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ES2639310T3 - Nanopartículas fluorescentes basadas en sílice - Google Patents

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ES2639310T3
ES2639310T3 ES10794842.4T ES10794842T ES2639310T3 ES 2639310 T3 ES2639310 T3 ES 2639310T3 ES 10794842 T ES10794842 T ES 10794842T ES 2639310 T3 ES2639310 T3 ES 2639310T3
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ES
Spain
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nanoparticle
peg
silica
nanoparticles
tumor
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Active
Application number
ES10794842.4T
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English (en)
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Michelle Bradbury
Ulrich Wiesner
Oula Penate Medina
Hoosweng Ow
Andrew Burns
Jason Lewis
Steven Larson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cornell University
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Cornell University
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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Publication date
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Abstract

Una nanopartícula fluorescente basada en sílice que comprende: un núcleo basado en sílice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del núcleo basado en sílice; una cubierta de sílice que rodea al menos una porción del núcleo; un polímero orgánico unido a la nanopartícula; una molécula de ligando unida a la nanopartícula; y un agente de contraste o un quelato unido a la nanopartícula; en la que hay unidas de alrededor de 1 a alrededor de 20 moléculas de ligando a la nanopartícula.

Description

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DESCRIPCION
Nanopartmulas fluorescentes basadas en s^lice Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a nanopartmulas fluorescentes basadas en sflice, y a metodos de uso de las nanopartmulas para detectar, diagnosticar, o tratar enfermedades tales como el cancer.
Antecedentes de la invencion
La deteccion precoz de tumores y la seleccion del tratamiento es primordial para conseguir un exito terapeutico y tasas de supervivencia a largo plazo. En su etapa temprana, muchos canceres estan localizados y se pueden tratar quirurgicamente. Sin embargo, a menudo es diffcil visualizar margenes tumorales bien definidos con las tecnicas actuales de imagenolog^a. Esto ha conducido a un numero desproporcionado de biopsias invasivas. Son necesarias sondas muy espedficas, selectivas molecularmente, para la deteccion precoz de diferencias moleculares entre las celulas normales y las tumorales, tales como las alteraciones espedficas del cancer en los niveles de expresion de receptores. Cuando se combinan con las tecnicas de imagenologfa de alta resolucion, las sondas espedficas selectivas molecularmente mejoraran enormemente la sensibilidad de deteccion, facilitando la caracterizacion, monitorizacion y tratamiento del cancer.
Las sondas actuales de imagenologfa de fluorescencia consisten en general en un fluoroforo convencional individual (p.ej., colorantes organicos, protemas fluorescentes), protemas fluorescentes (p.ej., GFP) y puntos cuanticos semiconductores (puntos Q). Los fluoroforos individuales normalmente son inestables y tienen un brillo limitado para la imagenologfa. De manera similar a los colorantes, las protemas fluorescentes tienden a exhibir interacciones del estado excitado que pueden conducir a parpadeo estocastico, apagamiento y fotoblanqueo. Los puntos Q se hacen en general de iones metalicos pesados tales como Pb2+ o Cd2+ y por lo tanto son toxicos. Burns et al. "Fluorescent core-shell silica nanoparticles: towards "Lab on a Particle" architectures for nanobiotechnology", Chem. Soc. Rev., 2006, 35, 1028-1042.
Se conocen nanopartmulas fluorescentes que tienen una cubierta electricamente conductora y un nucleo de sflice, y tienen utilidad en la administracion modulada de un agente terapeutico. Patentes de EE.UU. n°s 6.344.272 y 6.428.811. Un defecto de las nanopartmulas fluorescentes existentes es su brillo limitado y su baja detectabilidad como sondas fluorescentes en sistemas dispersos.
Las presentes nanopartmulas basadas en sflice fluorescentes multifuncionales ofrecen muchas ventajas sobre otras sondas fluorescentes. Las nanopartmulas son atoxicas, y tienen propiedades fotoffsicas excelentes (lo que incluye la eficacia fluorescente y fotoestabilidad), una biocompatibilidad elevada, y una farmacocinetica unica para el diagnostico y la terapia molecular. Las nanopartmulas son de un tamano relativamente pequeno, y tienen un revestimiento de PEG superficial que ofrece un aclaramiento renal excelente. Las nanopartmulas fluorescentes de la presente invencion contienen un nucleo fluorescente y una cubierta de sflice. Las arquitecturas nucleo-cubierta, la gran area superficial y la qrnmica superficial diversa de la nanopartmula permiten administrar multiples funcionalidades simultaneamente a una celula objetivo. Por ejemplo, la nanopartmula se puede funcionalizar con restos selectivos, agentes de contraste para la formacion medica de imagenes, agentes terapeuticos, u otros agentes. Los restos selectivos de la superficie de la nanopartmula pueden ser ligandos de tumores, que, cuando se combinan con agentes terapeuticos conjugados a nanopartmulas, hacen de la nanopartmula un vehmulo ideal para la seleccion como objetivo y potencialmente el tratamiento del cancer. Webster et al. Optical calcium sensors: development of a generic method for their introduction to the cell using conjugated cell penetrating peptides. Analyst, 2005;130:163-70. La nanopartmula basada en sflice se puede marcar con agentes de contraste para la imagenologfa de PET, SPECT, CT, MRI, y optica.
Sumario de la invencion
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanopartmula fluorescente basada en sflice que comprende un nucleo basado en sflice que tiene un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice; una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; de alrededor de 1 a alrededor de 20 ligandos unidos a la nanopartfcula; y un agente de contraste o un quelato unido a la nanopartfcula. El diametro de la nanopartfcula oscila de alrededor de 1 nm a alrededor de 25 nm, o de alrededor de 1 nm a alrededor de 8 nm. Los polfmeros organicos que se pueden unir a la nanopartfcula incluyen poli(etilen glicol) (PEG), polilactato, poli(acidos lacticos), carbohidratos, lfpidos, poli(acido glutamico) (PGA), poli(acido glicolico), poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), poli(acetato de vinilo) (PVA), o las combinaciones de los mismos.
El ligando puede ser capaz de unirse a al menos un componente celular, tal como un marcador tumoral. El numero de ligandos unidos a la nanopartfcula tambien puede oscilar de alrededor de 1 a alrededor de 10. Los ejemplos del ligando incluyen un peptido, protema, biopolfmero, polfmero sintetico, antfgeno, anticuerpo, microorganismo, virus, receptor, hapteno, enzima, hormona, compuesto qrnmico, patogeno, toxina, modificador superficial, o combinaciones de los mismos. La presente invencion abarca peptidos tales como el tripeptido RGD, el peptido dclico cRGD,
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octreotato, EPPT1 y los analogos pepffdicos de alfa-MSH. Cualquier peptido lineal, dclico o ramificado que contenga la secuencia RGD se halla dentro del alcance de la presente invencion.
Se puede unir un agente de contraste, tal como un radionuclido que incluye 89Zr, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I y 177Lu, a la nanoparffcula. De manera alternativa, la nanoparffcula se une a un quelato, por ejemplo, DFO, DOTa, TETA y DTPA, que esta adaptado para la union de un radionuclido. La nanoparffcula de la presente invencion se puede detectar mediante tomograffa de emision de positrones (PET), tomograffa computerizada de emision monofotonica (SPECT), tomograffa computerizada (CT), imagenologfa de resonancia magnetica (MRI), imagenolog^a optica (tal como la imagenologfa de fluorescencia, que incluye la imagenologfa de fluorescencia en el infrarrojo cercano (FIRC)), imagenologfa de bioluminiscencia, o combinaciones de las mismas.
Se puede unir un agente terapeutico a la nanoparffcula. Los agentes terapeuticos incluyen antibioticos, agentes antimicrobianos, antiproliferativos, antineoplasicos, antioxidantes, factores de crecimiento de celulas endoteliales, inhibidores de trombina, inmunosupresores, agentes anti-agregacion plaquetaria, inhibidores de la smtesis de colageno, anticuerpos terapeuticos, donantes de oxido mtrico, oligonucleotidos inversos, agentes de cicatrizacion de heridas, construcciones de transferencia de genes terapeuticos, componentes de la matriz extracelular, vasodilatadores, tromboffticos, antimetabolitos, agonistas de factores de crecimiento, antimitoticos, estatinas, esteroides, agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ACE), depuradores de radicales libres, agonistas de PPAR-gamma, ARN pequeno de interferencia (siARN), microARN, y agentes quimioterapicos antineoplasicos. Los agentes terapeuticos abarcados por la presente invencion tambien incluyen radionuclidos, por ejemplo, 90Y, 131I y 177Lu. El agente terapeutico se puede radiomarcar, tal como mediante la union a radiofluor 18F.
Tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto, la semivida de permanencia en la sangre de la nanoparffcula puede oscilar de alrededor de 2 horas a alrededor de 25 horas, de alrededor de 3 horas a alrededor de 15 horas, o de alrededor de 4 horas a alrededor de 10 horas. La semivida de permanencia en el tumor de la nanoparffcula tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto puede oscilar de alrededor de 5 horas a alrededor de 5 dfas, de alrededor de 10 horas a alrededor de 4 dfas, o de alrededor de 15 horas a alrededor de 3,5 dfas. La proporcion de la semivida de permanencia en el tumor respecto de la semivida de permanencia en la sangre de la nanoparffcula tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto puede oscilar de alrededor de 2 a alrededor de 30, de alrededor de 3 a alrededor de 20, o de alrededor de 4 a alrededor de 15. El aclaramiento renal de la nanoparffcula tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto puede oscilar de alrededor del 10% de DI (dosis inicial) a alrededor del 100% de DI en alrededor de 24 horas, de alrededor del 30% de DI a alrededor del 80% de DI en alrededor de 24 horas, o de alrededor del 40% de DI a alrededor del 70% de DI en alrededor de 24 horas. En una realizacion, tras administrar la nanoparffcula a un sujeto, la semivida de permanencia en la sangre de la nanoparffcula oscila de alrededor de 2 horas a alrededor de 25 horas, la semivida de permanencia en el tumor de la nanoparffcula oscila de alrededor de 5 horas a alrededor de 5 dfas, y el aclaramiento renal de la nanoparffcula oscila de alrededor del 30% de DI a alrededor del 80% de DI en alrededor de 24 horas.
Cuando las nanoparffculas se administran a un sujeto en una cantidad de alrededor de 100 veces la dosis humana equivalente, no se observa sustancialmente anemia, perdida de peso, agitacion, respiracion incrementada, alteracion GI, comportamiento anormal, disfuncion neurologica, anormalidades hematologicas, anormalidades bioqmmicas, lesiones relacionadas con farmacos en la patologfa de organos, mortalidad, o combinaciones de las mismas, en el sujeto en alrededor de 10 a alrededor de 14 dfas.
El aumento de la multivalencia de la nanoparffcula puede oscilar de alrededor de 2 veces a alrededor de 4 veces.
Tambien se describe una nanoparffcula fluorescente basada en sflice que comprende un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice; una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo; un poffmero organico unido a la nanoparffcula; y un ligando unido a la nanoparffcula, en el que la nanoparffcula tiene un diametro de entre alrededor de 1 nm y alrededor de 15 nm. Tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto, la semivida de permanencia en la sangre de la nanoparffcula oscila de alrededor de 2 horas a alrededor de 25 horas, la semivida de permanencia en el tumor de la nanoparffcula oscila de alrededor de 5 horas a alrededor de 5 dfas, y el aclaramiento renal de la nanoparffcula oscila de alrededor del 30% de DI a alrededor del 80% de DI en alrededor de 24 horas. El numero de ligandos unidos a la nanoparffcula puede oscilar de alrededor de 1 a alrededor de 20, o de alrededor de 1 a alrededor de 10. El diametro de la nanoparffcula puede ser de entre alrededor de 1 nm y alrededor de 8 nm. Se puede unir un agente de contraste, tal como un radionuclido, a la nanoparffcula. De manera alternativa, se puede unir un quelato a la nanoparffcula. La nanoparffcula se puede detectar mediante la imagenologfa de PET, SPECT, CT, MRI, optica, imagenologfa de bioluminiscencia, o combinaciones de las mismas. Se puede unir un agente terapeutico a la nanoparffcula. Tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto, la semivida de permanencia en la sangre de la nanoparffcula puede oscilar tambien de alrededor de 3 horas a alrededor de 15 horas, o de alrededor de 4 horas a alrededor de 10 horas. La semivida de permanencia en el tumor de la nanoparffcula tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto puede oscilar tambien de alrededor de 10 horas a alrededor de 4 dfas, o de alrededor de 15 horas a alrededor de 3,5 dfas. La proporcion de la semivida de permanencia en el tumor respecto de la semivida de permanencia en la sangre de la nanoparffcula tras la administracion de la nanoparffcula a un sujeto puede oscilar de alrededor de 2 a alrededor de 30, de alrededor de 3 a alrededor de 20, o de alrededor de 4 a alrededor de 15. El aclaramiento renal de la
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nanopartfcula puede oscilar tambien de alrededor del 40% de DI a alrededor del 70% de DI en alrededor de 24 horas tras la administracion de la nanopartfcula a un sujeto.
Tambien se proporciona una nanopartfcula fluorescente basada en sflice que comprende un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice; una cubierta de s^lice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; y un ligando unido a la nanopartfcula, en el que la nanopartfcula tiene un diametro de entre alrededor de 1 nm y alrededor de 8 nm. Tras la administracion de la nanopartfcula a un sujeto, la proporcion de la semivida de permanencia en el tumor respecto de la semivida de permanencia en la sangre de la nanopartfcula oscila de alrededor de 2 a alrededor de 30, y el aclaramiento renal de la nanopartfcula oscila de alrededor del 30% de DI a alrededor del 80% de DI en alrededor de 24 horas.
La presente invencion proporciona ademas un metodo para detectar un componente de una celula que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la celula con una nanopartfcula fluorescente basada en sflice que comprende un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice; una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; de alrededor de 1 a alrededor de 20 ligandos unidos a la nanopartfcula; y un agente de contraste o un quelato unido a la nanopartfcula; y (b) monitorizar la union de la nanopartfcula a la celula o a un componente celular mediante al menos una tecnica de imagenologfa.
La presente invencion proporciona ademas un metodo para la seleccion como objetivo de una celula tumoral que comprende administrar a un paciente de cancer una cantidad eficaz de una nanopartfcula fluorescente basada en sflice que comprende un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice; una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; un ligando unido a la nanopartfcula y capaz de unirse a un marcador tumoral; y al menos un agente terapeutico. La nanopartfcula puede estar radiomarcada. La nanopartfcula se puede administrar al paciente, pero sin limitacion, mediante las siguientes vfas: oral, intravenosa, nasal, subcutanea, local, intramuscular o transdermica.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1a muestra una representacion de la dispersion dinamica de luz (DLS) (numero medio) del tamano de partfcula para nanopartfculas de sflice que contienen Cy5 con sflice desnuda (gris) y revestida de PEG (negro).
La Figura 1b muestra la imagenologfa in vivo de la fluorescencia de partfculas con Cy5 con desmezclado espectral (pseudocolor) superpuesta sobre la imagenologfa con luz visible de ratones atfmicos 45 min tras la inyeccion de nanopartfculas de sflice desnuda.
La Figura 1c muestra la imagenologfa in vivo de la fluorescencia de partfculas con Cy5 con desmezclado espectral (pseudocolor) superpuesta sobre la imagenologfa con luz visible de ratones atfmicos 45 min tras la inyeccion de nanopartfculas con Cy5 y PEGiladas.
La Figura 1d muestra un estudio de biodistribucion in vivo mediante el uso de PET-CT co-registrada. La fila superior es una imagen de PET-CT co-registrada en serie 24 hr tras la inyeccion de una nanopartfcula revestida de PEG marcada con 124I, flanqueada por los barridos de microCT y microPET adquiridos independientemente. La fila inferior es una imagenologfa de microPET en serie.
La Figura 2a muestra datos de espectroscopfa de correlacion de fluorescencia (FCS) y ajustes monoexponenciales para el colorante Cy5 (gris claro), nanopartfculas revestidas de PEG que contienen Cy5 de 3,3 ±0,06 nm de diametro (gris oscuro, media ± desviacion estandar, n=9) y 6,0 ± 0,1 nm de diametro (negro, media ± desviacion estandar, n=6), que muestra las diferencias en el tiempo de difusion que resultan de los diferentes tamanos hidrodinamicos de las diferentes especies.
La Figura 2b muestra los espectros de absorcion y de emision del colorante Cy5 (gris claro), nanopartfculas revestidas de PEG de 3,3 nm de diametro (gris oscuro) y 6,0 nm de diametro (negro).
La Figura 2c muestra una comparacion del brillo relativo del colorante libre (gris claro) con nanopartfculas de 3,3 nm (gris oscuro) y 6,0 nm de diametro (negro), medido como la proporcion de cuentas por molecula/partfcula tal como se determina a partir de las curvas de FCS.
La Figura 2d muestra datos de fotoblanqueo para el colorante Cy5 (gris claro), nanopartfculas revestidas de PEG de 3,3 nm de diametro (gris oscuro), y 6,0 nm de diametro (negro) con excitacion mediante laser de ~3,5 mW.
La Figura 3a muestra el porcentaje de la dosis inicial (%DI) de partfculas conservadas por la sangre (negro) y los tejidos: hngado (gris claro), pulmon (gris medio-bajo), bazo (gris medio), y rinon (gris medio-alto) para nanopartfculas de 6,0 nm de diametro en diversos momentos de 10 min a 48 h tras la inyeccion (n=3 ratones, media ± desviacion estandar).
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La Figura 3b muestra una representacion de la concentracion de partfculas conservadas para nanopartfculas de 3,3 nm (gris claro) y 6,0 nm (negro) de diametro y los ajustes logarftmicos de su disminucion y las semividas.
La Figura 3c muestra una representacion de la excrecion de partfculas estimada para nanopartfculas de 3,3 nm (gris claro) y 6,0 nm (negro) de diametro y los ajustes logarftmicos asociados y las semividas (media ± desviacion estandar, n = 9 (tres ratones por punto de tiempo)).
La Figura 4 muestra la biodistribucion in vivo de las nanopartfculas en ratones que no albergan tumores y en ratones que albergan tumores con xenoinjertos subcutaneos de C6. (A) Partfculas de sflice desnudas; (B) Partfculas pEGiladas con RGD.
La Figura 5 muestra datos de union espedfica total para puntos (es decir, nanopartfculas) de cRGD y PEGilados mediante el uso de citometna de flujo en el canal de Cy5 en funcion del tiempo (a) y la concentracion de partfculas (b).
La Figura 6 muestra un diseno de puntos C multimodal para la seleccion como objetivo y la caracterizacion de integrina avp3.
Figura 6a. Representacion esquematica de las nanopartfculas de sflice nucleo-cubierta 124I-cRGDY-PEG-iladas con una superficie que alberga radiomarcadores y peptidos y un nucleo que contiene moleculas de colorante reactivo (recuadros).
Figura 6b. Resultados de FCS y ajustes monoexponenciales para las medidas de colorante Cy5 en disolucion (negro), puntos revestidos de PEG (punto de PEG, rojo), y revestidos de PEG, marcados con cRGDY (azul, bajo el conjunto de datos en rojo) que muestran diferencias en el tiempo de difusion como resultado de los tamanos hidrodinamicos variables.
Figura 6c. Comparaciones de tamanos hidrodinamicos (media ± d.e., n=15), y de brillo relativo del colorante libre con los puntos revestidos de PEG y los puntos de cRGDY-PEG obtenidos de las curvas FCS, junto con las concentraciones correspondientes de colorante y partfculas.
La Figura 7 muestra la purificacion y el control de calidad de puntos de 124I-RGDY-PEG mediante el uso de cromatograffa en columna de exclusion por tamano. Radiactividad (columna derecha) de puntos de 124I-RGD y puntos de 124I-PEG detectada mediante analisis con contador y y la intensidad de senal de fluorescencia
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correspondiente (Cy5, columna izquierda) de puntos de I-RGDY-PEG y puntos de I-PEG en cada fraccion eluida.
La Figura 8 muestra los estudios de union competitiva a receptores de integrina con puntos de 124I-cRGDY-PEG, peptido cRGDY, y anticuerpo anti-avp3 mediante el uso de dos tipos de celulas.
Figura 8a. Union espedfica y de afinidad elevada de puntos de 124I-cRGDY-PEG a celulas M21 mediante analisis con contador y. El recuadro muestra el analisis de Scatchard de los datos de union que representa la proporcion de la concentracion de radioligando unido al receptor (B) respecto del no unido (o libre, F), o proporcion unido-libre, B/F, frente a la concentracion unida al receptor, B; la pendiente corresponde a la constante de disociacion, Kd.
Figura 8b. Bloqueo del receptor de integrina avp3 de celulas M21 mediante el uso de citometna de flujo y anticuerpo anti-avp3 o cRGd en exceso sin radiomarcar antes de la incubacion con puntos de cRGDY-PEG.
Figura 8c. Union espedfica de puntos de cRGDY-PEG a M21 y a celulas M21L sin expresion superficial de integrina mediante el uso de citometna de flujo.
Figura 8d. Union espedfica de puntos de cRGDY-PEG a celulas HUVEC mediante citometna de flujo. Cada barra representa la media ± d.e. de tres replicas.
La Figura 9 muestra los perfiles farmacocineticos y de excrecion de las sondas de partfculas selectivas y no selectivas.
Figura 9a. Biodistribucion de puntos de 124I-cRGDY-PEG en ratones que albergan tumores M21 en diversos momentos de 4 a 168 h p.i. El recuadro muestra un grafico representativo de estos datos para la sangre para determinar la semivida de permanencia (T1/2).
Figura 9b. Biodistribucion de puntos de 124I-PEG de 4 a 96 h tras la inyeccion.
Figura 9c. Perfil de aclaramiento de muestras de orina recogidas hasta 168 hr p.i. de puntos de cRGDY-PEG sin radiomarcar (n=3 ratones, media ± d.e.).
Figura 9d. %DI/g acumulativa correspondiente para heces a intervalos de hasta 168 hr p.i. (n=4 ratones). Para los estudios de biodistribucion, las barras representan el medio ± d.e.
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La Figura 10 muestra los resultados del ensayo de toxicidad aguda.
Figura 10a. Hfgado representativo tenido con hematoxilina y eosina a 400x (recuadros superiores) y rinones tenidos a 200x (recuadros inferiores). Los ratones se trataron con una unica dosis de puntos de 127I-RGDY-PEG sin radiomarcar o puntos revestidos de 127I-PEG (vehnculo de control) por medio de inyeccion intravenosa, y se recogieron los organos 14 dfas mas tarde.
Figura 10b. Pesos diarios medios para cada grupo de tratamiento del estudio de toxicidad. La barra de escala de la Figura 10a corresponde a 100 pm.
La Figura 11 muestra la imagenologfa de PET in vivo en serie de la seleccion como objetivo de tumores.
Figura 11a. Imagenes de microPET frontales de cuerpo completo representativas a las 4 hrs p.i. que muestran las absorciones en tumores M21 (izquierda, flecha) y M21L (medio, flecha) de 3,6 y 0,7 %DI/g, respectivamente, y el contraste incrementado del tumor M21 a las 24 hrs (derecha).
Figura 11b. Absorcion in vivo de puntos de 124I-cRGDY-PEG en tumores M21 que sobreexpresan integrina ayp3 (negro, n=7 ratones) y tumores M21L que no la expresan (gris claro, n=5 ratones) y puntos de 124I-PEG en tumores M21 (gris oscuro, n=5).
Figura 11c. Proporciones de tumor M21-musculo para puntos de I-cRGDY-PEG (negro) y puntos de I-PEG (gris).
Figura 11d. Correlacion de absorciones en tumores M21 in vivo y ex vivo de sondas marcadas con cRGDY y sin marcar. Cada barra representa la media ± d.e.
La Figura 12 muestra una cartograffa nodular mediante el uso de la imagenologfa optica de fluorescencia multi- escala en el infrarrojo cercano.
Figura 12a. Imagenologfa de fluorescencia de cuerpo completo en la localizacion del tumor (T) y nodulos de drenaje inguinal (ILN) y axilar (ALN) y canales linfaticos comunicantes (barra, LC) 1 hr p.i. en un animal vivo expuesto quirurgicamente.
Figura 12b. Imagenes de fluorescencia de alta resolucion y luz blanca co-registradas correspondientes (fila superior) e imagenes de fluorescencia solamente (fila inferior) que revelan la infraestructura nodular de nodulos locales y distantes, que incluye venulas de endotelio alto (HEV). La mayor barra de escala de (b) corresponde a 500 pm.
La Figura 13a muestra el sistema experimental del uso del modelo de melanoma espontaneo en minicerdos para la cartograffa de lechos de nodulos linfaticos y los vasos linfaticos regionales que drenan la localizacion de un tumor de melanoma primario conocido.
La Figura 13b muestra la imagen de PET de campo de vision pequeno 5 minutos tras la inyeccion subdermica de partfculas multimodales (puntos de 124I-RGD-PEG) alrededor de la localizacion del tumor.
La Figura 14a muestra un barrido de PET dinamica de cuerpo completo con 18F-fluorodesoxiglucosa (18F-FDG) que muestra imagenes longitudinales, frontales, y axiales a traves de la localizacion de la enfermedad nodular en el cuello.
La Figura 14b muestra barridos fusionados de PET-CT con 18F-FDG que muestran imagenes longitudinales, frontales, y axiales a traves de la localizacion de la enfermedad nodular en el cuello.
La Figura 14c muestra la imagen de cuerpo completo de un minicerdo.
La Figura 15 muestra los mismos grupos de imagenes de la Figura 14, pero a nivel de la lesion de melanoma primario, adyacente a la columna vertebral en la parte superior del lomo.
La Figura 16a muestra imagenes de PET dinamica de alta resolucion tras la inyeccion subdermica en 4 cuadrantes de puntos de 124I-RGD-PEG alrededor de la localizacion del tumor a lo largo de un periodo de tiempo de 1 hora.
La Figura 16b muestra imagenes de PET-CT fusionadas tras la inyeccion subdermica en 4 cuadrantes de puntos de 124I-RGD-PEG alrededor de la localizacion del tumor a lo largo de un periodo de tiempo de 1 hora.
La Figura 16c muestra la imagenologfa con Cy5 (imagen superior), el nodulo extirpado (segunda imagen desde la parte superior), y la tincion con hematoxilina y eosina (las dos imagenes inferiores).
La Figura 17 muestra un esquema de una nanopartfcula con un colorante fluorescente dentro del nucleo y un revestimiento superficial de pEg. La nanopartfcula esta provista de triples enlaces para la "qmmica click" posterior con DFO y Tyr3-octreotato funcionalizados con grupos azida.
La Figura 18 muestra las estructuras de un derivado de PEG. Se usan reacciones qmmicas habituales para la
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produccion del PEG funcionalizado con triples enlaces, que despues se unira de manera covalente a la nanopartfcula por medio del grupo silano.
La Figura 19 muestra las estructuras de los derivados de DFO.
La Figura 20a muestra las estructuras de Tyr3-octreotato.
La Figura 20b muestra la smtesis del acido que contiene azida para la incorporacion en Tyr3-Octreotato.
La Figura 21a muestra un esquema de la produccion de nanopartfculas funcionalizadas con un colorante fluorescente en IRC dentro de su nucleo, un revestimiento superficial de PEG, quelatos con DFO y Tyr3-octreotato.
La Figura 21b muestra un esquema de la produccion de una nanopartfcula marcada con 89Zr multimodal (PET y fluorescencia) provista de Tyr3-octreotato.
La Figura 22 muestra imagenes microscopicas que demuestran la colocalizacion entre nanopartfculas de cRGF-PEG y Lysotracker Red en la ruta endodtica.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona una nanopartfcula fluorescente basada en sflice que permite la deteccion precisa, caracterizacion, monitorizacion y tratamiento de una enfermedad, tal como el cancer. La nanopartfcula tiene un intervalo de diametros que incluye entre alrededor de 0,1 nm y alrededor de 100 nm, entre alrededor de 0,5 nm y alrededor de 50 nm, entre alrededor de 1 nm y alrededor de 25 nm, entre alrededor de 1 nm y alrededor de 15 nm, o entre alrededor de 1 nm y alrededor de 8 nm. La nanopartfcula tiene un compuesto fluorescente colocado dentro de la nanopartfcula, y tiene un mayor brillo y rendimiento cuantico de fluorescencia que el compuesto fluorescente libre. La nanopartfcula tambien exhibe una bioestabilidad y biocompatibilidad elevadas. Para facilitar la excrecion urinaria eficaz de la nanopartfcula, se puede revestir con un polfmero organico, tal como poli(etilen glicol) (PEG). El pequeno tamano de la nanopartfcula, la base de sflice y el revestimiento de polfmero organico minimiza la toxicidad de la nanopartfcula cuando se administra in vivo. Para seleccionar como objetivo un tipo espedfico de celula, la nanopartfcula se puede conjugar ademas a un ligando, que es capaz de unirse a un componente celular (p.ej., la membrana celular u otro componente intracelular) asociado al tipo espedfico de celula, tal como un marcador tumoral o un intermedio de una ruta de senalizacion. En una realizacion, se puede unir un agente terapeutico a la nanopartfcula. Para permitir que la nanopartfcula sea detectable no solamente mediante imagenologfa optica (tal como imagenologfa de fluorescencia), sino tambien mediante otras tecnicas de imagenologfa, tales como tomograffa de emision de positrones (PET), tomograffa computerizada de emision monofotonica (SPECT), tomograffa computerizada (CT), e imagenologfa de resonancia magnetica (MRI), la nanopartfcula se puede conjugar tambien con un agente de contraste, tal como un radionuclido.
Las propiedades de las nanopartfculas posibilitan la excrecion a traves de los rinones, asf como la absorcion y retencion selectivas en los tumores en comparacion con los tejidos normales. Esto, junto con la ausencia de toxicidad in vivo, ha dado como resultado un producto unico que es prometedor para su traslado al ambito clmico.
La nanopartfcula puede tener tanto un ligando como un agente de contraste. El ligando permite que la nanopartfcula seleccione como objetivo un tipo espedfico de celula por medio de la union espedfica entre el ligando y el componente celular. Esta seleccion del objetivo, combinada con la imagenologfa multimodal, tiene multiples usos. Por ejemplo, se pueden usar las nanopartfculas para cartografiar nodulos linfaticos centinela (NLC), asf como para marcar los margenes de los tumores o estructuras neuronales, lo que permite que el cirujano extirpe lesiones malignas bajo una visualizacion directa y evite complicaciones durante el procedimiento quirurgico. El ligando tambien puede facilitar la entrada de la nanopartfcula en la celula o el transporte a traves de barreras, por ejemplo, para analizar el medio intracelular.
La nanopartfcula se puede acoplar con un ligando y un agente terapeutico con o sin un radiomarcador. El radiomarcador puede servir ademas como agente terapeutico para crear una plataforma multiterapeutica. Este acoplamiento permite que el agente terapeutico se transporte al tipo espedfico de celula por medio de la union espedfica entre el ligando y el componente celular. Esta seleccion del objetivo espedfica del agente terapeutico asegura el tratamiento selectivo de la localizacion de la enfermedad con efectos secundarios mmimos.
La nanopartfcula fluorescente de la presente invencion incluye un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo, y una cubierta de sflice sobre el nucleo. La cubierta de sflice puede rodear al menos una porcion del nucleo. De manera alternativa, la nanopartfcula puede tener solamente el nucleo sin la cubierta. El nucleo de la nanopartfcula puede contener el producto de reaccion de un compuesto fluorescente reactivo y un compuesto de organosilano co-reactivo. En otra realizacion, el nucleo de la nanopartfcula puede contener el producto de reaccion de un compuesto fluorescente reactivo y un compuesto de organosilano co- reactivo, y sflice. El diametro del nucleo puede ser de alrededor de 0,05 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 0,1 nm a alrededor de 50 nm, de alrededor de 0,5 nm a alrededor de 25 nm, de alrededor de 0,8 nm a alrededor de 15 nm, o de alrededor de 1 nm a alrededor de 8 nm. La cubierta de la nanopartfcula puede ser el producto de reaccion de un compuesto que forma sflice. La cubierta de la nanopartfcula puede tener un intervalo de capas. Por
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ejemplo, la cubierta de s^lice puede tener de alrededor de 1 a alrededor de 20 capas, de alrededor de 1 a alrededor de 15 capas, de alrededor de 1 a alrededor de 10 capas, o de alrededor de 1 a alrededor de 5 capas. El grosor de la cubierta puede oscilar de alrededor de 0,01 nm a alrededor de 90 nm, de alrededor de 0,02 nm a alrededor de 40 nm, de alrededor de 0,05 nm a alrededor de 20 nm, de alrededor de 0,05 nm a alrededor de 10 nm, o de alrededor de 0,05 nm a alrededor de 5 nm.
La cubierta de sflice de la nanopartmula puede cubrir solamente una porcion de la nanopartmula o la partmula completa. Por ejemplo, la cubierta de sflice puede cubrir alrededor del 1 a alrededor del 100 por ciento, de alrededor del 10 a alrededor del 80 por ciento, de alrededor del 20 a alrededor del 60 por ciento, o de alrededor del 30 a alrededor del 50 por ciento de la nanopartmula. La cubierta de sflice puede ser solida, es decir, sustancialmente no porosa, mesoporosa, tal como semiporosa, o porosa.
La presente nanopartmula fluorescente se puede sintetizar mediante las etapas de: conjugar de manera covalente un compuesto fluorescente, tal como un colorante fluorescente reactivo, con restos reactivos que incluyen, pero sin limitacion, maleimida, yodoacetamida, tiosulfato, amina, ester de N-hidroxisuccimida, ester de 4-sulfo-2,3,5,6- tetrafluorofenilo (STP), ester de sulfosuccinimidilo, esteres de sulfodiclorofenol, cloruro de sulfonilo, hidroxilo, isotiocianato, carboxilo, con un compuesto de organosilano, tal como un compuesto de organosilano co-reactivo, para formar un precursor de sflice fluorescente, y hacer reaccionar el precursor de sflice fluorescente para formar un nucleo fluorescente; conjugar de manera covalente un compuesto fluorescente, tal como un colorante fluorescente reactivo, con un compuesto de organosilano, tal como un compuesto de organosilano co-reactivo, para formar un precursor de sflice fluorescente, y hacer reaccionar el precursor de sflice fluorescente con un compuesto de formacion de sflice, tal como tetraalcoxisilano, para formar un nucleo fluorescente; y hacer reaccionar el nucleo resultante con un compuesto de formacion de sflice, tal como un tetraalcoxisilano, para formar una cubierta de sflice sobre el nucleo, para proporcionar la nanopartmula fluorescente.
La smtesis de las nanopartmulas nucleo-cubierta monodispersas fluorescentes se basa en un proceso de dos etapas. Primero, se conjugan de manera covalente las moleculas de colorante organico, isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), con un precursor de sflice y se condensan para formar un nucleo rico en colorante. Segundo, se anaden los monomeros de gel de sflice para formar una red de sflice mas densa alrededor del material del nucleo fluorescente, lo que proporciona proteccion hacia las interacciones con el disolvente que pueden ser perjudiciales para la fotoestabilidad. La versatilidad de la via preparativa permite la incorporacion de diferentes compuestos fluorescentes, tales como compuestos o colorantes organicos fluorescentes, dependiendo de la aplicacion deseada de la nanopartmula. Los compuestos fluorescentes que se pueden incorporar en el nucleo rico en colorante pueden cubrir todo el espectro de absorcion y emision UV-visible a IR cercano. Solicitudes de patentes de EE.UU. n°s 10/306.614, 10/536.569 y 11/119.969. Wiesner et al., Peg-coated Core-shell Silica Nanoparticles and Mathods of Manufactire and Use, documento PCT/US2008/74894.
Para la smtesis de la nanopartmula nucleo-cubierta compacta, se anade el precursor de colorante a un recipiente de reaccion que contiene cantidades adecuadas de amoniaco, agua y disolvente y se deja reaccionar durante la noche. El precursor de colorante se sintetiza mediante una reaccion de adicion entre un colorante del infrarrojo cercano espedfico de interes y 3-aminopropiltrietoxisilano en una proporcion molar de 1:50, con exclusion de humedad. Tras completar la smtesis del nucleo compacto rico en colorante, se anade posteriormente ortosilicato de tetraetilo (TEOS) para hacer crecer la cubierta de sflice que rodea al nucleo.
La smtesis de la nanopartmula nucleo-cubierta expandida se lleva a cabo mediante la co-condensacion de TEOS con el precursor de colorante, y permitiendo que la mezcla reaccione durante la noche. Despues de completar la smtesis del nucleo expandido, se anade TEOS adicional para hacer crecer la cubierta de sflice que rodea al nucleo.
La smtesis de las nanopartmulas homogeneas se lleva a cabo mediante la co-condensacion de todos los reactivos, el precursor de colorante y TEOS, y permitiendo que la mezcla reaccione durante la noche.
Las nanopartmulas pueden incorporar cualquier compuesto fluorescente conocido, tal como un compuesto organico fluorescente, colorantes, pigmentos, o combinaciones de los mismos. Se conoce una amplia diversidad de colorantes fluorescentes qmmicamente reactivos adecuados, vease, por ejemplo, MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, 6a ed., R. P. Haugland, ed. (1996). Un fluoroforo tfpico es, por ejemplo, un compuesto aromatico o heteroaromatico fluorescente tal como un pireno, un antraceno, un naftaleno, una acridina, un estilbeno, un indol o bencindol, un oxazol o benzoxazol, un tiazol o benzotiazol, un 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD), una cianina, una carbocianina, un carboestirilo, una porfirina, un salicilato, un antranilato, un azuleno, un perileno, una piridina, una quinolina, una cumarina (que incluye las hidroxicumarinas y aminocumarinas y los derivados fluorados de los mismos), y compuestos similares, veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n°s 5.830.912, 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782, 5.274.113, 5.433.896, 4.810.636 y 4.812.409. En una realizacion, se coloca Cy5, un colorante fluorescente del infrarrojo cercano (FIRC), dentro del nucleo de sflice de la presente nanopartmula. Las sondas que emiten en el infrarrojo cercano exhiben una atenuacion tisular y autofluorescencia disminuidas. Burns et al. "Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine", Nano Letters, 2009, 9 (1), 442-448.
El compuesto fluorescente no limitante que se puede usar en la presente invencion incluye Cy5, Cy5.5 (tambien
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conocido como Cy5++), Cy2, isotiocianato de fluorescema (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), ficoeritrina, Cy7, fluorescema (FAM), Cy3, Cy3.5 (tambien conocido como Cy3++), Rojo Texas, LightCycler-Red 640, LightCycler Red 705, tetrametilrodamina (TMR), rodamina, derivado de rodamina (ROX), hexaclorofluorescema (HEX), rodamina 6G (R6G), el derivado de rodamina JA133, colorantes fluorescentes Alexa (tales como Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 555, y Alexa Fluor 647), 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), yoduro de propidio, AMCA, Verde Espectro, Naranja Espectro, Aguamarina Espectro, Lisamina, y complejos de metales de transicion fluorescentes, tales como europio. El compuesto fluorescente que se puede usar tambien incluye protemas fluorescentes, tales como GFP (protema fluorescente verde), GFP mejorada (EGFP), protema fluorescente azul y derivados (BFP, EBFP, EBFP2, Azurita, mKalamal), protema fluorescente cian y derivados (CFP, ECFP, Cerulea, CyPet) y protema fluorescente amarilla y derivados (YFP, Citrina, Venus, YPet). Documentos WO2008142571, WO2009056282, WO9922026.
La superficie de la cubierta de sflice de las nanopartmulas se puede modificar mediante el uso de agentes de entrecruzamiento conocidos para introducir grupos funcionales superficiales. Los agentes de entrecruzamiento incluyen, pero sin limitacion, divinil benceno, dimetacrilato de etilen glicol, trimetacrilato de trimetilol propano, N,N'- metileno-bis-acrilamida, eteres de alquilo, carbohidratos, peptidos, fragmentos de ADN, u otros agentes funcionalmente equivalentes conocidos. El ligando se puede conjugar con la nanopartmula de la presente invencion, por ejemplo, por medio de reacciones de acoplamiento mediante el uso de carbodiimida, carboxilatos, esteres, alcoholes, carbamidas, aldehndos, aminas, oxidos de azufre, oxidos de nitrogeno, haluros, o cualquier otro compuesto adecuado conocido en la tecnica. Patente de EE.UU. n° 6.268.222.
Se puede unir un polfmero organico a la presente nanopartmula, p.ej., se puede unir a la superficie de la nanopartmula. Se puede unir un polfmero organico a la cubierta de sflice de la presente nanopartmula. El polfmero organico que se puede usar en la presente invencion incluye PEG, polilactato, poli(acidos lacticos), carbohidratos, lfpidos, poli(acido glutamico) (PGA), poli(acido glicolico), poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), poli(acetato de vinilo) (PVA), y las combinaciones de los mismos. La union del polfmero organico a la nanopartmula se puede llevar a cabo mediante un enlace covalente o no covalente, tal como mediante un enlace ionico, enlace de hidrogeno, enlace hidrofobo, coordinacion, adhesion, y absorcion ffsica. En una realizacion, la nanopartmula se conjuga de manera covalente con PEG, lo que impide la adsorcion de protemas del suero, facilita la excrecion urinaria eficaz y disminuye la agregacion de la nanopartmula. Burns et al. "Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine", Nano Letters, 2009, 9 (1), 442-448.
La superficie de la nanopartmula se puede modificar para que incorpore al menos un grupo funcional. El polfmero organico (p.ej., PEG) unido a la nanopartmula se puede modificar para que incorpore al menos un grupo funcional. Por ejemplo, el grupo funcional puede ser una maleimida o ester de W-hidroxisuccinimida (NHS). La incorporacion del grupo funcional hace posible unir diversos ligandos, agentes de contraste y/o agentes terapeuticos a la nanopartmula.
Se puede unir un ligando a la presente nanopartmula. El ligando es capaz de unirse a al menos un componente celular. El componente celular puede estar asociado a tipos espedficos de celulas, o puede tener niveles elevados en tipos espedficos de celulas, tales como celulas cancerosas o celulas espedficas de tejidos y organos particulares. Por lo tanto, la nanopartmula puede seleccionar como objetivo un tipo de celula espedfica, y/o proporciona una administracion selectiva para el tratamiento y el diagnostico de una enfermedad. Tal como se usa en la presente memoria, el termino "ligando" se refiere a una molecula o entidad que se puede usar para identificar, detectar, seleccionar como objetivo, monitorizar, o modificar un estado ffsico o afeccion, tal como un estado patologico o afeccion. Por ejemplo, se puede usar un ligando para detectar la presencia o ausencia de un receptor particular, nivel de expresion de un receptor particular, o niveles metabolicos de un receptor particular. El ligando puede ser, por ejemplo, un peptido, una protema, un fragmento de protema, una hormona peptfdica, un carbohidrato (es decir, lectinas), un biopolfmero, un polfmero sintetico, un antfgeno, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo (p.ej., Fab, nanocuerpos), un aptamero, un virus o componente viral, un receptor, un hapteno, una enzima, una hormona, un compuesto qmmico, un patogeno, un microorganismo o un componente de los mismos, una toxina, un modificador de superficie, tal como un tensioactivo para alterar las propiedades superficiales o la histocompatibilidad de la nanopartmula o de un analito cuando se asocia una nanopartmula con el, y combinaciones de los mismos. Los ligandos preferidos son, por ejemplo, anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, y ligandos de receptores. En otra realizacion, el ligando es poli-L-lisina (pLisina).
Se puede unir un antfgeno a la nanopartmula. Se puede usar la nanopartmula unida a un antfgeno para una vacunacion.
Las expresiones "componente de una celula" o "componente celular" se refieren, por ejemplo, a un receptor, un anticuerpo, un hapteno, una enzima, una hormona, un biopolfmero, un antfgeno, un acido nucleico (ADN o ARN), un microorganismo, un virus, un patogeno, una toxina, combinaciones de los mismos, y componentes similares. El componente de una celula puede estar colocado sobre la celula (p.ej., un receptor transmembrana) o dentro de la celula. En una realizacion, el componente de una celula es un marcador tumoral. Tal como se usa en la presente memoria, el termino "marcador tumoral" se refiere a una molecula, entidad o sustancia que se expresa o se sobreexpresa en una celula cancerosa, pero no en una celula normal. Por ejemplo, la sobreexpresion de ciertos receptores esta asociada a muchos tipos de cancer. Se puede conjugar un ligando capaz de unirse a un marcador
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tumoral en la superficie de la presente nanopartmula, de forma que la nanopartmula puede seleccionar como objetivo de manera espedfica la celula tumoral.
Se puede unir un ligando a la presente nanopartmula directamente o por medio de un ligador. La union del ligando a la nanopartmula se puede llevar a cabo mediante un enlace covalente o no covalente, tal como mediante un enlace ionico, enlace de hidrogeno, enlace hidrofobo, coordinacion, adhesion, y absorcion ffsica. El ligando se puede revestir sobre la superficie de la nanopartmula. El ligando se puede embeber sobre la superficie de la nanoparbcula. Tal como se usa en la presente memoria, "embeber" se refiere a la asimilacion o captacion. El ligando se puede unir a la superficie de la nanopartmula fluorescente, o se puede unir al nucleo cuando la cubierta es porosa o esta cubriendo una porcion del nucleo. Cuando el ligando se une a la nanopartmula por medio de un ligador, el ligador puede ser cualquier molecula adecuada, tal como un PEG funcionalizado. Los PEGs pueden tener multiples grupos funcionales para la union a la nanopartmula y a los ligandos. La partmula puede tener diferentes tipos de PEGs funcionalizados que albergan diferentes grupos funcionales que se pueden unir a multiples ligandos. Esto puede aumentar los efectos de multivalencia y/o contraste en la localizacion seleccionada como objetivo, lo que permite el diseno y la optimizacion de una plataforma multimodal compleja con una deteccion, tratamiento, y medicion in vivo selectivas mejoradas.
Se puede unir una diversidad de ligandos diferentes a la nanopartmula. Por ejemplo, se puede unir el tripeptido Arg- Gly-Asp (RGD) a la nanopartmula. De manera alternativa, se puede unir el peptido dclico cRGD (que puede contener otro(s) aminoacido(s), p.ej., cRGDY) a la nanopartmula. Cualquier peptido lineal, dclico o ramificado que contenga la secuencia RGD se halla dentro del alcance de la presente invencion. RGD se une a la integrina avp3, que se sobreexpresa en la superficie de las celulas endoteliales activadas durante la angiogenesis y en diversos tipos de celulas tumorales. Se ha demostrado que los niveles de expresion de la integrina avp3 se correlacionan bien con la agresividad de los tumores. Ruoslahti et al. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science 1987;238:491. Gladson et al. Glioblastoma expression of vitronectin and alpha v beta 3 integrin. Adhesion mechanism for transformed glial cells. J. Clin. Invest. 1991; 88:1924-1932. Seftor et al. Role of the alpha v beta 3 integrin in human melanoma cell invasion. Proc. Natl. Acad. Sci. 1992; 89:1557-1561.
De manera alternativa, el peptido sintetico EPPT1 puede ser el ligando unido a la nanopartmula. EPPT1, obtenido del sitio de union del anticuerpo monoclonal (ASM2), selecciona como objetivo MUC1 sin glicosilar (uMUC1). MUC1, un receptor transmembrana, esta muy glicosilado en los tejidos normales; sin embargo, se sobreexpresa e infraglicosila de manera anormal en casi todos los adenocarcinomas de celulas epiteliales humanas, y esta implicado en la patogenesis tumoral. Moore et al. In vivo targeting of underglycosylated MUC-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 2004; 64:1821-7. Patel et al. MUC1 plays a role in tumor maintenance in aggressive thryroid carcinomas. Surgery. 2005; 138:994-1001. Se pueden conjugar de manera alternativa anticuerpos espedficos, que incluyen los anticuerpos monoclonales hacia uMUC1, a la nanopartmula para seleccionar como objetivo uMUC1.
En una realizacion, los analogos peptfdicos de la hormona estimulante de a-melanotropina (a-MSH) son los ligandos unidos a la nanopartmula. Los analogos peptfdicos de a-MSH son capaces de unirse a los receptores de melanocortina-1 (MC1R), una familia de receptores acoplados a protema G sobreexpresados en las celulas de melanoma. Loir et al. Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 1999, 45:1083-1092.
En otra realizacion, el octreotato, un analogo peptfdico de somatostatina de 14 aminoacidos, es el ligando unido a la nanopartmula. El octreotido, que tiene una semivida mas larga que la somatostatina, es capaz de unirse a un receptor de somatostatina (SSTR). SSTR, un miembro de la familia de receptores acoplados a protema G, se sobreexpresa sobre la superficie de varios tumores humanos. Reubi et al. Distribution of Somatostatin Receptors in Normal and Tumor-Tissue. Metab. Clin. Exp. 1990;39:78-81. Reubi et al. Somatostatin receptors and their subtypes in human tumors and in peritumoral vessels. Metab. Clin. Exp. 1996;45:39-41. Se pueden conjugar de manera alternativa otros analogos de somatostatina a la nanopartmula para seleccionar como objetivo SSTR, tales como Tyr3-octreotido (Y3-OC), octreotato (TATE), Tyr3-octreotato (Y3-TATE), y 111In-DTPA-OC. Estos analogos de somatostatina se pueden utilizar para la imagenologfa de diagnostico por PET y la radioterapia selectiva del cancer. de Jong et al. Internalization of radio labelled [DTPA0]octreotide and [DOTA0, Tyr3]octreotide: peptides for somatostatin receptor targeted scintigraphy and radionuclide therapy. Nucl. Med. Commun. 1998;19:283-8. de Jong et al. Comparison of 111In-Labeled Somatostatin Analogues for Tumor Scintigraphy and Radionuclide Therapy. Cancer Res. 1998;58:437-41. Lewis et al. Comparison of four 64Cu-labeled somatostatin analogs in vitro and in a tumor-bearing rat model: evaluation of new derivatives for PET imaging and targeted radiotherapy. J Med Chem 1999;42:1341-7. Krenning et al. Somatostatin Receptor Scintigraphy with Indium-111-DTPA-D-Phe-1-Octreotide in Man: Metabolism, Dosimetry and Comparison with Iodine-123-Tyr-3-Octreotide. J Nucl. Med. 1992;33:652-8.
El numero de ligandos unidos a la nanopartmula puede oscilar de alrededor de 1 a alrededor de 20, de alrededor de 2 a alrededor de 15, de alrededor de 3 a alrededor de 10, de alrededor de 1 a alrededor de 10, o de alrededor de 1 a alrededor de 6. El pequeno numero de ligandos unidos a la nanopartmula ayuda a mantener el diametro hidrodinamico de la presente nanopartmula, que cumple el intervalo de tamanos umbral para el aclaramiento renal. Hilderbrand et al., Near-infrared fluorescence: application to in vivo molecular imaging, Curr. Opin. Chem. Biol., 14:71-9, 2010. El numero de ligandos medido puede ser un numero medio de los ligandos unidos a mas de una nanopartmula. De manera alternativa, se puede medir una nanopartmula para determinar el numero de ligandos
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unidos. El numero de ligandos unidos a la nanoparffcula se puede medir mediante cualquier metodo adecuado, que puede o no estar relacionado con las propiedades de los ligandos. Por ejemplo, se puede estimar el numero de peptidos cRGD unidos a la parffcula mediante el uso de medidas basadas en FCS de las concentraciones de parffculas absolutas y la concentracion de partida de los reactivos para el peptido cRGD. Se puede determinar de manera colorimetrica el numero medio de peptidos RGD por nanoparffcula y la eficacia de acoplamiento de RGD para los grupos de PEG funcionalizados en condiciones alcalinas y con metodos espectrofotometricos de Biuret. El numero de ligandos unidos a la nanoparffcula se puede medir tambien mediante resonancia magnetica nuclear (RMN), imagenologfa optica, ensayo de radiactividad, etc. Los expertos en la tecnica pueden determinar facilmente el metodo.
Se puede unir un agente de contraste a la presente nanoparffcula para la imagenologfa medica o biologica. Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "agente de contraste" se refiere a una sustancia, molecula o compuesto usado para aumentar la visibilidad de las estructuras o los fluidos en la imagenologfa medica o biologica. La expresion "agente de contraste" tambien se refiere a una molecula que produce contraste. Las tecnicas de imagenologfa abarcadas por la presente invencion incluyen la tomograffa de emision de positrones (PET), tomograffa computerizada de emision monofotonica (SPECT), tomograffa computerizada (CT), imagenologfa de resonancia magnetica (MRI), imagenologfa optica de bioluminiscencia, imagenologfa optica de fluorescencia, y combinaciones de las mismas. El agente de contraste abarcado por la presente invencion puede ser cualquier molecula, sustancia o compuesto conocido en la tecnica para la imagenologfa de PET, SPECT, CT, MRI, y optica. El agente de contraste puede ser radionuclidos, radiometales, emisores de positrones, emisores beta, emisores gamma, emisores alfa, iones metalicos paramagneticos, e iones metalicos superparamagneticos. Los agentes de contraste incluyen, pero sin limitacion, yodo, fluor, cobre, circonio, lutecio, astato, itrio, galio, indio, tecnecio, gadolinio, disprosio, hierro, manganeso, bario y sulfato de bario. Los radionuclidos que se pueden usar como agente de contraste unido a la nanoparffcula de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, 89Zr, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I y 177Lu.
El agente de contraste se puede conjugar directamente a la nanoparffcula. De manera alternativa, el agente de contraste se puede conjugar indirectamente a la nanoparffcula, mediante la union a ligadores o quelatos. El quelato se puede adaptar para unir un radionuclido. Los quelatos que se pueden unir a la presente nanoparffcula pueden incluir, pero sin limitacion, acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA), desferrioxamina (DFO) y trietilentetramina (TETA).
Los medios adecuados para la imagenologfa, deteccion, registro o medicion de las presentes nanoparffculas pueden incluir ademas, por ejemplo, un citometro de flujo, un citometro de barrido laser, un lector de microplacas de fluorescencia, un microscopio de fluorescencia, un microscopio confocal, un microscopio de campo brillante, un sistema de barrido de alto contenido, y dispositivos similares. Se puede usar mas de un tecnica de imagenologfa al mismo tiempo o consecutivamente para detectar las presentes nanoparffculas. En una realizacion, se usa la imagenologfa optica como herramienta sensible de cribado de alto rendimiento para adquirir multiples puntos de tiempo en el mismo sujeto, lo que permite determinaciones semicuantitativas de los niveles de marcadores tumorales. Esto compensa la resolucion temporal relativamente disminuida obtenida con PET, aunque PET es necesaria para conseguir una penetracion de profundidad adecuada para obtener datos volumetricos, y para detectar, cuantificar, y monitorizar los cambios en los niveles de receptores y/u otros marcadores celulares como medio para estudiar la progresion o mejora de una enfermedad, asf como para estratificar a los pacientes en protocolos de tratamiento adecuados.
Se puede unir un agente terapeutico a la nanoparffcula fluorescente, por ejemplo, para el tratamiento selectivo de una enfermedad. El agente terapeutico se puede administrar en una localizacion de una enfermedad de una manera sumamente espedfica o localizada, con la liberacion del agente terapeutico en la localizacion de la enfermedad. De manera alternativa, el agente terapeutico puede no liberarse. Se puede usar la nanoparffcula fluorescente conjugada con el ligando para la administracion selectiva de un agente terapeutico en una localizacion deseada en una diversidad de sistemas, tal como sobre, o dentro de, una celula o componente celular, dentro del cuerpo de un organismo, tal como un ser humano, o a traves de la barrera hematoencefalica.
El agente terapeutico se puede unir a la nanoparffcula directamente o indirectamente. El agente terapeutico se puede absorber en los intersticios o poros de la cubierta de sflice, o se puede revestir sobre la cubierta de sflice de la nanoparffcula fluorescente. En otras realizaciones en las que la cubierta de sflice no cubre toda la superficie, el agente terapeutico se puede asociar al nucleo fluorescente, tal como mediante absorcion ffsica o mediante interaccion con formacion de enlaces. El agente terapeutico se puede asociar con el ligando que esta unido a la nanoparffcula fluorescente. El agente terapeutico tambien se puede asociar con el polfmero organico o el agente de contraste. Por ejemplo, el agente terapeutico se puede unir a la nanoparffcula por medio de PEG. Los PEGs pueden tener multiples grupos funcionales para la union a la nanoparffcula y al agente terapeutico. La parffcula puede tener diferentes tipos de PEGs funcionalizados que albergan diferentes grupos funcionales que se pueden unir a multiples agentes terapeuticos. El agente terapeutico se puede unir a la nanoparffcula de manera covalente o no covalente.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "agente terapeutico" se refiere a una sustancia que se puede usar en el diagnostico, curacion, mitigacion, tratamiento, o prevencion de una enfermedad en un ser humano u otro animal. Tales agentes terapeuticos incluyen sustancias reconocidas en la Farmacopea oficial de los Estados Unidos,
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la Farmacopea Homeopatica oficial de los Estados Unidos, el Vademecum Nacional oficial, o cualquier suplemento de los mismos.
Los agentes terapeuticos que se pueden incorporar con las nanopartfculas fluorescentes o las nanopartfculas fluorescentes ligadas de la invencion incluyen nucleosidos, analogos de nucleosidos, ARN pequeno de interferencia (siARN), microARN, oligopeptidos, polipeptidos, anticuerpos, inhibidores de COX-2, promotores de la apoptosis, agentes del tracto urinario, agentes vaginales, vasodilatadores como agentes anti-neurodegenerativos (p.ej., para la enfermedad de Parkinson), agentes para la obesidad, agentes oftalmicos, agentes para la osteoporosis, parasimpatolfticos, parasimpatometicos, antianestesicos, prostaglandinas, agentes psicoterapeuticos, agentes respiratorios, sedantes, hipnoticos, agentes para la piel y membranas mucosas, anti-bacterianos, anti-fungicos, antineoplasicos, agentes cardioprotectores, agentes cardiovasculares, anti-tromboticos, estimulantes del sistema nervioso central, inhibidores de colinesterasa, anticonceptivos, agonistas de receptores de dopamina, agentes para la disfuncion erectil, agentes para la fertilidad, agentes gastrointestinales, agentes para la gota, hormonas, inmunomoduladores, analgesicos funcionalizados de manera adecuada o anestesicos generales o locales, anti- convulsivos, agentes anti-diabeticos, agentes anti-fibroticos, anti-infecciosos, agentes anticinetosicos, relajantes musculares, agentes inmunosupresores, agentes para la migrana, farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), agentes de cesacion tabaquica, o simpatolfticos (vease Physicians' Desk Reference, 55a ed., 2001, Medical Economics Company, Inc., Montvale, N.J., paginas 201-202).
Los agentes terapeuticos que se pueden unir a la presente nanopartfcula incluyen, pero sin limitacion, agentes alquilantes del aDn, inhibidores de topoisomerasas, agentes inductores de estres en el retfculo endoplasmico, un compuesto de platino, un antimetabolito, alcaloides de la vinca, taxanos, epotilonas, inhibidores de enzimas, antagonistas de receptores, anticuerpos terapeuticos, inhibidores de tirosina quinasa, radiosensibilizantes de boro (es decir, Velcade), y terapias de combinacion quimioterapicas.
Los ejemplos no limitantes de agentes alquilantes del ADN son mostazas nitrogenadas, tales como Mecloretamina, Ciclofosfamida (Ifosfamida, Trofosfamida), Clorambucilo (Melfalano, Prednimustina), Bendamustina, Uramustina y Estramustina; nitrosoureas, tales como Carmustina (BCNU), Lomustina (Semustina), Fotemustina, Nimustina, Ranimustina y Estreptozocina; sulfonatos de alquilo, tales como Busulfano (Manosulfano, Treosulfano); Aziridinas, tales como Carbocuona, TioTEPA, Triazicuona, Trietilenmelamina; Hidrazinas (Procarbazina); Triazenos tales como Dacarbazina y Temozolomida; Altretamina y Mitobronitol.
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de Topoisomerasa I incluyen derivados de Campotecina que incluyen CPT-11 (irinotecano), SN-38, APC, NPC, campotecina, topotecano, mesilato de exatecano, 9-nitrocamptotecina, 9- aminocamptotecina, lurtotecano, rubitecano, silatecano, gimatecano, diflomotecano, extatecano, BN-80927, DX- 8951f, y MAG-CPT, tal como se describio en Pommier Y. (2006) Nat. Rev. Cancer 6(10):789-802 y la publicacion de patente de EE.UU. n° 200510250854; Alcaloides de protoberberina y derivados de los mismos, que incluyen berberrubina y coralina, tal como se describio en Li et al. (2000) Biochemistry 39(24):7107-7116 y Gatto et al. (1996) Cancer Res. 15(12):2795-2800; Derivados de fenantrolina, que incluyen Benzo[i]fenantridina, Nitidina, y fagaronina, tal como se describio en Makhey et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11 (8): 1809-1820; Terbencimidazol y derivados del mismo, tal como se describio en Xu (1998) Biochemistry 37(10):3558-3566; y derivados de Antraciclina, que incluyen Doxorrubicina, Daunorrubicina, y Mitoxantrona, tal como se describio en Foglesong et al. (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 30(2):123-125, Crow et al. (1994) J. Med. Chem. 37(19):31913194, y Crespi et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 136(2):521-8. Los inhibidores de topoisomerasa II incluyen, pero sin limitacion, Etoposido y Teniposido. Los inhibidores dobles de topoisomerasa I y II incluyen, pero sin limitacion, Saintopina y otras Naftecenodionas, DACA y otras Acridin-4-Carboxamidas, Intoplicina y otros Benzopiridoindoles, TAS-I03 y otras 7H-indeno[2,1-c]Quinolin-7-onas, Pirazoloacridina, XR 11576 y otras Benzofenazinas, XR 5944 y otros compuestos dimericos, 7-oxo-7H-dibenz[f,ij]Isoquinolinas y 7-oxo-7H-benzo[e]Perimidinas, y Conjugados Antracenilo-aminoacido como se describio en Denny y Baguley (2003) Curr. Top. Med. Chem. 3(3):339-353. Algunos agentes inhiben la Topoisomerasa II y tienen actividad de intercalacion en el ADN, tales como, pero sin limitacion, Antraciclinas (Aclarrubicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Idarrubicina, Amrubicina, Pirarrubicina, Valrubicina, Zorubicina) y Antracenodionas (Mitoxantrona y Pixantrona).
Los ejemplos de agentes inductores de estres en el retfculo endoplasmico incluyen, pero sin limitacion, dimetil- celecoxib (DMC), nelfinavir, celecoxib, y radiosensibilizantes de boro (es decir, Velcade (Bortezomib)).
Los ejemplos no limitantes de compuestos basados en platino incluyen Carboplatino, Cisplatino, Nedaplatino, Oxaliplatino, tetranitrato de Triplatino, Satraplatino, Aroplatino, Lobaplatino, y JM-216. (vease McKeage et al. (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237 y, en general, CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, en la serie Basic and Clinical Oncology, Angioli et al. Eds., 2004).
Los ejemplos no limitantes de antimetabolitos incluyen los basados en acido folico, es decir, inhibidores de dihidrofolato reductasa, tales como Aminopterina, Metotrexato y Pemetrexed; inhibidores de timidilato sintasa, tales como Raltitrexed, Pemetrexed; los basados en purina, es decir, un inhibidor de adenosina desaminasa, tal como Pentostatina, una tiopurina, tal como Tioguanina y Mercaptopurina, un inhibidor halogenado de ribonucleotido reductasa, tal como Cladribina, Clofarabina, Fludarabina, o una tiopurina de guanina/guanosina, tal como Tioguanina; o basado en Pirimidina, es decir, un agente hipometilante de citosina/citidina, tal como Azacitidina y
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Decitabina, un inhibidor de ADN polimerasa, tal como Citarabina, un inhibidor de ribonucleotido reductasa, tal como Gemcitabina, o un inhibidor de timina/timidina timidilato sintasa, tal como un Fluorouracilo (5-FU). Los equivalentes de 5-FU incluyen profarmacos, analogos y derivados de los mismos tales como 5'-desoxi-5-fluorouridina (doxifluroidina), 1-tetrahidrofuranil-5-fluorouracilo (ftorafur), Capecitabina (Xeloda), S-I (MBMS-247616, que consiste en tegafur y dos moduladores, una 5-cloro-2,4-dihidroxipiridina y oxonato potasico), raltitrexed (tomudex), nolatrexed (Thymitaq, AG337), LY231514 y ZD9331, como se describio, por ejemplo, en Papamicheal (1999) The Oncologist 4:478-487.
Los ejemplos de alcaloides de la vinca incluyen, pero sin limitacion, Vinblastina, Vincristina, Vinflunina, Vindesina y Vinorelbina.
Los ejemplos de taxanos incluyen, pero sin limitacion, Docetaxel, Larotaxel, Ortataxel, Paclitaxel y Tesetaxel. Un ejemplo de una epotilona es ixabepilona.
Los ejemplos de inhibidores de enzimas incluyen, pero sin limitacion, inhibidores de farnesiltransferasa (Tipifamib); inhibidor de CDK (Alvocidib, Seliciclib); inhibidor de proteosoma (Bortezomib); inhibidor de fosfodiesterasa (Anagrelide; rolipram); inhibidor de IMP deshidrogenasa (Tiazofurina); e inhibidor de lipooxigenasa (Masoprocol). Los ejemplos de antagonistas de receptores incluyen, pero sin limitacion, ERA (Atrasentan); receptor retinoide X (Bexaroteno); y un esteroide sexual (Testolactona).
Los ejemplos de anticuerpos terapeuticos incluyen, pero sin limitacion, anti-HERI/EGFR (Cetuximab, Panitumumab); Anti-receptor HER2/neu (erbB2) (Trastuzumab); Anti-EpCAM (Catumaxomab, Edrecolomab) Anti-VEGF-A (Bevacizumab); Anti-CD20 (Rituximab, Tositumomab, Ibritumomab); Anti-CD52 (Alemtuzumab); y Anti-CD33 (Gemtuzumab). Patentes de EE.UU. n°s 5.776.427 y 7.601.355.
Los ejemplos de inhibidores de tirosina quinasa incluyen, pero sin limitacion, los inhibidores de ErbB: HER1/EGFR (Erlotinib, Gefitinib, Lapatinib, Vandetanib, Sunitinib, Neratinib); HER2/neu (Lapatinib, Neratinib); RTK de clase III: C- kit (Axitinib, Sunitinib, Sorafenib), FLT3 (Lestaurtinib), PDGFR (Axitinib, Sunitinib, Sorafenib); y VEGFR (Vandetanib, Semaxanib, Cediranib, Axitinib, Sorafenib); bcr-abl (Imatinib, Nilotinib, Dasatinib); Src (Bosutinib) y Janus quinasa 2 (Lestaurtinib).
Los agentes quimioterapicos que se pueden unir a la presente nanopartfcula pueden incluir ademas amsacrina, Trabectedina, retinoides (Alitretinoma, Tretinoma), trioxido de arsenico, agentes de disminucion de asparagina (Asparaginasa/Pegaspargasa), Celecoxib, Demecolcina, Elesclomol, Elsamitrucina, Etoglucid, Lonidamina, Lucantona, Mitoguazona, Mitotano, Oblimersen, Temsirolimus, y Vorinostat.
Los ejemplos de agentes terapeuticos espedficos que se pueden unir, ligar, o asociar a las nanopartfculas fluorescentes de la invencion son flomoxef; fortimicina(s); gentamicina(s); glucosulfona solasulfona; gramicidina S; gramicidina(s); grepafloxacino; guameciclina; hetacilina; isepamicina; josamicina; kanamicina(s); flomoxef; fortimicina(s); gentamicina(s); glucosulfona solasulfona; gramicidina S; gramicidina(s); grepafloxacino; guameciclina; hetacilina; isepamicina; josamicina; kanamicina(s); bacitracina; bambermicina(s); biapenem; brodimoprim; butirosina; capreomicina; carbenicilina; carbomicina; carumonam; cefadroxil; cefamandol; cefatrizina; cefbuperazona; cefclidina; cefdinir; cefditoren; cefepima; cefetamet; cefixima; cefinenoxima; cefininox; cladribina; apalcilina; apiciclina; apramicina; arbekacina; aspoxicilina; azidamfenicol; aztreonam; cefodizima; cefonicid; cefoperazona; ceforamida; cefotaxima; cefotetan; cefotiam; cefozopran; cefpimizol; cefpiramida; cefpiroma; cefprozil; cefroxadina; cefteram; ceftibuteno; cefuzonam; cefalexin; cefaloglicina; cefalosporina C; cefradina; cloranfenicol; clortetraciclina; clinafloxacino; clindamicina; clomociclina; colistina; ciclacilina; dapsona; demeclociclina; diatimosulfona; dibekacina; dihidroestreptomicina; 6-mercaptopurina; tioguanina; capecitabina; docetaxel; etoposido; gemcitabina; topotecan; vinorelbina; vincristina; vinblastina; teniposido; melfalano; metotrexato; 2-p-sulfanilanilinoetanol; 4,4'-sulfinildianilina; acido 4-sulfanilamidosalidlico; butorfanol; nalbufina. estreptozocina; doxorrubicina; daunorrubicina; plicamicina; idarrubicina; mitomicina C; pentostatina; mitoxantrona; citarabina; fosfato de fludarabina; butorfanol; nalbufina. estreptozocina; doxorrubicina; daunorrubicina; plicamicina; idarrubicina; mitomicina C; pentostatina; mitoxantrona; citarabina; fosfato de fludarabina; acediasulfona; acetosulfona; amikacina; anfotericina B; ampicilina; atorvastatina; enalapril; ranitidina; ciprofloxacino; pravastatina; claritromicina; ciclosporina; famotidina; leuprolida; aciclovir; paclitaxel; azitromicina; lamivudina; budesonida; albuterol; indinavir; metformina; alendronato; nizatidina; zidovudina; carboplatino; metoprolol; amoxicilina; diclofenac; lisinopril; ceftriaxona; captopril; salmeterol; xinafoato; imipenem; cilastatina; benazepril; cefaclor; ceftazidima; morfina; dopamina; bialamicol; fluvastatina; fenamidina; acido podofilmico; 2-etilhidrazina; acriflavina; cloroazodina; arsfenamina; amicarbilida; aminoquinurida; quinapril; oximorfona; buprenorfina; floxuridina; diritromicina; doxiciclina; enoxacina; enviomicina; epicilina; eritromicina; leucomicina(s); lincomicina; lomefloxacino; lucensomicina; limeciclina; meclociclina; meropenem; metaciclina; micronomicina; midecamicina(s); minociclina; moxalactama; mupirocina; nadifloxacino; natamicina; neomicina; netilmicina; norfloxacino; oleandomicina; oxitetraciclina; p-sulfanililbencilamina; panipenem; paromomicina; pazufloxacino; penicilina N; pipaciclina; acido pipeirndico; polimixina; primicina; quinacilina; ribostamicina; rifamida; rifampina; rifamicina SV; rifapentina; rifaximina; ristocetina; ritipenem; rokitamicina; rolitetraciclina; rosaramicina; roxitromicina; salazosulfadimidina; sanciclina; sisomicina; esparfloxacino; espectinomicina; espiramicina; estreptomicina; succisulfona; sulfacrisoidina; acido sulfaloxico; sulfamidocrisoidina; acido sulfamlico; sulfoxona; teicoplanina; temafloxacino; temocilina; tetroxoprim; tianfenicol; tiazolsulfona; tiostreptona; ticarcilina; tigemonam;
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Se pueden hallar listas de agentes terapeuticos adicionales, por ejemplo, en: Physicians' Desk Reference, 55a ed., 2001, Medical Economics Company, Inc., Montvale, N.J.; USpN Dictionary of USAN and International Drug Names, 2000, The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md.; y The Merck Index, 12a ed., 1996, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J.
El agente terapeutico tambien puede incluir radionuclidos cuando la presente nanopartfcula se usa en la radioterapia selectiva. En una realizacion, se asocian radionuclidos emisores beta de baja energfa, tales como construcciones con quelatos de 177Lu, con la nanopartfcula y se usan para tratar masas tumorales relativamente pequenas o una enfermedad micrometastasica. En otra realizacion, se pueden usar emisores beta de mayor energfa, tales como itrio- 90 (90Y), para tratar masas tumorales mayores. Tambien se puede usar yodo-131 (131I) para la radioterapia.
La superficie de la nanopartfcula se puede modificar para que incorpore al menos un grupo funcional. El polfmero organico (p.ej., PEG) unido a la nanopartfcula se puede modificar para que incorpore al menos un grupo funcional. Por ejemplo, el grupo funcional puede ser una maleimida o ester de W-hidroxisuccinimida (NHS). La incorporacion del grupo funcional hace posible unir diversos ligandos, agentes de contraste y/o agentes terapeuticos a la nanopartfcula.
En una realizacion, se une un agente terapeutico a la nanopartfcula (a la superficie o al revestimiento de polfmero organico) por medio de un grupo funcional de ester de NHS. Por ejemplo, se puede acoplar un inhibidor de tirosina quinasa, tal como dasatinib (BMS), o un agente quimioterapico (p.ej., taxol), por medio de un enlace ester a la nanopartfcula. Este enlace ester se puede escindir despues en un medio acido o enzimaticamente in vivo. Se puede usar esta aproximacion para administrar un profarmaco a un sujeto, en el que el farmaco se libera de la partfcula in vivo.
Se ha ensayado la aproximacion con profarmaco acoplando el inhibidor de molecula pequena dasatinib con las moleculas de PEG de la nanopartfcula. Basandose en los resultados de la biodistribucion y los calculos de dosificacion del farmaco en humanos, se ha descubierto que la nanopartfcula tiene propiedades biologicas unicas, que incluyen un aclaramiento relativamente rapido de la sangre en comparacion con los tumores, y la posterior acumulacion en el tejido tumoral del agente terapeutico, lo que sugiere que es viable una aproximacion con profarmaco. La nanopartfcula funcionalizada permite que los farmacos se dosifiquen multiples veces, lo que asegura que la concentracion de farmaco en el tumor sea mayor que la especificada por la CI-50 en el tejido tumoral, y todavfa no sea limitante de la dosis para otros tejidos de organos, tales como el corazon, fugado o rinon. El agente terapeutico y la nanopartfcula se pueden radiomarcar o marcar opticamente por separado, lo que permite la monitorizacion independiente del agente terapeutico y la nanopartfcula. En una realizacion, se acopla dasatinib radiofluorado (es decir, 18F) con restos de PEG-3400 unidos a la nanopartfcula por medio de uniones ester de NHS. El radiofluor es crucial para poder monitorizar independientemente los cambios dependientes del tiempo en la distribucion y la liberacion del farmaco de la nanopartfcula fluorescente (Cy5) radioyodada (124I). De esta manera, se puede monitorizar por separado el profarmaco (dasatinib) y la nanopartfcula. Esto permite la optimizacion del diseno del profarmaco en comparacion con los metodos de la tecnica anterior, en los que no se usa una aproximacion de doble marcaje. En otra realizacion, las moleculas de yodo radioterapeuticas (es decir, I-131), u otros emisores gamma o alfa terapeuticos, se conjugan con PEG por medio de un grupo funcional maleimida, en el que el agente terapeutico no se puede disociar del PEG in vivo.
Para que la presente nanopartfcula acomode facilmente una gran variedad de ligandos, agentes de contraste o quelatos, se puede modificar la superficie de la nanopartfcula para que incorpore un grupo funcional. La nanopartfcula tambien se puede modificar con polfmeros organicos (p.ej., PEGs) o quelatos que pueden incorporar un grupo funcional. Mientras tanto, el ligando, agente de contraste o agente terapeutico se modifica para que incorpore un grupo funcional que sea capaz de reaccionar con el grupo funcional sobre la nanopartfcula, o sobre los PEGs o agentes quelantes unidos a la nanopartfcula en condiciones adecuadas. Por lo tanto, cualquier ligando, agente de contraste o agente terapeutico que tenga el grupo funcional reactivo es capaz de conjugarse facilmente a
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la nanopartfcula. Esta aproximacion generalizable se denomina en la presente memoria "qmmica click", que permitina una gran versatilidad en la exploracion de aplicaciones multimodales. Cualquier mecanismo de reaccion adecuado en la presente invencion se puede adaptar a la "qmmica click", con tal de que se pueda conseguir una union simple y controlada del ligando, agente de contraste o quelato a la nanopartfcula. En una realizacion, se introduce un enlace triple libre en PEG, que ya esta conjugado de manera covalente a la cubierta de la nanopartfcula. Mientras tanto, se introduce un enlace azida en el ligando deseado (o agente de contraste, quelato). Cuando la nanopartfcula PEGilada y el ligando (o agente de contraste, quelato) se mezclan en presencia de un catalizador de cobre, se dara la cicloadicion de la azida al enlace triple, lo que da como resultado la conjugacion del ligando a la nanopartfcula. En una segunda realizacion, se puede introducir un grupo funcional de maleimida y un grupo tiol en la nanopartfcula y el ligando deseado (o agente de contraste, quelato), en donde la nanopartfcula tiene el grupo funcional de maleimida, y el ligando (o agente de contraste, quelato) tiene el grupo tiol, o viceversa. El enlace doble de maleimida reacciona facilmente con el grupo tiol para formar un enlace carbono-azufre estable. En una tercera realizacion, se puede introducir un grupo funcional de ester activado, p.ej., un grupo ester de succinimidilo, y un grupo amina en la nanopartfcula y el ligando deseado, agente de contraste o quelato. El grupo ester activado reacciona facilmente con el grupo amina para formar un enlace amida estable carbono-nitrogeno.
Tras la administracion de la presente nanopartfcula a un sujeto, la semivida de la permanencia en la sangre de las nanopartfculas puede oscilar de alrededor de 2 horas a alrededor de 25 horas, de alrededor de 3 horas a alrededor de 20 horas, de alrededor de 3 horas a alrededor de 15 horas, de alrededor de 4 horas a alrededor de 10 horas, o de alrededor de 5 horas a alrededor de 6 horas. Una semivida mas larga de permanencia en la sangre significa una circulacion mas larga, que permite que se acumulen mas nanopartfculas en el sitio objetivo in vivo. La semivida de permanencia en la sangre se puede determinar como sigue. Las nanopartfculas se administran primero a un sujeto (p.ej., un raton, un minicerdo o un ser humano). En diversos momentos tras la administracion, se toman muestras de sangre para medir las concentraciones de nanopartfculas por medio de metodos adecuados.
Tras la administracion de la presente nanopartfcula a un sujeto, la semivida de permanencia en el tumor de las presentes nanopartfculas puede oscilar de alrededor de 5 horas a alrededor de 5 dfas, de alrededor de 10 horas a alrededor de 4 dfas, de alrededor de 15 horas a alrededor de 3,5 dfas, de alrededor de 20 horas a alrededor de 3 dfas, de alrededor de 2,5 dfas a alrededor de 3,1 dfas, de alrededor de 1 dfa a 3 dfas, o alrededor de 73,5 horas.
La proporcion de la semivida de permanencia en el tumor respecto de la semivida de permanencia en la sangre de la nanopartfcula puede oscilar de alrededor de 2 a alrededor de 30, de alrededor de 3 a alrededor de 20, de alrededor de 4 a alrededor de 15, de alrededor de 4 a alrededor de 10, de alrededor de 10 a alrededor de 15, o alrededor de 13.
En una realizacion, para estimar los valores de semivida de permanencia (o aclaramiento) de las nanopartfculas radiomarcadas (T1/2) en la sangre, el tumor, y otros organos/tejidos importantes, se mide el porcentaje de los valores de la dosis inyectada por gramo (%DI/g) sacrificando grupos de ratones en momentos especificados tras la administracion de las nanopartfculas. Se recogen la sangre, el tumor, y los organos, se pesan, y se cuentan en un contador y de centelleo. Los valores de %DI/g se corrigen respecto de la desintegracion radiactiva en el momento de la inyeccion. Los datos de tiempo-concentracion de actividad resultantes para cada tejido se ajustan a una funcion monoexponencial decreciente para estimar los valores de T1/2 del tejido/organo.
Tras la administracion de la presente nanopartfcula a un sujeto, el aclaramiento renal de las presentes nanopartfculas puede oscilar de alrededor del 10% de DI (dosis inicial) a alrededor del 100% de DI en alrededor de 24 horas, de alrededor del 20% de DI a alrededor del 90% de DI en alrededor de 24 horas, de alrededor del 30% de DI a alrededor del 80% de DI en alrededor de 24 horas, de alrededor del 40% de DI a alrededor del 70% de DI en alrededor de 24 horas, de alrededor del 40% de DI a alrededor del 60% de DI en alrededor de 24 horas, de alrededor del 40% de DI a alrededor del 50% de DI en alrededor de 24 horas, o alrededor del 43% de DI en alrededor de 24 horas. El aclaramiento renal se puede determinar como sigue. Las nanopartfculas se administran primero a un sujeto (p.ej., un raton, un minicerdo o un ser humano). En diversos momentos tras la administracion, se toman muestras de orina para medir las concentraciones de nanopartfculas por medio de metodos adecuados.
En una realizacion, se ensaya el aclaramiento renal (p.ej., la fraccion de nanopartfculas excretadas en la orina a lo largo del tiempo) como sigue. A un sujeto se le administran las presentes nanopartfculas, y se recogen muestras de orina a lo largo de un cierto periodo de tiempo (p.ej., 168 horas). Las concentraciones de partfculas en cada punto de tiempo se determinan mediante el uso de analisis fluorimetricos, y se genera una curva de calibracion de diluciones en serie a partir de medidas de senales de fluorescencia con correccion del fondo de las muestras de orina mezcladas con concentraciones conocidas de partfculas (%DI). Los valores de concentracion, junto con las estimaciones de los volumenes medios diarios de orina de los ratones, se usan para calcular la %DI/g de orina acumulativa excretada. En otra realizacion, se ensaya el aclaramiento renal de las nanopartfculas radiomarcadas midiendo las actividades en muestras de orina (cuentas por minuto) a lo largo de intervalos de tiempo similares mediante el uso, por ejemplo, de un contador y, y tras la administracion de las nanopartfculas para calcular la excrecion acumulativa en orina.
En una tercera realizacion, para determinar la excrecion fecal acumulativa, se recogen las heces en jaulas metabolicas a lo largo de intervalos de tiempo similares tras la administracion de las nanopartfculas y se determinan
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las actividades de las muestras mediante el uso de un contador y.
Cuando las nanopartfculas se administran a un sujeto en una cantidad de alrededor de 100 veces la dosis humana equivalente, no se observa sustancialmente anemia, perdida de peso, agitacion, respiracion incrementada, alteracion GI, comportamiento anormal, disfuncion neurologica, anormalidades hematologicas, anormalidades bioqmmicas, lesiones relacionadas con farmacos en la patologfa de organos, mortalidad, o una combinacion de las mismas, en alrededor de 10 a alrededor de 14 dfas.
Cuando la presente nanopartfcula contiene al menos un ligando unido, el aumento de la multivalencia de la nanopartfcula (p.ej., en comparacion con el ligando solo) puede oscilar de alrededor de 1,5 veces a alrededor de 10 veces, de alrededor de 2 veces a alrededor de 8 veces, de alrededor de 2 veces a alrededor de 6 veces, de alrededor de 2 veces a alrededor de 4 veces, o alrededor de 2 veces.
Las nanopartfculas de la presente invencion muestran parametros fisicoqmmicos y biologicos in vitro e in vivo inesperados, a la vista de la tecnica anterior. Por ejemplo, la semivida de permanencia en la sangre estimada para las nanopartfculas unidas a ligando (p.ej., alrededor de 5,5 hrs para las nanopartfculas unidas a cRGD) es sustancialmente mas larga que la del ligando correspondiente (p.ej., alrededor de 13 minutos para cRGD). Montet et al. Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 6087-6093 (2006). Las semividas prolongadas de permanencia en la sangre pueden aumentar la biodisponibilidad de una sonda, facilitar la seleccion como objetivo de tumores, y proporcionar una mayor absorcion en el tumor a lo largo de periodos de tiempo mas largos. En una realizacion, la semivida de permanencia en el tumor para las nanopartfculas selectivas (es decir, nanopartfculas unidas a ligando) es alrededor de 13 veces mayor que la semivida de permanencia en la sangre, mientras la semivida de permanencia en el tumor para las nanopartfculas no selectivas (es decir, las nanopartfculas correspondientes sin unir a ligandos) es solamente alrededor de 5 veces mayor que la semivida de permanencia en la sangre. Esta diferencia sugiere una acumulacion en el tejido tumoral sustancialmente mayor de las nanopartroulas selectivas en comparacion con las nanopartroulas no selectivas. En ciertas realizaciones, dado el numero de ligandos unidos a la nanopartroula, las presentes nanopartroulas muestran una union de afinidad elevada inesperada (p.ej., Kd 0,51 nM y CI50 1,2 nM para la nanopartroula unida a cRGD), un aumento de la multivalencia (p.ej., un aumento de mas de 2 veces para las nanopartroulas unidas a cRGD en comparacion con el peptido cRGD solo), una absorcion tumoral diferencial significativa (p.ej., las nanopartroulas con PEG unidas a cRGD muestran un incremento de alrededor de 3 a 4 veces en la absorcion tumoral diferencial respecto de las nanopartroulas revestidas con PEG a lo largo de 72 hrs tras la administracion), y un contraste tumoral significativo respecto del musculo normal (p.ej., alrededor de 3 a 5 veces a lo largo de 72 hrs tras la administracion) basandose en las proporciones de absorcion en el tumor respecto del musculo.
En una realizacion, se descubrieron incrementos de la concentracion de actividad del triple para las nanopartroulas unidas a ligando en tumores que expresaban integrina respecto de los controles (p.ej., nanopartroulas unidas a ligando en tumores que no expresaban integrina, o las nanopartroulas correspondientes no unidas a ligandos en tumores que expresaban integrina) en el momento de la absorcion tumoral maxima (alrededor de 4 hrs tras la inyeccion de las nanopartroulas). Ademas, las proporciones de absorcion en el tumor respecto del musculo para las nanopartroulas selectivas (es decir, nanopartroulas unidas a ligando) revelo un contraste del tejido tumoral incrementado respecto del musculo normal, en comparacion con el contraste del tejido tumoral disminuido respecto del musculo normal para las nanopartroulas no selectivas (es decir, las nanopartroulas correspondientes no unidas a ligandos), lo que sugiere que las nanopartroulas selectivas lo son hacia el tumor.
En otra realizacion, tanto las nanopartroulas selectivas como las no selectivas muestran una excrecion renal eficaz a lo largo del mismo periodo de tiempo. Practicamente la mitad de la dosis inyectada se excreta a lo largo de las primeras 24 hrs tras la inyeccion, y alrededor del 72% en 96 hrs, lo que sugiere que la mayor parte de la excrecion se dio en el primer dfa tras la inyeccion. En contraste, los perfiles de excrecion fecal de las nanopartroulas selectivas indican que, de media, se elimina un 7% y 15% de la dosis inyectada a lo largo de 24 y 96 hrs, respectivamente.
Los parametros fisicoqmmicos y biologicos de las nanopartroulas atoxicas, junto con su capacidad de imagenologfa multimodal (p.ej., imagenologfa de PET y optica), ampifan el alcance de sus aplicaciones biomedicas potenciales. Las aplicaciones incluyen (a) la monitorizacion a largo plazo: el tiempo prolongado en la circulacion sangmnea y la biodisponibilidad correspondiente de las nanopartroulas resaltan su versatilidad para la monitorizacion temprana y a largo plazo de diversas etapas del tratamiento de enfermedades (tales como el cribado de diagnostico, la evaluacion antes del tratamiento, la intervencion terapeutica, y la monitorizacion tras el tratamiento) sin las limitaciones impuestas por las consideraciones sobre la toxicidad; (b) una penetracion tumoral mejorada: las propiedades de aclaramiento de las nanopartroulas selectivas (p.ej., su aclaramiento renal es mas lento que el de las sondas moleculares de la tecnica anterior) seran utiles para diversos tipos de aplicaciones biologicas. Por ejemplo, las nanopartroulas senan especialmente utiles en casos de tumores solidos escasamente vascularizados y relativamente inaccesibles en los que la localizacion de los agentes en general es lenta tras la administracion sistemica; (c) capacidad de imagenologfa multimodal: estas modalidades se pueden combinar en multiples escalas (es decir, a nivel de cuerpo completo hasta nivel celular) para conseguir informacion biologica sensible a la profundidad y complementaria. Por ejemplo, en la cartograffa de NLC, se pueden cartografiar los nodulos profundos mediante PET con respecto a su distribucion y numero, mientras se puede obtener una localizacion mas precisa y detallada de los nodulos superficiales mediante la imagenologfa de fluorescencia; y (d) agentes terapeuticos
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selectivos: se puede aprovechar el aclaramiento mas largo de las nanopartfculas selectivas del tumor en comparacion con las de la sangre para aplicaciones diagnosticas/terapeuticas combinadas, en las que las nanopartfculas pueden servir como vetnculo de administracion de agentes radioterapeuticos o farmacos.
Tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende la presente nanopartfcula. Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar de manera oral como una forma farmaceutica unitaria adecuada. Las composiciones farmaceuticas se pueden preparar en muchas formas, que incluyen los comprimidos, capsulas de gelatina dura o blanda, soluciones acuosas, suspensiones, y liposomas y otras formulaciones de liberacion lenta, tales como geles polimericos moldeados.
Los modos adecuados de administracion para la presente nanopartfcula o composicion incluyen, pero sin limitacion, la administracion oral, intravenosa, rectal, sublingual, mucosa, nasal, oftalmica, subcutanea, intramuscular, transdermica, raqmdea, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoidea, bronquial, y linfatica, y otras formas farmaceuticas para la administracion sistemica de ingredientes activos. La presente composicion farmaceutica se puede administrar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, que incluye, sin limitacion, la administracion transdermica (pasiva por medio de un parche, gel, crema, pomada o iontoforesis); intravenosa (inyeccion rapida, infusion); subcutanea (infusion, liberacion lenta); transmucosa (bucal y sublingual, p.ej., comprimidos orodispersables, obleas, pelfculas, y formulaciones efervescentes; conjuntiva (gotas oculares); rectal (supositorio, enema)); o intradermica (inyeccion rapida, infusion, liberacion lenta). La composicion se puede administrar de manera topica.
Las composiciones farmaceuticas lfquidas orales pueden estar en forma, por ejemplo, de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o se pueden presentar en forma de un producto seco para la reconstitucion con agua u otro vetnculo adecuado antes del uso. Tales composiciones farmaceuticas lfquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como agentes de suspension, agentes emulsionantes, vehnculos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), o conservantes.
Las composiciones farmaceuticas de nanopartfculas se pueden formular tambien para la administracion parenteral (p.ej., mediante inyeccion, por ejemplo, inyeccion rapida o infusion continua), y se pueden presentar en una forma farmaceutica unitaria en ampollas, jeringas prerrellenas, recipientes de infusion de pequeno volumen o recipientes multidosis con un conservante anadido. Las composiciones farmaceuticas pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehnculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. De manera alternativa, las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden estar en forma de polvo, obtenido mediante el aislamiento aseptico de un solido esteril o mediante la liofilizacion de una disolucion, para la reconstitucion con un vetnculo adecuado, p.ej., agua esteril, apirogena, antes del uso.
Para la administracion topica en la epidermis, las composiciones farmaceuticas se pueden formular en forma de pomadas, cremas o lociones, o como el ingrediente activo de un parche transdermico. Los sistemas adecuados de administracion transdermica se describen, por ejemplo, en A. Fisher et al. (pat. de EE.UU. n° 4.788.603), o R. Bawa et al. (pat. de EE.UU. n°s 4.931.279; 4.668.506; y 4.713.224). Las pomadas y las cremas se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adicion de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y, en general, tambien contendran uno o mas agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes de dispersion, agentes de suspension, agentes espesantes o agentes colorantes. Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar tambien por medio de ionoforesis, p.ej., como se describio en las pat. de EE.UU. n°s 4.140.122; 4.383.529; o 4.051.842.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion topica en la boca incluyen formas farmaceuticas unitarias tales como pastillas que comprenden una composicion farmaceutica de la invencion en una base con sabor, normalmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto; pastillas que comprenden la composicion farmaceutica en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga; geles mucoadherentes, y colutorios que comprenden la composicion farmaceutica en un vetnculo lfquido adecuado.
Para la administracion topica en el ojo, las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en forma de gotas, geles (S. Chrai et al., pat. de EE.UU. n° 4.255.415), gomas (S. L. Lin et al., pat. de EE.UU. n° 4.136.177), o por medio de un inserto ocular de liberacion prolongada (A. S. Michaels, pat. de EE.UU. n° 3.867.519 y H. M. Haddad et al., pat. de EE.UU. n° 3.870.791).
Cuando se desee, las composiciones farmaceuticas anteriormente descritas se pueden adaptar para proporcionar la liberacion sostenida de un compuesto terapeutico empleado, p.ej., mediante la combinacion con ciertas matrices de polfmeros hidrofilos, p.ej., que comprenden geles naturales, geles de polfmeros sinteticos o mezclas de los mismos.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion rectal en las que el vetnculo es un solido se presentan mas preferiblemente en forma de supositorios de dosis unitarias. Los vehnculos adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales usados habitualmente en la tecnica, y los supositorios se pueden formar de manera conveniente mezclando la composicion farmaceutica con el/los vehnculo(s) ablandado(s) o fundido(s), seguido de enfriamiento y moldeo.
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Las composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion vaginal se pueden presentar en forma de ovulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o aerosoles que contienen, ademas de las nanopartfculas y el agente terapeutico, vetuculos que se conocen bien en la tecnica.
Para la administracion mediante inhalacion, las composiciones farmaceuticas segun la invencion se administran de manera conveniente desde un insuflador, nebulizador o un envase presurizado u otro medio adecuado para administrar un aerosol. Los envases presurizados pueden comprender un propelente adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar proporcionando una valvula para liberar una cantidad medida.
De manera alternativa, para la administracion mediante inhalacion o insuflacion, las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tomar la forma de una composicion de polvos secos, por ejemplo, una mezcla de polvos de la composicion farmaceutica y de una base adecuada en polvo, tal como lactosa o almidon. La composicion de polvos se puede presentar en una forma farmaceutica unitaria, por ejemplo, en capsulas o cartuchos o, p.ej., envases de gelatina o de tipo blister desde los que se puede administrar el polvo con la ayuda de un inhalador o insuflador.
Para la administracion intranasal, las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden administrar por medio de un aerosol lfquido, tal como por medio de un atomizador de botella de plastico. Los tfpicos son Mistometer® (inhalador de isoproterenol - Wintrop) y el Medihaler® (inhalador de isoproterenol - Riker).
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden contener ademas otros adyuvantes, tales como aromatizantes, colorantes, agentes antimicrobianos, o conservantes.
Se apreciara ademas que la cantidad necesaria de las composiciones farmaceuticas para el uso en el tratamiento variara no solamente con el agente terapeutico seleccionado, sino tambien con la via de administracion, la naturaleza de la afeccion a tratar y la edad y estado del paciente, y finalmente estara bajo el criterio del medico o clmico que aplica el tratamiento. Para estudios de estos factores, vease J. F. Brien et al., Europ. J. Clin. Pharmacol., 14, 133 (1978); y Physicians' Desk Reference, Charles E. Baker, Jr., Pub., Medical Economics Co., Oradell, N.J. (41a ed., 1987). En general, las dosis del agente terapeutico cuando se usa en combinacion con las nanopartfculas fluorescentes de la presente invencion pueden ser inferiores a cuando el agente terapeutico se administra solo o en formas farmaceuticas convencionales. La elevada especificidad de la nanopartfcula fluorescente hacia un sitio objetivo, tal como un receptor situado en la superficie de una celula, puede proporcionar una concentracion relativamente muy localizada de un agente terapeutico, o, de manera alternativa, una liberacion sostenida de un agente terapeutico a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.
Las presentes nanopartfculas o composiciones se pueden administrar a un sujeto. El sujeto puede ser un marnffero, preferiblemente un ser humano. Los marnfferos incluyen, pero sin limitacion, animales murinos, ratas, conejos, simios, bovinos, ovinos, cerdos, caninos, felinos, animales de granja, animales de competicion, mascotas, equinos, y primates.
La presente invencion proporciona ademas un metodo para detectar un componente de una celula que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la celula con una nanopartfcula fluorescente basada en sflice que comprende un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice; una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; de alrededor de 1 a alrededor de 20 ligandos unidos a la nanopartfcula; y un agente de contraste o un quelato unido a la nanopartfcula; y (b) monitorizar la union de la nanopartfcula a la celula o a un componente celular (y/o su absorcion intracelular potencial) mediante al menos una tecnica de imagenologfa. La tecnica de imagenologfa puede ser la imagenologfa de PET, SPECT, CT, MRI, optica, bioluminiscencia o fluorescencia, y combinaciones de las mismas.
La localizacion del componente celular se puede detectar y determinar dentro de una celula completa metabolicamente activa, en un lisado de celulas completas, en una celula permeabilizada, en una celula fijada, o con un componente celular parcialmente purificado en un medio sin celulas. La cantidad y la duracion de la puesta en contacto puede depender, por ejemplo, de los objetivos diagnosticos o terapeuticos del metodo de tratamiento, tal como la deteccion fluorescente de los intermedios de una ruta de senalizacion estimulada (es decir, Akt, NF-kB), estados patologicos o afecciones, la administracion de un agente terapeutico, o ambos. La cantidad y la duracion de la puesta en contacto tambien pueden depender de la concentracion relativa de la nanopartfcula fluorescente respecto del analito objetivo, y del estado de la celula para el tratamiento.
La presente invencion proporciona ademas un metodo para la seleccion como objetivo de una celula tumoral que comprende administrar a un paciente de cancer una cantidad eficaz de una nanopartfcula fluorescente basada en sflice que comprende un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice; una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; un ligando unido a la nanopartfcula y capaz de unirse a un marcador tumoral; y al menos un agente terapeutico. La nanopartfcula puede estar radiomarcada. La nanopartfcula se puede administrar al paciente, pero sin limitacion, mediante las siguientes vfas: oral, intravenosa, nasal, subcutanea, local, intramuscular o transdermica.
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En ciertas realizaciones, puede ser deseable usar una mezcla de dos o mas tipos de nanopartfculas fluorescentes que tengan propiedades diferentes, tales como compuestos fluorescentes diferentes, ligandos, revestimientos de polfmeros organicos, agentes de contraste, o agentes terapeuticos para aprovechar los beneficios de seleccionar como objetivo diferentes componentes de una celula tumoral o diferentes poblaciones de las celulas tumorales, por ejemplo, de manera simultanea o secuencial.
Los metodos y composiciones de la invencion se pueden usar para ayudar a un medico o cirujano a identificar y caracterizar areas de enfermedad, tales como canceres y procesos inflamatorios/infecciosos, que incluyen, pero sin limitacion, canceres de la piel (melanoma), cabeza y cuello, prostata, cerebro, e intestino, para distinguir el tejido enfermo y el normal, tal como para detectar los margenes tumorales que son diffciles de detectar mediante el uso de un microscopio operatorio habitual, p.ej., en cirugfa del cerebro, para ayudar a prescribir una intervencion terapeutica o quirurgica, p.ej., determinando si una lesion es cancerosa y si se debena eliminar o si no es cancerosa y se debena dejar, o en la estadificacion quirurgica de una enfermedad, p.ej., estadificacion intraoperatoria de nodulos linfaticos, cartograffa de nodulos linfaticos centinela (NLC), p.ej., procedimientos de conservacion de nervios para preservar las estructuras neuronales vitales (nervios intraparotideos).
Los metodos y composiciones de la invencion se pueden usar en la deteccion de una enfermedad metastasica, monitorizacion de la respuesta a un tratamiento, cartograffa/seleccion como objetivo de NLC, procedimientos de conservacion de nervios, deteccion de una enfermedad residual, administracion selectiva de agentes terapeuticos (plataforma diagnostica/terapeutica combinada), administracion local de nanopartfculas no selectivas, que albergan farmacos (administracion en cateter), agentes terapeuticos que atraviesan la barrera hematoencefalica, tratamiento de enfermedades inflamatorias/isquemicas (es decir, cerebro, corazon, tracto urinario, vejiga), tratamiento combinado y medicion de una enfermedad (p.ej., medicion ratiometrica del pH, medicion de oxfgeno), etc.
Los metodos y las composiciones de la invencion tambien se pueden usar en la deteccion, caracterizacion y/o determinacion de la localizacion de una enfermedad, especialmente una enfermedad precoz, la gravedad de una enfermedad o una afeccion asociada a la enfermedad, la estadificacion de una enfermedad, y/o la monitorizacion de una enfermedad. La presencia, ausencia, o nivel de una senal emitida puede ser indicativa de un estado patologico. Los metodos y las composiciones de la invencion tambien se pueden usar para monitorizar y/o guiar diversas intervenciones terapeuticas, tales como procedimientos quirurgicos y basados en cateter, y en la monitorizacion de la terapia farmacologica, que incluye las terapias basadas en celulas. Los metodos de la invencion tambien se pueden usar en el pronostico de una enfermedad o afeccion. Las subpoblaciones celulares que se hallan dentro o en los margenes de la localizacion de la enfermedad, tales como celulas similares a las celulas madre ("celulas madre cancerosas") y/o celulas inflamatorias/fagodticas, se pueden identificar y caracterizar mediante el uso de los metodos y las composiciones de la invencion. Con respecto a todo lo anterior, los ejemplos de tales enfermedades o afecciones que se pueden detectar o monitorizar (antes, durante o despues de la terapia) incluyen el cancer (por ejemplo, melanoma, cancer tiroideo, colorrectal, ovarico, de pulmon, mama, prostata, cuello uterino, piel, cerebro, gastrointestinal, boca, rinon, esofagico, hueso), que se pueden usar para identificar los sujetos que tienen una susceptibilidad incrementada a desarrollar cancer y/o neoplasias malignas, es decir, que estan predispuestos a desarrollar cancer y/o neoplasias malignas, inflamacion (por ejemplo, afecciones inflamatorias inducidas por la presencia de lesiones cancerosas), enfermedad cardiovascular (por ejemplo, ateroesclerosis y afecciones inflamatorias de los vasos sangumeos, isquemia, ictus, trombosis), enfermedad dermatologica (por ejemplo, sarcoma de Kaposi, psoriasis), enfermedad oftalmica (por ejemplo, degeneracion macular, retinopatfa diabetica), enfermedad infecciosa (por ejemplo, infecciones bacterianas, virales, fungicas y parasitarias, que incluyen el Smdrome de Inmunodeficiencia Adquirida), enfermedad inmunologica (por ejemplo, un trastorno autoinmunitario, linfoma, esclerosis multiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus), enfermedad del sistema nervioso central (por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa, tal como enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer), enfermedades hereditarias, enfermedades metabolicas, enfermedades ambientales (por ejemplo, envenenamiento por plomo, mercurio y envenenamiento radiactivo, cancer de piel), enfermedad relacionada con los huesos (por ejemplo, osteoporosis, tumores oseos primarios y metastasicos, osteoartritis) y una enfermedad neurodegenerativa.
Los metodos y composiciones de la invencion, por lo tanto, se pueden usar, por ejemplo, para determinar la presencia y/o localizacion de un tumor y/o celulas similares a las celulas madre corresidentes ("celulas madre cancerosas"), la presencia y/o localizacion de celulas inflamatorias, que incluye la presencia de macrofagos activados, por ejemplo en las regiones peritumorales, la presencia y localizacion de una enfermedad vascular, que incluye areas en riesgo de oclusion aguda (es decir, placas vulnerables) en las arterias coronarias y perifericas, regiones de aneurismas en expansion, placas inestables en arterias carotidas, y areas isquemicas. Los metodos y composiciones de la invencion tambien se pueden usar en la identificacion y estudio de la muerte celular, lesion, apoptosis, necrosis, hipoxia y angiogenesis. Documento PCT/US2006/049222.
Los siguientes ejemplos se presentan con fines ilustrativos solamente, y no limitan la invencion.
Ejemplo 1 Preparacion y caracterizacion de nanopartfculas revestidas de PEG
Se sintetizaron nanopartfculas que conteman un colorante emisor en IRC (Cy-5) y se funcionalizaron mediante PEGilacion segun protocolos bien establecidos como se describio en el documento PCT/US2008/074894 y Stober et al. Controlled growth of monodispersed silica spheres in the micron size range. Colloid Interface Sci. 1968; 26:62-69.
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Ohnishi et al. J. Mol. Imaging 2005, 4:172-181. Se hizo reaccionar Cy5-maleimida con un compuesto de organosilano co-reactivo, (3-Mercaptopropil)trometoxisilano para formar un precursor de sflice fluorescente. Este precursor de sflice fluorescente se co-condenso con ortosilicato de tetraetilo para formar un nucleo basado en sflice fluorescente. Se anadio un compuesto de PEG-silano, con cadenas de poli(etilen glicol) (PEG, ~0,5 kDa) terminadas en metoxi, Metoxi(Polietilenoxi)Propil]-Trimetoxisilano, al nucleo basado en sflice fluorescente para formar un revestimiento de PEG sobre el nucleo. Las nanoparffculas revestidas de PEG se dializaron con solucion salina fisiologica (NaCl 0,15 M en H2O) a traves de membranas de dialisis 3500 MWCO Snakeskin y se filtraron de manera esteril. Todas las muestras se hicieron coincidir en la densidad optica a su longitud de onda de absorcion maxima (640 nm) antes de la inyeccion. Se realizaron medidas del tamano hidrodinamico mediante dispersion dinamica de luz (DLS) y espectroscopfa de correlacion de fluorescencia (FCS). Brevemente, las parffculas dializadas con agua se midieron en un sistema Brookhaven Instruments Company 200SM Static/DLS mediante el uso de un laser de HeNe (A = 632,8 nm). Debido al solapamiento de la absorcion del colorante con la fuente de excitacion, se usaron tiempos de integracion de 15 min para conseguir proporciones aceptables senal-ruido. Para FCS, las parffculas se dializaron con agua, se diluyeron en NaCl 0,15 M, y se midieron en un instrumento Zeiss LSM 510 Confocor 2 FCS (excitacion con HeNe a 633 nm). El instrumento se calibro por tamano antes de todas las medidas. La comparacion del brillo relativo de las nanoparffculas PEGiladas con el colorante libre se determino a partir de curvas de FCS, medido como la proporcion de cuentas por molecula/parffcula.
Ejemplo 2 Aclaramiento renal de las nanoparffculas revestidas de PEG
Se sintetizaron nanoparffculas de sflice nucleo-cubierta fluorescentes, que teman un radio hidrodinamico de alrededor de 3 nm. Se descubrio que estas nanoparffculas estaban en el intervalo de 6-10 nm de diametro, tal como se muestra mediante los resultados de dispersion dinamica de luz (DLS) (Figura 1a). La imagenologfa de fluorescencia en IRC de cuerpo completo in vivo de nanoparffculas de sflice desnudas (sin revestimiento de PEG), del orden de 6 nm y 3,3 nm, en ratones affmicos mostro un aclaramiento renal considerable 45 min tras la inyeccion, con una acumulacion significativa restante en el tugado (Figura 1b). La excrecion final a la circulacion enterohepatica se dio durante las siguientes 24 h. Basandose en estos resultados, las parffculas se revistieron de manera covalente con cadenas de poli(etilen glicol) (PEG, ~0,5 kDa) terminadas en metoxi, segun los protocolos del documento PCT/US2008/074894, para prevenir la opsonizacion y aumentar adicionalmente el aclaramiento de las parffculas mientras se mantiene un tamano hidrodinamico pequeno. Este tratamiento disminuyo la retencion en el tugado y dio como resultado una filtracion renal incrementada en la vejiga 45 min tras la inyeccion mediante la imagenologfa de fluorescencia en IRC (Figura 1c), con una fluorescencia en la vejiga visible a las 24 h. Las sondas se toleraron bien, sin efectos adversos o muertes de animales observadas a lo largo del desarrollo del estudio. La imagenologfa de PET-CT co-registrada en serie 24 hr tras la inyeccion de nanoparffculas revestidas de PEG marcadas con 124I (Figura 1d, fila superior) demostro una pequena cantidad de actividad residual en la vejiga, asf como una actividad superpuesta en el tugado/tracto gastrointestinal (centro), flanqueada por barridos de microCT y microPET adquiridos independientemente. Las imagenes de microPET en serie confirmaron los hallazgos de la imagenologfa de fluorescencia en IRC. Se descubrio que la semivida de la permanencia en la sangre de las nanoparffculas PEGiladas marcadas con 124I basandose en los cambios dependientes del tiempo de la actividad en la sangre a lo largo de un periodo de 96 horas fue de 7,3 horas. Para las nanoparffculas unidas a RGD, marcadas con 124I, se descubrio que la semivida de permanencia en la sangre fue de 5,6 horas.
Basandose en estos datos in vivo, se emprendio un estudio mas detallado sobre la biodistribucion y el aclaramiento de las nanoparffculas revestidas con los dos grupos de parffculas PEGiladas que conteman Cy5 para analizar el efecto del tamano de las sondas sobre la biodistribucion. Se generaron nanoparffculas con diametros hidrodinamicos de 3,3 ± 0,06 y 6,0 ± 0,1 nm, tal como se midio mediante espectroscopfa de correlacion de fluorescencia (FCS), (Figura 2a). Antes de los estudios in vivo, se investigaron las propiedades fotoffsicas de las parffculas para establecer sus niveles de rendimiento frente al colorante libre. A pesar del tamano de parffcula extremadamente pequeno, las moleculas de colorante encapsuladas en sflice exhibieron mejoras fotoffsicas respecto del colorante libre que aumentaron con el tamano de las parffculas, lo que incluye incrementos significativos del brillo, tal como se determino mediante la espectroscopfa de absorcion y emision (Figura 2b) y FCS (Figura 2c). En comparacion con el colorante libre, las nanoparffculas de 3,3 y 6,0 nm de diametro exhibieron incrementos del doble y triple en la semivida de fotoblanqueo, respectivamente, cuando se irradiaron con un laser de 635 nm de alta energfa (Figura 2d). Asf, se descubrio que estas sondas de nanoparffculas son brillantes y mas fotoestables que sus homologos de colorante libre.
Ademas de la determinacion semicuantitativa del comportamiento de las nanoparffculas in vivo a partir de la imagenologfa de cuerpo completo, se llevo a cabo el analisis ex vivo de homogeneizados de tejidos y fluidos mediante el uso de un lector de placas de fluorescencia, lo que permitio la cuantificacion calibrada de las variaciones observadas en la imagenologfa de fluorescencia en IRC. Las muestras se agruparon como fuentes "retenidas" (homogeneizados de Iffgado, rinon, pulmon, bazo, y sangre) y "excretadas" (orina) de fluorescencia de parffculas, se corrigieron los valores de fondo y se convirtieron en un porcentaje de la dosis inicial (% DI) por animal basandose en las curvas de calibracion. El analisis del tejido mostro una retencion minima de parffculas en los organos principales, y la mayoffa de la fluorescencia se atribuyo a la sangre circulante (Figura 3a). La retencion neta de parffculas, calculada como la suma de los componentes "retenidos", se ajusto con una curva de disminucion exponencial para determinar la cinetica de la excrecion (Figura 3b). Las parffculas mayores exhibieron una semivida mas larga en el tejido (ff/2(3,3 nm) =190 min, ff/2(6,0 nm) =350 min) y una retencion inicial mayor en los organos. Despues de 48 h, la
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partfcula de 6 nm exhibio una retencion mmima en el cuerpo (Rtotal(6,0 nm) =2,4±0,6% DI). Se usaron las muestras de orina recogidas en el momento del sacrificio, junto con los datos de calibracion de diluciones en serie, para estimar el aclaramiento renal total basandose en una estimacion conservativa del volumen medio de orina excretado por unidad de tiempo. Mediante este metodo, se estimo el %DI excretado a lo largo del tiempo para ambos tamanos de partfculas (Figura 3c).
Ejemplo 3 Nanopartfculas de sflice fluorescentes conjugadas con peptido de seleccion de integrina avp3 (modelo
de melanoma)
Para sintetizar una nanopartfcula multimodal con una afinidad elevada hacia el marcador tumoral de integrina avp3, se conjugo el hexapeptido lineal RGD (CGGRGD) a la nanopartfcula por medio de una union Cys-maleimida. Se inyectaron de manera subcutanea celulas C6 de glioma de rata a ratones macho atfmicos en los flancos. A los ~0,5 cm de diametro, se inyectaron IV nanopartfculas de s^lice desnudas o nanopartfculas PEGiladas con RGD (~500 nm/kg) a los ratones. La Figura 4 muestra la biodistribucion in vivo en ratones que no albergan tumores y en ratones que albergan tumores.
Se investigaron las caractensticas de union in vitro de nanopartfculas selectivas (unidas a RGD) y no selectivas (revestidas de PEG) hacia lmeas celulares humanas de melanoma positivas para integrina-avp3 (celulas M21) y negativas para integrina (celulas M21L) mediante el uso de citometna de flujo (Figuras 5a, 5b).
Ejemplo 4 Nanopartfculas de sflice fluorescentes conjugadas con peptido de seleccion de integrina avp3 y cartograffa de nodulos (modelo de melanoma)
Se utilizo un material biocompatible, sflice, que tiene una arquitectura que se podna ajustar exactamente a tamanos de partfcula optimizados para el aclaramiento renal. Se unieron peptidos pequenos de seleccion del objetivo y un marcador radiactivo a la superficie de las partfculas para las medidas de imagenologfa de PET en serie en un modelo de melanoma humano in vivo bien caracterizado, y se cartografiaron los nodulos linfaticos de drenaje y los canales linfaticos mediante el uso de un colorante del infrarrojo cercano (IRC) encapsulado y metodos de imagenologfa optica de fluorescencia multi-escala. Ballou et al., Sentinel lymph node imaging using quantum dots in mouse tumor models. Bioconjugate Chem. 18, 389-396 (2007). Kim et al., Near-infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping. Nat. Biotechnol. 22, 93-97 (2003). Tanaka et al, Image-guided oncologic surgery using invisible light: completed pre-clinical development for sentinel lymph node mapping. J Surg Oncol. 13, 1671-1681 (2006). Tambien se llevo a cabo un ensayo de toxicidad y se obtuvieron las dosis de radiacion en organos normales en humanos. De manera espedfica, se sintetizaron nanopartfculas de sflice nucleo-cubierta con encapsulacion de colorante del infrarrojo cercano (IRC) de ~7 nm de diametro, revestidas con cadenas de PEG y funcionalizadas en la superficie con un pequeno numero (~6-7) de peptidos de seleccion del objetivo y radiomarcadores.
Se demuestra que estas sondas son simultaneamente atoxicas, exhiben una union con elevada afinidad/avidez, una excrecion eficaz, y una absorcion diferencial significativa, y un contraste entre los tejidos tumorales y normales mediante el uso de aproximaciones de imagenologfa molecular multimodal. La deteccion, localizacion, y analisis sensible de los nodulos linfaticos y canales linfaticos, posibilitada por la fluorescencia del colorante del IRC, destaca la ventaja potencial distintiva de esta plataforma multimodal para la deteccion y estadificacion de una enfermedad metastasica en el ambito clmico, a la vez que se amplfa el intervalo inferior de los tamanos de nodulos que se pueden detectar.
Materiales y metodos
Smtesis de nanopartfculas de cRGDY-PEG y nanopartfculas de PEG
Se prepararon las partfculas mediante una condensacion de sflice de tipo Stober modificada como se describio previamente. Wiesner et al., Peg-coated Core-shell Silica Nanoparticles and Mathods of Manufactire and Use, documento PCT/US2008/74894. Larson, et al., Silica nanoparticle architecture determines radiative properties of encapsulated chromophores. Chem. Mater. 20, 2677-2684 (2008). Bogush, et al., Preparation of Monodisperse Silica Particles: Control of Size and Mass Fraction. J. Non-Cryst. Solids, 104, 95-106 (1988). Sadasivan, et al., Alcoholic Solvent Effect on Silica Synthesis-NMR and DLS Investigation. J. Sol-Gel Sci.Technol. 12, 5-14 (1998). Herz, et al., Large Stokes-Shift Fluorescent Silica Nanoparticles with Enhanced Emission over Free Dye for Single Excitation Multiplexing. Macromol Rapid Commun. 30, 1907-1910 (2009). Se conjugaron residuos de tirosina a las cadenas de PEG para la union de restos de radioyodo o yodo estable. Hermanson, Bioconjugate Techniques, (Academic Press, London, ed. 2, 2008). Todas las muestras se hicieron coincidir por densidad optica a su longitud de onda de absorcion maxima (640 nm) antes del radiomarcaje. Los peptidos cRGD se unieron a las cadenas de PEG funcionalizado por medio de una union cistema-maleimida, y se estimo el numero de peptidos cRGD unidos a la partfcula mediante el uso de medidas basadas en FCS de las concentraciones de partfculas absolutas y la concentracion inicial de los reactivos para el peptido cRGD.
Medidas comparativas del tamano hidrodinamico y del brillo relativo mediante espectroscopfa de correlacion de fluorescencia (FCS)
Las pardculas dializadas con agua se diluyeron en solucion salina fisiologica (NaCI 0,15 M en H2O) y se midieron en un instrumento Zeiss LSM 510 Confocor 2 FCS mediante el uso de excitacion con HeNe a 633 nm. El instrumento se calibro por tamano antes de todas las medidas. Las diferencias en el tiempo de difusion se usaron para determinar las variaciones en los tamanos hidrodinamicos del colorante y las especies de pardculas. Las comparaciones del 5 brillo relativo del colorante libre y de las nanopardculas de PEG y de RGDY-PEG se llevaron a cabo mediante el uso de las proporciones de cuentas por molecula/pardcula.
Radiomarcaje de conjugados de puntos C
El radiomarcaje de las nanopartfculas de cRGDY-PEG y PEG se llevo a cabo mediante el uso del metodo IODOGEN (Pierce, Rockford, IL). Piatyszek, et al., lodo-gen mediated radioiodination of nucleic acids. J. Anal. Biochem. 172, 10 356-359 (1988). Las actividades se midieron mediante un contador gamma (y) y la fluorescencia se midio mediante
el uso de un fluonmetro Varian (excitacion a 650 nm/emision a 680 nm).
Celulas y cultivo celular
Se mantuvieron lmeas celulares de melanoma humano M21 y una variante de M21 (M21-L, av negativa) en medio RPMI 1640/10% de BSA fetal, L-glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina (Instalacion Central de Preparacion de 15 Medios, Centro del Cancer Memorial Sloan-Kettering, Nueva York). Se cultivaron celulas endoteliales venosas de cordon umbilical humano (HUVECs) en medio M199/10% de suero bovino fetal, 20 pg/ml de factor de crecimiento de celulas endoteliales, 50 pg/ml de heparina, penicilina y estreptomicina.
Union a celulas in vitro y especificidad molecular de las nanopartfculas de 124I-cRGD-PEG
Para ensayar la union y especificidad de las partfculas hacia las celulas M21, se revistieron placas de 24 pocillos con 20 10 pg/ml de colageno tipo I (BD Biosciences, Bedford, MA) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y se
incubaron (37 °C, 30 min). Las celulas M21 (3,0 - 4,0 x105 celulas/pocillo) se cultivaron hasta la confluencia y se lavaron con medio RPMI 1640/0,5% de albumina de suero bovino (BSA). Se anadieron nanopartfculas de 124I-cRGD- PEG (0 - 4,0 ng/ml) a los pocillos, y las celulas se incubaron (25 °C, 4 horas), se lavaron con medio RPMI 1640/0,5% de BSA, y se disolvieron en NaOH 0,2 M. Se analizo la radiactividad mediante el uso de un contador gamma 25 automatico 1480 (Perkin Elmer) calibrado para yodo-124. Se determino la union inespedfica en presencia de un exceso de 1000 veces de cRGD (Peptides International, Louisville, KY). Se generaron representaciones de Scatchard de los datos de union y se analizaron mediante el uso de analisis de regresion lineal (Microsoft Excel 2007) para obtener los parametros de union al receptor (Kd, Bmax, CI50).
Estudios de union celular in vitro mediante el uso de metodos de deteccion optica
30 Se determino la union diferencial maxima de las nanopartfculas de cRGDY-PEG y las nanopartfculas de PEG a las celulas M21 durante una diversidad de tiempos de incubacion y concentraciones de partfculas mediante el uso de citometna de flujo, y los valores optimos se usaron en los estudios de union competitiva y especificidad. Se lavaron las celulas (3,0 x 105 celulas/pocillo) con medio RPMI 1640/0,5% de BSA, se desprendieron mediante el uso de un 0,25% de tripsina/EDTA, y se sedimentaron en un tubo de microcentnfuga (5 min a 1400 rpm, 25 °C). Los 35 sedimentos se resuspendieron en disolucion BD FACSFlow (BD Biosciences, San Jose, CA) y se analizaron en el canal de Cy5 para determinar el porcentaje de partfcula-sonda unida (FACSCalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA). Ademas se llevaron a cabo estudios de union competitiva tras la incubacion de nanopartfculas de cRGDY-PEG (2,5 ng/ml) con celulas M21, M21L, y HUVEC en presencia de cRGD en exceso y/o anticuerpo monoclonal de raton anti-integrina ayp3 humana conjugado a fluorescema (Millipore, Temecula, CA) y se analizaron 40 mediante citometna de flujo. Para estudiar la potencia de las nanopartfculas de RGDY-PEG respecto del peptido cRGD, se llevaron a cabo ensayos anti-adhesion. Se revistieron placas de microtitulacion de noventa y seis pocillos con vitronectina en PBS (5 pg/ml), seguido de 200 pl de RPMI/0,5% de BSA (1 h, 37 °C). Las celulas (3x104/100 pl/pocillo) se incubaron por cuadruplicado (30 min, 25 °C) con diversas concentraciones de nanopartfculas de cRGDY-PEG o peptido cRGD en RPMI/0,1% de BSA, y se anadieron a las placas revestidas de vitronectina (30 min, 45 37 °C). Los pocillos se lavaron suavemente con RPMi/0,1% de BSA para eliminar las celulas no adherentes; las
celulas adherentes se fijaron con un 4% de PFA (20 min, 25 °C) y se tineron con azul de metileno (1 h, 37 °C) para la determinacion de las densidades opticas, medidas con el uso de un lector de placas Tecan Safire (Aex = 650 nm, Aem = 680 nm, anchura de banda de 12 nm). El factor de aumento multivalente se calculo como la proporcion de los valores de CI50 con peptido cRGD respecto del punto de cRGDY-PEG. Montet, et al., Multivalent effects of RGD 50 peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 6087-6093 (2006).
Modelos Animales e Inoculacion de Tumores
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comite Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Centro del Cancer Memorial Sloan-Kettering, y siguieron las directrices de los Institutos Nacionales de la Salud sobre el bienestar animal. Se proporciono a ratones macho nu/nu 55 atfmicos (6-8 semanas de edad, Taconic Farms Inc, Hudson, NY) una disolucion de yoduro potasico que contema agua para bloquear la absorcion en la glandula tiroides del radioyodo libre in vivo, y se mantuvieron con una dieta Harlan Teklad Global Diet 2016, a voluntad, como se detalla en otra parte. Para generar xenoinjertos de M21 o M21L, se co-inyectaron de manera subcutanea volumenes iguales de celulas (~5x106/100 pl) y matrigel en la pata
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posterior en ratones diferentes. Los tamanos de los tumores se midieron con regularidad con un calibre, y se produjeron volumenes tumorales medios de 200 mm3.
Medidas farmacocineticas y de la semivida de permanencia (T1/2) in vivo
Se midieron las concentraciones de actividad dependiente del tiempo (%DI/g), corrigiendo la desintegracion radiactiva con respecto al tiempo de inyeccion, sacrificando grupos de ratones en momentos especificados tras la inyeccion i.v. de nanopartfculas de 124I-cRGDY-PEG o nanopartfculas de 124I-PEG (~20 pCi/raton) y recogiendo, pesando, y analizando la sangre, el tumor, y los organos en un contador y de centelleo calibrado para 124I. Los datos resultantes de concentracion de actividad-tiempo para cada tejido se ajustaron a una funcion monoexponencial decreciente para determinar los valores de T1/2 y A, el semiperiodo de permanencia en tejidos/organos y la interseccion a tiempo cero, respectivamente, de la funcion.
Se estimo la fraccion de partfculas excretadas en la orina a lo largo del tiempo mediante el uso de metodos descritos previamente. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters 9, 442-8 (2009). Brevemente, se inyectaron i.v. a ratones 200 pl de nanopartfculas de cRGDY-PEG o nanopartfculas de PEG sin marcar, y se recogieron muestras de orina a lo largo de un periodo de 168 hr (n=3 ratones por punto de tiempo). Las concentraciones de partfculas en cada punto de tiempo se determinaron mediante el uso de analisis fluorimetricos, y se genero una curva de calibracion de diluciones en serie a partir de medidas de senales de fluorescencia con correccion del fondo de las muestras de orina mezcladas con concentraciones conocidas de partfculas (%DI). Los valores de concentracion, junto con las estimaciones de los volumenes medios diarios de orina de los ratones, se usaron para calcular la %DI/g de orina acumulativa excretada a lo largo del tiempo. Para determinar la excrecion fecal acumulativa, se usaron jaulas metabolicas para recoger las heces a lo largo de un intervalo de tiempo similar tras la inyeccion i.v. de 200 pl de nanopartfculas de 124I-cRGDY-PEG (n=4 ratones por punto de tiempo). Se midieron las actividades de las muestras mediante el uso de un contador y calibrado para 124I.
Dosimetna
Las funciones de actividad-tiempo obtenidas para cada tejido se integraron analfticamente (con la inclusion del efecto de la desintegracion radiactiva) para proporcionar la actividad acumulativa correspondiente (es decir, el numero total de desintegraciones radiactivas). Despues se calcularon las dosis absorbidas de 124I en los organos de los ratones multiplicando la actividad acumulativa por la constante de dosis en equilibrio de 124I para las radiaciones no penetrantes (positrones), suponiendo una absorcion local completa de tales radiaciones e ignorando la contribucion de las radiaciones penetrantes (es decir, rayos y). Eckerman, et al., Radionuclide Data and Decay Schemes, 2a ed. Reston, VA: Society of Nuclear Medicine; 1989. Las actividades acumuladas en los organos normales de los ratones se convirtieron en actividades acumuladas en los organos normales humanos mediante el ajuste de las diferencias de masas corporales totales y de los organos entre los ratones y los seres humanos (hombre medio de 70 kg). Cristy, et al., Specific absorbed fractions of energy at various ages from internal photon sources (I-VII). Oak Ridge National Laboratory Report ORNL/TM-8381/V1-7. Springfield, VA: Servicio Nacional de Informacion Tecnica, Dep. de Comercio; 1987. Las actividades acumuladas en organos normales humanos calculadas se introdujeron en el programa informatico de dosimetna OLINDA para calcular, mediante el uso del formalismo del Comite de Dosimetna Interna Medica (MIRD) de la Sociedad de Medicina Nuclear, las dosis absorbidas por los organos de un hombre medio. Loevinger, et al., MIRD Primer for Absorbed Dose Calculations (Sociedad de Medicina Nuclear, Nueva York, 1991). Stabin, et al., OLINDA/EXM: the second-generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine. J. Nucl Med. 46, 1023-1027 (2005).
Estudios de toxicidad aguda e histopatologfa
Los ensayos de toxicidad aguda se llevaron a cabo con seis grupos de ratones B6D2F1 macho y hembra (7 semanas de edad, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). El grupo de tratamiento (n=6 machos, n=6 hembras) recibio la sonda selectiva sin marcar (nanopartfculas de 127I-RGDY-PEG), y el grupo de control (n=6 machos, n=6 hembras) nanopartfculas de PEG yodadas sin marcar (vehfculo, nanopartfculas de 127I-RGDY-PEG) en una unica inyeccion i.v. (200 pl). Ademas se ensayaron controles sin tratar (n=2 machos, n=2 hembras). Los ratones se observaron diariamente a lo largo de 14 dfas p.i. en busca de signos de morbilidad/mortalidad y cambios de peso, y se llevo a cabo una necropsia macroscopica, histopatologfa, y toma de muestras de sangre para hematologfa y determinaciones bioqmmicas en suero a los 7 y 14 dfas p.i (Fig. 10 y Tabla 3).
Imagenologfa de PET en serie de la seleccion espedfica de tumores
Se llevo a cabo la imagenologfa mediante el uso de un escaner de PET para animales pequenos (Focus 120 microPET; Concorde Microsystems, Nashville, TN). Se mantuvo a ratones que albergaban tumores M21 o M21L en las patas traseras con anestesia del 2% de isoflurano en oxfgeno a 2 L/min durante todo el periodo de escaneo. Se iniciaron adquisiciones de una hora en modo lista en el momento de la inyeccion i.v. de 200 pCi de nanopartfculas de 124I-cRGDY-PEG o nanopartfculas de 124I-PEG en todos los ratones, seguido de imagenes estaticas cada 30 min en serie a lo largo de un intervalo de 96 horas. Los datos de imagenes se corrigieron con respecto a la falta de uniformidad de la respuesta del escaner, perdidas de cuentas en tiempos muertos, cuentas aleatorias, y la
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desintegracion ffsica en el momento de la inyeccion. Las tasas de cuentas de voxeles en las imagenes reconstruidas se convirtieron en concentraciones de actividad (%DI/g) mediante el uso de un factor de calibracion del sistema medido. El analisis de la region de interes (ROI) tridimensional de las imagenes reconstruidas se llevo a cabo mediante el uso del programa informatico ASIPro (Concorde Microsystems, Nashville, TN) para determinar la media, el maximo, y la DE de la absorcion de la sonda en los tumores. Las proporciones de concentraciones de actividad tumor-musculo se obtuvieron dividiendo los valores de %DI/g del tumor obtenidos de las imagenes por los valores de %DI/g de musculo con el contador y.
Cartograffa de nodulos mediante el uso combinado de la imagenologfa y microscopfa de fluorescencia en IRC
A ratones atfmicos que albergaban tumores en las patas traseras se les inyectaron mediante una administracion peritumoral, en 4 cuadrantes, volumenes iguales de una muestra de puntos de cRGDY-PEG de 50 pl, y se les dejo deambular libremente. Tras un intervalo de 30 min a 1 hr, los ratones se anestesiaron con una mezcla de un 2% de isoflurano/98% de oxfgeno, y se hizo verticalmente una incision superficial en la lmea paramediana a lo largo de la cara ventral del raton para exponer quirurgicamente la region desde el miembro posterior hasta la axila ipsilateral al tumor. La imagenologfa optica in situ de nodulos locorregionales (es decir, inguinales, axilares) y los conductos linfaticos de drenaje (que incluyen la region axilar) se llevo a cabo mediante el uso de un microscopio de fluorescencia macroscopico equipado con filtros de paso de banda ancha de 650±20 nm de excitacion en IRC y de 710 nm de emision. Ademas se adquirieron imagenes opticas de cuerpo completo (instrumento de imagenologfa Maestro de Cambridge Research Instruments) y se sometieron a deconvolucion espectral como se informo previamente. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters 9, 442-8 (2009).
Analisis Estadfstico
Se llevaron a cabo analisis estadfsticos que compararon grupos de ratones con tumores que recibieron sondas selectivas/no selectivas o que albergaron tumores M21/M21L, mediante el uso de una prueba U de Mann-Whitney unilateral, y P<0,05 se considero estadfsticamente significativo. Para los estudios de biodistribucion, se compararon
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los valores de %DI/g medios espedficos de tejido de nanopartfculas de I-cRGDY-PEG (n=7 ratones) y de I- PEG (control, n=5 ratones) en cada punto de tiempo, y se observaron diferencias estadfsticamente significativas en las actividades del marcador en la sangre, los tumores, y los organos principales a las 4 y 96 hrs p.i., asf como a las 24 hrs p.i. para los tumores y otros tejidos (Tabla 1). Para los estudios de seleccion como objetivo de tumores, se descubrio que las diferencias de los valores medios de %DI/g entre los ratones con tumores M21 (n=7) y M21L (n=5), asf como los ratones que recibieron sondas de control (n=5), fueron maximos a las 4 hrs p.i. (p=0,0015 para ambos controles), y permanecieron significativamente elevados a las 24 hrs (p=0,0015 y p=0,004, respectivamente), 48 hrs (p=0,001 y p=0,003, respectivamente), 72 hrs (p=0,015 y 0,005, respectivamente), y 96 hrs (p=0,005 para M21-M21L). Se descubrio que las proporciones tumor-musculo para las nanopartfculas de 124I-cRGDY-PEG (n=7) frente a las nanopartfculas de 124I-PeG (n=5) fueron estadfsticamente significativas a las 24 hrs p.i. (p=0,001) y 72 hrs p.i. (p=0,006), pero no a las 4 hrs p.i. (p=0,35). Se determino la calidad de los valores de ajuste (R2), junto con sus valores de p asociados, para la curva de calibracion de orina (R2=0,973, p=0,01), asf como para las curvas de excrecion de %DI acumulativa urinaria (R2 > 0,95, p=0,047) y fecal (R2> 0,995, p<0,002) mediante el uso de un analisis de regresion no lineal (SigmaPlot, Systat, v. 11.0).
Resultados
Diseno y Caracterizacion de Nanopartfculas
Se prepararon nanopartfculas de sflice nucleo-cubierta que encapsulaban el colorante Cy5 (maximo de emision >650 nm), revestidas con cadenas de polietilen glicol (PEG) terminadas en metoxi (PEG ~0,5 kDa), segun los protocolos publicados previamente. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters, 9, 442-8 (2009). Ow, et al., Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Lett. 5, 113-117 (2005). El revestimiento de PEG neutro previno la absorcion inespedfica por parte del sistema reticuloendotelial (opsonizacion). El uso de PEGs bifuncionales posibilito la union de un pequeno numero (~6-7 por partfcula) de ligandos peptfdicos de arginina-glicina-acido aspartico dclicos (cRGDY) selectivos de integrina ayp3 para mantener un tamano hidrodinamico pequeno, lo que facilito un aclaramiento renal eficaz. Los ligandos peptfdicos se marcaron ademas con 124I por medio del uso de un ligador de tirosina para proporcionar una senal con la que se pudiesen formar imagenes cuantitativamente en tres dimensiones mediante PET (puntos de 124I-cRGDY- PEG, Fig. 6A); una ventaja practica importante del 124I de vida relativamente larga (periodo de semidesintegracion ffsico: 4,2 d) es que sigue habiendo una senal suficiente durante un tiempo suficiente para permitir la radiodeteccion durante al menos varios dfas tras la administracion, cuando la actividad de fondo se ha eliminado en gran medida y se maximiza el contraste tumor-fondo. La pureza de la nanopartfcula selectiva radiomarcada fue >95% mediante radiocromatograffa en capa fina. La estabilidad de la nanopartfcula selectiva sin radiomarcar es de alrededor de 1 ano mediante medidas de FCS. La partfcula se excreta intacta en la orina mediante analisis FCS. Tal como se usa en la presente memoria, "punto" y "nanopartfcula" se usan de manera intercambiable. Una partfcula revestida con PEG que contema un residuo de tirosina para el marcaje con 124I sirvio como sonda de control (puntos de 124I-PEG). La purificacion de las muestras radiomarcadas mediante cromatograffa de exclusion por tamanos (Fig. 7) dio como resultado rendimientos radioqmmicos >95%. Se midieron diametros hidrodinamicos de ~7 nm de d.i. para los puntos
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de cRGDY-PEG no radiactivos y para los puntos de PEG mediante espectroscop^a de correlacion de fluorescencia (FCS) (Fig. 6B y 6C). Se determino que el brillo relativo de los puntos de crGdY-PEG, de media, fue un 200% mayor que el del colorante libre (Fig. 6C), de manera coherente con los resultados anteriores. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters, 9, 442-8 (2009). Larson, et al., Silica nanoparticle architecture determines radiative properties of encapsulated chromophores. Chem. Mater. 20, 2677-2684 (2008). Basandose en estas propiedades fisicoqmmicas, se tuvo previsto alcanzar un equilibrio favorable entre la absorcion selectiva en el tumor y la retencion frente al aclaramiento renal de la partfcula selectiva, por lo que se maximizana la localizacion en el tejido objetivo mientras se minimizana la toxicidad en los tejidos normales y las dosis de radiacion.
Estudios de Ensayo de Union a Receptor in vitro
Para examinar la afinidad y especificidad de union in vitro de los puntos de I-cRGDY-PEG y los puntos de I- PEG a tumores y a las superficies endoteliales vasculares, se usaron lmeas de celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y de celulas de melanoma que sobreexpresaban integrina avp3 (M21) y que no la expresaban (M21L). Se observo una union lineal y saturable sumamente espedfica de los puntos de cRGDY-PEG a lo largo de un intervalo de concentraciones de partfculas (0 a 8 ng/ml) y tiempos de incubacion (hasta 5 hrs), con una union diferencial maxima a las 4 hr y una concentracion de partfculas de ~2,0 ng/ml (datos no mostrados) mediante el uso de citometna de flujo. Se ensayo la especificidad de union a receptor de los puntos de 124I-cRGDY-PEG mediante el uso de metodos de analisis con contador y despues de incubar inicialmente las celulas M21 con cRGD en exceso sin radiomarcar y despues de anadir diversas concentraciones de la sonda selectiva radiomarcada (Fig. 8A). El analisis de Scatchard de los datos de union proporciono una constante de equilibrio de disociacion, Kd, de 0,51 nM (Fig. 8A, recuadro) y una concentracion del receptor, Bmax, de 2,5 pM. Basandose en el valor de Bmax, se estimo que la densidad de receptores de integrina avp3 fue 1,0x104 por celula M21, razonablemente de acuerdo con la estimacion previamente publicada de 5,6 x 104 para esta lmea celular. Cressman, et al., Binding and uptake of RGD-containing ligands to cellular avp3 integrins. Int J Pept Res Ther. 15, 49-59 (2009). Tambien se observaron incrementos graduales de la absorcion celular de M21 espedfica de integrina a lo largo de un intervalo de temperaturas de 4 a 37 °C, lo que sugiere que la interiorizacion celular mediada por receptores contribuyo a la absorcion total (datos no mostrados). Los estudios adicionales de union competitiva mediante el uso de la sonda selectiva mostraron un bloqueo completo de la union mediada por receptor con un anticuerpo anti-integrina avp3 (Fig. 8B) mediante citometna de flujo. No se observo una reduccion significativa de la magnitud de union al receptor (~10% de M21) con celulas M21l (Fig. 8C) mediante el uso de un exceso de cRGDY o anticuerpo anti-integrina avp3. Estos resultados se confirmaron mediante estudios adicionales con contador y, y se determino una concentracion de
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inhibicion de la union del 50%, CI50, de 1,2 nM para el punto de I-cRGDY-PEG. Se hallo un factor de aumento multivalente asociado de mas de 2,0 para el punto de cRGDY-PEG respecto del peptido cRGD monomerico mediante el uso de un ensayo anti-adhesion y celulas M21 (datos no mostrados). Montet, et al., Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 6087-6093 (2006). Li, et al., 64Cu-labeled tetrameric and octomeric RGD peptides for small-animal PET of tumor avp3 integrin expression. J. Nucl Med. 48, 1162-1171 (2007). De forma similar a las celulas M21, el anticuerpo en exceso bloqueo de manera eficaz la union a receptores de los puntos de cRGDY-PEG a celulas HUVEC mediante citometna de flujo (Fig. 8D).
Estudios de Biodistribucion y Aclaramiento
Se estudio la biodistribucion dependiente del tiempo, asf como el aclaramiento renal y hepatobiliar, administrando de manera intravenosa dosis de marcador (~0,2 nanomoles) de puntos de 124I-cRGDY-PEG y puntos de 124I-PEG a modelos en raton de xenoinjertos de tumores M21 (Fig. 9). Aunque las concentraciones de actividad tisular (porcentaje de la dosis inyectada por gramo (%DI/g)) para la sonda selectiva se midieron a lo largo de un intervalo de tiempo 196 hr tras la inyeccion (p.i.), la comparacion de los marcadores de puntos de 124I-cRGDY-PEG (Fig. 9A) y de puntos de 124I-PEG (Fig. 9B) se limito a una ventana de 96 hr, ya que no se adquirieron datos para estos ultimos en 1 semana. Se observaron diferencias estadfsticamente significativas (p<0,05) en las actividades del marcador para la sangre, el tumor, y los organos principales a las 4 y 96 hrs p.i., asf como a las 24 hrs p.i. para el tumor y otros diversos tejidos (Tabla 1). La sonda selectiva se elimino casi completamente del cuerpo 1 semana p.i (~3% DI). Los semiperiodos de permanencia (T1/2) para la sangre, el tumor, y los organos principales para estos marcadores se muestran en la Tabla 2 (columnas 2 y 5). Se muestra un conjunto de datos representativos (permanencia en la sangre) en el recuadro de la Fig. 9A. Se determino un valor T1/2 en la sangre relativamente grande de 7,3 ± 1,2 hrs para el punto de 124I-PEG. Tras la union del peptido cRGDY para sintetizar el punto de 124I-cRGDY-PEG, el valor de T1/2 disminuyo ligeramente hasta 5,6 ± 0,15 hrs, pero fue acompanado por una mayor biodisponibilidad de la sonda (Tabla 2, columna 3). Se descubrio que el valor de T1/2 en el tumor para el punto de 124I-cRGDY-PEG fue alrededor de 13 veces mayor que el de la sangre, frente a solamente una diferencia de 5 veces para el punto de 124I-PEG (Tabla 2, columnas 2 y 5).
Valores p del estudio de biodistribucion que compara los puntos de 124I-cRGDY-PEG y 124I-PEGf
Tejido
Tiempos tras la inyeccion (horas)
4
24 96
Sangre
0,001 0,113 0,010
Tumor
0,045 0,012 0,001
Corazon
0,019 0,231 0,001
Pulmones
-- 0,039 0,006
^gado
0,001 0,033 0,028
Bazo
0,001 0,208 0,001
Intestino Delgado
0,001 0,046 0,002
Intestino Grueso
0,001 0,137 0,003
Rinones
-- 0,356 0,001
Musculo
0,001 0,007 0,001
Cerebro
0,001 0,074 0,001
Tabla 2
Organo Objetivo
Raton Ser humano4
124i-rgdy-peg 124i-peg 124i-rgdy-peg 124i-peg
T1/2 (h) D > (O' Dosis Absorbida (rad/mCi) T1/2 (h) D > (O' Dosis Absorbida (rad/mCi) Dosis Absorbida (rad/mCi)
Sangre
5,9 18,8 626 7,3 4,7 189 (vease la medula osea roja, mas adelante)
Corazon
6,8 7,0 266 34,1 0,8 120 0,307 (Pared) 0,087
Pulmones
8,5 5,7 267 37,7 3,0 498 0,298 0,263
Hfgado
65,9 3,9 935 52,5 1,4 294 0,486 0,234
Bazo
42,3 45,6 1071 27,4 45,7 410 3,20 0,254
195 286
Intestino Delgado
30,3 1,8 251 13,2 0,9 61 0,304 0,115
Intestino Grueso
23,9 2,0 228 49,2 0,5 99 0,427 (S) 0,209
0,724 (I) 0,416
Rinones
66,0 3,0 712 33,0 2,0 388 2,50 0,320
Musculo
27,7 0,8 105 47,1 0,2 38 0,227 0,060
Cerebro
13,9 0,4 29 8,5 0,2 8 0,187 0,149
§Tumor
73,5 1,5 380 37,0 0,9 146 n/a n/a
zHueso
(veanse las celulas osteogenicas)
Glandulas Suprarrenales
0,400 0,083
Mamas
0,141 0,042
Pared de la Vesfcula Biliar
0,289 0,097
Pared del Estomago
0,265 0,065
Ovarios
0,303 0,124
Pancreas
0,389 0,081
Medula Osea Roja
1,07 0,084
Celulas Osteogenicas
0,203 0,127
Piel
0,158 0,038
Testiculos
0,186 0,073
Timo
0,173 0,052
Tiroides
0,188 0,043
Pared de la Vejiga Urinaria
2,01 1,65
Utero
0,333 0,171
Cuerpo Total
0,034 0,075
Equivalente de la Dosis Efectiva (rem/mCi)
0,863 0,256
Dosis Efectiva (rem/mCi)
0,599 0,232
fHombre medio de 70 kg, S (superior), I (inferior), §modelo de melanoma en raton, zactividad osea muy inferior a otros tejidos (no informado)
Mediante una traduccion adecuada ajustada por la masa de los datos de biodistribucion anteriores al hombre, se obtuvieron las dosis de radiacion en organos normales humanos y se descubrio que eran comparables a las de otros radiomarcadores de diagnostico usados habitualmente (Tabla 2, columnas 8, 9). Junto con el hallazgo de que la 5 sonda selectiva fue atoxica y no dio como resultado efectos patologicos espedficos de tejidos (es decir, sin toxicidad aguda) (Fig. 10 y Tabla 3), se plantean aplicaciones de imagenologfa molecular selectiva y no selectiva por primera vez en seres humanos con estos agentes.
Histopatologfa de organos para puntos de 127I-RGDY-PEG frente a puntos de 127I-PEG
Tratamiento
SIN TRATAR Puntos de 127i-peg Puntos de 127I-RGDY-PEG
Sexo
M H M M H H M M H H
Corazon
N N N N N N N N N N
Timo
N N N N N N N N N N
Traquea
N N N N N N N N N N
Pulmones
N N N N N N N N N N
Rinones
N N N N N N N N N N
^gado
N N N N N N N N N N
Agrupamientos celulares aleatorios
1
Vesfcula biliar
NP N N N N NP N NP N N
Pancreas
N N N N N N N N N N
Linf. cronico
2F N N N N
Bazo
N N N N N N N N N N
Glandula salival
N N N N N N N N N N
Esofago
N N N N N N N N N N
Estomago
N N N N N N N N N N
Intestino delgado
N N N N N N N N N N
Hiperplasia linf. folic.
1
MF
Intestino grueso
N N N N N N N N N N
Nodulo linfatico mesenterico
N N N N N N N N N NP
Nodulo linfatico submandibular
NP NP N NP N N N N N N
Glandulas suprarrenales
N N N N N N N N N N
Tiroides
N N N N N N N N N N
Testiculos
N U N N U U N N U U
Epid^dimo
N U N N U U N N U U
Vesfculas seminales
N U N N U U N N U U
Glandulas coagulantes
N U N N U U N N U U
Prostata
N U N N U U N N U U
5
10
15
20
25
30
Ovario
U N U U N N U U N N
Utero
U N U U N N U U N N
Cuello de utero
U N U U N N U U N N
Glandula mamaria
NP NP N NP N N NP NP N NP
Vejiga urinaria
N N N N N N N N N N
Huesos, articulacion
N N N N N N N N N N
Medula osea
N N N N N N N N N N
Medula espinal
N N N N N N N N N N
Cerebro
N N N N N N N N N N
Hipofisis
N NP N N N N N N N N
Piel
N N N N N N N N N N
Inflamacion subcut.
1
Musculo esqueletico
N N N N N N N N N N
Nervios perifericos
N N N N N N N N N N
N: normal, U: no disponible, NP: no presente, 1: mmimo, 2: leve, F: focal, MF: multifocal
En otro estudio para confirmar que los puntos de 127I-RGD-PEG son atoxicos tras la administracion intravenosa en ratones, se llevo a cabo un ensayo de toxicidad de dosis unica formal a lo largo de 2 semanas mediante el uso de puntos de I-RGD-PEG a alrededor de 100 veces de la dosis humana equivalente. Los puntos de I-PEG sirvieron como partmula de control. En resumen, el procedimiento fue como sigue. Se usaron veintiocho ratones B6D2F1 de 8 semanas de edad en el estudio de toxicidad aguda, y se dividieron en un grupo de tratamiento y uno de control. El grupo de tratamiento (n= 6 machos + 6 hembras) recibio una dosis de nanopartmulas de sflice de 127I-RGD-PEG a una dosis de 1x10-9 moles/raton de manera intravenosa, y el grupo de control (n= 6 machos + 6 hembras) recibio la misma cantidad de vehmulo. Se sacrificaron dos ratones/grupo (un macho y una hembra/grupo) en el dfa 7 tras la dosis, y se realizaron analisis de bioqmmica clmica, hematologfa e histopatologfa espedfica de tejido en la autopsia. Todos los animales restantes (n= 5 machos + 5 hembras/grupo) se observaron durante 14 dfas tras el tratamiento. Se usaron cuatro ratones sin tratar (dos machos y dos hembras) como referencia. La conclusion de los estudios fue que no se observaron eventos adversos durante la dosificacion o el siguiente periodo de observacion de 14 dfas. No se observo mortalidad o morbilidad. Las observaciones clmicas incluyeron la ausencia de lo siguiente: anemia, perdida de peso, agitacion, respiracion incrementada, alteracion GI, comportamiento anormal, disfuncion neurologica, anormalidades en la hematologfa, anormalidades en la bioqmmica clmica, o lesiones relacionadas con farmacos desde el punto de vista de la patologfa de organos. Asf, una unica inyeccion de nanopartmulas de sflice 127I-RGD-PEG a 1x10-9 moles/raton, una dosis equivalente a un exceso de 100 veces la dosis de nanopartmulas de sflice de RGD-PEG necesaria para los estudios de imagenologfa de Fase 0, es segura y atoxica en ratones B6D2F1.
Se hallo una excrecion renal eficaz para las sondas selectivas y no selectivas de ~7 nm de diametro a lo largo de un periodo de tiempo de 168 hr mediante analisis fluorimetricos de muestras de orina. Las senales de fluorescencia se corrigieron con respecto al fondo y se convirtieron en concentraciones de partmulas (%DI/|jl) basandose en un esquema de calibracion de diluciones en serie (Fig. 9C, recuadro; Tabla 4, columna 2). Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters, 9, 442-8 (2009). Los valores de concentracion, junto con las estimaciones conservativas dependientes de la edad de la velocidad media de excrecion en orina, permitieron calcular la %DI acumulativa excretada (Tabla 4, columna 4). Drickamer, Rates of urine excretion by house mouse (mus domesticus): differences by age, sex, social status, and reproductive condition. J. Chem. Ecol. 21, 1481-1493 (1995). Se observo que practicamente la mitad de la dosis inyectada (alrededor del 43 %DI) se excreto a lo largo de las primeras 24 hrs p.i., y un ~72% DI en 96 hrs (Fig. 9C), lo que sugiere que la mayor parte de la excrecion se ha dado en el primer dfa p.i. No se pudo detectar una fluorescencia significativa de partmulas en la orina 168 hrs p.i. Los perfiles de excrecion fecal del punto de 124I-cRGDY-PEG indicaron que, de media, se elimino un 7% DI y 15% DI de la dosis inyectada a lo largo de 24 y 96 hrs, respectivamente (Fig. 9D). El analisis mediante FCS de las muestras de orina obtenidas en multiples momentos tras la inyeccion de la sonda selectiva revelo que la partmula se excreto intacta y sin liberacion del colorante encapsulado (datos no mostrados).
5
10
15
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35
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45
Datos de Concentracion en Orina y Excrecion Acumulativa
Tiempo (hr) Concentracion (%DI/|jl) Volumen Med. de Orina (jl) %DI Acumulativa Calculada Excretada
0 0,0 0,0 0
Punto de RGDY-PEG de 7,0 nm
1 0,292 41,6 6,07
4
0,026 166,7 26,1
24 0,016 1000 43,4
96 0,004 3974 72,2
Estudios de PET de Cuerpo Completo en Serie
Se llevo a cabo la imagenologfa de PET de la expresion de integrina en modelos en raton de xenoinjerto subcutaneo de M21 y M21L en las patas traseras en multiples momentos p.i. tras la inyeccion i.v. de puntos de 124I-cRGDY-PEG o puntos de 124I-PEG (control). Las imagenes de microPET frontales de cuerpo completo representativas a las 4 hrs (izquierda: tumor M21; medio: tumor M21L) y 24 hrs (derecha: tumor M21) p.i. se muestran en la Fig. 11A. La seleccion espedfica del tumor M21 que sobreexpresa la integrina ayp3 es claramente visible a partir de estas imagenes. Se muestran los valores de %DI/g de tumores medios y las desviaciones estandar para los grupos de tumores M21 (n=7) y M21L (control) (n=5) que recibieron los puntos de 124I-cRGDY-PEG selectivos, asf como para los ratones con tumores M21 (n=5) que recibieron el marcador de puntos de 124I-PEG no selectivos (Fig. 11B). En el momento de absorcion tumoral maxima (~4 hrs p.i.), se observaron incrementos de la concentracion de actividad del triple (en %DI/g) en los tumores M21 respecto de los controles. Las diferencias fueron estadfsticamente significativas en todos los momentos p.i. (p<0,05) excepto en 1 hr (p=0,27).
Las proporciones de absorcion tumor-musculo (%DI/g) obtenidas de las imagenes para los puntos de 124I-cRGDY- PEG revelaron un contraste tumoral incrementado en momentos posteriores (~24-72 hrs p.i.), mientras el de los
124 1 ' 124 1 '
puntos de I-PEG disminuyo (Fig. 11C). Este hallazgo sugirio que los puntos de I-cRGDY-PEG fueron, de hecho, selectivos hacia los tumores, lo cual se hizo mas evidente a medida que la actividad en la sangre se aclaro durante el periodo inicial de 24 hr (comparese la Fig. 11C con el recuadro de la Fig. 9A). Se hallo una correlacion estadfsticamente significativa entre los valores de %DI/g del tejido tumoral obtenidos mediante PET para los puntos de 124I-cRGDY-PEG y los puntos de 124I-PEG, y los valores de %DI/g de los tumores obtenidos mediante un contador Y ex vivo correspondientes (coeficiente de correlacion r = 0,94, P<0,0016; Fig. 11D), lo que confirma la exactitud de PET para obtener de manera no invasiva datos cuantitativos de biodistribucion.
Microscopfa e imagenologfa de Fluorescencia en IRC In Vivo
Se llevaron a cabo estudios de imagenologfa de fluorescencia in vivo mediante el uso de las pequenas nanoparffculas selectivas para cartografiar nodulos locales/regionales y canales linfaticos, asf como para superar las limitaciones anteriores. De manera importante, se puede aprovechar la naturaleza multimodal y el pequeno tamano de la sonda de parffculas selectivas para visualizar un intervalo de tamanos de nodulos y ramas linfaticas en el modelo de melanoma tras una administracion peritumoral, en 4 cuadrantes, simulando procedimientos intraoperatorios de cartograffa de nodulos linfaticos centinela humanos. Inicialmente, se llevo a cabo una microscopfa de fluorescencia en IRC en serie en ratones intactos a lo largo de un periodo de tiempo de 4 hr mediante el uso de las sondas de parffculas selectivas o no selectivas. La administracion peritumoral de la sonda selectiva revelo el drenaje y la visualizacion persistente de los nodulos inguinales y poplfteos adyacentes a lo largo de este intervalo, y los nodulos linfaticos mas pequenos y/o mas distantes fueron mas diffciles de visualizar. En contraste, la sonda no selectiva proporciono una visualizacion a mas corto plazo (~1 hr) de los nodulos locales, y se observo una senal de fluorescencia progresivamente mas debil (datos no mostrados). Tras la exposicion quirurgica, se descubrio que esta observacion fue el resultado una difusion de parffculas mas rapida desde la localizacion del tumor, en comparacion con la retencion prolongada observada con la sonda selectiva.
A continuacion se llevo a cabo una cartograffa de nodulos linfaticos representativos en multiples escalas espaciales mediante el uso de la imagenologfa optica de cuerpo completo de animales vivos (Fig. 12A) y tecnicas de microscopfa de fluorescencia en IRC (Fig. 12B) para visualizar el drenaje linfatico de la region peritumoral en los nodulos inguinales y axilares en animales vivos expuestos quirurgicamente. Ademas, las imagenes de fluorescencia de mayor resolucion (Fig. 12B, fila inferior) permitieron visualizar una arquitectura intranodular mas detallada, lo que incluye venulas de endotelio alto, que facilitan el paso de los linfocitos circulantes indiferenciados al nodulo, y que pueden tener implicaciones importantes para la estadificacion nodular y la capacidad de detectar micrometastasis en etapas mas tempranas de la enfermedad. Tambien se visualizaron las ramas linfaticas mas pequenas y menos
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10
15
20
25
30
35
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60
intensas mediante microscopfa de fluorescencia en la region axilar (datos no mostrados). As^ el pequeno tamano de la sonda selectiva no solamente permite visualizar el primer nodulo de drenaje (o nodulo centinela), en posicion proximal al tumor, sino que tambien posibilita la visualizacion de nodulos mas distantes y del patron de drenaje linfatico.
Discusion
Se informa de nanopartmulas de sflice atoxicas, de afinidad elevada, y eliminadas de manera eficaz para la seleccion espedfica de tumores y para la cartograffa de nodulos, con las que se han abordado con exito varios de los desaffos actuales asociados a otras tecnologfas de partmulas. Esta es la primera nanopartmula selectiva que, basandose en sus propiedades favorables, se puede decir que es clmicamente traducible como una sonda optica- PET combinada. La naturaleza complementaria de esta sonda multimodal, unida a su pequeno tamano (~7 nm de diametro), puede facilitar el estudio clmico posibilitando la integracion continua de los datos de imagenologfa adquiridos a diferentes escalas espaciales, temporales, y de sensibilidad, lo que potencialmente proporciona nuevas percepciones en los procesos moleculares fundamentales que controlan la biologfa de los tumores.
Los resultados in vitro muestran una especificidad de union a receptores de la sonda de partmulas selectivas de ~7 nm a celulas M21 y HUVEC. Se ha informado de hallazgos similares con ensayos de union a receptores mediante el uso de los mismos tipos celulares, pero con la forma monovalente del peptido. Cressman, et al., Binding and uptake of RGD-containing ligands to cellular ayp3 integrins. Int J Pept Res Ther. 15, 49-59 (2009). De manera importante, el aumento de la multivalencia de la sonda de partmulas unidas a cRGDY, junto con los valores de T1/2 de tiempo prolongado de permanencia en la sangre y en los tumores, son propiedades clave asociadas a la plataforma de partmulas que no se hallan con la forma monovalente del peptido.
El valor relativamente largo de T1/2 en la sangre de 7,3 ± 1,2 hrs estimado para el marcador de puntos de 124I-PEG puede estar relacionado con la superficie revestida de PEG qmmicamente neutra, que hace que la sonda sea biologicamente inerte y significativamente menos susceptible a la fagocitosis por parte del sistema reticuloendotelial. El hecho de que se descubriera una reduccion del valor de T1/2 hasta 5,6 ± 0,15 hrs para el marcador de puntos de 124I-cRGDY-PEG es muy probablemente el resultado del reconocimiento por parte de las integrinas objetivo y/o una mayor actividad de los macrofagos. Sin embargo, es sustancialmente mas largo que los valores publicados de T1/2 en la sangre de los marcadores con peptidos cRGDY existentes (~13 minutos), y da como resultado una mayor biodisponibilidad de la sonda, lo que facilita la seleccion como objetivo de tumores y produce mayores absorciones en los tumores a lo largo de periodos de tiempo mas largos. Montet, et al., Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 6087-6093 (2006). Ademas, el valor de T1/2 en los tumores para el punto de 124I-cRGDY-PEG fue alrededor de 13 veces mayor que para la sangre, frente a solamente una diferencia de cinco veces para el punto de 124I-PEG, lo que sugiere una localizacion en el tejido objetivo sustancialmente mayor para el primero que para el segundo. Tales interpretaciones mecamsticas de los datos in vivo se pueden aprovechar para perfeccionar los protocolos de diagnostico clmico, de planificacion del tratamiento, y de monitorizacion del tratamiento.
Los resultados de este estudio subrayan las claras ventajas ofrecidas por PET, una herramienta de imagenologfa potente, cuantitativa, y muy sensible para extraer de manera no invasiva informacion molecular relacionada con los niveles de expresion de receptores, la afinidad de union, y la especificidad. La mayor acumulacion y el aclaramiento mas lento desde los tumores M21, respecto de las estructuras circundantes normales, permite la discriminacion de los mecanismos de absorcion tumorales espedficos de los mecanismos inespedficos (es decir, perfusion tisular, perdidas) en los tejidos normales. Un pequeno componente de la absorcion en tumores M21, sin embargo, se puede atribuir presumiblemente a las alteraciones de la permeabilidad vascular (es decir, efectos de la permeabilidad y retencion incrementadas). Seymour, Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9, 135-187 (1992). Este modo de absorcion inespedfica refleja una porcion relativamente pequena de la absorcion tumoral total en momentos p.i. mas tempranos, basandose en los incrementos observados de %DI/g en ratones que recibieron el marcador de control (puntos de 124I-PEG, Fig. 11B). 1 hr p.i., no se observaron incrementos significativos de %DI/g en los tumores M21 respecto de los controles. Esta observacion puede reflejar el efecto de la perfusion diferencial en la primera hora, y la acumulacion y retencion en el tumor se observa principalmente en momentos posteriores p.i. (es decir, 24 hrs). Ademas, en comparacion con el marcador peptfdico clmicamente aprobado, 18F-galacto RGD, se hallo una absorcion mayor de practicamente el doble en los tumores M21 para los puntos 34 de 124I-cRGDY-PEG, y ademas ofrecieron las ventajas de union multivalente, tiempos prolongados de circulacion en la sangre, y un mayor aclaramiento renal.
Una ventaja de una sonda optica-PET combinada es la capacidad de analizar estructuras anatomicas que tienen tamanos en o por debajo del lfmite de resolucion del escaner PET (es decir, el denominado efecto de volumen parcial), que puede dificultar la deteccion y cuantificacion de la actividad en las lesiones. Por ejemplo, en modelos de animales pequenos, el estudio de la enfermedad metastasica en nodulos locales/regionales pequenos, importante clmicamente para la estadificacion y tratamiento de melanomas, puede no resolverse de manera adecuada mediante la imagenologfa de PET, dado que el tamano de los nodulos observados es en general del orden de la resolucion espacial del sistema (1-2 mm). Mediante la utilizacion de una segunda modalidad de imagenologfa complementaria y sensible, la imagenologfa de fluorescencia en el infrarrojo cercano (IRC), se pueden obtener mapas funcionales que revelan los patrones de enfermedad nodular y drenaje linfatico. Ballou et al., Sentinel lymph node imaging using
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quantum dots in mouse tumor models. Bioconjugate Chem. 18, 389-396 (2007). Aunque son necesarios estudios adicionales que investiguen la distribucion intranodular de la fluorescencia de puntos de cRGDY-PEG con respecto a los focos metastasicos para determinar si se puede conseguir la localizacion sensible de tales focos, estos resultados demuestran claramente las ventajas de trabajar con tal sonda optica-PET combinada.
En la clmica, no se pueden destacar suficientemente los beneficios de tal plataforma combinada para la estadificacion y el tratamiento de tumores. El tiempo prolongado en la circulacion sangumea y la biodisponibilidad resultante de esta nanosonda resalta su uso como herramienta versatil para la monitorizacion temprana y a largo plazo de las diversas etapas de tratamiento de enfermedades (el cribado de diagnostico, la evaluacion antes del tratamiento, la intervencion terapeutica, y la monitorizacion tras el tratamiento) sin las limitaciones impuestas por las consideraciones sobre la toxicidad. Una ventaja adicional importante es que, aunque las sondas rapidamente eliminadas pueden ser utiles para ciertas aplicaciones en las que la localizacion en el tejido objetivo es rapida por sf misma, la localizacion de muchos agentes en tumores solidos, a menudo escasamente vascularizados y por otra parte relativamente inaccesibles, probablemente sera lenta tras la administracion sistemica. Asf, la actual plataforma de nanopartmulas amplfa la diversidad de aplicaciones de tales agentes, debido a que la cinetica de la localizacion en el tejido objetivo ya no es limitante. Ademas, se pueden cartografiar los nodulos profundos mediante PET con respecto a su distribucion y numero, mientras se puede obtener una localizacion mas precisa y detallada de los nodulos superficiales mediante la imagenologfa de fluorescencia en IRC. Finalmente, se puede aprovechar la permanencia relativamente prolongada de la sonda selectiva en el tumor respecto de la permanencia en la sangre, ademas del aumento de la multivalencia, para futuras aplicaciones teranosticas, como vehmulo de administracion de compuestos radioterapicos o farmacos.
Ejemplo 5 Nanopartmulas de sflice fluorescentes conjugadas con peptido de seleccion de integrina avp3 y/o peptido de seleccion de uMUCI (modelos de cancer de tiroides y carcinoma de celulas escamosas (SCC))
Se unira un peptido cRGD (Peptides International), que tiene una funcionalidad terminal de cistema, a la nanopartmula PEGilada por medio de una union tiol-maleimida. Las nanopartmulas opcionalmente se pueden funcionalizar adicionalmente mediante un ligando peptfdico sintetico, EPPT1. Las nanopartmulas se caracterizaran basandose en el tamano de las partmulas, la distribucion de tamanos, y el fotoblanqueo.
Caracterizacion de los conjugados nanopartfcula-peptido
Para analizar las propiedades fotoffsicas por partmula, se usara la espectrofotometna, espectrofluorimetna, y espectroscopfa de correlacion de fluorescencia (FCS) multifotonica para determinar el tamano de las partmulas, el brillo, y la distribucion de tamanos. Los datos de tamanos se corroboraran mediante medidas de microscopfa electronica de barrido y dispersion dinamica de luz (DLS). Ow et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Letters 2005; 5, 113. El numero medio de peptidos RGD por nanopartmula y la eficacia de acoplamiento de RGD a los grupos PEG funcionalizados se estudiara colorimetricamente en condiciones alcalinas y con metodos espectrofotometricos de Biuret (A=450 nm, absorbancia maxima).
Los conjugados de nanopartmulas se yodaran por medio de ligadores de tirosina para crear una forma radiomarcada (124I) (T1/2 ~4 d) y estable (127I) mediante el uso de Iodogen51 (Pierce, Rockford, IL). El producto final se purificara mediante el uso de cromatograffa de exclusion por tamano.
Estudio de la especificidad de seleccion del objetivo in vitro y patrones de biodistribucion de las nanopartmulas de RGD y RGD-EPPT.
Se estudiaran los patrones de expresion de integrina avp3 y uMUC1 en lmeas celulares de carcinoma de tiroides y de celulas escamosas (SCC) respecto de controles conocidos negativos para integrina avp3 y positivos para integrina avp3 (lmeas celulares de melanoma humano M21-L y M21, respectivamente) y negativos para uMUC1 y positivos para uMUC1 (lmeas celulares U8728, H-29, respectivamente) mediante el uso de anticuerpos anti-integrina y anti- uMUC1. Se seleccionaran las lmeas celulares que expresan niveles altos de integrina-avp3 y/o MUC1 para los estudios de union diferencial con nanopartfculas de RGD y RGD-EPPT, asf como para la imagenologfa in vivo.
Los ensayos cuantitativos de union celular analizaran la eficacia del marcaje de las celulas tumorales, y se llevaran a cabo estudios de biodistribucion que ensayen la absorcion en el tumor, los organos, y los fluidos mediante el uso de conjugados de nanopartfculas radioyodadas (nanopartfculas de 124I-RGD, nanopartfculas de 124I-RGD-EPPT). Para comparar los datos de absorcion con PET de los conjugados de nanopartfculas con los observados inicialmente mediante el uso de imagenologm °ptica FIRC, cada c°njugad° de nanoPart^cu|as tambien se y°dara para crear una forma radiomarcada ( I) y estable ( I).
Microscop^a de fluorescencia con puntos de RGD y RGD-EPPT-C. La union diferencial de nanopartfculas de RGD y nanopartfculas de RGD-EPPT a lmeas celulares de carcinoma de tiroides/SCC que expresan niveles elevados de integrina avp3 y/o MUC1, frente a las lmeas de control, se visualizara mediante microscopfa de fluorescencia.
Modelos animales. Todos los experimentos con animales se realizaran de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comite Institucional de Cuidado y Uso de Animales, y siguiendo las directrices del NIH para el bienestar animal.
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Biodistribucion in vivo: Se inyectaran de manera subcutanea (s.c.) a ratones affmicos (6-8 semanas de edad, n=5 por tumor) en ambos flancos tumores negativos/positivos para integrina o negativos/positivos para uMUC1/ de diferentes ongenes tisulares (n=3/cada tumor). A un diametro de 0,5 cm (d.i.), se inyectaran de manera intravenosa (IV) a los ratones conjugados de nanoparffculas marcadas con 124I (~500 nm/kg). Los animales se sacrifican 0,5, 1, y 24 hrs mas tarde, y se extraen los tumores, organos, y fluidos para pesarlos y analizarlos (contador gamma). Los resultados de la biodistribucion se expresaran como el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido.
Ensayo Cuantitativo de Union Celular. La eficacia de marcaje se estudiara incubando un numero fijado de celulas de carcinoma que expresan niveles elevados de integrina avp3 y/o MUC1 con concentraciones preseleccionadas de conjugados de nanoparffculas marcadas con 124I durante 1 hr en una atmosfera humidificada con CO2 a 37 °C. Las celulas se lavan exhaustivamente, se lisan con un 0,1% de Triton X, y los lisados celulares se analizan en un contador gamma.
Estudio de las diferencias relativas en la seleccion espedfica de tumores mediante el uso de imagenologfa multimodal (PET-FIRC) in vivo.
Como herramienta de cribado de diagnostico de alto rendimiento, se puede usar la imagenologfa optica de FIRC para determinar las diferencias relativas en la biodistribucion de conjugados de nanoparffculas progresivamente funcionalizadas in vivo con una sensibilidad y resolucion temporal incrementadas. Tambien se pueden obtener datos semicuantitativos sobre la seleccion espedfica de tumores. Estos estudios preliminares facilitan la seleccion de lmeas celulares que expresan intensamente marcadores de interes para la cuantificacion detallada adicional de la biodistribucion y seleccion espedfica de tumores mediante el uso de PET.
Se llevara a cabo la imagenologfa optica de FIRC y microPET™ de cuerpo completo a lo largo de un periodo de 1 semana para analizar la absorcion diferencial en tumores en los flancos. Los resultados de estos estudios se validaran con microscopfa de fluorescencia de tumores ex vivo.
Imagenologfa de FIRC en Serie In Vivo. Se inyectaran a los ratones de manera bilateral celulas negativas para integrina avp3 y positivas para integrina avp3, o celulas negativas para uMUC1 y positivas para uMUC1 (n=5/tumor). Despues de que los tumores alcancen ~0,5 cm de d.i., se inyectaran IV conjugados de nanoparffculas yodados y no yodados estables (RGD, 127I-RGD, RDG-EPPT, 127I-RGD-EPPT). Se llevara a cabo la imagenologfa en serie mediante el uso del sistema de imagenologfa de fluorescencia Maestro™ In Vivo (CRI, Woburn, MA) a 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, y 24 hrs. A las 24 h, se sacrifican los ratones, y se diseccionan los tejidos/organos principales, se pesan, y se colocan en placas de 6 pocillos para la imagenologfa ex vivo. La emision de fluorescencia se analizara mediante el uso de las regiones de interes (ROIs) en los tumores, tejidos seleccionados, e inyectados de referencia, mediante el empleo de algoritmos de desmezclado espectral para eliminar la autofluorescencia. La division de las intensidades medias de fluorescencia de los tejidos por los valores de los inyectados permitira hacer comparaciones entre los diversos tejidos/organos para cada conjugado de nanoparffculas inyectado.
Adquisicion de Imagenes y Analisis con MicroPET Dinamica. Se inyectaran a dos grupos de ratones que albergan tumores (n=5/tumor) conjugados de nanoparffculas radiomarcadas con 124I (radiomarcadores), y se llevara a cabo la imagenologfa de PET dinamica durante 1 hr mediante el uso de un instrumento Focus 120 microPET™ (Concorde Microsystems, TN). Se inician adquisiciones de una hora en modo lista en el momento de la inyeccion IV de radiomarcadores de ~25,9 MBq (700 jCi). Los datos en modo de lista resultantes se reconstruyen en una matriz de 128x128x96 mediante retroproyeccion filtrada. El analisis de ROI de las imagenes reconstruidas se lleva a cabo mediante el uso del programa informatico ASIPro™ (Concorde Microsystems, TN) para determinar la media y DE de la absorcion de radiomarcador (%DI/g) en los tumores, otros organos/tejidos, y el ventnculo izquierdo (VI). Se obtendran datos adicionales a partir de imagenes estaticas en los puntos de tiempo de 24, 48, y 72 hr tras la inyeccion. Se usara un modelo cinetico de tres compartimentos y cuatro parametros para caracterizar el comportamiento del marcador in vivo. Para este analisis, se mide la entrada arterial mediante el uso de una ROI colocada sobre el VI.
Ejemplo 6 Cartograffa de nodulos en minicerdos
El barrido intraoperatorio en tiempo real del lecho nodular no se puede conseguir en la practica actualmente, ya que estos sistemas generalmente son demasiado engorrosos y caros para el uso en el quirofano, o pueden ser incapaces de proporcionar el campo de vision necesario o contraste de tejidos. Ademas, no hay agentes que contengan fluoroforos bioestables, clmicamente prometedores, que ofrezcan caractensticas fotoffsicas mejoradas y duraciones mas largas en la circulacion respecto de los colorantes originales, disponibles para aumentar el contraste de tejidos para procedimientos ampliados de cartograffa/extirpacion nodular. Con este estudio en animales, se mostrara que los avances en las sondas de parffculas multimodales y en las tecnologfas de dispositivos de imagenologfa molecular en tiempo real se pueden traducir facilmente en una diversidad de futuros ensayos clmicos en humanos. Tales tecnologfas transformativas pueden tener un impacto significativo en la asistencia habitual intraoperatoria del cancer proporcionando herramientas punteras de visualizacion selectiva para facilitar la deteccion de NLC metastasicos y posibilitando el trazado exacto de nodulo(s) de la anatoirna adyacente para minimizar el riesgo de lesiones en estructuras cruciales. Los beneficios incluyen la cartograffa intraoperatoria in vivo en tiempo real ampliada de la diseminacion de una enfermedad nodular y de la extension del tumor en la cabeza y el cuello. Se
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pueden cartografiar nodulos profundos mediante PET, mientras se puede obtener una localizacion precisa y detallada de los nodulos superficiales mediante imagenologfa de fluorescencia en IRC. El pequeno tamano de la sonda de parffculas tambien puede ampliar el Kmite inferior de los tamanos nodulares que se pueden detectar de manera sensible. El efecto neto de la plataforma multimodal atoxica propuesta, junto con la aplicacion de procedimientos combinados de diagnostico/tratamiento, tiene implicaciones importantes para la estadificacion, pronostico, y resultado clmico para esta enfermedad tan letal.
Enfermedad Objetivo. Ademas de melanoma, otros diversos tumores (es decir, mama, pulmon, y cerebro) sobreexpresan receptores de integrina avp3, y podffan servir como enfermedades objetivo.
El melanoma metastasico tiene un pronostico muy pobre, con una supervivencia mediana de menos de 1 ano11. El tratamiento eficaz se basa en la identificacion precoz, con una extirpacion quirurgica adecuada del cancer. La eliminacion quirurgica de la enfermedad primaria, el cribado, y el tratamiento de la diseminacion a los nodulos linfaticos regionales es el tratamiento de referencia en los EE.Uu. para estadificar la enfermedad con exactitud y ajustar el tratamiento. Las directrices de estadificacion recientemente revisadas reconocen la presencia de metastasis nodulares microscopicas como una marca distintiva de la enfermedad en estadio avanzado, que conduce a una supervivencia drasticamente reducida. El conocimiento del estado patologico nodular es cfftico para la estratificacion precoz del riesgo, predicciones mejoradas del resultado, y seleccion de subgrupos de pacientes que probablemente se beneficiaffan de un tratamiento adyuvante (diseccion nodular terapeutica, quimioterapia) o ensayos clmicos.
Cartograffa de Nodulos Linfaticos Centinela (NLC). Las tecnicas de cartograffa de NLC, usadas de manera rutinaria en la estadificacion de melanomas, identifican el/los nodulo(s) espedfico(s) que tienen un riesgo mas alto de metastasis tumoral. Este procedimiento identifica a los pacientes que albergan una enfermedad metastasica para el tratamiento adicional. Las tecnicas que son el tratamiento de referencia se basan en la inyeccion de un colorante coloidal de azufre con tecnecio radiactivo (99mTc) alrededor del tumor primario para la localizacion de NLC, seguido del uso intraoperatorio de una sonda gamma para medir la radiactividad en las estructuras linfaticas dentro de un lecho nodular expuesto. El colorante azul inyectado alrededor del tumor primario puede ayudar a trazar el/los NLC(s) pequenos del tejido adyacente, pero la tecnica es poco fiable y susceptible de complicaciones. La cartograffa de NLC y las tecnicas de biopsia actuales tienen limitaciones, y representan tasas mayores de ausencia de localizacion de NLC(s) en la cabeza y cuello en comparacion con otras localizaciones anatomicas. La region de la cabeza y cuello es muy conocida por sus patrones impredecibles de enfermedad metastasica. La estrecha proximidad de la enfermedad primaria a las metastasis nodulares en esta region hace que el uso intraoperatorio de la sonda gamma sea diffcil debido a la interferencia del sitio de inyeccion. De manera importante, la tecnologfa actual no permite que el cirujano visualice el nodulo centinela y lo diferencie de manera fiable de la grasa adyacente o de otros tejidos, poniendo en riesgo de lesion estructuras vitales (es decir, nervios) durante la diseccion para identificar y recoger este nodulo. El pequeno tamano de los nodulos y la amplia variacion de los patrones de drenaje proporciona exposiciones adicionales, que dan como resultado una tasa de ausencia de localizacion de alrededor del 10%.
Nanopartculas. La mayoffa de los estudios preclmicos han usado radiomarcadores con peptido RGD o conjugado pepffdico como ligandos de seleccion del objetivo para la imagenologfa de la expresion de integrina avp3. 18F- galacto-RGD y 99mTc-NC100692 son marcadores pepffdicos que se han usado con exito en pacientes para diagnosticar una enfermedad. Los marcadores pepffdicos se eliminan rapidamente, lo que puede dar como resultado una union reducida a receptores y una senal de fondo incrementada por la dispersion tisular inespedfica. Estas propiedades limitan el potencial de los marcadores pepffdicos para la monitorizacion a mas largo plazo. En contraste, las sondas de nanoparffculas (~10-100 nm), que tambien se han usado para la imagenologfa de la expresion de integrina en la neovasculatura tumoral, tienen semividas prolongadas en la circulacion para llevar a cabo una monitorizacion a mas largo plazo (es decir, dfas). Las nanoparffculas en general son mayores que los anticuerpos y agentes radiofarmaceuticos (<10 kDa), y estan asociadas a un transporte transmembrana mas lento, una absorcion incrementada en el SRE, y una absorcion inespedfica incrementada debido a la permeabilidad vascular tumoral alterada. Las nanoparffculas selectivas de 7 nm de diametro usadas para este estudio de cartograffa de NLC son aproximadamente comparables con el diametro medio de una molecula de albumina y 2-3 veces mas pequenas que el diametro medio de un anticuerpo ffpico. Respecto de los marcadores pepffdicos, la sonda de parffculas selectivas es menos susceptible a la extravasacion, y esta asociada a una semivida prolongada en la circulacion, lo que aumenta la seleccion como objetivo de los tumores. De manera importante, los puntos de 124I-cRGDY-PEG demuestran propiedades clave in vitro e in vivo en tumores M21, necesarias para la traduccion clmica.
Materiales y Metodos.
A minicerdos Sinclair con melanoma espontaneo (10-12 kg, Sinclair Research Center, MO) se les inyectaron de manera intravenosa 5 mCi de 18F-fluoro-desoxiglucosa (18F-FDG) para el cribado de cuerpo completo de metastasis nodulares y/o de organos. Se sometio a los minicerdos a un barrido de PET dinamica de cuerpo completo con 18F- FDG de 1 hr mediante el uso de un escaner PET clmico 40 minutos tras la inyeccion para el cribado de la enfermedad metastasica, seguido de adquisicion de un barrido CT para la localizacion anatomica. Despues se inyecto a los minicerdos de manera subdermica en un patron de 4 cuadrantes alrededor de la localizacion del tumor (localizaciones de cabeza y cuello, preferentemente) puntos de 124I-RGD-PEG multimodales 48 hrs tras la PET con
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18F-FDG, y se llevo a cabo un segundo barrido PET-CT dinamico para analizar otras metastasis nodulares.
Los minicerdos se llevaron al quirofano para la identificacion de los nodulos. Se llevo a cabo la imagenologfa optica de fluorescencia mediante el uso de un sistema de camara de fluorescencia en el infrarrojo cercano de gran campo de vision, un endoscopio modificado de campo de vision mas pequeno, y un estereomicroscopio modificado para obtener imagenes de fluorescencia de mayor resolucion dentro del lecho quirurgico expuesto.
La validacion de la senal fluorescente se llevo a cabo de manera intraoperatoria mediante un analisis con contador gamma con un dispositivo de PET manual clmicamente aprobado dentro del lecho operatorio para localizar puntos selectivos de manera transdermica, adquiridos intraoperatoriamente de piel y de los nodulos del interior y del lecho nodular.
Se extirpo la lesion cutanea primaria de melanoma, y se hizo una incision para permitir el acceso a el/los nodulo(s) centinela. Se confirmo la identidad nodular mediante el uso de sistemas de imagenologfa de PET manual y optica multi-escala, y se extirparon los nodulos en cuestion. Se enviaron muestras para el analisis histologico en busca de metastasis, y microscopfa confocal optica para confirmar la presencia de neoplasia maligna y fluorescencia de nanopartfculas.
Tras la recogida de los nodulos centinela, se extirpo todo lecho del nodulo linfatico y se analizo adicionalmente mediante el uso de metodos histologicos (con marcadores inmunohistoqmmicos para melanoma, segun fuera necesario), microscopfa de fluorescencia, y la sonda de PET manual para fines correlativos. Esta etapa ayudo a identificar otros nodulos malignos dentro del lecho nodular, y el numero de puntos de 124I-RGD-PEG presentes en los nodulos adyacentes por su aspecto tras la imagenologfa.
Se administraron puntos de 124I-RGD-PEG de manera subcutanea en las extremidades del animal secuencialmente. El transito de los puntos de 124I-RGD-PEG a los nodulos inguinales/axilares se siguio mediante el uso del sistema de imagenologfa optica y las sondas de PET manual para confirmar la duracion del transito a lo largo de las vfas linfaticas. Se expusieron quirurgicamente los lechos nodulares de drenaje, y se observo el patron de drenaje de los nodulos linfaticos. El nodulo linfatico centinela se recogio de cada localizacion para confirmar la naturaleza linfatica del tejido. Los animales se sacrificaron, y se extirpo cualquier lesion adicional observada tras la imagenologfa en la sala de necropsias de la instalacion animal.
Discusion.
Un barrido mediante PET-CT con 18F-fluorodesoxiglucosa (18F-FDG) de cuerpo completo revelo una lesion melanomatosa primaria adyacente a la columna vertebral en la parte superior del lomo, asf como un unico nodulo en el cuello, en posicion posterior del lado derecho del animal, y ambos mostraron avidez hacia FDG, y fueron sospechosos de enfermedad metastasica. Este hallazgo se confirmo tras la inyeccion subdermica, en 4 cuadrantes, de puntos de 124I-RGD-PEG alrededor de la localizacion del tumor, que ademas identifico dos nodulos hipermetabolicos mas, asf como los vasos linfaticos de drenaje. La interpretacion final de los barridos indicaron 3 nodulos metastasicos potenciales. La extirpacion quirurgica de la lesion primaria, los nodulos hipermetabolicos, y el tejido de otros lechos nodulares del cuello de manera bilateral se llevo a cabo despues de que las sondas de PET manual identificasen y confirmasen tasas de cuentas elevadas en la localizacion de el/los nodulo(s) centinela. La senal de fluorescencia irregular medida en el tejido de nodulos centinela posteriores derechos extirpados se correlaciono con las localizaciones de metastasis de melanoma mediante el analisis histologico. Todas las muestras nodulares hipermetabolicas se pigmentaron de color negro, y se descubrio que se correlacionaban con la presencia de diferentes agrupamientos de celulas de melanoma. Asf, los resultados del tejido extirpado quirurgicamente se enviaron al laboratorio de patologfa para la tincion con hematoxilina y eosina, y la tincion con otros marcadores de melanoma conocidos confirmo los hallazgos de la imagenologfa multimodal.
La Figura 13a muestra el sistema experimental del uso del modelo de melanoma espontaneo en minicerdos para la cartograffa de lechos de nodulos linfaticos y los vasos linfaticos regionales que drenan la localizacion de un tumor de melanoma primario conocido. Este modelo en minicerdos de tamano intermedio es necesario para simular la aplicacion de los procedimientos de biopsia de nodulos linfaticos centinela (NLC) en seres humanos, y sintetiza con mas exactitud la enfermedad humana. La Figura 13b muestra la imagen de PET de campo de vision pequeno 5 minutos tras la inyeccion subdermica de partfculas multimodales (puntos de 124I-RGD-PEG) alrededor de la localizacion del tumor. La region del tumor, los nodulos linfaticos, y los vasos linfaticos que drenan la localizacion del tumor se observan como areas de actividad incrementada (negro).
La Figura 14 muestra un barrido de PET dinamica de cuerpo completo con 18F-fluorodesoxiglucosa (18F-FDG) (Figura 14a) y barridos fusionados de PET-CT con 18F-FDG (Figura 14b) que muestran imagenes longitudinales, frontales, y axiales a traves de la localizacion de la enfermedad nodular en el cuello. El barrido de PET con 18F-FDG se llevo a cabo para cartografiar las localizaciones de la enfermedad metastasica tras la administracion intravenosa y antes de la administracion de la sonda de nanopartfculas radiomarcadas. Se observa un unico nodulo hipermetabolico en el cuello en posicion posterior en el lado derecho del animal (flechas, imagenes axiales, paneles superiores/inferiores), tambien identificado en la imagen del minicerdo de cuerpo completo (Figura 14c).
La Figura 15 muestra los mismos grupos de imagenes de la Figura 14, pero a nivel de la lesion de melanoma
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primario, adyacente a la columna vertebral en la parte superior del lomo. Se identifica la lesion avida de PET (flechas, imagenes axiales, paneles superiores/inferiores), asf como en la imagen del minicerdo de cuerpo completo (Figura 15c).
La Figura 16 muestra una PET dinamica de alta resolucion (Figura 16a) e imagenes de PET-CT fusionadas (Figura 16b) tras la inyeccion subdermica, en 4 cuadrantes, de puntos de 124I-RGD-PEG alrededor de la localizacion del tumor, que simula el protocolo clmico, a lo largo de un periodo de tiempo de 1 hora. Se hallaron tres nodulos linfaticos hipermetabolicos (flechas) en el cuello, lo que parece indicar la enfermedad metastasica. Se extirpo el NLC posterior derecho y se llevo a cabo una imagenologfa de fluorescencia en el infrarrojo cercano (IRC) de cuerpo completo. La senal de fluorescencia de Cy5 fue detectable dentro del nodulo extirpado (Figura 16c, superior, imagenologfa con Cy5) en la imagenologfa optica de cuerpo completo. El analisis patologico de este nodulo pigmentado en negro (flecha, NLC) mostro agrupamientos de celulas de melanoma invasoras en vistas transversales de bajo aumento (flechas) y alto aumento del nodulo mediante tincion con hematoxilina y eosina (dos imagenes inferiores), y se espera que la especificidad hacia el melanoma se confirme adicionalmente mediante el uso de tinciones especiales (Melan A, HMB45, PNL2, y "antfgeno asociado a melanoma", clon de BioGenex NKI/C3). Se espera ademas la colocalizacion de la partfcula con estos agrupamientos metastasicos de celulas en la microscopfa confocal de fluorescencia y autorradiograffa digital de alta resolucion, lo que confirmana la deteccion de la enfermedad metastasica.
Ejemplo 7 Nanopartfculas de sflice fluorescentes conjugadas con el peptido de seleccion del objetivo MC1R (modelo de melanoma)
Para los experimentos de imagenologfa (PET-FIRC) multimodal, se intercambiara el peptido de seleccion del objetivo y el radiomarcador de la superficie de las nanopartfculas para determinar la especificidad hacia el objetivo, la afinidad de union/avidez, y la sensibilidad de deteccion. Las nanopartfculas se sintetizaran mediante el uso de radiomarcadores terapeuticos (lutecio-177, 177Lu, t1/2 = 6,65 d) para la destruccion selectiva de celulas de melanoma que expresan MC1R. Los hallazgos de imagenologfa de PET cuantitativa y optica combinadas se correlacionaran con la autorradiograffa y la imagenologfa optica del tejido tumoral en escalas espaciales. Para la microscopfa celular, se usara un escaner confocal de fluorescencia in vivo para la imagenologfa de reflectancia y de fluorescencia combinadas.
Ejemplo 8 Nanopartfculas fluorescentes para radioterapia selectiva
Se llevaran a cabo estudios de aumento de la dosis con nanopartfculas de 131I-RGD y se monitorizara la respuesta al tratamiento semanalmente, a lo largo de seis semanas, mediante el uso de 18F-FDG PET. Se llevaran a cabo ensayos de absorcion tumoral dependiente del tiempo y dosimetna de la plataforma de nanopartfculas mediante el uso de la imagenologfa con camara gamma planar. Los datos de imagenologfa in vivo se correlacionaran con el analisis con contador gamma de las muestras tumorales extirpadas.
Se usaran ratones atfmicos macho (6-8 semanas, Charles River Labs, MA) para generar modelos de xenoinjertos en las patas posteriores tras la inyeccion de celulas de melanoma M21 humanas (5x105 en PBS). Los tumores se dejaran crecer 10-14 dfas hasta un tamano de 0,5-0,9 cm3.
Estudios de radioterapia selectiva basada en |. Se USara el radionUclido terapeutico 1 como radiomarcador para la radioterapia selectiva. Para estimar la dosis de I mas alta posible que no da como resultado muertes de animales y una perdida de peso menor del 20% (MTD), se llevara a cabo un estudio de aumento de la dosis en ratones atfmicos que albergan tumores. Para una dosis de 200 rad en la sangre54, es necesaria una actividad administrada de 10 MBq, que administrana una dosis de 270 rad al tumor. Se administraran 4 dosis de 10 MBq cada una para alcanzar una dosis en el tumor mayor de 1000 rad con un fraccionamiento de la dosis disenado para permitir la reparacion y conservacion de la medula osea. 131I permite la imagenologfa con camara gamma planar mediante el uso de un colimador de orificio para medir la absorcion tumoral dependiente del tiempo y la dosimetna de las nanopartfculas. La PET con 18F-FDG permite la monitorizacion cuantitativa de la respuesta tumoral, lo que proporciona informacion complementaria.
Basandose en estos datos, y los datos in vivo sobre el efecto de las nanopartfculas cargadas con paclitaxel, se llevara a cabo un estudio de terapia con el conjugado de nanopartfculas de 131I-RGD. Dos grupos de ratones que albergan tumores (n = 10 por grupo) recibiran cuatro actividades de 10,4 MBq una vez por semana durante 4 semanas, de conjugados de nanoparttculas de 131I-RGD administradas i.v. o vehfculo de solucion salina (control, n=10), y se monitorizaran a lo largo de un periodo de 6 semanas. Se cuantificara la respuesta al tratamiento/progresion basandose en el volumen tumoral (medido con un calibre). Todos los ratones de los grupos de tratamiento tambien se someteran a la imagenologfa una vez por semana (sesiones de ~1 hr) mediante imagenologfa de SPECT (Gamma Medica) a lo largo de un periodo de 6 semanas.
Adquisicion y Analisis de la Imagenologfa de PET con 18F-FDG. Dos grupos de ratones que albergan tumores (n=10/grupo) se someteran a un barrido de PET inicial antes, y despues semanalmente, tras el tratamiento a lo largo de un intervalo de 6 semanas. Se inyectaran de manera intravenosa (i.v.) a los ratones 500 pCi de 18F-FDG, y se adquiriran imagenes de PET de 10 minutos estaticas mediante el uso de un instrumento de microPET™ Focus 120
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(Concorde Microsystems, TN) antes y tras el tratamiento. Los datos adquiridos se reconstruiran en una matriz de 128x128x96 mediante retroproyeccion filtrada. Se llevaran a cabo analisis de la region de interes (ROI) de las imagenes reconstruidas mediante el uso del programa informatico ASIPro™ (Concorde Microsystems, TN) para determinar la media y DE de la absorcion de radiomarcador (%DI/g) en los tumores. Los animales se sacrificaran al final del estudio, y los tumores se extirparan para el analisis con contador gamma.
Ejemplo 9 Nanoparffculas fluorescentes conjugadas con quelato de radionuclido y peptido de seleccion MC1R
Las nanoparffculas PEGiladas se conjugaran con peptidos de seleccion del objetivo y quelatos macrodclicos unidos a radiomarcadores de elevada actividad espedfica.
Se uniran PEGs de pureza elevada de dos brazos activados, comercialmente disponibles, derivatizados con esteres de NHS o maleimida, a la cubierta de sflice de la nanoparffcula mediante el uso de procedimientos habituales. Uno de los dos grupos de PEG funcionalizados (esteres de NHS o maleimida) estaran disponibles para la conjugacion adicional con los agentes quelantes ligadores de construccion peptido-quelato, peptido dclico Re-[Cys3,4,10,D- Phe7]a-MSH3-13 (ReCCMSH(Arg11)), o acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N'N,,,N,"-tetraacetico (DOTA). La union covalente de los PEGs derivatizados a la superficie de las nanoparffculas se llevara a cabo de tal manera que se expongan los diferentes grupos funcionales para unir DOTA y las construcciones peptido-quelato, como se discute mas adelante.
Smtesis y caracterizacion fisicoqmmica de las nanoparffculas funcionalizadas.
Se sintetizaran nanoparffculas funcionalizadas estableciendo uniones covalentes de los siguientes restos con los grupos derivatizados de PEG:
(A) Quelatos DOTA para el radiomarcaje posterior de actividad espedfica elevada con radiometales emisores de positrones (es decir, 64Cu) para permitir la deteccion diagnostica con la imagenologfa de PET. DOTA se conjugara con los PEGs funcionalizados mediante el uso de la qrnmica Fmoc estandar, y se llevara a cabo la purificacion de las nanoparffculas queladas mediante cromatograffa. Se uniran 64Cu y 177Lu a DOTA mediante la incubacion de la mezcla de reaccion a 60° C durante 30 min, seguido de filtracion en gel o purificacion mediante cromatograffa ffquida a alta presion. De manera alternativa, se pueden conjugar nuclidos de PET, tales como 124I, 86Y, 68Ga y 89Zr, a la nanoparffcula, por medio del PEG funcionalizado con DOTA (radiometales) o del PEG funcionalizado con tirosina
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( I). El emisor monofotonico, Lu, obtenido en forma de LuCh, se complejara con DOTA para la radioterapia.
(B) El analogo de peptido de seleccion como objetivo de melanomas aMSH (ReCCMSH(Arg11)) se cicla con renio. Es necesario confirmar la proporcion de quelatos de DOTA respecto de los restos ReCCMSH(Arg11) en la superficie de las nanoparffculas PEGiladas.
La caracterizacion de las preparaciones de nanoparffculas funcionalizadas se llevara a cabo como sigue:
(A) Se determinara el numero medio de quelatos de DOTA por nanoparffcula mediante ensayos de dilucion isotopica estandar con 64Cu. Brevemente, se anadira 64Cu a disoluciones que contienen una cantidad conocida de nanoparffculas de ReCCMSH(Arg11). Las disoluciones incubadas se depositaran en puntos sobre placas de vidrio revestidas de gel de sflice, se desarrollaran en 1:1 de acetato de amonio del 10%-metanol (con EDTA), y se analizaran mediante radio-CCF. Mientras las nanoparffculas de ReCCMSH(Arg11) marcadas con 64Cu permaneceran en el origen, el 64Cu unido a EDTA migrara. La eficacia del marcaje en porcentaje se representara frente a los nanomoles totales de 64Cu anadidos a la mezcla de reaccion. El numero de quelatos unidos por nanoparffcula se puede determinar a partir del punto de inflexion de esta curva.
(B) Se analizara el numero medio de peptidos ReCCMSH(Arg11) por nanoparffcula y la eficacia de acoplamiento de ReCCMSH(Arg11) a los grupos de PEG funcionalizados mediante el uso de metodos espectrofotometricos (A=435 nm, absorbancia maxima) y del coeficiente de extincion conocido de ReCCMSH(Arg11). La incorporacion de renio ofrece la ventaja de que se pueden hacer medidas de absorbancia muy sensibles de las concentraciones de renio en una pequena muestra de producto.
Imagenologfa optica-PET in vitro e in vivo de nanoparffculas multifuncionales en modelos de melanoma para estudiar la seleccion espedfica de tumores y la respuesta al tratamiento.
Las nanoparffculas de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11) se compararan con la construccion nativa de 64Cu-DOTA- ReCCMSH(Arg11) para ensayar la capacidad de seleccion del objetivo de las nanoparffculas.
Ensayos de union competitiva. Se usaran las lmeas de melanoma murino B16/F1 positivas para el receptor MC1R. Se determinaran los valores de CI50 del peptido ReCCMSH(Arg11), la concentracion de peptido necesaria para inhibir un 50% la union del radioligando, mediante el uso de 125I-(Tyr2)-NDP7, un analogo de a-MSH radioyodado con una afinidad picomolar hacia MC1R. Se incubaran pocillos individuales a 25 °C durante 3 h con aproximadamente 50.000 cpm de 125I-(Tyr2)-NDP en 0,5 ml de medio de union con 25 mmol/L de acido N-(2- hidroxietil)-piperazin-N-(2-etanosulfonico), 0,2% de BSA y 0,3 mmol/L de 1,10-fenantrolina, con concentraciones de (Arg11)CCMSH que oscilaran de 10-13 a 10-5 mol/L. Se recogera por separado la radiactividad en las celulas y los
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medios y se medira, y los datos se procesaran para calcular el valor de CI50 del peptido Re(Arg11)CCMSH con el paquete informatico Kell (Biosoft, MO).
Ensayo de Cuantificacion de Receptores. Se anadiran alfcuotas de 5x105 celulas B16/F1 a los pocillos, se cultivaran en 200 pL de medio RPMI, y se incubaran a 37 °C durante 1,5 h en presencia de concentraciones crecientes de 125I- (Tyr2)-NDP (de 2,5 a 100 nCi) en 0,5 mL de medio de union (MEM con HEPES 25 mM, pH 7,4). Las celulas se lavaran con 0,5 mL de 0,2% de BSA/PBS 0,01 M helado, de pH 7,4, dos veces, y el nivel de actividad asociado a la
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fraccion celular se medira en un contador y. La union inespedfica se determinara incubando las celulas y I-(Tyr2)- NDP con NDP no radiactivo a una concentracion final de 10 pM. Se obtendran las representaciones de Scatchard representando la proporcion de union espedfica a 125I-(Tyr2)-NDP libre frente a la concentracion de union espedfica (fmol/millones de celulas); Smax, el numero maximo de sitios de union, es la interseccion en X de la recta de regresion lineal.
Se inyectaran de manera subcutanea lmeas de melanoma murino B16/F1 (5*105 en PBS) en las patas traseras de ratones atfmicos macho (6-8 semanas de edad). Los tumores se dejaran crecer 10-14 dfas hasta un tamano de 0,50,9 cm3.
Biodistribucion: Se inyectara de manera intravenosa una pequena cantidad del conjugado de nanopartfculas de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11) (~10 pCi, 0,20 pg) en cada uno de los ratones que albergan tumores B16/F1 palpables. Los animales se sacrificaran en momentos seleccionados tras la inyeccion (2, 4, 24, 48, 72 horas; n = 4- 5/punto de tiempo) y los tejidos deseados se extraeran, se pesaran, y se contara la radiactividad acumulada. Los ratones adicionales (n=5) a los que se les inyectara la construccion radiomarcada nativa, 64Cu-DOTA- ReCCMSH(Arg11) (~10 pCi, 0,20 pg), serviran como grupo de control, y se analizaran 1 h tras la inyeccion. Para examinar la especificidad de absorcion in vivo, se pre-inyectaran a un grupo adicional de ratones (punto de tiempo de 2 h) 20 pg de NDP para que actue como bloqueador de receptores inmediatamente antes de la inyeccion del conjugado de nanopartfculas de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11). Se pesaran los organos y tejidos principales y se analizaran con un contador gamma, y se determinara la dosis inyectada en porcentaje por gramo (%Dl/g).
Imagenologfa de FIRC en Serie In Vivo. En paralelo con los estudios de PET siguientes, se llevara a cabo una FIRC (imagenologfa de tomograffa de fluorescencia, FMT 225, Visen, Woburn, MA) mediante el uso de un haz laser en IRC de barrido de 680 nm ajustable y CCD antes y despues de la inyeccion i.v. en animales que albergan tumores (n=10). Los ratones se mantendran bajo anestesia continua con isoflurano, y se colocaran en un casete de imagenologfa multimodal portatil (compatible con microPET FMT 2500 y Focus 120) para el barrido de FMT antes y despues de la inyeccion (1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 y 72 horas). La imagen de fluorescencia en IRC, medida a lo largo de un periodo de 1-10 minutos, se reconstruira mediante el uso del programa informatico patentado Visen y se superpondra sobre una fotograffa normal del raton. Los datos de la imagenologfa son cuantitativos, ya que la intensidad medida esta directamente relacionada con la concentracion de fluoroforo de IRC, lo que permite generar mapas parametricos de las concentraciones absolutas de fluoroforo para el co-registro con los datos de imagenologfa de PET adquiridos.
Adquisicion de Imagenes y Analisis con PET Dinamica. Se colocaran dos grupos de ratones que albergan tumores (n=5/grupo) en el casete de imagenologfa para co-registrar estudios de PET-opticos secuenciales. A los ratones se les inyectaran de manera intravenosa (i.v.); a uno, conjugados de nanopartfculas de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11) radiomarcadas, y al segundo, construcciones nativas de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11). Tras la inyeccion, se adquiriran imagenes de PET dinamicas durante 1 hr mediante el uso de un instrumento microPET™ Focus 120 (Concorde Microsystems, TN). Se inician adquisiciones en modo lista de una hora en el momento de la inyeccion IV de la sonda radiomarcada (~1 mCi). Los datos en modo de lista resultantes se reconstruiran en una matriz de 128x128x96 mediante retroproyeccion filtrada. Los analisis de la region de interes (ROI) de las imagenes reconstruidas se llevan a cabo mediante el uso del programa informatico ASIPro™ (Concorde Microsystems, TN) para determinar la media y DE de la absorcion de radiomarcador (%DI/g) en los tumores, otros organos/tejidos, y el ventnculo izquierdo (VI). La modelizacion de los datos de la cinetica del marcador permitira la estimacion de los parametros farmacocineticos, que incluyen la administracion, el aclaramiento, y el volumen de distribucion. Como se indico, la entrada de sangre arterial se mide mediante el uso de una ROI colocada sobre el VI (como medida de la actividad en la sangre). Se obtendran datos adicionales a partir de imagenes estaticas en los puntos de tiempo de 24 hr, 48 hr, y 72 hr tras la inyeccion.
Microscopfa de fluorescencia y autorradiograffa de tejidos. Se utilizara una combinacion de tecnologfas de imagenologfa optica que exhiba escalas espaciales progresivamente mas pequenas (es decir, imagenologfa de fluorescencia de cuerpo completo, microscopfa de fluorescencia, y microscopfa de barrido laser confocal de fluorescencia in vivo) para la imagenologfa de tumores en animales vivos e intactos 72 h tras la inyeccion. Los ratones se mantendran bajo anestesia continua con isofluorano, por lo que se posibilitara la deteccion y localizacion de la senal de fluorescencia desde el nivel de animal completo/organo hasta el nivel celular a lo largo de un intervalo de aumentos. Se llevara a cabo la imagenologfa de un animal completo/macroscopica con un estereomicroscopio de fluorescencia (Visen; Nikon SMZ1500) equipado con filtros de fluorescencia de Cy5 y camaras CCD. Se desarrollara la capacidad de la microscopfa de barrido laser confocal de fluorescencia. Los ratones se sacrificaran posteriormente para realizar la autorradiograffa para cartografiar las biodistribuciones del marcador a alta resolucion en todo el volumen del tumor. Los tumores se extirparan, se congelaran subitamente, se cortaran en serie (cortes de 10 pm) y
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se montaran en un portaobjetos, con cortes alternantes colocados en contacto con una placa de fosforo en un casete opaco (hasta 1 semana). La tincion con hematoxilina y eosina se llevara a cabo en los cortes consecutivos restantes. Los hallazgos autorradiograficos se correlacionaran con los datos de la imagenologfa de PET y los resultados histologicos.
Se pueden usar de manera alternativa los radionuclidos terapeuticos 177Lu o 90Y para la radioterapia selectiva. Para estimar la dosis de 177Lu mas alta posible que no da como resultado muertes de animales y una perdida de peso menor del 20% (MTD), se llevara a cabo un estudio de aumento de la dosis en ratones atfmicos que albergan tumores. Se estudiaran las dosis de compuestos radiofarmaceuticos que se sospecha que estan en (o cerca de) la MTD basandose en los valores de la bibliograffa para 177Lu.
Ejemplo 10 Nanopartfculas fluorescentes funcionalizadas para conjugarlas con un ligando y un agente de contraste por medio de la "qmmica click"
Smtesis de nanopartmulas que contienen grupos funcionales versatiles para la conjugacion posterior del ligando (p.ej., peptidos) y el agente de contraste (p.ej., radionuclidos).
Para sintetizar una matriz de construcciones de nanopartfcula-peptido-quelato adecuadas para el radiomarcaje de actividad espedfica elevada, se puede usar una aproximacion de "qmmica click" para funcionalizar la superficie de la nanopartmula (Figura 17). Este metodo se basa en la cicloadicion catalizada por cobre de una azida a un triple enlace. Tal aproximacion permitina una gran versatilidad para explorar las aplicaciones multimodales.
Smtesis y caracterizacion de nanopartmulas. Los grupos de PEG que se uniran de manera covalente se produciran siguiendo el esquema de la Figura 14. Se unira PEG de manera covalente a la nanopartmula por medio del grupo silano. Se usaran rutas qmmicas estandar para la produccion del PEG funcionalizado con triples enlaces.
Funcionalizacion de nanopartmulas con triples enlaces. Para sintetizar los PEGs bifuncionalizados, la primera etapa empleara la reaccion muy estudiada de ester carboxflico activado con amina alifatica (Figura 18). De manera alternativa, se puede usar otra amina adecuada que alberga un triple enlace, por ejemplo, p-aminofenilacetileno. La segunda etapa de la smtesis tambien se basa en una reaccion de conjugacion muy conocida.
Smtesis y caracterizacion fisicoqmmica de nanopartmulas funcionalizadas conjugadas con peptidos modelo y quelatos.
La nanopartmula funcionalizada contiene (A) desferrioxamina B (DFO) para el radiomarcaje posterior de actividad espedfica elevada con el emisor de positrones zirconio 89 (89Zr) y (B) el peptido de seleccion del objetivo SSTR, octreotato.
Smtesis de DFO con un enlace azida. Se producira DFO con un grupo azida mediante la reaccion de DFO-B con acido p-azido benzoico) (Figura 19) y se purificara. La reaccion de "qmmica click" es una cicloadicion 1,3-dipolar a temperatura ambiente, y las condiciones se denominan a menudo "Condiciones de Huisgen". Aunque las reacciones se pueden completar en general a temperatura ambiente en etanol, puede ser adecuado calentar la reaccion. El catalizador a menudo es Cu(I)Br, pero las alternativas incluyen Cu(l)l o Cu(II)SO4 (con un reductor). Knor et al. Synthesis of novel 1,4,7,10-tetraazacyclodecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) derivatives for chemoselective attachment to unprotected polyfunctionalized compounds. Chemistry, 2007;13:6082-90. Las reacciones de qmmica click tambien se pueden llevar a cabo en ausencia de catalizador. De manera alternativa, el grupo NH3+ de DFO-B se puede convertir directamente en un grupo azida.
Smtesis de Tyr3-octreotato con una azida. La smtesis peptfdica en fase solida (SPPS) de Tyr3-octreotato (Figura 20A) se llevara a cabo en un sintetizador de peptidos. Brevemente, la smtesis implicara el metodo Fmoc (9- fluorenilmetoxicarbonilo) como se describio previamente para este peptido. Brevemente, el protocolo del instrumento requiere 25 pmol de aminoacidos protegidos con Fmoc posteriores activados mediante una combinacion de 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) y hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU). Los aminoacidos protegidos con Fmoc se adquiriran comercialmente, a menos que se indique de otra manera; los aminoacidos pre-envasados se obtendran de Perkin-Elmer (Norwalk, CT), mientras los que no esten disponibles en forma pre-envasada, tales como los D-aminoacidos y Fmoc-Cys(Acm), los suministrara BACHEM Bioscience, Inc. (King of Prussia, PA) o Novabiochem (San Diego, cA). El grupo azida (para la qmmica "click") se introducira en el esqueleto peptfdico por medio del acoplamiento de un acido que contiene azida en el extremo N-terminal del peptido, mientras el peptido todavfa esta protegido y unido a la resina (Figura 20B).
Smtesis de nanopartmulas funcionalizadas. La siguiente etapa sera conjugar el DFO que tiene un enlace azida y el Tyr3-octreotato que tiene un enlace azida (Figuras 21A y B) a la nanopartmula. La "qmmica click" es muy selectiva, cuantitativa y se puede llevar a cabo muy rapido y mediante el uso de condiciones suaves. El numero de grupos azida combinados de DFO y Tyr3-octreotato se controlara para no superar nunca el numero de triples enlaces disponibles; los triples enlaces estaran siempre en un exceso <5%.
Caracterizacion de las nanopartfculas funcionalizadas. Se determinara el numero medio de peptidos con quelatos DFO por nanopartfcula llevando a cabo un ensayo de dilucion isotopica estandar con 89Zr (o 68Ga). Se producira 89Zr
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en un ciclotron y se purificara. Brevemente, se anadiran 10 concentraciones de oxalato de 89Zr a disoluciones que contienen una cantidad conocida de nanopartfculas derivatizadas con DFO. Despues de una incubacion a temperatura ambiente de 30 min., las disoluciones se depositaran en puntos sobre placas de vidrio revestidas de gel de sflice, se desarrollaran en 1:1 de acetato de amonio del 10%-metanol (con EDTA) y se analizaran mediante radio- CCF. Mientras las nanopartfculas derivatizadas con 89Zr-DFO permaneceran en el origen, el 89Zr unido de manera inespedfica a EDTA migrara. La eficacia de marcaje en porcentaje se representara como una funcion de los nanomoles totales de 89Zr anadidos a la mezcla de reaccion. El numero de quelatos unidos a la nanopartfcula se puede determinar entonces a partir del punto de inflexion de esta curva.
El numero medio de peptido Tyr3-octreotato por nanopartfcula se determinara ensayando el puente disulfuro de Tyr3-octreotato. Brevemente, los enlaces disulfuro del Tyr3-octreotato se pueden escindir cuantitativamente mediante sulfito sodico en exceso a pH 9,5 y temperatura ambiente. Se puede usar DTNB o reactivo de Elman para cuantificar tioles en protemas mediante medidas de absorcion. Forma facilmente un disulfuro mixto con los tioles, lo que libera el cromoforo de acido 5-mercapto-2-nitrobenzoico (maximo de absorcion 410 nm). Solamente se modifican los tioles proteicos que son accesibles a este reactivo hidrosoluble. De manera alternativa, se puede usar el kit de ensayo Measure-iT™ Thiol de Invitrogen.
Ensayo in vivo en modelos adecuados de tumores.
Se generaran modelos de xenoinjerto subcutaneo mediante el uso de ratones SCID hembra que albergan tumores AR42J. Brevemente, se inyectaran de manera subcutanea celulas AR42J (1X107) en los flancos de ratones SCID hembra. Los tumores se dejaran crecer 10-12 dfas hasta un tamano de 0,5-0,9 cm.
Se espera que el radiomarcaje de la nanopartfcula de DFO con 89Zr se desarrolle en <15 min. a temperatura ambiente. El 89Zr unido de manera inespedfica se eliminara mediante la adicion de EDTA, seguida de una etapa de filtracion en gel.
Ensayos de union a receptores. Los ensayos de union a receptores se llevaran a cabo mediante el uso de nanopartfculas de 89Zr-DFo en membranas obtenidas de tumores AR42J. Los ligandos competitivos, las nanopartfculas de natZr-DFO y natZr-DFO-octreotato se prepararan mediante la reaccion de oxalato de circonio natural de pureza elevada con DFO-octreotato y nanopartfculas de DFO, respectivamente. La pureza de los productos finales se confirmara mediante HPLC. Los valores de CI50 se determinaran segun metodos publicados previamente, mediante el uso del sistema de ensayo MultiScreen de Millipore (Bedford, MA). El analisis de los datos se llevara a cabo mediante el uso de los programas GraFit (Erithacus Software, R.U.), LIGAND (NIH, Bethesda, MD), y GraphPad PRISM™ (San Diego, CA).
Ensayos in vitro. Las celulas AR42J se recogeran de monocapas con disolucion de disociacion celular (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se resuspenderan en medio DMEM nuevo a una concentracion de 2 * 106 celulas/mL. Se anadira una alfcuota de alrededor de 0,3 pmol de nanopartfculas de 89Zr-DFO a 10 mL de celulas, y se incubara a 37 °C con agitacion continua. Tras 1, 5, 15, 30, 45, 60 y 120 min se extraeran alfcuotas de 200 |jL por triplicado y se colocaran en hielo. Las celulas se aislaran inmediatamente mediante centrifugacion, y se calculara el % de absorcion del compuesto en las celulas.
Biodistribucion. Se inyectara de manera intravenosa una pequena cantidad de las nanopartfculas de 89Zr-DFO (~10 jCi, 0,20 jg) a cada uno de los ratones que albergan tumores palpables AR42J positivos. Los animales se sacrificaran en momentos seleccionados tras la inyeccion (1,4, 24, 48, 72 horas; n = 4-5) y los tejidos deseados se extraeran, se pesaran, y se contara la acumulacion de radiactividad. Se estudiaran dos grupos de control adicionales 1 h tras las inyecciones: (A) ratones con inyeccion del peptido radiomarcado nativo 89Zr-DFO-octreotato (~10 jCi, 0,20 jg), y (B) ratones con preinyeccion de un bloqueo de Tyr3-octreotato (150 jg) para demostrar la acumulacion mediada por receptor de las nanopartfculas de 89Zr-DFO. Se analizaran con un contador los tejidos, que incluyen sangre, pulmon, dgado, bazo, rinon, glandulas suprarrenales (positivas para STTR), musculo, piel, grasa, corazon, cerebro, hueso, pancreas (positivo para STTR), intestino delgado, intestino grueso, y tumor AR42J. Se calculara el porcentaje de dosis inyectada por gramo (%DI/g) y el porcentaje de dosis inyectada por organo (%DI/organo) mediante la comparacion con una disolucion patron pesada y contada.
Imagenologfa de FIRC in vivo. Se llevara a cabo la imagenologfa en serie mediante el uso del sistema de imagenologfa de fluorescencia Maestro™ In Vivo (CRI, Woburn, MA) a 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 y 72 hrs. A las 72 hr, se sacrificaran los ratones, y se diseccionaran los tejidos/organos principales, se pesaran, y se colocaran en placas de 6 pocillos para la imagenologfa ex vivo. La emision de fluorescencia se analizara mediante el uso de las regiones de interes (ROIs) en los tumores, tejidos seleccionados, e inyectados de referencia, mediante el empleo de algoritmos de desmezclado espectral para eliminar la autofluorescencia. Se realizaran las medias de las intensidades de fluorescencia y las desviaciones estandar (DE) para grupos de 5 animales. La division de las intensidades medias de fluorescencia de los tejidos por los valores de los inyectados permitira hacer comparaciones entre los diversos tejidos/organos para cada conjugado de nanopartfculas inyectado.
Imagenologfa de PET de animales pequenos in vivo. Se llevara a cabo la imagenologfa de PET de animales pequenos en un sistema microPET®-FOCUS™ (Concorde Microsystems Inc, Knoxville TN). Se anestesiaran ratones
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que albergan los tumores AR42J (n = 5 por grupo) con 1-2% de isoflurano, se colocaran en posicion de decubito supino, y se inmovilizaran en un soporte preparado a medida. Los ratones recibiran 200 pCi del complejo de nanoparffculas de 89Zr-DFO-octreotato por medio de la vena de la cola, y se someteran a la formacion de imagenes uno al lado del otro. Los animales se someteran inicialmente a la imagenologfa adquiriendo multiples barridos sucesivos de 10 minutos continuamente desde el momento de la inyeccion a lo largo de un periodo de tiempo de 1 hr, seguido de adquisiciones de datos estaticas de 10 min a las 2, 4, 24, 48 y 72 hrs tras la inyeccion. Se generaran los valores de absorcion estandar (SUVs) de las regiones de interes (ROIs) dibujadas sobre el tumor y otros organos de interes. El co-registro de las imagenes de PET se realizara en combinacion con una camara microCAT-II (Imtek Inc., Knoxville, TN), lo que proporciona imagenes anatomicas de rayos X y CT de alta resolucion. El registro de imagenes entre las imagenes de microCT y PET se llevara a cabo mediante el uso de una tecnica de registro de puntos de referencia y el programa informatico de visualizacion de imagenes AMIRA (AMIRA, TGS Inc, San Diego, CA). El metodo de registro se desarrolla mediante la transformacion rigurosa de las imagenes de microCT de los puntos de referencia proporcionados por los marcadores de referencia unidos directamente al lecho del animal.
Medidas farmacocineticas. Los datos de biodistribucion y PET dinamica proporcionaran la concentracion temporal de nanoparffcula de 89Zr-DFO-octreotato en el tejido, lo que permitira la caracterizacion de los parametros farmacocineticos del agente.
Microscopfa de fluorescencia y autorradiograffa de tejidos ex vivo. Se llevara a cabo la localizacion de los conjugados de nanoparffculas en los tejidos en cortes congelados. La imagenologfa de microPET permitira analizar completamente la distribucion global en los tumores y otros tejidos no seleccionados como objetivo. Tras la etapa aguda del ensayo de imagenologfa, tambien se llevara a cabo una autorradiograffa en los tumores, y estos datos se correlacionaran con la imagenologfa de PET y los resultados histologicos. Se tomaran cortes consecutivos (~10 pm), alternando los cortes para la autorradiograffa y para el analisis histologico. Estos cortes tambien se analizaran mediante microscopfa de fluorescencia multicanal en el canal del IRC.
Ejemplo 11 Estudios de interiorizacion de parffculas
El objetivo de este estudio es determinar la union e interiorizacion de las presentes nanoparffculas para estudiar su localizacion en los organulos subcelulares y la exocitosis. Esto ayudara a estudiar el destino de las parffculas funcionalizadas con diferentes restos selectivos y agentes terapeuticos unidos. Por ejemplo, nanoparffculas de diagnostico (p.ej., nanoparffculas revestidas de PEG no selectivas frente a las revestidas de cRGD-PEG) y nanoparffculas terapeuticas (p.ej., nanoparffculas de cRGD-PEG unidas a yodo para la radioterapia, unidas a inhibidores de tirosina quinasa, o unidas a farmacos quimioterapicos tales como Taxol).
Materiales y Metodos.
Estudios de interiorizacion/absorcion. Se llevaron a cabo ensayos de interiorizacion y estudios de colocalizacion para identificar rutas de absorcion espedficas.
Se colocaron en placas celulas de melanoma, que incluyen celulas M21 humanas y B16 de raton (~2x105 celulas/pocillo), en portaobjetos con camaras de 8 pocillos (1,7 cm2/pocillo) o placas de 24 pocillos (1,9 cm2/pocillo) con un cubreobjetos de vidrio redondo de 12 mm y se incubaron a 37 °C durante la noche. Para monitorizar la interiorizacion selectiva de nanoparffculas, las celulas se incubaron con puntos de cRGD-PEG (0,075 mg/ml) durante 3 hrs a 37 °C. Para eliminar las parffculas sin unir del medio, se lavaron las celulas dos veces con PBS. Se llevo a cabo microscopfa confocal en un microscopio confocal invertido Leica (Leica TCS SP2 AOBS) equipado con un objetivo HCX PL APO: 63x 1.2NA Water DICD para estudiar la colocalizacion de puntos de crGd-PEG con anticuerpos o tinciones espedficas de organulos. Las imagenes se analizaron mediante el uso del programa informatico ImageJ, version 1.37 (NIH Image;
http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Ensayos de colocalizacion/marcadores unidos a colorante. Para identificar las vesfculas endodticas implicadas en la interiorizacion de puntos C, se llevaron a cabo ensayos de colocalizacion en celulas vivas mediante el uso de marcadores unidos a colorante. Las celulas se coincubaron con diferentes nanoparffculas y colorantes. Los colorantes incluyen: Lysotracker Red 100 nM durante 30 min para marcar organulos acidos a lo largo de la ruta endosomica; 2 pg/mL de conjugado transferrina-Alexa 488 para marcar los endosomas de reciclado y clasificacion (ruta dependiente de clatrina); 1 mg/mL de conjugado de dextrano de 70 kDa-FITC a 37 °C durante 30 min para marcar los macropinosomas.
Anticuerpos de colocalizacion/espedficos de organulo. Se llevara a cabo una inmunocitoqmmica con marcadores conocidos para el aparato de Golgi y los lisosomas. Para el aparato de Golgi, se usara Giantina (Abcam, policlonal de conejo, 1:2000) para las celulas humanas; se usara GM-130 (BD Pharmingen, 1 pg/ml) para las celulas de raton. Para los lisosomas, se usara LC3B (Cell Signaling, policlonal de conejo, 0,5 pg/ml).
Para la tincion con Giantina o LC3B, las celulas se bloquearan durante 30 minutos en un 10% de suero de cabra normal/0,2% de BSA en PBS. La incubacion con el anticuerpo primario (anticuerpo policlonal anti-Giantina de conejo (catalogo de Abcam, n° ab24586, dilucion 1:2000) o LC3B (Cell Signaling, cat. n° 2775, 0,5 pg/ml) se realizara durante 3 horas, seguida de una incubacion de 60 minutos con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo biotinilado (Vector labs, cat. n° PK6101) en una dilucion 1:200. La deteccion se llevara a cabo con un bloqueante de anticuerpo
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secundario, bloqueante D, estreptavidina-HRP D (Ventana Medical Systems) y el kit de deteccion DAB (Ventana Medical Systems) segun las instrucciones del fabricante.
Para la tincion con GM-130, las celulas se bloquearan durante 30 min en reactivo de bloqueo de IgG de raton (Vector Labs, cat. n°: MKB-2213) en PBS. La incubacion con anticuerpo primario (anti-GM130 monoclonal, de BD Pharmingen; cat. n° 610822, concentracion 1 |jg/mL) sera realizara durante 3 horas, seguida de una incubacion de 60 minutos con anticuerpo secundario de raton biotinilado (Vector Labs, MOM Kit BMK-2202), en una dilucion 1:200. La deteccion se llevara a cabo con un bloqueante de anticuerpo secundario, bloqueante D, estreptavidina-HRP D (Ventana Medical Systems) y el kit de deteccion DAB (Ventana Medical Systems) segun las instrucciones del fabricante.
Para los estudios dependientes de la temperatura, las nanopartfculas se incubaran con nanopartfculas de cRGD- PEG a 4 °C, 25 °C, y 37 °C para analizar la fraccion de partfculas unidas a la superficie frente a las interiorizadas.
Para los estudios de exocitosis, se incubaran las nanopartfculas (0,075 mg/ml) durante 4 horas y los portaobjetos con camaras se lavaran con PBS, seguido de la adicion de medios nuevos. A intervalos de tiempo de 0,5, 1,0, 1,5, 2,5, 4,5, 8,0 hrs, se lavaran las celulas, se tripsinizaran, y se medira la senal de fluorescencia de las celulas y los medios mediante fluorimetna. En los estudios de dosis-respuesta, las celulas se incubaran a lo largo de un intervalo de concentraciones y tiempos de incubacion, y se ensayaran mediante el uso de citometna de flujo. En los estudios de viabilidad, se medira la viabilidad de las celulas mediante el uso de un ensayo de exclusion de azul tripan antes y despues de la incubacion para analizar la toxicidad. En los estudios de periodo de tiempo, se investigara el mecanismo de interiorizacion de las nanopartfculas en celulas vivas despues de incubar las celulas con conjugados de nanopartfculas a diferentes temperaturas de incubacion (4 °C, 25 °C, y 37 °C) mediante el uso de un microscopio confocal invertido a lo largo de un periodo de 12 hr a intervalos de 20 min.
Discusion.
Se descubrio que los puntos de cRGD-PEG y los puntos de PEG se colocalizan con Lysotracker Red en las celulas M21 y B16, lo que sugiere la absorcion en la ruta endosomica (Figura 22). Los datos mostraron que estas partfculas se colocalizan claramente con transferrina y dextrano. Independientemente de la funcionalidad de la superficie y de la carga total, las nanopartfculas (6-7 nm de diametro hidrodinamico) estudiadas parecen seguir la misma via. La imagenologfa en un periodo de tiempo en ambos tipos celulares demostro la interiorizacion de las nanopartfculas funcionalizadas dentro de una pequena fraccion de las celulas colocadas en las placas. Las partfculas se transportaron finalmente a las estructuras vesiculares de la region perinuclear. No se espera que los ensayos de colocalizacion con Giantina (o GM-130) muestren una senal fluorescente de nanopartfculas en el aparato de Golgi.

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una nanopartfcula fluorescente basada en s^lice que comprende:
    un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en s^lice;
    una cubierta de s^lice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; una molecula de ligando unida a la nanopartfcula; y un agente de contraste o un quelato unido a la nanopartfcula;
    en la que hay unidas de alrededor de 1 a alrededor de 20 moleculas de ligando a la nanopartfcula.
  2. 2. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que la nanopartfcula tiene un diametro de entre alrededor de 1 nm y alrededor de 25 nm, preferiblemente entre alrededor de 1 nm y alrededor de 8 nm.
  3. 3. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que el numero de moleculas de ligando unidas a la nanopartfcula oscila de alrededor de 1 a alrededor de 10.
  4. 4. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que el numero de moleculas de ligando unidas a la nanopartfcula oscila de alrededor de 10 a alrededor de 20.
  5. 5. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que el polfmero organico se selecciona del grupo que consiste en poli(etilen glicol) (PEG), polilactato, poli(acidos lacticos), carbohidratos, lfpidos, poli(acido glutamico) (PGA), poli(acido glicolico), poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), poli(acetato de vinilo) (PVA), y las combinaciones de los mismos.
  6. 6. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que el ligando es capaz de unirse a al menos un componente celular, que es preferiblemente un marcador tumoral.
  7. 7. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que el ligando se selecciona del grupo que consiste en un peptido, protema, biopolfmero, polfmero sintetico, antfgeno, anticuerpo, microorganismo, virus, receptor, hapteno, enzima, hormona, compuesto qmmico, patogeno, toxina, modificador superficial, y combinaciones de los mismos, en el que el peptido se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en tripeptido RGD, peptido dclico cRGD, octreotato, EPPT1 y analogos peptfdicos de alfa-MSH.
  8. 8. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que un agente de contraste esta unido a la nanopartfcula, en la que el agente de contraste es preferiblemente un radionuclido, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en 89Zr, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I y 177Lu.
  9. 9. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que un quelato esta unido a la nanopartfcula, en la que el quelato esta adaptado preferiblemente para unir un radionuclido, o se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en DFO, DOTA, TETA y DTPA.
  10. 10. La nanopartfcula de la reivindicacion 8, en la que la nanopartfcula es detectable mediante imagenologfa de PET, SPECT, CT, MRI, optica, que es preferiblemente la imagenologfa de fluorescencia, imagenologfa de bioluminiscencia, o combinaciones de las mismas.
  11. 11. La nanopartfcula de la reivindicacion 1, en la que un agente terapeutico esta unido a la nanopartfcula, en la que el agente terapeutico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en antibioticos, agentes antimicrobianos, antiproliferativos, antineoplasicos, antioxidantes, factores de crecimiento de celulas endoteliales, inhibidores de trombina, inmunosupresores, agentes anti-agregacion plaquetaria, inhibidores de la smtesis de colageno, anticuerpos terapeuticos, donantes de oxido mtrico, oligonucleotidos inversos, agentes de cicatrizacion de heridas, construcciones de transferencia de genes terapeuticos, componentes de la matriz extracelular, vasodilatadores, tromboltticos, antimetabolitos, agonistas de factores de crecimiento, antimitoticos, estatinas, esteroides, agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ACE), depuradores de radicales libres, agonistas de PPAR-gamma, ARN pequeno de interferencia (siARN), microARN, y agentes quimioterapicos antineoplasicos.
  12. 12. La nanopartfcula de la reivindicacion 11, en la que el agente terapeutico esta radiomarcado, preferiblemente unido a radiofluor 18F, o en la que el agente terapeutico es un radionuclido, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en 90Y, 131I y 177Lu.
  13. 13. Un metodo para detectar in vitro un componente de una celula que comprende las etapas de:
    - poner en contacto la celula con una nanopartfcula fluorescente basada en sflice que comprende:
    43
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en s^lice;
    una cubierta de s^lice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula; una molecula de ligando unida a la nanopartfcula; y un agente de contraste o un quelato unido a la nanopartfcula; en la que hay unidas de alrededor de 1 a alrededor de 20 moleculas de ligando a la nanopartfcula. y
    - monitorizar la union de la nanopartfcula a la celula o a un componente celular mediante al menos una tecnica de imagenologfa.
  14. 14. Una nanopartfcula fluorescente basada en sflice para el uso en la imagenologfa medica o biologica in vivo, en la que la nanopartfcula comprende:
    - un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice;
    - una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo;
    - un polfmero organico unido a la nanopartfcula;
    - una molecula de ligando unida a la nanopartfcula; y
    - un agente de contraste o un quelato unido a la nanopartfcula;
    en la que hay unidas de alrededor de 1 a alrededor de 20 moleculas de ligando a la nanopartfcula.
  15. 15. Una nanopartfcula fluorescente basada en sflice, que preferiblemente esta radiomarcada, para el uso en el tratamiento de un cancer en un paciente, en la que la nanopartfcula comprende:
    un nucleo basado en sflice que comprende un compuesto fluorescente colocado dentro del nucleo basado en sflice;
    una cubierta de sflice que rodea al menos una porcion del nucleo; un polfmero organico unido a la nanopartfcula;
    una molecula de ligando unida a la nanopartfcula y capaz de unirse a un marcador tumoral; y al menos un agente terapeutico,
    en la que hay unidas de alrededor de 1 a alrededor de 20 moleculas de ligando a la nanopartfcula.
  16. 16. La nanopartfcula fluorescente basada en sflice, para el uso en el tratamiento de un cancer en un paciente segun la reivindicacion 15, en la que la nanopartfcuia se administrara de manera oral, intravenosa, nasal, subcutanea, intramuscular o transdermica.
    FIGURA 1
    imagen1
    FIGURA 1
    d
    Corazon Intestino Higado
    Vejiga
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    FIGURA 2
    Emision (x106) Aex = 640 nm
    imagen6
    xj Densidad optica
    Emision normalizada (I/I0)
    imagen7
    imagen8
    :
    I
    —j----- —j----- ----f-----
    o
    lO o
    o
    «•} oi
    £
    m
    E
    c
    o
    (£>
    m
    T*
    *0
    >o
    O
    o
    o
    m G(T) - normalizado
    Brillo por particula (kHz)
    Tiempo (seg)
    FIGURA 3
    imagen9
    mi Sangre mu Rinon iH Bazo Pulmon ^gado
    imagen10
    10 180 360
    Tiempo (min)
    imagen11
    imagen12
    Higado
    Vejiga
    Pulmones
    * - »
    Borde del higado
    * /*
    t
    Bazo ■^
    24 horas
    imagen13
    Post mortem; sin piel
    Tumor sc. C6
    2
    Figura 4
    % separado de los eventos totales
    imagen14
    Tiempo (horas)
    imagen15
    Concentracion (ng/ml)
    Figura 5
    imagen16
    Sondas de PET/opticas multimodales selectivas
    imagen17
    PET-Marcador de cRGDY
    V\ r^-x ,
    imagen18
    Marcador de PET 124l
    ***** w/ titn
    Figura 6
    imagen19
    c.
    Cone, \
    Radio hidrod. | Brillo/Particula

    (nm) [ (nm)

    Col. Cy5 libre 10.S7+/-0.008 I 3,48
    .......................^...*■$*>■*...........................................

    Puntos de PEG I 3.S3+/-O.04 i 10,91
    , cRG^VeG l [ 1fc13
    5,37x10'4
    6,61x10*
    cn
    K)
    Figura 7
    Int. Rel. de Fluorescencia
    imagen20
    Actividad de 124l (cpm x 106)
    imagen21
    imagen22
    imagen23
    *s»
    lift
    •wfe
    *3
    % separado de los eventos totales
    Puntos de cRGDY-PEG + anti-avB3
    Puntos de cRGDY-PEG
    Control
    (blanco)
    Puntos de cRGDY-PEG + 250x anti-av^3
    Puntos de cRGDY-PEG + 100x anti-av^3
    Puntos de cRGDY-PEG
    Control
    (blanco)
    Figura 8
    Concentration de partlculas %DI/g acumulativa excretada
    (%DI/g) :*| (orina)
    imagen24
    Tiempo tras la inyeccion (hrs)
    Tiempo tras la inyeccion (hrs)
    imagen25
    imagen26
    imagen27
    h.
    35 - 30
    « 25 o
    | 20
    2
    o 15
    (A
    a>
    CL
    10
    5
    0
    't'-y/c
    , sift"'" ■ ■ ■
    .. . i:':¥
    «s i*
    r-ty-w-
    ^ iii iij
    Sin tratar M --J&-- Sin tratar H Vehiculo M -i^Vehiculo H Nanoparticula M ••*•• Nanoparticula H
    10
    12
    14
    18
    Tiempo (dias)
    Figura 10
    %DI/g de tumor/musculo
    C* 6.0
  17. 5.0 i
  18. 4.0 J
    imagen28
    *
    4
    insignificante
    wmm M21/Punto de RGDY-PEG j ssssssl M21/Punto de PEG i
    imagen29
    24 72 98
    Tiempo (hrs)
    FIGURA 11
    %DI/g de tumor, in vivo
    MMMM21/Punto de RGDY-PEG
    .........;M21L/Punto de RGDY-PEG
    M21/Punto de PEG
    imagen30
    1
    insignificante
    <&
    4 24 48.
    Tiempo (hrs)
    $3
    2 0 \ 1.5 \ 1.0 '| 0.5 -| 0.0 1-
    * Punto de RGDY-PEG O Punto de PEG
    =0.94
    *
  19. 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1,2 1,4 18 IS %DI/g de tumor, ex vivo
    Superpuesto
    LC
    FIGURA 12
    Modelo de Melanoma Espontaneo en Minicerdos
    cn
    oo
    imagen31
    A.
    imagen32
    Modelo de animal de tamano intermedio para simular con exactitud la aplicacion de los procedimientos de biopsia de NLC en seres humanos
    A.
    C.
    cn
    CO
    Barrido con 1SF-FDG de cuerpo completo - nivel del nodulo del cuello posterior
    imagen33
    Barrido con 18F-FDG de cuerpo completo Lesion de melanoma superficial
    C.
    imagen34
    A.
    Estudio de cartograffa de NLC en un modelo en minicerdos de melanoma espontaneo
    c.
    CD
    nodulo
    nodulo
    nodulo centinela %s\ ' s x' 's x * >> X v x' |
    %
    : l
    * \ \ n'vv ys ^ \> 5 ?:: v' *
    Longitud.
    ................................
    Punto de 124l-cRGD-PEG
    nodulo
    ,,PoSBSfi».
    I
    ? i &i
    PET-CT fusionada Punto de 1124l-cRGD-PEG
    nodulo
    centinela
    nodulo y nodulo
    \ s yr centinela
    tumor
    kskkkskwSSs.'''-
    Longitud.
    imagen35
    imagen36
    imagen37
    Figura 17
    imagen38
    Figura 18
    JL, JL ■ .M.J \MV y-'-..
    tlf ^ Y Irf^ Y ^ ^ ^
    AU
    Mesilato de desferrioxamina B (DFO-B)
    %<o
    '■ t v .' P: 5-? P '<■ J
    II I v H If |
    ^ iyzfi * X tf ^ ^ ?<! " ~ N / ^
    1
    DFO “clickable”
    Mi
    Figura 19
    imagen39
    I yr?-octf*ot3S.o = DP;he-C ^s-Tyr-DTrp-iy BrT h r-Op Th r-0 H; Tyr3-octreotato “clickable”: R = grupo que contiene N3
    T^T1-GS'b?S-o£ste H = H
    Figura 20a
    ErH#i n,.0 \ W-^E
    / . /
    \ T
    »p
    K^O,. :KT, 1 Sfc
    V- X»A.
    I '
    imagen40
    Figura 20b
    imagen41
    „ / *
    iF "■'A :S Punto C con triples enlaces DFO “clickable”
    WY- Tyr3-octreotato “clickable”
    Figura 21a
    imagen42
    Figura 21b
    Estudios de interiorizacion celular con celulas de melanoma
    Colocalizacion entre punto de cRGD-PEG y Lysotracker Red (canal verde)
    imagen43
    Lysotracker Red Puntos de cRGD-PEG Tincion de contraste
    Hoechst 33258 fusionada
    Incubacion: 0,075 mg/ml de puntos x 3 hrs Lysotracker Red (100 nM) x 30 min Microscopio confocal: Leica TCS SP2 AOBS Objetivo: Leica HCX PL APO: 63x 1.2NA Water DIC D
    Figura 22
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Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101443926B1 (ko) 2006-06-15 2014-10-02 마이크로벤션, 인코포레이티드 팽창성 중합체로 제조된 색전술용 장치
BRPI0821070B1 (pt) 2007-12-21 2018-10-23 Microvention Inc dispositivo para implantação e método para a preparação de um filamento de hidrogel para implantação em um animal
US10639396B2 (en) 2015-06-11 2020-05-05 Microvention, Inc. Polymers
WO2010127220A2 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Technip France Spar mooring line sharing method and system
CN115990277A (zh) 2009-07-02 2023-04-21 斯隆-凯特林癌症研究院 基于二氧化硅的荧光纳米颗粒
US12161734B2 (en) 2009-07-02 2024-12-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Multimodal silica-based nanoparticles
JP5722333B2 (ja) 2009-10-26 2015-05-20 マイクロベンション インコーポレイテッド 膨張性ポリマーで構成される塞栓形成デバイス
BR112013000907A2 (pt) * 2010-07-16 2017-10-31 Univ Denmark Tech Dtu composição, partícula nanodimensionada para uso em registro de imagem de raios-x e método para tratamento de uma condição ou doença associada ao crescimento indesejável de células em um indivíduo com necessidade dele
WO2012029342A1 (ja) * 2010-08-30 2012-03-08 コニカミノルタエムジー株式会社 組織染色方法、組織評価方法および生体物質検出方法
EP2687234A4 (en) * 2011-03-18 2014-09-24 Konica Minolta Inc SILICA NANOPARTICLES FOR DIAGNOSTIC PICTURE GENERATION, MANUFACTURING METHOD AND BIOSUBSTANCES MARKING AGENT
US9456823B2 (en) 2011-04-18 2016-10-04 Terumo Corporation Embolic devices
WO2013016126A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 The General Hospital Corporation Therapeutic nanoparticles and methods of use thereof
GB201117675D0 (en) 2011-10-13 2011-11-23 Univ St Andrews Nanocolloids for local temperature monitoring
KR101355985B1 (ko) 2011-11-29 2014-01-29 (주)유 바이오메드 다중 암 진단용 조성물
ITTO20120132A1 (it) * 2012-02-15 2013-08-16 Univ Degli Studi Torino Procedimento di identificazione di cellule apoptotiche
WO2013146694A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 コニカミノルタ株式会社 生体物質の検出方法
WO2013158781A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 Microvention, Inc. Embolic devices
CN102617852B (zh) * 2012-04-24 2013-07-17 华东师范大学 马来酰亚胺-聚谷氨酸-天冬氨酸聚合物和其复合物、及其制备方法和用途
US11339208B1 (en) 2012-05-31 2022-05-24 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Camelidae single-domain antibodies against Yersinia pestis and methods of use
US9351993B2 (en) 2012-06-14 2016-05-31 Microvention, Inc. Polymeric treatment compositions
KR20140015763A (ko) * 2012-07-24 2014-02-07 삼성디스플레이 주식회사 Ｌｅｄ 패키지 및 이를 갖는 표시 장치
KR102275634B1 (ko) 2012-10-15 2021-07-08 마이크로벤션, 인코포레이티드 폴리머 치료 조성물
US10264974B2 (en) * 2012-11-20 2019-04-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High resolution imaging using near-infrared-II fluorescence
US20140147381A1 (en) * 2012-11-29 2014-05-29 Gregory David Espenan 89zr compounds, to include somatostatin, apparatus and products comprising such compounds, methods of making same, and methods of using same for radio imaging and/or treatment
JP6568802B2 (ja) * 2013-02-20 2019-08-28 コーネル ユニバーシティＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 多層蛍光性ナノ粒子及びその製造並びに使用方法
JP6412918B2 (ja) * 2013-03-15 2018-10-24 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ マルチモーダルシリカ系ナノ粒子
CN103264987B (zh) * 2013-04-22 2014-12-24 浙江师范大学 金纳米簇的制备方法及其应用
CN105324667B (zh) * 2013-06-19 2018-08-24 柯尼卡美能达株式会社 生物体分子染色用的荧光纳米粒子及其制造方法
EP3040724B1 (en) * 2013-09-26 2018-08-29 Konica Minolta, Inc. Method for determining quantity of biological material in tissue section
WO2015047787A1 (en) * 2013-09-30 2015-04-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Pegylated nanoparticle compositions
JP6681334B2 (ja) * 2013-12-31 2020-04-15 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター リアルタイムの蛍光源のマルチチャネル撮像のためのシステム、方法、および装置
WO2015153996A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Micro Vention, Inc. Embolic devices
US10953110B2 (en) 2014-04-25 2021-03-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual emissive metal nanoparticles as ratiometric pH indicators
CN106456836B (zh) 2014-04-29 2019-12-06 微仙美国有限公司 包含活性剂的聚合物
WO2015167751A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Microvention, Inc. Polymers
EP3148591B1 (en) * 2014-05-29 2020-03-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Nanoparticle drug conjugates
WO2016004043A1 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 Blend Therapeutics, Inc. Targeted conjugates and particles and formulations thereof
JP6602834B2 (ja) * 2014-06-30 2019-11-06 ターベダ セラピューティクス インコーポレイテッド 標的化コンジュゲートならびにその粒子及び製剤
KR102510540B1 (ko) 2014-10-03 2023-03-16 나노틱스 엘엘씨 가용성 생물분자의 생물학적 활성을 억제하기 위한 조성물 및 방법
CA2970719C (en) * 2014-12-15 2023-08-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Cyclic peptides with enhanced nerve-binding selectivity, nanoparticles bound with said cyclic peptides, and use of same for real-time in vivo nerve tissue imaging
HK1250646A1 (zh) * 2015-04-07 2019-01-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center 纳米粒子免疫偶联物
EP3291840A4 (en) * 2015-05-04 2019-01-02 Cornell University Ultrasmall nanoparticles and methods of making and using same
CN108377643B (zh) * 2015-05-29 2021-09-21 纪念斯隆凯特琳癌症中心 使用超小纳米粒子通过铁死亡诱导营养素剥夺癌细胞的细胞死亡的治疗方法
US10925852B2 (en) 2015-06-30 2021-02-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Talc-bound compositions and uses thereof
EP3316863A4 (en) * 2015-06-30 2019-02-13 Tarveda Therapeutics, Inc. DIRECTED CONJUGATES AND PARTICLES AND FORMULATIONS THEREOF
US11660436B1 (en) 2015-08-04 2023-05-30 Verily Life Sciences Llc Device, system, and formulation for oral delivery of functionalized particles
JP7465494B2 (ja) 2015-10-21 2024-04-11 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン ナノ粒子での微小空洞及び虫歯の処置及び検出
CN108473538B (zh) * 2015-10-28 2022-01-28 塔弗达治疗有限公司 Sstr靶向缀合物及其颗粒和制剂
CN105510574B (zh) * 2015-11-25 2018-11-20 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 荧光纳米探针及其制备方法和用于食品中多种危害因子同步检测的方法
CN108495655A (zh) 2015-12-15 2018-09-04 纪念斯隆凯特琳癌症中心 用于组织区分例如用于术中可视化的成像系统和方法
US11696959B2 (en) * 2015-12-31 2023-07-11 City Of Hope Nanoparticle-cell construct with platinum anti-cancer agent
KR20180112060A (ko) 2016-02-23 2018-10-11 타베다 세라퓨틱스, 인코포레이티드 Hsp90 표적화된 접합체 및 이의 입자 및 제형
WO2017176762A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Nanotics, Llc Particles comprising subparticles or nucleic acid scaffolds
WO2017189961A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for targeted particle penetration, distribution, and response in malignant brain tumors
CA3029994A1 (en) 2016-07-07 2018-01-11 Cornell University Imaging systems and methods for particle-driven, knowledge-based, and predictive cancer radiogenomics
US10368874B2 (en) 2016-08-26 2019-08-06 Microvention, Inc. Embolic compositions
JP7492826B2 (ja) 2016-10-21 2024-05-30 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 分子ナノタグ
JP2020500863A (ja) 2016-11-30 2020-01-16 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 阻害剤官能化超小型ナノ粒子およびその方法
CN107050471A (zh) * 2016-12-27 2017-08-18 中国药科大学 基于富勒烯的靶向且具有快速清除特征的显像纳米探针及其制备方法和应用
FR3064364A1 (fr) * 2017-03-27 2018-09-28 S.P.C.M. Sa Methode de dosage de polymeres cationiques
CN110891613B (zh) * 2017-04-07 2022-08-26 观点医疗有限公司 多模式成像标记物
US12397067B2 (en) 2017-04-10 2025-08-26 Cornell University Sulfur- or heavy atom-containing nanoparticles, methods of making same, and uses thereof
CN111182891B (zh) * 2017-05-19 2022-08-09 康奈尔大学 官能化纳米颗粒及其制备和使用方法
EP3634500B1 (en) 2017-05-25 2023-10-25 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Ultrasmall nanoparticles labeled with zirconium-89 and methods thereof
TWI835736B (zh) * 2017-06-09 2024-03-21 法國商Ｎｈ蕾哈吉公司 合成二氧化矽奈米粒子之方法及藉由該方法所獲得的二氧化矽奈米粒子
US20210145985A1 (en) 2017-06-23 2021-05-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Method of imaging in vivo tissues using nanoparticles comprising a reference dye and a sensor dye
AU2018308332B2 (en) * 2017-07-25 2021-11-18 Lemonex Inc. Composition for delivering physiologically active ingredients into blood vessel
CN111200976B (zh) 2017-10-09 2023-07-07 微仙美国有限公司 放射性液体栓塞
CN107871677B (zh) * 2017-10-31 2020-08-25 合肥京东方光电科技有限公司 一种显示面板、封装监测装置及其封装监测方法
JP2021504475A (ja) * 2017-11-22 2021-02-15 ヒルストリーム・バイオファーマ・インコーポレイテッド ボルテゾミブを含むポリマーナノ粒子
WO2019113004A1 (en) 2017-12-04 2019-06-13 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of cancer treatment via regulated ferroptosis
CN108245688A (zh) * 2017-12-18 2018-07-06 中国科学院自动化研究所 肝细胞癌诊断试剂及其制备方法
US20210052731A1 (en) * 2018-05-02 2021-02-25 Cornell University Inorganic nanophotosensitizers and methods of making and using same
WO2019212945A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Nanotherapeutic systems and methods using particle-driven photodynamic therapy (pdt)
US11666411B2 (en) 2018-05-10 2023-06-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Systems for augmented reality surgical and clinical visualization
EP3588063A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-01 Universität Basel Method and computer program for determining a pharmacokinetic parameter in a biological sample by means of fluorsecence correlation spectroscopy
WO2020014253A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent nanoparticles and imaging uses
CN109110764A (zh) * 2018-08-13 2019-01-01 河南师范大学 一种以微生物细胞分泌液为基质还原制备单质硅纳米颗粒的方法及其应用
CN113195090B (zh) 2018-10-16 2023-06-20 硅胶实验室制药公司 二氧化硅胶囊/球制备的可调方法及其用途
CN109490265A (zh) * 2018-11-08 2019-03-19 深圳先进技术研究院 监测植物内物质运输的方法及其应用
EP3897752A1 (en) * 2018-12-17 2021-10-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Inducing favorable effects on tumor microenvironment via administration of nanoparticle compositions
CN109900670B (zh) * 2019-04-02 2021-07-06 济南大学 一种识别铁离子和氟离子的双功能探针及其制备和应用
US12042281B2 (en) 2019-07-17 2024-07-23 Terumo Cardiovascular Systems Corporation Fluorescent nanomaterial sensors and related methods
WO2021021866A1 (en) * 2019-08-01 2021-02-04 Academia Sinica Nanocomposite and uses thereof
DE102019129924A1 (de) * 2019-08-21 2021-02-25 Endress+Hauser Conducta Gmbh+Co. Kg Optochemischer Sensor, Sensorkappe, Verwendung des optochemischen Sensors und Verfahren zur Herstellung einer analyt-sensitiven Schicht des optochemischen Sensors
CN114929152B (zh) 2019-08-28 2025-03-25 观点医疗有限公司 超声标记物检测、标记物及相关联的系统、方法和物品
EP4021909A4 (en) 2019-08-29 2023-08-30 David C. Martin Biofunctional thiophene monomers
CN110551497B (zh) * 2019-09-15 2022-06-10 四川农业大学 一种分子印迹量子点磷光探针的制备方法及其应用
AU2020372991B2 (en) 2019-10-31 2024-09-19 Terumo Cardiovascular Systems Corporation Heart-lung machine with augmented reality display
US11882992B2 (en) 2019-11-27 2024-01-30 View Point Medical, Inc. Composite tissue markers detectable via multiple detection modalities including radiopaque element
US11903767B2 (en) 2019-11-27 2024-02-20 View Point Medical, Inc. Composite tissue markers detectable via multiple detection modalities
CN111840551B (zh) * 2020-07-28 2022-07-19 苏州大学 治疗糖尿病的非侵入式近红外光控的纳米材料
KR102379752B1 (ko) * 2020-08-19 2022-03-28 국민대학교산학협력단 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 및 조성물
WO2022093800A2 (en) 2020-10-27 2022-05-05 Elucida Oncology, Inc. Carrier particle-drug conjugates, self-immolative linkers, and uses thereof
CN113281317B (zh) * 2021-05-14 2022-04-29 北京指真生物科技有限公司 一种含有花菁类化合物的编码微球及其制备方法和应用
CN114394602B (zh) * 2021-12-22 2023-09-22 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种锰掺杂的中空介孔二氧化硅纳米材料及其制备方法与应用
CN114431160B (zh) * 2021-12-30 2023-07-21 中国科学院上海技术物理研究所 一种适用于太空微重力环境的动物排泄物收集系统
US20250186607A1 (en) * 2022-03-09 2025-06-12 The Regents Of The University Of California One-step supramolecular multifunctional coating on plant virus nanoparticles for bioimaging and therapeutic applications
CN115092938B (zh) * 2022-06-21 2024-02-06 苏州拉索生物芯片科技有限公司 一种氨基改性二氧化硅微球的制备方法及应用
US20240272075A1 (en) * 2023-02-10 2024-08-15 University Of Northern Iowa Research Foundation Taggant systems and methods of use
CN118388504B (zh) * 2024-07-01 2024-10-11 吉林大学第一医院 一种荧光标记的卡托普利及其应用

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3870791A (en) 1972-04-24 1975-03-11 Heskel M Haddad Solid state ophthalmic medication delivery method
US3867519A (en) 1972-04-27 1975-02-18 Alza Corp Bioerodible drug delivery device
US4051842A (en) 1975-09-15 1977-10-04 International Medical Corporation Electrode and interfacing pad for electrical physiological systems
DE2626348C3 (de) 1976-06-11 1980-01-31 Siemens Ag, 1000 Berlin Und 8000 Muenchen Implantierbare Dosiereinrichtung
US4136177A (en) 1977-01-31 1979-01-23 American Home Products Corp. Xanthan gum therapeutic compositions
US4255415A (en) 1978-11-22 1981-03-10 Schering Corporation Polyvinyl alcohol ophthalmic gel
US4383529A (en) 1980-11-03 1983-05-17 Wescor, Inc. Iontophoretic electrode device, method and gel insert
US4668506A (en) 1985-08-16 1987-05-26 Bausch & Lomb Incorporated Sustained-release formulation containing and amino acid polymer
US4931279A (en) 1985-08-16 1990-06-05 Bausch & Lomb Incorporated Sustained release formulation containing an ion-exchange resin
US4788603A (en) 1985-10-19 1988-11-29 Fuji Photo Film Co., Ltd. Camera for sequentially photographing a subject using a reference optical system and a telescopic optical system
US4812409A (en) 1986-01-31 1989-03-14 Eastman Kodak Company Hydrolyzable fluorescent substrates and analytical determinations using same
US4713224A (en) 1986-03-31 1987-12-15 The Boc Group, Inc. One-step process for purifying an inert gas
US4810636A (en) 1986-12-09 1989-03-07 Miles Inc. Chromogenic acridinone enzyme substrates
US4774339A (en) 1987-08-10 1988-09-27 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes
US5274113A (en) 1991-11-01 1993-12-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates
US5433896A (en) 1994-05-20 1995-07-18 Molecular Probes, Inc. Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes
US5248782A (en) 1990-12-18 1993-09-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength heteroaryl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes
US5187288A (en) 1991-05-22 1993-02-16 Molecular Probes, Inc. Ethenyl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes and their synthesis
US5660827A (en) 1992-03-05 1997-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies that bind to endoglin
US5830912A (en) 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
US6344272B1 (en) 1997-03-12 2002-02-05 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells
GB2330907A (en) 1997-10-28 1999-05-05 Applied Imaging Int Ltd A karyotyper and methods for producing karyotypes
AU2464299A (en) 1998-01-22 1999-08-09 Luminex Corporation Microparticles with multiple fluorescent signals
US6428811B1 (en) 1998-03-11 2002-08-06 Wm. Marsh Rice University Temperature-sensitive polymer/nanoshell composites for photothermally modulated drug delivery
US6254852B1 (en) * 1999-07-16 2001-07-03 Dupont Pharmaceuticals Company Porous inorganic targeted ultrasound contrast agents
US20050250854A1 (en) 2000-11-03 2005-11-10 Amgen Inc. Combination therapy using pentafluorobenzenesulfonamides and antineoplastic agents
US7279150B2 (en) * 2002-01-24 2007-10-09 Barnes-Jewish Hospital Chelating agents with lipophilic carriers
CA2476888A1 (en) 2002-02-01 2003-08-14 Vanderbilt University Targeted drug delivery methods
US8620410B2 (en) 2002-03-12 2013-12-31 Beth Israel Deaconess Medical Center Multi-channel medical imaging system
US20040101822A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Ulrich Wiesner Fluorescent silica-based nanoparticles
WO2006042233A1 (en) 2004-10-08 2006-04-20 The Cleveland Clinic Foundation Medical imaging using quantum dots
US7653427B2 (en) 2004-11-12 2010-01-26 Intra-Medical Imaging LLC Method and instrument for minimally invasive sentinel lymph node location and biopsy
EP1861072A2 (en) 2005-03-14 2007-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Nanocells for diagnosis and treatment of diseases and disorders
CA2600370A1 (en) 2005-03-14 2006-09-14 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bioactive fus1 peptides and nanoparticle-polypeptide complexes
CN101389314A (zh) * 2005-03-14 2009-03-18 得克萨斯大学体系董事会 生物活性fus1肽和纳米颗粒-多肽复合物
US7601355B2 (en) 2005-06-01 2009-10-13 Northwestern University Compositions and methods for altering immune function
AU2006261917A1 (en) 2005-06-24 2007-01-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Radiolabeled-pegylation of ligands for use as imaging agents
FR2888753B1 (fr) * 2005-07-21 2008-04-04 Commissariat Energie Atomique Vecteur cible avec fonction d'imagerie activable
WO2008044138A1 (en) 2006-10-12 2008-04-17 Syddansk Universitet Optical nanosensor for detection of reactive oxygen species
WO2008049118A2 (en) 2006-10-19 2008-04-24 The General Hospital Corporation Apparatus and method for obtaining and providing imaging information associated with at least one portion of a sample and effecting such portion(s)
US7902332B2 (en) * 2006-11-30 2011-03-08 General Electric Company Fluorine-labeled compounds
US20080213377A1 (en) 2006-12-08 2008-09-04 Bhatia Sangeeta N Delivery of Nanoparticles and/or Agents to Cells
US8239008B2 (en) 2007-04-13 2012-08-07 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Sentinel node identification using fluorescent nanoparticles
EP1995327A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Humboldt Universität zu Berlin Probe for detecting a particular nucleic acid sequence
US20110028662A1 (en) 2007-08-31 2011-02-03 Hybrid Silica Technologies, Inc. Peg-coated core-shell silica nanoparticles and methods of manufacture and use
DE102007052517A1 (de) 2007-10-29 2009-04-30 Autoimmun Diagnostika Gmbh ELISPOT-Verfahren mit zwei Filtersystemen
US8968699B2 (en) 2007-11-15 2015-03-03 The Regents Of The University Of California Switchable nano-vehicle delivery systems, and methods for making and using them
US8564792B2 (en) 2007-12-21 2013-10-22 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution in three dimensions
US8389679B2 (en) * 2009-02-05 2013-03-05 The Regents Of The University Of California Targeted antimicrobial moieties
WO2011005380A2 (en) * 2009-06-12 2011-01-13 Stc. Unm Arg-gly-asp-conjugated alpha-melanocyte stimulating hormone hybrid peptide for use in diagnosing and treating melanoma, including metastatic melanoma and methods related to same
CN115990277A (zh) 2009-07-02 2023-04-21 斯隆-凯特林癌症研究院 基于二氧化硅的荧光纳米颗粒
JP2013514977A (ja) 2009-12-16 2013-05-02 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 複数の物質の送達のための粒子
HRP20130953T1 (hr) 2010-04-15 2013-11-22 Spirogen Sàrl Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
US10732115B2 (en) 2012-06-22 2020-08-04 Cornell University Mesoporous oxide nanoparticles and methods of making and using same
US9695133B2 (en) 2012-07-13 2017-07-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Quinazolinone-based oncogenic-RAS-selective lethal compounds and their use
CN103566377A (zh) 2012-07-18 2014-02-12 上海博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
JP6412918B2 (ja) 2013-03-15 2018-10-24 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ マルチモーダルシリカ系ナノ粒子
EP3148591B1 (en) 2014-05-29 2020-03-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Nanoparticle drug conjugates
CN108377643B (zh) 2015-05-29 2021-09-21 纪念斯隆凯特琳癌症中心 使用超小纳米粒子通过铁死亡诱导营养素剥夺癌细胞的细胞死亡的治疗方法
US20210145985A1 (en) 2017-06-23 2021-05-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Method of imaging in vivo tissues using nanoparticles comprising a reference dye and a sensor dye
CN112291219B (zh) 2020-10-22 2023-06-13 格力博(江苏)股份有限公司 通信交互方法及系统

Also Published As

Publication number Publication date
PL2449379T3 (pl) 2017-12-29
US9625456B2 (en) 2017-04-18
EP3223013B1 (en) 2019-02-27
WO2011003109A8 (en) 2012-02-23
CN102713612B (zh) 2016-10-05
EP3499233A2 (en) 2019-06-19
EP3223013A1 (en) 2017-09-27
ES2718084T3 (es) 2019-06-27
CN106421817A (zh) 2017-02-22
DK2449379T3 (en) 2017-08-28
US20170239378A1 (en) 2017-08-24
US10548997B2 (en) 2020-02-04
EP2449379A4 (en) 2014-02-19
DK3223013T3 (en) 2019-04-15
US20130039848A1 (en) 2013-02-14
CN102713612A (zh) 2012-10-03
EP2449379B1 (en) 2017-05-17
CN115990277A (zh) 2023-04-21
WO2011003109A1 (en) 2011-01-06
PL3223013T3 (pl) 2019-07-31
EP3499233A3 (en) 2019-09-18
EP2449379A1 (en) 2012-05-09

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