde X8 comprende la secuencia de aminoácidos X6-X5-X4-G-D-R, en donde X6, X5 , y X4 son como se definen en cualquiera de las modalidades anteriores.
93. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las modalidades 83-91, en donde X8 comprende la secuencia de aminoácidos DDGDR o DEGDR.
Todas las referencias, que incluyen las publicaciones, solicitudes de patente, y patentes, citadas en la presente descripción se incorporan de este modo como referencia en su totalidad y en la misma medida en que si cada referencia se indicara como incorporada de manera individual y específica como referencia y se expusiera en su totalidad en la presente descripción (hasta la máxima medida permitida por la ley). Todos los encabezamientos y sub-encabezamientos se usan en la presente solo por conveniencia y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en la presente, está destinado meramente a ilustrar mejor la invención y no constituye una
limitación sobre el alcance de la invención a menos que se indique de cualquier otra manera. Ningún lenguaje en la descripción debe interpretarse como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención. La cita e incorporación de los documentos de patente en la presente descripción se realiza solo por conveniencia y no refleja ningún punto de vista sobre la validez, patentabilidad y/o exigibilidad de los documentos de patente. Esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia mencionada en las reivindicaciones adjuntas a esta como permitidas por la ley aplicable.
EJEMPLOS
Lista de abreviaturas
EK: Cadena ligera de enteroquinasa o enteroquinasa
D4K: DDDDK
NMP: N-Metil-2-Pirrolidona.
Abz: 2-aminobenzoilo
Dnp: 2,4-dinitrofenilo
Materiales y Métodos
Métodos generales de preparación
Método: SPPS_I ("Síntesis de péptidos en fase sólida)
Los sustratos de péptidos fluorogénicos atenuados intramolecularmente que tienen un fluoróforo Lys(Abz)amida C-terminal y un atenuador Lys(Dnp) N-terminal, se sintetizaron por Síntesis de Péptido en Fase Sólida.
Estos sustratos de péptidos tienen la siguiente estructura general:
Z2VX6-X5-X4-GDR-Z1* Fórmula (II)
en donde
X6-X5-X4 tienen el mismo significado que en la fórmula (I) (cada uno es un aminoácido, sin embargo X6 es opcional), Z2* es Lys(Dnp) y
Z1* es Z1 -Lys(Abz)amida, donde Z1 es como se define en la fórmula (I).
SPPS_I se realizó en un sintetizador Multipep RSi de Intavis Bioanalytical Instruments AG (Koeln, Alemania) a escala de 3 pmol en paralelo mediante el uso de 2,5 veces de exceso de Fmoc-aminoácidos (300 mM en NMP con 300 mM de Oxyma Pure®) con relación a la carga de la resina por ejemplo, de Rinkamida-Chematrix (0,5 mmol/g). La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 20 % en NMP. El acoplamiento se realizó mediante el uso de 1 : 1 : 1 : 1 aminoácido/Oxyma Pure®/DIC/colidina en NMP. Todos los aminoácidos se “acoplaron doble o triplemente”, lo que significa que después del primer acoplamiento (60 min), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácido, Oxyma Pure®, DIC, y colidina), y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (60 minutos).
Método: Purificación de EK
Las preparaciones de la enzima enteroquinasa purificada se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO2013/092855A1.
Métodos generales de detección y caracterización
Método: EK-cinética_1
La EK-cinética_1 se realizó mediante la medición de las velocidades iniciales de la hidrólisis de péptidos fluorogénicos atenuados intramolecularmente: Lys(Dnp)-péptido-Lys(Abz)amida de acuerdo con la fórmula (II). Después de medir la fluorescencia basal de los péptidos, generalmente en una concentración de sustrato en el intervalo de 1 a 50 pm, se midieron las velocidades iniciales de hidrólisis mediante la adición de la enzima enteroquinasa purificada a una concentración que permite leer la velocidad inicial de hidrólisis, es decir, menos del 5 % de hidrólisis en 30 min. Típicamente, puede usarse una concentración enzimática de 1 a 10 nM. Después de hasta una hora de hidrólisis se añadió enzima adicional para permitir la medición del nivel de fluorescencia en la
hidrólisis total. Las velocidades de hidrólisis se midieron generalmente en tampón MOPS 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5 a 25 °C mediante el uso de un lector de placas de fluorescencia Perkin Elmer Enspire mediante el uso de 320 nm para la excitación y 420 nm para la emisión.
Método: EK-cinética_2
La EK-cinética_2 se realizó mediante el cálculo de las velocidades iniciales de hidrólisis de GLP-1 de longitud completa con una extensión N-terminal. Las concentraciones de sustrato estaban en el intervalo de 150-300 pM. La reacción de hidrólisis se inició mediante la adición de una cantidad de enteroquinasa que proporciona una concentración final de 9,5 nM. Las muestras se tomaron después de 6,2 min, 18,7 min, 43,7 min, 86,3 min, 151,3 min y 243,8 min y se atenuaron mediante una dilución 1+9 en ácido acético al 5 %. Un método adecuado se usó en un UPLC Waters iClass para separar y cuantificar individualmente el sustrato restante y formar el producto en una columna de fase reversa analítica mediante la integración de las áreas de pico. Se ajustó una ecuación de la siguiente forma a los datos en bruto:
kcat * Ce * Cso
en donde t es el tiempo, cs0 es la concentración inicial del sustrato, ce es la concentración de la enzima, cpt es la concentración del producto en el tiempo t, cst es la concentración del sustrato en el tiempo t, kcat y Km son parámetros de la hidrólisis y Ki es la constante de inhibición por producto. Una constante Ki de 0,1 pm se usó para todas las reacciones. Las velocidades iniciales de hidrólisis se calcularon en base a los parámetros determinados para una concentración inicial del sustrato de 1 mg/ml para todos los péptidos. Todas las reacciones se realizaron en tampón Tris 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8,5.
Enzimas enteroquinasas
Las enzimas enteroquinasas usadas para los ejemplos en la presente descripción fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
Ejemplos 1-39
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden el N-terminal de GLP- 1( 7- 37) .
Para todos los Ejemplos 1-39 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z1 es HAEGT (SEQ ID NO: 10), es decir, el pentapéptido N-terminal de GLP-1(7-37), X6 está ausente y X5-X4 es como se especifica en la Tabla 1. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 1-39 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Por ejemplo, para el Ejemplo 1 el sustrato tiene la siguiente estructura Lys(Dnp)-AEGDR-HAEGT-Lys(Abz)amida (SEQ ID NO: 11) que es un sustrato modelo para polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden el sitio de escisión de enteroquinasa AEGDR (SEQ ID NO: 12).
Tabla 1. Velocidad de escisión relativa de enteroquinasa de sustratos que tienen como Z1 el péptido HAEGT (el sitio D4K es 100 %).
Ejemplos 40-59
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden el N-terminal de una variante de GLP-1(9-37).
Para todos los Ejemplos 40-59 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z1 es EGTFT (SEQ ID NO: 13), es decir, el pentapéptido N-terminal de GLP-1(9-37), X6 está ausente y X5-X4 es como se especifica en la Tabla 2. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 40-59 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Tabla 2. Velocidad de escisión relativa de enteroquinasa de sustratos que tienen como Z1 el péptido EGTFT (el sitio D4K es 100 %).
Ejemplos 60-79
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden el N-terminal de Exendina-4.
Para todos los Ejemplos 60-79 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z1 es HGEGT (SEQ ID NO: 14), es decir, el pentapéptido N-terminal de Exendina-4, X6 está ausente y X5-X4 es como se especifica en la Tabla 3. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 60-79 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Tabla 3. Velocidad de escisión relativa de enteroquinasa de sustratos que tienen como Z1 el péptido HGEGT (el sitio D4K es 100 %).
Ejemplos 80-83
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden el N-terminal de un análogo de glucagón.
Para todos los Ejemplos 80-83 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z1 es HGTFT (SEQ ID NO: 15), es decir, el pentapéptido N-terminal de un análogo de glucagón, y X5-X4 es como se especifica en la Tabla 4. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I, se purificaron mediante EKpurificación y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 80-83 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Tabla 4. Velocidad de escisión relativa de enteroquinasa de sustratos que tienen como Z1 el péptido HGTFT (el sitio D4K es 100 %).
Ejemplos 84-87
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden el N-terminal de un análogo de glucagón.
Para todos los Ejemplos 84-87 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z1 es QGTFT (SEQ ID NO: 16), es decir, el pentapéptido N-terminal de un análogo de glucagón, X6 está ausente y X5-X4 es como se especifica en la Tabla 5. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 84-87 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Tabla 5. Velocidad de escisión relativa de enteroquinasa de sustratos que tienen como Z1 el péptido QGTFT (el sitio D4K es 100 %).
Ejemplos 88-91
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden el N-terminal del glucagón humano.
Para todos los Ejemplos 88-91 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z1 es HSQGT (SEQ ID NO: 17), es decir, el pentapéptido N-terminal del glucagón humano, X6 está ausente y X5-X4 es como se especifica en la Tabla 6. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 88-91
fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Tabla 6. Velocidad de escisión relativa de enteroquinasa de sustratos que tienen como Z1 el péptido HSQGT (el sitio D4K es 100 %).
Ejemplos 92-110
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa de referencia que comprenden el N-terminal de GLP-1(7-37) y el X6 diferente.
Para todos los Ejemplos 92-110 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z1 es HAEGT (SEQ ID NO: 10), es decir, el pentapéptido N-terminal de GLP-1(7-37), X5-X4 es DE y X6 es como se especifica en la Tabla 7. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 92-110 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión de Enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene X6-X5-X4 = ADE (100 %). Tabla 7. Velocidad de escisión relativa de Enteroquinasa de sustratos que tienen como Z1 el péptido HAEGT, X6 como se especifica en la tabla y X5-X4 = DE (X6-X5-X4 = ADE es 100 %).
Ejemplos 111-117
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa de referencia que comprenden el N-terminal de GLP-1(7-37).
Para todos los Ejemplos 111-117 el sustrato es Z2*-X6-X5-X4-GDR-Zi *, en donde Zi es HAEGT (SEQ ID NO: 10), es decir, el pentapéptido N-terminal de GLP-1(7-37), X6 está ausente y el sitio de Enteroquinasa que corresponde a X5-X4-GDR es como se especifica en la Tabla 8. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_1.
El sitio de EK como se especifica en la Tabla 8 designa el pentapéptido correspondiente a la secuencia X5-X4-GDR. Por lo tanto, en el Ejemplo 111 el sustrato tiene la estructura Lys(Dnp)-IMGDRHAEGT- Lys(Abz)amida (SEQ ID NO: 18), y en el Ejemplo 112 el sustrato tiene la estructura Lys(Dnp)-INDDRHAEGT-Lys(Abz)amida (SEQ ID NO: 19). Por lo tanto, en el Ejemplo 112 el sitio de Enteroquinasa no incluye la secuencia g Dr sino una secuencia DDR. Las enzimas enteroquinasas usadas para los Ejemplos 111-117 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Tabla 8. Velocidad de escisión relativa de Enteroquinasa de sustratos de referencia que tienen como Z1 el péptido HAEGT (el sitio D4K es 100 %).
Ejemplos 118-137
Velocidad de escisión relativa de polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa que comprenden la secuencia completa de [Arg34]GLP-1(9-37) y una extensión N-terminal y polipéptidos de fusión escindibles por Enteroquinasa de referencia que comprenden DDDDK.
Para todos los Ejemplos 118-135 el sustrato fue Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*, en donde Z2 y Z1 son como se define en la Tabla 9, es decir, Z2 es una extensión N-terminal del polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa y Z1 es [Arg34]GLP-1(9-37), X6 está ausente y el sitio de Enteroquinasa que corresponde a X5-X4-GDR es como se especifica en la Tabla 9; excepto en los ejemplos de referencia, y como se especifica en la Tabla 9 (por ejemplo, Ejemplo 118), el sustrato fue Z2*-X6-DDDDK-Z1*. Los sustratos se sintetizaron mediante el método SPPS-I y sus velocidades de escisión por Enteroquinasa iniciales se determinaron mediante el método de EK-cinética_2.
El sitio de EK como se especifica en la Tabla 9 designa el pentapéptido correspondiente a la secuencia X5-X4-GDR. Por lo tanto, en el Ejemplo 119 el sustrato tiene la estructura DVKPGQPLYDEGDR-[Arg34]GLP-1(9-37).
Las enzimas Enteroquinasas usadas para los Ejemplos 118-135 fueron la variante de la cadena ligera bovina (C112A, L134K, I135K) como se describe en el documento WO2013/092855A1.
La velocidad inicial de escisión por enteroquinasa se normaliza contra el sustrato que tiene un sitio D4K (que sustituye a X5-X4-GDR en la fórmula (II)).
Tabla 9. Velocidad de escisión relativa de Enteroquinasa de los sustratos de referencia que comprenden la secuencia completa de [Arg34]GLP-1(9-37) como Z1 y una extensión N-terminal como Z2 como se define a continuación (el sitio D4K más lento en este conjunto es 100 %).
Claims (16)
1. Método para producir un polipéptido diana, dicho método que comprende las etapas:
a) expresar el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Z1 es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente;
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional;
en donde dicho polipéptido diana es Z1 en la fórmula (I);
b) poner en contacto dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa con una Enteroquinasa en condiciones que facilitan la escisión; y
c) aislar opcionalmente dicho polipéptido diana;
en donde al menos uno de X4 y X5 es E o D.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X4 es E, Q, L, D, G o A.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X5-X4 se selecciona del grupo que consiste en DE, DD, DL, DQ, DG, DA, DS, EE, EQ, EL, ED, EG, EA, ES, QE, HE, NE, y ME.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X5-X4 se selecciona del grupo que consiste en DD, DE, DL, DQ, EE, y EQ.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X5-X4 es DD o DE.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Z2 es un polipéptido que facilita la expresión de dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa en una célula huésped.
7. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde Z2 es un polipéptido que tiene de 2 a 50 residuos de aminoácidos, Z2 es un residuo de aminoácido, o Z2 está ausente.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Z1 comprende un polipéptido funcional, tal como un polipéptido farmacéuticamente activo o una enzima.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Z1 es un péptido de GLP-1 o una variante funcional de este, tal como Z1 es K34R-GLP-1(7-37) o K34R-GLP-1(9-37).
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Z1 es un péptido de glucagón o una variante funcional de este.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho contacto en la etapa b) se lleva a cabo en una solución acuosa que comprende un solvente orgánico.
12. Polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa que comprende el polipéptido de la fórmula:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO: 1
en donde
Z1 es un polipéptido que comprende al menos 2 residuos de aminoácidos;
X4 es E, Q, L, D, G, A, S, F, H, Y, W, T o M;
X5 se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente, excepto S e I;
X6 está ausente o se selecciona de los aminoácidos codificados genéticamente;
Z2 es un polipéptido o residuo de aminoácido opcional; y
en donde i) Z1 comprende un polipéptido farmacéuticamente activo, una enzima, o un precursor de este, o ii) dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa consiste en la fórmula (I) y Z2 comprende 40 o menos residuos de aminoácidos, tal como Z2 está ausente, Z2 es un residuo de aminoácido o Z2 es un polipéptido que comprende de 2-40 residuos de aminoácidos; y
al menos uno de X4 y X5 es E o D.
13. El polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa es de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-10.
14. La secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión escindible por Enteroquinasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-13.
15. El vector de expresión que comprende la secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 14 unida operativamente a un promotor corriente arriba y un terminador corriente abajo.
16. La célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en Saccharomyces spp., Pichia spp., Hansenula spp. y Kluyveromyces spp.
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