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ES2747273T3 - Anticuerpos anti-EpCAM y métodos de uso - Google Patents

Anticuerpos anti-EpCAM y métodos de uso Download PDF

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ES2747273T3
ES2747273T3 ES14850812T ES14850812T ES2747273T3 ES 2747273 T3 ES2747273 T3 ES 2747273T3 ES 14850812 T ES14850812 T ES 14850812T ES 14850812 T ES14850812 T ES 14850812T ES 2747273 T3 ES2747273 T3 ES 2747273T3
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ES
Spain
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seq
antibody
immunoconjugate
cancer
amino acid
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Active
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ES14850812T
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English (en)
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Jeannick Cizeau
Arjune Premsukh
Shilpa Chooniedass
Glen Macdonald
Joycelyn Entwistle
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Viventia Bio Inc
Original Assignee
Viventia Bio Inc
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Abstract

Un anticuerpo que se une a la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) que comprende: (i) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2; o (ii) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 12.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-EpCAM y métodos de uso
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud Provisional de EE.UU. No. 61/885.817 presentada el 2 de octubre de 2013, y a la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 62/030.805 presentada el 30 de julio de 2014.
Breve resumen de la invención
Las realizaciones de la invención están definidas por las reivindicaciones. La descripción también proporciona aspectos adicionales.
La presente descripción está relacionada con anticuerpos e inmunoconjugados que potencialmente carecen de epítopos de células T e incitan una respuesta inmune reducida. Un anticuerpo puede comprender una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1, Se Q ID NO: 11, SEQ ID NO: 31 o Se Q ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo tal como Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, armazones que no son de inmunoglobulina, multímeros, y cualquier combinación de los mismos. Los anticuerpos de la invención se unen a una molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) antigénica. En realizaciones adicionales, una composición puede incluir el anticuerpo descrito en la presente memoria y un excipiente, vehículo, tampón o estabilizador farmacéuticamente aceptable.
Un inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo (o fragmento del mismo) unido a una molécula efectora, en donde el anticuerpo puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, o Se Q ID NO: 32; y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, la molécula efectora puede ser un radioisótopo, un agente antineoplásico, un inmunomodulador, un modificador de la respuesta biológica, lectina, una toxina, un cromóforo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un ion metálico y cualquier combinación de los mismos.
Un método para tratar a un sujeto con cáncer puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo unido a una molécula efectora, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: I I , SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, la molécula efectora puede ser radioisótopos, agentes antineoplásicos, inmunomoduladores, modificadores de la respuesta biológica, lectinas, toxinas, un cromóforo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un ion metálico y cualquier combinación de los mismos. El método puede comprender además detectar o someter a imaginería el inmunoconjugado en el sujeto. En realizaciones adicionales, el método puede comprender además eliminar tejido canceroso del sujeto que se detecta o se somete a imaginería.
Un método para diagnosticar, detectar o monitorizar el cáncer en un sujeto puede comprender poner en contacto una muestra de ensayo tomada de dicho sujeto con un anticuerpo para formar un complejo anticuerpo-antígeno, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12; medir la cantidad de complejo anticuerpo-antígeno en la muestra de ensayo; y se proporciona normalizar los resultados frente a un control.
Un método para diagnosticar, detectar o monitorizar el cáncer en un sujeto puede implicar administrar al sujeto un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12; y detectar el anticuerpo en el sujeto.
Un kit para diagnosticar, detectar o monitorizar el cáncer puede incluir un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada de SEQ ID n O: 1, SEQ ID NO: 11, Se Q ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12, e instrucciones para uso del mismo.
Un método de imaginería de un tumor en un sujeto puede implicar administrar al sujeto un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID No : 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12; y detectar el anticuerpo por imaginería in vivo.
Descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un esquema de una realización de la presente invención, en particular, el fragmento Fab VB5-845 desinmunizado (VB5-845-DI), así como el fragmento Fab VB5-845 no desinmunizado (VB5-845-WT).
La FIG. 2 muestra el análisis de la secuencia Vh-WT (VH-tipo salvaje) usando iTope™. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en las filas "Promiscuo Alto" y "Promiscuo Moderado".
La FIG. 3 muestra el análisis de la secuencia Vl-DI (VH-desinmunizada) usando iTope™. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en las filas "Promiscuo Alto" y "Promiscuo Moderado".
La FIG. 4 muestra el análisis de la secuencia Vl-WT (VL-tipo salvaje) usando iTope™. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en las filas "Promiscuo Alto" y "Promiscuo Moderado".
La FIG. 5 muestra el análisis de la secuencia Vl-DI (VL-desinmunizada) usando iTope™. Las regiones que contienen péptidos potencialmente inmunogénicos se indican en las filas "Promiscuo Alto" y "Promiscuo Moderado".
La FIG. 6 muestra el análisis de las secuencias Vl-DI y Vl-DIF (V l-DI más C-terminal adicional) que abarcan el cambio de un solo aminoácido usando iTope™.
La FIG. 7 muestra la especificidad de unión de VB5-845-DI y VB5-845-WT frente a Cal-27 positivo para EpCAM y A-375 positivo para EpCAM, medido por citometría de flujo.
La FIG. 8 muestra la unión dependiente de la dosis de VB5-845-DI a la línea celular de carcinoma de células escamosas H&N positivas para EpCAM Cal27. La unión se expresa como las veces de aumento medio de la fluorescencia media sobre el control de PBS, por citometría de flujo.
La FIG. 9 muestra la afinidad de unión de los VB5-845-WT y VB5-845-DI frente a las células Cal-27, medida por citometría de flujo. La FIG. 10 muestra ensayos de competición entre variantes de VB5-845 y VB6-845 por citometría de flujo.
La FIG. 11 representa la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de VB5-845-DI.
La FIG. 12 muestra la alineación de los dominios Vh y Vl de VB5-845-WT y VB5-845-DI, con la numeración de Kabat. La FIG. 13 describe el ensayo de competición de VB6-845 con VB5-845-Algo (círculo abierto). El círculo negro y el triángulo negro corresponden a VB5-845-WT y VB4-845, respectivamente.
La FIG. 14 muestra el análisis por transferencia Western de la estabilidad en suero de VB5-845-Algo. Los carriles 1 a 4 corresponden a VB5-845-WT a las 0, 3, 6 y 24 horas. Los carriles 5 a 8 a VB5-845-Algo 0, 3, 6 y 24 horas. El carril 9 es solo suero humano. L: escalera y C: control.
La FIG. 15 muestra la termoestabilidad de VB5-845-WT (gris) y VB5-845-Algo (negro), expresada como un % de la hora 0 de un duplicado promedio.
La FIG. 16 muestra el perfil de inmunogenicidad del VB5-845-Algo medido por la proliferación de ensayos de células T CD3+CD4+.
La FIG. 17 muestra la alineación de los dominios Vh y Vl de VB5-845-WT y VB5-845 Algo, con la numeración de Kabat.
Descripción detallada
Esta invención no se limita a los procesos, composiciones o metodologías particulares descritos, ya que estos pueden variar. La terminología usada en la descripción tiene el propósito de describir únicamente las versiones o realizaciones particulares, y no pretende que limite el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a anteceder dicha descripción en virtud de la invención anterior.
Las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen una referencia plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a un "antioxidante" es una referencia a uno o más antioxidantes y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
El término "aproximadamente" significa más o menos el 10% del valor numérico del número con el que se está usando. Por lo tanto, aproximadamente el 50% significa en el rango de 45%-55%.
El término "animal", "paciente" o "sujeto" tal y como se usa en la presente memoria incluye, pero no se limita a, vertebrados humanos y no humanos tales como animales salvajes, domésticos y de granja.
Los "fragmentos de anticuerpos" que pueden usarse incluyen Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, multímeros y cualquier combinación de los mismos, y fragmentos de fuentes recombinantes y/o producidos en animales transgénicos. El anticuerpo o fragmento puede ser de cualquier especie, incluidos ratones, ratas, conejos, hámsteres y seres humanos. Los derivados de anticuerpos quiméricos, es decir, las moléculas de anticuerpos que combinan una región variable animal no humana y una región constante humana también se contemplan dentro del alcance de la invención. Las moléculas de anticuerpos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos humanizados que comprenden el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo de un ratón, rata u otra especie, con regiones constantes humanas. Se pueden usar métodos convencionales para preparar anticuerpos quiméricos. Se espera que los anticuerpos quiméricos sean menos inmunogénicos en un sujeto humano que el anticuerpo no quimérico correspondiente. Los anticuerpos humanizados pueden estabilizarse adicionalmente, por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/61635 y se incorpora por referencia en su totalidad.
"Agentes anticancerígenos" se refiere a compuestos o tratamientos que son efectivos en el tratamiento o prevención del cáncer, incluidos, sin limitación, agentes químicos, otros inmunoterapéuticos, vacunas contra el cáncer, compuestos antiangiogénicos, ciertas citoquinas, ciertas hormonas, terapia génica, radioterapia, cirugía y terapia dietética.
"Desinmunizado" se refiere a una molécula que carece o incita una respuesta inmune reducida en comparación con el equivalente de tipo salvaje.
"Anticuerpos desinmunizados" o "fragmentos de anticuerpos desinmunizados" se refiere a anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que carecen de uno o más epítopos de células T e incitan una respuesta inmune reducida en comparación con el equivalente de tipo salvaje.
"VB5-845 desinmunizado" se refiere al fragmento Fab del anticuerpo EpCAM en donde los supuestos epítopos de células T en el dominio Vh y el dominio Vl están mutados y podrían incitar una respuesta inmune reducida en comparación con el fragmento Fab no desinmunizado VB5-845 (VB5-845-WT). El fragmento Fab VB5-845 desinmunizado (VB5-845-DI) comprende un dominio Vh-Ch desinmunizado (SEQ ID NO: 1) y un dominio Vl-Cl desinmunizado (SEQ ID NO: 2). El fragmento Fab VB5-845 no desinmunizado (VB5-845-WT) comprende un dominio Vh-Ch de tipo salvaje (SEQ ID No : 5) y un dominio Vl-Cl de tipo salvaje (SEQ ID NO: 6).
"Cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado. Las cantidades efectivas de un inmunoconjugado pueden variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del animal. El régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica.
"Anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado" significa que el anticuerpo o fragmento comprende regiones marco humanas.
"Inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo conjugado con una molécula efectora. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa o fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, multímeros y cualquier combinación de los mismos, y fragmentos de fuentes recombinantes y/o producidos en animales transgénicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser una proteína sintética, una proteína de unión o un polipéptido. En algunas realizaciones, la molécula efectora puede ser una toxina, un radionucleótido, un radiofármaco, un agente marcador, un fármaco, un agente citotóxico, un péptido, una proteína y similares. Estas moléculas efectoras pueden ser capaces de matar, lisar o marcar o inducir otros efectos cuando el anticuerpo se une a un antígeno.
"Propensión reducida para incitar una respuesta inmune" tal y como se usa en la presente memoria significa que el anticuerpo EpCAM modificado o el fragmento de anticuerpo es menos inmunogénico que el anticuerpo EpCAM no modificado.
La "respuesta inmune" incluye respuestas inmunes tanto celulares como humorales.
El término "se administra directamente al sitio del cáncer" se refiere a la introducción directa o sustancialmente directa que incluye, sin limitación, inyecciones únicas o múltiples del inmunoconjugado directamente en el tumor o peritumoralmente, perfusión continua o discontinua en el tumor o peritumoralmente, introducción de un reservorio en el tumor o peritumoralmente, introducción de un aparato de liberación lenta en el tumor o peritumoralmente, introducción de una formulación de liberación lenta en el tumor o peritumoralmente, aplicación directa sobre el tumor, inyección directa en una arteria que alimenta sustancialmente directamente el área del tumor, inyección directa en un vaso linfático que drena sustancialmente en el área del tumor, introducción directa o sustancialmente directa en una cavidad sustancialmente cerrada (p. ej., cavidad pleural) o luz (p. ej., intravesicular). "Peritumoral" es un término que describe una región, dentro de aproximadamente 10 cm, preferiblemente dentro de 5 cm, más preferiblemente dentro de 1 cm, de lo que se considera el límite tumoral, tal como, pero no limitado a, un borde tumoral palpable. La "administración directa" en el contexto de la prevención de la aparición o la prevención de la recurrencia se define como la administración directamente en un sitio con riesgo de desarrollo o recurrencia de un cáncer.
"Farmacéuticamente aceptable" se refiere al uso clínico general y/o aprobación por parte de una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, listado en la Farmacopea de los Estados Unidos, o aceptación general por parte de los expertos en la técnica relevante.
Las "condiciones fisiológicas" para la unión de anticuerpos reflejan, pero no necesariamente duplican exactamente, las condiciones en las que un polipéptido de unión a EpCAM encontraría una molécula de EpCAM in vivo. La unión en condiciones fisiológicas debe ser razonablemente predictiva de que la unión ocurrirá in vivo.
"Prevención del cáncer" se refiere a la prevención de la aparición del cáncer. En ciertos casos, el tratamiento preventivo reduce la recurrencia del cáncer. En otros casos, el tratamiento preventivo disminuye el riesgo de que un paciente desarrolle un cáncer o inhibe la progresión de un estado precanceroso (p. ej., un pólipo del colon) a malignidad real.
"Dosis reducida" se refiere a una dosis que está por debajo de la dosis normalmente administrada y/o recomendada. La dosis administrada normalmente de un agente anticancerígeno se puede encontrar en materiales de referencia bien conocidos en la técnica, como, por ejemplo, la última edición de la Physician's Desk Reference.
"Tratamiento del cáncer" se refiere a la inhibición de la replicación de las células cancerosas, la apoptosis, la inhibición de la propagación del cáncer (metástasis), la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción del número de células cancerosas o el crecimiento tumoral, la disminución del grado maligno de un cáncer (p. ej., aumento de la diferenciación) o síntomas relacionados con la mejoría del cáncer.
"Terapéutico" significa un agente utilizado para desalentar, combatir, mejorar, prevenir o mejorar una afección, enfermedad o síntoma no deseado de un paciente.
"Variante" se refiere a cualquier derivado, análogo o fragmento farmacéuticamente aceptable de un inmunoconjugado, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una toxina (p. ej., toxina de Pseudomonas) o una molécula efectora descrita en la presente memoria. Una variante también engloba uno o más componentes de un multímero, multímeros que comprenden un componente individual, multímeros que comprenden múltiplos de un componente individual (p. ej., multímeros de una molécula de referencia), un producto de degradación química y un producto de degradación biológica. Un inmunoconjugado puede ser una "variante" en relación con un inmunoconjugado de referencia en virtud de alteración o alteraciones en la porción de unión a EpCAM y/o la porción de toxina del inmunoconjugado de referencia. Por ejemplo, un inmunoconjugado variante puede contener multímeros de la porción de anticuerpo y/o la porción de toxina. Una variante de la porción de toxina de la molécula retiene una toxicidad de al menos el 10%, al menos el 30%, al menos el 50%, al menos el 80%, al menos el 90%, en un ensayo estándar usado para medir la toxicidad de una preparación de la toxina de referencia. Una variante también puede referirse a polipéptidos que tienen al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o un 95% de identidad de secuencia con el inmunoconjugado de la presente invención. Un anticuerpo variante puede referirse a polipéptidos o proteínas que tienen al menos un 30%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o un 95% de identidad de secuencia del anticuerpo de la presente invención. Un anticuerpo variante o el inmunoconjugado puede referirse a polipéptidos o proteínas que tienen al menos un 30%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o un 95% de afinidad de unión del anticuerpo de la presente invención cuando se mide mediante un ensayo de unión competitivo.
Un inmunoconjugado variante que tiene una variación de la porción de unión a EpCAM del inmunoconjugado de referencia compite con la unión de un anticuerpo de referencia anti-EpCAM, en condiciones fisiológicas, en al menos un 10 por ciento y preferiblemente al menos un 30 por ciento (y véase infra). La competición en un 10 por ciento significa que, en un ensayo donde una concentración saturante de anticuerpo de referencia anti-EpCAM se une a EpCAM, el 10 por ciento de estos anticuerpos de referencia unidos se desplaza cuando se alcanza el equilibrio con una concentración equivalente del inmunoconjugado anti-EpCAM variante. Como ejemplo no limitante, la competición entre anticuerpos, o entre un anticuerpo y un inmunoconjugado, se mide uniendo el anticuerpo de referencia anti-EpCAM marcado a EpCAM en la superficie de las células o a un sustrato sólido recubierto con EpCAM, de modo que el anticuerpo está unido prácticamente a tofos los sitios de EpCAM, poniendo en contacto estos complejos de anticuerpo-antígeno con el anticuerpo anti-EpCAM de ensayo sin marcar o el inmunoconjugado de ensayo sin marcar, y midiendo la cantidad de anticuerpo marcado desplazado de los sitios de unión de EpCAM, en donde la cantidad de anticuerpo marcado libre liberado indica la cantidad de competición que ha ocurrido.
"VB5-845" se refiere a un fragmento Fab del anticuerpo EpCAM sin conjugado con toxina.
"VB6-845" se refiere a un fragmento Fab del anticuerpo EpCAM genéticamente unido a una toxina de la proteína bouganina (deBouganina) modificada.
"4D5MOC-B" o "4D5" significa el anticuerpo humanizado scFv MOC31 injertado en el marco de consenso humano artificial de scFv 4D5 como se describe en el documento WO 00/61635. 4D5MOC-B está representado por la SEQ ID NO: 8. "Anticuerpo MOC-31" significa el anticuerpo murino anti-EpCAM o anti-EGP-2 y está disponible en fuentes comerciales tales como BioGenex, No. de Cat. MU316-UC, Zymed Laboratories Inc., No. de Cat. 18-0270 o United States Biological, No. de Cat. M4165.
La inmunoterapia se ha convertido en una herramienta poderosa para combatir el cáncer. Los anticuerpos murinos y humanizados/quiméricos, y sus respectivos fragmentos de anticuerpos, dirigidos frente a antígenos asociados a tumores ("TAA") se han usado para el diagnóstico y la terapia de ciertos cánceres humanos. Las formas no conjugadas, conjugadas con toxinas y radiomarcadas de estos anticuerpos se han usado en dichas terapias.
Un antígeno asociado a tumor de interés para la inmunoterapia es la Molécula de Adhesión de Células Epiteliales (EpCAM), que también se conoce como 17-1 A, KSA, EGP-2 y GA733-2. EpCAM es una proteína transmembrana que se expresa altamente en muchos tumores sólidos, incluidos los carcinomas de pulmón, mama, ovario, colorrectal y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, pero se expresa débilmente en la mayoría de los tejidos epiteliales normales. Su expresión se correlaciona con la tasa de proliferación celular. Los anticuerpos específicos de EpCAM se han usado para obtener imágenes y detectar tumores primarios y metástasis en pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Hay muchos casos en los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmune no deseada a la proteína terapéutica. Varios anticuerpos monoclonales de ratón han mostrado ser prometedores como terapias en varios entornos de enfermedades humanas, pero en ciertos casos, han fallado debido a la inducción de grados significativos de una respuesta de anticuerpos antimurinos humanos (HAMA). Para los anticuerpos monoclonales, se han desarrollado varias técnicas en un intento de reducir la respuesta HAMA. Estos enfoques de ADN recombinante generalmente han reducido la información genética del ratón en la construcción final de anticuerpos al tiempo que aumentan la información genética humana en la construcción final. No obstante, los anticuerpos "humanizados" resultantes, en varios casos, todavía incitaron una respuesta inmune en pacientes.
La clave para la inducción de una respuesta inmune es la presencia dentro de la proteína de los péptidos que pueden estimular la actividad de las células T mediante la presentación en moléculas MHC de clase II, los llamados "epítopos de células T". Dichos epítopos de células T se definen comúnmente como cualquier secuencia de residuos de aminoácidos con la capacidad de unirse a moléculas de MHC de Clase II. Implícitamente, un "epítopo de células T" significa un epítopo, que cuando se une a las moléculas de MHC, puede ser reconocido por un receptor de células T (TCR), y que, al menos en principio, puede provocar la activación de estas células T mediante la participación de un TCR para promover una respuesta de células T. Por lo tanto, es deseable identificar y eliminar los epítopos de células T de los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos y desarrollar mejores anticuerpos/fragmentos de anticuerpos que inciten una respuesta inmune reducida.
Anticuerpos
En la presente memoria, se describen anticuerpos desinmunizados y fragmentos de anticuerpos desinmunizados que se unen a un antígeno de células cancerosas. El antígeno puede ser EpCAM. El anticuerpo puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID No : 31 o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa o fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, multímeros y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
Las secuencias de los fragmentos de cadena ligera y cadena pesada pueden modificarse o reemplazarse con otros aminoácidos de manera que el anticuerpo incite una respuesta inmune reducida en los seres humanos. Para preparar anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos, se puede usar cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos humanos pueden obtenerse cribando bibliotecas de anticuerpos humanos. Otra solución es trasplantar la especificidad de un anticuerpo monoclonal no humano injertando las regiones CDR en un marco humano. En una mejora de dicha técnica, se pueden producir anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos con un comportamiento de unión mejorado incorporando residuos adicionales derivados de dicho anticuerpo no humano. Además de lograr la humanización, se pueden usar técnicas para "reparar" fragmentos de anticuerpos con estabilidad y/o plegamiento o rendimiento subóptimos injertando las CDR de un fragmento scFv con la afinidad y especificidad de unión deseadas en el marco de un scFv diferente, con un comportamiento mejor. Dichos métodos para preparar anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, la producción en ratones SCID e inmunización in vitro.
En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, y la cadena ligera y la cadena pesada están unidas por un enlace covalente. En algunas realizaciones, el enlace covalente puede ser un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el enlace covalente puede ser a través de reticuladores químicos, tales como adipimidato de dimetilo, suberimidato de dimetilo y similares. En algunas realizaciones, pueden usarse reticuladores de aminoácidos, tales como (Gly4-Ser)n. Las secuencias de la cadena ligera y la cadena pesada descritas en la presente memoria pueden usarse para derivar scFv, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos y similares. Se pueden usar varias estrategias de enlace de proteínas para producir Fab y scFv bivalentes o biespecíficos, así como fusiones de Fab y scFv bifuncionales.
Los fragmentos de anticuerpos descritos en la presente memoria pueden clonarse y expresarse en E. coli en una forma biológicamente funcional. Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos también pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante usando células bacterianas o de mamífero.
Puede usarse el proceso de maduración de afinidad mediante el cual puede modificarse la especificidad, afinidad o avidez de unión del anticuerpo descrito en la presente memoria. Se ha ideado una serie de técnicas de laboratorio mediante las cuales se crea diversidad de secuencia de aminoácidos mediante la aplicación de diversas estrategias de mutación, ya sea en el fragmento de anticuerpo completo o en regiones seleccionadas tales como las CDR.
Las secuencias de aminoácidos variantes de la cadena pesada y la cadena ligera tienen al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 70%, lo más preferiblemente al menos un 80%, incluso más preferiblemente al menos un 90%, e incluso lo más preferiblemente un 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos variantes de la cadena pesada y la cadena ligera tienen al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 70%, lo más preferiblemente al menos un 80%, incluso más preferiblemente al menos un 90%, e incluso lo más preferiblemente un 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS: 11 y 12, respectivamente.
Inmunoconjugados
En algunas realizaciones, se proporcionan inmunoconjugados. En algunos aspectos, el inmunoconjugado descrito en la presente memoria puede ser un anticuerpo unido a una molécula efectora, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, multímeros y cualquier combinación de los mismos. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos desinmunizados o fragmentos de anticuerpos desinmunizados descritos en la presente memoria.
En algunas realizaciones, el anticuerpo en el inmunoconjugado puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el anticuerpo en el inmunoconjugado puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En las realizaciones descritas en la presente memoria, la molécula efectora puede ser radioisótopos, agentes antineoplásicos, inmunomoduladores, modificadores de la respuesta biológica, lectinas, toxinas, un cromóforo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un ion metálico y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula efectora puede ser una toxina, tal como abrina, modecina, viscumina, gelonina, bouganina, proteína bouganina modificada o desinmunizada (deBouganina), saporina, ricina, cadena de ricina A, briodina, lufina, momordina, restrictocina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina pertussis, toxina tetánica, toxina botulínica, toxina de Shigella, toxina del cólera, toxina de la difteria y cualquier combinación de las mismas. En realizaciones, la toxina puede ser deBouganina como se muestra en s Eq ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 42, o SEQ ID NO: 43. En realizaciones, la toxina puede ser la exotoxina A de Pseudomonas como se muestra en la SEQ ID NO: 3.
En otras realizaciones no limitantes, la toxina comprende un agente que actúa para disrumpir el ADN. Por lo tanto, las toxinas pueden ser, sin limitación, enediinas (p. ej., caliqueamicina y esperamicina) y agentes de molécula pequeña no enediina (p. ej., bleomicina, metidiopropil-EDTA-Fe (II)). Otras toxinas útiles de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación, daunorrubicina, doxorrubicina, distamicina A, cisplatino, mitomicina C, ecteinascidinas, duocarmicina/CC-1065 y bleomicina/pepleomicina. En otras realizaciones no limitantes, la toxina comprende un agente que actúa para disrumpir la tubulina. Dichas toxinas pueden comprender, sin limitación, rizoxina/maitansina, paclitaxel, vincristina y vinblastina, colchicina, auristatina, dolastatina 10, pelorusida A, agentes alquilantes, agentes antimitóticos, inhibidores de topoisomerasa I y derivados de camptotecina.
En otras realizaciones no limitantes, la porción de toxina del inmunoconjugado puede ser un agente alquilante que incluye, sin limitación, busulfano, carboxiftalatoplatino, clorambucilo, clorozotocina, cisplatino, clomesona, cianomorfolinodoxorrubicina, ciclodisona, dianhidrogalactitol, fluorodopán, hepsulfamo, hicantona, melfalán, mitomicina C, mitozolamida, mostaza nitrogenada, piperazina, piperazinadiona, pipobromano, porfiromicina, mostaza de espirohidantoína, teroxirona, tetraplatino, trietilenomelamina y similares.
En otras realizaciones no limitantes, la porción de toxina del inmunoconjugado de la invención puede ser un agente antimitótico que incluye, sin limitación, alocolchicina, halicondrina B, colchicina, derivado de colchicina, maitansina, rizoxina, taxol, derivado de taxol, tiocolchicina, tritil cisteína, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina.
En otras realizaciones no limitantes, la porción de toxina de un inmunoconjugado de la invención puede comprender un inhibidor de topoisomerasa II que incluye, sin limitación, doxorrubicina, amonafida, derivado de antrapirazol, pirazoloacridina, bisantreno HCl, daunorrubicina, desoxidoxorrubicina, mitoxantrona, menogaril, N,N-dibencil daunomicina, oxantrazol y rubidazona.
En otras realizaciones no limitantes, la porción de toxina del inmunoconjugado puede ser un antimetabolito de ARN o ADN que incluye, sin limitación, 5-azacitidina, 5-fluorouracilo, acivicina, aminopterina, derivado de aminopterina, 5,6-dihidro-5-azacitidina, metotrexato, derivado de metotrexato, N-(fosfonoacetil)-L-aspartato, pirazofurina, trimetrexato, 2'-desoxi-5-fluorouridina, glicinato de afidicolina, 5-aza-2'-desoxicitidina, ciclocitidina, guanazol, hidroxiurea, inosina glicoaldehído, macbecina II, pirazoloimidazol, tioguanina y tiopurina.
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado es un fragmento de anticuerpo humanizado que se une al dominio extracelular de EpCAM humano unido a la exotoxina A de Pseudomonas. En particular, el inmunoconjugado puede ser un fragmento Fab recombinante estabilizado y humanizado de anticuerpo EpCAM que se ha fusionado a una forma truncada de exotoxina A de Pseudomonas (aminoácidos ETA 252-608), como se muestra en la SEQ ID NO: 3. Este inmunoconjugado puede unirse a EpCAM expresado en células cancerosas. Una vez unido, el inmunoconjugado se internaliza y la exotoxina A de Pseudomonas mata a las células o bloquea la síntesis de proteínas, lo que conduce a la muerte celular. Es importante destacar que, dado que la mayoría de las células mucosales y los fibroblastos normales no expresan ampliamente EpCAM y, por lo tanto, no pueden internalizar el inmunoconjugado, están protegidas de los posibles efectos secundarios de la exotoxina.
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado puede ser un Fab unido a la exotoxina A de Pseudomonas. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y la exotoxina A de Pseudomonas (aminoácidos ETA 252-608) se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y la exotoxina A de Pseudomonas (aminoácidos ETA 252-608) se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la exotoxina A de Pseudomonas (aminoácidos ETA 252-608) se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la exotoxina A de Pseudomonas (aminoácidos ETA 252-608) se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado puede ser un fragmento de anticuerpo EpCAM humanizado unido a la proteína bouganina modificada, en donde la bouganina modificada tiene una propensión reducida para incitar una respuesta inmune. En una realización preferida, la bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar las células T y la bouganina modificada se modifica en uno o más residuos de aminoácidos en un epítopo de células T. En algunas realizaciones, la proteína bouganina modificada (deBouganina) tiene aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la proteína bouganina modificada puede tener aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, la proteína bouganina modificada puede tener aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, la proteína bouganina modificada puede tener aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, la proteína bouganina modificada puede tener aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 43.
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado puede ser un Fab unido a la proteína bouganina modificada. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y la proteína bouganina modificada se fusiona al extremo C de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y la proteína bouganina modificada se fusiona al extremo C de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la proteína bouganina modificada se fusiona al extremo C de la SEQ
ID NO: 11. En algunas realizaciones, el Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la proteína bouganina modificada se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO: 12. El Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
12, y la proteína bouganina modificada se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO: 31. El Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la proteína bouganina modificada se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO:
12. El Fab puede tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la proteína bouganina modificada se fusiona con el extremo
C de la SEQ ID NO: 32. Pueden tener una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la proteína bouganina modificada se fusiona con el extremo C de la SEQ ID NO: 12.
En algunos aspectos, el inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 13 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El primer y el segundo polipéptido pueden estar unidos por uno o más enlaces disulfuro. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 11, 31 o 32, y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID
NO: 16. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID
NO: 14 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 11, 31 o 32, y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 17. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 34 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 11, 31 o 32, y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 35. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 36 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 11, 31 o 32, y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 37. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 38 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 40 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 39 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 41 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 44 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 44 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 11, 31 o 32, y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 45. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 46 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la
SEQ ID NO: 46 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 11, 31 o 32, y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 47. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 48 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 48 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 49 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El inmunoconjugado puede ser VB6-845 Fab que tiene un primer polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 49 y un segundo polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 12.
El primer y el segundo polipéptido descritos en la presente memoria en los inmunoconjugados anteriores pueden estar unidos por uno o más enlaces de disulfuro.
Los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos descritos en la presente memoria pueden conjugarse con la molécula efectora por cualquier medio. Por ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede unirse a la toxina por medios químicos o recombinantes. Los medios químicos para preparar fusiones o conjugados son conocidos en la técnica y pueden usarse para preparar el inmunoconjugado. El método usado para conjugar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo y la toxina debe ser capaz de unir el anticuerpo con la toxina sin interferir con la capacidad del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unirse a la molécula diana.
En una realización, el anticuerpo y la toxina son ambas proteínas y se pueden conjugar usando técnicas bien conocidas en la técnica. Hay varios cientos de reticuladores descritos en la técnica que pueden conjugar dos proteínas. El reticulador generalmente se elige en función de los grupos funcionales reactivos disponibles o insertados en el anticuerpo o la toxina. Además, si no hay grupos reactivos, se puede usar un reticulador fotoactivable. En ciertos casos, puede ser deseable incluir un espaciador entre el anticuerpo y la toxina. Los agentes de reticulación conocidos en la técnica incluyen los agentes homobifuncionales: glutaraldehído, dimetilladipimidato y bis(diazobencidina) y los agentes heterobifuncionales: m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida y sulfo-m maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida.
Otros reticuladores que pueden usarse para acoplar una molécula efectora al fragmento de anticuerpo incluyen TPCH (S-(2-tiopiridil)-L-cisteína hidrazida y TPMPH ((S-(2-tiopiridil)mercapto-propionohidrazida). TPCH y TPMPH reaccionan en los restos de carbohidratos de las glicoproteínas que han sido previamente oxidados por tratamiento suave con peryodato, formando así un enlace de hidrazona entre la porción de hidrazida del reticulador y los aldehídos generados por el peryodato. Los reticuladores heterobifuncionales GMBS (N-gama-malimidobutiriloxi)-succinimida) y SMCC (succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano) reaccionan con aminas primarias, introduciendo así un grupo maleimida en el componente. Este grupo maleimida puede reaccionar posteriormente con sulfhidrilos en el otro componente, que puede introducirse mediante reticuladores mencionados anteriormente, formando así un enlace tioéter estable entre los componentes. Si el impedimento estérico entre los componentes interfiere con la actividad de cualquiera de los componentes, se pueden usar reticuladores que introducen brazos espaciadores largos entre los componentes e incluyen derivados, tales como n-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Por lo tanto, existe una gran cantidad de reticuladores adecuados que se pueden usar y cada uno de los cuales se selecciona según los efectos que tenga sobre la producción óptima de inmunoconjugado.
También se puede preparar una proteína de fusión de anticuerpo-molécula efectora usando técnicas de ADN recombinante. En tal caso, una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo se fusiona con una secuencia de ADN que codifica una molécula efectora, tal como una toxina, dando como resultado una molécula de ADN quimérica. La secuencia de ADN quimérica se transfecta en una célula huésped que expresa la proteína de fusión de molécula efectora-anticuerpo. La proteína de fusión puede recuperarse del cultivo celular y purificarse usando técnicas conocidas en la técnica.
La porción de anticuerpo de un inmunoconjugado puede derivarse de inmunoglobulina, es decir, puede rastrearse hasta una molécula de partida que es una inmunoglobulina (o anticuerpo). Por ejemplo, el anticuerpo puede producirse mediante la modificación de un armazón de inmunoglobulina usando técnicas estándar conocidas en la técnica. En otro ejemplo no limitante, los dominios de inmunoglobulina (p. ej. cadenas pesadas y/o ligeras variables) se pueden unir a un armazón distinto de inmunoglobulina. Además, el anticuerpo puede desarrollarse mediante, sin limitación, reacción química o diseño genético. Por consiguiente, en un ejemplo no limitante, un inmunoconjugado puede comprender un polipéptido derivado de inmunoglobulina (p. ej., un anticuerpo seleccionado de una biblioteca de anticuerpos), o una variante del mismo, que se une específicamente a células de cáncer de hígado; y una toxina o variante de la misma. Dichos polipéptidos de inmunoglobulina pueden rediseñarse para afectar sus características de unión a una molécula asociada a un tumor diana, o para mejorar sus características físicas, por ejemplo.
La porción de anticuerpo del inmunoconjugado no necesita estar basada en inmunoglobulina. Por consiguiente, un inmunoconjugado puede comprender un polipéptido no inmunoglobulínico (p. ej., Affibody®), o una variante del mismo, que se une específicamente a las células de cáncer de hígado; y una toxina o variante de la misma. Dicho polipéptido no inmunoglobulínico puede diseñarse para unirse a una molécula asociada a tumor diana. Además, el polipéptido no inmunoglobulínico puede modificarse por ingeniería para obtener una afinidad o avidez deseada y puede diseñarse para tolerar una variedad de condiciones físicas, incluyendo rangos de pH extremos y temperatura relativamente alta.
De hecho, para su uso en una composición farmacéutica, puede ser ventajoso el diseño de un polipéptido no inmunoglobulínico con una vida media relativamente larga en condiciones fisiológicas (p. ej., 37 °C en presencia de peptidasas). Además, dichas moléculas, o variantes de las mismas, pueden demostrar buena solubilidad, tamaño pequeño, plegamiento apropiado y pueden expresarse en sistemas bacterianos de bajo costo fácilmente disponibles y, por lo tanto, fabricarse en cantidades comercialmente razonables. La capacidad de diseñar un polipéptido no inmunoglobulínico está dentro de la habilidad del experto en la técnica.
Los ejemplos de polipéptidos de unión a epítopos incluyen, sin limitación, ligandos que comprenden un dominio de fibronectina tipo III, moléculas de unión basadas en el ensamblaje de dominios de proteína repetidos que comprenden dominios de homología de pleckstrina (PH), repeticiones de anquirina y similares.
En otras realizaciones no limitantes, el inmunoconjugado comprende una variante que tiene secuencias de aminoácidos, idénticas al menos en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% a la exotoxina A de Pseudomonas como se muestra en la SEQ ID NO: 3.
En otras realizaciones, el inmunoconjugado comprende una variante que tiene secuencias de aminoácidos, idénticas al menos en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% a la proteína bouganina como se muestra en la SEQ ID NO: 4.
Métodos de uso
En la presente memoria, se describen métodos para usar anticuerpos, fragmentos de anticuerpos e inmunoconjugados descritos en la presente memoria. Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos y/o los inmunoconjugados usados pueden incluir cualquiera de los anticuerpos/fragmentos de anticuerpos desinmunizados descritos en la presente memoria, en donde el anticuerpo/fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, Se Q ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12.
Un método para tratar a un sujeto con cáncer puede implicar la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12. El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, multímeros y cualquier combinación de los mismos. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos desinmunizados o fragmentos de anticuerpos desinmunizados descritos en la presente memoria. El anticuerpo además comprende una molécula efectora unida al anticuerpo (colectivamente, un inmunoconjugado). En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, la molécula efectora puede ser un radioisótopo, un agente antineoplásico, un inmunomodulador, un modificador de la respuesta biológica, lectina, una toxina, un cromóforo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un ion metálico y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, los inmunoconjugados pueden usarse para tratar cáncer, tal como cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, de esófago, páncreas y cáncer de próstata. Los cánceres que se originan en cualquier célula epitelial también pueden ser una diana de estos inmunoconjugados y anticuerpos.
En realizaciones preferidas no limitantes, el cáncer es susceptible de tratamiento mediante la administración directa del inmunoconjugado al sitio del cáncer. Por ejemplo, una masa tumoral diana puede estar cerca de la superficie de la piel. En otro ejemplo, un tejido enfermo puede estar encapsulado por un quiste, o se encuentra en una cavidad sustancialmente cerrada que incluye, sin limitación, una luz. En otras realizaciones, el cáncer es susceptible de tratamiento por la administración intravenosa del inmunoconjugado.
Un kit para diagnosticar el cáncer puede incluir un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID No : 11, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12, e instrucciones para su uso. Un kit para diagnosticar el cáncer puede incluir un inmunoconjugado, en donde dicho inmunoconjugado comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31 o SEQ Id NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12, unida a una molécula efectora e instrucciones para su uso. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos desinmunizados o fragmentos de anticuerpos desinmunizados descritos en la presente memoria.
Un kit para detectar el cáncer puede incluir un fragmento de anticuerpo anti-EpCAM, y preferiblemente incluye además un reactivo que contiene un anticuerpo anti-Ig marcado, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ig unido a una enzima como la fosfatasa alcalina o un anticuerpo anti-Ig radiomarcado. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo anti-EpCAM puede unirse a un cromóforo, un fluoróforo o un ligando radiomarcado.
Los inmunoconjugados y los anticuerpos descritos en la presente memoria también pueden usarse para detectar o monitorizar en un sujeto. Un método para detectar o monitorizar el cáncer en un sujeto puede implicar poner en contacto una muestra de ensayo tomada del sujeto con un anticuerpo para formar un complejo antígeno-anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12; medir la cantidad del complejo anticuerpo-antígeno en la muestra de ensayo; y normalizar los resultados frente a un control. La muestra de ensayo puede ser suero, linfa, exudado ascítico, líquido intercelular, lisado de tejido, saliva, secciones de tejido, células, muestras de biopsia y similares. El complejo anticuerpo-antígeno se puede detectar por cualquier medio, como, por ejemplo, el método de hibridación sobre mancha, el método de transferencia Western, el método de ELISA o el método de ELISA en sandwich. Además, el complejo anticuerpoantígeno puede detectarse mediante el uso de acuerdo con reacciones de múltiples etapas, tales como la reacción con un anticuerpo anti-Ig unido a biotina y luego con un material unido a avidina. Un método para detectar o monitorizar el cáncer en un sujeto puede implicar poner en contacto una muestra de ensayo tomada del sujeto con un inmunoconjugado para formar un complejo, en donde el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12; medir la cantidad del complejo en la muestra de ensayo; y normalizar los resultados frente a un control.
Un método para detectar o monitorizar el cáncer en un sujeto puede implicar administrar al sujeto un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12; y detectar el anticuerpo. Un método para detectar o monitorizar el cáncer en un sujeto puede implicar administrar al sujeto un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que tiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID n O: 11, SEQ ID NO: 31, o Se Q ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12; y detectar el inmunoconjugado.
Los anticuerpos y los inmunoconjugados descritos en la presente memoria pueden usarse para obtener imágenes de un tumor en un sujeto. Un método de imaginería de un tumor en un sujeto puede implicar administrar al sujeto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12; y detectar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo mediante imaginería in vivo. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos desinmunizados o fragmentos de anticuerpos desinmunizados descritos en la presente memoria y puede estar unido a una molécula efectora. Un método para obtener imágenes de un tumor en un sujeto puede implicar administrar al sujeto un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que tiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, Se Q ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 12; y detectar el inmunoconjugado por imaginería in vivo. El inmunoconjugado puede incluir además una molécula efectora.
En algunas realizaciones, la molécula efectora utilizada para detectar el cáncer o para imaginería de un tumor puede ser un radioisótopo, un cromóforo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un ion metálico y cualquier combinación de los mismos. Las imaginería in vivo se puede realizar mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como imaginería de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF), imaginería de reflectancia de fluorescencia (FRI), tomografía mediada por fluorescencia (FMT), tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía de emisión de fotones únicos (SPECT), imaginería por resonancia magnética (MRI), p Et con imaginería por tomografía computarizada concurrente (PET/CT), PET con imaginería por resonancia magnética concurrente (PET/MRI) y cualquier combinación de los mismos.
El método puede incluir además la resección de tejido canceroso, tal como un tumor o una parte de un órgano, después de la imaginería in vivo del sujeto. La resección quirúrgica se puede realizar mediante cualquier técnica conocida en la técnica. El método puede incluir además administrar el anticuerpo o inmunoconjugado después de la resección para medir la compleción de la resección tumoral.
En ciertos aspectos, los anticuerpos como se describen en la presente memoria están marcados con un radiotrazador. Un radiotrazador es típicamente una sustancia que contiene un radioisótopo que permite una fácil detección y medición. Una serie de formas diferentes de hidrógeno, carbono, fósforo, azufre y yodo se utilizan comúnmente en el diagnóstico médico. Los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse con cualquier radiotrazador adecuado. Los radiotrazadores preferidos incluyen radiotrazadores para imaginería médica. Los radiotrazadores comunes usados incluyen 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 99mTc, mIn, 123I, 131I, 133Xe, 201T1 e 90Y. Preferiblemente, los anticuerpos como se describen en la presente memoria están marcados con 18F, 123/131I, mIn, 90Y o 99mTc.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden marcarse con cualquier sonda fluorescente conocida en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen fluoresceína, ácido acético amino cumarina, isocianato de tetrametilcodomina, Rojo Texas, Cy 3.0, Cy 5.0, proteína verde fluorescente y similares.
En otro aspecto preferido, los anticuerpos como se describen en la presente memoria están marcados con un agente de contraste. Un agente de contraste es una sustancia usada para aumentar o modificar el contraste de órganos, fluidos o estructuras anatómicas en el cuerpo humano o animal. Los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse con cualquier agente de contraste adecuado. Los agentes de contraste preferidos incluyen agentes de contraste para imaginería médica. Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención están marcados con un agente de contraste de MRI (imaginería por resonancia magnética) tal como un agente de contraste superparamagnético o un agente de contraste paramagnético. Los agentes de contraste de MRI son típicamente metales quelados o coloides. Los agentes de contraste más comúnmente usados incluyen agentes de contraste a base de gadolinio (Gd) tales como gadolinio-DTPA, agentes de contraste a base de óxido de hierro tales como partículas pequeñas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPIO) y partículas pequeñas ultrapequeñas superparamagnéticas de óxido de hierro (USPIO) y agentes de contraste paramagnéticos a base de quelatos de manganeso tales como Mn-DPDP.
La descripción también proporciona métodos para reducir el riesgo de complicaciones postquirúrgicas que comprenden administrar una cantidad efectiva de un inmunoconjugado antes, durante o después de la cirugía, y en realizaciones específicas no limitantes, cirugía para tratar el cáncer.
La descripción también proporciona métodos para prevenir la aparición, prevenir o retrasar la recurrencia, o reducir la tasa de recurrencia del cáncer que comprenden administrar directamente a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de un inmunoconjugado.
La descripción también proporciona métodos para sensibilizar un tumor o cáncer a uno o más agentes anticancerígenos que comprenden administrar un inmunoconjugado de la invención. En un aspecto no limitante, el otro agente anticancerígeno comprende otro inmunoconjugado dirigido a EpCAM. En otro aspecto no limitante, el otro agente anticancerígeno comprende radiación. Los otros agentes anticancerígenos pueden administrarse antes de, solapándose con, simultáneamente y/o después de la administración del inmunoconjugado. Cuando se administran simultáneamente, el inmunoconjugado y otro agente anticancerígeno pueden administrarse en una sola formulación o en formulaciones separadas, y si están por separado, opcionalmente, por diferentes modos de administración. En consecuencia, la combinación de uno o más inmunoconjugados y uno o más agentes anticancerígenos puede actuar sinérgicamente para combatir el tumor o el cáncer. En algunos aspectos, el inmunoconjugado puede coadministrarse, administrarse simultáneamente o administrarse secuencialmente con uno o más agentes anticancerígenos.
En algunos aspectos, los agentes anticancerígenos pueden ser tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, acetato de megestrol, anasfrozol, letrazol, borazol, exemestano, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, acetato de goserelina, luprolida, finasterida, herceptina, metotrexato, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina, mitramicina, cisplatino, carboplatino, melfalán, clorambucilo, busulfán, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, tiotefán, vincristina, taxol, taxotere, etopósido, tenipósido, amsacrina, irinotecán, topotecán, una epotilona, Iressa, Tarceva, Sorafenib, inhibidores de angiogénesis, inhibidores de EGF, inhibidores de VEGF, inhibidores de CDK, citoquinas, inhibidores de Her1 y Her2, y anticuerpos monoclonales.
En otros aspectos, se proporcionan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar un inmunoconjugado en combinación con un régimen de radioterapia. La terapia también puede comprender cirugía y/o quimioterapia. Por ejemplo, el inmunoconjugado puede administrarse en combinación con radioterapia y cisplatino (Platinol), fluorouracilo (5-FU, Adrucil), carboplatino (Paraplatino) y/o paclitaxel (Taxol). El tratamiento con el inmunoconjugado puede permitir el uso de acuerdo con dosis más bajas de radiación y/o tratamientos de radiación menos frecuentes, lo que puede, por ejemplo, reducir la incidencia de dolor de garganta severo que impide la función de deglución, lo que puede provocar potencialmente una pérdida de peso o deshidratación no deseada.
Las composiciones farmacéuticas para la terapia de combinación también pueden incluir, sin limitación, antibióticos (p. ej., dactinomicina, bleomicina, mitramicina, antramicina), asparaginasa, proteína BCG, toxina diftérica, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, agentes antimitóticos, abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, agentes antihistamínicos, agentes contra las náuseas, etc.
De hecho, la administración directa de una cantidad efectiva de un inmunoconjugado a un paciente que necesita dicho tratamiento puede dar como resultado dosis reducidas de otro agente anticancerígeno que tenga eficacia clínicamente significativa. Dicha eficacia de la dosis reducida del otro agente anticancerígeno puede no observarse en ausencia de la administración con un inmunoconjugado. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para tratar un tumor o cáncer que comprenden administrar una dosis reducida de uno o más agentes anticancerígenos.
Además, la terapia de combinación que comprende un inmunoconjugado para un paciente que necesita dicho tratamiento puede permitir tiempos de tratamiento relativamente cortos en comparación con la duración o el número de ciclos de regímenes de tratamiento estándar. Por consiguiente, la presente descripción proporciona métodos para tratar un tumor o cáncer que comprenden administrar uno o más otros agentes anticancerígenos durante una duración relativamente corta y/o en menos ciclos de tratamiento.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, las terapias de combinación que comprenden un inmunoconjugado y otro agente anticancerígeno pueden reducir la toxicidad (es decir, los efectos secundarios) del tratamiento global contra el cáncer. Por ejemplo, se puede observar una toxicidad reducida, en comparación con una monoterapia u otra terapia de combinación, cuando se administra una dosis reducida de inmunoconjugado y/u otro agente anticancerígeno, y/o cuando se reduce la duración de un ciclo (es decir, el período de una administración única o el período de una serie de dichas administraciones), y/o cuando se reduce el número de ciclos.
Los resultados clínicos de los tratamientos contra el cáncer que usan un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención son fácilmente discernibles por un experto en la técnica relevante, tal como un médico. Por ejemplo, los ensayos médicos estándar para medir los marcadores clínicos del cáncer pueden ser fuertes indicadores de la eficacia del tratamiento. Dichos ensayos pueden incluir, sin limitación, examen físico, escalas de rendimiento, marcadores de enfermedad, ECG de 12 derivaciones, mediciones tumorales, biopsia de tejido, citoscopia, citología, cálculos del diámetro más largo del tumor, radiografía, imagen digital del tumor, signos vitales, peso, registro de eventos adversos, evaluación de episodios infecciosos, evaluación de medicamentos concomitantes, evaluación del dolor, química sanguínea o sérica, detección de marcadores séricos, análisis de orina, escaneo CT y análisis farmacocinético. Además, los efectos sinérgicos de una terapia de combinación que comprende el inmunoconjugado y otro agente anticancerígeno pueden determinarse mediante estudios comparativos con pacientes sometidos a monoterapia.
La dosis efectiva del anticuerpo o inmunoconjugado a administrar durante un ciclo varía según el modo de administración. La administración directa (p. ej., inyección intratumoral) requiere dosis corporales totales mucho menores de inmunoconjugado en comparación con la administración intravenosa sistémica del inmunoconjugado. Será evidente para el experto en la técnica que la administración local puede dar como resultado dosis corporales más bajas, y en esas circunstancias, y se esperaría y desearía un bajo nivel de inmunoconjugado plasmático en circulación.
La dosis efectiva por administración directa de anticuerpo o inmunoconjugado puede variar de aproximadamente 10 a 3.000, 20 a 900, 30 a 800, 40 a 700, 50 a 600, 60 a 500, 70 a 400, 80 a 300, 90 a 200, o 100 a 150 microgramos/tumor/día. La dosis puede variar de aproximadamente 10 a 20, 21 a 40, 41 a 80, 81 a 100, 101 a 130, 131 a 150, 151 a 200, 201 a 280, 281 a 350, 351 a 500, 501 a 1.000, 1.001 a 2.000, o 2.001 a 3.000 microgramos/tumor/día. La dosis puede ser al menos aproximadamente 20, 40, 80, 130, 200, 280, 400, 500, 750, 1.000, 2.000 o 3.000 microgramos/tumor/día.
En otras realizaciones, la administración del inmunoconjugado es a una dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg/dosis a aproximadamente 2.000 mg/kg/dosis.
La dosis efectiva de anticuerpo o inmunoconjugado puede variar de aproximadamente 100 a 5.000, 200 a 4.000, 300 a 3.000, 400 a 2.000, 500 a 1.000, 600 a 900, o 700 a 1.500 microgramos/tumor/mes. La dosis puede variar de aproximadamente 100 a 199, 200 a 399, 400 a 649, 650 a 999, 1.000 a 1.799, 1.800 a 2.499, 2.500 a 3.499, 3.500 a 4.999, 5.000 a 7.499, 7.500 a 10.000, o 10.001 a 20.000 microgramos/tumor/mes. La dosis puede ser al menos aproximadamente 100, 200, 400, 650, 1.000, 1.400, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 7.500, 10.000 o 20.000 microgramos/tumor/mes.
En otra realización, el inmunoconjugado se administra por vía intratumoral a una dosis total por ciclo equivalente a, o inferior a, la dosis máxima tolerada establecida en un ensayo de seguridad, pero la dosis se estandariza en relación con el volumen del tumor. Por ejemplo, los sujetos recibirán entre 1 microgramo por cm3 y 500 microgramos por cm3 de tumor o una dosis suficiente para alcanzar aproximadamente entre 14 picomoles y 7 nanomoles por cm3 de tejido tumoral. La dosis se administrará en un volumen que no exceda de aproximadamente el 20-50% del volumen del tumor. El inmunoconjugado se diluirá en una disolución salina adecuada. Por ejemplo, para un tumor con un volumen estimado de 3 cm3, una dosis diana de 14 picomoles (1 microgramo por cm3) y un volumen relativo de inyección máximo de aproximadamente 1/3 del tumor, se diluirán 3 microgramos de inmunoconjugado en aproximadamente 1 ml de diluyente.
La dosis efectiva de otro agente anticancerígeno a administrar junto con un anticuerpo o inmunoconjugado durante un ciclo también varía de acuerdo con el modo de administración. El uno o más agentes anticancerígenos pueden administrarse por vía intratumoral o por otros modos de administración. Típicamente, los agentes quimioterapéuticos se administran sistémicamente. La dosificación estándar y los regímenes de tratamiento son conocidos en la técnica (véanse, p. ej., las últimas ediciones del índice Merck y la Physician's Desk Reference).
Por ejemplo, en una realización, el agente anticancerígeno adicional comprende dacarbazina a una dosis que varía de aproximadamente 200 a 4.000 mg/m2/ciclo. En una realización preferida, la dosis varía de 700 a 1.000 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende fludarabina a una dosis que varía de aproximadamente 25 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende arabinósido de citosina (Ara-C) en una dosis que varía de aproximadamente 200 a 2.000 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende docetaxel a una dosis que varía de aproximadamente 1,5 a 7,5 mg/kg/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende paclitaxel a una dosis que varía de aproximadamente 5 a 15 mg/kg/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende cisplatino a una dosis que varía de aproximadamente 5 a 20 mg/kg/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende 5-fluorouracilo a una dosis que varía de aproximadamente 5 a 20 mg/kg/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende doxorrubicina a una dosis que varía de aproximadamente 2 a 8 mg/kg/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende epipodofilotoxina a una dosis que varía de aproximadamente 40 a 160 mg/kg/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende ciclofosfamida a una dosis que varía de aproximadamente 50 a 200 mg/kg/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende irinotecán a una dosis que varía de aproximadamente 50 a 75, 75 a 100, 100 a 125, o 125 a 150 mg/m2/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno comprende vinblastina a una dosis que varía de aproximadamente 3,7 a 5,4, 5,5 a 7,4, 7,5 a 11 u 11 a 18,5 mg/m2/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende vincristina a una dosis que varía de aproximadamente 0,7 a 1,4, o de 1,5 a 2 mg/m2/ciclo.
En otra realización más, el agente anticancerígeno adicional comprende metotrexato a una dosis que varía de aproximadamente 3,3 a 5, 5 a 10, 10 a 100 o 100 a 1.000 mg/m2/ciclo.
La terapia de combinación con un anticuerpo o inmunoconjugado puede sensibilizar el cáncer o el tumor a la administración de un agente anticancerígeno adicional. Por consiguiente, la presente invención contempla terapias de combinación para prevenir, tratar y/o prevenir la recurrencia del cáncer que comprenden administrar una cantidad eficaz de un inmunoconjugado antes de, posteriormente a o simultáneamente con una dosis reducida de un agente anticancerígeno. Por ejemplo, el tratamiento inicial con un inmunoconjugado puede aumentar la sensibilidad de un cáncer o tumor al pulso posterior con una dosis de agente anticancerígeno. Esta dosis está cerca o por debajo del rango bajo de dosificaciones estándar cuando el agente anticancerígeno se administra solo, o en ausencia de un anticuerpo o inmunoconjugado. Cuando se administra simultáneamente, el inmunoconjugado se puede administrar separadamente del agente anticancerígeno, y opcionalmente, a través de un modo diferente de administración.
Por consiguiente, en una realización, el agente anticancerígeno adicional comprende cisplatino, p. ej., PLATINOL o PLAT-INOL-AQ (Bristol Myers), a una dosis que varía de aproximadamente 5 a 10, 11 a 20, 21 a 40, o 41 a 75 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende carboplatino, p. ej., PARAPLATINO (Bristol Myers), a una dosis que varía de aproximadamente 2 a 3, 4 a 8, 9 a 16, 17 a 35, o 36 a 75 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende ciclofosfamida, p. ej., CITOXÁN (Bristol Myers Squibb), a una dosis que varía de aproximadamente 0,25 a 0,5, 0,6 a 0,9, 1 a 2, 3 a 5, 6 a 10, 11 a 20, o 21 a 40 mg/kg/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende citarabina, p. ej., CITOSAR-U (Pharmacia & Upjohn), a una dosis que varía de aproximadamente 0,5 a 1, 2 a 4, 5 a 10, 11 a 25, 26 a 50 o 51 a 100 mg/m2/ciclo. En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende liposoma de citarabina, p. ej., DEPOCIT (Chiron Corp.), a una dosis que varía de aproximadamente 5 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende dacarbazina, p. ej., DTIC o DTICDOME (Bayer Corp.), a una dosis que varía de aproximadamente 15 a 250 mg/m2/ciclo o que varía de aproximadamente 0,2 a 2 mg/kg/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende topotecán, p. ej., HYCAMTIN (SmithKline Beecham), a una dosis que varía de aproximadamente 0,1 a 0,2, 0,3 a 0,4, 0,5 a 0,8, o 0,9 a 1,5 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende irinotecán, p. ej., CAMPTOSAR (Pharmacia & Upjohn), a una dosis que varía de aproximadamente 5 a 9, 10 a 25, o 26 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende fludarabina, p. ej., FLUDARA (Berlex Laboratories), a una dosis que varía de aproximadamente 2,5 a 5, 6 a 10, 11 a 15, o 16 a 25 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende arabinósido de citosina (Ara-C) en una dosis que varía de aproximadamente 200 a 2.000 mg/m2/ciclo, 300 a 1.000 mg/m2/ciclo, 400 a 800 mg/m2/ciclo, o 500 a 700 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende docetaxel, p. ej., TAXOTERE (Rhone Poulenc Rorer) a una dosis que varía de aproximadamente 6 a 10, 11 a 30, o 31 a 60 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende paclitaxel, p. ej., TAXOL (Bristol Myers Squibb), a una dosis que varía de aproximadamente 10 a 20, 21 a 40, 41 a 70, o 71 a 135 mg/kg/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende 5-fluorouracilo a una dosis que varía de aproximadamente 0,5 a 5 mg/kg/ciclo, 1 a 4 mg/kg/ciclo, o 2-3 mg/kg/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende doxorrubicina, p. ej., ADRIAMICINA (Pharmacia y Upjohn), DOXIL (Alza), RUBEX (Bristol Myers Squibb), a una dosis que varía de aproximadamente 2 a 4, 5 a 8, 9 a 15, 16 a 30, o 31 a 60 mg/kg/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende etopósido, p. ej., VEPESID (Pharmacia & Upjohn), a una dosis que varía de aproximadamente 3,5 a 7, 8 a 15, 16 a 25, o 26 a 50 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende vinblastina, p. ej., VELBAN (Eli Lilly), a una dosis que varía de aproximadamente 0,3 a 0,5, 0,6 a 0,9, 1 a 2 o 3 a 3,6 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende vincristina, p. ej., ONCOVIN (Eli Lilly), a una dosis que varía de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 mg/m2/ciclo.
En otra realización, el agente anticancerígeno adicional comprende metotrexato a una dosis que varía de aproximadamente 0,2 a 0,9, 1 a 5, 6 a 10 u 11 a 20 mg/m2/ciclo.
En otra realización, se administra un inmunoconjugado en combinación con al menos otro inmunoterapéutico que incluye, sin limitación, rituxán, rituximab, campath-1, gemtuzumab y trastuzutmab.
En otra realización, se administra un inmunoconjugado en combinación con uno o más agentes antiangiogénicos que incluyen, sin limitación, angiostatina, talidomida, kringle 5, endostatina, serpina (inhibidor de la serina proteasa), antitrombina, fragmento proteolítico de 29 kDa N-terminal y de 40 kDa C-terminal de fibronectina, fragmento proteolítico de prolactina de 16 kDa, fragmento proteolítico de 7,8 kDa del factor plaquetario 4, un péptido de 13 aminoácidos correspondiente a un fragmento del factor plaquetario 4, un péptido de 14 aminoácidos correspondiente a un fragmento de colágeno I, un péptido de 19 aminoácidos correspondiente a un fragmento de trombospondina I, un péptido de 20 aminoácidos correspondiente a un fragmento de SPARC y una variante de los mismos, incluyendo una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En otra realización, se administra un inmunoconjugado en combinación con una o más citoquinas que incluyen, sin limitación, linfoquinas, factores de necrosis tumoral, citoquina similar al factor de necrosis tumoral, linfotoxina, interferón, proteína inflamatoria de macrófagos, factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos, interleuquina (incluyendo, sin limitación, interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-6, interleuquina-12, interleuquina-15, interleuquina-18) y una variante de los mismos, incluyendo una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En otra realización más, se administra un inmunoconjugado en combinación con una vacuna contra el cáncer que incluye, sin limitación, células o tejidos autólogos, células o tejidos no autólogos, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, gonadotropina coriónica humana, vacuna BCG viva, proteínas de linaje de melanocitos, y antígenos específicos de tumor mutados.
En otra realización más, se administra un inmunoconjugado en asociación con terapia hormonal. Los terapéuticos hormonales incluyen, sin limitación, un agonista hormonal, un antagonista hormonal (p. ej., flutamida, tamoxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON)) y esteroides (p. ej., dexametasona, retinoide, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, deshidrotestosterona, glucocorticoide, mineralocorticoide, estrógeno, testosterona, progestina).
En otra realización más, se administra un inmunoconjugado en asociación con un programa de terapia génica para tratar o prevenir el cáncer.
En otra realización más, se administra un inmunoconjugado dirigido a EpCAM en combinación con uno o más agentes que aumentan la expresión de EpCAM en las células tumorales de interés. La expresión de EpCAM preferiblemente aumenta de modo que se expresa un mayor número de moléculas de EpCAM en la superficie de la célula tumoral. Por ejemplo, el agente puede inhibir los ciclos normales de la endocitosis del antígeno EpCAM. Dicho tratamiento de combinación puede mejorar la eficacia clínica del inmunoconjugado dirigido a EpCAM solo, o con otros agentes anticancerígenos o radioterapia. En realizaciones específicas no limitantes, el agente que aumenta la expresión de EpCAM en las células tumorales es tartrato de vinorelbina (Navelbina) y/o paclitaxel (Taxol).
La terapia de combinación puede aumentar así la sensibilidad del cáncer o tumor al inmunoconjugado y/o al agente anticancerígeno adicional administrados. De esta manera, pueden ser posibles ciclos de tratamiento más cortos, reduciendo así los eventos tóxicos. Por consiguiente, la descripción proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de un inmunoconjugado y al menos otro agente anticancerígeno durante un ciclo de tratamiento corto. La duración del ciclo puede variar de aproximadamente 1 a 30, 2 a 27, 3 a 15, 4 a 12, 5 a 9, o 6-8 días. La duración del ciclo puede variar según el agente anticancerígeno específico en uso. La invención también contempla la administración continua o discontinua, o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. El experto en la técnica apreciará una duración de ciclo apropiada para un agente anticancerígeno específico, y la invención contempla la evaluación continua de programas de tratamiento óptimos para cada agente anticancerígeno. Las pautas específicas para el experto en la técnica se conocen en la técnica.
Alternativamente, se pueden desear ciclos de tratamiento más largos. En consecuencia, la duración del ciclo puede variar de aproximadamente 10 a 56, 12 a 48, 14 a 28, 16 a 24 o 18 a 20 días. La duración del ciclo puede variar según el agente anticancerígeno específico en uso.
Rutas de administración
Los anticuerpos y/o inmunoconjugados descritos en la presente memoria pueden administrarse al paciente a través de cualquier ruta adecuada. Los anticuerpos y/o inmunoconjugados pueden administrarse por inyección en el sistema vascular o por inyección en un órgano. Las rutas de administración preferidas incluyen inyección parenteral, intravascular y/o intravenosa. La administración parenteral incluye inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracavitaria, intratecal, intratumoral, transdérmica e intravenosa. En una realización preferida, los anticuerpos y/o inmunoconjugados se administran por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo. En otras realizaciones, los anticuerpos y/o inmunoconjugados pueden administrarse directamente en el sitio del cáncer.
El inmunoconjugado y los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse de manera convencional por cualquier ruta en la que sean activos. La administración puede ser sistémica, parenteral, tópica u oral. Por ejemplo, la administración puede ser, pero no se limita a, por las rutas parenteral, oral, bucal u ocular, o intravaginal, por inhalación, por inyecciones de depósito o por implantes. Por lo tanto, los modos de administración para los anticuerpos/inmunoconjugados de la presente invención (ya sea solos o en combinación con otros productos farmacéuticos) pueden ser, pero no están limitados a, sublinguales, inyectables (incluidas formas de acción corta, depósito, implante y pastillas inyectadas por vía subcutánea. o intramuscular), o mediante el uso de acuerdo con cremas vaginales, supositorios, pesarios, anillos vaginales, supositorios rectales, dispositivos intrauterinos y formas transdérmicas tales como parches y cremas.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el inmunoconjugado y/u otro agente anticancerígeno se administra al paciente mediante administración directa. En consecuencia, el inmunoconjugado y/u otro agente anticancerígeno pueden administrarse, sin limitación, mediante una o más inyecciones directas en el tumor, mediante perfusión continua o discontinua en el tumor, mediante la introducción de un reservorio del inmunoconjugado, mediante la introducción de un aparato de liberación lenta en el tumor, mediante la introducción de una formulación de liberación lenta en el tumor, y/o mediante aplicación directa sobre el tumor. Por el modo de administración en el tumor, también se contempla la introducción del inmunoconjugado y/u otro agente anticancerígeno en el área del tumor, o en un vaso sanguíneo o vaso linfático que fluye sustancialmente directamente en el área del tumor. En cada caso, la composición farmacéutica se administra en al menos una cantidad suficiente para alcanzar el punto final, y si es necesario, comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se contempla que los inmunoconjugados pueden administrarse por vía intratumoral, mientras que cualquier otro agente anticancerígeno puede administrarse al paciente por otros modos de administración (p. ej., por vía intravenosa). Además, cuando se pretende administrar múltiples agentes anticancerígenos a un paciente, el inmunoconjugado y uno o más de los otros agentes anticancerígenos pueden administrarse por vía intratumoral, mientras que otros agentes anticancerígenos pueden administrarse por otros modos de administración (p. ej., por vía intravenosa y oral).
En algunas realizaciones, una composición puede ser un anticuerpo de la invención y un excipiente, vehículo, tampón o estabilizador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición puede ser un inmunoconjugado de la invención y un excipiente, vehículo, tampón o estabilizador farmacéuticamente aceptable. Un inmunoconjugado según la invención puede estar comprendido en una composición farmacéutica o medicamento. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración directa incluyen, sin limitación, polvos liofilizados o disoluciones o suspensiones inyectables estériles acuosas o no acuosas, que pueden contener además antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que las composiciones sean sustancialmente isotónicas con la sangre de un receptor previsto. Otros componentes que pueden estar presentes en dichas composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las disoluciones y suspensiones de inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles. El inmunoconjugado se puede suministrar, por ejemplo, pero no a modo de limitación, como un polvo liofilizado que se reconstituye con agua o disolución salina estéril antes de la administración al paciente.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen composiciones esencialmente químicamente inertes y no tóxicas que no interfieren con la efectividad de la actividad biológica de la composición farmacéutica. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones salinas, disoluciones de glicerol, etanol, cloruro de N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), diolesilfosfotidil-etanolamina (DOPE) y liposomas. Dichas composiciones deben contener una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de administración directa al paciente.
En otra realización, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo o inmunoconjugado y uno o más agentes anticancerígenos adicionales, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable que incluye, sin limitación, aquellas formadas con grupos amino libres tales como las derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
En diversas realizaciones de la invención, la composición farmacéutica se administra directamente en el área del tumor o tumores mediante, por ejemplo, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica (p. ej., junto con un apósito para heridas después de la cirugía), inyección, mediante un catéter, mediante un supositorio o mediante un implante. Un implante puede ser de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Los supositorios generalmente contienen ingredientes activos en el rango del 0,5% al 10% en peso.
En otras realizaciones, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca del tumor diana. Por ejemplo, una microbomba puede administrar dosis controladas directamente en el área del tumor, regulando así finamente el tiempo y la concentración de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, el vehículo farmacéutico puede incluir, sin limitación, aglutinantes, recubrimientos, disgregantes, cargas, diluyentes, sabores, colorantes, lubricantes, deslizantes, conservantes, sorbentes, edulcorantes, ácido linoleico conjugado (CLA), gelatina, cera de abejas, agua purificada, glicerol, cualquier tipo de aceite, incluidos, sin limitación, aceite de pescado o aceite de soja, o similares. Las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos/inmunoconjugados también pueden comprender vehículos o excipientes sólidos o en fase de gel adecuados. Los ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como, p. ej., polietilenglicoles.
Para la administración oral, los inmunoconjugados y anticuerpos pueden formularse fácilmente combinando estos inmunoconjugados/anticuerpos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que los inmunoconjugados de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lodos, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener añadiendo un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cargas tales como azúcares, que incluyen, pero no limitados a, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, pero no limitadas a, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como, pero no limitados a, la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se pueden proporcionar con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar disoluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis anticuerpos/inmunoconjugados.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen, pero no están limitadas a, cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con un relleno tal como, p. ej., lactosa, aglutinantes tales como, p. ej., almidones y/o lubricantes tales como, p. ej., talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los inmunoconjugados/anticuerpos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para dicha administración.
Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de, p. ej., comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.
Para la administración por inhalación, las composiciones para uso de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en la forma de presentación de un pulverizador en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de acuerdo con un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para usar en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo de los inmunoconjugados/anticuerpos y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Las composiciones de la presente invención también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, p. ej., que contienen bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, las composiciones de la presente invención también pueden formularse como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular.
Las inyecciones de liberación lenta se pueden administrar a intervalos de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 meses o más. Así, por ejemplo, los inmunoconjugados/anticuerpos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.
En la administración transdérmica, las composiciones de la presente invención, por ejemplo, pueden aplicarse a un apósito, o pueden aplicarse mediante sistemas terapéuticos transdérmicos que, por consiguiente, se suministran al organismo.
Las composiciones de la presente invención también se pueden administrar en combinación con otros ingredientes activos, tales como, por ejemplo, adyuvantes, inhibidores de proteasas u otros fármacos o compuestos compatibles donde se considera que dicha combinación es deseable o ventajosa para lograr los efectos deseados de los métodos descritos en la presente memoria.
En algunas realizaciones, el componente disgregante comprende uno o más de croscarmelosa de sodio, carmelosa de calcio, crospovidona, ácido algínico, alginato de sodio, alginato de potasio, alginato de calcio, una resina de intercambio iónico, un sistema efervescente basado en ácidos alimentarios y un componente de carbonato alcalino, arcilla, talco, almidón, almidón pregelatinizado, glicolato de sodio de almidón, flóculo de celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, silicato de calcio, un carbonato metálico, bicarbonato de sodio, citrato de calcio o fosfato de calcio.
En algunas realizaciones, el componente diluyente comprende uno o más de manitol, lactosa, sacarosa, maltodextrina, sorbitol, xilitol, celulosa en polvo, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, carboxietilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, almidón, glicolato de sodio de almidón, almidón pregelatinizado, un fosfato de calcio, un carbonato metálico, un óxido metálico o un aluminosilicato metálico.
En algunas realizaciones, el componente lubricante opcional, cuando está presente, comprende uno o más de ácido esteárico, estearato metálico, estearil fumarato de sodio, ácido graso, alcohol graso, éster de ácido graso, behenato de glicerilo, aceite mineral, aceite vegetal, parafina, leucina, sílice, ácido silícico, talco, éster de ácido graso de propilenglicol, aceite de ricino polietoxilado, polietilenglicol, polipropilenglicol, polialquilenglicol, éster graso de polioxietilenglicerol, éter de alcohol graso de polioxietileno, esterol polietoxilado, aceite de ricino polietoxilado, aceite vegetal polietoxilado o cloruro de sodio.
Ejemplos
Ejemplo 1: método de mapeo de los epítopos de células T en los dominios Vh y Vl del fragmento de anticuerpo EpCAM.
Las secuencias de los dominios Vh-Ch y Vl-Cl del fragmento de anticuerpo EpCAM no desinmunizado (Fab) VB5-845-WT están representadas por las SEQ ID NO: 5 y 6, y también se han descrito en la patente de EE. UU. 7.339.031, que se incorpora en la presente memoria como referencia. El análisis de las secuencias usando iTope™ se realizó con 9mers superpuestos que abarcan las proteínas que se ensayaron frente a cada uno de los 34 alelos de MHC de clase II. Cada 9mer se calificó en función del 'ajuste' potencial y de las interacciones con las moléculas de MHC de clase II. Las puntuaciones de péptidos calculadas por el software se encuentran entre 0 y 1. Se destacaron los péptidos que produjeron una puntuación de unión media alta (> 0,55 en la función de puntuación iTope™). Si >=50% de los péptidos de unión a MHC de clase II (es decir, 17 de 34 alelos) tenían una alta afinidad de unión (puntuación >0,6), dichos péptidos se definieron como péptidos de unión a MHC de clase II "promiscuos de afinidad alta". Los péptidos de unión a MHC de clase II que se unían a >=50% de los alelos con una puntuación >0,55 se definieron como "promiscuos de afinidad moderada". Las secuencias también se usaron para interrogar al TCED™ mediante búsqueda BLAST con el fin de identificar cualquier homología de secuencia alta con epítopos de células T previamente identificados.
El dominio Vh-Ch no desinmunizado se designa como Vh-Ch de tipo salvaje (WT) (SEQ ID NO: 5) y el dominio Vh-Ch desinmunizado se designa como Vl-Cl desinmunizado (DI) (SEQ ID NO: 1). Del mismo modo, el dominio Vl-Cl no desinmunizado se designa como Vl-Cl de tipo salvaje (WT) (SEQ ID NO: 6) y el dominio Vl-Cl desinmunizado se designa como Vl-Cl desinmunizado (DI) (SEQ ID NO: 2). Los análisis de péptidos del dominio variable solamente-VH-WT, Vh-DI, Vl-WT y Vl-DI se muestran en las Fig. 2-6. La Tabla 1 muestra los aminoácidos mutados requeridos para generar Vh-DI. La Tabla 2 muestra los ácidos mutados requeridos para generar Vl-DI.
TABLA 1
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TABLA 2
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Se ensayaron otras mutaciones, pero no se enumeran en las tablas anteriores, porque no se expresaron o fallaron en los estudios de unión.
Ejemplo 2: preparación de VB5-845 desinmunizado
Mientras que las mutaciones de Fab se evaluaron in silico con la molécula VB5-845, la caracterización biológica se realizó usando tanto el Fab desinmunizado solo como una proteína de fusión que contenía el fragmento Fab desinmunizado fusionado con la carga útil de la toxina de DeBouganina en el extremo C de la cadena ligera. La carga útil de la toxina deBouganina (SEQ ID NO: 4) se usó como una etiqueta para el estudio de citometría de flujo y como una etapa de captura para la cuantificación por ELISA del sobrenadante inducido.
Los fragmentos 845 Vh y Vl mutados se generaron mediante el método de PCR de Empalme por Extensión de Solapamiento, SOE-PCR usando los cebadores correspondientes. Cada fragmento Vh y Vl se clonó en el vector pCR 2.1 y se transformó en células de E. coli 10F para la secuenciación. El plásmido pCR 2.1 que contenía el inserto correcto se digirió con un conjunto identificado de enzimas de restricción, específicas bien para Vh o Vl.
El fragmento Vh se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y SacII y se ligó con el fragmento Sac II-CH-VL-CL-de-Boug-XhoI en el vector pING3302, digerido previamente con EcoRI y Xhol. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron con la reacción de ligación y se creció una colonia transformada para la expresión a pequeña escala.
El fragmento Vl, digerido con las enzimas de restricción SalI y BsmI, se ligó con el plásmido VB6-845/pSP73, digerido previamente con las mismas enzimas de restricción. La reacción de ligación se transformó en células de E. coli 10F y, después de la selección con ampicilina, el plásmido VB6-845/pSV73 se extrajo de una colonia cultivada durante la noche. El inserto VB6-845 se obtuvo con la combinación de las enzimas de restricción ScaI, EcoRI y XhoI y se ligó en el vector pING3302, digerido previamente con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron entonces con la reacción de ligación VB6-845/3302 y se creció una colonia transformada para la expresión a pequeña escala.
Para combinar las cadenas mutadas, los fragmentos Vh y Vl se digirieron con EcoRI-SacII y SacII-XhoI, respectivamente, y se ligaron en presencia del plásmido pING3302, digerido previamente con EcoRI y XhoI. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron con la reacción de ligación VB6-845 Vh+Vl/3302 y se creció una colonia transformada para la expresión a pequeña escala.
Ingeniería de la variante VB5-845-DI
El VB5-845 DI está representado por un dominio de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19; y un dominio de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 20. La variante VB5-845-DI se preparó por ingeniería usando el sitio de restricción único BssSI presente en la cadena Cl kappa. El fragmento 845 EcoRI-Vh-Ch-Vl-Cl-BssSI se ligó con el fragmento BssSI-Cl kappa-XhoI en el plásmido pING3302, digerido previamente con EcoRI y XhoI. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron con la reacción de ligación para la secuenciación y la expresión a pequeña escala.
Expresión a pequeña escala
Las células 10F transformadas que contenían la variante VB5-845-DI/plásmido 3302 se inocularon en 5 mL de 2-YT que contenían 25 pg/mL de tetraciclina y se incubaron a 37 °C con agitación constante a 225 rpm. Después de 16 horas de incubación, se inocularon 300 pL de cultivo de siembra de toda la noche en 30 mL de TB (1% de inóculo), y se incubaron a 37 °C con agitación constante a 225 rpm hasta que se alcanzó una DO600 de 2,0. El cultivo se indujo con 150 |jL de L-Arabinosa (0,1% final), y se incubó a 25 °C con agitación constante a 225 rpm. A las 16 horas después de la inducción, se recogió el sobrenadante del cultivo para su análisis mediante transferencia Western, ELISA y citometría de flujo.
Expresión de VB5-845-DI a escala de 15 L
El cultivo en Medios Mínimo de Glicerol (GMM) de células de E. coli E104 transformadas se realizó en un biorreactor de 20 L a 28 °C, flujo de aire y agitación de 10 SLPM y 1.000 RPM, respectivamente, y un pH de 7,0 mantenido con hidróxido de amonio. Brevemente, se inocularon 15 L de GMM con 150 mL de cultivo de siembra cultivado en GMM que contenía 25 pg/mL de tetraciclina hasta una DO600 de 2,0-2,5 en un incubador con agitación ajustado a 26 °C y 200 RPM. En el biorreactor de 20 L, un aumento en el oxígeno disuelto (OD) a > 90% desencadenó la alimentación con glicerol al 50% a través del bucle de pO2 en un punto de ajuste de OD del 40%, para controlar la tasa de crecimiento. A una DO600 de 50, se indujo el cultivo con una alimentación de glicerol al 50% que contenía L-arabinosa usando la misma estrategia de alimentación. Después de 40 horas de inducción, el sobrenadante que contenía VB5-845-DI se clarificó por centrifugación seguido de microfiltración, se concentró y se diafiltró frente a tampón NaPO420 mM, pH 7,0.
Purificación de un lote de 15 L
Todas las columnas de cromatografía fueron empaquetadas en carcasas de columnas reutilizables de GE healthcare y despirogenadas haciendo fluir NaOH 1 N a través de las columnas durante 35 minutos y lavadas con WFI hasta que el pH del efluente de la columna fue <pH 8,0.
El punto isoeléctrico teórico de VB5-845 desinmunizado es 8,65. El pH del sobrenadante del cultivo diafiltrado se ajustó a pH 6,2 para la unión a una columna de intercambio catiónico débil (p. ej., CM sefarosa preparada según las instrucciones del fabricante) que se equilibró previamente con tampón NaPO420 mM, tampón NaCl 25 mM pH 6,2. Después de cargar, la columna se lavó a la línea de base UV 280 nm con tampón de equilibrado y el VB5-845-DI unido se eluyó aumentando el pH y el NaCl del tampón de equilibrado a tampón NaPO420 mM, tampón NaCl 150 mM pH 7,5.
El pico del producto recogido en la etapa anterior se diluyó 3 veces con tampón NaPO420 mM, pH 7,0 y el pH final de la disolución diluida se ajustó a pH 7,5 antes de la aplicación en una columna de intercambio aniónico (p. ej., Q-sefarosa preparada según las instrucciones del fabricante) operada en modo de flujo continuo. La columna se equilibró con tampón NaPO420 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5. El pH del flujo saliente de la columna y lavado combinados se ajustó a pH 6,0 para su aplicación en la tercera columna.
La muestra combinada se hizo fluir entonces a través de una columna de intercambio catiónico (p. ej., SP sefarosa preparada según las instrucciones del fabricante) previamente equilibrada con tampón NaPO420 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0 y se recogió el efluente que contenía el producto. El pH del efluente se ajustó a pH 7,5 y se esterilizó por filtración para almacenamiento a largo plazo a 4 °C y -20 °C.
El nivel de expresión de la construcción VB5-845-DI se estimó mediante análisis por transferencia Western. Brevemente, se cargaron 16 pL de sobrenadante de cultivo inducido y 4 pL de tampón de muestra LDS en un gel NuPAGE Bis-Tris al 10%. El gel se transfirió entonces a una membrana de nitrocelulosa a 40 V durante 1 hora. Después de bloquear y lavar la membrana, se detectó la proteína VB5-845-DI usando un anticuerpo anti-kappaperoxidasa de rábano (1/1.000) durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se reveló usando DAB, y el nivel de expresión de las construcciones VB5-845-DI se comparó con VB6-845 y VB5-845-WT. La especificidad de las bandas detectadas se confirmó usando sobrenadante de E. coli no inducida.
Se usó un ELISA para cuantificar la proteína VB6-845 presente en los sobrenadantes de cultivo inducidos. Brevemente, una placa Immunolon 1B se recubrió con 10 pg/mL de anti-bouganina de conejo y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de lavar y bloquear la placa, los sobrenadantes de las variantes VB6-845, diluidos 1/320, 1/640 y 1/1.280, así como una curva estándar preparada a partir del anticuerpo VB6-845-WT purificado (25 ng/mL-0,195 ng/mL), se añadieron a la placa y se incubaron durante 2 horas a 22 °C. La proteína VB5-845-DI unida se detectó usando un anticuerpo anti-kappa-peroxidasa de rábano (1/1.000) durante 1 hora a 22 °C. La placa se reveló usando TMB. Los sobrenadantes de cultivo de VB6-845-WT e inducidos por el plásmido pING3302 se usaron como un control positivo y negativo, respectivamente.
Ejemplo 3: ensayos de unión in vitro
La unión de los fragmentos de anticuerpos VB5-845 desinmunizados (VB5-845-DI) y VB5-845 no desinmunizados (VB5-845-WT) se evaluó en la línea celular de cáncer CAL-27 mediante citometría de flujo. Las variantes VB5-845 purificadas (DI y WT) se incubaron a 1 pg/mL con 0,3 x 106 células tumorales durante 2 horas en hielo. Después de lavar con PBS-FBS al 5%, se añadió un anticuerpo biotinilado de cabra anti-IgG humana (H&L) (1/200) a las células y se incubó durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron con PBS-FBS al 5% y se añadió estreptavidina-cychrome durante 30 minutos en hielo para detectar las proteínas VB5-845 unidas a las células (FIG. 7).
La FIG. 8 muestra la unión dependiente de la dosis de VB5-845-DI a la línea celular de carcinoma de células escamosas H&N positivas para EpCAM Cal-27. No se observó unión frente al melanoma A375 negativo para EpCAM. La unión se expresa como las veces de aumento medio de la fluorescencia media sobre el control de p Bs por citometría de flujo.
Ejemplo 4: afinidad de unión
La citometría de flujo se usó para medir la afinidad de unión de VB5-845-WT y VB5-845-DI. Brevemente, las proteínas VB5-845 se incubaron a concentraciones que variaban de 3,2 ng/mL a 1.000 ng/mL con 0,2 x 106 células CAL 27 en hielo durante 2 horas. Después de lavar con PBS-FBS al 5%, se añadió un anticuerpo biotinilado de cabra anti-IgG humana y se incubó durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron con PBS-FBS al 5% y se añadió estreptavidinacychrome durante 30 minutos en hielo para detectar VB5-845 unido a las células. Los valores y el análisis gráfico se generaron usando Sigma Plot (Jandel Scientific, San Rafael, CA). La inversa de la fluorescencia media determinada se representó como una función de la inversa de la concentración de anticuerpo para determinar KD por el método de Lineweaver-Burk. Se generó un gráfico y se calculó la KD a partir de la pendiente de la curva. La constante de disociación, valor KD, se determinó mediante la siguiente ecuación: 1/F= 1/Fmáx (KD/Fmáx) (1/Fab), donde F = fluorescencia mediana de fondo restada y Fmáx se calculó a partir de la gráfica (FIG. 9)
Ejemplo 5: ensayos de competición
La capacidad de las variantes VB5-845 (VB5-845-DI y VB5-845-WT) para competir con VB6-845 para unirse a las células tumorales CAL 27 se determinó por citometría de flujo. VB6-845 es un inmunoconjugado unido a toxina de bouganina desinmunizada y se ha descrito en la Patente de EE.UU. No. 7.339.031 y se incorpora en la presente memoria por referencia. Las variantes de VB5-845 y VB6-845 se incubaron conjuntamente en 150 pL con 0,2 x 106 células tumorales durante 2 horas en hielo. La concentración de VB6-845 se mantuvo constante a 1 pg/mL mientras que la concentración de las variantes de VB5-845 se incrementó de 781 ng/mL a 25 pg/mL. La VB6-845 unida en la superficie celular se detectó con un anticuerpo anti-de-bouganina de ratón seguido de un H&L antiratón de cabra acoplado a FITC (FIG. 10).
Ejemplo 6: análisis EpiScreen de clones de tipo salvaje vs. clones desinmunizados
Preparación y selección de donantes de PBMC
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aíslan de capas leucoplaquetarias de donantes de la comunidad sana (de sangre extraída en 24 horas) obtenidas del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre del Reino Unido (Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Reino Unido) y de acuerdo con la aprobación otorgada por el Comité de Ética de Investigación Local del Addenbrooke's Hospital. Las PBMC se aíslan de las capas leucoplaquetarias mediante centrifugación de densidad Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, Reino Unido) y las células T CD8+ se deplecionan usando CD8+ RosetteSep™ (StemCell Technologies Inc, Londres, Reino Unido). Los donantes se caracterizan mediante la identificación de los haplotipos HLA-DR usando un kit de tipificación de tejidos basado en HLA SSP-PCR (Biotest, Solihull, Reino Unido). También se determinan las respuestas de las células T a un antígeno control (hemocianina de lapa (KLH), [Pierce (Perbio), Cramlington, Reino Unido]), así como péptidos derivados de los virus de la gripe A y Epstein Barr. Las PBMC se congelan y almacenan entonces en nitrógeno líquido hasta que se requieran.
Se selecciona una cohorte de 51 donantes para representar mejor el número y la frecuencia de los alotipos HLA-DR expresados en la población mundial. El análisis de los alotipos expresados en la cohorte frente a los expresados en la población mundial revelará que se alcanza una cobertura de >80% y que todos los alotipos principales de HLA-DR (alotipos individuales con una frecuencia >5% expresados en la población mundial) están bien representados.
Ensayos de la evolución temporal de la proliferación de las células T EpiScreen™
Las PBMC de cada donante se descongelan, se cuentan y se evalúa la viabilidad. Las células se reviven medio de cultivo AIM-VR a temperatura ambiente, se lavan y se resuspenden en AIM-VR a 4-6x106 PBMC/ml. Para cada donante, se establecen cultivos a granel en los que se añade 1 mL de preparación madre de células de proliferación a los pocillos apropiados de una placa de 24 pocillos. Se añaden 0,5 mL de medio de cultivo y 0,5 mL de cada muestra diluida a las PBMC para proporcionar una concentración final de 0,3 pM. Para cada donante, también se incluye un control de reproducibilidad (células incubadas con 100 pg/ml de KLH), un control positivo (células incubadas con 25 pg/ml de PHA) y un pocillo solo con medio de cultivo. Los cultivos se incuban durante un total de 8 días a 37 °C con CO2 al 5%. En los días 5, 6, 7 y 8, las células en cada pocillo se resuspenden suavemente, y se transfieren 3 x 100 pl partes alícuotas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Los cultivos se pulsan con 0,75 pCi [3H]-Timidina (Perkin ElmerR, Beaconsfield, Reino Unido) en 100 pl de medio de cultivo AIM-VR y se incuban durante 18 horas más antes de recoger sobre rejillas de filtro (Perkin ElmerR) usando un recolector de células Skatron Micro 96S - 10056. Las cuentas por minuto (cpm) para cada pocillo se determinan mediante contaje de centelleo Meltilex™ (Perkin ElmerR) en un contador de centelleo líquido 1450 Microbeta Wallac Trilux (Perkin ElmerR) en paralux, contaje de fondo bajo.
Ensayos ELISpot de IL-2 EpiScreen™
También se usaron donantes idénticos a los usados en el ensayo de proliferación para el ensayo ELISpot de IL-2. Las células se descongelan y reviven como se ha descrito anteriormente. Las placas ELISpot (Millipore, Watford, Reino Unido) se humedecen previamente y se recubren durante la noche con 100 pl/pocillo de muestra de captura de IL-2 (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) en PBS. Las placas se lavan entonces 3 veces en PBS, se incuban durante la noche en tampón de bloqueo (BSA al 1% en PBS) y se lavan en medio AIM-VR. La densidad celular para cada donante se ajusta a 4-6x106 PBMC/ml en medio de cultivo AIM-VR y se añaden 100 pL de células a cada pocillo. Se añaden 50 pL de muestras y controles a los pocillos apropiados, así como 50 pL de AIMV para llevar el volumen total a 200 pL/pocillo. Las muestras se ensayan en cultivos sextuplicados y, para cada donante, también se incluyen en cada placa un control negativo (medio AIMV R solo), control sin células y un control positivo con mitógeno (PHA a 2,5 pg/ml - usado como ensayo interno para la función ELISpot y la viabilidad celular). Después de un período de incubación de 8 días, las placas ELISpot se revelan mediante lavado secuencial en dH2O y PBS (x3) antes de la adición de 100 pL de muestra de detección biotinilada filtrada (R&D Systems) en PBS/BSA al 1%. Después de la incubación a 37 °C durante 1,5 horas, las placas se lavan adicionalmente en PBS (x3) y se añaden 100 pL de estreptavidina-AP filtrada (R&D Systems) en PBS/BSA al 1% durante 1,5 horas (incubación a temperatura ambiente). La estreptavidina-AP se desecha y las placas se lavan en PBS (x4). Se añaden 100 pL de sustrato BCIP/NBT (R&D Systems) a cada pocillo y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. El revelado de las manchas se detiene lavando los pocillos y la parte posterior de los pozos tres veces con dH2O. Las placas secas se escanean en un analizador ImmunoscanR y las manchas por pocilio (spw) se determinan usando el software ImmunoscanR versión 4.
Análisis de los datos de EpiScreen™
Para los ensayos de proliferación y ELISpot de IL-2, se ha establecido previamente un umbral empírico de un índice de estimulación (SI) igual a o mayor de 2 (SI>2,00), por lo que las muestras que inducen respuestas por encima de este umbral se consideran positivas (los SI límite > 1,90 también están resaltados). El extenso desarrollo de ensayos y estudios previos han demostrado que este es el umbral mínimo de señal a ruido que permite la máxima sensibilidad sin detectar grandes números de respuestas falsas positivas u omitir eventos inmunogénicos sutiles. Para ambos conjuntos de datos de proliferación (n=3) y ELISpot de IL-2 (n=6), las respuestas positivas se definen por umbrales estadísticos y empíricos de la siguiente manera: (1) Significancia (p<0,05) de la respuesta al comparar cpm o spw de los pocillos de ensayo frente a pocillos control de medio usando el ensayo de la t de Student de dos muestras no emparejadas; (2) Índice de estimulación mayor de o igual a 2 (SI>2,00), donde SI = media de los pocillos de ensayo (cpm o spw) / línea de base (cpm o spw). Los datos presentados de esta manera se indican como SI>2,00, p <0,05. Además, la variación intraensayo se evalúa calculando el coeficiente de varianza y la desviación estándar (SD) de los datos brutos de los cultivos replicados.
Ejemplo 7: ingeniería molecular y expresión de VB6-845 desinmunizado (clon Algo)
Diseño experimental
Ingeniería de variantes de VB6-845
Los fragmentos 845 Vh y Vl mutados se generaron mediante el método de PCR de Empalme por Extensión de Solapamiento, SOE-PCR. Cada fragmento Vh y Vl se clonó en el vector pCR 2.1 y se transformó en células de E. coli 10F para la secuenciación. El plásmido pCR 2.1 que contenía el inserto correcto se digirió con un conjunto identificado de enzimas de restricción, específicas bien para Vh o Vl.
El fragmento Vh se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y SacII y se ligó con el fragmento Sac II-CH-VL-CL-de-Boug-XhoI en el vector pING3302, digerido previamente con EcoRI y Xhol. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron con la reacción de ligación y se creció una colonia transformada para la expresión a pequeña escala.
El fragmento Vl, digerido con las enzimas de restricción SalI y BsmI, se ligó con el plásmido VB6-845 pSP73, digerido previamente con las mismas enzimas de restricción. La reacción de ligación se transformó en células de E. coli 10F y, después de la selección con ampicilina, el plásmido VB6-845/pSV73 se extrajo de una colonia cultivada durante la noche. El inserto VB6-845 se obtuvo con la combinación de enzimas de restricción ScaI, EcoRI y XhoI y se ligó en el vector pING3302, digerido previamente con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron entonces con la reacción de ligación VB6-845/3302 y se creció una colonia transformada para la expresión a pequeña escala.
Para combinar las cadenas mutadas, los fragmentos Vh y Vl se digirieron con EcoRI - SacII y SacII - XhoI, respectivamente, y se ligaron en presencia del plásmido pING3302, digerido previamente con EcoRI y XhoI. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron con la reacción de ligación VB6-845 Vh+Vl/3302 y se creció una colonia transformada para la expresión a pequeña escala.
Ingeniería de VB5-845 Algo
El VB5-845-Algo Fab está representado por un dominio de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23; y un dominio de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24. El VB5-845-Algo fue preparado por ingeniería usando el sitio de restricción único BssSI presente en la cadena Cl kappa. El fragmento 845 EcoRI-Vh-Ch-Vl-Cl-BssSI se ligó con el fragmento BssSI-Cl kappa-XhoI en el plásmido pING3302, digerido previamente con EcoRI y XhoI. Las células de E. coli 10F químicamente competentes se transformaron con la reacción de ligación para la secuenciación y la expresión a pequeña escala.
Expresión a pequeña escala
Las células 10F transformadas que contenían bien el plásmido VB6-845-Algo/3302 o el plásmido VB5-845-Algo/3302 se inocularon en 5 mL de 2-YT que contenía 25 pg/mL de tetraciclina y se incubaron a 37 °C con agitación constante a 225 rpm. Después de 16 horas de incubación, se inocularon 300 pL de cultivo de siembra de toda la noche en 30 mL de Tb (1% de inóculo), y se incubó a 37 °C con agitación constante a 225 rpm hasta que se alcanzó una DO600 de 2,0. El cultivo se indujo con 150 pL de L-Arabinosa (0,1% final), y se incubó a 25 °C con agitación constante a 225 rpm. A las 16 horas después de la inducción, se recogió el sobrenadante del cultivo para su análisis mediante transferencia Western, ELISA y citometría de flujo.
Análisis por transferencia Western
El nivel de expresión de VB6-845 y VB5-845-Algo se estimó mediante análisis por transferencia Western. Brevemente, se cargaron 16 pL de sobrenadante de cultivo inducido y 4 pL de tampón de muestra LDS en un gel NuPAGE Bis-Tris al 10%. El gel se transfirió entonces a una membrana de nitrocelulosa a 40 V durante 1 hora. Después de bloquear y lavar la membrana, se detectó la proteína VB6/VB5-845-Algo usando un anticuerpo anti-kappa-peroxidasa de rábano (1/1.000) durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se reveló usando DAB, y el nivel de expresión del VB6/VB5-845-Algo se comparó con los tipos salvajes (WT) VB6/VB5-845, respectivamente. La especificidad de las bandas detectadas se confirmó usando sobrenadante de E. coli no inducido.
Cuantificación por ELISA
Se usó un ELISA para cuantificar la proteína VB6-845 presente en los sobrenadantes de cultivo inducidos. Brevemente, una placa Immunolon1B se recubrió con 10 pg/ml de anti-bouganina de conejo y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de lavar y bloquear la placa, los sobrenadantes VB6-845, diluidos 1/320, 1/640 y 1/1.280, así como una curva estándar preparada a partir del anticuerpo VB6-845 purificado (25 ng/mL-0,195 ng/mL), se añadieron a la placa y se incubaron durante 2 horas a 22 °C. La proteína VB6-845 unida se detectó usando un anticuerpo antikappa-peroxidasa de rábano (1/1.000) durante 1 hora a 22 °C. La placa se reveló usando TMB. Los sobrenadantes de cultivos inducidos por VB6-845-WT y el plásmido pING3302 se usaron como un control positivo y negativo, respectivamente.
Reactividad de unión medida por citometría de flujo
Sobrenadantes de cultivos inducidos por VB6-845: la reactividad de las construcciones VB6-845 se evaluó mediante citometría de flujo usando carcinoma de células escamosas humanas positivas para EpCAM CAL 27. Usando la cuantificación por ELISA, los volúmenes del sobrenadante inducido por VB6-845 se ajustaron a la concentración más baja y se incubaron con 0,2 x 106 células tumorales durante 2 horas en hielo. Después de lavar con PBS-FBS al 5%, se añadió un anticuerpo de conejo anti-bouganina (1/100) a las células y se incubó durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron con PBS-FBS al 5%, y se añadió un anticuerpo anti-conejo de cabra acoplado a FITC (1/100) durante 30 minutos en hielo para detectar la proteína VB6 unida a las células. Los sobrenadantes de cultivo inducidos por VB6-845-WT y el plásmido pING3302 se usaron como un control positivo y negativo, respectivamente.
VB5-845 purificado: la reactividad de unión de las variantes de VB5-845 purificadas a la línea celular tumoral CAL 27 se midió por citometría de flujo. Las variantes de VB5-845 purificadas se incubaron a 1 pg/mL con 0,3 x 106 células tumorales durante 2 horas en hielo. Después de lavar con PBS-FBS al 5%, se añadió un anticuerpo biotinilado de cabra anti-IgG humana (H&L) (1/200) a las células y se incubó durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron con PBS-FBS al 5% y se añadió estreptavidina-cychrome durante 30 minutos en hielo para detectar la proteína VB5 unida a las células. Se usó VB5-845-WT como un control positivo.
VB6-845 purificado: la reactividad de unión del VB6-845-Algo purificado a 100 ng/mL se midió como se ha descrito anteriormente. La citotoxicidad se midió con un ensayo MTS usando líneas celulares positivas y negativas para EpCAM. Se usó VB6-845-WT como un control positivo.
Afinidad de unión
Se usó citometría de flujo para medir la afinidad de unión del VB5-845-Algo. Brevemente, VB5-845-Algo se incubó a concentraciones que variaban de 3,2 ng/mL a 1.000 ng/mL con 0,2 x 106 células CAL 27 en hielo durante 2 horas. Después de lavar con PBS-FBS al 5%, se añadió un anticuerpo biotinilado de cabra anti-IgG humana (1/200) y se incubó durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron con PBS-FBS al 5% y se añadió estreptavidina-cychrome (1/120) durante 30 minutos en hielo para detectar VB5-845-Algo unido a las células. Los valores y el análisis gráfico se generaron usando Sigma Plot (Jandel Scientific, San Rafael, CA). La inversa de la fluorescencia mediana determinada se representó como una función de la inversa de la concentración de anticuerpo para determinar Kd por el método de Lineweaver-Burk. Se generó una gráfica y la Kd se calculó a partir de la pendiente de la curva. La constante de disociación, valor Kd, se determinó mediante la siguiente ecuación: 1/F= 1/Fmáx (Kd /Fmáx) (1/Fab), donde F = fluorescencia mediana de fondo restada y Fmáx se calculó a partir de la gráfica.
Ensayo de competición con VB6-845 o VB5-845-WT
La capacidad del VB5-845-Algo para competir con VB6-845 por la unión a las células tumorales CAL 27 se determinó por citometría de flujo. VB5-845-Algo y VB6-845 se incubaron conjuntamente en 150 L con 0,3 x 106 células tumorales durante 2 horas en hielo. La concentración de VB6-845 se mantuvo constante a 1 pg/mL mientras que la concentración de VB5-845-Algo se incrementó de 17,8 pg/mL a 71 pg/mL. Las células se lavaron con PBS-FBS al 5%, y se añadió un anticuerpo de conejo anti-bouganina (1/100) a las células y se incubó durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS-FBS al 5%, se añadió un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado a FITC (1/100) durante 30 minutos en hielo para detectar la proteína VB6 unida a las células. Se usó VB4-845 como un control positivo para competir con VB6-845 por la unión a la línea celular tumoral CAL 27.
Estabilidad en suero
La estabilidad en suero de las variantes VB5-845 y VB6-845 se determinó mediante análisis por transferencia Western. Brevemente, se añadieron variantes a una concentración de 80 pg/mL en 500 pL de suero humano y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 24 horas. A las 0 horas, 3 horas, 6 horas y 24 horas, las muestras se agitaron con vórtex y se extrajo una parte alícuota de 45 pL y se almacenó a -20 °C en presencia de 15 pL de LDS. La transferencia Western se realizó como anteriormente, cargando 200 ng/pocillo de variante. Las proteínas VB5-845 o VB6-845 se detectaron usando un anticuerpo anti-4D5 de conejo (1/1.000) durante 45 minutos a temperatura ambiente, seguido de un anticuerpo anti-conejo-peroxidasa de rábano (1/2.000) durante 45 minutos a temperatura ambiente. La membrana se reveló con DAB. Se usaron VB5-845 o VB6-845 purificados como controles positivos.
Termoestabilidad
Se usó citometría de flujo para determinar la termoestabilidad de las variantes VB5-845 y VB6-845. Las variantes VB5-845 y VB6-845 se añadieron a una concentración de 80 pg/mL en PBS y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 24 horas. A las 0 horas, 3 horas, 6 horas y 24 horas, se extrajo una parte alícuota de 25 pL y se almacenó a -20 °C para su análisis por citometría de flujo. Para el ensayo, las muestras de las variantes VB5-845 y VB6-845 se diluyeron a 1 pg/mL y 100ng/mL, respectivamente en 150 pL de PBS-FBS al 5% y se incubaron con 0,3 x 106 células durante 2 horas en hielo. Después de lavar con PBS-FBS al 5%, se añadió un anticuerpo biotinilado de cabra anti-IgG humana (H L) (1/200) y se incubó durante 1 hora en hielo. Después del lavado, se añadió estreptavidina fluorocromo PE-Cy5 (1/120) para detectar la unión a la superficie celular de VB5-845. Los VB5-845-WT y VB6-845-WT purificados se usaron como un control positivo.
Proliferación de células T de VB5-845-Algo
La capacidad de VB5-845-Algo y VB5-845 para inducir la proliferación de células T se midió mediante la selección de subpoblaciones CD3+CD4+ por citometría de flujo. La proliferación con o sin las proteínas Fab se analizó mediante la intensidad de fluorescencia de EdU-A488, un marcador de incorporación de ADN. Los datos se expresaron como índices de estimulación (valores SI) que corresponden a la proporción del número de linfocitos T CD3+CD4+ activados en los pocillos tratados con Fab frente a los no tratados.
Resultados
El análisis Epibase® identificó los epítopos de células T potenciales presentes en las cadenas pesadas y ligeras. Los cambios propuestos son aminoácidos que corresponden a las secuencias de la línea germinal y se clasificaron como "mutaciones seguras o de riesgo". Porque, de acuerdo con el número de cambios, no era factible evaluar el efecto de una única mutación puntual sobre la expresión y la actividad biológica. Por lo tanto, las mutaciones seguras se agruparon y se introdujeron con dos rondas consecutivas de SOE-PCR. Sin embargo, debido a la incertidumbre para las posiciones Vh38 y Vl50, se crearon cadenas que contenían bien residuos mutados o de tipo salvaje. Una vez que se verificaron las secuencias, las cadenas mutadas se clonaron en la unidad dicistrónica VB6-845 y se expresaron en presencia de su respectivo equivalente de tipo salvaje. Si el nivel de expresión y la actividad biológica eran comparables a WT, entonces las cadenas pesadas y ligeras mutadas se combinaron y ensayaron. Para las "mutaciones de riesgo", Vh53, Vh93 y Vh98 se evaluaron en primer lugar como una única mutación puntual. Si se determina adecuado, se incorporaron entonces dentro de la construcción final Vh.
Ingeniería molecular de la primera generación de VB6-845
1) Ingeniería y ensayo de la primera versión de VB6-845 de las "mutaciones seguras":
VH-algo: se requirieron dos rondas sucesivas de SOE-PCR para introducir todas las mutaciones. Como se ve en la Tabla 3, el clon Vn-Ir contenía el FR1 y parte de las mutaciones FR3. El molde Vn-Ir se empleó entonces en la siguiente reacción de SOE-PCR para crear VH-IIr que contiene todas las mutaciones y en el caso de VH-IIr-K38, la posición 38 no cambió. La reacción de secuenciación realizada en la reacción final de SOE-PCR también reveló que uno de los clones secuenciados, llamado IIr-CDR1, contiene todos los aminoácidos mutados, excepto la región CDR1 y FR2. El nivel de expresión de las cadenas pesadas mutadas en presencia de la cadena ligera Wt fue similar al WT. Además, la actividad biológica, medida por citometría de flujo, no se modificó en comparación con WT. Es destacable que la fluorescencia mediana más alta obtenida con algunas de las variantes podría ser el resultado de la subestimación de la concentración obtenida por ELISA.
Tabla 3: mutaciones de VH-al o actividad bioló ica
Figure imgf000027_0001
Los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos mutados. La fluorescencia mediana reportada, MF, es un promedio de dos experimentos independientes y se expresa como % de WT. Número según la nomenclatura de Kabat. VL-Algo: las cadenas ligeras que contienen las mutaciones CDR1/A50-CDR2/FR4 o CDR1/Q50-CDR2/FR4 se introdujeron mediante la primera reacción de SOE-PCR. En contraste con la estrategia de Vh, se preparó por ingeniería una construcción que contenía solo las mutaciones FR2 y se ensayó por separado. La actividad biológica del clon Ir-A50 disminuyó significativamente, lo que demuestra que la mutación A50 era perjudicial para la unión de VB6-845 a EpCAM. Como consecuencia, las mutaciones de FR2 solo se añadieron a la cadena ligera Ir-Q50. Cuando se ensayó, el nivel de expresión y actividad biológica de IIr-Q50 fue un 70 y 44% más bajo que el de WT, respectivamente. Es destacable que el nivel de expresión y la actividad biológica se restauraron solo parcialmente invirtiendo la posición 41 al aminoácido WT.
Tabla 4: mutaciones de VL-al o actividad bioló ica
Figure imgf000027_0002
Los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos mutados. La fluorescencia mediana reportada, MF, es un promedio de dos experimentos independientes y se expresa como % de WT. Numerados según la nomenclatura de Kabat.
VH-VL-algo: En base a los resultados descritos anteriormente, se seleccionaron VH-IIr y VL-Ir-Q50, se combinaron y se expresaron como una proteína de fusión recombinante VB6-845. Como se ve en la Tabla 5, más del 66% de la actividad biológica se perdió, lo que sugiere que algunas mutaciones han afectado la interfaz Vh-Vl.. Para determinar el área problemática, Vn-Ir y VH-IIr-CDR1 también se prepararon por ingeniería en presencia de VL-Ir-Q50 y se ensayaron. La actividad biológica de VB6-845-(VH-IIr-CDR1/VL-Ir-Q50) se restauró parcialmente, lo que sugiere que las mutaciones dentro de las regiones CDR1 pueden haber alterado en parte la interfaz VH-VL.
-
Figure imgf000027_0003
La fluorescencia mediana reportada, MF, es un promedio de dos experimentos independientes y se expresa como % de WT.
2) Ingeniería y ensayo de las "mutaciones de riesgo" de VB6-845
Las construcciones VB6-845 que contienen una única mutación puntual "de riesgo" fueron preparadas por ingeniería por SOE-PCR y se ensayaron. Como se ve en la Tabla 6, solo la posición K98Q no afectó la actividad biológica.
h " "
Figure imgf000028_0003
La fluorescencia mediana reportada, MF, es un promedio de dos experimentos independientes y se expresa como % de WT. Numerados según la nomenclatura de Kabat.
3) Ingeniería y ensayo de la segunda versión de VB6-845
Sobre la base de los resultados descritos anteriormente, se realizaron algunos ajustes. Para el dominio Vh, la posición 35 se invirtió a WT. Para el dominio Vl, la dificultad de mutar el FR2 y la posición 50 condujo a un conjunto diferente de mutaciones para las regiones FR2 y CDR2.
VH-algo, segunda versión: la posición 35 se invirtió en un residuo de asparagina usando el inserto IIr como un molde en la reacción de SOE-PCR. Como se esperaba, no se observaron diferencias en el nivel de expresión o la actividad biológica cuando se preparó por ingeniería con la cadena ligera de tipo salvaje (Tabla 7). De manera similar, la adición de la mutación CDR3, Q98 al IIr-N35 no alteró la expresión o la actividad biológica.
-
Figure imgf000028_0001
Los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos mutados. La fluorescencia mediana reportada, MF, es un promedio de dos experimentos independientes y se expresa como % de WT. Numerados según la nomenclatura de Kabat.
VL-algo, segunda versión: ambas cadenas ligeras que contienen bien las mutaciones FR2 (H39-S42) o CDR2 (E51-H53-Q55) mostraron una unión disminuida cuando se ensayaron como una molécula VB6-845. Este efecto se amplificó aún más cuando se combinó con las mutaciones CDR1 y FR4 como una construcción Vl final (IIr/FR2/CDR2). Es destacable que también es posible que las mutaciones de la cadena ligera solo sean funcionales en presencia de la Vh mutada. Sin embargo, como contingencia, también se preparó por ingeniería una cadena ligera (IIr-KSHI) que contenía solo unas pocas mutaciones que tendrán el mayor impacto en la depleción de los epítopos de células T y se encontró que la actividad biológica era similar a VB6-845 WT.
T l : n v r i n Vl l m i n ivi i l i
Figure imgf000028_0002
Los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos mutados. La fluorescencia mediana reportada, MF, es un promedio de dos experimentos independientes y se expresa como % de WT. Numerados según la nomenclatura de Kabat.
VH-VL-algo, segunda versión: La cadena Vh final, IIr-N35-Q98 se combinó con VL-Ir-CDR2, VL-IIr-FR2-CDR2 y VL-IIrKSHI. Como se ve en la tabla 7, solo la construcción VB6-845 que contenía el combinado VH-Nr-N35-Q98 y VL-IIr-KSHI tuvo un nivel de expresión y actividad biológica similares al WT y se conoce como VB6-845-Algo. Las otras combinaciones rinden una pérdida significativa de expresión y unión a EpCAM.
T l : n l n v r i n V -V Al
Figure imgf000029_0001
La mediana de fluorescencia reportada, MF, es un promedio de dos experimentos independientes y se expresa como % de WT. Numerados según la nomenclatura de Kabat.
Actividad biológica de VB5-845-Algo
Para evitar la interferencia de deBouganina con el ensayo de proliferación de células T, se creó, expresó y purificó la versión Fab VB5-845 de VB6-845-Algo. La proteína Fab VB5-845-Algo purificada se sometió a varios ensayos biológicos y los datos se compararon con VB5-845-WT.
Ensayo de competición
Para asegurar que no se alteraba la especificidad, se ensayó la capacidad de VB5-845-Algo para competir con la unión de VB6-845 a las células CAL-27 positivas para EpCAM. Como se muestra en la FIG. 13, VB5-845-Algo (círculo abierto) compitió con la unión VB6-845. Se usaron VB4-845 y VB5-845-WT como controles positivos.
Estabilidad en suero humano
Para demostrar que las mutaciones no creaban sitios proteolíticos, se incubaron VB5-845-Algo y VB5-845-WT en suero humano a 37 °C hasta un máximo de 24 horas. La estabilidad de las proteínas VB5 se evaluó mediante análisis por transferencia Western. Como se muestra en la FIG. 14, el análisis no reveló cambios en la intensidad, lo que sugiere que ambas proteínas VB5-845 permanecieron intactas en el suero humano.
Termoestabilidad
Para asegurar que las mutaciones no afectaban la termoestabilidad de la interfaz Vh-Vl, se evaluó la actividad biológica de VB5-845-Algo mediante citometría de flujo después de incubar a 37 °C en 1xPBS durante 0, 3, 6 y 24 horas. Los datos se expresan como el porcentaje de la fluorescencia mediana obtenida a las 0 horas (FIG. 15). VB5-845-Algo mostró un ligero aumento sobre el control de 0 horas, lo que sugiere que el resto Fab es térmicamente estable.
Afinidad de unión
La afinidad de unión se midió por citometría de flujo usando células tumorales CAL-27. Usando una curva de titulación, se determinó la Kd como se describe en los diseños experimentales (Tabla 10).
Tabla 10
Figure imgf000029_0002
Actividad biológica de VB6-845-Algo
Para evaluar la actividad biológica, VB6-845-Algo (que contiene deBouganina) se purificó y se ensayó mediante citometría de flujo y ensayo MTS usando las líneas celulares positivas para EpCAM CAL-27, h T-29, MCF-7 y OVCAR-3. También se incluyeron las líneas celulares negativas para EpCAM A-375 y COLO-320 para asegurar que no se alteraba la especificidad de VB6-845-Algo. Como se muestra en la Tabla 11, la unión de VB6-845-Algo a las líneas celulares positivas para EpCAM fue un 53% a 32% menor que la de VB6-845-WT (usado como un control positivo). Como consecuencia, VB6-845-Algo fue de 7 a 9 veces menos potente en comparación con WT. Como era de esperar, no se midieron ni unión ni CI50 con las líneas celulares negativas para EpCAM.
Tabla 11
Figure imgf000030_0001
Números representativos de dos experimentos independientes. Las veces de incremento (FI) es un promedio de dos mediciones independientes.
Inmunogenicidad
El perfil de inmunogenicidad del VB5-845-Algo se midió por la proliferación de células T CD3+CD4+ y se comparó con VB5-845-WT. Como se esperaba, 12 de los 53 donantes respondieron a VB5-845-WT, lo que representa casi el 23% (FIG. 16). En contraste, solo 2 donantes dieron una respuesta al VB5-845-Algo (casi el 4%), lo que demuestra que las mutaciones introducidas han reducido significativamente el potencial inmunogénico del resto Fab.
Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 (VH-CH o DI VH-CH desinmunizado)
EV QLVE S GGGLV QPGGSLRL S C AAS GYTFT AY GMNWVRQ AP GKGLEWMG WINTYTGESTYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFAI KGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSC SEQ ID NO : 2 (Vl-Cl o DI Vl-Cl desinmunizado) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI Y QMSNL AS GVP S RF S S S GS GTDFTLTIS S LQPEDF ATYY C AQNLEIPRTF GTGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO: 3 (toxina ETA 252-608) EGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAAR LSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQG TGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGG DVSFSTRGTQNWTERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRAR SQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPG FYRTGLTLAAPEAAGEVERL1GHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERT
VVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPP
SEQ ID NO: 4 (proteína bouganina modificada) YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDIT TTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTN RVTLTFDGS Y QKL VNAAKADRKALELGVNKLEF SIEAIHGKTIN GQE AAKFFL IVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSP QCTTINP ALQLISP SNDP WVVNKVS QISPDMGILKFKS SK SEQ ID NO: 5 (VH-CH o WT VH-CH de tipo salvaje)
EV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTNY GMNWVKQAPGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKG DYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKKVEPKSC SEQ ID NO: 6 (VL-CL o WT VL-CL de tipo salvaje) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI Y QMSNL AS GVP S RF S S S GS GTDFTLTIS S LQPEDF ATYY C AQNLEIPRTF GQGT KVELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO: 7 (secuencia de ADN de VB5-845 desinmunizado)
C T GC AGGT CT AT GGA AC GAT A A AT GC C C AT GA A AATT CT ATTT C A AGGAG ACAGTCATAatgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgctgcccaaccagcgatggcgG AAGTACAGCTGGTCgaaTCCGGTggtGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTAGCctgC GTctgAGCTGCGCGGCGAGCGGTTACACCTTCACCgcgTACGGTATGAACTG GGTTcgtCAGGCTCCGGGTAAAGGTTTGGAATGGATGGGTTGGATCAACAC CTATACCGGTGAGTCTACCTACGCTGATAGCgttAAAGGCCGTTTCACCatcA GCgctGACACTAGCaaaaacaccGCGTACCTGCAGatgAACTCTCTGCGTGCTGAG GACACTGCGGTTTACTACTGCGCTCGTTTCGCGATCAAAGGTGACTATTGG GGTCAGGGTACTCTGgttACCGTTAGCAGCGCTAGCACTAAgGGcCCGTCCG TTTTCCCACTGGCTCCGTCTTCTAAAAGCACTTCTGGTGGTACCGCGGCTC TGGGTTGCCTTGTTAAAGACTACTTCCCTGAACCGGTCACCGTTAGCTGGA ACTCCGGTGCGTTGACCTCTGGTGTTCACACCTTCCCAGCGGTTCTGCAGT CTAGCGGTCTGTATAGCCTGAGCTCTGTAGTTACCGTTCCGTCTTCTAGCC TGGGTACGCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAACCGAGCAACACT A A AGT GGAT A A A A A AGTT GA AC C GA AGT C TT GCT AGT A AT CT AGAGT C GA CCTGCAGGTCTATGGAACGATAAATGCCCATGAAAATTCTATTTCAAGGA GACAGTCATAATGAAATACCTTCTGCCGACCGCTGCCGCTGGTCTGCTGCT GTTGGCTGCTCAACCGGCTATGGCAGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGT CTAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGACCGTGTGACCATCACCTGCCGTAGC ACTAAATCCCTGCTGCACTCTAACGGCATCACCTACCTGTATTGGTACCAA CAGAAACCGGGTAAAGCTCCGAAACTGCTGATCTACCAGATGTCTAACCT GGCTAGCGGCGTTCCTTCTCGTTTTTCTTCTAGCGGTAGCGGTACTGACTT CACCCTGACCATTAGCTCTCTGCAGCCTGAAGACTTTGCGACCTACTATTG CGCTCAGAACCTTGAAATCCCGCGTACCTTCGGCaccGGTACCAAAGTTGA AatcAAGCGTACCGTTGCGGCTCCGTCTGTTTTCATCTTCCCACCTAGCGAT
GAAC AGCTT AAAT CT GGT ACT GCT AGCGT AGTTT GC CT GCTT AAC AACTTC TACCCTCGTGAAGCTAAAGTTCAGTGGAAAGTTGACAACGCTCTGCAGTC T GGT AACT CT C AGGAAT CTGT GACC GAAC AGGAT AGC AAAGAT AGC AC CT ATAGCCTGTCTAGCACCCTGACCCTTAGCAAGGCGGACTATGAAAAACAC AAAGTTTACGCTTGCGAGGTGACCCACCAAGGTCTGTCTTCTCCGGTGACT AAAT C CTTT AAC C GT GGC GA AT GCT AGT GA SEQ ID NO: 8 (4D5MOC-B)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPK LLIY QMSNL AS GVP S RF S S S GS GTDFTLTIS S LQPEDF ATYY C AQNLEIP RTFGQGTKVELKRTPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGSEVQLVQSGPGLVQ PGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSF KGRFTF S LDTS AS AAYLQIN S LR AEDT AV YY C ARF AIKGDYW GQGTLLTV S S SEQ ID NO: 9 (proteína bouganina modificada)
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDIT TTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTN RVTLTFDGSYQKLVNAAKX1DRKX2LX3LGVX4KLEFSIEA1HGKTINGQEX5AK
FFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNFKVLNLENNW GDISD AIHK SSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK
en donde X1 en la posición 123 es Thr o Ala o Gln; X2 en la posición 127 es Gly o Ala; X3 en la posición 129 es Gln o Gly o Glu; X4 en la posición 133 es Asn o Asp o Thr o Ala o Arg o Gln o Glu o Gly o His o Lys o Ser; y X5 en la posición 152 es Gln o Ala.
SEQ ID NO: 10(VB6-845)
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFT NYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAY LQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVP S S SLGT QTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKS CTRHRQPRGWEQLYNT V SF NLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKT VKV AIDVTDVYVV GY QDKWDGKDRAVFLDKVPTV ATSKLFPGVTNRVTLTF DGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINP ALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSKMKYLLPTAAAGLLLLAAQPA MAHHHHHHDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQK PGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLE IPRTF GQGTKVELKRTY AAP SVFIFPPSDEQLKS GT AS V V CLLNNFYPRE AKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLS SPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 11 (Algo VH-CH)
EVQLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFT AY GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFEFSLDTHNSSAYLQIQSLREEDTAVYYCARFAIQG DYW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT A ALGOL VKDYFPEP VTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC SEQ ID NO: 12 (Algo VL-CL) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGSAPKLLIY QMSHLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC SEQ ID NO: 13 (DI VH-CH-deBougan¡na)
EV QLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYTFTAY GMNWVRQ APGKGLEWMG WINTYTGESTYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFAI
KGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAK GTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVV GY QDKWD GKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALEL GVNKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGS FKPNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQIS PDMGILKFKSSK
SEQ ID NO: 14 (Algo VH-CH-deBouganina)
EVQLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFT AY GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYT GES TY AD SFKGRFEF S LDTHN S S AYLQIQ S LREEDT AVYY C ARF AIQG DYW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT AALGCL VKDYFPEP VTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGV NKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLY GSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 15 (WT VH-CH-deBouganina)
EV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTNY GMNWVKQ APGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKG DYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGV NKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLY GSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 16 (DI VL-Ci_-deBougan¡na) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI Y QMSNL AS GVP S RF S S S GS GTDFTLTIS S LQPEDF ATYY C AQNLEIPRTF GT GT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGECTRHRQPRGWEQKYNTV SFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPV C QLPVTLQTIADDKRF VLVDITTTSKKTVKV AIDVTD VYVV GY QDKWDGKDR AVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNK LEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNF KVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGI LKFKSSK
SEQ ID NO: 17 (Algo VL-CL-deBougan¡na) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGSAPKLLIY QMSHLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGECTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLP VTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVV GY QDKWDGKDRAVF LDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFS IEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNFKVL NLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKF KSSK SEQ ID NO: 18 (WT VL-CL-deBougan¡na) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI Y QMSNL AS GVP S RF S S S GS GTDFTLTIS S LQPEDF ATYY C AQNLEIPRTF GQGT KVELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGECTRHRQPRGWEQKYNTV SFNLGEAYEYPTFIQDLRNEL AKGTPV C QLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDR AVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNK LEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNF
KVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGI LKFKSSK SEQ ID NO: 19 (Secuencia nucleótida de DI Vl-Cl)
CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA CAG TCA TA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG GAA GTA CAG CTG GTC gaa TCC GGT ggt GGT CTG GTT CAG CCG GGT GGT AGC ctg CGT ctg AGC TGC GCG GCG AGC GGT TAC ACC TTC ACC gcg TAC GGT ATG AAC TGG GTT cgt CAG GCT CCG GGT AAA GGT TTG GAA TGG ATG GGT TGG ATC AAC ACC TAT ACC GGT GAG TCT ACC TAC GCT GAT AGC gtt AAA GGC CGT TTC ACC ate AGC gct GAC ACT TCT aaa aac acc GCG TAC CTG CAG atg AAC TCT CTG CGT GCT GAG GAC ACT GCG GTT TAC TAC TGC GCT CGT TTC GCG ATC AAA GGT GAC TAT TGG GGT CAG GGT ACT CTG gtt ACC GTT AGC AGC GCT AGC ACT AAG GGC CCG TCC GTT TTC CCA CTG GCT CCG TCT TCT AAA AGC ACT TCT GGT GGT ACC GCG GCT CTG GGT TGC CTT GTT AAA GAC TAC TTC CCT GAA CCG GTC ACC GTT AGC TGG AAC TCC GGT GCG TTG ACC TCT GGT GTT CAC ACC TTC CCA GCG GTT CTG CAG TCT AGC GGT CTG TAT AGC CTG AGC TCT GTA GTT ACC GTT CCG TCT TCT AGC CTG GGT ACG CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAC CAC AAA CCG AGC AAC ACT AAA GTG GAT AAA AAA GTT GAA CCG AAG TCT TGC TAG TAA
SEQ ID NO: 20 (Secuencia nucleótida de DI VL-CL)
CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA CAG TCA TA ATG AAA TAC CTT CTG CCG ACC GCT GCC GCT GGT CTG CTG CTG TTG GCT GCT CAA CCG GCT ATG GCA GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCG TCT AGC CTG AGC GCA AGC GTT GGT GAC CGT GTG ACC ATC ACC TGC CGT AGC ACT AAA TCC CTG CTG CAC TCT AAC GGC ATC ACC TAC CTG TAT TGG TAC CAA CAG AAA CCG GGT AAA GCT CCG AAA CTG CTG ATC TAC CAG ATG TCT AAC CTG GCT AGC GGC GTT CCT TCT CGT TTT TCT TCT AGC GGT AGC GGT ACT GAC TTC ACC CTG ACC ATT AGC TCT CTG CAG CCT GAA GAC TTT GCG ACC TAC TAT TGC GCT CAG AAC CTT GAA ATC CCG CGT ACC TTC GGC acc GGT ACC AAA GTT GAA ate AAG CGT ACC GTT GCG GCT CCG TCT GTT TTC ATC TTC CCA CCT AGC GAT GAA CAG CTT AAA TCT GGT ACT GCT AGC GTA GTT TGC CTG CTT AAC AAC TTC TAC CCT CGT GAA GCT AAA GTT CAG TGG AAA GTT GAC AAC GCT CTG CAG TCT GGT AAC TCT CAG GAA TCT GTG ACC GAA CAG GAT AGC AAA GAT AGC ACC TAT AGC CTG TCT AGC ACC CTG ACC CTT AGC AAG GCG GAC TAT GAA AAA CAC AAA GTT TAC GCT TGC GAG GTG ACC CAC CAA GGT CTG TCT TCT CCG GTG ACT AAA TCC TTT AAC CGT GGC GAA TGC TAG TGA SEQ ID NO: 21 (Secuencia nucleótida de WT VH-CH)
CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA CAG TCA TA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG GAA GTA CAG CTG GTT CAG TCC GGC CCG GGT CTT GTT CAA CCG GGT GGT TCC GTT CGT ATC TCT TGC GCT GCT TCT GGT TAC ACG TTC ACC AAC TAC GGC ATG AAC TGG GTC AAA CAG GCT CCG GGT AAA GGC CTG GAA TGG ATG GGC TGG ATC AAC ACC TAC ACC GGT GAA TCC ACC TAC GCT GAC TCC TTC AAA GGT CGC TTC ACT TTC TCC CTC GAC ACA AGT GCT AGT GCT GCA TAC CTC CAA ATC AAC TCG CTG CGT GCA GAG GAT ACA GCA GTC TAT TAC TGC GCC CGT TTC GCT ATC AAA GGT GAC TAC TGG GGT CAA GGC ACG CTG CTG ACC GTT TCC TCG GCT AGC ACC AAA GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT TAG TGA SEQ ID NO: 22 (Secuencia nucleótida de WT VL-CL)
CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA CAG TCA TA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG CAC CAT CAT CAC CAT CAC GAT ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCG TCC TCC CTG AGT GCT TCT GTT GGT GAC CGT GTT ACC ATC ACC TGC CGT TCC ACC AAA TCC CTC CTG CAC TCC AAC GGT ATC ACC TAC CTT TAT TGG TAT CAA CAG AAA CCG GGT AAA GCT CCG AAA CTT CTG ATC TAC CAG ATG TCC AAC CTG GCT TCC GGT GTT CCG TCT CGT TTC TCC AGT TCT GGT TCT GGT ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC TCT TCT CTG CAG CCG GAA GAC TTC GCT ACC TAC TAC TGC GCT CAG AAC CTG GAA ATC CCG CGT ACC TTC GGT CAG GGT ACC AAA GTT GAA CTT AAG CGC ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTGA SEQ ID NO: 23 (Secuencia nucleótida de Algo VH-CH) GAATTCCTGCAGGTCTATGGAACGATAAATGCCCATGAAAATTCTATTTCA AGGAGACAGTCATAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTG TTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCGGAAGTACAGCTGcagCAGTCC GGTCCGGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTAGCGTTCGTATTAGCTGCGCGGC GAGCGGTTACACCTTCACCgcgTACGGTATGAACTGGGTTcgtCAGGCTCCG GGTAAAGGTTTGGAATGGATGGGTTGGATCAACACCTATACCGGTGAGTC TACCTACGCTGATAGCTTCAAAGGCCGTTTCgaaTTTAGCCTTGACACTcacaa cAGCtctGCGTACCTGCAGATTcagTCTCTGCGTgaaGAGGACACTGCGGTTTA CTACTGCGCTCGTTTCGCGATCcagGGTGACTATTGGGGTCAGGGTACTCTG gttACCGTTAGCAGCGCTAGCACTAAgGGcCCGTCCGTTTTCCCACTGGCTCC GTCTTCTAAAAGCACTTCTGGTGGTACCGCGGCTCTGGGTTGCCTTGTTAA AGACTACTTCCCTGAACCGGTCACCGTTAGCTGGAACTCCGGTGCGTTGAC CTCTGGTGTTCACACCTTCCCAGCGGTTCTGCAGTCTAGCGGTCTGTATAG CCTGAGCTCTGTAGTTACCGTTCCGTCTTCTAGCCTGGGTACGCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAACCGAGCAACACTAAAGTGGATAAAAAA GTT GA AC C GA AGT CTT GCT AGT A A
SEQ ID NO: 24 (Secuencia nucleótida de Algo V L-C L)
T C T A G A G T C G A C C T G C A G G T C T A T G G A A C G A T A A A T G C C C A T G A A A A T T C T A T T T C A A G G A G A C A G T C A T A A T G A A A T A C C T T C T G C C G A C C G C T G C C G C T GGT CT GCT GCT GTT GGCT GCT C AACC GGC T AT GGC AGAC ATCC AGAT GAC CCAGTCCCCGTCTAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGACCGTGTGACCATCA CCTGCaaaAGCACTAAATCCCTGCTGCACTCTAACGGCATCACCTACCTGTA TTGGTACCAACAGAAACCGGGTtctGCTCCGAAACTGCTGATCTACCAGATG TCTcacCTGGCTAGCGGCGTTCCTTCTCGTTTTTCTTCTAGCGGTAGCGGTAC TGACTTCACCCTGACCATTAGCTCTCTGCAGCCTGAAGACTTTGCGACCTA CTATTGCGCTCAGAACCTTGAAATCCCGCGTACCTTCGGCCAGGGTACCA AAGTTGAAatcAAGCGTACCGTTGCGGCTCCGTCTGTTTTCATCTTCCCACC TAGCGATGAACAGCTTAAATCTGGTACTGCTAGCGTAGTTTGCCTGCTTAA CAACTTCTACCCTCGTGAAGCTAAAGTTCAGTGGAAAGTTGACAACGCTC TGCAGTCTGGTAACTCTCAGGAATCTGTGACCGAACAGGATAGCAAAGAT AGCACCTATAGCCTGTCTAGCACCCTGACCCTTAGCAAGGCGGACTATGA AAAACACAAAGTTTACGCTTGCGAGGTGACCCACCAAGGTCTGTCTTCTC CGGTGACTAAATCCTTTAACCGTGGCGAATGC SEQ ID NO: 25 (Secuencia nucleótida de DI VH-CH-deBouganina)
CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA CAG TCA TA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG GAA GTA CAG CTG GTC gaa TCC GGT ggt GGT CTG GTT CAG CCG GGT GGT AGC ctg CGT ctg AGC TGC GCG GCG AGC GGT TAC ACC TTC ACC gcg TAC GGT ATG AAC TGG GTT cgt CAG GCT CCG GGT AAA GGT TTG GAA TGG ATG GGT TGG ATC AAC ACC TAT ACC GGT GAG TCT ACC TAC GCT GAT AGC gtt AAA GGC CGT TTC ACC ate AGC gct GAC ACT TCT aaa aac acc GCG TAC CTG CAG atg AAC TCT CTG CGT GCT GAG GAC ACT GCG GTT TAC TAC TGC GCT CGT TTC GCG ATC AAA GGT GAC TAT TGG GGT CAG GGT ACT CTG gtt ACC GTT AGC AGC GCT AGC ACT AAG GGC CCG TCC GTT TTC CCA CTG GCT CCG TCT TCT AAA AGC ACT TCT GGT GGT ACC GCG GCT CTG GGT TGC CTT GTT AAA GAC TAC TTC CCT GAA CCG GTC ACC GTT AGC TGG AAC TCC GGT GCG TTG ACC TCT GGT GTT CAC ACC TTC CCA GCG GTT CTG CAG TCT AGC GGT CTG TAT AGC CTG AGC TCT GTA GTT ACC GTT CCG TCT TCT AGC CTG GGT ACG CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAC CAC AAA CCG AGC AAC ACT AAA GTG GAT AAA AAA GTT GAA CCG AAG TCT TGC ACC CGT CAC CGT CAG CCG CGT GGT TGG GAA CAG aaa TATAACACCGTATCTTTTAACCTGG GTG AGGCGTATGAATACCCGACCTTCATCCAGGACCTGCGTAATGAACTTG CTAAAGGTACCCCTGTTTGCCAGCTGCCTGTGACCCTGCAGACCATCGCTG ATGATAAACGTTTCGTTCTGGTTGACATTACCACCACCTCCAAAAAAACCG TTAAAGTCGCGATCGATGTGACCGACGTTTACGTGGTAGGTTACCAGGAT AAATGGGACGGTAAAGATCGTGCGGTTTTCCTGGACAAAGTTCCGACCGT AGCGACTTCTAAACTGTTCCCAGGTGTGACCAACCGTGTGACCCTGACCTT C GAC GGC AGC T AT CAGA A ACT GGTT AAC GC GGC C A A AGCT GAT C GT A AAG CTCTCGAACTGGGTGTTAACAAACTGGAGTTCAGCATTGAAGCTATCCAC GGTAAAACCATCAACGGTCAAGAAGCAGCTAAATTCTTCCTGATCGTGAT CCAGATGGTTAGCGAAGCAGCGCGTTTTAAATACATTGAAACCGAAGTAG TTGATCGTGGTCTGTATGGTAGCTTCAAACCGAACTTCAAAGTTCTTAACC TGGAGAACAACTGGGGTGACATTAGCGACGCGATCCATAAATCTTCCCCG CAATGCACCACCATTAACCCGGCTCTGCAGCTGATCTCTCCGTCTAACGAT CCGTGGGTAGTTAACAAAGTGTCTCAAATCAGCCCGGACATGGGTATCCT GAAATTTAAATCTAGCAAATAGTGACTCGAG SEQ ID NO: 26 (Secuencia nucleótida de Algo VH-CH-deBouganina) GAATTCCTGCAGGTCTATGGAACGATAAATGCCCATGAAAATTCTATTTCA AGGAGACAGTCATAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTG TTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCGGAAGTACAGCTGcagCAGTCC GGTCCGGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTAGCGTTCGTATTAGCTGCGCGGC GAGCGGTTACACCTTCACCgcgTACGGTATGAACTGGGTTcgtCAGGCTCCG GGTAAAGGTTTGGAATGGATGGGTTGGATCAACACCTATACCGGTGAGTC TACCTACGCTGATAGCTTCAAAGGCCGTTTCgaaTTTAGCCTTGACACTcacaa cAGCtctGCGTACCTGCAGATTcagTCTCTGCGTgaaGAGGACACTGCGGTTTA CTACTGCGCTCGTTTCGCGATCcagGGTGACTATTGGGGTCAGGGTACTCTG gttACCGTTAGCAGCGCTAGCACTAAgGGcCCGTCCGTTTTCCCACTGGCTCC GTCTTCTAAAAGCACTTCTGGTGGTACCGCGGCTCTGGGTTGCCTTGTTAA AGACTACTTCCCTGAACCGGTCACCGTTAGCTGGAACTCCGGTGCGTTGAC CTCTGGTGTTCACACCTTCCCAGCGGTTCTGCAGTCTAGCGGTCTGTATAG CCTGAGCTCTGTAGTTACCGTTCCGTCTTCTAGCCTGGGTACGCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAACCGAGCAACACTAAAGTGGATAAAAAA GTTGAACCGAAGTCTTGCACCCGTCACCGTCAGCCGCGTGGTTGGGAACA
GaaaTATAACACCGTATCTTTTAACCTGGGTGAGGCGTATGAATACCCGACC TTCATCCAGGACCTGCGTAATGAACTTGCTAAAGGTACCCCTGTTTGCCAG CTGCCTGTGACCCTGCAGACCATCGCTGATGATAAACGTTTCGTTCTGGTT GACATTACCACCACCTCCAAAAAAACCGTTAAAGTCGCGATCGATGTGAC CGACGTTTACGTGGTAGGTTACCAGGATAAATGGGACGGTAAAGATCGTG CGGTTTTCCTGGACAAAGTTCCGACCGTAGCGACTTCTAAACTGTTCCCAG GTGTGACCAACCGTGTGACCCTGACCTTCGACGGCAGCTATCAGAAACTG GTTAACGCGGCCAAAGCTGATCGTAAAGCTCTCGAACTGGGTGTTAACAA ACTGGAGTTCAGCATTGAAGCTATCCACGGTAAAACCATCAACGGTCAAG AAGC AGCT AAATT CTTC CT GATCGT GAT C C AGAT GGTT AGCGAAGC AGC G CGTTTTAAATACATTGAAACCGAAGTAGTTGATCGTGGTCTGTATGGTAGC TTCAAACCGAACTTCAAAGTTCTTAACCTGGAGAACAACTGGGGTGACAT TAGCGACGCGATCCATAAATCTTCCCCGCAATGCACCACCATTAACCCGG CTCTGCAGCTGATCTCTCCGTCTAACGATCCGTGGGTAGTTAACAAAGTGT CTC AAAT C AGC CCGGAC AT GGGT ATC CT GAAATTT AAAT CT AGC AAAT AG TGACTCGAG SEQ ID NO: 27 (Secuencia nucleótida de WT VH-CH-deBouganina)
CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA CAG TCA TA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG GAA GTA CAG CTG GTT CAG TCC GGC CCG GGT CTT GTT CAA CCG GGT GGT TCC GTT CGT ATC TCT TGC GCT GCT TCT GGT TAC ACG TTC ACC AAC TAC GGC ATG AAC TGG GTC AAA CAG GCT CCG GGT AAA GGC CTG GAA TGG ATG GGC TGG ATC AAC ACC TAC ACC GGT GAA TCC ACC TAC GCT GAC TCC TTC AAA GGT CGC TTC ACT TTC TCC CTC GAC ACA AGT GCT AGT GCT GCA TAC CTC CAA ATC AAC TCG CTG CGT GCA GAG GAT ACA GCA GTC TAT TAC TGC GCC CGT TTC GCT ATC AAA GGT GAC TAC TGG GGT CAA GGC ACG CTG CTG ACC GTT TCC TCG GCT AGC ACC AAA GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGTACCCGTCACCGTCAGCCGCGTGGTTGG GAA CAG CTC TATAACACCGTATCTTTTAACCTGGGTGAGGCGTATGA ATACCCG ACCTTCATCCAGGACCTGCGTAATGAACTTGCTAAAGGTACCCCTGTTTGC CAGCTGCCTGTGACCCTGCAGACCATCGCTGATGATAAACGTTTCGTTCTG GTTGACATTACCACCACCTCCAAAAAAACCGTTAAAGTCGCGATCGATGT GAC C GAC GTTT AC GT GGT AGGTT AC C AGGAT A AAT GGGAC GGT A A AGAT C GTGCGGTTTTCCTGGACAAAGTTCCGACCGTAGCGACTTCTAAACTGTTCC CAGGTGTGACCAACCGTGTGACCCTGACCTTCGACGGCAGCTATCAGAAA CTGGTTAACGCGGCCAAAGCTGATCGTAAAGCTCTCGAACTGGGTGTTAA CAAACTGGAGTTCAGCATTGAAGCTATCCACGGTAAAACCATCAACGGTC AAGAAGCAGCTAAATTCTTCCTGATCGTGATCCAGATGGTTAGCGAAGCA GCGCGTTTTAAATACATTGAAACCGAAGTAGTTGATCGTGGTCTGTATGGT AGCTTCAAACCGAACTTCAAAGTTCTTAACCTGGAGAACAACTGGGGTGA CATTAGCGACGCGATCCATAAATCTTCCCCGCAATGCACCACCATTAACC CGGCTCTGCAGCTGATCTCTCCGTCTAACGATCCGTGGGTAGTTAACAAAG TGTCTCAAATCAGCCCGGACATGGGTATCCTGAAATTTAAATCTAGCAAA TAGTGACTCGAG SEQ ID NO: 28 (Secuencia nucleótida de DI VL-CL-deBouganina)
CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT GCC CAT GAA AAT TCT ATT TCA AGG AGA CAG TCA TA ATG AAA TAC CTT CTG CCG ACC GCT GCC GCT GGT CTG CTG CTG TTG GCT GCT CAA CCG GCT ATG GCA GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCG TCT AGC CTG AGC GCA AGC GTT GGT GAC CGT GTG ACC ATC ACC TGC CGT AGC ACT AAA TCC CTG CTG CAC TCT AAC GGC ATC ACC TAC CTG TAT TGG TAC CAA CAG AAA CCG GGT AAA GCT CCG AAA CTG CTG ATC TAC CAG ATG TCT AAC CTG GCT AGC GGC GTT CCT TCT CGT TTT TCT TCT AGC GGT AGC GGT ACT GAC TTC ACC CTG ACC ATT AGC TCT CTG CAG CCT GAA GAC TTT GCG ACC TAC TAT TGC GCT CAG AAC CTT GAA ATC CCG CGT ACC TTC GGC acc GGT ACC AAA GTT GAA ate AAG CGT ACC GTT GCG GCT CCG TCT GTT TTC ATC TTC CCA CCT AGC GAT GAA CAG CTT AAA TCT GGT ACT GCT AGC GTA GTT TGC CTG CTT AAC AAC TTC TAC CCT CGT GAA GCT AAA GTT CAG TGG AAA GTT GAC AAC GCT CTG CAG TCT GGT AAC TCT CAG GAA TCT GTG ACC GAA CAG GAT AGC AAA GAT AGC ACC TAT AGC CTG TCT AGC ACC CTG ACC CTT AGC AAG GCG GAC TAT GAA AAA CAC AAA GTT TAC GCT TGC GAG GTG ACC CAC CAA GGT CTG TCT TCT CCG GTG ACT AAA TCC TTT AAC CGT GGC GAA TGCACCCGTCACCGTCAGCCGCGTGGTTGGGA ACAGaaa TATAA CACCGTATCTTTTAACCTGGGTGAGGCGTATGAATACCCGACCT TCATC CAGGACCTGCGTAATGAACTTGCTAAAGGTACCCCTGTTTGCCAGCTGCCT GTGACCCTGCAGACCATCGCTGATGATAAACGTTTCGTTCTGGTTGACATT ACCACCACCTCCAAAAAAACCGTTAAAGTCGCGATCGATGTGACCGACGT TTACGTGGTAGGTTACCAGGATAAATGGGACGGTAAAGATCGTGCGGTTT TCCTGGACAAAGTTCCGACCGTAGCGACTTCTAAACTGTTCCCAGGTGTGA CCAACCGTGTGACCCTGACCTTCGACGGCAGCTATCAGAAACTGGTTAAC GCGGC C AAAGCT GATC GT AAAGCT CTCGA ACT GGGT GTT AAC A AACT GGA GTTCAGCATTGAAGCTATCCACGGTAAAACCATCAACGGTCAAGAAGCAG CTAAATTCTTCCTGATCGTGATCCAGATGGTTAGCGAAGCAGCGCGTTTTA AATACATTGAAACCGAAGTAGTTGATCGTGGTCTGTATGGTAGCTTCAAA CCGAACTTCAAAGTTCTTAACCTGGAGAACAACTGGGGTGACATTAGCGA CGCGATCCATAAATCTTCCCCGCAATGCACCACCATTAACCCGGCTCTGCA GCTGATCTCTCCGTCTAACGATCCGTGGGTAGTTAACAAAGTGTCTCAAAT CAGCCCGGACATGGGTATCCTGAAATTTAAATCTAGCAAATAGTGACTCG AG
SEQ ID NO: 29 (Secuencia nucleótida de Algo V L-C L-deBouganina) T C T A G A G T C G A C C T G C A G G T C T A T G G A A C G A T A A A T G C C C A T G A A A A T T C T A T T T C A A G G A G A C A G T C A T A A T G A A A T A C C T T C T G C C G A C C G C T G C C G C T GGT CT GCT GCT GTT GGCT GCT C AAC CGGCT ATGGC AGAC AT C C AGAT GAC CCAGTCCCCGTCTAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGACCGTGTGACCATCA CCTGCaaaAGCACTAAATCCCTGCTGCACTCTAACGGCATCACCTACCTGTA TTGGTACCAACAGAAACCGGGTtctGCTCCGAAACTGCTGATCTACCAGATG TCTcacCTGGCTAGCGGCGTTCCTTCTCGTTTTTCTTCTAGCGGTAGCGGTAC TGACTTCACCCTGACCATTAGCTCTCTGCAGCCTGAAGACTTTGCGACCTA CTATTGCGCTCAGAACCTTGAAATCCCGCGTACCTTCGGCCAGGGTACCA AAGTTGAAatcAAGCGTACCGTTGCGGCTCCGTCTGTTTTCATCTTCCCACC TAGCGATGAACAGCTTAAATCTGGTACTGCTAGCGTAGTTTGCCTGCTTAA CAACTTCTACCCTCGTGAAGCTAAAGTTCAGTGGAAAGTTGACAACGCTC TGCAGTCTGGTAACTCTCAGGAATCTGTGACCGAACAGGATAGCAAAGAT AGCACCTATAGCCTGTCTAGCACCCTGACCCTTAGCAAGGCGGACTATGA AAAACACAAAGTTTACGCTTGCGAGGTGACCCACCAAGGTCTGTCTTCTC CGGTGACTAAATCCTTTAACCGTGGCGAATGCACCCGTCACCGTCAGCCG CGTGGTTGGGAACAGaaaTATAACACCGTATCTTTTAACCTGGGTG AGGCGTATGAATACCCGACCTTCATCCAGGACCTGCGTAAT GAACTTGCTAAAGGTACCCCTGTTTGCCAGCTGCCTGTGACCCTGCAGACC ATCGCTGATGATAAACGTTTCGTTCTGGTTGACATTACCACCACCTCCAAA AAAACCGTTAAAGTCGCGATCGATGTGACCGACGTTTACGTGGTAGGTTA CCAGGATAAATGGGACGGTAAAGATCGTGCGGTTTTCCTGGACAAAGTTC CGACCGTAGCGACTTCTAAACTGTTCCCAGGTGTGACCAACCGTGTGACC CTGACCTTCGACGGCAGCTATCAGAAACTGGTTAACGCGGCCAAAGCTGA TCGTAAAGCTCTCGAACTGGGTGTTAACAAACTGGAGTTCAGCATTGAAG CTATCCACGGTAAAACCATCAACGGTCAAGAAGCAGCTAAATTCTTCCTG ATCGTGATCCAGATGGTTAGCGAAGCAGCGCGTTTTAAATACATTGAAAC CGAAGTAGTTGATCGTGGTCTGTATGGTAGCTTCAAACCGAACTTCAAAG TTCTTAACCTGGAGAACAACTGGGGTGACATTAGCGACGCGATCCATAAA TCTTCCCCGCAATGCACCACCATTAACCCGGCTCTGCAGCTGATCTCTCCG TCTAACGATCCGTGGGTAGTTAACAAAGTGTCTCAAATCAGCCCGGACAT GGGT AT C C T GA A ATTT AA AT CT AGC A A AT AGT GACT C GAG
SEQ ID NO: 30 (Secuencia nucleótida de W T V L-C L-deBouganina) C TG C A G GTC T A T G G A A C G A T A A A T GCC C A T G A A A A T T C T A T T T C A AGG AG A CAG TCA TA ATG A A A TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG CAC CAT CAT CAC CAT CAC GAT ATC CAG ATG ACC CAG TCC CCG TCC TCC CTG AGT GCT TCT GTT GGT GAC CGT GTT ACC ATC ACC TGC CGT TCC ACC A A A TCC CTC CTG CAC TCC AAC GGT ATC ACC TAC CTT TAT TGG TAT CAA CAG A A A CCG GGT A A A GCT CCG A A A CTT CTG ATC TAC CAG ATG TCC AAC CTG GCT TCC GGT GTT CCG TCT CGT TTC TCC AGT TCT GGT TCT GGT ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC TCT TCT CTG CAG CCG GAA GAC TTC GCT ACC TAC TAC TGC GCT CAG AAC CTG GAA ATC CCG CGT ACC TTC GGT CAG GGT ACC A A A GTT GAA CTT AAG CGC ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG A A A TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AA T AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC A A A GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC A A A GCA GAC TAC GAG A A A CAC A A A GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC AC A AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT ACCCGTCACCGTCAGCCG CGTGGTTGGGAACAGCTCTATAACACCGTATCTTTTAACCT GGGTGAGGCGT ATG AATACCCGACCTTCATCCAGGACCTGCGTAATGAACTTG CTAAAGGT ACCCCTGTTTGCCAGCTGCCTGTGACCCTGCAGACCATCGCTG ATG ATAAA CGTTTCGTTCTGGTTGACATTACCACCACCTCCAAAAAAACCGTTAAAGTC GCGATCGATGTGACCGACGTTTACGTGGTAGGTTACCAGGATAAATGGGA CGGTAAAGATCGTGCGGTTTTCCTGGACAAAGTTCCGACCGTAGCGACTT CTAAACTGTTCCCAGGTGTGACCAACCGTGTGACCCTGACCTTCGACGGC AGCT AT C AGAAACTGGTT AACGC GGC C AAAGCT GATCGT A A AGCT CTCGA ACT GGGTGTT AAC AAACT GGAGTT C AGC ATTGAAGCT ATC CAC GGT A AAA CCATCAACGGTCAAGAAGCAGCTAAATTCTTCCTGATCGTGATCCAGATG GTTAGCGAAGCAGCGCGTTTTAAATACATTGAAACCGAAGTAGTTGATCG TGGTCTGTATGGTAGCTTCAAACCGAACTTCAAAGTTCTTAACCTGGAGAA CAACTGGGGTGACATTAGCGACGCGATCCATAAATCTTCCCCGCAATGCA CCACCATTAACCCGGCTCTGCAGCTGATCTCTCCGTCTAACGATCCGTGGG TAGTTAACAAAGTGTCTCAAATCAGCCCGGACATGGGTATCCTGAAATTT AA AT CT AGC AA AT AGT GACTCGAG
SEQ ID NO: 31 (Algo VH(CDRsWT)-CH) EVQLQQSGPGLVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGW INTYT GES TY AD SFKGRFEF S LDTHN S S AYLQIQ S LREEDT AVYY C ARF AIKG DYW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT A ALGCL VKDYFPEP VTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC SEQ ID NO: 32 (Algo VH(CDRsWT Treg) - CH)
EVQLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFTN Y GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYT GES TY AD SFKGRFEF S LDTHN S S AYLQMNSLRAEDT AVYY C ARF AIKG DYW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT AALGCL VKDYFPEP VTV S WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKKVEPKSC SEQ ID NO: 33 (deBouganina 2) YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDIT TTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTN RVTLTFDGSYQKLVHSAEVDRKDLELGVNKLEFSIEA1HGKTINGQEIAKFFLI VIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLHGSFKPDFKVLDLENNWGDISDA1HKSSPQ CTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK SEQ ID NO: 34 (DI VH-CH-deBouganina 3)
EV QLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYTFTAY GMNWVRQ APGKGLEWMG WINTYTGESTYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFAI KGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TV S WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S S LGT QTYICNVNHKP S NTKVDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAK GTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVV GY QDKWD GKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV/FAAKADRKALEL GVWKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGS FKPNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQIS PDMGILKFKSSK SEQ ID NO: 35 (DI VL-CL-deBougan¡na 3) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI Y QMSNL AS GVP S RF S S S GS GTDFTLTIS S LQPEDF ATYY C AQNLEIPRTF GT GT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC TRHRQPRGWEQKYNTV SFNLGEAYEYPTFIQDLRNEL AKGTPV CQLPVTLQTI ADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPT VATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV^AAKADRKALELGVTVKLEFSIEA1HG KTINGQEA AKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNFKVLNLENN WGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK SEQ ID NO: 36 (Algo VH-CH-deBouganina 3)
EVQLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFT AY GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYT GES TY AD SFKGRFEF S LDTHN S S AYLQIQ S LREEDT AVYY C ARF AIQG DYW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT AALGCL VKDYFPEP VTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV/FAAKADRKALELGV MCLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 37 (Algo VL-CL-deBouganina 3) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGSAPKLLIY QMSHLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGECTRHRQPRGWEQKYNTV SFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLP VTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVV GY QDKWDGKDRAVF LDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV^AAKADRKALELGVTVKLEFS IEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNFKVL NLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKF KSSK SEQ ID NO: 38 (Algo VH(CDRsWT)-CH-deBouganina)
EVQLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFTNY GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYT GES TY AD SFKGRFEF S LDTHN S S AYLQIQ S LREEDT AVYY C ARF AIKG DYW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT AALGCL VKDYFPEP VTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLP VTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGV NKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLY GSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 39 (Algo VH(CDRsWT)-CH-deBougan¡na3)
EVQLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFTNY GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYT GES TY AD SFKGRFEF S LDTHN S S AYLQIQ S LREEDT AVYY C ARF AIKG DYW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT AALGCL VKDYFPEP VTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV7/AAKADRK.4LELGV MCLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVYDRGLYGSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 40 (Algo Vh(CDRsWT Treg)-CH-deBouganina)
EV QLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFTNY GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFEFSLDTHNSSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFAIKG D YW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT AALGCL VKDYFPEP VTV S WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGV NKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLY GSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 41 (Algo VH(CDRsWT+Treg)-CH-deBougan¡na3)
EV QLQQ S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFTNY GMNWVRQ APGKGLEWMGW INTYT GES TY AD SFKGRFEF S LDTHN S S AYLQMNSLRAEDT AVYY C ARF AIKG D YW GQGTL VTV S S AS TKGP S VFPL AP S SKS TS GGT AALGCL VKDYFPEP VTV S WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV7/AAKADRKALLLGV WKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 42 (deBouganina 3) YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDIT TTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTN RVTLTFDGSYQKLVtfAAKADRKALELGViVKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFL
IVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSP QCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK SEQ ID NO: 43 (deBouganina 4) YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDIT TTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTN RVTLTFDGSYQKLV7/AAKVDRKDLELGVWKLEFSIEA1HGKTINGQEIAKFFLI VIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQ CTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK
SEQ ID NO: 44 (DI VH-CH-deBouganina 4)
EV QLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYTFTAY GMNWVRQAPGKGLEWMG WINTYTGESTYADSVKGRFTISADTSKNTAYLOMNSLRAEDTAVYYCARFAI KGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAK GTPV CQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVV GY QDKWD GKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV^AAKVDRKDLEL GV7VKLEF SIE A1HGKTIN GQEIAKFFLIVIQM V S EAARFKYIETEV VDRGLY GSF KPNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISP DMGILKFKSSK SEQ ID NO 45 (DI VL-CL-deBouganina4) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI Y QMSNL AS GVP S RF S S S GS GTDFTLTIS S LQPEDF ATYY C AQNLEIPRTF GTGT KVEIKRTV AAP S VFIFPP S DEQLKS GT AS V V CLLNNFYPRE AKV Q WKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC TRHRQPRGWEQKYNTV SFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTI ADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPT VATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV^AAKVDRKDLELGVMCLEFSIEA1HG KTINGQEIAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNFKVLNLENN WGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK SEQ ID NO: 46 (Algo VH-CH-deBouganina 4)
EV QLQQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTAYGMNWVRQAPGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFEFSLDTHNSSAYLOIOSLREEDTAVYYCARFAIOG DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV S WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV^AAKVDRKDLELGV AKLEFSIEA1HGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKP NFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK
SEQ ID NO: 47 (Algo VL-CL-deBougan¡na 4) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGSAPKLLIY QMSHLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTK VEIKRTV AAPS VFIFPP SDEQLKSGT AS VVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC TRHRQPRGWEQKYNTV SFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTI ADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTD VYVV GY QDKWDGKDRAVFLDKVPT VATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV/7AAKVDRKDLELGWVKLEFSIEA1HG KTINGQEIAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNFKVLNLENN WGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK SEQ ID NO: 48 (Algo VH(CDRsWT)-CH-deBougan¡na4)
EV QLQQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTNY GMNWVRQAPGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFEFSLDTHNSSAYLOIOSLREEDTAVYYCARFAIKG DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV S WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLP VTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTD VYVVGYQDKWDGK
DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVi/AAKVDRKDLELGV MCLEFSIEA1HGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKP NFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 49: (Algo VH(CDRsWT Treg)-CH-deBouganina4)
EV QL^Q S GPGL V QP GGS VRIS C AAS GYTFTNY GMNWVRQAPGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFEFSLDTHNSSAYLOM NSLRAEDTAVYYCARFAIK GDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT V S WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S S LGT QTYICNVNHKP SN TKVDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKG TPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTD VYVVGYQDKWDG KDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV^AAKVDRKDLELG VMCLEFSIEA1HGKTINGQEIAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK
SEQ ID NO: 50 (WT VH-CH-deBouganina 3)
EV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTNY GMNWVKQAPGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKG DYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP VCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV/FAAKADRKALELGV AKLEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFK PNFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 51 (WT VH-CH-deBouganina4)
EV QLVQSGPGLV QPGGSVRISC AASGYTFTNY GMNWVKQAPGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKG DYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WN S GALTS GVHTFP AVLQ S S GLY S LS S V VTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKKVEPKSCTRHRQPRGWEQKYNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTP V CQLP VTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKV AIDVTDVYVV GY QDKWDGK DRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV/FAAKVDRKDLELGV MvLEFSIEA1HGKTIN GQEIAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKP NFKVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD MGILKFKSSK SEQ ID NO: 52 (WT VL-CL-deBouganina 3) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGT KVELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGECTRHRQPRGWEQKYNTV SFNLGEAYEYPTFIQDLRNEL AKGTPV C QLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDR AVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLV/FAAKADRKALELGViVK LEFSIEA1HGKTINGQEAAKFFLIVIQMV SEAARFKYIETEVVDRGLY GSFKPNF KVLNLENNWGDISDA1HKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGI LKFKSSK

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) que comprende:
(i) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2; o
(ii) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 12.
2. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a EpCAM, unido a una molécula efectora, en donde el anticuerpo comprende
(i) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2; o
(ii) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 12.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, o el inmunoconjugado según la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos de anticuerpos biespecíficos.
4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, o el inmunoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo Fab y en donde la cadena ligera y la cadena pesada están unidas por un enlace covalente, opcionalmente en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro.
5. El inmunoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la molécula efectora se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un agente antineoplásico, un inmunomodulador, un modificador de la respuesta biológica, lectina, una toxina, un cromóforo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un ion metálico y cualquier combinación de los mismos.
6. El inmunoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la molécula efectora es una toxina seleccionada del grupo que consiste en abrina, modecina, viscumina, gelonina, bouganina, saporina, ricina, cadena de ricina A, briodina, lufina, momordina, restrictocina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina pertusis, toxina tetánica, toxina botulínica, toxina de Shigella, toxina del cólera, toxina de la difteria y cualquier combinación de las mismas.
7. El inmunoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la molécula efectora es la exotoxina A de Pseudomonas (SEQ ID NO: 3), la toxina bouganina (SEQ ID NO: 4) o la toxina bouganina seleccionada de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43.
8. Una composición que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 6, o un inmunoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, y un excipiente, vehículo, tampón o estabilizador farmacéuticamente aceptable.
9. El inmunoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, o la composición según la reivindicación 8, para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
10. El inmunoconjugado o composición para uso según la reivindicación 9, en donde el inmunoconjugado o composición está en una forma para administración parenteral seleccionada del grupo que consiste en inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracavitaria, intratecal, intratumoral, transdérmica e intravenosa.
11. El inmunoconjugado o composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en donde el inmunoconjugado está en una forma de dosificación de 0,01 mg/kg/dosis a 2.000 mg/kg/dosis.
12. El inmunoconjugado o composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende además el uso de uno o más agentes anticancerígenos y en donde los agentes anticancerígenos se coadministran, se administran simultáneamente o se administran secuencialmente con el inmunoconjugado, opcionalmente en donde los agentes anticancerígenos se seleccionan de tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, acetato de megestrol, anasfrozol, letrazol, borazol, exemestano, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, acetato de goserelina, luprolida, finasterida, herceptina, metotrexato, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina, mitramicina, cisplatino, carboplatino, melfalán, clorambucilo, busulfán, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, tiotefán, vincristina, taxol, taxotere, etopósido, tenipósido, amsacrina, Irinotecán, topotecán, epotilonas, Iressa, Tarceva, inhibidores de la angiogénesis, inhibidores de EGF, inhibidores de VEGF, inhibidores de CDK, citoquinas, inhibidores de Herl y Her2, y anticuerpos monoclonales.
13. El inmunoconjugado o composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, cáncer de esófago, páncreas y próstata.
14. Un método para detectar o monitorizar el cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:
- poner en contacto una muestra de ensayo tomada del sujeto con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 6, para formar un complejo anticuerpo-antígeno;
- medir la cantidad del complejo anticuerpo-antígeno en la muestra de ensayo; y
- normalizar los resultados frente a un control.
15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 6 para uso en un método de imaginería de un tumor en un sujeto, comprendiendo el método:
- administrar al sujeto el anticuerpo y
- detectar el anticuerpo mediante imaginería in vivo, opcionalmente en donde el anticuerpo comprende además una molécula efectora seleccionada del grupo que consiste en un radioisótopo, un cromóforo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, un ion metálico y cualquier combinación de los mismos.
16. El anticuerpo para uso según la reivindicación 15, en donde la imaginería in vivo se selecciona del grupo que consiste en imaginería por fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF), imaginería por reflectancia de fluorescencia (FRI), tomografía mediada por fluorescencia (FMT), tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT), imaginería por resonancia magnética (MRI), p Et con imaginería por tomografía computarizada concurrente (PET/CT), PET con imaginería por resonancia magnética concurrente (PET/MRI), y cualquier combinación de los mismos.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2829283T (pt) 2003-04-30 2017-09-08 Univ Zuerich Método para tratamento do cancro utilizando uma imunotoxina
CN105764925A (zh) 2013-10-02 2016-07-13 维文蒂亚生物公司 抗EpCAM抗体和使用方法
WO2016145349A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 Viventia Bio Inc. Methods of treatment for epcam positive bladder cancer
CA2979400A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 Viventia Bio Inc. Dosing strategies for targeting epcam positive bladder cancer
WO2017023704A1 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 Sutro Biopharma, Inc. ANTI-EpCAM ANTIBODIES, COMPOSITIONS COMPRISING ANTI-EpCAM ANTIBODIES AND METHODS OF MAKING AND USING ANTI-EpCAM ANTIBODIES
KR20190038567A (ko) 2016-07-26 2019-04-08 테사 테라퓨틱스 피티이. 엘티디. 키메라 항원 수용체
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
AU2020292304B2 (en) 2019-06-11 2023-03-30 Bioatla, Inc. Conditionally active anti-EpCam antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
CN110950959B (zh) * 2020-02-25 2020-07-03 和铂医药(上海)有限责任公司 靶向EpCAM的抗体及其制备和应用
US20250339564A1 (en) 2022-04-06 2025-11-06 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Epithelial cell adhesion molecule (epcam)-fluorescence imaging molecule for the detection of gastrointestinal tumors and cancer positive lymph nodes
TW202502825A (zh) * 2023-03-02 2025-01-16 美商拜奧亞特拉公司 條件性活性抗epcam抗體、抗體片段及併入其之構築體
CN116875520B (zh) * 2023-07-12 2024-06-14 吉林农业大学 表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒中的应用

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5082767A (en) 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
IL98528A0 (en) 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
US20030148463A1 (en) 1997-04-14 2003-08-07 Micromet Ag Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof
GB9709421D0 (en) 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
AU8040898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Tanox Pharma B.V. Type-1 ribosome-inactivating protein
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
US6280742B1 (en) 1998-06-17 2001-08-28 Zonagen, Inc. Methods and materials for the treatment of prostatic carcinoma
DK1171468T3 (da) 1999-04-09 2008-10-20 Univ Zuerich Fremgangsmåde til stabilisering af kimære immunoglobuliner eller immunoglobulinfragmenter, samt stabiliseret anti-EGP-2-scFv-fragment
GB9911569D0 (en) 1999-05-18 1999-07-21 Oxford Biomedica Ltd Antibodies
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
DK1383785T3 (da) 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
US20030148950A1 (en) 2001-10-09 2003-08-07 Li Xin Kringle domain 1 of human hepatocyte growth factor and uses therefor
MXPA04003535A (es) 2001-10-15 2005-06-20 Immunomedics Inc Proteinas de enlace para objetivos directos.
US20040022726A1 (en) 2002-06-03 2004-02-05 Goldenberg David M. Methods and compositions for intravesical therapy of bladder cancer
SI21272A (sl) 2002-07-31 2004-02-29 LEK farmacevtska dru�ba d.d. Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli
CA2424255A1 (en) 2003-03-26 2004-09-26 Claudio Di Paolo Immunotoxins
PT2829283T (pt) 2003-04-30 2017-09-08 Univ Zuerich Método para tratamento do cancro utilizando uma imunotoxina
CN1954073B (zh) * 2004-03-19 2013-01-16 默克专利股份有限公司 被修饰Bouganin蛋白、细胞毒素及其方法和用途
EP1737961B1 (en) 2004-03-19 2013-05-08 Merck Patent GmbH Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof
PL1766017T3 (pl) 2004-06-10 2015-08-31 Viventia Bio Inc Przeciwciało specyficzne wobec nowotworu
WO2006066408A1 (en) * 2004-12-21 2006-06-29 Viventia Biotech Inc. Cancer specific antibody and cell surface proteins
US20090171317A1 (en) 2006-03-10 2009-07-02 Ebrahim Versi Self-Catheterization Device To Administes Compounds To The Bladder
WO2008052322A1 (en) 2006-10-30 2008-05-08 Viventia Biotech Inc. Immunotoxγn fusions comprising an antibody fragment and a plant toxin linked by protease cleavable linkers
US8263744B2 (en) * 2007-04-19 2012-09-11 Viventia Biotechnologies Inc. Binding proteins that bind to EpCAM linked to an effector molecule
CA2700815A1 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Viventia Biotech Inc. Optimized nucleic acid sequences for the expression of vb4-845
CA2618163A1 (en) 2008-02-07 2009-08-07 K. W. Michael Siu Head and neck cancer biomarkers
WO2010031185A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Protox Therapeutics Inc. Treating cancer stem cells using targeted cargo proteins
EP2416805B1 (en) 2009-04-08 2013-07-24 Heinz Dr. Faulstich Amatoxin antibody conjugates for the treatment of cancer
GB0909904D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Affitech As Product
WO2011116387A1 (en) 2010-03-19 2011-09-22 Tetragenetics, Inc. Production of aglycosylated monoclonal antibodies in ciliates
CN103732259A (zh) 2011-06-24 2014-04-16 森彻斯有限公司 细胞外靶向药物缀合物
AU2014252683A1 (en) 2013-04-12 2015-11-19 Viventia Bio Inc. Compositions and methods for detection and treatment of hepatocellular carcinoma
CN105764925A (zh) 2013-10-02 2016-07-13 维文蒂亚生物公司 抗EpCAM抗体和使用方法
CA2979400A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 Viventia Bio Inc. Dosing strategies for targeting epcam positive bladder cancer
WO2017040801A2 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Viventia Bio Inc. Methods for making and using an immunoconjugate for the treatment of cancer

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