ES2639832T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la enfermedad de Darier - Google Patents

Abstract

Un agente que es capaz de recuperar el tráfico de E-cadherina en queratinocitos de Darier y la formación de uniones adherentes para uso en el tratamiento de un paciente con enfermedad de Darier, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en chaperonas químicas y chaperonas farmacológicas, siendo la chaperona química ácido 4-fenilbutírico (AFB) y siendo la chaperona farmacológica 1,5-(butilimino)-1,5-didesoxi-D-glucitol (miglustat).

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de la enfermedad de Darier Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de la enfermedad de Darier.

Antecedentes de la invencion

La enfermedad de Darier (ED) es un trastorno de la queratinizacion caracterizado por el desarrollo de papulas queratosicas en areas seborreicas y anomalfas espedficas de la una. La prevalencia esta estimada en alrededor de 1/50 000. El comienzo de la enfermedad normalmente tiene lugar alrededor de la pubertad. Los pacientes presentan papulas queratosicas grasas y coloreadas (pardo-amarillentas o pardas), que pueden estar aisladas o agrupadas formando placas. Las lesiones cutaneas con frecuencia llegan a infectarse y a ser malolientes y son responsables de un gran malestar. Pueden agravarse por exposicion a la luz solar o a radiacion UVB artificial, calor, sudoracion, friccion e infecciones. Los sitios de predileccion son las areas seborreicas del tronco y el rostro: parte superior del pecho, espalda, lados del cuello, frente, orejas y cuero cabelludo. Las curvaturas tambien estan implicadas con frecuencia (las ingles, axilas y la region anogenital). Las manos y los pies tambien pueden presentar papulas discretas en las superficies dorsales. El examen cuidadoso de las palmas y las plantas con frecuencia revela pequenas marcas o queratosis puntuadas que son muy sugerentes, si no espedficas, de ED. Las anormalidades en la una son casi constantes y muy sugerentes. Las unas muestran la combinacion espedfica de estnas longitudinales rojas y blancas y presentan hiperqueratosis subungueal. Son fragiles y presentan un defecto con forma de V. El paladar duro, la mucosa oral, el esofago, la vulva y el recto pueden ser el sitio de papulas pequenas blanquecinas, con frecuencia densamente agrupadas (leucoplaquia). Los pacientes presentan una susceptibilidad aumentada a herpes simple e infecciones piogenicas. La importancia de la enfermedad es muy variable, incluso dentro de la misma familia.

La ED es producida por mutaciones en el gen ATP2A2 (12q23-q24.1) que codifica una bomba de Ca2+ del retfculo endoplasmico. El ATP2A2 codifica la isoforma 2 de Ca2+-ATPasa de retfculo sarco/endoplasmico (SERCA2), una bomba de calcio que transporta Ca2+ del citosol al lumen de retfculo endoplasmico (RE) para mantener una alta concentracion de Ca2+ en este organulo. Estudios funcionales de mutaciones de ATP2A2 identificadas en ED han demostrado que conducen a perdida de transporte de Ca2+ de la bomba. Como consecuencia de la perdida de transporte de Ca2+ de SERCA2, los queratinocitos Darier (QD) muestran deposito de Ca2+ de RE agotado.

El diagnostico de la ED se basa en el examen histologico de biopsias de lesiones cutaneas que revelan hiperqueratosis, disqueratosis focal y acantolisis suprabasal. Los diagnosticos diferenciales incluyen enfermedad de Hailey-Hailey, penfigo y disqueratoma verrugoso (veanse estos terminos), asf como dermatosis acantolttica transitoria.

El tratamiento es sintomatico. Los pacientes debenan evitar el sol y el calor. Los emolientes que contienen urea o acido lactico son beneficiosos para lesiones mas limitadas. La aplicacion topica de tretinoma o isotretinoma es eficaz contra la hiperqueratosis, pero el riesgo de irritacion limita su uso. Los esteroides topicos pueden reducir la irritacion, pero no son eficaces cuando se usan solos. Los retinoides tales como tazaroteno se toleran mejor. En el caso de enfermedad grave, la acitretina (un retinoide oral) es el tratamiento mas eficaz, pero deben controlarse posibles efectos secundarios. Se han indicado depresion y manifestaciones neuropsicologicas y puede ser necesario soporte psicologico espedfico. De acuerdo con esto, hay una necesidad en la tecnica de identificar nuevos objetivos farmacologicos para el tratamiento de la ED.

Sumario de la invencion

La presente descripcion se refiere a metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de la enfermedad de Darier. Mas en particular, la presente descripcion se refiere a un agente que es capaz de recuperar el trafico de E-cadherina en QD y la formacion de uniones adherentes para uso en un metodo para tratar pacientes con enfermedad de Darier. En particular, la presente descripcion se refiere a un agente seleccionado del grupo que consiste en chaperonas moleculares, qrnmicas y farmacologicas para uso en un metodo para tratar pacientes con enfermedad de Darier.

La presente invencion se refiere a un agente que es capaz de recuperar el trafico de E-cadherina en queratinocitos de Darier y la formacion de uniones adherentes para uso en el tratamiento de un paciente con enfermedad de Darier, en la que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en chaperonas qrnmicas y chaperonas farmacologicas, siendo la chaperona qrnmica acido 4-fenilbutmco (AFB) y siendo la chaperona farmacologica 1,5- (butilimino)-1,5-didesoxi-D-glucitol (miglustat).

Descripcion detallada de la invencion

La enfermedad de Darier es un trastorno cutaneo genetico, dominante, grave, caracterizado por perdida de adhesion

celula a celula y queratinizacion anormal. Los autores identificaron previamente el gen defectuoso, ATP2A2, que codifica SERCA2, una bomba de Ca2+-ATPasa del retmulo endoplasmico (RE). Aqm, demuestran que los queratinocitos de Darier (QD) muestran una respuesta al estres del RE constitutivo y formation de uniones adherentes (UA) inmaduras. Estos defectos resultan directamente de la perdida de la funcion de SERCA2 puesto 5 que tratar los queratinocitos normales con tapsigargina, un inhibidor de SERCA2, recuerda el estres del rE y UA inmaduras. Demuestran que las UA anormales en los QD se deben a un defecto selectivo en el trafico de E- cadherina que es retenido en el RE. Por supuesto, la expresion de E-cadherina constitutiva en la membrana plasmatica recupera el reclutamiento de catenina para la membrana celular. El tratamiento de QD con acido 4- fenilbutmico, una chaperona qmmica que reduce el estres del RE o con Miglustat una chaperona farmacologica, 10 recupera la formacion de UA maduras, identificando estas moleculas como prometedores agentes terapeuticos en pacientes de Darier.

De acuerdo con esto, la presente invention se refiere a un agente que es capaz de recuperar el trafico de E- cadherina en los QD y la formacion de uniones adherentes para uso en un metodo para tratar a pacientes con enfermedad de Darier. En particular, la presente invencion se refiere a un agente seleccionado del grupo que 15 consiste en chaperonas moleculares, qmmicas y farmacologicas, para uso en un metodo para tratar a pacientes con Darier.

El agente puede ser cualquier tipo de compuesto qmmico. El agente puede ser una molecula pequena, un complejo organometalico, un compuesto inorganico, una protema, una glucoprotema, un peptido, un carbohidrato, un lipido o un acido nucleico. En algunas realizaciones, el agente es una molecula pequena.

20 Tipicamente, el agente relativo a la invencion es una chaperona qmmica. Una “chaperona qmmica” tiene su significado general en la tecnica y se refiere a un compuesto que se sabe que estabiliza la conformation de protemas contra la desnaturalizacion (por ejemplo, desnaturalizacion qmmica, desnaturalizacion termica), conservando de ese modo la estructura y la funcion de la protema (Welch et al., Cell Stress Chaperones 1:109-115, 1996). En algunas realizaciones, la “chaperona qmmica” es una molecula pequena o compuesto de bajo peso 25 molecular. Preferiblemente, la “chaperona qmmica” no es una protema.

Ejemplos de chaperonas qmmicas incluyen, pero no se limitan a, glicerol, agua deuterada (D2O), dimetilsulfoxido (DMSO), N-oxido de trimetilamina (OTMA), glicina betama (betama), glicerolfosfocolina (GFC) (Burg et al. Am. J. Physiol. (Renal Physiol. 43): F762-F765, 1998), butirato de 4-fenilo o acido 4-fenilbutmco (AFB), metilaminas y acido tauroursodesoxicolico (ATUDC) o cualquier derivado de los mismos.

30 En algunas realizaciones, la chaperona qmmica segun la description es un derivado de butirato de 4-fenilo con la formula:

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en la que n es 1 o 2;

R0 es arilo, heteroarilo o fenoxi, en la que el arilo, heteroarilo y fenoxi que esta no sustituido o sustituido con, independientemente, uno o mas grupos halogeno, hidroxi o alquilo (C1-C6) inferior;

R1 y R2 son independientemente H, alcoxi inferior, hidroxi, alquilo inferior o halogeno y

R3 y R4 son independientemente H, alquilo inferior, alcoxi inferior o halogeno o

una sal farmaceuticamente aceptable del mismo o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, R0 es un anillo de fenilo sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, R0 es un anillo de fenilo no sustituido. En otras realizaciones, R0 es un anillo de fenilo monosustituido. En otras realizaciones mas, R0 es un anillo de fenilo disustituido. En otras realizaciones mas, R0 es un anillo de fenilo trisustituido. En algunas realizaciones, R0 es un anillo de fenilo sustituido con 1, 2, 3 o 4 atomos de halogeno. En algunas realizaciones, R0 es un anillo de heteroarilo sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, R0 es un anillo de naftilo. En algunas realizaciones, R0 es de cinco o de seis miembros, preferiblemente de seis miembros. En algunas realizaciones, R1 y R2 son ambos hidrogeno. En algunas realizaciones, n es 1. En otras realizaciones, n es 2. En algunas realizaciones, todos los R3 y R4 son hidrogeno. En otras realizaciones, al menos R3 o R4 es hidrogeno. En algunas realizaciones, el compuesto se usa en forma de sal (por ejemplo, sal de sodio, sal de potasio, sal de magnesio, sal de amonio, etc.). Otros derivados utiles en la presente descripcion se describen en la Patente de EE. UU. num. 5.710.178. Puede obtenerse butirato de 4-fenilo o sus derivados de fuentes comerciales o prepararse por smtesis total o semismtesis.

En algunas realizaciones, la chaperona qmmica segun la descripcion es un derivado de ATUDC util en la presente

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description es de la formula:

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en la que:

R es -Ho alquilo C1-C4;

R1 es -CH2-SO3R3 y R2 es -H o R1 es -COOH y R2 es -CH2-CH2-CONH2, - CH2-CONH2, -CH2-CH2- SCH3 o -CH2-S-CH2-COOH y

R3 es -H o un aminoacido basico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, R es H. En otras realizaciones, R es metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo o terc-butilo, preferiblemente, metilo. En algunas realizaciones, R1 o R2 es hidrogeno. En algunas realizaciones, R1 es -CH2-SO3R3 y R2 es -H. En otras realizaciones, R1 es -COOH y R2 es -CH2-CH2-CONH2, -CH2-CONH2, -CH2- CH2-SCH3 o -CH2-S-CH2-COOH. En algunas realizaciones, r3 es hidrogeno. En algunas realizaciones, R3 es lisina, arginina, ornitina o histidina. Pueden obtenerse derivados de ATUDC y acido ursodesoxicolico de fuentes comerciales, preparados a partir de smtesis total u obtenidos a partir de una semismtesis. En algunas realizaciones, el derivado se prepara por semismtesis, por ejemplo, como se describe en las Patentes de EE. UU., nums., 5.550.421 y 4.865.765.

La chaperona quimica segun la descripcion tambien puede ser un derivado de N-oxido de trimetilamina que presente la formula:

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R1 I R3

R2

en la que:

R1, R2 y R3 son independientemente hidrogeno, halogeno o alquilo C1-C6 inferior o

una sal farmaceuticamente aceptable del mismo o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, R1, R2 y R3 son iguales. En otras realizaciones, al menos uno de R1, R2 y R3 es diferente. En otras realizaciones mas, todos los R1, R2 y R3 son diferentes. En algunas realizaciones, R1, R2 y R3 son independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 inferior. En otras realizaciones mas, R1, R2 y R3 son independientemente alquilo C1-C6 inferior. En otras realizaciones mas, R1, R2 y R3 son independientemente metilo, etilo o propilo. En algunas realizaciones, R1, R2 y R3 son etilo. Pueden obtenerse derivados de OTMA de fuentes comerciales o prepararse por smtesis total o semismtesis.

Tipicamente, el agente segun la descripcion es una chaperona farmacologica. Como se usa en la presente memoria, los terminos "chaperona farmacologica" se refieren a una molecula, tal como una molecula pequena, protema, peptido, acido nucleico o carbohidrato, que entra en las celulas y se une de manera espedfica a una protema y presenta uno o mas de los siguientes efectos: (i) potenciar la formation de una conformation molecular estable de la protema; (ii) servir como andamiaje molecular (iii) inducir el trafico de la protema del RE a otra localization celular, preferiblemente una localizacion celular natural, es decir, evitar la degradation asociada al RE de la protema; (iv) evitar la agregacion de protemas mal plegadas y/o (v) recuperar o potenciar la funcion y/o actividad natural al menos parcial a la protema.

En otra realization, la chaperona farmacologica segun la descripcion es isofagomina (IFG; (3R,4R,5R)-5- (hidroximetil)-3,4-piperidinodiol). La IFG presenta una formula molecular de C 6 H 13 NO3 y un peso molecular de 147,17. Este compuesto se describe ademas en las Patentes de EE. UU., nums., 5.844.102 a Sierks et al., y 5.863.903, a Lundgren et al. Se describen derivados de N-alquil IFG en la Patente de EE. UU., num., 6.046.214.

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En otra realizacion, la chaperona farmacologica segun la descripcion se selecciona del grupo que consiste en derivados de hidroxipiperidina, que se describen en las publicaciones de patente internacional PCT en tramitacion WO 2005/046611 y WO 2005/046612 y en la solicitud de patente de EE. UU., numero de serie 10/988 428, presentada el 12 de noviembre de 2004. Otros ejemplos incluyen derivados de glucoimidazol y polihidroxiciclohexenilamina que se describen en la solicitud de patente de EE. UU., numero de serie 10/988 427 presentada el 12 de noviembre de 2004.

Otras chaperonas farmacologicas mas se describen en la Patente de EE. UU. num. 6.599.919 a Fan et al., e incluyen calistegina A 3, calistegina A 5, calistegina B 1, calistegina B 2, calistegina B 3, calistegina B 4, calistegina C 1, N-metil-calistegina B 2, DMDP, DAB, castanospermina, N-butil-isofagomina, N-(3-ciclohexilpropil)-isofagomina, N-(3-fenilpropil)-isofagomina y N-[(2E,6Z,10Z)-3,7,11-trimetildodecatrienil]-isofagomina.

En otra realizacion no limitante, la chaperona farmacologica puede ser un inhibidor de la glucosidasa. Actualmente, para el control de calidad de plegamiento de la glucoprotema, las glucosidasas son de eminente importancia (Roth J. et al., Histochem Cell Biol (2008) 129: 163-177; Marcus NY. Et al., the Journal of Biological Chemistry, vol 275 num., 3 (2000) 1987-1992). En otra realizacion, la chaperona farmacologica puede ser un N-alquil-derivado de 1,5- didesoxi-1,5-imino-D-glucitol. 1,5-Didesoxi-1,5-imino-D-glucitol (o 1-desoxinojirimicina o dNj) y sus N-alquil- derivados son inhibidores conocidos de las enzimas de tratamiento de oligosacaridos unidos en el N, alfa- glucosidasa I y II. Saunier et al., J. Biol. Chem. 257, 14155-14161 (1982); Elbein, Ann. Rev. Biochem. 56, 497-534 (1987). En una realizacion particular, dicho grupo alquilo contiene de 2-8 atomos de carbono y preferiblemente de 46 atomos de carbono. En otra realizacion particular, el grupo alquilo es butilo o hexilo. Finalmente, en otra realizacion, el N-alquil-derivado de 1,5-didesoxi-1,5-imino-D-glucitol es 1,5-(butilimino)-1,5-didesoxi-D-glucitol que tambien se conoce como miglustast (Zavesca™). Otros ejemplos de inhibidores de la glucosidasa incluyen polihidroxibenzofenonas como se describe en Hu et al. (Arch Pharme Chem Life Sci 2010 000 1-7).

En otra realizacion, la chaperona farmacologica segun la descripcion es un inhibidor de la glucosilceramida sintasa.

Por ejemplo, dicho inhibidor de la glucosilceramida sintasa puede ser tartrato de eliglustat como se describe en Cox TM. Curr Opin Investing Drugs, octubre de 2010; 11 (10): 1169-81 o peterschmitt MJ. Et al. Clin Pharmacol., 25 de octubre de 2010. Otros ejemplos tambien incluyen D-treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol (FDMP) y derivados de los mismos como se describe en Abe A. et al., Curr Drug Metab., septiembre de 2001; 2 (3): 331-8 tales como D-treo-3',4'-etilenodioxi-1-fenil-2-palmitoilamino-3-pirrolidino-1-propanol y D-treo-4'-hidroxi-1-fenil-2- palmitoilamino-3-pirrolidino-1-propanol. Otros ejemplos incluyen derivados de piperidina como se describe en la patente internacional WO02/055498 y 3,4,5-piperidinotriol, 2-(hidroximetil)-1-[(4-(pentiloxi)fenil)metil]-, (2S,3S,4R,5S) tal como se describe en la patente de EE. uU. 2007/0259918.

Los agentes para uso segun la invencion pueden administrarse en la forma de una composicion farmaceutica, como se define a continuacion. Los agentes de la invencion pueden combinarse con excipientes farmaceuticamente aceptables y opcionalmente matrices de liberacion prolongada, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.

De acuerdo con esto, un aspecto mas de la descripcion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un agente util segun la invencion para uso en un metodo para tratar pacientes con enfermedad de Darier.

El termino "Farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra reaccion perjudicial cuando se administran a un marnffero, especialmente un ser humano, cuando sea apropiado. Un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a una carga solida, semisolida o lfquida, diluyente, material de encapsulacion o agente auxiliar de formulacion de cualquier tipo, no toxico.

En las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion para administracion oral, sublingual, subcutanea, intramuscular, intravenosa, transdermica, local o rectal, el principio activo, solo o junto con otro principio activo, pueden administrarse en una forma de administracion unitaria, como una mezcla con soportes farmaceuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administracion unitarias, adecuadas, comprenden formas por via oral tales como comprimidos, capsulas de gel, polvos, granulos y suspensiones orales o disoluciones, formas de administracion sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administracion subcutanea, transdermica, topica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdermica, transdermica, intratecal e intranasal y formas de administracion rectal.

Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas contienen vehuculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion que puede ser inyectada. Estas pueden ser, en particular, disoluciones isotonicas, esteriles, salinas (fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, de potasio, de calcio o de magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que, en la adicion, dependiendo del caso, de agua esterilizada o disolucion salina fisiologica, permiten la constitucion de disoluciones inyectables.

Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso y polvos esteriles para la

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preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida hasta el punto de que exista aptitud para ser inyectado facil. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenaje y debe conservarse contra la accion contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las disoluciones que comprenden compuestos de la invencion como base libre o sales farmacologicamente aceptables pueden prepararse en agua mezcladas convenientemente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles lfquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de los microorganismos.

El agente de la invencion puede formularse en una composicion en una forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clortudrico o fosforico o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden proceder de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.

El portador tambien puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos puede producirse por varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede producirse por el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan disoluciones inyectables esteriles por incorporacion de los polipeptidos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilizacion filtrada. En general, las dispersiones se preparan por incorporacion de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vetuculo esteril que contenga el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado a vacfo y liofilizacion que proporcionan un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolucion filtrada esteril previamente del mismo.

En la formulacion, las disoluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en tal cantidad como sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones son administradas facilmente en una variedad de formas farmaceuticas, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero tambien pueden emplearse capsulas de liberacion de farmaco y similares.

Para administracion parenteral en disolucion acuosa, por ejemplo, la disolucion debena ser tamponada convenientemente si es necesario y hacer primero el diluyente lfquido isotonico con suficiente disolucion salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. En relacion con esto, los medios acuosos esteriles que pueden emplearse seran conocidos para los expertos en la materia a la luz de la presente descripcion. Por ejemplo, podfa disolverse una dosis en 1 ml de disolucion de NaCl isotonica y anadir a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectar en el sitio propuesto de infusion. Necesariamente tendra lugar alguna variacion en la dosis dependiendo de la enfermedad del individuo que se este tratando. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el individuo.

El agente de la invencion puede formularse dentro de una mezcla terapeutica para comprender aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o asf. Tambien pueden administrarse dosis multiples.

Ademas de los compuestos de la invencion formulados para administracion parenteral, tal como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para administracion oral; formulaciones de liposomas; capsulas de liberacion controlada y cualquier otra forma usada en la actualidad.

En una realizacion particular, puede ser deseable administrar el agente de la invencion en mezcla con un portador farmaceuticamente aceptable, topico. El portador farmaceuticamente aceptable, topico, es cualquier portador sustancialmente no toxico utilizable de manera convencional para administracion topica de productos farmaceuticos en que el agente de la invencion permanecera estable y biodisponible cuando se aplique directamente a superficies cutaneas. Por ejemplo, portadores tales como los conocidos en la tecnica eficaces para penetrar la capa de queratina de la piel en el estrato corneo pueden ser utiles en el suministro del agente de la invencion al area de

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interes. Dichos portadores incluyen liposomas. El agente de la invencion puede ser dispersado o emulsionado en un medio de una manera convencional para formar una preparacion Kquida o mezclada con un portador semisolido (gel) o solido para formar una pasta, polvo, pomada, crema, locion o similar.

Portadores farmaceuticamente aceptables topicos, adecuados, incluyen agua, disolucion salina tamponada, gelatina de petroleo (vaselina), petrolato, aceite de parafina, aceite vegetal, aceite animal, ceras organicas e inorganicas, tales como cera microcristalina, parafina y ozocerita, polfmeros naturales, tales como xantanas, gelatina, celulosa, colageno, almidon o goma arabiga, poUmeros sinteticos, alcoholes, polioles y similares. El portador puede ser una composicion de portador miscible en agua. Dicha composicion de portador farmaceuticamente aceptable, topica, miscible en agua, puede incluir las preparadas con uno o mas principios de ingredientes apropiados de tratamiento.

Debido a que las condiciones dermatologicas que se tienen que tratar pueden ser visibles, el portador topico puede ser tambien un portador topico aceptable. El portador topico aceptable sera cualquier portador sustancialmente no toxico convencionalmente utilizable para administracion topica en que el agente de la invencion permanecera estable y biodisponible cuando se aplique directamente a la superficie de la piel. Portadores cosmeticamente aceptables adecuados son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, lfquidos, cremas, aceites, lociones, pomadas, geles o solidos, cosmeticamente aceptables, tales como cremas cosmeticas de noche, bases de maquillaje, aceites bronceadores, filtros solares, lociones para las manos, maquillaje y bases de maquillaje, mascarillas y similares, convencionales. Los portadores aceptables topicos pueden ser similares o identicos por naturaleza a los portadores farmaceuticamente aceptables, topicos, descritos anteriormente.

Puede ser deseable tener un sistema de suministro que controle la liberacion de agente de la invencion a la piel y se adhiera a la misma o se mantenga sobre la piel durante un periodo de tiempo prolongado para aumentar el tiempo de contacto del agente de la invencion sobre la piel. La liberacion prolongada o retardada de agente de la invencion proporciona una administracion mas eficaz resultante de una dosificacion menos frecuente y/o disminuida de agente de la invencion y mejor cumplimiento del paciente. Ejemplos de portadores adecuados para liberacion prolongada o retardada en un entorno humedo incluyen gelatina, goma arabiga, polfmeros de xantana. Portadores farmaceuticos capaces de liberar el agente de la invencion cuando se exponen a cualquier entorno oleoso, graso, ceroso o humedo en el area que se este tratando, incluyen resina termoplastica o resina termoendurecible flexible o elastomero, incluyendo resinas termoplasticas tales como poli(haluros de vinilo), poli(esteres de vinilo), poli(haluros de vinilideno) y poliolefinas halogenadas, elastomeros tales como brasiliensis, polidienos y cauchos naturales y sinteticos halogenados y resinas termoendurecibles flexibles tales como poliuretanos, resinas epoxfdicas y similares. Se describen sistemas de suministro controlado, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. num. 5 427 778 que proporciona formulaciones de gel y disoluciones viscosas para suministro del agente de la invencion a un sitio de la piel. Los geles presentan las ventajas de tener un alto contenido en agua para mantener la humedad de la piel, la capacidad para absorber exudado de la piel, aplicacion facil y eliminacion facil por lavado. Preferiblemente, el portador de liberacion prolongada o retardada es un gel, liposoma, microesponja o microesfera. El agente de la invencion tambien puede administrarse junto con otros agentes farmaceuticamente eficaces incluyendo, pero no limitado a, antibioticos, otros agentes de curacion de la piel y antioxidantes.

Un objeto mas de la invencion se refiere a un metodo para tratar la enfermedad de Darier que comprende administrar a un individuo con necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente para uso segun la invencion.

Por una “cantidad terapeuticamente eficaz” se quiere decir una cantidad suficiente del agente para tratar la enfermedad de Darier a una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico.

Se entendera que el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente invencion se decidira por el medico interviniente dentro del alcance del buen criterio medico. El nivel de la dosis terapeuticamente eficaz, espedfico, para cualquier individuo particular dependera de una variedad de factores incluyendo el trastorno que se este tratando y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del individuo; el tiempo de administracion, via de administracion y tasa de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos usados en asociacion o coincidentes con el polipeptido espedfico empleado y factores similares conocidos en las artes medicas. Por ejemplo, esta bien dentro de la destreza de la tecnica empezar con dosis del compuesto a niveles menores que los requeridos para conseguir el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se consiga el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos puede variarse por un amplio intervalo de 0,01 a 1000 mg por adulto al dfa. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 25,0; 50,0; 100; 250 y 500 mg del agente para el ajuste sintomatico de la dosis al individuo que se esta tratando. Un medicamento contiene tfpicamente desde aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del agente, preferiblemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del agente. Una cantidad eficaz del farmaco se suministra ordinariamente a un nivel de dosis de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al dfa, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal al dfa.

La invencion se ilustrara ademas por las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no debenan interpretarse de ningun modo como limitantes del alcance de la presente invencion.

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Ejemplo 1: La disfuncion de SERCA2 en la enfermedad de Darier produce estres constitutivo y uniones adherentes inmaduras: reversion por moleculas de chaperona

Material y metodos

Pacientes de ED y diagnostico molecular. Se tomaron biopsias de pacientes de Darier de la piel no afectada (perilesional). Se obtuvieron biopsias de control de piel normal de cinco controles con igual edad y sexo. Se investigaron en los cinco pacientes de Darier (D1 a D5) mutaciones en el gen ATP2A2 por secuenciacion de los 21 exones y flanqueando sitios de empalme de ATP2A2. En el siguiente estudio, se han comparado los queratinocitos de estos cinco pacientes de ED (D1 a D5) con queratinocitos normales de seis controles sanos (QN).

Cultivo celular. Se cultivaron queratinocitos en medio 0,06 mM de CaCl2 EpiLife (Invitrogen) a confluencia del 6080% y se incubaron despues en medio 1,2 mM de CaCl2 EpiLife durante 4 horas para inducir la formacion de contactos celula-celula. Los experimentos se realizaron a pases comparables entre QN y QD.

Tratamientos con farmacos. Para la induccion de estres del RE, se cultivaron queratinocitos en medio de alto contenido en Ca2+ (1,2 mM) con tapsigargina (TG, Sigma) a 1 pM durante diferentes periodos de tiempo. Para la inhibicion de bomba de SERCA en Qn, se trataron previamente los queratinocitos con 100 nM de TG durante 30 min en medio de bajo contenido en Ca2+ (0,06 mM). Se retiro el medio y se incubaron las celulas en medio de alto contenido en Ca2+ (1,2 mM) durante unas 4 horas adicionales para inducir la formacion de contactos celula-celula. Para tratamiento de moleculas de chaperona, se trataron previamente los queratinocitos con 4-fenilbutirato de sodio (AFB, 5 mM, Calbiochem), Miglustat y su analogo de iminoazucar inactivo (NB-DGJ) (500 pM, un obsequio de F. Becq) durante 24 h antes de cambiar el medio para medio de alto contenido en Ca2+ (1,2 mM).

Inmunofluorescencia. Se cultivaron queratinocitos sobre cubreobjetos, se fijaron con paraformaldetudo al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 10 minutos. Despues de bloquear con suero fetal bovino al 1% en PBS, se incubaron las celulas con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Con posterioridad, se incubaron las celulas con el anticuerpo secundario conjugado de Alexa apropiado a temperatura ambiente durante 1 hora. Para la coloracion con actina, se incubaron las celulas con faloidina-TRITC a temperatura ambiente durante 1 hora. Por ultimo, se montaron los cubreobjetos sobre tiras de vidrio usando ajuste Vectashield Hard (Vector laboratories) y se examinaron usando un microscopio confocal Zeiss LSM 710 con un objetivo 40 Plan-Apochromat (aceite 1,3) o un objetivo 63 Plan-Apochromat (aceite 1,4), junto con una ampliacion x2.

Cuantificacion de volumenes de compartimentos intracelulares y colocalizacion. Para cuantificaciones de volumen, se formaron imagenes de todas las reconstrucciones de la serie Z con un agujerito de 1 unidad de Airy con una etapa Z optima. Se abrieron archivos de la serie Z LSM en el programa informatico Imaris 7.1.1 (Bitplane Inc.) como volumenes y despues se tomaron isosuperficies usando un filtro gaussiano de 0,2 pm. Se inspecciono de manera visual la isosuperficie de cada compartimento intracelular para asegurar que siguiera proximo a la imagen tridimensional original subyacente y no incorporara voxeles fuera de la region del compartimento intracelular observable. Se selecciono cada isosuperficie y se registro estadfsticamente el volumen. Se realizo cuantificacion de las senales de colocalizacion usando el programa informatico Metamorph (Molecular Devices). En una unica seccion optica, se calcula la superficie de la senal roja (E-cadherina) que se combina con una senal verde (Calnexina).

Metodos Western. Se lisaron queratinocitos en tampon conteniendo Tris 50 mM (pH 8), NaCl 120 mM, NP-40 al 0,5%, coctel de inhibidores de proteasa Complete™ (Roche) y coctel 2 de inhibidor de fosfatasa (Sigma) durante 30 minutos sobre hielo y se granularon por centrifugacion. Se recogio el sobrenadante para la cuantificacion de la cantidad de protema por la prueba de Bradford. Se anadieron cantidades iguales de protema soluble a tampon Laemmli (Tris HCl 62,5 mM, pH 6,8, ®-mercaptoetanol al 5%, SDS al 2%, glicerol al 10% y azul de bromofenol al 0,002%). Se separaron muestras por SDS-PAGE y se transfirieron sobre membrana Hybond-C extra (GE Healthcare). Se uso inmunodeteccion de p-actina como un control de carga. Se desarrollaron manchas por quimioluminiscencia (ECL Advance, GE Healthcare o SuperSignal West Dura, Pierce).

RT-PCR. Se aislo el ARN de queratinocitos usando TRIzol (Invitrogen) y se transcribio inverso usando iniciadores de hexamero y virus RT de leucemia de murina Moloney. Se realizo multiplicacion PCR.

Transduccion de queratinocitos con vectores retrovirales. Para transduccion de queratinocitos, se complemento medio acondicionado que contema retrovirus recombinante con 4 pg/ml de polybrene. Se cambio el medio 16 h despues de la adicion del virus y se dejo que las celulas expresaran la protema de interes durante 72 h antes de experimentos de inmunofluorescencia. La eficacia de infeccion tfpica fue 90%, cuando se valoro usando el gen indicador GFP.

Analisis estadfstico. Se uso la prueba t de Student para datos no pareados de dos colas para analisis estadfstico. Los valores de P de 0,05 o menos se consideraron significativos. Los asteriscos representan la significacion estadfstica frente al control apropiado en cada caso * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001.

Aprobacion del estudio. Este estudio se realizo segun los principios eticos de la Declaracion de Helsinki y fue aprobado por el comite etico medico del Hospital Purpan en Toulouse. Todos los pacientes dieron su consentimiento

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Resultados

Los queratinocitos de Darier muestran una respuesta al estres del RE constitutivo.

La [Ca2+]RE disminuida, un rasgo caractenstico de QD (3-6), desencadena estres del RE en muchas celulas (18, 19). Se muestra que la perdida de un alelo ATP2A2 en QD es suficiente para aumentar la fosforilacion de eIF2a e IRE1, es decir, en ausencia de factor estresante exogeno, cuando se compara con queratinocitos normales (QN). Este resultado describe un estres del RE constitutivo en QD. Despues de exposicion a tapsigargina (TG), un inhibidor altamente espedfico de bombas SERCA (20), se aumenta la fosforilacion de eIF2a e IRE1 en QD hasta el punto que es mayor que en QN (2 a 3 veces en QD y 1,5 veces en QN para fosfo-eIF2a). Ademas, la forma activa, empalmada, de ARNm de XBP1, el objetivo de ARNasa fosforilada IRE1, aumento en QD comparado con QN, despues de tratamiento de TG, consistente con la activacion creciente de IRE1 observada en qD. La fosforilacion de eIF2a e IRE1 y el empalme de XBP1 aumentaron en QD de los cinco pacientes estudiados (D1 a D5), estableciendo que los QD son mas susceptibles de respuesta al estres del RE inducida por factores estresantes que QN.

La inmunocoloracion para marcadores espedficos calnexina, ERGIC-53, GM130 y TGN46 mostro respectivamente, que el RE, ERGIC (compartimento intermedio de Golgi del RE, por sus siglas en ingles), compartimentos c/s-Golgi y frans-Golgi se localizan estrictamente en una zona perinuclear en QN. Por el contrario, la coloracion de calnexina es difusa por todo el citoplasma en QD en condiciones basales. La coloracion espedfica para cada compartimento pos- RE muestra puntos dispersados por todo el citoplasma, indicando su fragmentacion. Las mediciones cuantitativas mostraron un aumento significativo en los volumenes de cada compartimento. Todos estos cambios morfologicos se han descrito como inducidos por estres del RE en diferentes tipos de celulas (18, 21).

Cabe senalar que, el numero de celulas confluentes por campo fue siempre mas pequeno para QD que para QN, que sugiere que QD se extiende mas que QN, en un numero de pases comparable.

Ademas, estos datos muestran que QD muestra diferentes caractensticas de respuesta al estres del RE en condiciones exentas de factor estresante.

La formacion de uniones adherentes inducidas por Ca2+ esta disminuida en QD.

El desplazamiento de 0,06 mM a 1,2 mM de concentracion de calcio extracelular induce contactos celula a celula y la formacion de complejos de adhesion. La presencia de un estres del RE constitutivo en QD es probable que altere importantes funciones del RE, tales como plegamiento de protemas secretoras y (trans)membrana (revisado en (18)). Siendo la perdida de adhesion celula a celula (acantolisis) el principal rasgo histologico en lesiones cutaneas de Darier, se investigo primero la localizacion de E-cadherina, la protema transmembrana de UA cuyo direccionamiento a la membrana plasmatica es una de las respuestas celulares mas tempranas a aumento de Ca2+ que conduce a adhesion celular. En condiciones de bajo contenido en calcio (0,06 mM), la E-cadherina fue distribuida de manera difusa en el citoplasma en QN y QD. Despues de 4 horas en medio de alto contenido en calcio (1,2 mM) para inducir adhesion celula-celula, las moleculas de E-cadherina se desplazaron a la membrana plasmatica en QN, con una coloracion fina alrededor de la periferia celular, formando un cinturon continuo a lo largo de las fronteras celula-celula. La coloracion de la E-cadherina en QD fue drasticamente diferente comparado con QN: se detectaron agrupaciones puntuadas en las fronteras celula-celula, con organizacion anormal en hebras dispuestas de manera perpendicular, o a diferentes angulos, al borde de la celula. Al contrario que para QN, el espacio intercelular observado entre QD adyacentes puso de manifiesto perdida de adherencia entre estas celulas.

La localizacion de diferentes cateninas implicadas en los complejos de UA tambien se modifico en QD. Despues de incubacion en medio con alto contenido en calcio (1,2 mM), las protemas de catenina se desplazaron a la membrana plasmatica en QN y formaron un cinturon continuo lineal delgado a lo largo de las fronteras celula-celula, mientras en QD todos los patrones de coloracion de catenina mostraron un patron puntuado bajo la membrana plasmatica. En condiciones de bajo contenido en calcio (0,06 mM), las p-, a- y p120-cateninas se distribuyeron de manera difusa en el citosol en QN y QD.

Durante la formacion de UA, la union secuencial de cateninas a E-cadherina induce polimerizacion de actina como se observa en QN, en que F-actina aparece como haces corticales delgados bajo, y paralelos a, la membrana plasmatica. Por el contrario, los filamentos de F-actina formaron haces gruesos y desorganizados en QD. Estos hallazgos proporcionan evidencia para la localizacion incorrecta de componentes de UA, que revela la formacion anormal de estas estructuras de adhesion tempranas en QD con un efecto sobre la organizacion de los filamentos de F-actina.

Los niveles de expresion de cada protema de UA fueron similares entre QN y QD como se revelo por analisis de inmunotransferencia que sugieren que la formacion de UA anormal en QD no es una consecuencia del nivel de expresion reducido. Cabe destacar que, despues de 4 horas de exposicion a 1,2 mM de Ca2+ (tiempo para permitir la formacion de UA), se aumento la fosforilacion de eIF2a en QD comparado con QN. Asf, la disminucion de formacion de UA inducida por Ca2+ se correlaciona con la respuesta aumentada al estres del RE en QD.

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La tapsigargina inhibe la formacion de uniones adherentes en QN

Para ensayar si el conjunto de UA defectuoso en QD es una consecuencia directa de perdida de funcion de SERCA2, se trato QN con TG para inhibir de manera espedfica bombas SERCA. TG indujo un agrandamiento del compartimento del RE caracterizado por un aumento de dos veces el volumen del RE en QN tratado con TG comparado con QN no tratado. Cabe destacar que, el numero de celulas confluentes por campo del microscopio fue siempre mas pequeno en QN tratado con TG que en QN no tratado, como se observo entre QD y QN. El analisis de inmunofluorescencia de UA en QN pretratado con TG cultivado en Ca2+ 1,2 mM revelo anormalidades de UA similares a las de QD: la E-cadherina y las cateninas se organizaron en hebras dispuestas en un angulo con el borde de la celula, la coloracion fue puntuada en las fronteras celula-celula y la red de F-actina aparecio desorganizada en el citosol. Estos resultados demuestran que la extension del RE y la formacion de UA defectuosas observadas en QD son una consecuencia directa de la perdida de funcion de SERCA2.

La formacion de la union adherente disminuida en QD se debe a un defecto selectivo de trafico de E-cadherina a la membrana plasmatica.

La E-cadherina recien sintetizada requiere unir p-catenina para facilitar su transporte fuera del RE a la membrana plasmatica (22). Para distinguir entre un defecto selectivo en trafico de E-cadherina y salida deficiente del RE producida por ausencia de reclutamiento de p-catenina en la membrana plasmatica, se expreso un mutante de E- cadherina fijado como objetivo en la membrana plasmatica independientemente de union de p-catenina (23). Se transdujeron QN y QD con partfculas vmcas (MSCV-EcadM-GFP) que codificaban este mutante de E-cadherina, en condiciones de bajo contenido en calcio (0,06 mM) para evitar localizacion de membrana plasmatica de E-cadherina endogena. Se observo una coloracion pericelular, delgada, de mutante de E-cadherina en la membrana plasmatica, ademas de una fraccion citosolica, como se indico previamente en estirpes de queratinocitos (23). Curiosamente, la p-catenina se relocalizo en la membrana plasmatica en QD como se observo en QN. QN y QD transducidos con un vector MSCV-IRES-GFP de control, expresando GFP solo, no mostraron ni coloracion de E-cadherina ni relocalizacion de p-catenina en la membrana plasmatica en condiciones de bajo contenido en calcio. Estos resultados muestran que p-catenina endogena en QD se puede localizar en la membrana plasmatica en coloracion lineal, que demuestra que la formacion deficiente de UA en QD se debe a un defecto selectivo en el trafico de E- cadherina a la membrana plasmatica.

La E-cadherina es retenida en el RE en QD y en QN tratado con TG

Usando un anticuerpo contra la region intracelular de E-cadherina, se confirmo la coloracion espesa y puntuada de E-cadherina en la membrana plasmatica en QD y QN tratado con TG comparado con QN. Ademas, se observo retencion intracelular de E-cadherina en QD y en Qn tratado con TG como senal perinuclear que estaba ausente de QN, indicando el trafico deficiente de E-cadherina a la membrana plasmatica.

Para identificar el compartimento en el que se retiene E-cadherina en QD, se realizo coinmunofluorescencia para E- cadherina y calnexina, un marcador del RE. La E-cadherina intracelular colocalizada con calnexina en QD y QN tratado con TG. La cuantificacion de superficie intracelular de E-cadherina que se superpone con el compartimento positivo de calnexina demostro una retencion significativa de E-cadherina en el RE en QD de los cinco pacientes estudiados y en QN tratado con TG.

El tratamiento de QD con moleculas de chaperona recupera la formacion de uniones adherentes

Las chaperonas qrnmicas tales como acido 4-fenilbutmco (AFB) alivian el estres del RE y recuperan el plegamiento de las protemas y la estabilidad en modelos de enfermedad (24, 25). El AFB es, por lo tanto, una herramienta elegante para examinar las consecuencias funcionales de estres del RE en la formacion de UA en QD. El tratamiento de AFB de QD disminuyo la fosforilacion de eIF2a inducida por TG y recupero la condensacion perinuclear del RE, similar a QN. Ademas, el QD tratado con AFB adquirio una forma poligonal pronunciada (caractenstica de adhesion celula a celula) cuyos rasgos son: una coloracion pericelular lineal, aguda y mas intensa de E-cadherina y cateninas; haces corticales de F-actina paralelos y mas proximos a la membrana celular. En conjunto estos datos muestran que el AFB disminuye el estres del RE y corrige la formacion de UA en QD.

Tambien se ensayo la chaperona farmacologica Miglustat (N-butildesoxinojirimicina, Zavesca®). Esta molecula ha sido propuesta para uso clmico en fibrosis dstica debido a su capacidad para corregir el trafico defectuoso de AF508-CFTR(26). No se redujo ni la fosforilacion de eIF2a inducida por TG ni la expansion del RE en QD tratado con Miglustat. Sin embargo, Miglustat indujo una coloracion pericelular continua, intensa, estrecha, de todos los componentes de la UA en la membrana plasmatica de QD, asf como polimerizacion de la red de F-actina. Su analogo inactivo (NB-DGJ) no tuvo efecto sobre la localizacion de E-cadherina. Estos resultados se obtuvieron con Miglustat 500 |jM, una concentracion a la que todas las celulas presentaron un fenotipo poligonal. A concentracion menor (100 jM), Miglustat indujo localizacion aumentada de la membrana plasmatica de E-cadherina solo en un numero limitado de celulas. No se observo toxicidad de las moleculas de chaperona hacia los queratinocitos para estos protocolos.

Los efectos de AFB y Miglustat se observaron de manera reproducible en los queratinocitos de los cinco pacientes

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de ED estudiados. Cabe senalar que, ni AFB ni Miglustat aumentaron la expresion de E-cadherina y SERCA2 en QD. Estos resultados demuestran el total de rescate de formacion de UA por moleculas de chaperona en QD.

Discusion

Este estudio demuestra por primera vez que el QD mostro una respuesta al estres del RE constitutivo que conduce a formacion de UA defectuosa y ese tratamiento con moleculas de chaperona recupera la formacion de UA maduras.

La [Ca2+]RE desempena una funcion importante en las funciones relacionadas con el RE (27), remodelado del RE (28), arquitectura del compartimento pos-RE (21) y respuesta al estres del RE (18, 19). Aqm, se muestra que, la disfuncion de SERCA2, por disminucion de [Ca2+]RE (5, 6), indujo una tension del RE constitutiva. En el QD, el RE es difuso por todo el citoplasma, todos los compartimentos possecretores del RE estan desorganizados y fragmentados y se aumenta el tamano celular comparado con QN, como se describio previamente en otras celulas con estres del RE (29). La expansion del RE y el agrandamiento celular se recapitularon en QN tratado por un inhibidor de SERCA2, que demuestra que estos cambios morfologicos son una consecuencia directa de la perdida de funcion de SERCA2 en QD.

El comienzo de la enfermedad de Darier es normalmente alrededor de la pubertad y realiza un curso recidivante cronico, con exacerbaciones por factores estresantes tales como irradiacion UVB, calor, friccion e infecciones. De manera destacable, en condiciones basales, se aumenta la fosforilacion de eIF2a e IRE1 en QD, que demuestra que una perdida de un alelo ATP2A2 es suficiente para inducir una respuesta al estres del RE en condiciones sin factor estresante. Los factores desencadenantes de manifestaciones clmicas podfan actuar exacerbando el estres del RE constitutivo de QD, como se observo con TG. Consistente con esta nocion, se sabe que la irradiacion UVB induce una respuesta al estres del RE (30). La presencia de queratinocitos redondeados (cuerpos redondos), que son caractensticos de ED y que se cree que corresponden a celulas apoptoticas, podfa resultar de una respuesta al estres del RE no controlada desencadenada por factores externos, conduciendo a muerte celular programada.

Las secciones de la piel de pacientes de Darier se caracterizan de manera histologica por acantolisis, que conduce a grietas suprabasales. La formacion de UA, uno de los casos mas tempranos siguiendo al incremento en la concentracion extracelular de calcio (11), se sabe que transcurre por diferentes fases, siendo las UA inmaduras una de las mas tempranas42. En QD, se observaron dos filas de moleculas de E-cadherina/catenina colocalizadas como puntos en los bordes de los contactos celula-celula y los filamentos de actina se aproximaron a contactos de la celula inicial perpendicularmente (31-34). Estos son rasgos de la primera etapa de formacion de UA y tfpico de UA inmaduras. Por contraste, en las mismas condiciones, el QN mostro coloracion lineal de E-cadherina y cateninas en la membrana plasmatica, que es caractenstico de UA maduras. Se concluyo que QD forma UA inmaduras, que predispone la epidermis de ED a adhesion intercelular defectuosa cuando se expuso a factores desencadenantes. QN tratado con TG desarrollo la misma UA inmadura, que demuestra que la perdida de funcion de SERCA2 es la causa de defecto en la formacion de UA.

Se proporciono evidencia de que la formacion de UA inmaduras en QD se debe al trafico defectuoso de E-cadherina a la membrana plasmatica: 1) los niveles de expresion de protemas de componentes de UA son comparables entre QD y QN; 2) la respuesta al estres del RE activada en Qd y en QN tratado con TG conduce a retencion de E- cadherina en el RE y 3) la expresion de E-cadherina recombinante que localiza de manera constitutiva la membrana celular en condiciones de bajo contenido en Ca2+ es suficiente para trasladar p-catenina endogena a la membrana celular.

El tratamiento actual para la ED no es satisfactorio y se basa principalmente en el uso de retinoides topicos u orales (acitretina o isotretinoma) que con frecuencia no son tolerados y no son completamente eficaces (35). Se ha demostrado que el AFB actua como una chaperona qmmica en varias enfermedades de mal plegamiento de protemas, que permite el plegado de la protema mutada y su localizacion apropiada en la celula por liberacion del estres del RE (24-26, 36). Se demostro aqm que el AFB atenua la respuesta al estres del RE en QD, como se pone de manifiesto por la disminucion de la fosforilacion de eIF2a y el volumen del RE y restaura el trafico de protemas de UA a la membrana plasmatica para formar UA maduras. Estos datos establecen una funcion causal para el estres del RE en la formacion de UA inmaduras. Ademas, Miglustat, una chaperona farmacologica conocida por permitir la localizacion apropiada de CFTR (26) mutado, restaura el trafico de moleculas de la UA a la membrana plasmatica y la formacion de UA maduras en QD. Se demuestra por primera vez que estas moleculas de chaperona pueden restaurar la localizacion apropiada de una protema no mutada retenida en el RE como resultado de un estres del RE inducido por agotamiento de Ca2+.

Los mecanismos precisos de accion de estas moleculas no estan claros. Aunque se ha descrito el AFB como un regulador (37) de la transcripcion, no se modifica la expresion ni de E-cadherina ni de SERCA2 en QD tratado con AFB. Por el contrario, la respuesta al estres del RE disminuida y el traslado de moleculas de las UA a la membrana plasmatica en QD tratado con AFB sugiere que el AFB podfa actuar por su actividad de chaperona qmmica evitando la agregacion de protemas mutantes mal plegadas y aliviando el estres del RE, como se indico previamente (38).

En la fibrosis qmstica, Miglustat evita la interaccion entre AF508-CFTR y calnexina, una protema de chaperona de RE dependiente de Ca2+, que permite un AF508-CFTR funcional para alcanzar la membrana plasmatica (26). En

QD, Miglustat puede liberar la E-cadherina de calnexina, permitiendo as^ su trafico del RE a la membrana plasmatica.

En conclusion, estos resultados establecen que un estres del RE constitutivo produce formacion de UA inmaduras en QD. El estres del RE sena un mecanismo general que justificara la formacion defectuosa de UA, pero tambien el 5 trafico deficiente de desmoplaquina como se describio previamente (10), perdida subyacente de adhesion celula a celula en la epidermis de ED. Este trabajo pone en evidencia el papel crucial de la concentracion en Ca2+ del RE en la fisiopatologfa de la ED y permite clasificar la ED como una enfermedad relacionada con el estres del RE que implica mal plegamiento de protemas. Ademas, debido a que las moleculas de chaperona han sido usadas con exito ya en animales y/o ensayos clmicos (24, 25, 39-41), este estudio proporciona una importante prueba del principio 10 que soporta una futura aplicacion clmica en pacientes de Darier.

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REFERENCIAS

Por toda esta solicitud, varias referencias describen el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion. Las descripciones de estas referencias se incorporan por la presente por referencia en la presente descripcion.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un agente que es capaz de recuperar el trafico de E-cadherina en queratinocitos de Darier y la formacion de uniones adherentes para uso en el tratamiento de un paciente con enfermedad de Darier, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en chaperonas qmmicas y chaperonas farmacologicas, siendo la chaperona 5 qmmica acido 4-fenilbutmco (AFB) y siendo la chaperona farmacologica 1,5-(butilimino)-1,5-didesoxi-D-glucitol (miglustat).