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ES2634450T3 - Modulación antisentido de la expresión de PTP1B - Google Patents

Modulación antisentido de la expresión de PTP1B Download PDF

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ES2634450T3
ES2634450T3 ES12771485.5T ES12771485T ES2634450T3 ES 2634450 T3 ES2634450 T3 ES 2634450T3 ES 12771485 T ES12771485 T ES 12771485T ES 2634450 T3 ES2634450 T3 ES 2634450T3
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ptp1b
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Inventor
Sanjay Bhanot
Susan M. Freier
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Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido monocatenario modificado, en el que dicho oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en SEQ ID NO: 26, en el que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2'-O-metoxietilo, en el que cada enlace internucleosídico de dicho oligonucleótido modificado es un enlace de fosforotioato, y en el que cada residuo de citosina de dicho oligonucleótido modificado es una 5- metilocitosina.

Description

CAMPO
En la presente memoria se describen métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de PTP1B mARN y proteína en un animal. Tales métodos, compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir, retrasar o aliviar enfermedades asociadas con trastornos metabólicos, en particular los trastornos asociados con la diabetes.
FONDO
La proteína de fosfatasa de tirosina 1B (PTP1B) es un miembro de una familia de PTPs (Barford, et al, Science 1994. 263: 1397-1404) y es una enzima citosólica (Neel y Tonks, Curr Opin Cell Biol 1997. 9: 193-204). PTP1B se expresa de forma ubicua incluyendo tejidos que son los principales reguladores del metabolismo de la insulina, como el hígado, músculo y grasa (Goldstein, Receptor 1993. 3: 1-15), donde es la enzima de PTP principal.
PTP1B se considera que es un regulador negativo de la señalización de la insulina. PTP1B interactúa con el receptor de insulina y lo desfosforila, atenuando de este modo y potencialmente terminando la transducción de señalización de la insulina (Goldstein et al, J. Biol Chem 2000, 275: 4383-4389). El papel fisiológico de PTP1B en la señalización de la insulina se ha demostrado en modelos de ratones knockout. Los ratones que carecen del gen PTP1B estaban protegidos contra la resistencia a la insulina y la obesidad (Elchebly et al, Science 1999 283:. 15441548). Ratones deficientes en PTP1B tenían baja adiposidad, tasa metabólica basal incrementada así como el gasto total de energía, y estaban protegidos de la obesidad inducida por la dieta. La captación de glucosa estimulada por insulina fue elevada en el músculo esquelético, mientras que el tejido adiposo no estaba afectado proporcionando evidencia que la sensibilidad a la insulina incrementada en los ratones deficientes en PTP1B era específica de tejido (Klaman et al, Mol Cell Biol 2000 20: 5479-5489). Estos ratones fueron fenotípicamente normales y también fueron resistentes a la obesidad inducida por la dieta, resistencia a la insulina y tenían significativamente más bajos niveles de triglicéridos en una dieta alta en grasas. Por lo tanto, sería beneficiosa la inhibición de PTP1B en pacientes que sufren de diabetes de tipo II, síndrome metabólico, dislipidemia diabética, o enfermedades metabólicas relacionadas.
Inhibición antisentido de PTP1B ofrece una ventaja única sobre los inhibidores de moléculas pequeñas tradicionales en que los inhibidores antisentido no se basan en la unión competitiva del compuesto a la proteína e inhiben directamente la actividad mediante la reducción de la expresión de PTP1B. La tecnología antisentido está emergiendo como un medio eficaz para reducir la expresión de ciertos productos génicos y por lo tanto puede resultar únicamente útil en un número de aplicaciones de investigación, diagnóstico, y terapéutico para la modulación de PTP1B.
US 2002/055479 describe compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico que codifica PTP1B.
De momento existe una falta de opciones aceptables para el tratamiento de trastornos metabólicos. Es por tanto un objeto para proporcionar compuestos y métodos para el tratamiento de tales enfermedades y trastornos.
RESUMEN
En la presente memoria se describen métodos, compuestos y composiciones para modular la expresión de PTP1B y tratar, prevenir, retrasar o aliviar enfermedades asociadas con trastornos metabólicos, en particular los trastornos asociados con la diabetes y/o un síntoma de la misma.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido monocatenario modificado, en el que dicho oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en SEQ ID NO: 26, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados;
un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado 2'-O-metoxietilo, en el que cada enlace internucleosídico de dicho oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato, y en el que cada residuo de citosina de dicho oligonucleótido modificado es una 5-metilocitosina.
La invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención y al menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona el compuesto o composición de la invención para su uso en
a) prevenir, tratar, mejorar, ralentizar la progresión de, o retrasar la aparición de una enfermedad o condición asociada con la PTP1B en un animal; o b) prevenir o retrasar la aparición de aumento de los niveles de glucosa en sangre en un animal; c) prevenir, tratar, mejorar, o ralentizar la progresión de una enfermedad metabólica o condición.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Los numerosos objetos y ventajas de la presente invención pueden ser mejor entendidos por los expertos en la técnica haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:
Figura 1 muestra una transferencia Western de los oligonucleótidos antisentido PTP1B, ISIS 404173 e ISIS 142082, demonstrando la disminución de expresión de la proteína PTP1B en 8mgk/semana la potencia de los compuestos. Véase la Tabla 47.
Figura 2 es una tabla de resumen de los estudios de tolerabilidad clave en monos cynomolgus (véase el Ejemplo 17).
Figura 3 es una reducción de representación gráfica de ARNm de PTP1B humano en un estudio preclínico de respuesta a la dosis. El tratamiento con ISIS 404173 se comparó con el de ISIS 113715, el candidato clínico previo. Como se muestra aquí, la dosificación con ISIS 404173 era más potente y causó una reducción significativa en los niveles de PTP1B de ARNm en comparación con la dosificación con ISIS 113715. En particular, en dosis de 0,3 mM, hubo una disminución de cinco veces en los niveles de PTP1B ARNm con ISIS 404173 en comparación con ISIS 113715.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Es de entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, según se reivindica. En este documento, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" y "incluido", no es limitativo. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de analítica química, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se pueden utilizar para la síntesis química, y análisis químico.
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Las técnicas estándar se pueden utilizar para la síntesis química, y análisis químico. A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también de 2'-MOE y 2'-O (CH2)2-OCH3) Se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo furosilo. Un azúcar modificado por 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado. "Nucleótido de 2'-O-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado 2'-Ometoxietilo. "Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido de una diana de ácido nucleico que es complementaria al extremo de nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular. "Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al extremo nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular. "5-metilocitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5metilocitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro de +10% de un valor. Por ejemplo, si se afirma, "un marcador se puede aumentar en aproximadamente un 50%", se da a entender que el marcador se puede aumentar entre el 45%-55%.
"Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones un antisentido oligonucleótido dirigido a PTP1B es un agente farmacéutico activo.
5 "Región diana activa" o "región diana" se refiere a una región a la que uno o más compuestos activos antisentido está dirigido. "Compuestos de antisentido activos" significan compuestos de antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína.
La "adipogénesis" significa el desarrollo de células de grasa de preadipocitos. "Lipogénesis" significa la 10 producción o la formación de grasa, ya sea degeneración grasa o infiltración grasa.
"Adiposidad" o "obesidad" se refiere al estado de ser obeso o una cantidad excesivamente alta de grasa corporal o tejido adiposo en relación con la masa corporal magra. La cantidad de grasa corporal incluye preocupación tanto para la distribución de la grasa en todo el cuerpo como el tamaño y la masa de los depósitos de
15 tejido adiposo. La distribución de grasa corporal se puede estimar mediante medidas de pliegues cutáneos, relaciones de circunferencia de cintura a cadera, o técnicas tales como ultrasonido, tomografía computarizada o resonancia magnética. Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades, los individuos con un índice de masa corporal (IMC) de 30 o más se consideran obesos. El término "obesidad" como se usa en este documento incluye condiciones en las que se produce un aumento en la grasa corporal más allá del requisito físico
20 como resultado de la acumulación excesiva de tejido adiposo en el cuerpo. El término "obesidad" incluye, pero no se limita a las siguientes condiciones: la obesidad de inicio en adultos; obesidad alimentaria; obesidad endógena o inflamatoria; obesidad endocrina; obesidad familiar; obesidad hiperinsulinar; obesidad hiperplásica-hipertrófica; obesidad de hipogonadismo; obesidad de hipotiroidismo; obesidad de toda la vida; obesidad mórbida y la obesidad exógena.
25 "Administrado concomitantemente" se refiere a la co-administración de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos son manifiestos en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una sola composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación, o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no tienen por qué
30 manifestarse al mismo tiempo. Los efectos sólo necesitan superponerse por un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente a un animal, e incluye, pero no se limita a, la administración por un profesional médico y la auto-administración. 35
"Agente" significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. "Primer agente" significa un compuesto terapéutico proporcionado en este documento. Por ejemplo, un primer agente puede ser un PTP1B que se orienta a oligonucleótido antisentido. "Segundo agente" significa un segundo compuesto terapéutico de la invención (por ejemplo, un segundo PTP1B orientado a
40 oligonucleótido antisentido) y/o un compuesto terapéutico no PTP1B.
"Amelioration" se refiere a una disminución de al menos un indicador, muestra, o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas para los expertos en la técnica.
45 "Animal" se refiere a un ser humano o animal no humano, incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero no limitado a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un
50 compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o la proteína codificada por tal ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" se refiere a un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar la 55 hibridación con un ácido nucleico diana a través de puentes de hidrógeno.
"Inhibición antisentido" se refiere a la reducción de los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de
proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación
con los niveles diana de ácido nucleico o los niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido.
60 "Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de una sola hebra que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región correspondiente o segmento de un ácido nucleico diana.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo furosilo modificado por el puente de dos átomos del anillo no geminales. 65 Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico.
"Estructura de tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna forma químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene los nucleótidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" se refiere a un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas.
"Co-administración" significa la administración de dos o más agentes a un individuo. Los dos o más agentes pueden estar en una única composición farmacéutica, o puede estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes se pueden administrar a través de las mismas o diferentes vías de administración. Co-administración abarca administración paralela o secuencial.
"Colesterol" es una molécula de esterol que se encuentra en las membranas celulares de todos los tejidos animales. El colesterol debe ser transportado en el plasma sanguíneo de un animal por las lipoproteínas, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de desnidad intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL), y lipoproteína de alta densidad (HDL). "Colesterol de plasma" se refiere a la suma de todas las lipoproteínas (VDL, IDL, LDL, HDL) esterificadas y/o colesterol presente en el plasma o suero no esterificado.
"Inhibidor de la absorción de colesterol" significa un agente que inhibe la absorción del colesterol exógeno obtenido a partir de la dieta.
"Complementariedad" significa la capacidad para el apareamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significan nucleobases inmediatamente adyacentes la una a la otra.
"Desoxirribonucleótido" quiere decir un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición de la porción de azúcar del nucleótido 2'. Los desoxirribonucleótidos pueden ser modificados con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Diabetes mellitus" o "diabetes" es un síndrome caracterizado por el metabolismo desordenado y anormalmente alto de azúcar en sangre (hiperglucemia) como resultado de niveles insuficientes de insulina o sensibilidad reducida a la insulina. Los síntomas característicos son la producción de orina excesiva (poliuria) debido a los niveles de glucosa en sangre, sed excesiva y el aumento de la ingesta de líquidos (polidipsia) procurando compensar la orina incrementada, visión borrosa debido a los efectos de glucosa en sangre en la óptica del ojo, pérdida de peso inexplicada, y letargo.
"Dislipidemia diabética" o "diabetes de tipo 2 con dislipidemia" se refiere a una afección caracterizada por diabetes de tipo 2, la reducción de HDL-C, niveles elevados de triglicéridos, y partículas de LDL elevadas pequeñas y densas.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser una solución salina líquida, por ejemplo.
"Dislipidemia" se refiere a un trastorno de los lípidos y/o metabolismo de las lipoproteínas, incluyendo lípidos y/o lipoproteína de producción excesiva o deficiencia. Las dislipidemias pueden manifestarse por la elevación de los lípidos tales como colesterol y triglicéridos, así como las lipoproteínas tales como las lipoproteínas de baja densidad (LDL).
"Unidad de dosificación" significa una forma en la que se proporciona un agente farmacéutico, por ejemplo píldora, comprimido, u otra unidad de dosificación conocida en la técnica. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido liofilizado. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido reconstituido.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionado en una única administración, o en un período de tiempo especificado. En ciertas realizaciones, una dosis se puede administrar en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones donde se desea la
administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente mediante una única inyección, por lo tanto, dos o más inyecciones se pueden utilizar para conseguir la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período prolongado de tiempo o de forma continua. Las dosis se pueden afirmar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo en necesidad del agente. La cantidad eficaz puede variar entre los individuos, dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo, y otros factores relevantes.
"Totalmente complementario" o "100% complementario" significa cada nucleobase de una secuencia de nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria de una segunda secuencia de nucleobase de un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que se coloca una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que apoyan la escisión H de RNasa entre las regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en el que los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido
o nucleósidos que comprende las regiones externas. La región interna puede ser denominada como un "segmento de hueco" y las regiones externas pueden denominarse "segmentos de ala."
"Ensanchado por hueco" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de hueco de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
"Glucosa" es un monosacárido utilizado por las células como fuente de energía y el intermedio inflamatorio. "La glucosa en plasma" se refiere a la glucosa presente en el plasma.
"Inhibidor de HMG-CoA" significa un agente que actúa a través de la inhibición de la reductasa de enzima HMG-CoA, tales como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina y simvastatina.
"Hibridación" significa la hibridación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana.
"Hiperlipidemia" o "hiperlipemia" es una condición caracterizada por lípidos séricos elevados o que circulan lípidos (plasma). Esta condición manifiesta una concentración anormalmente alta de grasas. Las fracciones de lípidos en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad y los triglicéridos.
"Hipertrigliceridemia" se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos.
"Identificación" o "selección de un animal con metabólico" significa identificar o seleccionar un sujeto después de haber sido diagnosticado con una enfermedad metabólica, o un trastorno metabólico; o, identificar o seleccionar un sujeto que tiene cualquier síntoma de una enfermedad metabólica, incluyendo, pero no limitado al síndrome metabólico, hiperglucemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, resistencia incrementada a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina, por encima del peso corporal normal, y/o por encima de la grasa corporal normal o cualquier combinación de los mismos. Dicha identificación se puede realizar por cualquier método, incluyendo, pero no limitado a, pruebas o evaluaciones clínicas estándar, tales como la medición de suero o de circulación (plasma) de glucosa en sangre, la medición de suero o triglicéridos circulantes (plasma), la medición de la presión sanguínea, el cuerpo de medición de grasa, la medición de peso corporal, y similares.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individual" o "sujeto" o "animal" significa un animal humano o no humano seleccionado para el tratamiento
o terapia.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad de un ARN
o proteínas y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
"Resistencia a la insulina" se define como la condición en la que una cantidad normal de insulina son insuficientes para producir una respuesta normal de la insulina a partir de células de grasa, músculo y el hígado. Resistencia a la insulina en células de grasa da como resultado la hidrólisis de los triglicéridos almacenados, lo que eleva los ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo. resistencia a la insulina en el músculo reduce la captación de
glucosa mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de la glucosa, sirviendo ambos efectos para elevar la glucosa en sangre. Altos niveles de plasma de insulina y glucosa debido a la resistencia a la insulina a menudo conduce al síndrome metabólico y diabetes de tipo 2.
5 "Sensibilidad a la insulina" es una medida del nivel de eficacia con el que un individuo procesa la glucosa. Un individuo que tiene una alta sensibilidad de la insulina procesa eficazmente la glucosa mientras que un individuo con baja sensibilidad a la insulina no procesa efectivamente glucosa.
"Enlace Internucleosídico" se refiere a la unión química entre nucleósidos.
10 "La administración intravenosa" significa administración en una vena.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí.
15 "Terapia hipolipemiante" o "agente reductor de lípidos" se refiere a un régimen terapéutico proporcionado a un sujeto para reducir uno o más lípidos en un sujeto. En ciertas realizaciones, se proporciona una terapia hipolipemiante para reducir uno o más de ApoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, triglicéridos, partículas pequeñas densas de LDL y Lp(a) en un sujeto. Ejemplos de terapia de reducción de lípidos incluyen estatinas, fibratos e inhibidores de MTP.
20 "Principales factores de riesgo" se refiere a factores que contribuyen a un alto riesgo de una enfermedad o condición particular. En ciertas realizaciones, los principales factores de riesgo para la enfermedad cardíaca coronaria incluyen, sin limitación, el tabaquismo, hipertensión, niveles bajos de HDL-C, historia familiar de enfermedad coronaria del corazón, la edad y otros factores se describen aquí.
25 "Enfermedad metabólica" o "trastorno metabólico" se refiere a una afección caracterizada por una alteración
o perturbación en la función metabólica. "Metabólico" y "metabolismo" son términos bien conocidos en la técnica y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que se producen dentro de un organismo vivo. Las enfermedades metabólicas o trastornos incluyen, pero no se limitan a, obesidad, diabetes, hiperglucemia,
30 prediabetes, la enfermedad no alcohólica del hígado graso (NAFLD), síndrome metabólico, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética, o hipertrigliceridemia o una combinación de los mismos.
"Síndrome metabólico" se refiere a una condición caracterizada por una agrupación de lípidos y factores de riesgo cardiovascular no lipídicos de origen metabólico. En ciertas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica
35 por la presencia de cualesquiera 3 de los siguientes factores: circunferencia de la cintura superior a 102 cm en hombres o mayor que 88 cm en mujeres; triglicéridos en suero de al menos 150 mg/dl; HDL-C de menos de 40 mg/dl en hombres o menos de 50 mg/dl en mujeres; la presión arterial de al menos 130/85 mmHg; y la glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dL. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).
40 "Falta de coincidencia" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de aparearse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico de diana.
45 "Dislipidemia mixta" se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol y triglicéridos elevados.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico natural (es decir, un enlace de internucleósido de fosfodiéster). 50
"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina, o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C), y uracilo (U).
55 "Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o nucleobase modificado.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, enlace de internucleósido modificado, o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un 60 nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido modificado.
65 "Azúcar modificado" se refiere a la sustitución o el cambio de un azúcar natural.
"Motivo" significa que el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Inhibidor de MTP" significa que un agente inhibe la enzima, la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales.
"Enlace internucleosídico natural" significa un enlace de fosfodiéster 3' a 5'.
"Resto de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Enfermedad no alcohólica del hígado graso" o "NAFLD" significa una condición caracterizada por la inflamación grasa del hígado que no es debido a un uso excesivo de alcohol (por ejemplo, consumo de alcohol de más de 20 g/día). En ciertas realizaciones, NAFLD se relaciona con resistencia a la insulina y el síndrome metabólico. NAFLD abarca un espectro de la enfermedad que van desde simple acumulación de triglicéridos en los hepatocitos (esteatosis hepática) para esteatosis hepática con la inflamación (esteatohepatitis), fibrosis y cirrosis.
"Esteatohepatitis no alcohólica" (EHNA) se produce a partir de la progresión de la NAFLD más allá de la deposición de los triglicéridos. Se necesita un "segundo golpe" capaz de inducir la necrosis, inflamación y fibrosis para el desarrollo de la EHNA. Los candidatos para el segundo golpe se pueden agrupar en categorías generales: factores que causan un aumento del estrés oxidativo y los factores que promueven la expresión de citocinas proinflamatorias
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye los ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos de doble cadena, ácidos ribonucleicos pequeños (siARN), y microARN (miARN). Un ácido nucleico puede comprender también una combinación de estos elementos en una sola molécula.
"Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico.
"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azúcar, ligamiento, o modificación de nucleobases.
"Nucleósidos" se refiere a una base nitrogenada unida a un azúcar.
"Nucleósidos miméticos" incluye aquellas estructuras utilizadas para sustituir el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente la articulación en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como por ejemplo nucleósidos miméticos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar biciclos o triciclos por ejemplo unidades de azúcar no de furanosa.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo de fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Nucleotide mimético" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como por ejemplo ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O-u otro enlace no fosfodiéster).
"Compuesto oligomérico" o "oligómero" se refiere a una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras y es capaz de hibridar a una región de una molécula de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleósidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos quiméricos.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos ligados cada uno de los cuales pueden ser modificados o no modificados, independiendo uno de otro.
"Administración parenteral" se refiere a la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal, o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua o crónica, o corto o intermitente.
"Péptido" significa una molécula formada por la vinculación de al menos dos aminoácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" se refiere a una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a una indicación particular. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a PTP1B es agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administración a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y una solución acuosa estéril.
"Vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un medio o diluyente que no interfiere con la estructura del oligonucleótido. Ciertos de tales vehículos permiten que composiciones farmacéuticas se formulen como, por ejemplo, comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y pastillas para la ingestión oral por un sujeto. Por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa estéril.
"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales farmacéuticamente aceptables, conjugados, profármacos o isómeros de los compuestos descritos en la presente memoria.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológicas y farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido progenitor y no imparten efectos toxicológicos no deseados.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica mediante la sustitución de uno de los átomos de oxígeno no puente con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace de internucleósido modificado.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlaces) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o prevenir la aparición o desarrollo de una enfermedad, trastorno, o condición por un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir significa también la reducción del riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o condición.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos o condiciones.
"Proteína fosfatasa de tirosina 1B" o "PTP1B" (también conocido como PTPN1; proteína fosfatasa de tirosina, no receptor de tipo 1; PTP-1B; RKPTP) significa cualquier ácido nucleico o proteína de PTP1B.
"Expresión PTP1B" significa el nivel de ARNm transcrito a partir del gen que codifica PTP1B o el nivel de proteína traducida a partir del ARNm. La expresión de PTP1B puede ser determinada por métodos conocidos en la técnica tales como una transferencia de Northern o Western.
"Ácido nucleico de PTP1B" significa cualquier ácido nucleico que codifica PTP1B. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de PTP1B incluye una secuencia de ADN que codifica PTP1B, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica PTP1B (incluyendo el ADN genómico que comprende intrones y exones), y una secuencia de ARNm que codifica PTP1B. "ARNm de PTP1B" significa un ARNm que codifica una proteína PTP1B.
"Efectos secundarios" se refiere a respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento aparte de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías, y malestar general. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalías de la función hepática. Por ejemplo, bilirrubina incrementada puede indicar toxicidad hepática o anomalías de la función hepática.
"Oligonucleótido de cadena sencilla" significa un oligonucleótido que no se hibrida con una cadena complementaria.
"Hibridar específicamente" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhiben un mínimo o ningún efecto sobre los ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Estatinas" significa un agente que inhibe la actividad de la reductasa de HMG-CoA.
"Administración subcutánea" se refiere a la administración justo debajo de la piel.
"Orientación" o "de diana" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibrida específicamente con un ácido nucleico diana e inducir un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcripción de ARN diana" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser diana de compuestos antisentido.
"Segmento" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana a la que está dirigido un compuesto antisentido. "Sitio diana en 5'" se refiere al nucleótidos más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3’” se refiere al nucleótido más 3’ de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Cambio de estilo de vida terapéutico" significa cambios en la dieta y estilo de vida destinados a reducir la masa de tejido colesterol y/o graso/adiposo. Tal cambio puede reducir el riesgo de desarrollar enfermedades del corazón, y puede incluir recomendaciones para la ingesta dietética de calorías diarias totales, la grasa total, grasa saturada, grasa poliinsaturada, grasa monoinsaturada, carbohidratos, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como recomendaciones para actividad física.
"Triglicéridos" o "TG" significa un lípido o grasa neutral que consiste de glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso.
"Diabetes de tipo 2", (también conocido como "diabetes mellitus de tipo 2" o "diabetes mellitus de tipo 2", y "diabetes mellitus de tipo 2" antes denominada, "diabetes no dependiente de insulina (NIDDM)", "diabetes relacionada con la obesidad", o "diabetes del adulto") es un trastorno metabólico que se caracteriza principalmente por la resistencia a la insulina, deficiencia relativa de insulina y hiperglicemia.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno, o condición.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, restos de azúcares, y enlaces de internucleósido. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir β-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, β-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas realizaciones
Ciertas realizaciones describen métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de PTP1B.
Ciertas realizaciones describen compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de PTP1B es cualquiera de las secuencias expuestas en el nº de Acceso GenBank NM_002827.2 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), nº de acceso GenBank NT_011362.9 truncado de los nucleótidos 14178000 a 14256000 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2); y una concatenación de las secuencias de los exones 1-9, el intrón 9 y el exón 10 del andamio PTP1B de mono rhesus (que se incorpora en el presente documento como SEQ ID NO: 3).
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 10 a 30 enlaces nucleósidos y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 4-32 o 100-111.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 10 a 30 enlaces de nucleósidos y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26 o 44.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 15 a 30 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 15 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 15 a 30 nucleósidos enlazados y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 4-32. o 100-111.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 15 a 30 nucleósidos enlazados y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26 o 44.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 15 a 30 nucleósidos enlazados y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden constar de 15 a 30 nucleósidos enlazados y tener una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 18 a 21 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 18 a 21 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 18 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 4-32. o 39-49.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 18 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26 o 44.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 18 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 18 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 35 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32 o 50.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 35 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 35 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 35 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 30 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 30 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 4-32 o 50.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 30 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 30 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438 472,
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 30 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 25 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 25 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 25 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 25 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 25 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438 472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 25 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 24 nucleósidos que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 24 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 24 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 24 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 24 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 24 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 23 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 23 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, o 23 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 23 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 23 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 23 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 23 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 22 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 22 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 22 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 22 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 22 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 22 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 21 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 21 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleobases contiguas complementarias a una longitud igual porción de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constan de 20 a 21 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constarán de 20 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento constarán de 20 nucleósidos enlazados y tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en la presente consisten en cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en el presente documento se componen de ISIS NO: 404.173.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionadas en este documento consisten en SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionadas en este documento comprenden una sal de oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionadas en este documento comprenden además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarias a cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3 medidas sobre la totalidad del oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una cualquiera de la SEQ ID NO: 4-32 o 39-50. tal como se mide sobre la totalidad del oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 26 o 44. medido sobre la totalidad del oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438373, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472 como se mide sobre la totalidad del oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con ISIS NO: 404173 tal como se mide sobre la totalidad del oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, el compuesto proporcionado en el presente documento consiste en un oligonucleótido monocatenario modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 18 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato internucleosídico.
En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido de dicho oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados, el segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados, el segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos
enlazados, el segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado por 2'-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados, el segmento de hueco que consta de ocho deoxinucleósidos enlazados, el segmento de ala 5' que consta de seis nucleósidos enlazados, el segmento de ala 3' que consta de seis nucleósidos enlazados, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados, el segmento de hueco que consiste en trece deoxinucleósidos enlazados, el segmento de ala 5' que consta de dos nucleósidos enlazados, el segmento de ala 3’ que consta de cinco nucleósidos enlazados, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 18 nucleósidos enlazados, el segmento de hueco que consta de ocho deoxinucleósidos enlazados, el segmento 5' de ala que consta de cinco nucleósidos enlazados, el segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3, en el que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala a 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 3' y el de la segmento de ala 5', cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 18 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3, en las que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consta de ocho deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala 5' que consta de seis nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de seis nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 19 nucleobases contiguas de las SEQ ID NOs: 4-32, en las que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste de diez deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 19 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26, en el que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez vinculado deoxinucleósidos; b) segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionadas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados tienen la secuencia de nucleobase de la SEQ ID NO: 26, en la que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5’ y
el segmento de ala 3’, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende al menos 19 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26 o 44, en la que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina. En ciertas realizaciones, el compuesto o composición comprende el compuesto de cualquiera de ISIS NOs: 404173, 410002, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 20 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NOs: 4-32, en el que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26, en el que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez vinculado deoxinucleósidos; b) segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionadas en este documento comprenden un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 26, en la que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados; b) segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados. El segmento de hueco está colocado entre segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2’-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada residuo de citosina es una 5-metilocitosina. En ciertas realizaciones, el compuesto o composición comprende el compuesto ISIS NOs: 404.173.
Ciertas realizaciones describen métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de PTP1B.
Ciertas realizaciones describen un método de reducir la expresión de PTP1B en un animal que comprende la administración al animal de un compuesto como se describe en este documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 10 a 30 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 20 a 35 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 20 a 25 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 20 a 24 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 20 a 23 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 20 a 22 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 20 a 21 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado 20 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B.
Ciertas realizaciones describen un método de prevenir, mejorar o tratar una enfermedad metabólica en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 10 a 30 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado 20 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. Los ejemplos de enfermedades metabólicas o trastornos incluyen, pero no se limitan a la obesidad, diabetes, hiperglucemia, prediabetes, la enfermedad no alcohólica del hígado graso (NAFLD), síndrome metabólico, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética, o hipertrigliceridemia o una combinación de los mismos.
Ciertas realizaciones dan a conocer un método para reducir los niveles de glucosa en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 10 a 30 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado 20 nucleósidos enlazados de longitud dirigidos a PTP1B. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, aminora o trata una enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, alivia o trata la diabetes. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, alivia o trata la obesidad. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, alivia o trata el síndrome metabólico. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, alivia o trata la resistencia a la insulina. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, alivia o trata la hiperglucemia. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata NAFLD. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, alivia o trata la dislipidemia diabética. En ciertas realizaciones, el nivel de glucosa se reduce en al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%.
En ciertas realizaciones, PTP1B tiene la secuencia como se expone en cualquiera de los números de acceso de GenBank Nº de Acceso GENBANK NM_002827.2 (incorporados en el presente documento como SEQ ID NO: 1), nº de acceso GENBANK NT_011362.9 truncado de los nucleótidos 14.178.000-14256000 (incorporado en este documento como SEQ ID NO: 2); y una concatenación de secuencias de exones 1-9, el intrón 9 y el exón 10 del andamio PTP1B mono rhesus (que se incorpora en el presente documento como SEQ ID NO: 3). En ciertas realizaciones, PTP1B tiene la secuencia humana como se establece en SEQ ID NOs: 1-2. En ciertas realizaciones, PTP1B tiene la secuencia de mono rhesus según se expone en SEQ ID NOs: 3).
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionadas en este documento comprenden una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmaceúticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NOs: 4-32, 50 o una sal del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 25 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NOs: 4-32, 50 o una sal del mismo y un vehículo farmacéuticamente portador o diluyente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NO: 432, 50 o una sal del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionadas en este documento comprenden una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmaceúticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NO: 26 o una sal del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 25 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NO: 26 o una sal del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NO: 26 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en el presente documento comprenden una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmaceúticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionadas de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS NOs: 404173, 410002, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 25 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS NOs: 404173, 410002, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionadas de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS NOs: 404173, 410002, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472 o una sal del mismo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones descritas en el presente documento comprenden una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmaceúticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionadas de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS NO: 404173 o una de sus sales y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 25 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionadas de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS Nº: 404173, o una sal del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionadas de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS Nº: 404173, o una sal del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertas realizaciones describen un método para el tratamiento de un animal con una enfermedad o condición relacionada con PTP1B o que comprende: a) la identificación de dicho animal con la enfermedad o condición relacionada con PTP1B, y b) administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase al menos 90% complementaria a cualquiera de SEQ ID NOs: 1-3 tal como se mide sobre la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto administrado al animal trata o reduce la enfermedad o condición relacionada con PTP1B, o un síntoma del mismo, en el animal. En ciertas realizaciones, la enfermedad o afección relacionada con PTP1B es diabetes.
Ciertas realizaciones describen un método para el tratamiento de un animal con una enfermedad o condición relacionada con PTP1B o que comprende: a) la identificación de dicho animal con la enfermedad o condición relacionada con PTP1B, y b) administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase al menos 100% complementaria a cualquiera de SEQ ID NOs: 1-3, medida sobre la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto administrado a los animales trata o reduce la enfermedad o condición relacionada con PTP1B, o un síntoma del mismo, en el animal. En ciertas realizaciones, la enfermedad o afección relacionada con PTP1B es diabetes.
Ciertas realizaciones describen métodos para tratar, prevenir, o mejorar una enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, la enfermedad metabólica es la obesidad, diabetes, hiperglucemia, prediabetes, enfermedad no alcohólica de hígado graso (NAFLD), síndrome metabólico, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética, o hipertrigliceridemia o una combinación de los mismos.
Ciertas realizaciones describen métodos para tratar, prevenir, o mejorar un trastorno hiperproliferativo.
Ciertas realizaciones describen métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto como se describe en el presente documento a un animal. En ciertas realizaciones, el método comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NOs: 4-32 o 50. Ciertas realizaciones describen métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto como se describe en este documento a un animal. En ciertas realizaciones, el método comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de nucleobase indicada en SEQ ID NO: 26.
Ciertas realizaciones dan a conocer métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto como se describe en el presente documento a un animal. En ciertas realizaciones, el método comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS NOs: 404173, 410002, 438383, 438445, 438454, 438463, o 438472.
Ciertas realizaciones describen métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto como se describe en este documento a un animal. En ciertas realizaciones, el método comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de entre las secuencias de nucleobases recitadas en ISIS NO: 404173.
En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
En ciertas realizaciones, la administración previene, trata, alivia, o retrasa la progresión de una enfermedad metabólica como se describe aquí.
En ciertas realizaciones, la administración previene, trata, aminora, o retarda la progresión de la diabetes como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el compuesto se co-administra con un segundo agente.
En ciertas realizaciones, el compuesto y el segundo agente se administran concomitantemente.
En ciertas realizaciones, la administración es la administración parenteral.
Ciertas realizaciones dan a conocer además un método para reducir PTP 1 B mARN o expresión de la proteína en un animal que comprende administrar al animal un compuesto o composición como se describe en el presente documento para reducir el ARNm de PTP1B o expresión de la proteína en el animal. En ciertas realizaciones, el animal es un humano. En ciertas realizaciones, la reducción de ARNm de PTP1B o expresión de la proteína previene, trata, aminora, o retarda la progresión de la enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, la enfermedad metabólica o afección es diabetes.
Ciertas realizaciones describen un método para el tratamiento de un ser humano con una enfermedad metabólica que comprende identificar al humano con la enfermedad y administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste en el síndrome metabólico, la hiperglucemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de los niveles de glucosa, aumento de la resistencia a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina, por encima del peso corporal normal, y/o por encima de la grasa corporal normal o cualquier combinación de los mismos.
Ciertas realizaciones describen un método para el tratamiento de un humano con diabetes que comprende la identificación de la humana con la enfermedad y administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste en el síndrome metabólico, la hiperglucemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de los niveles de glucosa, aumento de la resistencia a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina, por encima del peso corporal normal, y/o por encima de la grasa corporal normal o cualquier combinación de los mismos.
Se describe además un método para reducir o prevenir la enfermedad metabólica que comprende administrar a un ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto o composición como se describe aquí, reducir o prevenir la enfermedad metabólica de este modo.
Además se describe un método para reducir o prevenir la diabetes que comprende administrar a un ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto o composición como se describe en el presente documento, la reducción o prevención de la diabetes de ese modo.
También se describe un método para mejorar un síntoma de enfermedad metabólica, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, o 3, mejorando de este modo un síntoma de enfermedad metabólica en el humano.
Además se describe un método para mejorar un síntoma de diabetes, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 10 a 30 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, o 3, mejorando de este modo un síntoma de diabetes en el ser humano.
Además se describe un método para mejorar un síntoma de diabetes, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2,
o 3, mejorando de este modo un síntoma de diabetes en el ser humano.
Además se describe un método para reducir la tasa de progresión de un síntoma asociado con enfermedades metabólicas, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende 10 a 30 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, o 3, reduciendo así la tasa de progresión de un síntoma de enfermedad metabólica en el humano.
Además se describe un método para reducir la tasa de progresión de un síntoma asociado con la diabetes, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido
modificado que consta de 20 a 35 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, o 3, reduciendo así la tasa de progresión de un síntoma de diabetes en el ser humano.
5 Además se describe un método para reducir la tasa de progresión de un síntoma asociado con la diabetes, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 20 nucleósidos enlazados, en el que dicho oligonucleótido modificado se hibrida específicamente con SEQ ID NO: 1, 2, o 3, reduciendo así la tasa de progresión de un síntoma de diabetes en el ser humano.
10 También se describen métodos y compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención, o mejora de una enfermedad metabólica.
También se describen métodos y compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, 15 prevención, o mejora de la diabetes.
Ciertas realizaciones describen el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir la enfermedad metabólica.
20 Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar, o prevenir la diabetes.
Ciertas formas de realización proporcionan un compuesto como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención, o mejora de las enfermedades metabólicas tal como se describe en el presente 25 documento por la terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente
documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas formas de realización proporcionan un compuesto como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención, o mejora de la diabetes como se describe en el presente documento por la 30 terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes
o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar enfermedades metabólicas tal como se describe en el 35 presente documento por la terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el
presente documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar la diabetes como se describe en el presente 40 documento por la terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente
documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar enfermedades metabólicas tal como se describe en la 45 presente memoria en un paciente al que posteriormente se administra un agente adicional o terapia como se
describe aquí.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o mejorar la diabetes como se describe en la presente memoria 50 en un paciente al que se administra posteriormente un agente o terapia adicional como se describe en el presente
documento.
Ciertas formas de realización proporcionan un kit para tratar, prevenir o mejorar enfermedades metabólicas tal como se describe en el presente documento en el que el kit comprende: 55
(i)
un compuesto tal como se describe en este documento; y, alternativamente,
(ii)
un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Ciertas formas de realización proporcionan un kit para tratar, prevenir o mejorar la diabetes como se 60 describe aquí en donde el kit comprende:
(i)
un compuesto tal como se describe en este documento; y, alternativamente,
(ii)
un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Un kit como se describe en el presente documento puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir, o mejorar la enfermedad metabólica, como se describe en el presente documento por la terapia de combinación como se describe aquí. En ciertas realizaciones, la enfermedad metabólica es la diabetes.
Compuestos de antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos, oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, y siARNs. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" a un ácido nucleico diana, el sentido de que es capaz de experimentar la hibridación con un ácido nucleico diana a través de puentes de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas de dichas realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de PTP1B es de 10 a 30 nucleótidos de longitud. En otras palabras, los compuestos de antisentido son de 10 a 30 nucleobases enlazadas. En otras realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8 a 80, 10 a 50, 15 a 30, 18 a 21, 20 a 80, 20 a 35, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21 o 20 nucleobases enlazadas. En ciertas de dichas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consta de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, o 80 nucleobases enlaces de longitud, o un rango definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un único nucleósido suprimido del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente desde el extremo 3' (truncamiento 3'). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos nucleósidos eliminados del extremo 5', o, alternativamente, puede tener dos subunidades eliminadas desde el extremo 3'. Alternativamente, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar en todo el oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido borrado de extremo 5' y un nucleósido borrado del extremo 3'.
Cuando un solo nucleósido adicional está presente en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional puede estar situado en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido. Cuando dos o más adicionales nucleósidos están presentes, los nucleósidos adicionales pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del oligonucleótido. Alternativamente, el nucleósido añadido puede dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene un nucleósido añadido al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de desajuste sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89: 7305 a 7.309, 1992), una serie de oligonucleótidos antisentido 13-25 nucleobases de longitud se ensayaron para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 o 11 bases de desajuste cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían desajustes. Del mismo modo, el objetivo específico de escisión se consiguió usando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobase, incluyendo aquellos con 1 o 3 desajustes.
Gautschi et al (J. Natl Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido que tiene 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desajustes a mARN de bcl-xL para reducir la expresión tanto de Bcl-2 como de Bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró actividad antitumoral potente in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc Acid Res 16: 3341-3358,1988) examinaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestas de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo era capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los 28 o 42 oligonucleótidos antisentido de nucleobases.
Motivos de compuesto antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a las propiedades de compuestos de antisentido tales como la actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión incrementada para un ácido nucleico diana, o la resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Compuestos de antisentido quiméricos contienen típicamente al menos una región modificada de modo que confieren una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, captación celular incrementada, afinidad de unión incrementada para el ácido nucleico diana, y/o aumento de la actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como un sustrato para la endonucleasa celular ARNsa H, que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN.
Los compuestos de antisentido que tienen un motivo de gápmero se consideran compuestos de antisentido quiméricos. En un gápmero se posiciona una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta ARNseH de escisión entre las regiones exteriores que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden, en algunas realizacionesm incluir ß-Dribonucleósidos, β-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (por ejemplo, los nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3, entre otros), y el azúcar bicíclico modificado (tales nucleósidos bicíclicos modificados en el azúcar pueden incluir los que tienen un acetato constreñido). En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, incluyendo, por ejemplo, 2’-MOE y etilo constreñido. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios modificados y no modificados restos de azúcar. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir diversas combinaciones de nucleósidos de 2'-MOE, nucleósidos de etilo limitados, y 2’-deoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender restos uniformes de azúcar, variante, o restos de azúcar alternos. El motivo ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "XYZ", donde "X" representa la longitud de ala 5', "Y" representa la longitud de la brecha, y "Z" representa la longitud de ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender restos de azúcar uniformes, variantes, o alternos. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" puede incluir uno o más 2'deoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-deoxinucleósidos. Tal como se usa en este documento, un gápmero descrito como "XYZ" tiene una configuración tal que la brecha se coloca inmediatamente adyacente a cada uno de ala 5’ y ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5’ y el hueco, o la brecha y el extremo 3' del ala. Cualquiera de los compuestos de antisentido descritos en este documento pueden tener un motivo gápmero. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son los mismos, en otras realizaciones son diferentes. En ciertas realizaciones, "Y" es de entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y, o Z puede ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B poseen un motivo gápmero 5-10-5.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B poseen un motivo gápmero 6-8-6.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B poseen un motivo gápmero 5-8-5.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de PTP1B tiene un motivo de hueco ensanchado.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B tienen un motivo 2-13-5 de hueco ensanchado.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de PTP1B es cualquiera de las secuencias expuestas en el GenBank nº de Acceso NM_002827.2 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), nº de acceso GenBank NT_011362.9 truncado de nucleótidos 14178000-14256000 (incorporado en este documento como SEQ ID NO: 2); y una concatenación de las secuencias de los exones 1-9, el intrón 9 y el exón 10 del andamio PTP1B de mono rhesus (que se incorpora en el presente documento como SEQ ID NO: 3).
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación de un resto azúcar, un enlace internucleosídico o una base nucleotídica. Como tales, compuestos de antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, de forma independiente, una o más modificaciones en un resto azúcar, un enlace internucleosídico o una base nucleotídica. Los compuestos
de antisentido descritos por un Número Isis (Nº Isis) indican una combinación de secuencia de nucleobase y el motivo.
En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana.
5 Por ejemplo, una región diana puede abarcar una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificadora, una región de iniciación de traducción, región de terminación de la traducción, o cualquier otra región de ácido nucleico definido. Las regiones estructuralmente definidas para PTP1B pueden obtenerse por el número de acceso de las bases de datos de secuencias tales como NCBI y tal información se incorpora aquí por referencia. En ciertas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia de un sitio diana 5' de un
10 segmento diana dentro de la región de destino a un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la misma región objetivo.
La focalización incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se hibrida un compuesto antisentido, de tal manera que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una
15 reducción en los niveles de ARNm diana de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de la proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos objetivo. Múltiples segmentos diana dentro de una
20 región diana pueden ser superpuestos. Alternativamente, pueden ser no solapantes. En ciertas realizaciones, los segmentos de destino dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas emodiments, segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos, es decir, es aproximadamente, no es más que, es no más de aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un rango definido por dos
25 cualesquiera de los valores precedentes. En ciertas realizaciones, los segmentos de destino dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan las regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de sitios diana 5' o sitios diana 3' que figuran en el presente documento.
30 Segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de un 5' UTR, una región codificante, 3' UTR, un intrón, un exón, o una unión exón/intrón. Segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específcamente una cierta región estructuralmente definida como el codón de inicio o codón de parada.
35 La determinación de segmentos diana adecuados pueden incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias de todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST se puede utilizar para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede prevenir la selección de secuencias de compuesto antisentido que puede hibridar de manera no específica a secuencias distintas de un
40 ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de diana).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por la reducción porcentual de niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos de antisentido dentro de una región diana activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de PTP1B de ARNm son indicativos de la inhibición de la expresión de
45 PTP1B. Las reducciones en los niveles de una proteína PTP1B también son indicativos de la inhibición de la expresión de ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión de PTP1B. En ciertas realización, la reducción de los niveles de glucosa, niveles de lípidos reducidos, y la reducción de peso corporal puede ser indicativa de la inhibición de la expresión de PTP1B. En ciertas realizaciones, la mejora de los síntomas asociados con la enfermedad metabólica puede ser indicativa de la inhibición de la expresión de
50 PTP1B. En ciertas realizaciones, la mejora de los síntomas asociados con la diabetes puede ser indicativa de la inhibición de la expresión de PTP1B. En ciertas realizaciones, la reducción de la resistencia a la insulina es indicativa de inhibición de la expresión de PTP1B. En ciertas realizaciones, la reducción de los biomarcadores de la diabetes puede ser indicativa de la inhibición de la expresión de PTP1B.
55 Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en este documento y un ácido nucleico de PTP1B. El mecanismo más común de la hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlace de hidrógeno Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso) entre nucleobases
60 complementarias de las moléculas de ácidos nucleicos.
La hibridación puede producirse bajo condiciones variables. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y se determinan por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridarse.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido proporcionados en este documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico de PTP1B.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede enlazarse por hidrógeno con las correspondientes nucleobases del ácido nucleico diana, de tal manera que un efecto deseado se producirá (por ejemplo, la inhibición antisentido de un diana de ácido nucleico, tal como un ácido nucleico de PTP1B).
Un compuesto antisentido puede hibridarse por uno o más segmentos de un ácido nucleico de PTP1B tal que segmentos intervinientes o adyacentes no están involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, desajuste o estructura de horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido descritos aquí, o una porción especificada de la misma, son, o son al menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% complementario a un ácido nucleico de PTP1B, una región diana, el segmento diana, o parte especificada de la misma. La complementariedad porcentual de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo, y por lo tanto se hibridarían específicamente, representarían el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden ser agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que es de 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendrían 77,8% de complementariedad en general con el ácido nucleico diana y se describe en el presente documento. Complementariedad porcentual de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineamiento local básico) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410;. Zhang y Madden, Genome Res, 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, la identidad de secuencia
o la complementariedad, se pueden determinar mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido proporcionados en el presente documento, o partes especificadas de la misma, son totalmente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico de PTP1B, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana de la misma. Como se usa en este documento, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de apareamiento de bases preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia diana que es de 400 nucleobases de longitud, siempre que hay una correspondiente porción de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que es totalmente complementaria al compuesto antisentido. Totalmente complementario también se puede utilizar en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "totalmente complementaria" a una secuencia diana que es de 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es totalmente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una parte de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede o puede no ser totalmente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si los 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarios a la secuencia diana.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando dos o más nucleobases no complementarias están presentes, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria se encuentra en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gápmero.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase no complementaria con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de PTP1B, o porción especificada de la misma.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase no complementaria con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de PTP1B, o porción especificada de la misma.
Los compuestos de antisentido proporcionados en este documento también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Tal como se usa en el presente documento, "parte" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlaces) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobase de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 16 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 17 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 18 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 19 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido son complementarios a al menos una porción de 20 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos de antisentido que son complementarios a al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleobases de un segmento diana, o un rango definido por dos cualquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos de antisentido proporcionados en este documento también pueden tener una identidad porcentual definida a una secuencia particular de nucleótidos, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o porción del mismo. Tal como se usa en este documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en el presente documento si tiene la misma capacidad de nucleobase de emparejamiento. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto uracilo como timidina se emparejan con adenina. Versiones acortadas y alargadas de los compuestos de antisentido descritos en este documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos de antisentido proporcionados en este documento también se contemplan. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersarse en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen idéntico apareamiento de bases con respecto a la secuencia a la que se está comparando.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a uno o más de los compuestos de antisentido o SEQ ID NOs, o una porción del mismo, descrita en este documento.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La parte de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar vinculado al resto de hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través de la unión covalente de los nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos de fosfato se conocen comúnmente como la formación de los enlaces de internucleósido del oligonucleótido.
Las modificaciones de los compuestos de antisentido comprenden sustituciones o cambios a enlaces internucleosídicos, restos de azúcar, o nucleobases. Compuestos de antisentido modificados se prefieren a menudo sobre las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad aumentada para el ácido nucleico diana, mayor estabilidad en presencia de nucleasas, o aumento de la actividad inhibidora.
Nucleósidos químicamente modificados también se pueden emplear para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, los resultados comparables pueden obtenerse a menudo con compuestos de antisentido cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces de internucleósido modificados
El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace de fosfodiéster 3' a 5'. Los compuestos de antisentido que tienen uno o más enlaces de internucleósido modificados, es decir de origen no natural, se seleccionan a menudo más compuestos de antisentido que tienen enlaces de internucleósido naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, una mayor absorción celular, una mayor afinidad para los ácidos nucleicos diana, y el aumento de estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces de internucleósido modificados incluyen enlaces de internucleósido que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces de internucleósido que no tienen un átomo de fósforo. Enlaces de internucleósido que contienen fósforo representativo incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilofosfonatos, fosforamidato, y fosforotioatos. Los métodos de preparación de los enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B comprenden uno o más enlaces de internucleósido modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces de internucleósido modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
Los compuestos de antisentido proporcionados en este documento pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en el que el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados de azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasa mejorada, aumento de la afinidad de unión, o alguna otra propiedad biológica beneficiosa para los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden un resto de anillo de ribofuranosa modificado químicamente. Los ejemplos de anillos químicamente modificados de ribofuranosa incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2'); puente de átomos en el anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA); sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R), o C(R1) (R)2 (R = H, C1-C12 alquilo o un grupo protector); y sus combinaciones. Ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen, nucleósido sustituido 2'-F-5'-metilo (véase, solicitud internacional PCT WO2008/101157, publicada el 8/21/08 para los otros nucleósidos sustituidos 5', 2'-bis), sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2 (véase, solicitud de patente publicada de Estados Unidos US2005/0130923, publicada el 16 de junio, 2005), o, alternativamente, sustitución 5' de un BNA (véase, solicitud internacional PCT WO2007/134181, publicada el 11/22/07, en el que LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Ejemplos de nucleósidos modificados que tienen restos de azúcar incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes de 5’-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede ser seleccionada de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2) 2-O-N (Rm) (Rn), y O-CH2-C(=O)-N (Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
Tal como se usa en este documento, "nucleósidos bicíclicos" se refieren a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre átomos de anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido descritos en este documento incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos en el que el puente comprende un nucleósido bicíclico 4' a 2'. Ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos 4' a 2', incluyen, pero no se limitan a, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2' y 4’-CH(CH2OCH3)-O-2', y análogos de los mismos (véase, Patente de Estados Unidos 7.399.845, expedida el 15 de julio de 2008); 4’-C(CH3) (CH3)-O-2’, y análogos de los mismos (véase, Solicitud Internacional PCT publicada WO2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2', y análogos de los mismos (véase, publicada PCT Solicitud Internacional WO2008/150729, publicado diciembre 11, 2008); 4’-CH2-ON (CH3) -2' (véase, publicada Solicitud de Patente de Estados Unidos US2004/0171570, publicada el 2 de septiembre del 2004); 4’-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector (véase, Patente de Estados Unidos 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4’-CH2-C(H) (CH3)-2’ (véase, Chattopadhyaya, et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4’-CH2-C(=CH2)-2’, y análogos de los mismos (véase, publicada Solicitud Internacional PCT WO2008/154401, publicada el 8 de diciembre, 2008). También véase, por ejemplo: Singh et al, Chem. Commun, 1998, 4, 455-456.; Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3.607 a 3.630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633 a 5638; Kumar et al., Bioorg. Medicina. Chem. Lett, 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem, 1998, 63, desde 10.03510.039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129 (26) 8362-8379 (jul 4, de 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther, 2001, 3, 239-243; Nos de Patente de EE.UU. 6.670.461, 7.053.207, 6.268.490, 6.770.748, 6.794.499, 7.034.133, 6.525.191, 7.399.845; Las solicitudes internacionales PCT publicadas WO2004/106356, WO 94/14226, WO2005/021570 y WO2007/134181; La Publicación de Patente de Estados Unidos Nº US2004/0171570, US2007/0287831 y US2008/0039618; y la patente de EE.UU. nº de serie 12/129.154, 60/989.574, 61/026.995, 61/026.998, 61/056.564, 61/086.231, 61/097.787 y 61/099.844; y la Solicitud Internacional PCT Nos.
PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, y PCT/US2008/068922. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones estereoquímicas de azúcar incluyendo, por ejemplo αL-ribofuranosa y β-D-ribofuranosa (véase solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
En ciertas realizaciones, restos de azúcares bicíclicos de nucleósidos BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y la posición 2' del resto de azúcar de pentofuranosilo en el que dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-; donde:
x es 0, 1, o 2;
n es 1, 2, 3, o 4;
15 cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, heterociclo radical, heterociclo sustituido radical, heteroarilo, heteroarilo sustituido, C5-C7 radical alicíclico, C5-C7 alicíclico radical sustituido, halógeno, C1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), O sulfoxilo (S(=O)-J1); y cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, alquilo sustituido C1-C12 alquilo, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 aminoalquilo sustituido, o un grupo Protector.
25 En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra) (Rb)]n-,-[C(Ra) (Rb)]n-O-, C(RaRb)-N(R)-O-o, -C(RaRb)-ON(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4’-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-ON(R)-2’, y 4'-CH2-N(R)-O-2'-, en el que cada Ris, independientemente, H, un grupo protector, o C1-C12 alquilo.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos que se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende puente de 4 '2' metiloeno-oxi, puede estar en la configuración α-L o en la configuración β-D. Anteriormente, BNA de α-L-metiloenoxi (4’-CH2-O-2') se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6.365-6372).
35 En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos que incluyen, pero no se limitan a, (A) α-L-metiloenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (b) β-D-Metiloenoxi (4’-CH2-O-2') BNA, (C) Etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) Aminooxi (4’-CH2O-N(R)-2’) BNA, (E) Oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) Metilo (metiloenoxi) (4’-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metiloenotio (4’-CH2-S-2 ') BNA, (H) metileno-amino (4'-CH2-N(R)-2’) BNA, (i) metilo carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)2’) BNA, y (J) propiloeno carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA, como se representa a continuación.
65 en donde Bx es el resto de base y R es, independientemente, H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico tiene la Fórmula I:
donde: 15
Bx es un resto de base heterocíclica;
-Qa -Qb-Qc-es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-ON(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O-, o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es C1-C12 alquilo o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo 20 reactivo de fósforo, un resto fósforo, o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula II:
donde:
40 Bx es un resto de base heterocíclica; Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo reactivo de fósforo, un resto fósforo, o una unión covalente a un medio de soporte; Za es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
45 En una realización, cada uno de los grupos sustituidos es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, C1-C6 alquilo, o C1-C6 alquilo sustituido y X es O o NJc.
50 En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula III:
donde:
Bx es un resto de base heterocíclica; Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo reactivo de fósforo, un resto fósforo, o una unión covalente a un medio de soporte; Zb es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido, o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula IV:
donde:
25 Bx es un resto de base heterocíclica; Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo reactivo de fósforo, un resto fósforo, o una unión covalente a un medio de soporte; Rd es C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, o C2-C6 alquinilo sustituido; cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquilo, alquilo sustituido C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, o C2-C6 alquinilo sustituido, C1-C6 alcoxilo, sustituido C1-C6 alcoxilo, acilo, acilo sustituido, C1-C6 aminoalquilo, o C1-C6 aminoalquilo sustituido;
35 En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula V:
donde:
Bx es un resto de base heterocíclica; Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo
55 reactivo de fósforo, un resto fósforo, o una unión covalente a un medio de soporte; qa, 1b, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1-C12 alquilo, alquilo sustituido C1-C12 alquilo, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxi, C1-C12 alcoxi sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son = C(qg)(qh); qg y qf son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, o C1-C12 alquilo sustituido.
La síntesis y la preparación de metiloenoxi (4’-CH2-O-2') BNA monómeros adenina, citosina, guanina, 5metilo-citosina, timina, y uracilo, juntos con su oligomerización y las propiedades de reconocimiento de ácidos 65 nucleicos han sido descritos (véase, por ejemplo, Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3.607-3.630). BNAs y
preparación de los mismos también se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226.
Los análogos de metiloenoxi (4’-CH2-O-2') BNA, metiloenoxi (4’-CH2-O-2') BNA, y 2'-tio-BNA, también han sido preparados (véase, por ejemplo, Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). La preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las polimerasas de ácido nucleico ha sido también descrita (véase, por ejemplo, Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un análogo de oligonucleótido de alta afinidad de novela conformacionalmente restringida, ha sido descrito en la técnica (véase, por ejemplo, Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, BNA de 2'-amino-y 2'-metiloamino se han preparado y se ha informado anteriormente de la estabilidad térmica de sus dúplex con hebras de ARN y ADN complementarias.
En ciertas realizaciones, nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula VI:
donde:
Bx es un resto de base heterocíclica; Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo reactivo de fósforo, un resto fósforo, o una unión covalente a un medio de soporte; cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxilo, C1-C12 alcoxilo sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk, o N(H)C(=S)NJjJk; y q1 y qj o ql y qk juntos son = C (qg) (qh), en el que qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, o C1-C12 alquilo sustituido.
Un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el análogo de alquenilo, puente 4’CH=CH-CH2-2', han sido descritos (véase, por ejemplo, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 44294443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). La síntesis y la preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos también se han descrito (véase, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007,129 (26), 8362-8379).
Tal como se usa en este documento, " nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta el átomo de carbono 2' y átomo de carbono 4'.
Tal como se usa en este documento, "nucleósidos monocíclicos" se refieren a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcares bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar,
o análogo de resto de azúcar, de un nucleósido puede ser modificado o sustituido en cualquier posición.
Tal como se usa en este documento, "azúcar modificado 2'" quiere decir un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, incluyendo, pero no limitado a alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y sustituido, alquilo sustituido y amino no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, modificaciones 2' se seleccionan de sustituyentes incluyendo, pero no limitados
a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también pueden seleccionarse a partir de: C1-C12 alquilo; alquilo sustituido; alquenilo; alquinilo; alcarilo; aralquilo; O-alcarilo o O-aralquilo; SH; SCH3; OCN; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo informador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas; y un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral de 2'-MOE (véase, por ejemplo, Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11.944-12.000). Dicha sustitución de 2'-MOE se han descrito por haber mejorado la afinidad de unión en comparación con los nucleósidos no modificados y a otros nucleósidos modificados, tales como 2'-O-metilo, O-propilo, y O-aminopropilo. Los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2’-MOE también se han
demostrado ser inhibidores antisentido de la expresión de genes con características prometedoras para su uso in vivo (véase, por ejemplo, Martin, P., Helv Chim Acta, 1995, 78, 486-504.; Altmann et al, Chimia, 1996, 50, 168-176;. Altmann et al, Biochem Soc Trans, 1996, 24, 630-637; y Altmann et al, Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917926).
Tal como se usa en este documento, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un tetrahidropiran de seis miembros de "azúcar" sustituidos por el residuo pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, CJ. Bioorg. y Med. Chem (2002) 10: 841-854), HNA de fluoro (F-HNA), o aquellos compuestos que tienen la Fórmula X:
en el que de forma independiente para cada uno de dicho al menos un análogo nucleosídico de tetrahidropirano de Fórmula X:
Bx es un resto de base heterocíclica; T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3; q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, o C2-C6 alquinilo sustituido; constituyen una de R1 y R2 es hidrógeno y el otro se selecciona entre halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 y CN, en el que X es O, S, o NJ1, y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o C1-C6 alquilo.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos THP modificados de fórmula X en la que qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu es distinto de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu es metilo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de THP de fórmula X se proporcionan en donde uno de R1 y R2 es F. En algunas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H, R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
Tal como se usa en este documento, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinta de H o OH. Nucleósidos 2'modificados, incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar se conecta de carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar y nucleósidos con sustituyentes 2' sin puente, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-ON(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido. nucleósidos modificados 2’ pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Tal como se usa en este documento, "2’-F" se refiere a un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2'.
Tal como se usa en este documento, "2’-OMe" o "2’-OCH3" o "2'-O-metilo" cada uno se refiere a un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Tal como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, uno o más de la pluralidad de nucleósidos se modifica. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
Muchos otros sistemas de anillo de sustituto de azúcar bicíclico y el tricíclico también son conocidos en la técnica que se puede utilizar para modificar los nucleósidos para su incorporación en compuestos de antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Estos sistemas de anillo pueden someterse a diversas sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para las preparaciones de azúcares modificados son bien conocidos para los expertos en la técnica.
En nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobases (naturales, modificados,
o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido comprenden uno o más nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleótidos 2'-MOE modificados están dispuestas en un motivo gápmero. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un CET. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados por CET están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gápmero.
Nucleobases modificadas
Modificaciones de nucleobase (o base) o sustituciones son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con nucleobases naturales o sintéticas no modificadas. Tanto nucleobases naturales como modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobases pueden impartir estabilidad nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa para compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5metilocitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones de 5-metilocitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico diana. Por ejemplo, las sustituciones 5-metilocitosina han demostrado aumentar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico mediante 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Nucleobases no modificadas adicionales incluyen citosina de 5-hidroximetilo, xantina, hipoxantina, 2aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, uracilo de 5-propinilo (-C=C-CH3) y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, uracilo de 6-azo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otros adeninas y guaninas 8sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos 5-sustituidos y citosinas, 7metiloguanina y 7-metiloadenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
Restos de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos de antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas por N-2, N-6 y O-6, incluyendo 2 aminopropiloadenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos de antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B comprenden uno o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido de hueco ensanchado dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilocitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5metilocitosina.
Composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con la sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones farmacéuticas o formulaciones. Composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, incluyendo, pero no limitadas a la vía de administración, extensión de la enfermedad, o la dosis a administrar.
El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de PTP1B se puede utilizar en composiciones farmacéuticas por combinación del compuesto antisentido con un diluyente farmacéuticamente aceptable o portador adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para uso en composiciones para administración parenteral. Por consiguiente, en una realización, empleada en los métodos descritos en este documento es una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de PTP1B y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de antisentido abarcan cuaeslquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo en esto. De acuerdo con ello, por ejemplo, la divulgación también se extrae de las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sales de potasio, sodio y.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en este documento se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica. Para una revisión de sales farmacéuticamente aceptables, véase Stahl y Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002). sales de sodio de los oligonucleótidos antisentido son útiles y son bien aceptados para la administración terapéutica a los humanos. Por consiguiente, en una realización, los compuestos descritos en este documento están en la forma de una sal de sodio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que son escindidos por las nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos de antisentido conjugados
Los compuestos de antisentido pueden ser unidos covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos lipídicos. grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos de antisentido también se pueden modificar para tener uno o más grupos estabilizadores que están generalmente unidos a uno o ambos extremos terminales de compuestos de antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidas en grupos estabilizadores están estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico de terminales de la degradación de exonucleasa, y puede ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo 5 '(5'-tapa), o en el extremo 3 '(3’-tapa), o puede estar presente en ambos extremos terminales. Estructuras de tapa se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas invertidas abásicas desoxi. Además grupos estabilizantes 3' y 5' que se pueden utilizar para limitar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo de células y tratamiento de compuestos de antisentido
Los efectos de los compuestos de antisentido sobre el nivel, actividad o expresión de ácidos nucleico de PTP1B se pueden ensayar in vitro en una variedad de tipos de células. Tipos de células utilizadas para este tipo de análisis están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de acuerdo con el proveedor de instrucciones usando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Tipos celulares ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B, hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
Se describen aquí procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden ser modificados apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente el 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el lípido catiónico LIPOFECTIN® reactivo de transfección (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que varía típicamente de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en OPTI-MEM® 1 medio de suero reducido (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración
deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración LIPOFECTAMINE® que varía típicamente de 2 a 12 ug/ml por 100 nM oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitro-gen, Carlsbad, CA). Oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en OPTI-MEM® 1 medio de suero reducido (Invitrogen, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración Cytofectin® que varía típicamente de 2 a 12 ug/ml por 100 nM oligonucleótido antisentido.
Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye electroporación.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se recogen típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, en el que el ARN tiempo o niveles de proteína de ácidos nucleicos diana se miden por métodos conocidos en la técnica y se describen en este documento. En general, cuando los tratamientos se llevan a cabo en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido utilizado varía de línea celular a línea celular. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular, son bien conocidos en la técnica. Oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que van de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectina o Citofectina. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan en concentraciones más elevadas que van desde 625 a 20.000 nM cuando se transfectaron usando electroporación.
Aislamiento de ARN
Análisis de ARN puede llevarse a cabo en el ARN celular total o poli(A)+ mARN. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se preparó utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) según los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de los niveles diana o expresión
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de PTP1B se puede ensayar en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción de la polimerasa competitiva cadena (PCR), o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede llevarse a cabo en el ARN celular total o poli(A)+ mARN. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el ABI PRISM 7600, 7700, o 7900 Secuence Detection System disponibles comercialmente, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de niveles de ARN diana
La cuantificación de los niveles de ARN diana puede lograrse por PCR cuantitativa en tiempo real a través de ABI PRISM 7600, 7700, o 7900 Sequence Detección System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que se utiliza entonces como el sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. El RT y las reacciones de PCR en tiempo real se llevan a cabo secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Reactivos RT y PCR a tiempo real se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Reacciones de RT, PCR en tiempo real se llevan a cabo por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Cantidades diana de gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan utilizando ya sea el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tales como la ciclofilina A, o mediante la cuantificación de ARN total usando RiboGreen® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de Ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, al ejecutarse simultáneamente con la diana, multiplexación, o por separado. El ARN total se cuantificó usando reactivo de cuantificación del ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación del ARN por RiboGreen® se enseñan en Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368374). Un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) se utiliza para medir la fluorescencia RiboGreen®.
Las sondas y cebadores se diseñan para hibridarse con un ácido nucleico de PTP1B. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software de tipo PRIMER Express® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
La inhibición antisentido de ácidos nucleico de PTP1B se puede evaluar mediante la medición de los niveles de proteína PTP1B. Los niveles de proteína de PTP1B pueden ser evaluados o cuantificados en una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos de proteína cuantitativos, ensayos de actividad de la proteína (por ejemplo, ensayos de actividad de la caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o fluorescencia de células activadas (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden ser identificados y obtenidos a partir de una variedad de fuentes, como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se pueden preparar a través de métodos monoclonales o policlonales convencionales de generación de anticuerpos bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de PTP1B humana y de rata están disponibles comercialmente.
Pruebas in vivo de los compuestos de antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, son probados en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de PTP1B y producir cambios fenotípicos. Las pruebas pueden llevarse a cabo en animales normales, o en modelos de enfermedad experimentales. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmaceúticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías parenterales de modo de gestión. Tras un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, el ARN se aisla de tejido y se miden los cambios en la expresión de ácido nucleico de PTP1B. También se midieron los cambios en los niveles de proteína PTP1B.
Ciertas indicaciones
En ciertas realizaciones, descritas en este documento son procedimientos de tratamiento de un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe aquí. En ciertas realizaciones, el individuo tiene la enfermedad relacionada con el metabolismo.
Como se muestra en los ejemplos siguientes, los compuestos dirigidos a PTP1B, como se describe en el presente documento, se ha demostrado para reducir la gravedad de los síntomas fisiológicos de enfermedades relacionadas con el metabolismo, incluyendo el síndrome metabólico, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética, la hipertrigliceridemia, la obesidad y el aumento de peso. En algunos de los experimentos, los compuestos reducen los niveles de glucosa en sangre, por ejemplo, los animales continuaron a experimentar síntomas, pero los síntomas fueron menos graves en comparación con los animales no tratados. En otro de los experimentos, sin embargo, los compuestos parecen reducir los síntomas de la diabetes; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo experimentaron síntomas menos graves que los que se administran los compuestos durante un periodo de tiempo más corto. En otro de los experimentos, sin embargo, los compuestos parecen inhibir el aumento de peso; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo experimentaron síntomas menos graves que los que se administran los compuestos durante un periodo de tiempo más corto. En otro de los experimentos, sin embargo, los compuestos parecen inhibir la hipertrigliceridemia; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo experimentó síntomas menos graves que los que se administran los compuestos durante un periodo de tiempo más corto. La capacidad de los compuestos ejemplificados a continuación para restaurar la función, por tanto, demuestra que los síntomas de la enfermedad pueden ser invertidos mediante el tratamiento con un compuesto tal como se describe en el presente documento.
La diabetes mellitus se caracteriza por numerosos síntomas físicos y fisiológicos. Cualquier síntoma conocido para un experto en la técnica a estar asociado con la diabetes de tipo 2 se puede mejorar o modular de otro modo como se ha expuesto anteriormente en los métodos descritos anteriormente. En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma físico seleccionado del grupo que consiste en aumento de los niveles de glucosa, el aumento de la ganancia de peso, micción frecuente, sed inusual, hambre extrema, fatiga extrema, visión borrosa, infecciones frecuentes, hormigueo o entumecimiento en las extremidades, piel seca y con picazón, pérdida de peso, úlceras, inflamación de las encías y de cicatrización lenta.
En ciertas realizaciones, el síntoma es un síntoma fisiológico seleccionado del grupo que consiste en aumento de la resistencia a la insulina, aumento de los niveles de glucosa, aumento de la masa grasa, la disminución de la tasa metabólica, una disminución del aclaramiento de glucosa, disminución de la tolerancia a la glucosa, disminución de la sensibilidad a la insulina, disminución de la sensibilidad hepática a la insulina, el aumento de tamaño de tejido adiposo y el peso, aumento de grasa corporal, y el aumento de peso corporal.
En ciertas realizaciones, el síntoma físico es ganancia de peso incrementada. En ciertas realizaciones, el síntoma es la micción frecuente. En ciertas realizaciones, el síntoma es sed inusual. En ciertas realizaciones, el síntoma es hambre extrema. En ciertas realizaciones, el síntoma es la fatiga extrema. En ciertas realizaciones, el síntoma es la visión borrosa. En ciertas realizaciones, el síntoma es infecciones frecuentes. En ciertas realizaciones, el síntoma es hormigueo o entumecimiento en las extremidades. En ciertas realizaciones, el síntoma es la piel seca
y con picazón. En ciertas formas de realización, el síntoma consiste en la pérdida de peso. En ciertas realizaciones, el síntoma consiste en úlceras de cicatrización lenta. En ciertas realizaciones, el síntoma es inflamación de las encías. En ciertas realizaciones, el síntoma se incrementa la resistencia a la insulina. En ciertas realizaciones, el síntoma consiste en aumento de masa grasa. En ciertas realizaciones, el síntoma disminuye la tasa metabólica. En
5 ciertas realizaciones, el síntoma es la disminución del aclaramiento de la glucosa. En ciertas realizaciones, el síntoma disminuye la tolerancia a la glucosa. En ciertas realizaciones, el síntoma disminuye la sensibilidad a la insulina. En ciertas realizaciones, el síntoma disminuye la sensibilidad a la insulina hepática. En ciertas realizaciones, el síntoma incrementa el tamaño de tejido adiposo y el peso. En ciertas realizaciones, el síntoma incrementa la grasa corporal. En ciertas realizaciones, el síntoma incrementa el peso corporal.
10 Liu y Chernoff han demostrado que PTP1B se une a y sirve como sustrato para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Liu y Chernoff, Biochem. J., 1997, 327, 139-145). Además, en las células de carcinoma epidermoide humano A431, pT1b se encontró que se inactivado por la presencia de H2O2 generada por la adición de EGF. Estos estudios indican que PTP1B puede regularse negativamente por el estado de oxidación de la
15 célula, que a menudo se desreguló durante la tumorigénesis (Lee et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 15.366-15.372).
La sobreexpresión de PTP1B se ha demostrado en cánceres de ovario malignos y esta correlación se acompañó de un aumento concomitante en la expresión del receptor del factor de crecimiento asociado (Wiener et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 1994, 170, 1177 -1183).
20 PTP1B se ha demostrado para suprimir la transformación en células NIH3T3 inducidas por el oncogén neu (Brown-Shimer et al., Cancer Res., 1992, 52, 478-482), así como en la fibroblastos 3Y1 de rata inducidos por v-srk, v-src, y v-ras (Liu et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 250-259) y de fibroblastos de rata-1 inducidos por bcr-abl (LaMontagne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1998, 95, 14.094-14.099). También se ha demostrado que PTP1B
25 promueve la diferenciación de células K562, una línea celular de leucemia mielógena crónica, de manera similar como lo hace un inhibidor de la bcr-abl oncogénica. Estos estudios describen el posible papel de PTP1B en el control de la patogénesis de la leucemia mieloide crónica (LaMontagne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1998, 95, 14.094-14.099).
30 En consecuencia, en el presente documento se divulgan métodos para mejorar un síntoma asociado con trastornos hiperproliferativos en un sujeto en necesidad del mismo. En ciertas realizaciones, el trastorno hiperproliferativo es cáncer. En ciertas realizaciones, descritos en este documento son procedimientos para mejorar un síntoma asociado con el cáncer. En ciertas realizaciones, se describe un método para reducir la tasa de aparición de un síntoma asociado con trastornos hiperproliferativos. En ciertas realizaciones, se describe un método para
35 reducir la tasa de aparición de un síntoma asociado con el cáncer. En ciertas realizaciones, se describe un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con trastornos hiperproliferativos. En ciertas realizaciones, se describe un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con el cáncer. En tales realizaciones, los métodos comprenden administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dirigido a un ácido nucleico de PTP1B.
40 En ciertas realizaciones, se describen métodos para tratar a un individuo que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe aquí. En ciertas realizaciones, el individuo tiene la enfermedad relacionada con el metabolismo.
45 En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un resultado de ácido nucleico de PTP1B en la reducción de la expresión de PTP1B en al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o de un rango definido por dos de estos valores.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido 50 dirigidos a transtiretina se utilizan para la preparación de un medicamento para tratar un paciente que sufre o es susceptible de enfermedad relacionada con el metabolismo.
En ciertas realizaciones, los métodos descritos en este documento incluyen la administración de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobases contiguas tal como 55 se describe en el presente documento de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 26 (ISIS 404173).
Administración
En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones como se describe en el presente documento se
60 pueden administrar en un número de maneras, dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser tópica, pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. Los compuestos y composiciones como se describe en el presente documento se pueden administrar directamente a un tejido u órgano.
En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones que se describen en el presente documento se administran parenteralmente. "Administración parenteral" se refiere a la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye la administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal, o administración intracraneal, por ejemplo, administración intracerebral, administración intratecal, administración intraventricular, administración ventricular, la administración intracerebroventricular, administración intraventricular cerebral o la administración ventricular cerebral. La administración puede ser continua o crónica, o corta o intermitente.
En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por inyección. La inyección puede ser administrada con una jeringa o una bomba. En ciertas realizaciones, la inyección es una inyección en bolo. En ciertas realizaciones, la inyección se administra directamente a un tejido u órgano.
En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones que se describen en el presente documento se administran parenteralmente.
En ciertas realizaciones, la administración parenteral es subcutánea.
En realizaciones adicionales, la formulación para la administración es los compuestos descritos en el presente documento y solución salina.
En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido se administra por inyección o infusión una vez cada mes, cada dos meses, cada 90 días, cada 3 meses, cada 6 meses, dos veces al año o una vez al año.
Ciertas terapias de combinación
En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran conjuntamente con uno o más de otros agentes farmacéuticos. En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno, o condición como las una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar una enfermedad diferente, trastorno o condición como las una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, dichos uno o más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas como se describe aquí. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas son coadministradas con otro agente farmacéutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinatorio. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.
En ciertas realizaciones, un primer agente y uno o más segundos agentes se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se administran en momentos diferentes. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan juntos en una única formulación farmacéutica. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan por separado.
En ciertas realizaciones, el segundo compuesto se administra antes de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto se administra después de administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto se administra al mismo tiempo como una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo compuesto coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el segundo compuesto se administra solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo compuesto coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el segundo compuesto se administra solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo compuesto coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el segundo compuesto se administra solo.
En ciertas realizaciones, la co-administración de un segundo compuesto potencia el efecto de un primer compuesto, tal que la co-administración de los compuestos resulta en un efecto que es mayor que el efecto de la administración del primer compuesto solo. En ciertas realizaciones, la co-administración se traduce en efectos que son aditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, la coadministración se traduce en efectos que son supraaditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, el primer compuesto es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto es un compuesto antisentido.
En ciertas realizaciones, el segundos agentes incluyen, pero no se limitan a, un agente reductor de la glucosa. El agente de reducción de la glucosa puede incluir, pero no se limita a, un cambio de estilo de vida terapéutico, agonista de PPAR, un inhibidor de peptidasa de dipeptidilo (IV), un análogo de GLP-1 analógica,
insulina o un análogo de insulina, un secretagogo de insulina, un inhibidor de SGLT2, un análogo de la amilina humana, una biguanida, un inhibidor de la alfa-glucosidasa, o una combinación de los mismos. El agente reductor de la glucosa puede incluir, pero no se limita a la metformina, sulfonilourea, rosiglitazona, meglitinida, tiazolidindiona, inhibidor de la alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. La sulfonilourea puede ser acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, glipizida, gliburida, o gliclazida. La meglitinida puede ser nateglinida o repaglinida. La tiazolidinediona puede ser pioglitazona o rosiglitazona. La alfa-glucosidasa puede ser acarbosa o miglitol.
En algunas realizaciones, la terapéutica hipoglucemiante es un análogo de GLP-1. En algunas realizaciones, el GLP-1 analógica es la exendina-4 o liraglutida.
En otras realizaciones, la terapéutica hipoglucemiante es una sulfonilourea. En algunas realizaciones, el sulfonilurea es acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, glipizida, gliburida, o gliclazida.
En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es una biguanida. En algunas realizaciones, la biguanida es metformina, y en algunas realizaciones, los niveles de glucosa en sangre se reducen sin aumento de la acidosis láctica en comparación con la acidosis láctica observada después del tratamiento con metformina sola.
En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es una meglitinida. En algunas formas de realización, la meglitinida es nateglinida o repaglinida.
En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es una tiazolidindiona. En algunas realizaciones, la tiazolidinediona es pioglitazona, rosiglitazona, o troglitazona. En algunas realizaciones, los niveles de glucosa en sangre se reducen sin mayor ganancia de peso que la observada con el tratamiento con rosiglitazona sola.
En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es un inhibidor de la alfa-glucosidasa. En algunas realizaciones, el inhibidor de alfa-glucosidasa es la acarbosa o el miglitol.
En una cierta realización, un agente hipoglucemiante coadministrado es ISIS 113715.
En una cierta realización, la terapia hipoglucemiante es cambio de estilo de vida terapéutico.
En ciertas realizaciones, los segundos agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes reductores de lípidos. El agente de disminución de lípidos puede incluir, pero no se limita a la atorvastatina, simvastatina, rosuvastatina, y ezetimiba. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra antes de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra después de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra al mismo tiempo como una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administra solo. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante que se coadministra es mayor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la reductasa de HMG-CoA. En ciertas de dichas realizaciones, el inhibidor de la reductasa de la reductasa de HMG-CoA es una estatina. En ciertas de dichas realizaciones, la estatina se selecciona de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina y rosuvastatina.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de dichas realizaciones, el inhibidor de la absorción de colesterol es ezetimibe.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de reductasa de HMG-CoA co-formulado e inhibidor de absorción de colesterol. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante co-formulado es ezetimiba/simvastatina.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de proteína de transferencia de triglicérido microsomal (inhibidor de MTP).
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un oligonucleótido dirigido a ApoB.
En ciertas realizaciones, los segundos agentes incluyen, pero no se limitan a un fármaco o agente antiobesidad. Tales agentes anti-obesidad incluyen, pero no se limitan a Orlistat, Sibutramina, Rimonabant o, y se pueden administrar como se ha descrito anteriormente como agentes de tejido adiposo o el peso corporal de descenso. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido puede ser coadministrado con supresores del apetito.
Tales inhibidores del apetito incluyen, pero no se limitan a tenuato de dietilpropión, mazindol, orlistat, fendimetrazina, fentermina, y sibutramina y se pueden administrar como se describe en el presente documento. En cierta realización, los agentes anti-obesidad se basan en CNS tales como, pero no limitados a, sibutramina o a base de GLP-1 tales como, pero no limitados a, liraglutida.
Formulaciones
Los compuestos proporcionados en este documento también se pueden mezclar, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas de receptores de orientación, u otras formulaciones, para ayudar en la absorción, distribución y/o absorción. Patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de tales captación, distribución y/o formulaciones de ayuda a la absorción incluyen, pero no se limitan a, US: 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.
Los compuestos de antisentido proporcionados en el presente documento abarcan cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos proporcionados en el presente documento: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo. El término "sal farmacéuticamente aceptable" incluye una sal preparada a partir de ácidos o bases no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Para oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos
6.287.860. Las sales de sodio se han demostrado para ser formas adecuadas de fármacos de oligonucleótidos.
El término "derivado farmacéuticamente aceptable" abarca, pero no se limita a, sales farmacéuticamente inaceptables, solvatos, hidratos, ésteres, profármacos, polimorfos, isómeros, variantes marcadas isotópicamente de los compuestos descritos en la presente memoria.
La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los compuestos de antisentido proporcionados en este documento. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en un número de maneras, dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser parenteral. La administración parenteral incluye la administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o inyección intramuscular o infusión; o intracraneal, por ejemplo, administración intracerebral, administración intratecal, administración intraventricular, administración ventricular, administración intracerebroventricular, administración intraventricular cerebral o administración ventricular cerebral.
La administración parenteral, se prefiere para dirigirse a la expresión de PTP1B en el hígado y plasma. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para administración oral. Composiciones farmaceúticas y formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Condones recubiertos, guantes y similares también pueden ser útiles.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los ingredientes activos con el vehículo farmacéutico o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo uniforme e íntimamente en asociación los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero no limitadas a, tabletas, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilocelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones farmacéuticas y formulaciones
de la presente invención pueden comprender uno o más de potenciadores de penetración, vehículos, excipientes u otros ingredientes activos o inactivos.
Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas por lo general superiores a 0,1 mm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas y el fármaco activo que puede estar presente como una solución en la fase acuosa, la fase aceitosa o como una fase separada. Las microemulsiones se incluyen como una realización de la presente invención. Emulsiones y sus usos son bien conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos 6.287.860.
Las formulaciones de la presente invención incluyen formulaciones liposomales. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa esférica o bicapas. Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición a ser administracióndo. Los liposomas catiónicos son liposomas que se cree que interactúan con las moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable con carga positiva. Los liposomas que son sensibles al pH o negativamente cargados se cree que atrapan el ADN en lugar de formarse un complejo con él. Ambos liposomas catiónicos y no catiónicos se han utilizado para suministrar ADN a las células.
Los liposomas también incluyen liposomas "estabilizados estéricamente", un término que, como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, dan lugar a tiempos de vida de circulación mejorada en relación con liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos 6.287.860.
En otra realización, las formulaciones de la presente invención incluyen formulaciones de solución salina. En ciertas formas de realización, una formulación consiste de los compuestos descritos en el presente documento y solución salina. En ciertas realizaciones, una formulación consiste esencialmente de los compuestos descritos en el presente documento y solución salina. En ciertas realizaciones, la solución salina es una solución salina de grado farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la solución salina es una solución salina tamponada. En ciertas realizaciones, la solución salina es una solución salina tamponada de fosfato (PBS).
En ciertas realizaciones, una formulación excluye liposomas. En ciertas realizaciones, la formulación excluye liposomas estabilizados estéricamente. En ciertas realizaciones, una formulación excluye fosfolípidos. En ciertas realizaciones, la formulación consiste esencialmente de los compuestos descritos en el presente documento y solución salina y excluye liposomas.
Las formulaciones farmacéuticas y composiciones de la presente invención también pueden incluir tensioactivos. Tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos 6.287.860.
En una realización, la presente invención emplea varios potenciadores de la penetración para afectar a la prestación eficiente de los ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Potenciadores de la penetración y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. 6.287.860.
Un experto en la técnica reconocerá que las formulaciones están diseñadas de forma rutinaria de acuerdo con su uso previsto, es decir, la vía de administración.
Las formulaciones para administración tópica incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos proporcionados en este documento están mezclados con un agente de administración tópica como por ejemplo lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lípidos y liposomas preferidos incluyen neutro (por ejemplo, etanolamina de DOPE de dioleoilfosfatidilo, DMPC de colina de dimiristoílofosfatidilo, colina de distearolifosfatidilo) negativo (por ejemplo, DMPG de glicerol de dimiristoílofosfatidil) y catiónico (por ejemplo, DOTAP de dioleoiltetrametiloaminopropilo y DOTMA de etanolamina de dioleoilfosfatidilo).
Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, incluyendo intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, la inyección intramuscular intraarterial o infusión, o intracraneal pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no limitado a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Ciertas realizaciones proporcionadas en este documento proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más compuestos oligoméricos y uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a los fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, arabinósido de citosina, biscloroetilnitrosourea, busulfán, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona,
testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilomelamina, pentametilomelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilociclohexilnitrosurea, mostazas nitrogenadas, melfalán, ciclofosfamida, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se utiliza con los compuestos proporcionados en la presente memoria, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o más de otros agentes tales quimioterapéuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, la radioterapia y de oligonucleótidos). Los fármacos anti-inflamatorios, incluyendo pero no limitado a los fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivirales, incluyendo, pero no limitado a, ribavirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en composiciones proporcionadas en este documento. Las combinaciones de los compuestos de antisentido y otros fármacos no antisentido están también dentro del alcance de esta invención. Dos o más compuestos combinados pueden utilizarse juntos o secuencialmente.
En otra realización relacionada, las composiciones proporcionadas en este documento pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos de antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. Alternativamente, las composiciones proporcionadas en este documento pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo ácido nucleico diana. Numerosos ejemplos de compuestos de antisentido se conocen en la técnica. Dos o más compuestos combinados pueden utilizarse juntos o secuencialmente.
Dosificación
Se cree que la formulación de composiciones terapéuticas y su posterior administración (dosificación) está dentro de la experiencia de aquellos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y capacidad de respuesta del estado de enfermedad a tratar, con el curso del tratamiento que dura de varios días a varios meses, o hasta que una cura se efectúa o se logra una disminución del estado de enfermedad. Los programas de dosificación óptimos pueden calcularse a partir de mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales, y generalmente se pueden estimar sobre la base de EC50 que se ha encontrado para ser eficaz en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosis es de 0,01 mg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una o más veces diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o a intervalos deseados. Tras un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de enfermedad, donde el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que van desde 0,01 mg a 100 g por kg de peso corporal, una vez o más al día.
Aunque la presente invención ha sido descrita con especificidad de acuerdo con algunas de sus realizaciones preferidas, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar la invención y no están destinados a limitar la misma.
Ciertos compuestos
Aproximadamente doscientos setenta y seis compuestos de antisentido de nuevo diseño de varias longitudes, motivos y composición de espina dorsal se ensayaron para determinar su efecto sobre el ARNm de PTP1B humano in vitro en varios tipos de células. Los nuevos compuestos se compararon con unos quinientos compuestos diseñados previamente incluyendo ISIS 107772, ISIS 107831, ISIS 142025, ISIS 142026, ISIS 142027, ISIS 142028, ISIS 142082, ISIS 146908, e ISIS 146909, que han sido previamente determinados como parte de los compuestos más potentes antisentido in vitro (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº de publicación de EE.UU. 2003/0220282 publicado 27.11.2003 y la publicación de patente PCT Nº WO2007/131237 publicado 11/15/2007). De los aproximadamente doscientos ochenta cinco compuestos de antisentido recién diseñados y diseñados previamente, aproximadamente once compuestos se seleccionaron para estudio adicional basado en la potencia in vitro. Los compuestos seleccionados se ensayaron para la inhibición dependiente de la dosis en HUVEC, HepG2, HUVEC, LLC-MK2, y hepatocitos primarios cynomolgus. Oligonucleótidos adicionales se diseñaron basándose en microwalk de ISIS 409826, uno de los compuestos seleccionados que mostraron una reducción significativa de PTP1B mARN en todas las líneas celulares ensayadas. Los oligonucleótidos se probaron en células HUVEC (Ejemplo 5), junto con gápmeros de la pantalla anterior (Ejemplo 1). Se seleccionaron varios oligonucleótidos antisentido de la pantalla en el Ejemplo 5 y se ensayaron para la inhibición dependiente de la dosis en células HUVEC (Ejemplo 6) y las células HepG2 (Ejemplo 7). Además, dos oligonucleótidos fueron diseñados como shortmeros a ISIS 1.428.082, uno de los compuestos seleccionados. Estos dos shortmeros (ISIS 446431 e ISIS 446432), así como cinco oligonucleótidos ISIS seleccionados del estudio descrito en los Ejemplos 6 y 7 se probaron en células HepG2, células LLC-MK2, células HUVEC, y hepatocitos primarios cynomolgus (Ejemplos 8-11). oligonucleótidos ISIS que demostraron la reducción dependiente de la dosis de PTP1B mARN en todas las líneas celulares se ensayaron para determinar la tolerabilidad in vivo. Dos oligonucleótidos más ISIS 446433 e ISIS 446434, diseñados como shortmeros para ISIS 409826, se incluyeron en los estudios de tolerancia in vivo también.
Los doce gápmeros elegidos fueron probados en un modelo de ratón (véase el Ejemplo 12) y un modelo de rata (Ejemplo 13). En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 3291 a 3310, 989 a 1008, 3290 a 3309, 3.287 a 3.306, 3291 a 3310, 3288 a 3307, 3292 a 3309, 3293 a 3308, 3288 a 3305, y 3289-3304 de SEQ ID NO: 1. En los modelos in vivo, se midieron los pesos corporales y pesos de los órganos, los marcadores metabólicos del hígado, tales como transaminasa de alanina, transaminasa de aspartato y bilirrubina, marcadores metabólicos del riñón, tales como BUN y creatinina, niveles de glucosa en plasma, niveles de colesterol y triglicéridos, y niveles de citoquinas inflamatorias. De los doce compuestos ensayados, cinco compuestos, ISIS 142082, ISIS 404173, ISIS 410003, ISIS 446431, ISIS 446432 fueron seleccionados y se midió su viscosidad (Ejemplo 14). Todos los cinco oligonucleótidos se consideran óptimos en su viscosidad de acuerdo con los criterios establecidos para el estudio.
La evaluación final de estos estudios (Ejemplos 12-14) condujo a la selección de cuatro compuestos que tienen una secuencia de nucleobases de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 27 (ISIS 142082), 46 (ISIS 446431), 26 (ISIS 404173), y 23 (ISIS 409826). En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios a las regiones 3291 a 3310, 3292 a 3309, 3290 a 3309, 3287 a 3306 de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas, como se describe adicionalmente en el presente documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene una parte de nucleobasa de la secuencia indicada en la SEQ ID NOs, como se describe adicionalmente en este documento. En ciertas realizaciones, los compuestos que se dirigen a las regiones enumeradas o que tienen una porción de nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas pueden ser de diversas longitudes, como se describe adicionalmente en este documento, y pueden tener uno de varios motivos, como se describe adicionalmente en este documento. En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido a una región o que tiene una parte nucleobasa de una secuencia indicada en las SEQ ID NOs enumeradas tiene la longitud y el motivo específico, como se indica por ISIS NOs: ISIS 142082, ISIS 446431, ISIS 404173, e ISIS 409826.
Tres compuestos que tienen una secuencia de nucleobases de una secuencia indicada en SEQ ID NO: 27 (ISIS 142082), 23 (ISIS 404173), y 46 (ISIS 446431), se ensayaron adicionalmente en un largo plazo, estudio de tolerabilidad de seis meses en un modelo de ratón (véase el Ejemplo 15). La vida media en el hígado de ratones CD1 de los cuatro de los compuestos que tienen una secuencia de nucleobasa de una secuencia indicada en SEQ ID NOs: 53 (ISIS 409826), 27 (ISIS 142082), 26 (ISIS 404173), y 46 (ISIS 446431) también se evaluó (Ejemplo 16).
Estos cuatro compuestos se ensayaron para la eficacia, perfil farmacocinético y la tolerabilidad en monos cynomolgus (Ejemplo 17). Los estudios de inhibición en estos monos indican que el tratamiento con algunos de estos compuestos causó una reducción de PTP1B mARN en el hígado y tejidos de grasa. Específicamente, el tratamiento con ISIS 409826, ISIS 142082, ISIS 446431 e ISIS 404173 causó una reducción de 45%, 48%, 18 y 22% de PTP1B ARNm en el tejido hepático, respectivamente comparado con el control PBS. El tratamiento con ISIS 409826, ISIS 142082, ISIS 446431 e ISIS 404173 causó una reducción de 21%, 28%, 12% y 31% de PTP1B ARNm en el tejido graso, respectivamente comparado con el control PBS. Se observó que ISIS 404173 causó una reducción similar de PTP1B mARN en comparación con ISIS 142082, a pesar de que los dos oligonucleótidos se diferencian entre sí por un solo cambio de pares de bases de su región de destino en el SEQ ID NO: 1. Un análisis de proteínas de tejido hepático también se llevó a cabo por análisis de transferencia Western. La reducción de ARNm de PTP1B usando ISIS 409826, ISIS 142082, ISIS 446431 e ISIS 404173 se midió a una dosis máxima de 40 mgk/semana para la eficacia y a una dosis menor de 8mgk/semana para la potencia (véase tabla 45). El análisis de proteínas en una dosis menor de 8 mgk/semana demostró que ISIS 404173 causó una mayor reducción (33%) de proteína PTP1B que ISIS 142082 (20%) que demuestra que ISIS 404173 era más potente que ISIS 142082 (véase Tabla 47 y Figura 1). El análisis de proteínas en la dosis más alta de 40 mg/semana demostró que ISIS 404173 (reducción de 60% de proteína) fue tan eficaz como ISIS 142082 (65% de reducción de la proteína). Por último, el tratamiento con ISIS 409826 e ISIS 142082 resultó en niveles de PCR al 22% a 4,8 mg/L y 6,7 mg/L. Por lo tanto, ISIS 404173 causó el menor incremento en los niveles de PCR que indica que ISIS 404173 es extremadamente tolerable y no proinflamatorio. Los pesos de los órganos también se midieron para evaluar la tolerabilidad de oligonucleótidos ISIS por los monos. El tratamiento con ISIS 142082 a una dosis de 40 mg/L causó aumentos en pesos de riñón e hígado de 21 g y 18 g, respectivamente, que es un aumento de dos veces por encima del control (riñón 10 g y el hígado 10,5 g). El tratamiento con ISIS 409826 causó un aumento de dos veces en el peso del hígado (18,5 g vs. 10,5 g de control) y un incremento de tres veces en el peso del bazo (6,0 g vs. 2,3 g de control). El tratamiento con ISIS 446431 causó un aumento de cuatro veces en el peso del bazo (9,6 g vs. 2,3 g control). El tratamiento con ISIS 404173 causó un aumento de menos de una vez en todos los órganos (14,8 g riñón; hígado 15,5 g; bazo 3,7 g) Véase (Figura 2). Por lo tanto, el tratamiento con ISIS 142082, ISIS 409826 y ISIS 446431 no se consideraron tolerables en los monos, mientras que el tratamiento con ISIS 404173 era tolerable.
El tratamiento con ISIS 142082 causó aumento de peso de los órganos y niveles elevados de PCR, lo que indica un estado inflamatorio. El tratamiento con ISIS 409826 también causó niveles elevados de PCR y niveles de C3 de bajo complemento, lo que indica un estado de enfermedad. El tratamiento con ISIS 404173 e ISIS 446431 se considera óptimo en términos de sus perfiles de tolerabilidad en macacos de Java. Sin embargo, ISIS 446431 demostró menos potencia en comparación con ISIS 404173.
En el caso de los estudios de perfil farmacocinético de los oligonucleótidos en el hígado y el riñón, ninguno de los oligonucleótidos ISIS demostró proporciones anormales en la concentración en el hígado en comparación con el riñón. ISIS 404173 era un mejor acumulador renal en comparación con ISIS 142082, como se indica en los resultados.
Por lo tanto, los estudios in vivo, en particular en los monos cynomolgus, indican que ISIS 404173 era tan potente y considerablemente más tolerable en comparación con los otros compuestos. Los estudios demuestran que ISIS 142082, aunque desplazado de ISIS 407173 por sólo una nucleobase, era tan eficaz pero menos potente y tolerable que ISIS 404173, como se demuestra por los ensayos para marcadores metabólicos e inflamatorios. En general, ISIS 404173 era más potente y tolerable en comparación con cualquier otro compuesto.
Por consiguiente, se proporcionan en la presente memoria compuestos de antisentido con una cualquiera o más de las características mejoradas. En ciertas formas de realización, se describe en el presente documento compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado tal como se describe adicionalmente en este documento dirigido a o que se hibridan específicamente con la región de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
En consecuencia, en el presente documento se divulgan compuestos de antisentido con una cualquiera o más de las características mejoradas. En ciertas realizaciones, descritas en este documento están compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado tal como se describe adicionalmente en este documento dirigido a o que hibrida específicamente con la región de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento son eficaces en virtud de tener al menos uno de un CI50 in vitro de menos de 0,4 µM, menos de 0,35 µM, menos de 0,3 µM, menos de 2,5 µM, menos de 2,0 µM, menos de 1,5 µM, menos de 1,0 µM, cuando se administran a una línea celular de mono cynomolgus de hepatocitos mediante electroporación como se describe en Ejemplo 11. En ciertas realizaciones, los compuestos como se describe aquí son altamente tolerables, como se demuestra por tener al menos uno de un aumento de valor de ALT o AST de no más de 4 veces, 3 veces, o 2 veces sobre los animales tratados con solución salina; o un aumento en el hígado, el bazo o el peso del riñón de no más de 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% o 2%.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Inhibición antisentido del ARNm de PTP1B humano en células HUVEC
Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PTP1B humano fueron diseñados y examinados por su efecto sobre la transcripción ARN PTP1B in vitro. ISIS 107772, ISIS 107831, ISIS 142025, ISIS 142026, ISIS 142027, ISIS 142028, ISIS 142082, ISIS 146908, e ISIS 146909, reivindicada en una patente anterior (BIOL001USP2) fueron incluidos en este ensayo para la comparación. Las células HUVEC se cultivaron a una densidad de 5.000 células por pocillo se transfectaron usando LipofectAMINE 2000® con 2 nM de oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. los niveles de PTP1B de ARNm se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RiboGreen®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de los niveles de PTP1B de ARNm, en relación con células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido de la Tabla 1 son 5-10-5 gápmeros MOE o 2-13-5 gápmeros MOE. Los 510-5 gápmeros MOE tienen un segmento de hueco que comprende diez 2'-deoxinucleósidos y segmento de dos alas que comprende cinco nucleósidos de 2'-MOE. Los 2-13-5 gápmeros MOE tienen un segmento de hueco que comprende trece 2'-deoxinucleósidos, un segmento de ala 5' que comprende dos nucleósidos de 2'-MOE y un segmento de ala 3' que comprende tres nucleósidos de 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido largo de cada gápmero son enlaces de fosforotioato (P =S). Todos los residuos de citosina a través de cada gápmero son 5metilocitosinas. 'Sitio de inicio de diana' indica el extremo nucleótido más 5' al que el oligonucleótido antisentido está dirigido en la secuencia del gen humano. 'Sitio de parada de diana' indica el nucleótido más 3’ al que el oligonucleótido antisentido está dirigido en la secuencia del gen humano. Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 1 se dirigen, ya sea a la secuencia de ARNm, designadaa aquí como SEQ ID NO: 1 (Nº de Acceso GenBank NM_002827.2) o a la secuencia genómica, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (Nº de acceso de NT_011362.9 truncado de los nucleótidos 14178000 a 14256000), o a ambas.
Algunos de los oligonucleótidos humanos de la Tabla 1 son también totalmente de reacción cruzada con las secuencias de gen de mono rhesus. 'n/a' indica que había más de 3 apareamientos erróneos de bases entre el oligonucleótido humano y la secuencia del gen de mono rhesus. Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia de mono rhesus, más probable el oligonucleótido humano puede reaccionar de forma cruzada con la secuencia de mono rhesus. Los oligonucleótidos humanos en la Tabla 1 se compararon con la SEQ ID NO: 3 (exones 1-9, intrón 9 y exón 10 del andamio PTP1B de mono rhesus). "Sitio de inicio de diana de mono rhesus" indica el extremo más 5' de nucleótidos al que el gápmero está dirigido en la secuencia del gen de mono rhesus. "Sitio de parada de diana de mono rhesus" indica el nucleótido más 3’ al que el gápmero está dirigido secuencia del gen de mono rhesus.
Tabla 1
La inhibición de la transcripción de ARN PTP1B humano en células HUVEC mediante oligonucleótidos antisentido dirigidos a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3
ISIS No
Secuencia Motivo % de inhibici ón Sitio de inicio en SEQ ID NO: 1 Sitio de inicio en SEQ ID NO: 2 Sitio de inicio en SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO
142025
TTGTCGATCTGCTCGAACTC 5-10-5 43 190 1989 197 4
142026
GACTTGTCGATCTGCTCGAA 5-10-5 59 193 1992 989 5
107772
CCCGGACTTGTCGATCTGCT 5-10-5 66 197 1996 3754 6
142027
GCTCCCGGACTTGTCGATCT 5-10-5 55 200 1999 3759 7
142028
CCAGCTCCCGGACTTGTCGA 5-10-5 60 203 2002 4498 8
373125
GGCACCTTCGATCACAGCCA 5-10-5 55 989 70726 4487 9
113715
GCTCCTTCCACTGATCCTGC 5-10-5 50 1035 n/a 4500 10
107831
GGTCATGCACAGGCAGGTTG 5-10-5 70 2360 75039 3753 11
409988
AGGTCATGCACAGGCAGGTT 2-13-5 83 2361 75040 3759 12
409821
GATCAGGTCATGCACAGGCA 5-10-5 86 2365 75044 3575 13
404176
TGATCAGGTCATGCACAGGC 5-10-5 87 2366 75045 4493 14
146908
ACCCTTGGAATGTCTGAGTT 5-10-5 56 2544 75223 3746 15
404169
CCCATACCCTTGGAATGTCT 5-10-5 77 2549 75228 3756 16
409815
TCCCATACCCTTGGAATGTC 5-10-5 72 2550 75229 3566 17
146909
TTCCCATACCCTTGGAATGT 5-10-5 43 2551 75230 3569 18
409845
TATTCCATGGCCATTGTAAA 5-10-5 23 3283 75962 4485 19
410030
TTATTCCATGGCCATTGTAA 2-13-5 24 3284 75963 4486 20
409825
TTTATTCCATGGCCATTGTA 5-10-5 34 3285 75964 192 21
409883
GTTTATTCCATGGCCATTGT 3-14-3 36 3286 75965 198 22
409999
GGTTTATTCCATGGCCATTG 2-13-5 54 3287 75966 190 23
409826
GGTTTATTCCATGGCCATTG 5-10-5 73 3287 75966 201 23
410000
TGGTTTATTCCATGGCCATT 2-13-5 55 3288 75967 194 24
404172
TGGTTTATTCCATGGCCATT 5-10-5 61 3288 75967 192 24
410001
ATGGTTTATTCCATGGCCAT 2-13-5 51 3289 75968 198 25
409827
ATGGTTTATTCCATGGCCAT 5-10-5 44 3289 75968 195 25
410002
AATGGTTTATTCCATGGCCA 2-13-5 0 3290 75969 204 26
404173
AATGGTTTATTCCATGGCCA 5-10-5 48 3290 75969 201 26
410003
AAATGGTTTATTCCATGGCC 2-13-5 64 3291 75970 193 27
142082
AAATGGTTTATTCCATGGCC 5-10-5 52 3291 75970 190 27
410004
AAAATGGTTTATTCCATGGC 2-13-5 46 3292 75971 196 28
409828
AAAATGGTTTATTCCATGGC 5-10-5 44 3292 75971 194 28
409829
AAAAATGGTTTATTCCATGG 5-10-5 36 3293 75972 198 29
404161
GGTCATTTCCATGGCCAGAG 2-13-5 78 n/a 73855 3746 31
409975
GGAGGTCATTTCCATGGCCA 2-13-5 85 n/a 73858 n/a 32
409976
AGGAGGTCATTTCCATGGCC 2-13-5 85 n/A 73859 2379 30
Ejemplo 2: Inhibición antisentido dependiente de dosis del ARNm de PTP1B humano en células HUVEC
Varios oligonucleótidos antisentido, que mostraron la inhibición antisentido significativa de PTP1B mARN en 55 el estudio descrito en el Ejemplo 1 se ensayaron adicionalmente en células HUVEC en diversas dosis. Las células se sembraron a una densidad de 5.000 células por pocillo y se transfectaron usando LipofectAMINE 2000® con 0,9375 nM, 1,875 nM, 3,75 nM, 7,5 nM, 15 nM, y 30 concentraciones nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de transcripción de ARNm de PTP1B se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sonda de cebadores RTS3000 60 (secuencia hacia delante CTGGTTTAACCTCCTATCCTTGGA, designada aquí como SEQ ID NO: 33; secuencia inversa CAGAGCAGCTCGCTACCTCTCT, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 34, secuencia de la sonda CAGCTGGCTCTCCACCTTGTTACACATTATGT, designada aquí como SEQ ID NO: 35). los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 2 como porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar. 65
Tabla 2
Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B humano en células HUVEC
ISIS No
0,9375 nM 1,875 nM 3,75 nM 7,5 nM 15,0 nM 30,0 nM CI50(nM)
113715
0 0 2 11 23 33 > 30
404161
1 0 7 29 42 57 17
404169
0 6 17 37 57 72 7
404176
0 0 20 38 68 79 6
409815
0 0 7 30 48 65 12
409821
0 1 17 41 68 82 5
409826
0 0 10 30 47 64 12
409975
0 0 23 50 74 86 4
409976
0 0 21 46 65 82 5
409988
0 0 23 49 70 83 5
410003
0 0 4 16 28 46 > 30
Ejemplo 3: inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B mARN en células LLC-MK2
Los oligonucleótidos antisentido del estudio descrito en el Ejemplo 2 también son de reacción cruzada con el secuencia del gen de mono rhesus (SEQ ID NO: 3) y se ensayaron adicionalmente en células LLC-MK2 de mono 25 rhesus a diversas dosis. Las células se sembraron a una densidad de 3.000 células por pocillo y se transfectaron usando Lipofectina con 3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, y 100 nM concentraciones de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores de sonda RTS198 (secuencia delantera GGAGTTCGAGCAGATCGACAA, designada aquí como SEQ ID NO: 36; secuencia 30 inversa GGCCACTCTACATGGGAAGTC, designada aquí como SEQ ID NO: 37, secuencia de sonda AGCTGGGCGGCCATTTACCAGGAT, designada aquí como SEQ ID NO: 38). Los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 3 como porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar. Los sitios de inicio y parada de cada oligonucleótido en mono rhesus SEQ ID NO: 3 (la concatenación de los exones 1-9, intrón 9 y exón 10 del
35 andamio PTP1B rhesus (andamio de gen 240) se presentan en la Tabla 4.
Tabla 3
inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B mARN en células LLC-MK2
ISIS No
3,125 nM 6,25 nM 12,5 nM 25,0 nM 50,0 nM 100,0 nM CI50 (nM)
113715
9 18 18 42 71 88 12
404161
18 26 37 49 67 79 9
404169
9 33 36 52 70 85 8
404176
4 21 28 52 73 85 10
409815
19 27 32 51 67 83 9
409821
4 20 37 53 74 85 9
409826
7 31 63 46 62 78 8
409975
13 20 28 43 62 74 15
409976
12 20 37 42 65 77 12
409988
3 20 39 56 73 86 8
410003
16 24 36 43 65 80 11
Tabla 4
Sitios diana de oligonucleótidos antisentido dirigidos a PTP1B en la secuencia del gen de mono rhesus (SEQ ID NO: 3)
ISIS No
Sitio de inicio Sitio de parada
113715
1035 1054
404161
2385 2404
409975
2388 2407
409976
2389 2408
409988
3566 3585
409821
3570 3589
404176
3571 3590
404169
3754 3773
409815
3755 3774
409826
4491 4510
410003
4495 4514
Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B mARN en hepatocitos primarios cynomolgus
Algunos de los oligonucleótidos antisentido del estudio descrito en los Ejemplos 1, 2 y 3 se ensayaron adicionalmente en hepatocitos primarios cynomolgus a diversas dosis. Las células se sembraron a una densidad de
35.000 células por pocillo y se transfectaron usando Lipofectina con 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, y 200 nM concentraciones de cada antisentido oligonucleótido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de
25 las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores de sonda RTS198. los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 5 como porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar.
Tabla 5
Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B mARN en hepatocitos primarios cynomolgus
ISIS No
6,25 nM 12,5 nM 25,0 nM 50,0 nM 100,0 nM 200,0 nM CI50 (nM)
373125
16 4 13 32 48 67 104
404161
7 3 24 40 56 77 72
404169
0 13 27 44 57 77 67
404176
16 17 27 42 64 76 59
409815
0 24 26 40 57 75 69
409821
0 9 25 37 60 73 73
409826
8 28 10 37 56 71 82
409975
13 19 29 38 57 75 67
409976
2 18 13 35 60 80 70
409988
16 22 28 41 59 77 61
410003
17 10 37 46 60 78 56
Ejemplo 5: Inhibición antisentido del ARNm de PTP1B humano en células HUVEC mediante oligonucleótidos diseñados por microwalk
Gápmeros adicionales fueron diseñados sobre la base de ISIS 409826 que demostró una inhibición significativa de PTP1B en todas las líneas celulares ensayadas. Estos gápmeros fueron diseñados mediante la 55 creación de gápmeros que se desplazan ligeramente aguas arriba y aguas abajo (es decir, "microwalk") de ISIS 409826. Los oligonucleótidos también se crearon con diversos motivos, por ejemplo, motivos 5-10-5 MOE, 5-8-5 MOE, 2-13-5 Moe, 6-8-6 MOE, o fueron oligonucleótidos uniformes con desoxi y unidades de MOE. Estos gápmeros se examinaron in vitro. Oligonucleótidos ISIS 142082, ISIS 113715, ISIS 373125, ISIS 404161, ISIS 404172, ISIS 404173, ISIS 404176, ISIS 409825, ISIS 409827, ISIS 409828, ISIS 409829, ISIS 409845, ISIS 409998, ISIS 409999, ISIS 410000, ISIS 410001, ISIS 410002, ISIS 410003, ISIS 410004, e ISIS 410030 (del Ejemplo 1), así como ISIS 399038, ISIS 404159, ISIS 404174 y, a partir de una solicitud anterior (CORE0061WO15), también se incluyeron en el ensayo para la comparación. Las células HUVEC se cultivaron a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con 2,000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un
período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de cebador de sonda humano establecido RTS3000 se utilizó para medir los niveles de PTP1B de ARNm. los niveles de PTP1B de ARNm se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de
5 PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar. Los resultados se presentan en las Tablas 6 y 7.
Los 5-10-5 gápmeros MOE son de 20 nucleótidos de longitud, en los que el segmento central hueco está compuesto de diez 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden cinco nucleótidos cada una. Los 5-8-5 gápmeros MOE son 18 nucleótidos de longitud, en los que el
10 segmento central hueco se compone de ocho 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas de cinco nucleótidos que comprenden. Los 2-13-5 gápmeros MOE son de 20 nucleótidos de longitud, en los que el segmento central hueco se compone de trece 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en las direcciones 5' y 3' con las alas que comprenden dos y cinco nucleótidos respectivamente. Los 6-8-6 gápmeros MOE son 18 nucleótidos de longitud, en los que el segmento central hueco se compone de ocho 2'-deoxinucleótidos
15 está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3’) por alas que comprenden seis nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 5-8-5, 2-13-5 y 6-8-6), cada nucleótido en el extremo 5' del segmento del ala y cada nucleótido en el extremo 3' del segmento de ala tiene una modificación de 2'-MOE. Los oligonucleótidos uniformes tienen unidades de desoxi y Moe distribuidos a lo largo de la longitud del oligonucleótido. Los símbolos para las diversas químicas de unidades en las secuencias de oligonucleótidos uniformes son como sigue: 'd' = 2'
20 desoxirribosa; 'e' = 2'-O-metoxietilo ribosa. Los enlaces de internucleósido a lo largo de cada gápmero son enlaces de fosforotioato (P =S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gápmero son 5-metilocitidinas. "Sitio de inicio de destino" indica nucleótidos más 5’ de los que está dirigido el gápmero. "Sitio de parada de diana" indica el nucleótido más 3' al que está dirigido el gápmero. Cada gápmero enumerado en la Tabla 6 se dirige a SEQ ID NO: 1 (Nº de Acceso GenBank NM_002827.2). Todos los oligonucleótidos antisentido enumerados en la Tabla 7 objetivo
25 SEQ ID NO: 2 (Nº de acceso de NT_011362.9 truncadas de los nucleótidos 14178000 a 14256000).
Como se muestra en las Tablas 6 y 7, varios de los gápmeros exhibieron una inhibición de al menos el 50%, incluidos los números de ISIS: 113715, 142082, 373125, 399038, 404159, 404161, 404172, 404173, 404176, 409826, 409827, 409999, 410000, 410001, 410002, 410003, 410004, 438371, 438372, 438373, 438374, 438375,
30 438377, 438379, 438380, 438381, 438383, 438384, 438439, 438442, 438443, 438444, 438445, 438450, 438451, 438452, 438453, 438454, 438456, 438458, 438459, 438460, 438461, 438462, 438464, 438465, 438468, 438469, 438472, 438473, y 438474
Varios de los gápmeros exhibieron una inhibición de al menos 60%, incluidos los números de ISIS: 113715,
35 142082, 373125, 404161, 404172, 404173, 404176, 409826, 409827, 409999, 410000, 410001, 410002, 410003, 438373, 438380, 438381, 438382, 438442, 438444, 438445, 438450, 438451, 438452, 438453, 438459, 438460, 438 461, 438.462, 438.468, 438.469, 438.472, y 438474.
Varios de los gápmeros exhibieron inhibición de al menos 70%, incluyendo los números ISIS: 142082, 373125,
40 399038, 404172, 404173, 404176, 409826, 409827, 409999, 410000, 410001, 410002, 410003, 438373, 438374, 438451, 438452, 438453, 438460, 438461, 438462, 438468, 438469, 438472, y 438474.
Varios de los gápmeros exhibieron inhibición de al menos 80%, incluyendo los números ISIS: 142082, 404161, 404173, 409826, 410000, 410001, 410002, 410003, 438451, 438452, 438460, 438461, y 438474. 45 Varios de los gápmeros exhibieron una inhibición de al menos el 85%, incluidos los números de ISIS: 142082,404161, 404173, 409826, 410001, 410002, y 410003.
Varios de los gápmeros exhibieron inhibición de al menos 90%, incluyendo los números ISIS: 142.082, 50 404.161, y 409.826.
Tabla 6
Inhibición de los niveles de PTP1B de ARNm humano por los oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a la SEQ ID NO: 1
Sitio de inicio
Sitio de parad a ISIS No Secuencia Motivo % de inhibición SEQ ID NO
989
1008 373125 GGCACCTTCGATCACAGCCA 5-10-5 MOE 72 9
1035
1054 113715 GCTCCTTCCACTGATCCTGC 5-10-5 MOE 68 10
2366
2385 404176 TGATCAGGTCATGCACAGGC 5-10-5 MOE 89 14
3283
3302 409845 TATTCCATGGCCATTGTAAA 5-10-5 MOE 32 19
3284
3303 404174 TTATTCCATGGCCATTGTAA 5-10-5 MOE 47 20
328 4
330 3 4100 30 TTATTCCATGGCCATTGTAA 2-13-5 MOE 47 20
328 4
330 3 4383 77 TeTeAdTdTdCeCeAdTdGdGdCdCdAdTdTdGdT dAeAe Unidades desoxi y MOE 52 20
328 4
330 3 4384 39 TeTeAdTdTdCdCdAdTdGeGeCdCdAdTdTdGdTdTdAeAe Unidades desoxi y MOE 53 20
328 4
330 3 4384 48 TeTeAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTdTdGdTdAeAe Unidades desoxi y MOE 34 20
328 4
330 3 4384 57 TeTeAeTdTdCdCdAeTdGdGdTeCdCdAdTdTdGdTdAeAe Unidades desoxi y MOE 35 20
328 4
330 3 4384 66 TTATTCCATGGCCATTGTAA 6-8-6 MOE 25 20
328 5
330 4 4098 25 TTTATTCCATGGCCATTGTA 5-10-5 MOE 47 21
328 5
330 4 4099 98 TTTATTCCATGGCCATTGTA 2-13-5 MOE 49 21
328 5
330 2 4383 68 TATTCCATGGCCATTGTA 5-8-5 MOE 32 39
328 5
330 4 4383 78 TeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTdTdAe Ae Unidades desoxi y MOE 46 21
328 5
330 4 4384 40 TeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGeGdCdCdAdTdTdG dTdAe Unidades desoxi y MOE 30 21
328 5
330 4 4384 49 TeTeTdAdTdTeCeCdAdTdGdGdCdCdAdTdTdG eTdAe Unidades desoxi y MOE 43 21
328 5
330 4 4384 58 TeTeTdAdTdTdCdCeAeTdGdGdCdCdAdTdTdG eTdAe Unidades desoxi y MOE 53 21
328 5
330 4 4384 67 TTTATTCCATGGCCATTGTA 6-8-6 MOE 33 21
328 6
330 5 3990 38 GTTTATTCCATGGCCATTGT 5-10-5 MOE 74 22
328 6
330 5 4041 59 GTTTATTCCATGGCCATTGT 2-13-5 MOE 54 22
328 6
330 3 4383 69 TTATTCCATGGCCATTGT 5-8-5 MOE 33 40
328 6
330 5 4383 79 GeTdTdTdAdTeTeCdCdAdTreGdGdCdCdAdTdT dGeTd Unidades desoxi y MOE 51 22
328 6
330 5 4384 41 GeTdTdTdAdTdTdCdCdAeTdGdGdCdCdAdTdT dGeTd Unidades desoxi y MOE 40 22
328 6
330 5 4384 50 GeTeTeTreAdTeTeCdCdAdTreGdGdCdCdAdTre TdGeTd Unidades desoxi y MOE 64 22
328 6
330 5 4384 59 GeTeTeTreAdTdTdCdCdAdTreGdGdCdCdAdTre TdGeTd Unidades desoxi y MOE 68 22
328 6
330 5 4384 68 GTTTATTCCATGGCCATTGT 6-8-6 MOE 76 22
328 7
330 6 4098 26 GGTTTATTCCATGGCCATTG 5-10-5 MOE 93 23
328 7
330 6 4099 99 GGTTTATTCCATGGCCATTG 2-13-5 MOE 75 23
328 7
330 4 4383 70 TTTATTCCATGGCCATTG 5-8-5 MOE 33 41
328 7
330 6 4383 80 GeGeTdTdTdAeTeTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTdTeGe Unidades desoxi y MOE 63 23
328 7
330 6 4384 42 GeGeTdTdTdAdTdTdCdCcAeTdGdGdCdCdAdTdTeGe Unidades desoxi y MOE 67 23
328 7
330 6 4384 51 GeGeTdTdTdAeTeTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTeTeGe Unidades desoxi y MOE 83 23
328 7
330 6 4384 60 GeGeTdTdTdAdTdTdCeCdAdTdGdGdCdCdAdTeTeGe Unidades desoxi y MOE 82 23
328 7
330 6 4384 69 GGTTTATTCCATGGCCATTG 6-8-6 MOE 71 23
328 8
330 7 4041 72 TGGTTTATTCCATGGCCATT 5-10-5 MOE 76 24
328 8
330 7 4100 00 TGGTTTATTCCATGGCCATT 2-13-5 MOE 83 24
328 8
330 5 4383 71 GTTTATTCCATGGCCATT 5-8-5 MOE 54 42
328 8
330 7 4383 81 TdGeGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdATeTe Unidades desoxi y MOE 69 24
328 8
330 7 4384 43 TdGeGdTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTeTe Unidades desoxi y MOE 50 24
328 8
330 7 4384 52 TdGeGeTdTdTdAeTdTdCdCdAdTreGdGdCdC dAeTeTe Unidades desoxi y MOE 82 24
328 8
330 7 4384 61 TdGeGeTdTdTdAdTeTeCdCdAdTdGdGdCdCd AeTeTe Unidades desoxi y MOE 81 24
328 8
330 7 4384 70 TGGTTTATTCCATGGCCATT 6-8-6 MOE 46 24
328 9
330 8 4098 27 ATGGTTTATTCCATGGCCAT 5-10-5 MOE 74 25
328 9
330 8 4100 01 ATGGTTTATTCCATGGCCAT 2-13-5 MOE 85 25
328 9
330 6 4383 72 GGTTTATTCCATGGCCAT 5-8-5 MOE 52 43
328 9
330 8 4383 82 AeTdGdGdTdTeTeAdTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAeTd Unidades desoxi y MOE 65 25
328 9
330 8 4384 44 AeTdGdGdTdTdTdAdTdTeCeCdAdTdGdGdCd CdAeTd Unidades desoxi y MOE 72 25
328 9
330 8 4384 53 AeTdGeGdTreTeTeAdTdTdCdCdAdTdGdGdC dCeAeTe Unidades desoxi y MOE 72 25
3289
3308 438462 AeTdGeGdTdTdTreAeTdTreCdCdAdTreGdGddor eCdAeTd Unidades desoxi y MOE 70 25
3289
3308 438471 ATGGTTTATTCCATGGCCAT 6-8-6 MOE 45 25
3290
3309 404173 AATGGTTTATTCCATGGCCA 5-10-5 MOE 85 26
3290
3309 410002 AATGGTTTATTCCATGGCCA 2-13-5 MOE 85 26
3290
3307 438373 TGGTTTATTCCATGGCCA 5-8-5 MOE 70 44
3290
3309 438383 AeAeTreGdGdTeTeTreAdTdTdCdCdAdTreGdGdCdCeA e Unidades desoxi y MOE 54 26
3290
3309 438445 AeAeTdGdGdTdTdTdAdTeTeCdCdAdTdGdGdCd CdAe Unidades desoxi y MOE 66 26
3290
3309 438454 AeAeTdGdGdTeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAe Unidades desoxi y MOE 52 26
3290
3309 438463 AeAeTdGdGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAe Unidades desoxi y MOE 39 26
3290
3309 438472 AATGGTTTATTCCATGGCCA 6-8-6 MOE 73 26
3291
3310 142082 AAATGGTTTATTCCATGGCC 5-10-5 MOE 90 27
3291
3310 410003 AAATGGTTTATTCCATGGCC 2-13-5 MOE 86 27
3291
3308 438374 ATGGTTTATTCCATGGCC 5-8-5 MOE 79 45
3291
3310 438384 AeAeAdTdGdGeTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGd CdCd Unidades desoxi y MOE 53 27
3291
3310 438446 AeAeAdTdGdGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGd CdCd Unidades desoxi y MOE 38 27
3291
3310 438455 AeAeAeTdGdGeTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGe CdCd Unidades desoxi y MOE 58 27
3291
3310 438464 AeAeAeTdGdGdTdTeTeAdTdTdCdCdAdTdGdGd CdCd Unidades desoxi y MOE 58 27
3291
3310 438473 AAATGGTTTATTCCATGGCC 6-8-6 MOE 57 27
3292
3311 409828 AAAATGGTTTATTCCATGGC 5-10-5 MOE 43 28
3292
3311 410004 AAAATGGTTTATTCCATGGC 2-13-5 MOE 58 28
3292
3309 438375 AATGGTTTATTCCATGGC 5-8-5 MOE 55 46
3292
3311 438385 AeAeAdAdTdGeGeTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGd GeCd Unidades desoxi y MOE 36 28
3292
3311 438447 AeAeAdAdTdGdGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGd GeCd Unidades desoxi y MOE 35 28
3292
3311 438456 AeAeAeAdTdGeGeTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGe GeCd Unidades desoxi y MOE 58 28
3292
3311 438465 AeAeAeAdTdGdGTeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGeG eCd Unidades desoxi y MOE 51 28
3292
3311 438474 AAAATGGTTTATTCCATGGC 6-8-6 MOE 82 28
3293
3312 409829 AAAAATGGTTTATTCCATGG 5-10-5 MOE 42 29
3293
3310 438376 AAATGGTTTATTCCATGG 5-8-5 MOE 36 47
Tabla 7
La inhibición de los niveles de PTP1B de ARNm humano por los oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigido a la SEQ ID NO: 2
Sitio de inicio
Sitio de parada ISIS No Secuencia Motivo % de inhibición SEQ ID NO
70726
70745 373125 GGCACCTTCGATCACAGCCA 5-10-5 MOE 72 9
73855
73874 404161 GGTCATTTCCATGGCCAGAG 2-13-5 MOE 93 31
75045
75064 404176 TGATCAGGTCATGCACAGGC 5-10-5 MOE 89 14
75962
75981 409845 TATTCCATGGCCATTGTAAA 5-10-5 MOE 32 19
75963
75982 404174 TTATTCCATGGCCATTGTAA 5-10-5 MOE 47 20
75963
75982 410030 TTATTCCATGGCCATTGTAA 2-13-5 MOE 47 20
75963
75982 438377 TeTeAdTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAdTdTdGdTdAeAe Unidades desoxi y MOE 52 20
75963
75982 438439 TeTeAdTdTdCdCdAdTdGeGeCd CdAdTdTdGdTdAeAe Unidades desoxi y MOE 53 20
75963
75982 438448 TeTeAeTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAdTdTdGdTdAeAe Unidades desoxi y MOE 34 20
75963
75982 438457 TeTeAeTdTdCdCdAeTdGdGdCd CdAdTdTdGdTdAeAe Unidades desoxi y MOE 35 20
75963
75982 438466 TTATTCCATGGCCATTGTAA 6-8-6 MOE 25 20
75964
75983 409825 TTTATTCCATGGCCATTGTA 5-10-5 MOE 47 21
75964
75983 409998 TTTATTCCATGGCCATTGTA 2-13-5 MOE 49 21
75964
75981 438368 TATTCCATGGCCATTGTA 5-8-5 MOE 32 39
75964
75983 438378 TeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdC dCdAdTdTdGdTdAe Unidades desoxi y MOE 46 21
75964
75983 438440 TeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGeGdC dCdAdTdTdGdTdAe Unidades desoxi y MOE 30 21
75964
75983 438449 TeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdC dCdAdTdTdGeTdAe Unidades desoxi y MOE 43 21
75964
75983 438458 TeTeTdAdTdTdCdCdAeTdGdGdC dCdAdTdTdGeTdAe Unidades desoxi y MOE 53 21
75964
75983 438467 TTTATTCCATGGCCATTGTA 6-8-6 MOE 33 21
75965
75984 399038 GTTTATTCCATGGCCATTGT 5-10-5 MOE 74 22
75965
75984 404159 GTTTATTCCATGGCCATTGT 2-13-5 MOE 54 22
75965
75982 438369 TTATTCCATGGCCATTGT 5-8-5 MOE 33 40
75965
75984 438379 GeTdTunTdAdTeTeCdCdAdTdGd GdCdCdAdTdTdGeTd Unidades desoxi y MOE 51 22
75965
75984 438441 GeTdTdTdAdTdTdCdCdAeTdGdG dCdCdAdTdTdGeTd Unidades desoxi y MOE 40 22
75965
75984 438450 GeTeTeTdAdTeTeCdCdAdTdGdG dCdCdAdTdTdGeTd Unidades desoxi y MOE 64 22
75965
75984 438459 GeTeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGdG dCdCdAdTdTdGeTd Unidades desoxi y MOE 68 22
75965
75984 438468 GTTTATTCCATGGCCATTGT 6-8-6 MOE 76 22
7596 6
759 85 4098 26 GGTTTATTCCATGGCCATTG 5-10-5 MOE 93 23
7596 6
759 85 4099 99 GGTTTATTCCATGGCCATTG 2-13-5 MOE 75 23
7596 6
759 83 4383 70 TTTATTCCATGGCCATTG 5-8-5 MOE 33 41
7596 6
759 85 4383 80 GeGeTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTdTdGe Unidades desoxi y MOE 63 23
7596 6
759 85 4384 42 GeGeTdTdTdAdTdTdCdCdTdGdGdCdCdAdTdTdGe Unidades desoxi y MOE 67 23
7596 6
759 85 4384 51 GeGeTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTeTeGe Unidades desoxi y MOE 83 23
7596 6
759 85 4384 60 GeGeTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAdTeTeGe Unidades desoxi y MOE 82 23
7596 6
759 85 4384 69 GGTTTATTCCATGGCCATTG 6-8-6 MOE 71 23
7596 7
759 86 4041 72 TGGTTTATTCCATGGCCATT 5-10-5 MOE 76 24
7596 7
759 86 4100 00 TGGTTTATTCCATGGCCATT 2-13-5 MOE 83 24
7596 7
759 84 4383 71 GTTTATTCCATGGCCATT 5-8-5 MOE 54 42
7596 7
759 86 4383 81 TdGeGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCd ATeTd Unidades desoxi y MOE 69 24
7596 7
759 86 4384 43 TdGeGdTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCdCd AdTeTe Unidades desoxi y MOE 50 24
7596 7
759 86 4384 52 TdGeGeTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCd AeTeTe Unidades desoxi y MOE 82 24
7596 7
759 86 4384 61 TdGeGeTdTdTdAdTeTeCdCdAdTdGdGdCdCd AeTeTe Unidades desoxi y MOE 81 24
7596 7
759 86 4384 70 TGGTTTATTCCATGGCCATT 6-8-6 MOE 46 24
7596 8
759 87 4098 27 ATGGTTTATTCCATGGCCAT 5-10-5 MOE 74 25
7596 8
759 87 4100 01 ATGGTTTATTCCATGGCCAT 2-13-5 MOE 85 25
7596 8
759 85 4383 72 GGTTTATTCCATGGCCAT 5-8-5 MOE 52 43
7596 8
759 87 4383 82 AeTdGdGdTdTeTeAdTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAeTd Unidades desoxi y MOE 65 25
7596 8
759 87 4384 44 AeTdGdGdTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAeTd Unidades desoxi y MOE 72 25
7596 8
759 87 4384 53 AeTdGeGdTdTeTeAdTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAeTd Unidades desoxi y MOE 72 25
7596 8
759 87 4384 62 AeTdGeGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCd CdAeTd Unidades desoxi y MOE 70 25
7596 8
759 87 4384 71 ATGGTTTATTCCATGGCCAT 6-8-6 MOE 45 25
7596 9
759 88 4041 73 AATGGTTTATTCCATGGCCA 5-10-5 MOE 85 26
75969
75988 410002 AATGGTTTATTCCATGGCCA 2-13-5 MOE 85 26
75969
75986 438373 TGGTTTATTCCATGGCCA 5-8-5 MOE 70 44
75969
75988 438383 AeAeTdGdGdTeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAe Unidades desoxi y MOE 54 26
75969
75988 438445 AeAeTdGdGdTdTdTdAdTeTeCdCdAdTdGdGdCdCdAe Unidades desoxi y MOE 66 26
75969
75988 438454 AeAeTdGdGdTeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAe Unidades desoxi y MOE 52 26
75969
75988 438463 AeAeTdGdGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCdAe Unidades desoxi y MOE 39 26
75969
75988 438472 AATGGTTTATTCCATGGCCA 6-8-6 MOE 73 26
75970
75989 142082 AAATGGTTTATTCCATGGCC 5-10-5 MOE 90 27
75970
75989 410003 AAATGGTTTATTCCATGGCC 2-13-5 MOE 86 27
75970
75987 438374 ATGGTTTATTCCATGGCC 5-8-5 MOE 79 45
75970
75989 438384 AeAeAdTdGdGeTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGdCdCd Unidades desoxi y MOE 53 27
75970
75989 438446 AeAeAdTdGdGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGdCdCd Unidades desoxi y MOE 38 27
75970
75989 438455 AeAeAeTdGdGeTdTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGeCdCd Unidades desoxi y MOE 58 27
75970
75989 438464 AeAeAeTdGdGdTdTeTeAdTdTdCdCdAdTdGdGeCd Unidades desoxi y MOE 58 27
75970
75989 438473 AAATGGTTTATTCCATGGCC 6-8-6 MOE 57 27
75971
75990 409828 AAAATGGTTTATTCCATGGC 5-10-5 MOE 43 28
75971
75990 410004 AAAATGGTTTATTCCATGGC 2-13-5 MOE 58 28
75971
75988 438375 AATGGTTTATTCCATGGC 5-8-5 MOE 55 46
75971
75990 438385 AeAeAdAdTdGeGeTdTdAdTdTdCdCdAdTdGdGeCd Unidades desoxi y MOE 36 28
75971
75990 438447 AeAeAdAdTdGdGdTdTdTdAeTdTdCdCdAdTdGdGeCd Unidades desoxi y MOE 35 28
75971
75990 438456 AeAeAeAdTdGeGeTdTdTdUN4TdTdCdCdAdTdGeGeCd Unidades desoxi y MOE 58 28
75971
75990 438465 AeAeAeAdTdGdGTeTeTdAdTdTdCdCdAdTdGeGeCd Unidades desoxi y MOE 51 28
75971
75990 438474 AAAATGGTTTATTCCATGGC 6-8-6 MOE 82 28
75972
75991 409829 AAAAATGGTTTATTCCATGG 5-10-5 MOE 42 29
75972
75989 438376 AAATGGTTTATTCCATGG 5-8-5 MOE 36 47
Ejemplo 6: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del ARNm de PTP1B humano en células HUVEC
Varios oligonucleótidos antisentido, que mostraron la inhibición antisentido significativa de PTP1B mARN en
el estudio descrito en el Ejemplo 5 se ensayaron adicionalmente en células HUVEC en diversas dosis. Las células
5 se sembraron a una densidad de 2.000 células por pocillo y se transfectaron por electroporación con
concentraciones de 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM y 4000 nM de cada
oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de
PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto cebadores de sonda
RTS3000. los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. 10 Los resultados se presentan en la Tabla 8 como porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de
control sin tratar.
Tabla 8
Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B humano en células HUVEC
ISIS No
31,25 nM 62,5 nM 125,0 nM 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000.0 nM 4000,0 nM CI50 (MM)
142082
15 30 40 42 71 84 90 94 0,2
404173
15 19 33 54 69 81 86 93 0,2
404176
9 26 34 34 67 80 88 94 0,3
409826
17 16 28 44 60 73 85 95 0,3
410002
0 0 24 52 54 77 90 96 0,4
410003
9 7 19 46 60 80 91 95 0,4
438374
20 22 40 44 59 70 79 85 0,3
438460
14 21 23 42 62 78 85 95 0,3
438474
27 0 13 34 42 68 74 86 0,6
Ejemplo 7: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de humano ARNm de PTP1B en células HepG2
30 Los oligonucleótidos antisentido, ensayados en el estudio descrito en el Ejemplo 6, se ensayaron adicionalmente en células HepG2 a diversas dosis, Las células se sembraron a una densidad de 20,000 células por pocillo y se transfectaron por electroporación con concentraciones 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM y 4000 nM de cada oligonucleótido antisentido, después de aproximadamente 16 horas, se aisló
35 ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores de sonda RTS3000, los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®, los resultados se presentan en la Tabla 9 como porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar, Los niveles de mARN también se analizaron usando el conjunto de cebadores de sonda mono rhesus RTS198, y los resultados se presentan en la Tabla 10. Los sitios de inicio y
40 parada de cada oligonucleótido en SEQ ID NO: 3 de mono rhesus se presentan en la Tabla 11,
Tabla 9
Análisis de la inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B humano en células HepG2 utilizando RTS3000
ISIS No
31,25 nM 62,5 nM 125,0 nM 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000,0 nM 4000,0 nM CI50 (µM)
142082
0 0 7 0 26 38 60 82 1,4
404173
2 0 1 19 0 29 47 80 1,9
404176
0 0 5 13 2 33 62 79 1,7
409826
0 0 0 2 15 29 46 76 1,9
410002
13 6 0 11 8 28 44 75 2,0
410003
0 0 9 11 22 33 30 83 1,9
438374
0 0 17 11 23 38 33 61 2,9
438460
4 0 10 11 9 26 52 79 1,8
438474
0 0 2 11 6 20 52 54 2,8
Tabla 10
Análisis de la inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B humano en células HepG2 utilizando RTS198
ISIS No
31,25 nM 62,5 nM 125,0 nM 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000.0 nM 4000,0 nM CI50 (MM)
142082
14 19 2 0 80 41 63 80 1,5
404173
0 0 2 0 16 26 60 83 1,6
404176
0 0 0 5 0 31 59 80 1,9
409826
0 0 0 16 23 10 49 72 2,3
410002
0 0 0 0 0 0 40 100 > 4,0
410003
0 1 12 0 10 41 51 82 1,6
438374
0 0 0 9 43 22 49 55 2,8
438460
0 0 0 9 30 42 47 81 1,4
438474
2 0 9 38 19 31 49 60 2,5
Tabla 11
Sitios diana de oligonucleótidos antisentido dirigidos a PTP1B en la secuencia del gen de mono rhesus (SEQ ID NO: 3)
OligoID
Sitio de inicio Sitio de parada SEQ ID NO
142082
4495 4514 27
404173
4494 4513 26
404176
3571 3590 14
409826
4491 4510 23
410002
4494 4513 26
410003
4495 4514 27
438374
4495 4512 45
438460
4491 4510 23
438474
4496 4515 28
Ejemplo 8: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del ARNm de PTP1B humano en células HepG2
Oligonucleótidos antisentido cortos al lugar diana de ISIS 142082 fueron diseñados. Los sitios diana, 40 motivos y detalles de secuencia de estos shortmeros se presentan en la Tabla 12. Estos oligonucleótidos antisentido se ensayaron en células HepG2 a diversas dosis. Algunos de los oligonucleótidos antisentido desde el estudio descrito en el Ejemplo 7 se incluyeron en el ensayo para la comparación. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron por electroporación con concentraciones 78,125 nM, 156,25 nM, 312,5 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM y 10.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de 45 aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores de sonda RTS3000. Los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 13 como el porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar.
50 Tabla 12
Sitios diana de oligonucleótidos antisentido dirigidos a la SEQ ID NO: 1
ISIS No
Sitio de inicio Sitio de parada Secuencia Motivo SEQ ID NO
142082
3291 3310 AAATGGTTTATTCCATGGCC 5-10-5 27
446431
3292 3309 AATGGTTTATTCCATGGC 4-10-4 46
446432
3293 3308 ATGGTTTATTCCATGG 3-10-3 48
Tabla 13
Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B humano en células HepG2
ISIS No
78,125 nM 156,25 nM 312,5 nM 625,0 nM 1250,0 nM 2500,0 nM 5000,0 nM 10000,0 nM CI50 (µM)
113715
6 12 17 17 16 45 61 86 3,3
142082
14 34 23 47 60 81 86 90 0,8
404173
8 22 29 45 60 73 83 88 0,8
409826
19 18 41 56 75 84 89 91 0,5
410003
0 0 19 39 55 81 91 92 1,0
446431
10 24 26 38 57 74 85 92 1,0
446432
0 8 10 10 10 26 40 67 6,0
Ejemplo 9: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B mARN en células LLC-MK2
Los oligonucleótidos antisentido del estudio descrito en el Ejemplo 8 también son de reacción cruzada con la secuencia del gen PTP1B mono rhesus (SEQ ID NO: 3) y se ensayaron adicionalmente en células LLC-MK2 de mono rhesus a diversas dosis. Las células se sembraron a una densidad de 25.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones 78,125 nM, 156,25 nM, 312,5 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM, y 10.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores de sonda RTS198. Los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN
25 total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 14 como el porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar. Los sitios de inicio y parada de cada oligonucleótido en la SEQ ID Nº: 3 mono rhesus se presentan en la Tabla 15.
Tabla 14
Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B mARN en células LLC-MK2
ISIS No
78,125 nM 156,25 nM 312,5 nM 625,0 nM 1250,0 nM 2500,0 nM 5000,0 nM 10000,0 mM CI50 (MM)
113715
0 0 4 13 27 53 57 70 3.3
142082
2 12 31 41 69 74 80 92 0.9
404173
2 0 22 29 36 61 78 84 1.6
409826
12 0 19 38 66 66 82 92 1.2
410003
0 0 0 26 32 65 81 91 1.8
446431
0 0 9 32 45 70 79 58 1.4
446432
0 0 7 16 10 20 26 43 37.0
45 Tabla 15
Sitios diana de oligonucleótidos antisentido dirigidos a la SEQ ID NO: 3
ISIS No
Sitio de inicio Sitio de parada Secuencia SEQ ID NO
113715
1035 1054 GCTCCTTCCACTGATCCTGC 10
142082
4495 4514 AAATGGTTTATTCCATGGCC 27
404173
4494 4513 AATGGTTTATTCCATGGCCA 26
409826
4491 4510 GGTTTATTCCATGGCCATTG 23
410003
4495 4514 AAATGGTTTATTCCATGGCC 27
446431
4496 4513 AATGGTTTATTCCATGGC 46
446432
4497 4512 ATGGTTTATTCCATGG 48

Ejemplo 10: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del ARNm de PTP1B humano en células HUVEC
Los oligonucleótidos antisentido, ensayados en el estudio descrito en los Ejemplos 8 y 9, se ensayaron 65 adicionalmente en células HUVEC en diversas dosis. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron por electroporación con concentraciones 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM, 500 nM,
1000 nM, 2000 nM y 4000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores de sonda RTS3000. Los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 16 como el porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar.
Tabla 16
Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B humano en células HUVEC
ISIS No
31,25 nM 62,5 nM 125,0 nM 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000.0 nM 4000,0 nM CI50 (MM)
113715
10 0 22 24 65 86 92 98 0,2
142082
52 78 89 93 95 96 98 98 <0,3
404173
35 66 80 89 95 98 97 97 0,05
409826
57 72 82 64 97 98 98 98 <0,3
410003
43 47 75 84 48 95 96 91 0,05
446431
33 63 75 87 96 97 98 98 0,05
446432
0 11 30 45 66 79 85 76 0,3

Ejemplo 11: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PTP1B mARN en hepatocitos primarios cynomolgus
Los oligonucleótidos antisentido del estudio descritos en los Ejemplos 8-10 se ensayaron adicionalmente en 25 hepatocitos primarios cynomolgus a diversas dosis. Las células se sembraron a una densidad de 35.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM, 500 nM,
1.000 nM, 2.000 nM, y 4.000 nM de cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de PTP1B de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebadores de sonda RTS198. Los niveles de PTP1B de mARN se normalizaron al contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la Tabla 17 como el porcentaje de inhibición de PTP1B mARN, respecto a las células de control sin tratar.
Tabla 17
Inhibición antisentido dependiente cynomolgus
de la dosis de PTP1B mARN en hepatocitos primarios
ISIS No
31,25 nM 62,5 nM 125,0 nM 250,0 nM 500,0 nM 1000,0 nM 2000.0 nM 4000,0 nM CI50 (MM)
113715
4 26 25 43 46 73 82 95 0,4
142082
25 37 50 67 74 87 86 88 0,1
404173
18 20 43 54 67 82 85 89 0,2
409826
34 47 51 65 76 87 88 90 0,1
410003
8 20 44 53 68 79 80 83 0,2
446431
9 14 35 54 57 79 79 88 0,3
446432
4 0 1 3 0 11 6 37 > 4,0

Ejemplo 12: La tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a PTP1B humano en un modelo de ratón
Oligonucleótidos ISIS que demostraron la inhibición dependiente de la dosis en los estudios descritos en los Ejemplos 8-11 fueron evaluados por tolerabilidad en un modelo de ratón monitorizando los cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos en ratones CD1. Dos oligonucleótidos adicionales ISIS 446433 (4-10-4 MOE; 5'
55 GTTTATTCCATGGCCATT-3' (SEQ ID NO: 42); sitio de inicio diana en SEQ ID NO: 1 es de 3288) e ISIS 446434 (310-3; 5'-TTTATTCCATGGCCAT-3' (SEQ ID NO: 49); sitio de inicio diana en SEQ ID NO: 1 es 3289) fueron diseñados como shortmeros a ISIS 409826 (sitio de inicio diana en SEQ ID NO: 1 es 3287) y también se evaluaron en este estudio.
Tratamiento
Ratones CD1 (disponibles de Jackson Labs, Bar Harbor, ME) se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron con pienso normal de laboratorio ad libitum (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN). Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en el centro de investigación antes del inicio del experimento. Los
65 oligonucleótidos antisentido se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los oligonucleótidos se disolvieron en 0,9% de PBS para inyección.
Grupos de cinco ratones CD1 se inyectaron por vía subcutánea dos veces a la semana con 100 mg/kg de ISIS 142082, ISIS 373125, ISIS 404173, ISIS 409826, ISIS 410002, ISIS 410003, ISIS 438452, ISIS 438460, ISIS 446431, ISIS 446432, ISIS 446433, o ISIS 446434 durante 4 semanas. Un grupo de cinco ratones CD1 se inyectó por vía subcutánea dos veces a la semana con PBS durante 4 semanas. Este grupo PBS sirvió como el grupo
5 control. Las muestras de sangre se recogieron a través de corte de cola. Dos días después de la última dosis, se tomaron los pesos corporales, los ratones fueron sacrificados y los órganos y plasma se recogieron para su posterior análisis.
Pesos corporales y de órganos
Los pesos corporales de los ratones se midieron semanalmente. Los pesos corporales se presentan en la Tabla 18. Pesos del hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 19. Los resultados demuestran que ninguno de los oligonucleótidos ISIS tenía ningún efecto adverso sobre la salud general de los ratones.
Tabla 18
Pesos semanales corporales de ratones CD1 oligonucleótido antisentido (g)
durante el tratamiento de
Semana 1
Semana 2 Semana 3 Semana 4
PBS
29 31 32 34
ISIS 142082
31 34 34 36
ISIS 373125
29 31 32 35
ISIS 404173
31 33 34 36
ISIS 409826
31 34 34 37
ISIS 410002
32 35 35 36
ISIS 410003
31 34 34 37
ISIS 438452
32 35 36 39
ISIS 438460
31 34 34 37
ISIS 446431
30 33 33 36
ISIS 446432
27 30 30 33
ISIS 446433
30 33 33 37
ISIS 446434
30 33 34 37
Tabla 19
Pesos de los órganos de ratones CD1 después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido (g)
Hígado
Grasa Bazo Riñón
PBS
1,7 0,45 0,11 0,53
ISIS 142082
2,3 0,33 0,18 0,52
ISIS 373125
1,9 0,38 0,16 0,53
ISIS 404173
2,3 0,41 0,23 0,59
ISIS 409826
2,2 0,37 0,17 0,54
ISIS 410002
1,9 0,22 0,30 0,76
ISIS 410003
2,1 0,44 0,22 0,60
ISIS 438452
2,2 0,42 0,18 0,55
ISIS 438460
2,2 0,34 0,17 0,52
ISIS 446431
2,1 0,34 0,19 0,53
ISIS 446432
1,7 0,31 0,13 0,46
ISIS 446433
2,2 0,35 0,17 0,53
ISIS 446434
2,2 0,36 0,18 0,56
Funcionamiento del hígado
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, los niveles plasmáticos de las 65 transaminasas se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los niveles plasmáticos de ALT (transaminasa de alanina) y AST (transaminasa de aspartato) se
midieron dos veces por semana. Los resultados se presentan en las Tablas 20 y 21, e indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS fueron considerados tolerables en los ratones, como se demuestra por su perfil de transaminasa hepática.
Tabla 20
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en ALT (UI/L) de ratones CD1
Semana 0
Semana 2 Semana 4
PBS
27 26 20
ISIS 142082
38 35 105
ISIS 373125
30 27 51
ISIS 404173
30 31 124
ISIS 409826
26 34 236
ISIS 410002
27 203 219
ISIS 410003
31 29 99
ISIS 438452
32 40 217
ISIS 438460
30 40 216
ISIS 446431
29 38 114
ISIS 446432
26 27 35
ISIS 446433
25 76 115
ISIS 446434
23 44 146
Tabla 21
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de AST (UI/L) de ratones CD1
Semana 0
Semana 2 Semana 4
PBS
54 62 50
ISIS 142082
75 59 103
ISIS 373125
55 57 97
ISIS 404173
52 61 117
ISIS 409826
49 59 192
ISIS 410002
51 151 417
ISIS 410003
64 47 122
ISIS 438452
59 56 157
ISIS 438460
65 56 217
ISIS 446431
56 66 140
ISIS 446432
50 51 74
ISIS 446433
54 87 121
ISIS 446434
42 64 132
Niveles de glucosa en plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre el metabolismo de la glucosa, los niveles plasmáticos de glucosa se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus 55 AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 22, expresados en mg/dL. Ninguno de los
oligonucleótidos ISIS tenía ningún efecto adverso sobre el metabolismo de la glucosa de los ratones.
Tabla 22
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de glucosa en plasma en ratones CD1
Semana 0
Semana 2 Semana 4
PBS
175 188 182
ISIS 142082
195 178 161
ISIS 373125
187 201 177
ISIS 404173
185 213 168
ISIS 409826
183 187 187
ISIS 410002
183 164 137
ISIS 410003
198 218 168
ISIS 438452
168 197 175
ISIS 438460
212 203 169
ISIS 446431
192 188 148
ISIS 446432
194 193 175
ISIS 446433
216 198 151
ISIS 446434
199 189 159
Lípidos en plasma y niveles de triglicéridos
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre el colesterol y metabolismo de los triglicéridos, los niveles plasmáticos de cada se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en las Tablas 23 y 24, expresados en mg/dL. La mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tienen ningún efecto adverso del metabolismo lipídico de los ratones.
Tabla 23 Tabla 24
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de colesterol en plasma en ratones CD1
Semana 0
Semana 2 Semana 4
PBS
162 145 153
ISIS 142082
156 136 126
ISIS 373125
137 106 104
ISIS 404173
162 124 154
ISIS 409826
153 142 146
ISIS 410002
136 63 47
ISIS 410003
160 131 96
ISIS 438452
143 128 121
ISIS 438460
146 140 129
ISIS 446431
139 124 116
ISIS 446432
146 135 137
ISIS 446433
152 144 145
ISIS 446434
147 147 144
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de triglicéridos en plasma en ratones CD1
Semana 0
Semana 2 Semana 4
PBS
153 153 162
ISIS 142082
170 153 114
ISIS 373125
142 116 112
ISIS 404173
195 140 107
ISIS 409826
182 120 80
ISIS 410002
137 99 51
ISIS 410003
152 138 102
ISIS 438452
123 134 93
ISIS 438460
165 146 85
ISIS 446431
131 160 123
ISIS 446432
168 194 136
ISIS 446433
186 117 133
ISIS 446434
145 101 84
Niveles de citoquinas
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS de factores implicados en la inflamación, se recogió sangre después del final del período de tratamiento para la medición de los niveles de citoquinas. Las muestras se enviaron a Aushon Biosystems (Woburn, MA) para el análisis. Los niveles de IL-6 murina, JE, MIP-1α, y TNF-α se midieron usando los anticuerpos murinos. Los resultados se presentan en la Tabla 25. La mayor parte de los oligonucleótidos ISIS no tienen ningún efecto adverso sobre los niveles de citoquinas de los ratones.
Tabla 25
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de citoquinas en plasma en ratones CD1
mIL-6
MJE mMIP-1α mTNF-α
PBS
250 20 1 4
ISIS 142082
225 145 4 23
ISIS 373125
77 91 3 17
ISIS 404173
88 155 1 24
ISIS 409826
33 112 3 15
ISIS 410002
113 225 28 84
ISIS 410003
111 138 4 24
ISIS 438452
62 148 1 15
ISIS 438460
64 184 2 9
ISIS 446431
52 170 1 15
ISIS 446432
57 75 1 3
ISIS 446433
64 138 3 61
ISIS 446434
59 127 0 21

Ejemplo 13: La tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a PTP1B humano en un modelo de rata
Los oligonucleótidos ISIS del estudio descrito en el Ejemplo 12 se evaluaron adicionalmente para la tolerabilidad en un modelo de rata por seguimiento de los cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos en ratas Sprague Dawley.
Tratamiento
Ratas Sprague Dawley se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum de pienso normal de laboratorio (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN). Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en el centro de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido se prepararon en PBS y se esterilizan por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los oligonucleótidos se disolvieron en 0,9% de PBS para inyección.
Grupos de cuatro ratas cada uno se inyectaron por vía subcutánea dos veces a la semana con ISIS 142082, ISIS 373125, ISIS 404173, ISIS 409826, ISIS 410002, ISIS 410003, ISIS 438452, ISIS 438460, ISIS 446431, ISIS 446432, ISIS 446433 o ISIS 446434 a una dosis de 50 mg/kg dos veces a la semana durante 4 semanas, seguido de una dosis de 30 mg/kg dos veces a la semana durante 8 semanas. Un grupo de cuatro ratas se inyectó por vía subcutánea dos veces a la semana con PBS durante 12 semanas. Este grupo PBS sirvió como el grupo control. Las muestras de sangre se recogieron a través de corte de cola. Dos días después de la última dosis, se tomaron los pesos corporales, las ratas se sacrificaron y los órganos y el plasma se recogieron para su posterior análisis.
Pesos corporales y de órganos
Los pesos corporales de las ratas se midieron semanalmente. Los pesos corporales se presentan en la Tabla 26. Pesos de dígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio, y se presentan en la Tabla 27. 'n/a' indica que no hay datos disponibles para ese grupo en particular en ese momento particular debido a que todas las ratas en el grupo se han sacrificado antes del momento.
Tabla 26
Pesos quincenales corporales de ratas Sprague Dawley durante el tratamiento de oligonucleótido antisentido (g)
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
288 369 405 442 463 500 495
ISIS 142082
295 348 318 345 337 347 345
ISIS 373125
304 385 399 419 427 421 448
ISIS 404173
294 346 352 377 384 391 401
ISIS 409826
292 346 350 355 356 373 356
ISIS 410002
297 333 323 324 306 335 n/a
ISIS 410003
299 341 328 320 307 305 301
ISIS 438452
301 327 335 333 327 347 332
ISIS 438460
304 345 346 347 356 377 n/a
ISIS 446431
307 376 340 357 353 357 349
ISIS 446432
287 340 344 363 372 399 404
ISIS 446433
298 331 318 354 n/A n/A n/A
ISIS 446434
303 366 356 n/A n/A n/A n/A
Tabla 27
Pesos de los órganos de ratas oligonucleótido antisentido (g)
Sprague Dawley durante el tratamiento de
Hígado
Grasa Bazo Riñón
PBS
15,9 2,1 0,8 3,6
ISIS 142082
21,8 0,7 4,5 5,2
ISIS 373125
17,9 1,1 1,9 3,4
ISIS 404173
17,7 1,1 2,3 4,3
ISIS 409826
19,8 0,5 3,6 4,4
ISIS 410003
18,7 0,5 3,8 3,5
ISIS 438452
17,3 0,6 3,1 3,8
ISIS 446431
22,1 0,4 6,1 5,3
ISIS 446432
18,1 1,2 3,3 3,8
Función del hígado
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, los niveles plasmáticos de las transaminasas fueron medidos usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los niveles plasmáticos de ALT (transaminasa de alanina) y AST (transaminasa de aspartato) se midieron dos veces por semana. Los niveles plasmáticos de bilirrubina (mg/dL) también se midieron usando el mismo analizador de química clínica. Los resultados se presentan en las Tablas 28, 29 y 30. 'n/a' indica que no hay datos disponibles para ese grupo en particular en ese punto de tiempo particular debido a que todas las ratas del grupo se han sacrificado antes del punto de tiempo.
Tabla 28
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en ALT (UI/L) de ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
58 68 54 48 48 46 46
ISIS 142082
54 75 40 44 49 62 57
ISIS 373125
57 61 60 48 48 45 38
ISIS 404173
49 52 53 41 51 53 42
ISIS 409826
51 59 56 50 42 37 40
ISIS 410002
46 65 75 73 103 126 n/A
ISIS 410003
49 78 62 49 61 59 66
ISIS 438452
46 57 58 53 51 52 50
ISIS 438460
49 88 162 96 114 91 n/A
ISIS 446431
51 57 45 45 40 55 49
ISIS 446432
52 59 48 43 44 49 46
ISIS 446433
53 120 65 86 n/A n/A n/A
ISIS 446434
53 76 161 n/A n/A n/A n/A
Tabla 29 Tabla 30
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de AST (UI/L) de ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
84 92 86 79 91 74 81
ISIS 142082
87 89 86 126 136 154 149
ISIS 373125
79 72 93 124 111 95 81
ISIS 404173
75 69 88 75 89 96 83
ISIS 409826
75 74 96 112 108 90 106
ISIS 410002
67 87 155 173 229 245 n/A
ISIS 410003
71 95 106 136 161 160 186
ISIS 438452
70 84 104 157 164 174 167
ISIS 438460
79 122 214 287 216 172 n/A
ISIS 446431
73 79 93 137 129 158 153
ISIS 446432
80 76 86 99 96 105 102
ISIS 446433
77 151 128 234 n/a n/a n/a
ISIS 446434
81 137 359 n/a n/a n/a n/a
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la bilirrubina (mg/dL) de ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
0,11 0,15 0,14 0,16 0,25 0,16 0,13
ISIS 142082
0,12 0,11 0,18 0,12 0,12 0,15 0,15
ISIS 373125
0,13 0,13 0,15 0,36 0,14 0,15 0,13
ISIS 404173
0,11 0,13 0,14 0,13 0,13 0,14 0,10
ISIS 409826
0,12 0,12 0,15 0,12 0,11 0,10 0,10
ISIS 410002
0,11 0,13 0,18 0,13 0,19 0,54 n/a
ISIS 410003
0,12 0,12 0,14 0,16 0,14 0,17 0,14
ISIS 438452
0,12 0,13 0,15 0,13 0,14 0,13 0,13
ISIS 438460
0,11 0,14 0,22 0,28 0,15 0,17 n/a
ISIS 446431
0,14 0,17 0,19 0,13 0,10 0,16 0,16
ISIS 446432
0,12 0,14 0,13 0,12 0,11 0,14 0,13
ISIS 446433
0,12 0,12 0,18 0,20 n/a n/a n/a
ISIS 446434
0,12 0,17 0,20 n/a n/a n/a n/a
Funcionamiento del riñón
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en las Tablas 31 y 32, expresados en mg/dL. La proteína total de orina a la proporción de creatinina también se calculó y los resultados se presentan en la Tabla
33.
Tabla 31 Tabla 32
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de BUN (mg/dl) de ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
17 20 20 18 26 18 16
ISIS 142082
21 23 31 23 31 24 29
ISIS 373125
21 21 24 19 31 21 21
ISIS 404173
18 19 21 19 25 21 20
ISIS 409826
20 21 24 23 28 22 26
ISIS 410002
19 22 25 23 29 32 n/a
ISIS 410003
18 20 23 23 30 29 26
ISIS 438452
19 22 27 25 29 22 24
ISIS 438460
20 23 25 26 31 24 n/a
ISIS 446431
19 21 24 23 29 24 23
ISIS 446432
20 21 24 20 29 23 19
ISIS 446433
18 21 25 53 n/a n/a n/a
ISIS 446434
18 23 120 n/a n/a n/a n/a
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en la creatinina (mg/dL) de ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
0,2 0,3 0,4 0,3 0,5 0,4 0,3
ISIS 142082
0,3 0,3 0,5 0,4 0,5 0,5 0,4
ISIS 373125
0,3 0,3 0,6 0,4 0,6 0,6 0,4
ISIS 404173
0,3 0,3 0,5 0,4 0,5 0,6 0,4
ISIS 409826
0,3 0,4 0,6 0,4 0,5 0,5 0,4
ISIS 410002
0,3 0,3 0,6 0,4 0,5 0,5 n/a
ISIS 410003
0,3 0,3 0,6 0,4 0,6 0,6 0,4
ISIS 438452
0,3 0,3 0,6 0,4 0,5 0,5 0,4
ISIS 438460
0,3 0,4 0,5 0,3 0,5 0,5 n/a
ISIS 446431
0,3 0,3 0,5 0,4 0,5 0,5 0,4
ISIS 446432
0,3 0,3 0,6 0,4 0,5 0,5 0,4
ISIS 446433
0,3 0,3 0,5 0,4 n/a n/a n/a
ISIS 446434
0,3 0,4 0,8 n/a n/a n/a n/a
Tabla 33
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de la proteína total de orina a la proporción de creatinina en orina de ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
1,5 1,4 1,2 1,6 1,3 1,2 1,2
ISIS 142082
1,2 4,3 4,0 7,7 6,6 7,5 7,4
ISIS 373125
1,3 3,9 3,8 6,7 6,2 8,8 9,7
ISIS 404173
1,1 4,8 5,5 6,4 7,4 10,2 11,9
ISIS 409826
1,2 3,7 3,8 5,9 9,8 28,8 37,6
ISIS 410002
1,2 3,9 4,1 6,0 9,7 26,3 n/a
ISIS 410003
1,3 4,5 5,3 5,9 7,6 10,8 18,0
ISIS 438452
1,4 3,3 3,1 5,1 8,0 9,2 10,5
ISIS 438460
1,3 4,0 4,5 7,3 16,0 53,9 n/a
ISIS 446431
1,2 4,5 5,0 5,3 7,2 8,0 8,8
ISIS 446432
1,3 4,2 4,4 6,2 9,1 7,6 9,2
ISIS 446433
1,1 3,4 5,7 81,5 n/a n/a n/a
ISIS 446434
1,1 3,7 25,8 n/a n/a n/a n/a
Niveles de glucosa en plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre el metabolismo de la glucosa, los niveles plasmáticos de glucosa se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 34, expresados en mg/dL.
Tabla 34
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de glucosa en plasma en ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
150 140 155 152 163 138 144
ISIS 142082
153 137 155 145 142 130 135
ISIS 373125
153 135 136 143 133 106 135
ISIS 404173
162 138 149 152 145 144 154
ISIS 409826
155 141 150 145 143 132 135
ISIS 410002
152 139 148 151 130 124 n/a
ISIS 410003
152 138 146 140 132 126 143
ISIS 438452
166 134 162 153 135 143 147
ISIS 438460
166 140 151 156 150 130 n/a
ISIS 446431
154 143 155 147 153 139 145
ISIS 446432
159 141 155 152 152 138 153
ISIS 446433
158 138 141 118 n/a n/a n/a
ISIS 446434
166 149 124 n/a n/a n/a n/a
Lípidos en plasma y los niveles de triglicéridos
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre los niveles de colesterol total y de triglicéridos, los niveles plasmáticos de cada se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en las Tablas 35 y 36, expresados en mg/dL.
Tabla 35 Tabla 36
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de colesterol en plasma (mg/dl) en ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10 Semana 12
PBS
55 57 64 51 73 64 53
ISIS 142082
62 41 54 62 70 64 62
ISIS 373125
73 59 66 51 66 61 39
ISIS 404173
57 41 68 62 87 85 75
ISIS 409826
57 42 79 65 86 122 110
ISIS 410002
69 57 75 65 73 96 n/a
ISIS 410003
72 44 70 67 89 76 73
ISIS 438452
63 33 53 51 71 70 61
ISIS 438460
64 40 98 81 94 146 n/a
ISIS 446431
64 41 56 54 63 68 59
ISIS 446432
62 44 70 50 80 80 65
ISIS 446433
59 63 95 139 n/a n/a n/a
ISIS 446434
63 48 91 n/a n/a n/a n/a
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de triglicéridos en plasma (mg/dl) en ratas Sprague Dawley
Semana 0
Semana 2 Semana 4 Semana 6 Semana 8 Semana 10
PBS
66 73 82 80 98 106
ISIS 142082
92 30 71 44 25 28
ISIS 373125
66 28 20 24 24 28
ISIS 404173
48 28 28 35 31 49
ISIS 409826
68 29 28 25 31 68
ISIS 410002
71 23 23 27 71 n/a
ISIS 410003
78 22 22 37 30 64
ISIS 438452
89 33 39 34 50 35
ISIS 438460
98 20 34 35 33 n/a
ISIS 446431
72 29 38 36 35 48
ISIS 446432
n/a 41 37 31 37 53
ISIS 446433
68 21 29 129 n/a n/a
ISIS 446434
60 27 103 n/a n/a n/a
Niveles de citoquinas
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS de factores implicados en la inflamación, se recogió sangre después del final del período de tratamiento para la medición de los niveles de citoquinas. Las muestras se enviaron a Aushon Biosystems (Woburn, MA) para el análisis. Los niveles de rata IL-6, MCP-1, MIP-1α, y TNF-α se midieron con sus respectivos anticuerpos. Los resultados se presentan en la Tabla 37.
Tabla 37
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de citoquinas en plasma en ratas Sprague Dawley
rIL-6
rMCP-1 rMIP-1α rTNF-α
PBS
315 403 6 77
ISIS 142082
74 3082 38 697
ISIS 373125
<25 2215 7 15
ISIS 404173
125 2244 60 499
ISIS 409826
<25 6041 52 100
ISIS 410003
245 3315 40 444
ISIS 438452
105 4513 26 519
ISIS 446431
924 3104 54 402
ISIS 446432
29 2007 46 610

Ejemplo 14: Medición de la viscosidad de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a PTP1B humana
La viscosidad de los oligonucleótidos antisentido seleccionados de estudios descritos en los Ejemplos 12 y 13 se midió con el objetivo de filtrar los oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad de más de 40 cP a una concentración de 165-185 mg/mL. Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad mayor que 40 cP serían demasiado viscosos para ser administrados a cualquier sujeto.
Oligonucleótidos ISIS (32-35 mg) se pesaron en un vial de vidrio, se añadieron 120 ml de agua y el oligonucleótido antisentido se disolvió en solución calentando el vial a 50°C. Parte de (75 ml) la muestra precalentada se pipeteó a un micro-viscosímetro (Cambridge). La temperatura de micro-viscosímetro se fijó a 25°C y se midió la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 ml) de la muestra precalentada se pipeteó en 10 ml de agua para lectura UV a 260 nm a 85°(instrumento Cary UV) C. Los resultados se presentan en la Tabla 38 e indican que todas las soluciones de oligonucleótidos antisentido son óptimos en su viscosidad bajo el criterio indicado anteriormente.
Tabla 38
La viscosidad y la concentración de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a PTP1B humana
ISIS Nº
Viscosidad (cP) Concentración (mg/ml)
142082
3,8 188
404173
3,8 163
410003
4,5 176
446431
3,2 180
446432
2,4 175

Ejemplo 15: Estudio de tolerabilidad de seis meses de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a PTP1B humano en un modelo de ratón
Oligonucleótidos de ISIS seleccionados de los estudios descritos en los Ejemplos 12-14 se evaluaron para determinar tolerabilidad a largo plazo en un modelo de ratón monitorizando los cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos en ratones CD1.
Tratamiento
Ratones CD1 machos se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y alimentados ad libitum de pienso normal de laboratorio (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN). Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en el centro de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los oligonucleótidos se disolvieron en 0,9% de PBS para inyección.
Grupos de diez ratones cada uno CD1 se inyectaron por vía subcutánea dos veces a la semana con 25 mg/kg de ISIS 142082, ISIS 404173, ISIS 446431 o durante 24 semanas. Un grupo de diez ratones CD1 se inyectó por vía subcutánea dos veces a la semana con PBS durante 24 semanas. Este grupo PBS sirvió como el grupo de control. Las muestras de sangre se recogieron en los días 140 a través de las hemorragias mandibulares. En el día 168, se recogió sangre mediante punción cardiaca terminal bajo anestesia de CO2, los ratones fueron sacrificados y los órganos se recogieron para su posterior análisis.
Niveles de glucosa en plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre el metabolismo de la glucosa, los niveles plasmáticos de glucosa se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 39, expresados en mg/dL.
Tabla 39
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de glucosa en plasma en el día 168
Glucosa
PBS
214
ISIS 142082
177
ISIS 404173
204
ISIS 446431
191
Funcionamiento del hígado
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, los niveles plasmáticos de las transaminasas fueron medidos usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (transaminasa de alanina) y AST (transaminasa de aspartato) en el día 168. Los niveles plasmáticos de bilirrubina (mg/dL) también se midieron usando el mismo analizador de química clínica. La fosfatasa alcalina, que se sintetiza en cantidades incrementadas por las células hepáticas dañadas, también es un marcador de la enfermedad del hígado (Narayanan, S. Ann Clin Lab Sci 21: 12-8, 1991) y se midió de manera similar. La albúmina, que normalmente se disminuyó en la enfermedad hepática (Oettl,
K. et al, Biochim Biophys Acta 1782: 469-73, 2008), también se midió de manera similar. Los resultados se presentan en la Tabla 40.
Tabla 40
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de marcadores metabólicos de hígado en el día 168
ALT (UI/L)
AST (UI/L) Bilirrubina (mg/dL) Fosfatasa alcalina (IU/L) Albúmina (g/dL)
PBS
50 82 0.2 44 2,5
ISIS 142082
148 197 0.1 56 2,3
ISIS 404173
68 137 0.1 57 2,5
ISIS 446431
115 173 0.1 42 2,4
Función cardíaca
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función cardíaca, los niveles plasmáticos de creatina fosfoquinasa (CPK) se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY) en el día 168. Un aumento en el nivel de este marcador indica lesión del músculo cardíaco (Barohn, RJ En: Goldman L, Ausiello D, eds Cecil Medicine 23a ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007: capítulo 447). Los resultados se presentan en la Tabla 41.
Tabla 41
Efecto del tratamiento con cardiaco en día 168
oligonucleótido antisentido en CPK marcador
CPK (IU/L)
PBS
98
ISIS 142082
120
ISIS 404173
107
ISIS 446431
159
Función pancreática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función pancreática, los niveles plasmáticos de amilasa se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY) en el día 168. Un aumento en el nivel de este marcador indica la pancreatitis aguda (Sternby, B. et al., Mayo Clin Proc 71: 1138-1144, 1996). Los resultados se presentan en la Tabla 42.
Tabla 42
Efecto del tratamiento con marcador en día 168
oligonucleótido antisentido de amilasa pancreática
Amilasa (IU/L)
PBS
1101
ISIS 142082
1374
ISIS 404173
1280
ISIS 446431
1232
Función del riñón
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina se midieron usando un analizador de química clínica automatizada (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 43, expresados en mg/dL.
Tabla 43
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de marcadores metabólicos de riñón en el día 168
BOLLO
creatinina
PBS
20 0,3
ISIS 142082
24 0,2
ISIS 404173
21 0,2
ISIS 446431
19 0,3

Ejemplo 16: Medición de la vida media de oligonucleótido antisentido en hígado de ratón CD1
Ratones CD1 se trataron con los oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de estudios descritos en el Ejemplo 14, y la vida media de oligonucleótidos, así como el tiempo transcurrido para la degradación de oligonucleótidos y la eliminación desde el hígado se evaluó.
Tratamiento
Grupos de diez ratones cada uno CD1 se inyectaron por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas con 50 mg/kg de ISIS 142082, ISIS 446431, ISIS 404173 o ISIS 409826. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados 3 días y 56 días después de la dosis final. Los hígados se recogieron para su análisis.
Medición de la concentración de oligonucleótido
Se midió la concentración del oligonucleótido de longitud completa. El método utilizado es una modificación de métodos publicados previamente (Leeds et al, 1996; Geary et al, 1999) que constan de una extracción de fenolcloroformo (líquido-líquido) seguida de una extracción en fase sólida. Un estándar interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado de 27-mer 2'-O-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aquí como SEQ ID NO: 50) se añadió antes de la extracción. Concentraciones de la muestra de tejido se calcularon utilizando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1,14 mg/g. Vidas medias se calcularon entonces utilizando el software WinNonlin (Pharsight).
Los resultados se presentan en la Tabla 44. Los oligonucleótidos antisentido con vidas medias dentro de 11-34 días fueron elegidos para estudios posteriores.
Tabla 44
Concentración de longitud completa de oligonucleótido (mg/g) y vida media (días) de oligonucleótido en hígado de ratón CD1
Días
Conc. de cuerpo entero. (Mg/g) Vida media (días)
142082
3 265 19,8
56
42
446431
3 293 19,6
56
45
404173
3 281 14,8
56
24
409826
3 304 18,4
56
41

Ejemplo 17: Efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a PTP1B humana en monos cynomolgus
Monos cynomolgus se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los Ejemplos 15 y 16. Eficacia y tolerabilidad de oligonucleótido antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y el riñón, se evaluaron.
Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un período de tiempo de 30 días, durante el cual los paneles estándar de la química del suero y la hematología, el examen de muestras de heces para huevos y parásitos, y una prueba de la tuberculosis, se llevaron a cabo para excluir monos anormales o enfermos.
Seis grupos asignados aleatoriamente de tres monos cynomolgus machos y dos hembras se inyectaron por vía subcutánea tres veces por semana durante la primera semana, y posteriormente, una vez a la semana durante las próximas 12 semanas, ya sea con 8 mg/kg o 40 mg/kg de ISIS 142082, ISIS 446431 o ISIS 404173. Un grupo de monos cynomolgus con tres machos y dos hembras se inyectaron por vía subcutánea tres veces por semana durante la primera semana, y posteriormente, una vez a la semana para las próximas 12 semanas con 40 mg/kg de ISIS 409826. Un grupo de control de monos cynomolgus con tres machos y dos hembras se inyectó por vía subcutánea tres veces por semana durante la primera semana, y posteriormente, una vez a la semana durante las próximas 12 semanas con PBS. Sacrificios terminales de todos los grupos se llevaron a cabo 48 horas después de la última dosis, en el día 93.
Durante el período de estudio, se observaron los monos diariamente para detectar signos de enfermedad o angustia. Cualquier animal que muestra los efectos adversos para el tratamiento se retiró y se refirió al veterinario y Director del Estudio.
Estudios de inhibición
Análisis de ARN
Se extrajo ARN de hígado y los tejidos adiposos abdominales para análisis en tiempo real PCR de PTP1B utilizando el conjunto de cebadores de sonda 1 (secuencia delantera GACCAGCTGCGCTTCTCCTA, designada aquí como SEQ ID NO: 51; secuencia inversa CAGAGGAGTCCCCCATGATG, designada aquí como SEQ ID NO: 52; secuencia de la sonda TTGGCTGTGATCGAAGGTGCCAAA, designada aquí como SEQ ID NO: 53) o el conjunto de cebadores de sonda 2 (secuencia delantera GGGCCCTTTGCCTAACACA, designada aquí como SEQ ID NO: 54; secuencia inversa CGACACCCCTGCTTTTCTG, designada aquí como SEQ ID NO: 55; secuencia de sonda CGGTCACTTTTGGGAGATGGTGTGG, designada aquí como SEQ ID NO: 56), cada una dirigida a diferentes regiones del ARNm de PTP1B. Los resultados se presentan como porcentaje de reducción de PTP1B mARN, con respecto al control de PBS, normalizada con RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla 45, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS resultó en una reducción significativa de PTP1B mARN en comparación con el control de PBS. El tratamiento con ISIS 404173 causó la reducción de los niveles de PTP1B de mARN similar a la del tratamiento con ISIS 142082.
Tabla 45
La inhibición de PTP1B mARN en el hígado de mono cynomolgus y tejido graso relativo al control PBS
ISIS Nº
Dosis (mg/kg) % de inhibición en el hígado (conjunto de sonda 1) % de inhibición en el hígado (conjunto de sonda 2) % de inhibición en grasa (conjunto de sonda 1) % de inhibición en grasa (conjunto de sonda 2)
409826
40 38 45 17 21
142082
8 12 14 13 16
40
46 48 34 28
446831
8 0 8 6 1
40
8 18 14 12
404173
8 4 13 8 4
40
26 22 38 31
Análisis de proteínas
El tejido se extrae de hígado para la medición de los niveles de proteína PTP1B mediante análisis de transferencia western. Específicamente, las muestras de proteína PTP1B de monos tratados con ISIS 404173 se compararon con los tratados con ISIS 142082. Los resultados se presentan en las Tablas 46, 47 y 48 expresados como porcentaje de reducción en comparación con los niveles de control. Los niveles de PTP1B se normalizaron contra los niveles de proteína total, así como contra una proteína expresada constitutivamente, IR-β. El tratamiento con ISIS 404173 causó una mayor reducción de la proteína en el hígado PTP1B a la del tratamiento con ISIS 142082 en la dosis más baja de 8 mg/kg (Tabla 47).
Tabla 46 Tabla 47
Reducción del nivel de proteína PTP1B después del tratamiento con ISIS 404173 en el hígado de mono cynomolgus
Dosis (mg/kg)
% de inhibición (normalizado a la proteína total) % de inhibición (normalizado a IR-P)
8
49 42
40
67 66
Reducción del nivel de proteína PTP1B después del tratamiento con ISIS 404173 o ISIS 142082 a 8 mg/kg en el hígado de mono cynomolgus
ISIS No
% de inhibición (normalizado a la proteína total) % de inhibición (normalizado a IR-β)
142082
20 4
404173
33 27
Tabla 48
Reducción del nivel de proteína PTP1B después del tratamiento con ISIS 404173 o ISIS 142082 a 40 mg/kg en el hígado de mono cynomolgus
ISIS No
% de inhibición (normalizado a la proteína total) % de inhibición (normalizado a IR-β)
142082
65 63
404173
60 56
Estudios de tolerancia
Mediciones de peso corporal y de órganos
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la salud general de los animales, los pesos corporales y de órganos se midieron después del sacrificio terminal. Los pesos corporales se midieron y se compararon con los de los animales de control de PBS. Los pesos de los órganos se midieron y los pesos de los grupos de tratamiento se compararon con los correspondientes pesos de control de PBS. Los datos se presentan en la Tabla 49. El tratamiento con ISIS 142082 causó aumentos en el peso del hígado y del riñón en la dosis más alta.
Tabla 49
Pesos corporales y peso de los órganos finales en el mono cynomolgus relativos al control
Dosis (mg/kg)
Peso corporal (kg) Riñón (g) Hígado (g) Bazo (g) Músculo de gastrocnemio (g)
PBS
- 2,2 9,6 10,5 2,3 10,6
409826
40 2,3 14,0 18,5 6,0 8,8
142082
8 2,3 10,6 13,0 3,7 9,5
40
2,2 20,9 17,7 7,0 9,0
446431
8 2,3 11,6 12,7 4,8 10,2
40
2,3 15,9 16,1 9,6 7,7
404173
8 2,3 11,6 12,8 4,8 11,1
40
2,2 14,8 15,5 3,7 8,7
Función del hígado
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, las muestras de sangre se recogieron de todos los grupos de estudio 7 días antes del inicio del tratamiento, así como en los días 30, 58, y 93 del período de tratamiento. Las muestras de sangre se recogieron en tubos sin anticoagulante para la separación de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 min y después se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente) para obtener el suero.
Los niveles de transaminasas se midieron usando un analizador de química NEO Toshiba 200FR (Toshiba Co., Japón). Los niveles plasmáticos de ALT (transaminasa de alanina) y AST (transaminasa de aspartato) se midieron y los resultados se presentan en las Tablas 50 y 51, expresados en IU/L. La fosfatasa alcalina, que se sintetiza en cantidades incrementadas por las células hepáticas dañadas y también es un marcador de la enfermedad del hígado y se midió de manera similar, y los datos se presentan en la Tabla 52. Los niveles de AST, ALT y fosfatasa alcalina en todos los grupos de tratamiento eran similares a los del grupo de control PBS.
Proteína C-reactiva (PCR), que se sintetiza en el hígado y que sirve como un marcador de la inflamación, también se midió de manera similar, y los datos se presentan en la Tabla 53. El tratamiento con ISIS 142082 e ISIS 409826 en la dosis más alta dio lugar a altos niveles de PCR, lo que sugiere la inflamación del hígado.
La bilirrubina es también un marcador metabólico del hígado y se midió de manera similar y se presenta en la Tabla 54, expresada en mg/dL. Se encontró que los niveles de bilurubina de todos los grupos de tratamiento eran similares a los del grupo de control PBS. Gammaglutamiltransferasa (GGT) es una enzima producida en el hígado y es un marcador de laboratorio útil de daño hepático temprano o enfermedad colestática (Betro, MG et al, Am J. Clin Pathol 60: 672-8,1973). Los niveles de GGT se midieron y los resultados se presentan en la Tabla 55, y no demuestran ninguna diferencia en el control de PBS y los grupos de tratamiento.
Tabla 50
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en ALT (UI/L) en el suero de mono cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 37 44 42 35
409826
40 39 51 86 74
142082
8 37 39 45 36
40
49 62 59 69
446431
8 52 54 67 86
40
38 58 87 99
404173
8 34 50 41 45
40
44 50 63 73
Tabla 51
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de AST (UI/L) en el suero de mono cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
40 49 55 44
409826
40 48 53 73 59
142082
8 44 45 49 42
40
54 70 72 69
446431
8 57 43 48 50
40
41 60 63 81
404173
8 44 53 57 59
40
46 65 71 74
Tabla 52 Tabla 53
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de la fosfatasa alcalina (IU/L) en el suero de mono cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 784 834 1021 838
409826
40 728 883 1178 981
142082
8 718 739 788 688
40
666 656 711 774
446431
8 742 745 885 908
40
778 759 768 735
404173
8 888 957 1135 1155
40
931 958 1135 1263
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de PCR (mg/l) en plasma de mono cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
1,0 1,8 1,4 1,2
409826
40 1,0 4,3 4,8 4,8
142082
8 0,8 1,2 0,9 1,0
40
0,8 2,6 3,4 12,1
446431
8 1,4 1,4 0,9 1,1
40
0,8 2,4 2,2 6,7
404173
8 1,4 1,9 1,5 1,8
40
3,1 1,6 1,2 1,6
Tabla 54
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la bilirrubina (mg/dL) en plasma de mono cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 0,19 0,20 0,20 0,17
409826
40 0,17 0,13 0,13 0,10
142082
8 0,17 0,18 0,16 0,14
40
0,16 0,13 0,13 0,08
446431
8 0,21 0,17 0,18 0,15
40
0,19 0,18 0,15 0,12
404173
8 0,23 0,19 0,20 0,16
40
0,22 0,15 0,14 0,13
Tabla 55
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en GGT (UI/l) en plasma de mono cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 65 74 79 71
409826
40 84 86 94 87
142082
8 63 67 68 62
40
67 72 71 61
446431
8 60 62 62 63
40
61 58 62 60
404173
8 57 66 66 68
40
56 63 69 79
Función del riñón
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, las muestras de sangre se recogieron de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recogieron en tubos sin anticoagulante para la separación de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 min y después se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente) para obtener el suero. Los niveles de BUN y creatinina se midieron 7 días antes del inicio del tratamiento, así como en los días 30, 58 y 93 del periodo de tratamiento usando un analizador de química NEO Toshiba 200FR (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en las Tablas 56 y 57, expresados en mg/dL. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS no tuvo efectos adversos en cualquiera de BUN o los niveles de creatinina.
Tabla 56
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de BUN en suero (mg/dL) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 28 28 25 28
409826
40 32 30 28 32
142082
8 26 25 24 26
40
28 28 25 25
446431
8 28 27 25 26
40
28 27 25 28
404173
8 28 30 24 27
40
28 24 25 23
Tabla 57
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de creatinina sérica (mg/dL) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
0,83 0,88 0,94 0,78
409826
40 0,77 0,84 0,92 0,82
142082
8 0,74 0,78 0,79 0,71
40
0,72 0,80 0,86 0,73
446431
8 0,79 0,75 0,83 0,71
40
0,76 0,83 0,88 0,77
404173
8 0,81 0,91 0,87 0,82
40
0,76 0,84 0,92 0,76
Niveles de colesterol y triglicéridos
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre el metabolismo lipídico, las muestras de sangre se recogieron de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recogieron en tubos sin anticoagulante para la separación de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 min y después se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente) para obtener el suero. Las concentraciones de colesterol y triglicéridos se midieron 7 días antes del inicio del tratamiento, así como en los días 30, 58 y 93 del periodo de tratamiento usando un analizador de química NEO Toshiba 200FR (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en las Tablas 58 y 59, expresados en mg/dL. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS no tuvo efectos adversos en cualquiera de los niveles de colesterol o de triglicéridos.
Tabla 58 Tabla 59
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de colesterol en suero (mg/dL) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 135 163 162 143
409826
40 153 150 140 116
142082
8 116 151 159 141
40
110 140 138 128
446431
8 125 144 141 133
40
93 99 95 81
404173
8 123 147 149 136
40
135 135 125 124
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de triglicéridos en suero (mg/dL) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 47 55 45 54
409826
40 30 29 33 42
142082
8 23 31 37 32
40
28 28 35 42
446431
8 24 46 34 33
40
31 44 47 56
404173
8 28 38 25 28
40
30 38 45 34
Hematología
Para evaluar cualquier efecto inflamatorio de oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus, muestras de sangre fueron de aproximadamente 0,5 ml de sangre se recogió de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contienen la sal de potasio de EDTA. Se analizaron las muestras para recuento de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC), el recuento de plaquetas y el contenido de hemoglobina, utilizando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, EE.UU.). Los datos se presentan en las Tablas 60-63. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS no alteró significativamente el recuento de células de sangre o los niveles de hemoglobina, en comparación con el control.
Tabla 60
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de WBC (x 103/µl) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 11,6 12,6 11,1 8,9
409826
40 12,4 12,7 15,3 10,8
142082
8 11,3 15,2 12,8 9,7
40
11,9 13,2 12,5 8,5
446431
8 9,7 13,4 12,7 9,3
40
10,7 11,5 11,9 10,2
404173
8 14,9 18,9 14,9 11,8
40
11,1 14,2 12,9 10,8
Tabla 61 Tabla 62
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido de RBC (x 106/ Ml) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
5,5 5,6 5,8 5,1
409826
40 5,6 5,8 6,1 5,6
142082
8 5,4 5,4 5,6 5,2
40
5,7 5,6 5,8 5,5
446431
8 5,5 5,3 5,5 5,4
40
5,5 5,4 5,8 5,3
404173
8 5,9 5,9 6,1 5,7
40
5,1 5,4 5,5 5,5
Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en las plaquetas (x 103/µl) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 592 555 571 516
409826
40 536 493 400 338
142082
8 439 477 349 284
40
461 454 401 263
446431
8 438 397 359 282
40
516 337 369 323
404173
8 489 491 420 355
40
520 470 389 316
Tabla 63
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de hemoglobina (g/dL) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 12,5 12,8 13,1 11,9
409826
40 12,6 12,8 13,3 12,5
142082
8 12,3 12,5 13,0 12,2
40
12,1 12,0 12,1 11,5
446431
8 12,3 12,1 12,4 12,6
40
12,7 12,6 13,3 12,4
404173
8 12,7 13,0 13,3 12,7
40
11,6 12,3 12,4 12,6
Análisis de los factores de inflamación
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS para el análisis de complemento C3 como un factor de la inflamación, se recogió sangre de todos los animales disponibles en tubos sin anticoagulante para la separación de suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 min y después se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente) para obtener el suero. El complemento C3 se midió usando un analizador automático (Toshiba 200 analizador de química FR NEO, Toshiba co., Japón). Los datos se presentan en la Tabla 64, expresada en mg/dL. El tratamiento con ISIS 409826 resultó en niveles bajos de complemento C3, lo que indica un estado de enfermedad.
Tabla 64
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de C3 en suero (mg/dL) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día -7 Día 1 Día 30 Día 58 Día 93
PBS
- 136 138 148 149 129
409826
40 129 131 101 101 90
142082
8 126 135 126 127 111
40
133 134 106 121 111
446431
8 130 144 128 132 125
40
129 130 111 117 114
404173
8 127 136 137 136 127
40
125 134 101 103 102
Análisis de los niveles de insulina
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la glándula tiroides, se recogió sangre en los días 42, 84 y 91 a partir de animales en ayunas durante la noche en tubos tratados con EDTA. Los tubos se mantuvieron en hielo y se obtuvo plasma tras la centrifugación (3000 rpm durante 10 min a 4°C) dentro de 30 min de recogida de sangre. Los niveles de insulina se midieron usando un analizador automático (Toshiba 200 analizador de química FR NEO, Toshiba co., Japón). Los datos se presentan en la Tabla 65, expresada en ng/mL.
Tabla 65
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en los niveles de insulina en plasma (ng/ml) en monos cynomolgus
Dosis (mg/kg)
Día 42 Día 84 Día 91
PBS
- 29 26 26
409826
40 14 22 15
142082
8 8 4 8
40
8 10 10
404173
8 9 10 7
40
6 3 2
Estudios farmacocinéticos
Medición de la concentración de oligonucleótido
Se midió la concentración del oligonucleótido de longitud completa, así como la concentración de oligonucleótido total (incluyendo la forma degradada). El método utilizado es una modificación de los métodos publicados anteriormente; que consisten de una extracción de fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida de una extracción en fase sólida (Leeds et al., 1996 Geary et al., 1999). Un estándar interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado de 27-mer 2'-O-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aquí como SEQ ID NO: 50) se añadió antes de la extracción. Concentraciones de la muestra de tejido se calculan utilizando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1,14 mg/g. Los resultados se presentan en las Tablas 66 y 67, expresados como mg/g de tejido. Se calculó la relación de las concentraciones en el riñón en comparación con el hígado. El tratamiento con oligonucleótidos ISIS no dio como resultado ninguna anomalía en la relación. Los resultados indican que ISIS 404173 es un acumulador renal mejor que ISIS 142082 en la dosis más alta.
Tabla 66
Concentración de oligonucleótido total cynomolgus
(mg/g) en el hígado de mono
ISIS Nº
Dosis (mg/kg) Riñón Hígado Relación riñon/hígado
409826
40 4424 954 4,64
142082
8 1688 1044 1,62
40
6385 1774 3,60
446431
8 1323 641 2,06
40
6662 1159 5,75
404173
8 971 712 1,36
40
7180 1464 4,90
Tabla 67
Concentración de oligonucleótido de longitud completa (mg/g) en el hígado de mono cynomolgus
ISIS Nº
Dosis (mg/kg) Riñón Hígado Kidney relación/hígado
409826
40 3472 728 4,77
142082
8 1232 653 1,89
40
4103 1244 3,30
446431
8 1204 416 2,89
40
5645 846 6,67
404173
8 650 424 1,53
40
5039 1094 4,61
LISTADO DE SECUENCIAS
[0503]
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Sanjay Bhanot Susan M. Freier
<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE PTP1B
<130> BIOL0149WO
<150> 61/474.981
<151> 2011-04-13
<160> 56
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 3318
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 78001
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 4522
<212> ADN
<213> Macaca mulatta
<400> 3 <210> 4
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400>4 ttgtcgatct gctcgaactc 20
<210> 5
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 5 Sgacttgtcga tctgctcgaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 6 cccggacttg tcgatctgct 20
<210> 7
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 7 gctcccggac ttgtcgatct 20
<210> 8
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 8 ccagctcccg gacttgtcga 20
<210> 9
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 9 ggcaccttcg atcacagcca 20
<210> 10
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 10 gctccttcca ctgatcctgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 11 ggtcatgcac aggcaggttg 20
<210> 12
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 12 aggtcatgca caggcaggtt 20
<210> 13
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 13 gatcaggtca tgcacaggca 20
<210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 14 tgatcaggtc atgcacaggc 20
<210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 15 acccttggaa tgtctgagtt 20
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 16 cccataccct tggaatgtct 20
<210> 17
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 17 tcccataccc ttggaatgtc 20
<210> 18
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 18 ttcccatacc cttggaatgt 20
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 19 tattccatgg ccattgtaaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 20 ttattccatg gccattgtaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 21 tttattccat ggccattgta 20
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 22 gtttattcca tggccattgt 20
<210> 23
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 23 ggtttattcc atggccattg 20
<210> 24
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 24 tggtttattc catggccatt 20
<210> 25
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 25 atggtttatt ccatggccat 20
<210> 26
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 26 aatggtttat tccatggcca 20
<210> 27
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 27 aaatggttta ttccatggcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> ADN <220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 28 aaaatggttt attccatggc 20
<210> 29
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 29 aaaaatggtt tattccatgg 20
<210> 30
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 30 aggaggtcat ttccatggcc 20
<210> 31
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 31 ggtcatttcc atggccagag 20
<210> 32
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 32 ggaggtcatt tccatggcca 20
<210> 33
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 33 ctggtttaac ctcctatcct TGGA 24
<210> 34
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 34 cagagcagct cgctacctct ct 22
<210> 35
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 35 cagctggctc tccaccttgt tacacattat gt 32
<210> 36
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 36 ggagttcgag cagatcgaca un 21
<210> 37
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 37 ggccactcta catgggaagt c 21
<210> 38
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 38 ccatttacca agctgggcgg GGAT 24
<210> 39
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 39 tattccatgg ccattgta 18
<210> 40
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 40 ttattccatg gccattgt 18
<210> 41
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 41 tttattccat ggccattg 18
<210> 42
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 42 gtttattcca tggccatt 18
<210> 43
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 43 ggtttattcc atggccat 18
<210> 44
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 44 tggtttattc catggcca 18
<210> 45
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 45 atggtttatt ccatggcc 18
<210> 46
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 46 aatggtttat tccatggc 18
<210> 47
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 47 aaatggttta ttccatgg 18
<210> 48
<211> 16
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 48 atggtttatt CCATGG 16
<210> 49
<211> 16
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 49 tttattccat ggccat 16
<210> 50
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sintético
<400> 50 gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27
<210> 51
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 51 gaccagctgc gcttctccta 20
<210> 52
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador sintético
<400> 52 cagaggagtc ccccatgatg 20
<210> 53
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 53 ttggctgtga tcgaaggtgc caaa 24
<210> 54
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador
<400> 54 gggccctttg cctaacaca 19
<210> 55
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 55 cgacacccct gcttttctg 19
<210> 56
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 56 cggtcacttt tgggagatgg tgtgg 25

Claims (10)

  1. Reivindicaciones
    1.
    Un compuesto que comprende un oligonucleótido monocatenario modificado, en el que dicho oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en SEQ ID NO: 26, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
    un segmento de hueco que consiste en diez deoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consta de cinco nucleósidos enlazados; un segmento de ala 3' que consta de cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado de 2'-O-metoxietilo, en el que cada enlace internucleosídico de dicho oligonucleótido modificado es un enlace de fosforotioato, y en el que cada residuo de citosina de dicho oligonucleótido modificado es una 5metilocitosina.
  2. 2.
    El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto consiste en el oligonucleótido de cadena sencilla modificado.
  3. 3.
    El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto es un compuesto antisentido conjugado.
  4. 4.
    El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el compuesto comprende una sal del oligonucleótido modificado.
  5. 5.
    El compuesto de la reivindicación 4, en el que la sal es una sal de sodio o una sal de potasio.
  6. 6.
    Una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  7. 7.
    El compuesto o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso en terapia.
  8. 8.
    El compuesto o composición de la reivindicación 7 para su uso en
    a) prevenir, tratar, mejorar, ralentizar la progresión de, o retrasar la aparición de una enfermedad o condición asociada con la PTP1B en un animal; o b) prevenir o retrasar la aparición de aumento de los niveles de glucosa en sangre en un animal; c) prevenir, tratar, mejorar, o ralentizar la progresión de una enfermedad metabólica o condición.
  9. 9.
    El compuesto o composición para su uso según la reivindicación 8, en el que
    a) el animal es humano; b) el animal es un animal diabético; y/o c) los niveles de glucosa en sangre son los niveles de glucosa en plasma o niveles de glucosa en suero.
  10. 10.
    El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la enfermedad o afección es:
    a) diabetes, opcionalmente diabetes de tipo 2; o b) obesidad.
    Figura 1 * 1 animal muy alto en día 93; de otro modo el incremento era de ~3-4 veces. Figura 2 Figura 3
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