ES2830257T3 - Modulación de la expresión de la proteína de tipo angiopoyetina 3 - Google Patents

Abstract

Compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 17 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1140 a 1159 la de SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1, y en el que el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, un azúcar modificado, como mínimo, un enlace internucleosídico modificado y/o, como mínimo, una nucleobase modificada, o una sal del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Modulación de la expresión de la proteína de tipo angiopoyetina 3

Sector de la invención

En la presente memoria descriptiva, se dan a conocer procedimientos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de ARNm y proteína de tipo angiopoyetina 3 (ANGPTL3) en un animal. Además, en la presente memoria descriptiva se dan a conocer procedimientos, compuestos y composiciones que tienen un inhibidor de la ANGPTL3 para reducir enfermedades o afecciones relacionadas con ANGPTL3 en un animal. Dichos procedimientos, compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir, retrasar o mejorar una o más enfermedades cardiovasculares o síndromes metabólicos, o uno de sus síntomas, en un animal.

Estado de la técnica anterior

La diabetes y la obesidad (denominadas a veces colectivamente "diabesidad") están interrelacionadas porque se sabe que la obesidad exacerba la patología de la diabetes y más del 60 % de los diabéticos son obesos. La mayor parte de la obesidad humana se asocia con resistencia a la insulina y resistencia a la leptina. De hecho, se ha sugerido que la obesidad puede tener un impacto aún mayor en la acción de la insulina que la propia diabetes (Sindelka et al., Physiol Res., 2002, 51, 85-91). Además, se sabe que varios compuestos en el mercado para el tratamiento de la diabetes inducen aumento de peso, un efecto secundario muy indeseable para el tratamiento de esta enfermedad.

La enfermedad cardiovascular también está interrelacionada con la obesidad y la diabetes. La enfermedad cardiovascular abarca una amplia variedad de etiologías y tiene una variedad igualmente amplia de agentes causales y actores interrelacionados. Muchos agentes causales contribuyen a síntomas, tales como niveles elevados de colesterol en plasma, entre los que se incluyen el colesterol no de lipoproteínas de densidad elevada (no HDL-C, de non-high density lipoprotein cholesterol), así como otros trastornos relacionados con los lípidos. Dichos trastornos relacionados con los lípidos, denominados generalmente dislipidemia, incluyen hiperlipidemia, hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia, entre otras indicaciones. El colesterol no HDL elevado se asocia con la aterogénesis y sus secuelas, incluidas enfermedades cardiovasculares tales como arteriosclerosis, arteriopatía coronaria, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico y otras formas de cardiopatía. Estos se clasifican como los tipos de enfermedades más prevalentes en los países industrializados. De hecho, se estima que 12 millones de personas en los Estados Unidos padecen arteriopatía coronaria y, aproximadamente, 36 millones requieren tratamiento para los niveles elevados de colesterol.

La evidencia epidemiológica y experimental ha demostrado que los niveles elevados de triglicéridos circulantes (TG) pueden contribuir a la enfermedad cardiovascular y una miríada de trastornos metabólicos (Valdivielso et al., 2009, Atherosclerosis Zhang et al., 2008, Circ Res. 1; 102 (2): 250-6). Los TG derivados de fuentes exógenas o endógenas se incorporan y secretan en quilomicrones desde el intestino o en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, de very low density lipoproteins) desde el hígado. Una vez en circulación, los TG son hidrolizados por la lipoproteína lipasa (LpL) y los ácidos grasos libres resultantes pueden ser absorbidos por los tejidos locales y utilizados como fuente de energía. Debido al profundo efecto que tiene la LpL sobre los TG plasmáticos y el metabolismo en general, es de gran interés descubrir y desarrollar compuestos que afecten a la actividad de LpL.

El síndrome metabólico es una combinación de trastornos médicos que aumentan el riesgo de enfermedad cardiovascular y diabetes. Los síntomas, que incluyen presión arterial elevada, triglicéridos elevados, disminución de HDL y obesidad, tienden a aparecer conjuntamente en algunas personas. Afecta a un gran número de personas de forma agrupada. En algunos estudios, se calcula una prevalencia en los EE. UU. de hasta el 25 % de la población. El síndrome metabólico se conoce con otros nombres, tales como síndrome X (metabólico), síndrome de resistencia a la insulina, síndrome de Reaven o CHAOS. Con la prevalencia elevada de trastornos cardiovasculares y trastornos metabólicos, sigue siendo necesario mejorar los enfoques para tratar estas afecciones.

Las angiopoyetinas son una familia de factores de crecimiento secretados. Conjuntamente con sus respectivos receptores específicos de endotelio, las angiopoyetinas desempeñan un papel importante en la angiogénesis. Un miembro de la familia, la de tipo angiopoyetina 3 (también conocida como proteína de tipo angiopoyetina 3, ANGPT5, ANGPTL3 o angiopoyetina 5), se expresa predominantemente en el hígado y se cree que desempeña un papel en la regulación del metabolismo de los lípidos (Kaplan et al., J. Lipid Res., 2003, 44, 136-143). Las exploraciones de asociación de todo el genoma (GWAS, de Genome-wide association scans) que analizan el genoma en busca de variantes comunes asociadas con las concentraciones plasmáticas de HDL, LDL y triglicéridos descubrieron una asociación entre los triglicéridos y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, de single-nucleotide polymorphisms) cerca de la ANGPTL3 (Willer et al., Nature Genetics, 2008, 40 (2): 161-169). Los individuos con mutaciones homocigotas de la ANGPTL3 con pérdida de función presentan niveles bajos de todos los lípidos y lipoproteínas plasmáticos aterogénicos, tales como el colesterol total (CT) y los TG, colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), apoliproteína B (apoB), no HDL-C, así como HDL-C (Romeo et al. 2009, J Clin Invest, 119 (1): 70-79; Musunuru et al. 2010 N Engl J Med, 363: 2220-2227; Martin-Campos et al. 2012, Clin Chim Acta, 413: 552-555; Minicocci et al. 2012, J Clin Endocrino! Metab, 97: e1266-1275; Noto et al. 2012, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 32: 805-809; Pisciotta et al. 2012, Circulation Cardiovasc Genet, 5: 42-50). Este fenotipo clínico se ha denominado hipolipidemia combinada familiar (FHBL2, de familia! combined hypolipidemia). A pesar de la secreción reducida de VLDL, los individuos con FHBL2 no tienen un mayor contenido de grasa hepática. También parecen tener niveles más bajos de glucosa e insulina en plasma y, lo que es más importante, tanto la diabetes como las enfermedades cardiovasculares parecen estar ausentes en estos individuos. Hasta la fecha, no se han informado fenotipos clínicos adversos (Minicocci et al. 2013, J of Lipid Research, 54: 3481-3490). Se ha demostrado que la reducción de la ANGPTL3 conduce a una disminución de los niveles de TG, colesterol y LDL en modelos animales (Patente US13/520,997; Patente WO2011/085271). Los ratones deficientes en ANGPTL3 tienen niveles muy bajos de triglicéridos (TG) y colesterol en plasma, mientras que la sobreexpresión produce los efectos opuestos (Koishi et al. 2002; Koster 2005; Fujimoto 2006). En consecuencia, el papel potencial de la ANGPTL3 en el metabolismo de los lípidos lo convierte en una diana atractiva para la intervención terapéutica.

Hasta la fecha, las estrategias terapéuticas para tratar la enfermedad cardiometabólica dirigidas directamente a los niveles de la ANGPTL3 han sido limitadas. Se han sugerido o desarrollado previamente fragmentos de polipéptido ANGPTL3 (Patente US12/128,545), anticuerpos anti-ANGPTL3 (Patente U^s 12/001,012) e inhibidores de ácido nucleico de la ANGPTL3, incluidos los oligonucleótidos antisentido (Patente US13/520,997; Patente WO2011/085271), pero ninguno de los compuestos que están dirigidos directamente a ANGPTL3 ha sido aprobados para el tratamiento de enfermedades cardiometabólicas. En consecuencia, existe una necesidad insatisfecha de compuestos para inhibir ANGPTL3 altamente potentes y tolerables. La divulgación de la presente memoria descriptiva se refiere al descubrimiento de nuevos y muy potentes inhibidores de la expresión de la ANGPTL3 y su utilización en tratamiento.

La patente WO 2004/072046 analiza la utilización de cebadores oligonucleotídicos para amplificar una porción de la secuencia codificante de la ANGPTL3.

Características de la invención

La presente invención da a conocer un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 17 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1140 a 1159 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1, y en el que el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, un azúcar modificado, como mínimo, un enlace internucleosídico modificado y/o, como mínimo, una nucleobase modificada, o una sal del mismo.

La presente invención da a conocer, además, un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 14 nucleobases contiguas de la SEQ iD NO: 77, o una sal del mismo, en el que el oligonucleótido modificado comprende:

un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados;

un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados;

en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico, en el que, como mínimo, un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

La presente invención da a conocer, además, un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 14 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 77, o una sal del mismo, en el que el oligonucleótido modificado comprende:

un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados;

un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados;

en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico, en el que, como mínimo, un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

La presente invención da a conocer, además, una composición que comprende un compuesto u oligonucleótido modificado, según la presente invención, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención da a conocer, además, una composición que comprende un compuesto u oligonucleótido modificado, según la presente invención, para su utilización en terapia.

Características de la divulgación

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer composiciones y procedimientos para modular la expresión del ARNm y la proteína de la ANGPTL3. En determinados aspectos, la composición es un inhibidor específico de la ANGPTL3. En determinados aspectos, el inhibidor específico de la ANGPTL3 disminuye la expresión del ARNm y la proteína de la ANGPTL3.

En determinados aspectos, la composición es un inhibidor específico de la ANGPTL3. En determinados aspectos, el inhibidor específico de la ANGPTL3 es un ácido nucleico. En determinados aspectos, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En determinados aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado. Un compuesto, según la presente invención, comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19 o 20 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 77, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1, y en el que el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, un azúcar modificado, como mínimo, un enlace internucleosídico modificado y/o, como mínimo, una nucleobase modificada.

Un compuesto, según la presente invención, comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de, como mínimo, 17 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1140-1159 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1, y en el que el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, un azúcar modificado, como mínimo, un enlace internucleosídico modificado y/o, como mínimo, una nucleobase modificada.

Un compuesto, según la presente invención, comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de, como mínimo, 17 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 9715-9734 de la SEQ ID NO: 2, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1, y en el que el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, un azúcar modificado, como mínimo, un enlace internucleosídico modificado y/o, como mínimo, una nucleobase modificada.

Un compuesto, según la presente invención, comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 14 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 77, en el que el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos; (b) un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico, en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

Un oligonucleótido modificado, según la presente invención, consiste en 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en, como mínimo, 14 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 77, en el que el oligonucleótido modificado consiste en: (a) un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’, en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico, en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

En determinadas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido modificado representado por la siguiente estructura y la designación ISIS 563580. En determinadas realizaciones, el compuesto comprende el oligonucleótido modificado ISIS 563580 representado por la siguiente estructura.

Determinadas realizaciones dan a conocer una composición que comprende un compuesto u oligonucleótido modificado, según la presente invención, o una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En determinadas realizaciones, la modulación de la expresión de la ANGPTL3 se produce en una célula o tejido. En determinadas realizaciones, las modulaciones se producen en una célula o tejido de un animal. En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano. En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel del ARNm de la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de la proteína ANGPTL3. En determinadas realizaciones, se reducen los niveles de la proteína y el ARNm de la ANGPTL3. Esta reducción puede tener lugar de una manera dependiente del tiempo o dependiente de la dosis. Determinadas realizaciones dan a conocer composiciones que comprenden compuestos u oligonucleótidos modificados, según la presente invención, para su utilización en terapia. Determinadas realizaciones dan a conocer compuestos u oligonucleótidos modificados, según la presente invención, para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, estas enfermedades, trastornos y afecciones son enfermedades, trastornos y afecciones cardiovasculares y/o metabólicas. En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones y los procedimientos para terapia incluyen la administración de un inhibidor específico de la ANGPTL3 a un individuo que lo necesite.

Descripción detallada

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son únicamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la presente invención, tal como se reivindica. En la presente memoria descriptiva, la utilización del singular incluye el plural, a menos que se indique específicamente lo contrario. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la utilización de "o" significa "y/o", a menos que se indique lo contrario. Además, la utilización de la expresión "entre los o las que se incluyen" así como otras formas, tales como "que incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los títulos de las secciones que se utilizan en la presente memoria descriptiva son solo para fines organizativos y no se deben interpretar como una limitación del tema descrito.

Definiciones

A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica, y los procedimientos y técnicas de las mismas, descritas en la presente memoria descriptiva son las bien conocidas y utilizadas de manera común en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar para síntesis química y análisis químico.

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

"2’-O-metoxietilo" (también 2’-MOE y 2’-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo de la posición 2’ de un anillo de furosilo. Un azúcar modificado con 2’-O-metoxietilo es un azúcar modificado.

"Nucleótido 2’-O-metoxietílico" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado con 2’-O-metoxietilo.

"Sitio diana 3’" o "sitio de parada 3’" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 3’ de un compuesto antisentido particular.

"Sitio diana 5’" o "sitio de inicio 5’" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 5’ de un compuesto antisentido particular.

"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5’. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.

"Aproximadamente" significa dentro de ±10 % de un valor. Por ejemplo, si se indica, "un marcador puede incrementarse en, aproximadamente, un 50 %", implica que el marcador se puede incrementar entre un 45 % y un 55 %.

"Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido dirigido a ANGPTL3 es un agente farmacéutico activo.

"Región diana activa" o "región diana" significa una región a la que están dirigidos uno o más compuestos antisentido activos.

"Compuestos antisentido activos" significan compuestos antisentido que reducen los niveles del ácido nucleico diana o los niveles de la proteína.

"Adipogénesis" significa el desarrollo de células grasas a partir de preadipocitos. "Lipogénesis" significa la producción o formación de grasa, ya sea degeneración grasa o infiltración grasa.

"Adiposidad" u "obesidad" se refiere al estado de obesidad o una cantidad excesivamente elevada de grasa corporal o tejido adiposo en relación con la masa corporal magra. La cantidad de grasa corporal incluye la preocupación tanto por la distribución de la grasa por todo el cuerpo como por el tamaño y la masa de los depósitos de tejido adiposo. La distribución de la grasa corporal se puede estimar mediante mediciones de pliegues cutáneos, relaciones de circunferencia de cintura a cadera o técnicas tales como ultrasonidos, tomografía computarizada o resonancia magnética. Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades, las personas con un índice de masa corporal (IMC) de 30 o más se consideran obesas. El término "obesidad", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, incluye condiciones en las que hay un aumento de grasa corporal más allá del requisito físico como resultado de una acumulación excesiva de tejido adiposo en el cuerpo. El término "obesidad" incluye, sin constituir limitación, los siguientes estados: obesidad de inicio de la edad adulta; obesidad alimentaria; obesidad endógena o metabólica; obesidad endocrina; obesidad familiar; obesidad hiperinsulinar; obesidad hiperplásica-hipertrófica; obesidad hipogonadal; obesidad hipotiroidea; obesidad de por vida; obesidad mórbida y obesidad exógena.

"Administrado simultáneamente" se refiere a la coadministración de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración simultánea no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.

"Administrar" significa proporcionar un agente a un animal e incluye, sin constituir limitación, administrarlo por un profesional médico y autoadministrarse.

"Agente" significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. "Primer agente" significa un compuesto terapéutico de la presente invención. Por ejemplo, un primer agente puede ser un oligonucleótido antisentido dirigido a la ANGPTL3. "Segundo agente" significa un segundo compuesto terapéutico de la presente invención (por ejemplo, un segundo oligonucleótido antisentido dirigido a ANGPTL3) y/o un compuesto terapéutico que no está relacionado con la ANGPTL3.

"Mejoría" se refiere a una disminución de, como mínimo, un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. La severidad de los indicadores se puede determinar mediante mediciones subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la materia.

"ANGPTL3" significa cualquier ácido nucleico o proteína de la ANGPTL3.

"Expresión de la ANGPTL3" significa el nivel de ARNm transcrito a partir del gen que codifica la ANGPTL3 o el nivel de proteína traducida a partir del ARNm. La expresión de la ANGPTL3 se puede determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como transferencia Northern o Western.

"Ácido nucleico de la ANGPTL3" significa cualquier ácido nucleico que codifica la ANGPTL3. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un ácido nucleico de la ANGPTL3 incluye una secuencia de ADN que codifica la ANGPTL3, una secuencia de ARN transcrita a partir del ADN que codifica la ANGPTL3 (que incluye ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica la ANGPTL3. "ARNm de la ANGPTL3" significa un ARNm que codifica una proteína ANGPTL3.

"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, monos y chimpancés.

"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o una proteína diana codificada por dicho ácido nucleico diana. "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.

"Inhibición antisentido" significa reducción de niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido.

"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.

"Lipoproteína que contiene ApoB" significa cualquier lipoproteína que tiene la apolipoproteína B como su componente proteico, y se entiende que incluye LDL, VLDL, IDL y lipoproteína (a) y generalmente puede ser diana de agentes y terapias reductoras de lípidos. "LDL que contiene ApoB-100" significa LDL que contiene la isoforma de ApoB-100.

"Aterosclerosis" significa un endurecimiento de las arterias que afecta a arterias grandes y medianas y se caracteriza por la presencia de depósitos grasos. Los depósitos grasos se denominan "ateromas" o "placas", que consisten principalmente en colesterol y otras grasas, calcio y tejido cicatricial, y dañan el revestimiento de las arterias.

"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furosilo modificado mediante la formación de un puente entre dos átomos del anillo no geminales. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.

"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando así un sistema de anillo bicíclico.

"Estructura de caperuza" o "resto de caperuza terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.

"Enfermedad cardiovascular" o "trastorno cardiovascular" se refiere a un grupo de afecciones relacionadas con el corazón, los vasos sanguíneos o la circulación. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos cardiovasculares se incluyen, sin constituir limitación, aneurisma, angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular (accidente cerebrovascular), cardiopatía coronaria, hipertensión, dislipidemia, hiperlipidemia e hipercolesterolemia. "Enfermedad cardiometabólica" o "trastorno cardiometabólico" son enfermedades o trastornos que afectan tanto al sistema cardiovascular como al sistema metabólico. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos cardiometabólicos se incluyen, sin constituir limitación, diabetes y dislipidemias.

"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que, de alguna manera, es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos 2’-O-metoxietílicos es químicamente distinta a una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2’-O-metoxietílicas.

"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene, como mínimo, dos regiones químicamente distintas.

"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes a un individuo. Los dos o más agentes pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes se puede administrar a través de la misma o diferentes vías de administración. La coadministración comprende la administración paralela o secuencial.

El "colesterol" es una molécula de esterol que se encuentra en las membranas celulares de todos los tejidos animales. El colesterol debe ser transportado en el plasma sanguíneo de un animal mediante lipoproteínas que incluyen lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de densidad elevada (HDL). "Colesterol en plasma" se refiere a la suma de todas las lipoproteínas (VDL, IDL, LDL, HDL) esterificadas y/o el colesterol no esterificado presente en el plasma o suero.

"Inhibidor de la absorción de colesterol" significa un agente que inhibe la absorción de colesterol exógeno obtenido de la dieta.

"Complementariedad" significa la capacidad de emparejarse entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico. En determinadas realizaciones, la complementariedad entre el primer y el segundo ácido nucleico puede ser entre dos cadenas de ADN, entre dos cadenas de ARN o entre una cadena de ADN y una de ARN. En determinadas realizaciones, algunas de las nucleobases de una cadena coinciden con una base de enlace de hidrógeno complementaria de la otra cadena. En determinadas realizaciones, todas las nucleobases de una cadena se emparejan con una base de enlace de hidrógeno complementaria de la otra cadena. En determinadas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un segundo ácido nucleico es un ácido nucleico diana. En determinadas de estas realizaciones, un oligonucleótido antisentido es un primer ácido nucleico y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.

"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.

"Cardiopatía coronaria (CHD, de Coronary heart disease)" significa un estrechamiento de los pequeños vasos sanguíneos que suministran sangre y oxígeno al corazón, que a menudo es el resultado de la aterosclerosis.

"Desoxirribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2’ de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos se pueden modificar con cualquiera de una variedad de sustituyentes.

La "diabetes mellitus" o "diabetes" es un síndrome caracterizado por un metabolismo desordenado y un nivel de azúcar en sangre anormalmente elevado (hiperglucemia) como resultado de niveles insuficientes de insulina o sensibilidad reducida a la insulina. Los síntomas característicos son producción excesiva de orina (poliuria) debido a niveles elevados de glucosa en sangre, sed excesiva y aumento de la ingesta de líquidos (polidipsia) que intenta compensar el aumento de la micción, visión borrosa debido a los efectos de la elevada glucosa en sangre sobre la óptica del ojo, pérdida inexplicable de peso y letargo.

"Dislipidemia diabética" o "diabetes tipo 2 con dislipidemia" significa una afección caracterizada por diabetes tipo 2, HDL-C reducido, triglicéridos elevados y partículas LDL densas pequeñas elevadas.

"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero que es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.

"Dislipidemia" se refiere a un trastorno del metabolismo de lípidos y/o lipoproteínas, que incluye sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Las dislipidemias se pueden manifestar por la elevación de lípidos tales como el colesterol y los triglicéridos, así como por las lipoproteínas tales como el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LdL).

"Unidad de dosificación" significa una forma en la que se proporciona un agente farmacéutico, por ejemplo, píldora, comprimido u otra unidad de dosificación conocida en la técnica. En determinadas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido liofilizado. En determinadas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido reconstituido.

"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico, proporcionada en una sola administración o en un período de tiempo específico. En determinadas realizaciones, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en determinadas realizaciones en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se adapta fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden utilizar dos o más inyecciones para conseguir la dosis deseada. En determinadas realizaciones, el agente farmacéutico se administra mediante infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes. Las dosis se pueden expresar en mg/kg o g/kg.

"Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para conseguir un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.

"Completamente complementario" o "100 % de complementariedad" significa que cada nucleobase de una secuencia de nucleobases de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en una segunda secuencia de nucleobases de un segundo ácido nucleico. En determinadas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.

"Gápmero” significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H se sitúa entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en el que los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "segmento espaciador" y las regiones externas pueden denominarse "segmentos de ala".

"De espaciador ampliado" significa un compuesto quimérico antisentido que tiene un segmento espaciador de 12 o más 2’-desoxirribonucleósidos contiguos situados entre los segmentos de ala 5’ y 3’, que tienen de uno a seis nucleósidos, e inmediatamente adyacentes a los mismos.

La "glucosa" es un monosacárido utilizado por las células como fuente de energía e intermedio metabólico. "Glucosa en plasma" se refiere a la glucosa presente en el plasma.

"C-Lipoproteína de densidad elevada (HDL-C)" significa colesterol asociado con partículas de lipoproteína de densidad elevada. La concentración de HDL-C en suero (o plasma) generalmente se cuantifica en mg/dl o nmol/l. "HDL-C en suero" y "HDL-C en plasma" significan HDL-C en suero y plasma, respectivamente.

"Inhibidor de la HMG-CoA reductasa" significa un agente que actúa mediante la inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa, tal como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina y simvastatina.

"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana.

"Hipercolesterolemia" significa una afección caracterizada por colesterol o colesterol circulante (plasma), colesterol-LDL y colesterol-VLDL elevados, según las directrices del Informe del Panel de Expertos del Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol (NCEP) de Detección, Evaluación del Tratamiento de colesterol elevado en adultos (véase, Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).

La "hiperlipidemia" o "hiperlipemia" es una afección caracterizada por lípidos séricos o lípidos circulantes (plasmáticos) elevados. Esta afección manifiesta una concentración anormalmente elevada de grasas. Las fracciones de lípidos en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad y triglicéridos.

"Hipertrigliceridemia" significa una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos.

"Identificar" o "seleccionar un individuo que tiene una enfermedad metabólica o cardiovascular" significa identificar o seleccionar un individuo que ha sido diagnosticado con una enfermedad metabólica, una enfermedad cardiovascular o un síndrome metabólico o, identificar o seleccionar un individuo que tenga algún síntoma de una enfermedad metabólica, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico entre los que se incluyen, sin constituir limitación, hipercolesterolemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de la resistencia a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina, peso corporal superior al normal y/o contenido de grasa corporal superior al normal o cualquier combinación de los mismos. Dicha identificación se puede conseguir mediante cualquier procedimiento, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, ensayos o evaluaciones clínicas estándar, tales como medir el colesterol sérico o circulante (plasma), medir la glucosa en sangre sérica o circulante (plasma), medir los triglicéridos séricos o circulantes (plasma), medir la presión arterial, medir el contenido de grasa corporal, medir el peso corporal y similares.

"Identificar" o "seleccionar un individuo diabético" significa identificar o seleccionar un individuo que ha sido identificado como diabético o identificar o seleccionar un individuo que tiene algún síntoma de diabetes (tipo 1 o tipo 2) tal como, sin constituir limitación, tener una glucosa en ayunas de, como mínimo, 110 mg/dl, glucosuria, poliuria, polidipsia, aumento de la resistencia a la insulina y/o disminución de la sensibilidad a la insulina.

"Identificar" o "seleccionar un individuo obeso" significa identificar o seleccionar un individuo que ha sido diagnosticado como obeso o identificar o seleccionar un individuo con un IMC superior a 30 y/o una circunferencia de cintura superior a 102 cm en hombres o superior a 88 cm en mujeres.

"Identificar" o "seleccionar un individuo que tiene dislipidemia" significa identificar o seleccionar un individuo diagnosticado con un trastorno del metabolismo de lípidos y/o lipoproteínas, entre los que se incluyen la sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Las dislipidemias se pueden manifestar por la elevación de lípidos, tales como el colesterol y los triglicéridos, así como por las lipoproteínas, tales como el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL).

"Identificar" o "seleccionar un individuo que tiene una mayor adiposidad" significa identificar o seleccionar un individuo que tiene una mayor cantidad de grasa corporal (o adiposidad) que incluye la preocupación por la distribución de la grasa por todo el cuerpo o el tamaño y la masa de los depósitos de tejido adiposo o por ambas. La distribución de la grasa corporal se puede estimar mediante mediciones de pliegues cutáneos, relaciones de circunferencia de cintura a cadera o técnicas tales como ultrasonido, tomografía computarizada o resonancia magnética. Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades, las personas con un índice de masa corporal (IMC) de 30 o más se consideran obesos.

"Resultado cardiovascular mejorado" significa una reducción en la aparición de eventos cardiovasculares adversos, o del riesgo de los mismos. Entre los ejemplos de eventos cardiovasculares adversos se incluyen, sin constituir limitación, muerte, reinfarto, accidente cerebrovascular, shock cardiogénico, edema pulmonar, paro cardíaco y arritmia auricular.

"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.

"Individuo", "sujeto" o "animal" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia. "Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o la actividad.

La "resistencia a la insulina" se define como la condición en la que las cantidades normales de insulina son inadecuadas para producir una respuesta normal de insulina de las células, por ejemplo, células grasas, musculares y/o hepáticas. La resistencia a la insulina en las células grasas da como resultado la hidrólisis de los triglicéridos almacenados, lo que eleva los ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo. La resistencia a la insulina en el músculo reduce la absorción de glucosa, mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de glucosa, y ambos efectos sirven para elevar la glucosa en sangre. Los niveles plasmáticos elevados de insulina y glucosa debido a la resistencia a la insulina conducen frecuentemente al síndrome metabólico y diabetes tipo 2.

La "sensibilidad a la insulina" es una medida de la eficacia con la que un individuo procesa la glucosa. Un individuo que tiene una elevada sensibilidad a la insulina procesa eficazmente la glucosa mientras que un individuo con baja sensibilidad a la insulina no procesa eficazmente la glucosa.

"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.

"Administración intravenosa" significa administración en una vena.

"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes que están unidos por enlace entre sí.

"Reducción de lípidos" significa una reducción de uno o más lípidos en un individuo. La reducción de lípidos puede tener lugar con una o más dosis a lo largo del tiempo.

"Agente reductor de lípidos" significa un agente, por ejemplo, un modulador específico de la ANGPTL3, proporcionado a un individuo para conseguir una disminución de lípidos en el individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un agente reductor de lípidos a un individuo para reducir uno o más de apoB, apoC-III, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no HDL-C, triglicéridos, partículas LDL pequeñas y densas y Lp (a) en un individuo.

"Terapia de reducción de lípidos" significa un régimen terapéutico proporcionado a un individuo para reducir uno o más lípidos en un individuo. En determinadas realizaciones, se proporciona una terapia de reducción de lípidos para reducir uno o más de apoB, apoC-III, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no HDL-C, triglicéridos, partículas LDL pequeñas y densas. y Lp (a) en un individuo.

"Lipoproteína", tal como VLDL, LDL y HDL, se refiere a un grupo de proteínas que se encuentran en el suero, plasma y linfa y son importantes para el transporte de lípidos. La composición química de cada lipoproteína difiere en que la HDL tiene una mayor proporción de proteína que de lípido, mientras que la VLDL tiene una menor proporción de proteína que de lípido.

"Colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C)" significa colesterol transportado en partículas de lipoproteínas de baja densidad. La concentración de LDL-C en suero (o plasma) generalmente se cuantifica en mg/dl o nmol/l. "LDL-C sérico" y "LDL-C plasmático" significan LDL-C en el suero y el plasma, respectivamente.

Los "principales factores de riesgo" se refieren a factores que contribuyen a un elevado riesgo de una enfermedad o afección en particular. En determinadas realizaciones, entre los principales factores de riesgo de cardiopatía coronaria se incluyen, sin constituir limitación, tabaquismo, hipertensión, HDL-C bajo, antecedentes familiares de cardiopatía coronaria, edad y otros factores dados a conocer en la presente memoria descriptiva.

"Trastorno metabólico" o "enfermedad metabólica" se refiere a una afección caracterizada por una alteración o perturbación en la función metabólica. "Metabólico" y "metabolismo" son términos bien conocidos en la técnica y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que ocurren dentro de un organismo vivo. Entre los trastornos metabólicos se incluyen, sin constituir limitación, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo I y tipo 2), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia debida a diabetes tipo 2.

"Síndrome metabólico" significa una afección caracterizada por una agrupación de factores de riesgo cardiovascular lipídicos y no lipídicos de origen metabólico. En determinadas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica por la presencia de 3 cualesquiera de los factores siguientes: circunferencia de la cintura mayor de 102 cm en hombres o mayor de 88 cm en mujeres; triglicéridos séricos de, como mínimo, 150 mg/dl; HDL-C menos de 40 mg/dl en hombres o menos de 50 mg/dl en mujeres; presión arterial de, como mínimo, 130/85 mmHg; y glucosa en ayunas de, como mínimo, 110 mg/dl. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).

"Emparejamiento erróneo" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana.

"Dislipidemia mixta" significa una afección caracterizada por colesterol elevado y triglicéridos elevados.

"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).

"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase que no sea adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U).

"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, uno o más restos de azúcar modificados o nucleobases modificadas.

"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, uno o más restos de azúcar modificados, enlaces internucleosídicos modificados o nucleobases modificadas. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, uno o más restos de azúcar modificados o nucleobases modificadas.

"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende, como mínimo, un nucleótido modificado. "Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.

"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.

"Inhibidor de MTP" significa un agente que inhibe la proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos enzimática.

"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3’ a 5’.

"Resto de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2’-H) o ARN (2’-OH).

"Enfermedad del hígado graso no alcohólico" o "NAFLD" significa una afección caracterizada por una inflamación grasa del hígado que no se debe al consumo excesivo de alcohol (por ejemplo, un consumo de alcohol superior a 20 g/día). En determinadas realizaciones, la NAFLD está relacionada con la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico. La NAFLD abarca un espectro de enfermedades que van desde la simple acumulación de triglicéridos en los hepatocitos (esteatosis hepática) hasta la esteatosis hepática con inflamación (esteatohepatitis), fibrosis y cirrosis.

La "esteatohepatitis no alcohólica" (NASH) se produce por la progresión de la NAFLD más allá del depósito de triglicéridos. Se requiere un "segundo impacto" capaz de inducir necrosis, inflamación y fibrosis para el desarrollo de NASH. Los candidatos para el segundo impacto se pueden agrupar en categorías amplias: factores que causan un aumento del estrés oxidativo y factores que promueven la expresión de citocinas proinflamatorias. Se ha sugerido que el aumento de los triglicéridos hepáticos conduce a un aumento del estrés oxidativo en los hepatocitos de animales y humanos, lo que indica una posible relación de causa y efecto entre la acumulación de triglicéridos hepáticos, el estrés oxidativo y la progresión de la esteatosis hepática a EHNA (Browning y Horton, 2005). J Clin Invest, 2004, 114, 147-152). La hipertrigliceridemia y la hiperlipoacidemia pueden causar acumulación de triglicéridos en tejidos periféricos (Shimamura et al., Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322, 1080-1085).

"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos de interferencia pequeños (ARNip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una sola molécula.

"Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.

"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace o modificación de nucleobase.

"Nucleósido" significa una nucleobase enlazada a un azúcar.

"Mimético de nucleósidos" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico, tales como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar bicíclicos o tricíclicos, por ejemplo, unidades de azúcar no de furanosa.

"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.

"Mimético de nucleótidos" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolínicos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster).

"Compuesto oligomérico" u "oligómero" se refiere a una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras y es capaz de hibridar con una región de una molécula de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleósidos. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos antisentido. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos quiméricos.

"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente uno de otro.

"Administración parenteral" significa la administración diferente a la de a través del tracto digestivo. La administración parenteral incluye administración tópica, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.

"Péptido" significa una molécula formada enlazando, como mínimo, dos aminoácidos mediante enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.

"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido dirigido a la ANGPTL3 es un agente farmacéutico.

"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y una solución acuosa estéril. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un medio o diluyente que no interfiere con la estructura o función del oligonucleótido. Determinados vehículos de este tipo permiten formular composiciones farmacéuticas tales como, por ejemplo, comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y pastillas para la ingestión oral por un individuo. Algunos de estos vehículos permiten formular composiciones farmacéuticas para inyección o infusión. Por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa estéril.

"Sales farmacéuticamente aceptables" significan sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no le proporcionan efectos toxicológicos no deseados.

"Enlace fosforotioato" significa un enlace internucleosídico en el que el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes por un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.

"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.

"Prevenir" se refiere a retrasar o impedir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo, desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.

"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva, que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas o condiciones.

"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintas de los efectos deseados. En determinadas realizaciones, entre los efectos secundarios se incluyen reacciones en el lugar de la inyección, anomalías en los ensayos de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar. Por ejemplo, niveles elevados de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.

"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no hibrida con una cadena complementaria.

"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad con un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, a la vez que exhibe efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.

"Estatina" significa un agente que inhibe la actividad de la HMG-CoA reductasa.

"Administración subcutánea" significa administración justo debajo de la piel.

"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.

"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcrito del ARN diana" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser la diana de compuestos antisentido.

La "región diana" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene, como mínimo, una estructura, función o característica identificable.

"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que están dirigidos uno o más compuestos antisentido. "Sitio diana 5’ " o "sitio de inicio 5’ " se refiere al nucleótido más 5’ de un segmento diana. "Sitio diana 3’" o "sitio de parada 3’" se refiere al nucleótido más 3’ de un segmento diana.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.

"Cambio terapéutico de estilo de vida" significa cambios en la dieta y el estilo de vida destinados a reducir la masa de grasa/tejido adiposo y/o el colesterol. Dicho cambio puede reducir el riesgo de desarrollar cardiopatía y puede incluir recomendaciones para la ingesta dietética de calorías diarias totales, grasas totales, grasas saturadas, grasas poliinsaturadas, grasas monoinsaturadas, carbohidratos, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como recomendaciones para la realización de actividad física.

"Triglicérido" significa un lípido o grasa neutra que consiste en glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso. "Diabetes tipo 2" (también conocida como "diabetes mellitus tipo 2" o "diabetes mellitus, tipo 2", y anteriormente llamada "diabetes mellitus de tipo 2", "diabetes no insulinodependiente (NIDDM)", "diabetes relacionada con la obesidad", o "diabetes de inicio en el adulto") es un trastorno metabólico que se caracteriza principalmente por resistencia a la insulina, deficiencia relativa de insulina e hiperglucemia.

"Tratar" se refiere a la administración de una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.

"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos. En determinadas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (Es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).

Determinados aspectos

En determinados aspectos dados a conocer en la presente memoria descriptiva, la ANGPTL3 tiene la secuencia que se establece en GenBank No. de registro NM_014495.2 (incorporada en la presente memoria descriptiva como la SEQ ID NO: 1). En determinados aspectos, la ANGPTL3 tiene la secuencia que se establece en GenBank No. de registro NT_032977.9 nucleótidos 33032001 a 33046000 (incorporada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 2).

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos que tienen una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las SEQ ID NO: 1-2.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado de 12 a 30 nucleósidos de longitud enlazados dirigidos a la ANGPTL3. La diana ANGPTL puede tener una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-2.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de, como mínimo, 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1140 a 1159 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1. En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10, como mínimo, 11, como mínimo, 12, como mínimo, 13, como mínimo, 14, como mínimo, 15, como mínimo, 16, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1140 a 1159 de la SEQ ID NO: 1.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases complementaria a las nucleobases 1140 a 1159 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de, como mínimo, 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1907 a 1926 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1. En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10, como mínimo, 11, como mínimo, 12, como mínimo, 13, como mínimo, 14, como mínimo, 15, como mínimo, 16, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19, o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1907 a 1926 de la SEQ ID NO: 1.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases complementaria a las nucleobases 1907 a 1926 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de, como mínimo, 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 147 a 162 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1. En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10, como mínimo, 11, como mínimo, 12, como mínimo, 13, como mínimo, 14, como mínimo, 15 o 16 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 147 a 162 de la SEQ ID NO: 1. En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases complementaria a las nucleobases 147 a 162 de la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en de 18 a 24, de 19 a 22 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleósidos enlazados o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene 20 nucleósidos enlazados de longitud.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de la SEQ ID NO: 1.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10, como mínimo, 11, como mínimo, 12, como mínimo, 13, como mínimo, 14, como mínimo, 15, como mínimo, 16, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19 o 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO:

15-27, 30-73, 75-85, 87-232, 238, 240-243, 245-247, 249-262, 264-397, 399-469, 471-541, 543-600, 604-760, 762-819, 821-966, 968-971, 973-975, 977-990, 992-1110, 1112-1186, 1188-1216, 1218-1226, 1228-1279, 1281-1293, 1295-1304, 1306-1943, 1945-1951, 1953-1977, 1979-1981, 1983-2044, 2046-2097, 2099-2181, 2183-2232, 2234-2238, 2240-2258, 2260-2265, 2267-2971, 2973-2976, 2978-4162, 4164-4329, 4331-4389, 4391-4394, 4396-4877.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10, como mínimo, 11, como mínimo, 12, como mínimo, 13, como mínimo, 14, como mínimo, 15, como mínimo, 16, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19 o 20 nucleobases contiguas de las secuencias de nucleobase de las SEQ ID NO: 77.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10, como mínimo, 11, como mínimo, 12, como mínimo, 13, como mínimo, 14, como mínimo, 15, como mínimo, 16, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19 o 20 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 20.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10, como mínimo, 11, como mínimo, 12, como mínimo, 13, como mínimo, 14, como mínimo 15, o 16 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 110.

En determinados aspectos de la divulgación, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % de complementariedad con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-2, tal como se mide sobre la totalidad del oligonucleótido modificado.

En determinados aspectos, el compuesto dado a conocer en la presente memoria descriptiva es un oligonucleótido monocatenario. En determinadas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido modificado monocatenario. En determinadas realizaciones, como mínimo, un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado. En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato.

En determinadas realizaciones, como mínimo, un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado. En determinadas realizaciones, como mínimo, un azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En determinadas realizaciones, como mínimo, un azúcar modificado comprende un 2’-O-metoxietilo, un etilo restringido, un 3’-fluoro-HNA o un puente 4’-(CH2)n-O-2’, en el que n es 1 o 2.

En determinadas realizaciones, como mínimo, un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada. En determinadas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado con: a) un segmento espaciador que consiste en desoxinucleósidos enlazados; b) un segmento de ala 5’ que consiste en nucleósidos enlazados; y c) un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos enlazados. El segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’ y cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer oligonucleótidos modificados que consisten en de 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprenden: un segmento espaciador que consiste en desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en nucleósidos enlazados; un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos enlazados; en los que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’ y en los que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de la SEQ ID NO: 1-2, en los que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

Un compuesto o composición, según la presente invención, comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 14 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionada de la SEQ ID NO: 77, en el que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados con la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 77 y comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado es ISIS 563580. En determinadas realizaciones, ISIS 563580 se caracteriza como un gápmero 5-10-5 MOE, que tiene una secuencia de (de 5’ a 3’) GGACATTGCCAGTAATCGCA (incorporada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 77), en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato, cada citosina es una 5’-metilcitosina, cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 son nucleósidos modificados con 2’-O-metoxietilo, y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2’-desoxinucleósidos.

En determinadas realizaciones, ISIS 563580 se describe mediante la siguiente notación química: Ges Ges Aes mCes Aes Tds Tds Gds mCds mCds Ads Gds Tds Ads Ads Tes mCes Ges mCes Ae; en el que,

A = una adenina,

mC = una 5’-metilcitosina

G = una guanina,

T = una timina,

e = un nucleósido modificado con 2’-O-metoxietilo,

d = un 2’-desoxinucleósido, y

s = un enlace internucleosídico fosforotioato.

En determinadas realizaciones, ISIS 563580 se describe mediante la siguiente estructura química:

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende ISIS 563580 representado por la estructura química anterior.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases seleccionada de la SEQ ID NO: 20, en el que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos; un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados con la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 20 y comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos enlazados; en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietílico; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos o composiciones que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 110, en el que el oligonucleótido modificado comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en tres nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos enlazados; en el que el segmento de separación se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada segmento de ala comprende, como mínimo, un azúcar 2’-O-metoxietílico y, como mínimo, un azúcar cEt; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado consiste en 16 nucleósidos enlazados con la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 110 y comprende: un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5’ que consiste en tres nucleósidos enlazados; un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos enlazados; en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3’; en el que cada segmento de ala comprende, como mínimo, un azúcar 2’-O-metoxietílico y, como mínimo, un azúcar cEt; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

En determinadas realizaciones, los compuestos y composiciones inhiben la expresión de la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones inhiben la ANGPTL3 en, como mínimo, un 5 %, como mínimo, un 10 %, como mínimo, un 20 %, como mínimo, un 30 %, como mínimo, un 35 %, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, un 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 % o, como mínimo, un 95 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 50 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 55 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 60 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 65 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 70 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 75 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 80 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 85 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 90 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido modificado reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 95 %.

En determinadas realizaciones, los compuestos y composiciones reducen uno o más de triglicéridos, colesterol LDL, colesterol no HDL, colesterol VLDL, colesterol total, ApoB y ApoC-III. En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones reducen uno o más de triglicéridos, colesterol LDL, colesterol no HDL, colesterol VLDL, colesterol total, ApoB y ApoC-III en, como mínimo, un 5 %, como mínimo, un 10 %, como mínimo, un 20 %, como mínimo, un 30 %, como mínimo, un 35 %, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, un 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 % o, como mínimo, un 95 %.

En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones tienen una IC⁵⁰ de menos de 20 pMI, menos de 10 l¿M, menos de 8 pMI, menos de 5 pMI, menos de 2 |¿M, menos de 1 |¿M o menos de 0,8 pMI, cuando se ensayan en células humanas, por ejemplo, en la línea celular Hep3B, tal como se describe en los ejemplos 2-3 y 7-10.

En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones son eficaces por tener una viscosidad de menos de 40 cP, menos de 35 cP, menos de 30 cP, menos de 25 cP, menos de 20 cP o menos de 15 cP cuando se mide por los parámetros tal como se describen en el ejemplo 13.

En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones son altamente tolerables, tal como se demuestra por las mediciones de tolerabilidad in vivo descritas en los ejemplos. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son altamente tolerables, tal como se demuestra al tener un aumento en el valor de ALT y/o AST de no más de 4, 3, 2 o 1,5 veces respecto a los animales tratados con solución salina.

En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones comprenden una sal del oligonucleótido modificado.

En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones comprenden además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano.

En determinadas realizaciones, los compuestos y las composiciones se utilizan en terapia. En determinadas realizaciones, la terapia se utiliza para tratar, prevenir o ralentizar la progresión de una enfermedad relacionada con ANGPTL3 elevada. En determinadas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular y/o metabólica. En determinadas realizaciones, la enfermedad metabólica y/o cardiovascular incluye, sin constituir limitación, obesidad, diabetes, aterosclerosis, dislipidemia, lipodistrofia, cardiopatía coronaria, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hiperlipoacidemia o síndrome metabólico o una combinación de los mismos. La dislipidemia puede ser hiperlipidemia. La hiperlipidemia puede ser hiperlipidemia combinada, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia o tanto hipercolesterolemia como hipertrigliceridemia. La hipercolesterolemia puede ser hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH, de familia! homozygous hypercholesterolemia), hipercolesterolemia heterocigótica familiar (HeFH de familial heterozygous hypercholesterolemia). La hipertrigliceridemia puede ser síndrome de quilomicronemia familiar (FCS, de familialchylomicronemia syndrome) o hiperlipoproteinemia tipo IV. La NAFLD puede ser esteatosis hepática o esteatohepatitis. La diabetes puede ser diabetes tipo 2 o diabetes tipo 2 con dislipidemia.

En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones se designan como un primer agente y los procedimientos o utilizaciones dados a conocer en la presente memoria descriptiva comprenden además la administración de un segundo agente. En determinadas realizaciones, el primer agente y el segundo agente se administran conjuntamente. En determinadas realizaciones, el primer agente y el segundo agente se administran conjuntamente de forma secuencial o simultánea.

En determinadas realizaciones, el segundo agente es un agente hipoglucemiante. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, un cambio de estilo de vida terapéutico, un agonista de PPAR, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa (IV), un análogo de GLP-1, insulina o un análogo de insulina, un secretágogo de insulina, un inhibidor de SGLT2, un análogo de amilina humana, una biguanida, un inhibidor de la alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, metformina, sulfonilurea, rosiglitazona, meglitinida, tiazolidindiona, inhibidor de alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. La sulfonilurea puede ser acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, una glipizida, una gliburida o una gliclazida. La meglitinida puede ser nateglinida o repaglinida. La tiazolidindiona puede ser pioglitazona o rosiglitazona. La alfa-glucosidasa puede ser acarbosa o miglitol.

En determinadas realizaciones, el segundo agente es una terapia hipolipemiante. En determinadas realizaciones, entre las terapias hipolipemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, un cambio de estilo de vida terapéutico, un inhibidor de la HMG-CoA reductasa, un inhibidor de la absorción de colesterol, un inhibidor de MTP (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a MTP), un inhibidor de ApoB (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a ApoB), un inhibidor de ApoC3 (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a ApoC3), un inhibidor de PCSK9 (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a PCSK9), un inhibidor de CETP (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a CETP), fibrato, aceite beneficioso (por ejemplo, krill o aceites de pescado (por ejemplo, VascepaR), aceite de linaza, u otros aceites ricos en ácidos grasos omega-3 tales como ácido a-linolénico (ALA, de), ácido docosahexaenoico (DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA)), o cualquier combinación de los mismos. El inhibidor de la HMG-CoA reductasa puede ser atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina o simvastatina.

El inhibidor de la absorción de colesterol puede ser ezetimiba. El fibrato puede ser fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, clofibrato, gemfibrozil y similares.

En determinadas realizaciones, la administración comprende la administración parenteral.

En determinadas realizaciones, el compuesto da como resultado una reducción de los niveles de lípidos, incluidos los niveles de triglicéridos, los niveles de colesterol, la resistencia a la insulina, los niveles de glucosa o una combinación de los mismos. Uno o más de los niveles se pueden reducir independientemente en, como mínimo, un 5 %, como mínimo, un 10 %, como mínimo, un 20 %, como mínimo, un 30 %, como mínimo, un 35 %, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, un 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 % o, como mínimo, un 95 %. La administración del compuesto puede dar como resultado una mejora de la sensibilidad a la insulina o la sensibilidad a la insulina hepática. La administración del compuesto puede dar como resultado una reducción de las placas ateroscleróticas, obesidad, glucosa, lípidos, resistencia a la glucosa, colesterol o mejora de la sensibilidad a la insulina o cualquier combinación de los mismos.

También se da a conocer la utilización de un compuesto, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar, retrasar o prevenir una o más de una enfermedad metabólica o una enfermedad cardiovascular.

Determinadas realizaciones dan a conocer un kit para tratar, prevenir o mejorar una o más de una enfermedad metabólica o una enfermedad cardiovascular, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en el que el kit comprende: a) un compuesto, tal como se describe en la presente memoria descriptiva; y opcionalmente b) un agente o terapia adicional, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. El kit puede incluir además instrucciones o una etiqueta para utilizar el kit para tratar, prevenir o mejorar una o más de una enfermedad metabólica o una enfermedad cardiovascular.

Compuestos antisentido

Entre los compuestos oligoméricos se incluyen, sin constituir limitación, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.

En determinados aspectos, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3’, comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En determinados aspectos de este tipo, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3’, comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.

En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico de la ANGPTL3 tiene de 17 a 30 nucleótidos de longitud. En otras palabras, los compuestos antisentido tienen de 17 a 30 nucleobases enlazadas. En otras realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 18 a 24, de 19 a 22 o 20 nucleobases unidas. En determinadas de estas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases enlazadas de longitud, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.

En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un solo nucleósido eliminado del extremo 5’ (truncamiento 5’), o alternativamente del extremo 3’ (truncamiento 3’). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos o más nucleósidos eliminados del extremo 5’, o alternativamente puede tener dos o más nucleósidos eliminados del extremo 3’. Alternativamente, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar por todo el oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tenga uno o más nucleósidos eliminados del extremo 5’ y uno o más nucleósidos eliminados del extremo 3’.

Cuando está presente un único nucleósido adicional en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional puede ubicarse en el extremo 5’, 3’ o en la porción central del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos añadidos pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos al extremo 5’ (adición 5’), o alternativamente al extremo 3’ (adición 3’) o a la porción central, del oligonucleótido. Alternativamente, el nucleósido añadido se puede dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tenga uno o más nucleósidos añadidos al extremo 5’, uno o más nucleósidos añadidos al extremo 3’ y/o uno o más nucleósidos añadidos a la porción central. Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992), se ensayó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor grado que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, la escisión específica de la diana se consiguió utilizando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 emparejamientos erróneos.

Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100 % con el mRNA de bcl-2 y que tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.

Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) ensayaron la capacidad para detener la traducción de DHFR humano de serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobase en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases por sí solo pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.

Determinados motivos y mecanismos de compuestos antisentido

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada hacia un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo. Los compuestos antisentido quiméricos contienen normalmente, como mínimo, una región modificada para conferir mayor resistencia a la degradación de nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión hacia el ácido nucleico diana y/o mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN.

La actividad antisentido puede resultar de cualquier mecanismo que implique la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico diana, en el que la hibridación finalmente da como resultado un efecto biológico. En determinadas realizaciones, se modula la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, se reduce la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana da como resultado en última instancia la degradación del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana no da como resultado la degradación del ácido nucleico diana. En determinadas de estas realizaciones, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico diana (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o mediante mecanismos que no se han aclarado. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en la presente memoria descriptiva no están limitados por un mecanismo particular.

Entre los mecanismos antisentido se incluyen, sin constituir limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la ruta RISC y entre los que se incluyen, sin constituir limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Determinados compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de estos mecanismos y/o mediante mecanismos adicionales.

Antisentido mediado por RNasa H

En determinadas realizaciones, la actividad antisentido resulta, como mínimo, en parte, de la degradación del ARN diana por la RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido monocatenarios que son "de tipo ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden, como mínimo, una porción de ADN o nucleósidos de tipo ADN pueden activar la RNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, estos compuestos antisentido comprenden, como mínimo, un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En determinadas de estas realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de RNasa H. En determinadas realizaciones, dichos compuestos antisentido son gápmeros, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En determinadas de estas realizaciones, el espaciador del gápmero comprende nucleósidos de ADN. En determinadas de estas realizaciones, el espaciador del gápmero comprende nucleósidos de tipo ADN. En determinadas de estas realizaciones, el espaciador del gápmero comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos de tipo ADN.

Determinados compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasa H se sitúa entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento espaciador sirve, generalmente, como sustrato para la escisión de endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden incluir en algunas realizaciones P-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2’ (estos nucleósidos modificados en 2’ pueden incluir 2’-MOE y 2’-O-CH3, sin constituir limitación), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (estos nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un etilo restringido). En determinadas realizaciones, los nucleósidos en las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, que incluyen, por ejemplo, restos de azúcar bicíclico y 2’-MOE, tales como etilo o LNA restringido. En determinadas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados y no modificados. En determinadas realizaciones, las alas pueden incluir diversas combinaciones de nucleósidos 2’-MOE, restos de azúcar bicíclicos tales como nucleósidos de etilo restringidos o nucleósidos LNA y 2’-desoxinucleósidos.

Cada región distinta puede comprender restos de azúcar uniformes, variantes o restos de azúcar alternos. El motivo ala-espaciador-ala se describe con frecuencia como "XYZ", donde "X" representa la longitud del ala 5’, "Y" representa la longitud del espaciador y "Z" representa la longitud del ala 3’. "X" y "Z" pueden comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternos. En determinadas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2’-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2’-desoxinucleósidos. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un gápmero descrito como "XYZ" tiene una configuración tal que el espaciador se sitúa inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5’ y 3’. De este modo, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5’ y el espaciador, o el espaciador y el ala 3’. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente memoria descriptiva puede tener un motivo gápmero. En determinadas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes. En determinadas realizaciones, "Y" está entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.

En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de la ANGPTL3 tiene un motivo gápmero en el que el espaciador consiste en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo azúcar descrito por la fórmula A siguiente:

(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z

en la que:

cada A es independientemente un nucleósido sustituido en 2’;

cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;

cada J es independientemente un nucleósido sustituido en 2’ o un 2’-desoxinucleósido;

cada D es un 2’-desoxinucleósido;

m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14; siempre que:

como mínimo, uno de m, n y r sea distinto de 0;

como mínimo, uno de w e y sea distinto de 0;

la suma de m, n, p, r y t sea de 2 a 5; y

la suma de v, w, x, y y z sea de 2 a 5.

Compuestos de ARNi

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARN de interferencia (ARNi), que incluyen compuestos de ARN bicatenario (también denominados ARN de interferencia pequeños o ARNip) y compuestos de ARNi monocatenario (o ARNmc). Dichos compuestos funcionan, como mínimo, en parte a través de la ruta RISC para degradar y/o secuestrar un ácido nucleico diana (por tanto, incluyen compuestos de microARN/miméticos de microARN). En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden modificaciones que los hacen particularmente adecuados para estos mecanismos.

i. compuestos de ARNmc

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido, incluidos los particularmente adecuados para su utilización como compuestos de ARNi monocatenario (ARNmc), comprenden un extremo terminal 5’ modificado. En determinadas de estas realizaciones, el extremo terminal 5’ comprende un resto fosfato modificado. En determinadas realizaciones, este fosfato modificado está estabilizado (por ejemplo, resistente a la degradación/escisión en comparación con el fosfato 5’ no modificado). En determinadas realizaciones, estos nucleósidos del extremo 5’ estabilizan el resto de fósforo 5’. En la técnica se pueden encontrar determinados nucleósidos 5’ terminales modificados, por ejemplo, en la Patente WO/2011/139702.

En determinadas realizaciones, el nucleósido 5’ de un compuesto de ARNmc tiene la fórmula Ilc:

en la que:

T¹ es un resto de fósforo protegido opcionalmente;

T² es un grupo de unión entre nucleósidos que une el compuesto de fórmula Ilc al compuesto oligomérico;

A tiene una de las fórmulas:

Q¹ y Q² son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ , alquinilo C²-C⁶ sustituido o N(R3)(R4);

Q³ es O, S, N(R⁵) o C(R⁶)(R⁷);

cada R³ , R⁴ , R⁵ , R6 y R⁷ es, independientemente, H, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido o alcoxilo C¹-C⁶ ;

M³ es O, S, NR¹⁴, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R1^b), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) u OC(R15)(Bx2);

R¹⁴ es H, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido;

R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷ y R¹⁸ son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido;

Bx¹ es un resto de base heterocíclica;

o si Bx² está presente, entonces Bx² es un resto de base heterocíclica y Bx¹ es H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido;

J⁴ , J⁵ , J6 y J⁷ son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido; o J⁴ forma un puente con uno de J⁵ o J⁷ , en el que dicho puente comprende de 1 a 3 grupos birradicales enlazados seleccionados entre O, S, NR¹⁹, C(R²⁰)(R²¹), C(R²⁰)=C(R²¹), C[=C(R²⁰)(R²¹)] y C(=O) y los otros dos de J⁵ , J6 y J⁷ son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido;

cada R¹⁹, R²⁰ y R²¹ es, independientemente, H, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido;

G es H, OH, halógeno u O-[C(R⁸)(R⁹)]n-[(C=O)m-X¹]j-Z;

cada R8 y R⁹ es, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ o alquilo C¹-C⁶ sustituido;

X¹ es O, S o N(E¹);

Z es H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ , alquinilo C²-C⁶ sustituido o N(E2)(E3);

E¹, E² y E³ son cada uno, independientemente, H, alquilo C¹-C⁶ o alquilo C¹-C⁶ sustituido;

n es de 1 a, aproximadamente, 6;

m es 0 o 1;

j es 0 o 1;

cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ¹, N(J¹)(J²),=NJ¹, SJ¹, N³ , CN, OC(=X²)J¹, OC(=X²)N(J¹)(J²) y C(=X²)N(J¹)(J²); X² es O, S o NJ³ ;

cada J¹, J² y J³ es, independientemente, H o alquilo C¹-C⁶ ;

cuando j es 1, entonces Z es distinto de halógeno o N(E²)(E³); y

en el que dicho compuesto oligomérico comprende de 8 a 40 subunidades monoméricas y puede hibridar con, como mínimo, una porción de un ácido nucleico diana.

En determinadas realizaciones, M³ es O, CH=CH, OCH² u OC(H)(Bx²). En determinadas realizaciones, M³ es O. En determinadas realizaciones, J⁴ , J⁵ , J6 y J⁷ son cada uno H. En determinadas realizaciones, J⁴ forma un puente con uno de J⁵ o J⁷.

En determinadas realizaciones, A tiene una de las fórmulas:

en las que:

Q¹ y Q² son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ o alcoxilo C¹-C⁶ sustituido. En determinadas realizaciones, Q¹ y Q² son cada uno H. En determinadas realizaciones, Q¹ y Q² son cada uno, independientemente, H o halógeno. En determinadas realizaciones, Q¹ y Q² es H y el otro de Q¹ y Q² es F, CH³ u OCH³.

En determinadas realizaciones, T¹ tiene la fórmula:

en la que:

Ra y Rc son cada uno, independientemente, hidroxilo protegido, tiol protegido, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, amino protegido o amino sustituido; y

Rb es O o S. En determinadas realizaciones, Rb es O y Ra y Rc son cada uno, independientemente, OCH³ , OCH²CH³ o CH(CH3)2.

En determinadas realizaciones, G es halógeno, OCH³ , OCH² F, OCHF² , OCF³ , OCH²CH³ , O(CH²)² F, OCH²CHF² , OCH²CF³ , OCH²-CH=CH² , O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R10)(R^h ), O(CH2)2-ON(R10)(R11), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11), OCH2 C(=O)-N(R10)(R11), OCH²C(=O)-N(R¹²)-(CH²)²-N(R¹⁰)(Rh ) o O(CH2)2rN(R12)-C(=NR13)[N(R10)(Rn)j, en el que R¹⁰, R¹¹, R¹² y R¹³ son cada uno, independientemente, H o alquilo C¹-C⁶. En determinadas realizaciones, G es halógeno, OCH³ , OCF³ , OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2 C(=O)-N(H)CH3, OCH2 C(=O)-N(H)-(CH²)²-N(CH³)² u OCH²-N(H)-C(=NH)NH². En determinadas realizaciones, G es F, OCH³ u O(CH²)²-OCH³. En determinadas realizaciones, G es O(CH²)²-OCH³.

En determinadas realizaciones, el nucleósido 5’ terminal tiene la fórmula lie:

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido, incluidos los particularmente adecuados para ARNmc, comprenden uno o más tipos de restos de azúcar modificados y/o restos de azúcar de origen natural dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Dichos motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar analizadas en la presente memoria descriptiva y/u otras modificaciones de azúcar conocidas.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene modificaciones uniformes de azúcar. En determinadas de estas realizaciones, cada nucleósido de la región comprende la misma modificación de azúcar de tipo ARN. En determinadas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2’-F. En determinadas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2’-OMe. En determinadas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2’-MOE. En determinadas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido cEt. En determinadas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido LNA. En determinadas realizaciones, la región uniforme constituye todo o esencialmente todo el oligonucleótido. En determinadas realizaciones, la región constituye el oligonucleótido completo excepto los nucleósidos 1-4 terminales.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más regiones de modificaciones alternas de azúcar, en las que los nucleósidos alternan entre nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un primer tipo y nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un segundo tipo. En determinadas realizaciones, los nucleósidos de ambos tipos son nucleósidos de tipo ARN. En determinadas realizaciones, los nucleósidos alternos se seleccionan entre: 2’-OMe, 2’-F, 2’-MOE, LNA y cEt. En determinadas realizaciones, las modificaciones alternas son 2’-F y 2’-OMe. Estas regiones pueden ser contiguas o pueden estar interrumpidas por nucleósidos modificados de manera diferente o nucleósidos conjugados.

En determinadas realizaciones, la región alterna de modificaciones alternas consiste cada una en un solo nucleósido (es decir, el patrón es (AB)xAy, en el que A es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un primer tipo y B es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un segundo tipo; x es 1-20 e y es 0 o 1). En determinadas realizaciones, una o más regiones alternas en un motivo alterno incluyen más de un único nucleósido de un tipo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir una o más regiones de cualquiera de los siguientes motivos de nucleósidos:

AABBAA;

ABBABB;

AABAAB;

ABBABAABB;

ABABAA;

AABABAB;

ABABAA;

ABBAABBABABAA;

BABBAABBABABAA; o

ABABBAABBABABAA;

en los que A es un nucleósido de un primer tipo y B es un nucleósido de un segundo tipo. En determinadas realizaciones, A y B se seleccionan cada uno entre 2’-F, 2’-OMe, BNA y MOE.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo alterno de este tipo también comprenden un nucleósido terminal 5’ modificado, tal como los de fórmula Ilc o lie.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo 2-2-3. Estas regiones comprenden el siguiente motivo:

-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-en el que: A es un primer tipo de nucleósido modificado;

B y C, son nucleósidos que están modificados de manera diferente que A, sin embargo, B y C pueden tener modificaciones iguales o diferentes entre sí;

x e y son de 1 a 15.

En determinadas realizaciones, A es un nucleósido modificado con 2’-OMe. En determinadas realizaciones, B y C son ambos nucleósidos modificados con 2’-F. En determinadas realizaciones, A es un nucleósido modificado con 2’-OMe y B y C son ambos nucleósidos modificados con 2’-F.

En determinadas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:

5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z

en el que:

Q es un nucleósido que comprende un resto de fosfato estabilizado. En determinadas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la fórmula Ilc o lie;

A es un primer tipo de nucleósido modificado;

B es un segundo tipo de nucleósido modificado;

D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente del nucleósido adyacente a él. De este modo, si y es 0, entonces D se debe modificar de manera diferente a B y si y es 1, entonces D se debe modificar de manera diferente a A. En determinadas realizaciones, D difiere tanto de A como de B.

X es 5-15;

Y es 0 o 1;

Z es 0-4.

En determinadas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:

5’-(Q)-(A)x-(D)z

en el que:

Q es un nucleósido que comprende un resto de fosfato estabilizado. En determinadas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la fórmula IIc o IIe;

A es un primer tipo de nucleósido modificado;

D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente de A.

X es 11-30;

Z es 0-4.

En determinadas realizaciones, A, B, C y D en los motivos anteriores se seleccionan entre: 2’-OMe, 2’-F, 2’-MOE, LNA y cEt. En determinadas realizaciones, D representa nucleósidos terminales. En determinadas realizaciones, dichos nucleósidos terminales no están diseñados para hibridar con el ácido nucleico diana (aunque uno o más podrían hibridar por casualidad). En determinadas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es adenina, independientemente de la identidad de la nucleobase en la posición correspondiente del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es timina.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido, incluidos los particularmente adecuados para su utilización como ARNmc, comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleosídicos modificados uniformemente. En determinadas de estas realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está enlazada uniformemente mediante enlaces internucleosídicos fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido está enlazado uniformemente mediante enlaces internucleosídicos fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona entre fosfodiéster y fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona entre fosfodiéster y fosforotioato y, como mínimo, un enlace internucleosídico es fosforotioato.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende, como mínimo, 6 enlaces internucleosídicos fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende, como mínimo, 8 enlaces internucleosídicos fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende, como mínimo, 10 enlaces internucleosídicos fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende, como mínimo, un bloque de, como mínimo, 6 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende, como mínimo, un bloque de, como mínimo, 8 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende, como mínimo, un bloque de, como mínimo, 10 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende, como mínimo, un bloque de, como mínimo, 12 enlaces internucleosídicos fosforotioato consecutivos. En determinadas de estas realizaciones, como mínimo, uno de estos bloques está ubicado en el extremo 3’ del oligonucleótido. En determinadas de estas realizaciones, como mínimo, uno de estos bloques está ubicado dentro de los 3 nucleósidos del extremo 3’ del oligonucleótido.

Los oligonucleótidos que tienen cualquiera de los diversos motivos de azúcar descritos en la presente memoria descriptiva pueden tener cualquier motivo de enlace. Por ejemplo, los oligonucleótidos, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, los descritos anteriormente, pueden tener un motivo de enlace seleccionado entre los de la siguiente tabla, sin constituir limitación:

ii. Compuestos de ARNip

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARNi bicatenario (ARNip). En estas realizaciones, una o ambas cadenas pueden comprender cualquier motivo de modificación descrito anteriormente para ARNmc. En determinadas realizaciones, los compuestos de ARNmc pueden ser ARN sin modificar. En determinadas realizaciones, los compuestos de ARNip pueden comprender nucleósidos de ARN no modificados, pero enlaces internucleosídicos modificados.

Varias realizaciones se refieren a composiciones bicatenarias en las que cada cadena comprende un motivo definido por la ubicación de uno o más nucleósidos modificados o no modificados. En determinadas realizaciones, se dan a conocer composiciones que comprenden un primer y un segundo compuesto oligomérico que hibridan total o, como mínimo, parcialmente para formar una región dúplex y que además comprenden una región que es complementaria e hibrida con un ácido nucleico diana. Es adecuado que dicha composición comprenda un primer compuesto oligomérico que es una cadena antisentido que tiene complementariedad total o parcial con una diana de ácido nucleico y un segundo compuesto oligomérico que es una cadena sentido que tiene una o más regiones de complementariedad y que forma, como mínimo, una región dúplex con el primer compuesto oligomérico.

Las composiciones de varias realizaciones modulan la expresión génica mediante la hibridación con un ácido nucleico diana, dando como resultado la pérdida de su función normal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es la ANGPTL3. En determinada realización, la degradación de la ANGPTL3 diana se facilita mediante un complejo RISC activado que se forma con las composiciones dadas a conocer en la presente memoria descriptiva.

Varias realizaciones se refieren a composiciones bicatenarias en las que una de las cadenas es útil, por ejemplo, para influir en la carga preferencial de la cadena opuesta en el complejo RISC (o de escisión). Las composiciones son útiles para dirigirse a moléculas de ácido nucleico seleccionadas y modular la expresión de uno o más genes. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención hibridan con una porción de un ARN diana dando como resultado la pérdida de la función normal del ARN diana.

Determinadas realizaciones se refieren a composiciones bicatenarias en las que ambas cadenas comprenden un motivo hemímero, un motivo completamente modificado, un motivo posicionalmente modificado o un motivo alterno. Cada cadena de las composiciones de la presente invención se puede modificar para cumplir un papel particular en, por ejemplo, la ruta del ARNip. La utilización de un motivo diferente en cada cadena o el mismo motivo con diferentes modificaciones químicas en cada cadena permite dirigir la cadena antisentido al complejo RISC mientras se inhibe la incorporación de la cadena sentido. Dentro de este modelo, cada cadena se puede modificar de forma independiente de modo que se mejore su función particular. La cadena antisentido se puede modificar en el extremo 5’ para mejorar su función en una región del RISC, mientras que el extremo 3’ se puede modificar de forma diferencial para mejorar su función en una región diferente del RISC.

Las moléculas de oligonucleótidos bicatenarios pueden ser una molécula polinucleotídica bicatenaria que comprenda regiones autocomplementarias sentido y antisentido, en la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región sentido que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia del ácido nucleico diana o una porción de la misma. Las moléculas de oligonucleótidos bicatenarios se pueden ensamblar a partir de dos oligonucleótidos separados, en los que una cadena es la cadena sentido y la otra es la cadena antisentido, en los que las cadenas antisentido y sentido son autocomplementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a secuencia de nucleótidos en la otra cadena; tal como cuando la cadena antisentido y la cadena sentido forman una estructura dúplex o bicatenaria, por ejemplo en la que la región bicatenaria es de, aproximadamente, 15 a, aproximadamente, 30, por ejemplo, aproximadamente, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases; la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la cadena sentido comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma (por ejemplo, de aproximadamente, 15 a, aproximadamente, 25 o más nucleótidos de la molécula de oligonucleótido bicatenaria son complementarios al ácido nucleico diana o una porción del mismo). Alternativamente, el oligonucleótido bicatenario se ensambla a partir de un único oligonucleótido, en el que las regiones autocomplementarias sentido y antisentido del ARNip están enlazadas por medio de un enlazador o enlazadores basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico.

El oligonucleótido bicatenario puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrico, horquilla u horquilla asimétrica, que tiene regiones autocomplementarias sentido y antisentido, en el que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana separada o una porción de la misma y la región sentido que tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. El oligonucleótido bicatenario puede ser un polinucleótido monocatenario circular que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región sentido que tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma, y en el que el polinucleótido circular se puede procesar in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario comprende secuencias o regiones sentido y antisentido separadas, en las que las regiones sentido y antisentido están enlazadas covalentemente mediante moléculas enlazadoras de nucleótidos o no nucleótidos, tal como se conoce en la técnica o, alternativamente, están enlazadas no covalentemente mediante interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas y/o interacciones de apilamiento. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen diana. En otra realización, el oligonucleótido bicatenario interactúa con la secuencia de nucleótidos de un gen diana de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen diana.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, no es necesario que los oligonucleótidos bicatenarios se limiten a aquellas moléculas que contienen solo ARN, sino que además engloban nucleótidos y no nucleótidos químicamente modificados. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de interferencia pequeño carecen de nucleótidos que contienen 2’-hidroxi (2’-OH). En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos de interferencia pequeños no incluyen opcionalmente ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2’-OH). Sin embargo, dichos oligonucleótidos bicatenarios que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula para soportar el ARNi pueden tener un enlazador o enlazadores unidos u otros grupos, restos o cadenas unidos o asociados que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2’-OH. Opcionalmente, los oligonucleótidos bicatenarios pueden comprender ribonucleótidos en, aproximadamente, el 5, 10, 20, 30, 40 o 50 % de las posiciones de nucleótidos. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término ARNip pretende ser equivalente a otros términos utilizados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar ARNi específico de secuencia, por ejemplo ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), microARN (miARN), ARN de horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido de interferencia pequeño, ácido nucleico de interferencia pequeño, oligonucleótido modificado de interferencia pequeño, ARNip químicamente modificado, ARN silenciador de genes postranscripcional (ARNsgpt), y otros. Además, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término ARNi pretende ser equivalente a otros términos utilizados para describir la interferencia de ARN específica de secuencia, tal como silenciamiento de genes postranscripcional, inhibición de la traducción o epigenética. Por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos bicatenarios para silenciar genes epigenéticamente tanto a nivel postranscripcional como a nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitante, la regulación epigenética de la expresión génica por las moléculas de ARNip de la presente invención puede resultar de la modificación mediada por ARNip de la estructura de la cromatina o el patrón de metilación para alterar la expresión génica (véase, por ejemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).

Se contempla que los compuestos y composiciones de varias realizaciones dadas a conocer en la presente memoria descriptiva pueden estar dirigidos a la ANGPTL3 mediante un mecanismo de silenciamiento génico o ARNi mediado por ARNbc, que incluye, por ejemplo, moléculas efectoras de ARN bicatenario en "horquilla" o tallo-bucle en las que una sola cadena de ARN con las secuencias autocomplementarias pueden asumir una conformación bicatenaria, o moléculas efectoras de ARNbc dúplex que comprenden dos cadenas separadas de ARN. En diversas realizaciones, el ARNbc consiste completamente en ribonucleótidos o consiste en una mezcla de ribonucleótidos y desoxinucleótidos, tales como los híbridos de ARN/ADN dados a conocer, por ejemplo, en la Patente WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la Patente US60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. El ARNbc o la molécula efectora de ARNbc puede ser una sola molécula con una región de autocomplementariedad, de modo que las bases de los nucleótidos en un segmento de la molécula se emparejen con nucleótidos en otro segmento de la molécula. En diversas realizaciones, un ARNbc que consiste en una sola molécula consiste completamente en ribonucleótidos o incluye una región de ribonucleótidos que es complementaria a una región de desoxirribonucleótidos. Alternativamente, el ARNbc puede incluir dos cadenas diferentes que tienen una región de complementariedad entre sí.

En diversas realizaciones, ambas cadenas consisten completamente en ribonucleótidos, una cadena consiste completamente en ribonucleótidos y una cadena consiste completamente en desoxirribonucleótidos, o una o ambas cadenas contienen una mezcla de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En determinadas realizaciones, las regiones de complementariedad tienen, como mínimo, un 70, 80, 90, 95, 98 o 100 % de complementariedad entre sí y con una secuencia de ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la región del ARNbc que está presente en una conformación bicatenaria incluye, como mínimo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos o incluye todos los nucleótidos en un ADNc u otra secuencia de ácido nucleico diana que está representada en el ARNbc. En algunas realizaciones, el ARNbc no contiene ninguna región monocatenaria, tal como extremos monocatenarios, o el ARNbc es una horquilla. En otras realizaciones, el ARNbc tiene una o más regiones monocatenarias o salientes. En determinadas realizaciones, los híbridos de ARN/ADN incluyen una cadena o región de ADN que es una cadena o región antisentido (por ejemplo, tiene, como mínimo, el 70, el 80, el 90, el 95, el 98 o el 100 % de complementariedad con un ácido nucleico diana) y una cadena o región de ARN que es una cadena o región sentido (por ejemplo, tiene, como mínimo, el 70, el 80, el 90, el 95, el 98 o el 100 % de identidad con un ácido nucleico diana) y viceversa.

En diversas realizaciones, el híbrido de ARN/ADN se prepara in vitro utilizando procedimientos enzimáticos o de síntesis química, tales como los descritos en la presente memoria descriptiva o los descritos en la Patente WO00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la Patente US60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. En otras realizaciones, una cadena de ADN sintetizada in vitro forma un complejo con una cadena de ARN preparada in vivo o in vitro antes, después o al mismo tiempo que la transformación de la cadena de ADN en la célula. En aún otras realizaciones, el ARNbc es un único ácido nucleico circular que contiene una región sentido y una antisentido, o el ARNbc incluye un ácido nucleico circular y un segundo ácido nucleico circular o un ácido nucleico lineal (véase, por ejemplo, la Patente WO00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la Patente US60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999). Entre los ejemplos de ácidos nucleicos circulares se incluyen estructuras de lazo en las que el grupo fosforilo 5’ libre de un nucleótido se une al grupo hidroxilo 2’ de otro nucleótido en forma de bucle.

En otras realizaciones, el ARNbc incluye uno o más nucleótidos modificados en los que la posición 2’ en el azúcar contiene un halógeno (tal como un grupo flúor) o contiene un grupo alcoxilo (tal como un grupo metoxi) lo que aumenta la vida media del ARNbc in vitro o in vivo comparado con el ARNbc correspondiente en el que la posición 2’ correspondiente contiene un hidrógeno o un grupo hidroxilo. En aún otras realizaciones, el ARNbc incluye uno o más enlaces entre nucleótidos adyacentes distintos de un enlace fosfodiéster de origen natural. Entre los ejemplos de estos enlaces se incluyen enlaces fosforamida, fosforotioato y fosforoditioato. Los ARNbc también pueden ser moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente, tal como se enseña en la Patente US6,673,661. En otras realizaciones, el ARNbc contiene una o dos cadenas protegidas, tal como se da a conocer, por ejemplo, en la Patente WO00/63364, presentado el 19 de abril de 2000, o la Patente US60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999.

En otras realizaciones, el ARNbc puede ser cualquiera de las moléculas de ARNbc, como mínimo, parcialmente dadas a conocer en la Patente WO00/63364, así como cualquiera de las moléculas de ARNbc descritas en la Patente US60/399,998; y la Patente 60/419,532 y la Patente w O 2004/035765. Cualquiera de los ARNbc se puede expresar in vitro o in vivo utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva o procedimientos estándar, tales como los descritos en la Patente WO00/63364.

Ocupación

En determinadas realizaciones, no se espera que los compuestos antisentido den como resultado la escisión o el ácido nucleico diana a través de la RNasa H o que den como resultado la escisión o secuestro a través de la ruta RISC. En determinadas de estas realizaciones, la actividad antisentido puede resultar de la ocupación, en la que la presencia del compuesto antisentido hibridado altera la actividad del ácido nucleico diana. En determinadas de estas realizaciones, el compuesto antisentido se puede modificar uniformemente o puede comprender una mezcla de modificaciones y/o nucleósidos modificados y no modificados.

Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos

Entre las secuencias de nucleótidos que codifican la ANGPTL3 se incluyen, sin constituir limitación, las siguientes: la secuencia humana, tal como se establece en GenBank No. de registro NM_014495.2 (incorporada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1) o GenBank No. de registro NT_032977.9 nucleótidos 33032001 a 33046000 (incorporada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 2). Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO. en los ejemplos contenidos en la presente memoria descriptiva es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por un SEQ ID NO. pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número de Isis (No. Isis) indican una combinación de secuencia y motivo de nucleobase.

Una región diana es una región definida estructuralmente del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una UTR 3’, una UTR 5’, un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región definida del ácido nucleico. Las regiones definidas estructuralmente para la ANGPTL3 se pueden obtener mediante el número de registro de bases de datos de secuencias, tales como NCBI. Una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5’ de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3’ de otro segmento diana dentro de la región diana.

Un "segmento diana" es una subporción más pequeña de una región diana dentro de un ácido nucleico. Por ejemplo, un segmento diana puede ser la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se direcciona uno o más compuestos antisentido. "Sitio diana 5’" o "sitio de inicio 5’" se refiere al nucleótido más 5’ de un segmento diana. "sitio diana 3’" o " sitio de parada 3’" se refiere al nucleótido más 3’ de un segmento diana.

El direccionamiento incluye la determinación de, como mínimo, un segmento diana con el que hibrida un compuesto antisentido, de manera que se produce el efecto deseado. En determinadas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En determinadas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.

Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Se pueden superponer diversos segmentos diana dentro de una región diana. Alternativamente, pueden no superponerse. En determinados aspectos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, aproximadamente, 300 nucleótidos. En determinados aspectos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, que es aproximadamente ese número, no es más que ese número, no es más que, aproximadamente, ese número, o es un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En determinados aspectos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o no más de, aproximadamente, ese número. En determinados aspectos, los segmentos diana son contiguos. En la presente memoria descriptiva se dan a conocer regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios diana 5’ o sitios diana 3’ enumerados en la presente memoria descriptiva. Los segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de una UTR 5’, una región codificante, una UTR 3’, un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una cierta región definida estructuralmente, tal como el codón de inicio o el codón de parada.

La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, se puede utilizar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de diana).

Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, según se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En determinadas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de la ANGPTL3 son indicativas de la inhibición de la expresión de la proteína ANGPTL3. Las reducciones en los niveles de una proteína ANGPTL3 también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos, tales como una reducción del nivel de colesterol, LDL, triglicéridos o glucosa, pueden ser indicativos de la inhibición del ARNm de la ANGPTL3 y/o la expresión de proteínas.

Hibridación

En algunas realizaciones, se produce la hibridación entre un compuesto antisentido dado a conocer en la presente memoria descriptiva y un ácido nucleico de la ANGPTL3. El mecanismo de hibridación más común implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.

La hibridación puede tener lugar en diversas condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.

Los procedimientos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). Los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de la ANGPTL3.

Complementariedad

Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse mediante enlace de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de la ANGPTL3).

Un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de la ANGPTL3 de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, un emparejamiento erróneo o una estructura de horquilla).

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos antisentido, o una porción específica de los mismos con, como mínimo, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de complementariedad con un ácido nucleico de la ANGPTL3, una región diana, un segmento diana o una porción específica del mismo. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva, o una porción específica de los mismos tienen, o tienen, como mínimo, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de complementariedad con la secuencia de una o más de las SEQ ID NO: 1. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando procedimientos de rutina. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes se pueden agrupar o intercalar con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría el 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Paquete de análisis de secuencias de Wisconsin, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos antisentido, o porciones específicas de los mismos, completamente complementarios (es decir, con el 100 % de complementariedad) con un ácido nucleico diana, o una porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de la ANGPTL3, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejarse por bases de forma precisa con las correspondientes nucleobases de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto de 20 nucleobases antisentido es completamente complementario a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. También se puede utilizar completamente complementario en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.

La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5’ o en el extremo 3’ del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está ubicada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido de gápmero.

En determinados aspectos, los compuestos antisentido que tienen o tienen hasta 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase o nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de la ANGPTL3, o una porción específica del mismo.

En determinados aspectos, compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase o nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de la ANGPTL3, o una porción específica del mismo.

Los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también se puede referir a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a, como mínimo, una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a, como mínimo, una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a, como mínimo, una porción de 15 nucleobase de un segmento diana. También se dan a conocer compuestos antisentido que son complementarios a, como mínimo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más porciones de nucleobases de un segmento diana, o un intervalo definido por dos de estos valores.

Identidad

Los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva también pueden tener un porcentaje definido de identidad con una secuencia de nucleótidos particular, No. SEQ ID NO., o la secuencia de un compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia dada a conocer en la presente memoria descriptiva si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ^a Dⁿ dada a conocer se consideraría idéntico a la secuencia de ADN, dado que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones abreviadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente memoria descriptiva, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula según el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando. Los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, dados a conocer en la presente memoria descriptiva tienen, como mínimo, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad con uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO., o una porción de los mismos, dados a conocer en la presente memoria descriptiva.

Modificaciones

Un nucleósido es una combinación de base y azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar enlazado al resto hidroxilo 2’, 3’ o 5’ del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, se hace referencia a los grupos fosfato de manera común como los que forman los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.

Las modificaciones de compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados son preferentes a menudo a las formas nativas, debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por el ácido nucleico diana, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora aumentada.

También se pueden utilizar nucleósidos químicamente modificados para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen estos nucleósidos químicamente modificados.

Enlaces internucleosídicos modificados

El enlace internucleosídico de origen natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3’ a 5’. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no de origen natural, se seleccionan a menudo sobre compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural, debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y aumento de la estabilidad en presencia de nucleasas.

Entre los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados se incluyen enlaces internucleosídicos que conservan un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Entre los enlaces internucleosídicos representativos que contienen fósforo se incluyen, sin constituir limitación, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los procedimientos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En determinadas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.

Fragmentos de azúcar modificados

Los compuestos antisentido de la presente invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos con azúcar modificado pueden conferir estabilidad mejorada a las nucleasas, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa modificados químicamente. Entre los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente se incluyen, sin constituir limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5’ y 2’, la unión de átomos del anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S, N(R) o C(Ri)(R²) (R, Ri y R² son cada uno independientemente H, alquilo C¹-C¹² o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos de azúcares químicamente modificados se incluyen nucleósido sustituido con 2’-F-5’-metilo (véase la Patente WO2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5’, 2’-bis sustituidos dados a conocer) o sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2’ (véase la Patente US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5’ de un BNA (véase la Patente WO2007/134181 publicada el 22/11/07 en la que LNA se sustituye, por ejemplo, por un grupo 5’-metilo o 5’-vinilo).

Entre los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados se incluyen, sin constituir limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5’-vinilo, 5’-metilo (R o S), 4’-S, 2’-F, 2’-OCH3, 2’-OCH2CH3, 2’-OCH2CH2F y 2’-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2’ también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C¹-C¹⁰, OCF³ , OCH² F, O(CH^SCH³ , O(CH²)²-ON(Rm)(Rn), O-CH²-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH²-C(=O)-N(Ri)-(CH²)²-N(Rm)(Rn), donde cada R¹, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) incluyen, sin constituir limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4’ y 2’. En determinadas realizaciones, entre los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva se incluyen uno o más nucleósidos de ^b N^a en los que el puente comprende una de las fórmulas: 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2’ y 4’-CH(CH2OCH3)-O-2’ (y análogos de los mismos, véase la Patente US7,399,845, concedida el 15 de julio de 2008); 4’-C(CH3)(CH3)-O-2’ (y análogos de los mismos, véase la Patente PCT/US2008/068922 publicada como Patente WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ (y análogos del mismo, véase la Patente PCT/US2008/064591 publicada como Patente WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4’-CH2-ON(CH3)-2’ (véase la Patente US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4’-CH2-N(R)-O-2’, en el que R es H, alquilo C¹-C¹² o un grupo protector (véase la Patente US7,427,672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4’-CH2-C(H)(CH3)-2’ (véase Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4’-CH2-C(=CH2)-2’ (y análogos de los mismos, véase la Patente PCT/US2008/066154 publicada como Patente WO2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).

Se ha informado de más nucleósidos bicíclicos en la literatura publicada (véase, por ejemplo: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (26) 8362-8379; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Patentes US7,399,845; US7,053,207; US7,034,133; US6,794,499; US6,770,748; US6,670,461; US6,525,191; US6,268,490; Patentes US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; Patentes US12/129,154; US61/099,844; US61/097,787; US61/086,231; US61/056,564; US61/026,998; US61/026,995; US60/989,574; Patentes WO2007/134181; WO2005/021570; WO2004/106356; WO94/14226; y Patentes WO2009/006478; WO2008/154401; y WO2008/150729). Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones estereoquímicas del azúcar que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la Patente PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como Patente WO99/14226).

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En determinadas realizaciones, el resto de azúcar, o el análogo de resto de azúcar, de un nucleósido se puede modificar o sustituir en cualquier posición.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "nucleósido bicíclico 4’-2’ " o "nucleósido bicíclico 4’ a 2’" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2’ y el átomo de carbono 4’ del anillo de azúcar.

En determinadas realizaciones, entre los restos de azúcar bicíclicos de nucleósidos de BNA se incluyen, sin constituir limitación, compuestos que tienen, como mínimo, un puente entre los átomos de carbono 4’ y 2’ del resto de azúcar pentofuranosilo que incluyen, sin limitación, puentes que comprenden 1 o de 1 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -S(Ra)²-, -S(=O)x- y -N(Ra)-; en los que: x es 0, 1 o 2; n es 1, 2, 3 o 4; cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C¹² sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, arilo C⁵-C²⁰, arilo C⁵-C²⁰ sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C⁵-C⁷ , radical alicíclico C⁵-C⁷ sustituido, halógeno, OJ¹, NJ¹J² , SJ¹, N³ , COOJ¹, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)²-J¹) o sulfoxilo (S(=O)-J¹); y

cada J¹ y J² es, independientemente, H, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C¹² sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, arilo C⁵-C²⁰ , arilo C⁵-C²⁰ sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C¹-C¹², aminoalquilo C¹-C¹² sustituido o un grupo protector.

En determinadas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-ON(R)-. En determinadas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-ON(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'-, en los que cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C¹-C¹².

En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen además por su configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-(CH2)-O-2', puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

En determinadas realizaciones, entre los nucleósidos bicíclicos se incluyen aquellos que tienen un puente 4' a 2' en el que dichos puentes incluyen, sin constituir limitación, a-L-4'-(CH2)-O-2', p-D-4'-CH2-O-2', 4'-(CH2) 2-O-2',

4'-CH2-ON(R)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-S-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH2-CH(CH3)-2' y 4'-(CH2)3-2', en los que R es H, un grupo protector o alquilo C¹-C¹².

En determinada realización, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclico;

-Qa-Qb-Qc- es -CH²-N(Rc)-CH²-, -C(=O)-N(Rc)-CH²-, -CH²-ON(Rc)-, -CH²-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH²;

Rc es alquilo C¹-C¹² o un grupo protector de amino; y

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.

En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Za es alquilo C¹-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ , alquinilo C²-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alqu

C²-C⁶ sustituido, al C²-C⁶ sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido.

En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJJd, SJc, N³ , OC(=X)Jc y NJeC(=X)NJcJd, en los que cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C¹-C⁶ o alquilo C¹-C⁶ sustituido y X es

O o NJc.

En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Zb es alquilo C¹-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ , alquinilo C²-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alqu

C²-C⁶ sustituido, al C²-C⁶ sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).

En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclico;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Rd es alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o al C²-C⁶ sustituido;

cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido, alcoxilo C¹-C⁶ , alcoxilo C¹-C⁶ sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C¹-C⁶ o aminoalquilo C¹-C⁶ sustituido;

En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C¹² sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, alcoxilo C¹-C¹², alcoxilo

C¹-C¹² sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO² Jj, NJjJk, N³ , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJj Jk, C(=O)Jj, OC(=O)NJj Jk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;

o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);

qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C¹² o alquilo C¹-C¹² sustituido.

Se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos de adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo que tienen un puente 4’-CH2-O-2’, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). La síntesis de nucleósidos bicíclicos también se ha descrito en las Patentes WO 98/39352 y WO 99/14226.

También se han preparado análogos de diversos nucleósidos bicíclicos que tienen grupos puente 4’ a 2’ tales como 4’-CH2-O-2’ y 4’-CH2-S-2’ (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de dúplex de oligodesoxirribonucleótidos que comprenden nucleósidos bicíclicos para su utilización como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2’-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de elevada afinidad restringido conformacionalmente (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2’-amino- y 2’-metilamino-BNA y se ha informado anteriormente de la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.

En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C¹² sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, alcoxilo C¹- C¹², alcoxilo C¹-C¹² sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO² Jj, NJjJk, N³ , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y

qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), en el que qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C¹-C¹² o alquilo C¹-C¹² sustituido.

Se ha descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4’-(CH2)3-2’ y el puente análogo de alquenilo 4’-CH=CH-CH2-2’ (Frier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos conjuntamente con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).

En determinadas realizaciones, entre los nucleósidos bicíclicos se incluyen, sin constituir limitación, (A) a-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (B) p-D-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (C) etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2’) BNA, (^d) aminooxi (4’-CH2-ON(R)-2’) BNA, (E) oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA, (F) metil(metilenoxi) (4’-CH(CH3)-O-2’) BNA (denominado también etilo restringido o cEt), (G) metilen-tio (4’-CH2-S-2’) BNA, (H) metilen-amino (4’-CH2-N(r)-2’) BNA, (I) metilcarbocíclico (4’-CH2-CH (CH3)-2’) BNA, (J) propilencarbocíclico (4’-(CH2)3-2’) BNA y (K) vinil ^b N^a , tal como se muestran a continuación.

en los que Bx es el resto de base y R es, independientemente, H, un grupo protector, alquilo C¹-C⁶ o alcoxilo C¹-C⁶. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales y se puede denominar sustituto de azúcar. Entre los nucleósidos de THP modificados se incluyen, sin constituir limitación, los que se denominan en la técnica ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoroHNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo tetrahidropiranilo tal como se ilustra a continuación.

en la que:

Bx es un resto de base heterocíclica;

T³ y T⁴ son cada uno, independientemente, un grupo de enlace entre nucleósidos que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto oligomérico o uno de T³ y T⁴ es un grupo de enlace entre nucleósidos que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto oligomérico u oligonucleótido y el otro de T³ y T⁴ es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5’ o 3’;

q¹, q² , q³ , q⁴ , q⁵ , q6 y q⁷ son cada uno independientemente, H, alquilo C¹-C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido; y

uno de R¹ y R² es hidrógeno y el otro se selecciona entre halógeno, alcoxilo sustituido o no sustituido, NJ¹ J² , SJ¹, N³ , OC(=X)J¹, 0C(=X)NJJ2, NJ³C(=X)NJJ² y CN, en los que X es O, S o NJ¹ y cada J¹, J² y J³ es, independientemente, H o alquilo C¹-C⁶.

En determinadas realizaciones, q¹, q² , q³ , q⁴ , q⁵ , q6 y q⁷ son cada uno H. En determinadas realizaciones, como mínimo, uno de q¹, q² , q³ , q⁴ , q⁵ , q6 y q⁷ es distinto de H. En determinadas realizaciones, como mínimo, uno de q¹, q² , q³ , q⁴ , q⁵ , q6 y q⁷ es metilo. En determinadas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP en los que uno de R¹ y R² es F. En determinadas realizaciones, R¹ es flúor y R² es H; R¹ es metoxi y R² es H, y R¹ es metoxietoxi y R² es H.

En determinadas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden restos de azúcar morfolino y su utilización en compuestos oligoméricos (véase, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41,4503-4510; y las Patentes US5,698,685; US5,166.315; US5,185,444; y US5,034,506). Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la fórmula siguiente:

En determinadas realizaciones, los morfolinos se pueden modificar, por ejemplo, añadiendo o alterando diversos grupos sustituyentes de la estructura morfolino anterior. Dichos sustitutos de azúcar se denominan en la presente memoria descriptiva "morfolinos modificados".

También se dan a conocer combinaciones de modificaciones sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos con 2’-F-5’-metilo (véase la Patente WO2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5’, 2’-bis sustituidos dados a conocer) y la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y sustitución adicional en la posición 2’ (véase la Patente US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5’ de un ácido nucleico bicíclico (véase la Patente WO2007/134181, publicada el 22/11/07 en la que un nucleósido bicíclico 4’-CH2-O-2’ está sustituido adicionalmente en la posición 5’ con un grupo 5’-metilo o 5’-vinilo). También se han descrito la síntesis y la preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (véase, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo pentofuranosilo en los nucleósidos de origen natural. Entre los nucleósidos de ciclohexenilo modificados se incluyen, sin constituir limitación los descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente WO2010/036696, de propiedad común, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24 (5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33 (8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61 (6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60 (9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13 (6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001,29 (24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20 (4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Patente WO06/047842; y Patente WO01/049687). Determinados nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la fórmula X.

en la que independientemente para cada uno de dicho, como mínimo, un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de fórmula X:

Bx es un resto de base heterocíclica;

T³ y T⁴ son cada uno, independientemente, un grupo de enlace entre nucleósidos que enlaza el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T³ y T⁴ es un grupo de enlace entre nucleósidos que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T³ y T⁴ es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5’ o 3’; y

q¹ , q² , q³ , q⁴ , q⁵ , q6, q⁷ , q8 y q⁹ son cada uno, independientemente, H, alquilo C¹ -C⁶ , alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C⁶ , alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ , alquinilo C²-C⁶ sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.

En la técnica se conocen muchos otros sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos y son adecuados como sustitutos de azúcar que se pueden utilizar para modificar nucleósidos, para su incorporación en compuestos oligoméricos tal como los que se dan a conocer en la presente memoria descriptiva (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Christian J. Bioorg. &. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillos pueden sufrir diversas sustituciones adicionales para mejorar aún más su actividad.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "azúcar modificado en 2’" significa un azúcar furanosilo modificado en la posición 2’. En determinadas realizaciones, entre estas modificaciones se incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, que incluye, sin constituir limitación, alcoxilo sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En determinadas realizaciones, las modificaciones en 2’ se seleccionan entre sustituyentes que incluyen, sin constituir limitación: O[(CH²)nO]mCH³ , O(CH²)nNH² , O(CH²)nCH³ , O(CH²)nF, O(CH²)n ONH² , OCH2C(=O)N(H)CH3, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a, aproximadamente, 10. Otros grupos sustituyentes en 2’ también se pueden seleccionar de: alquilo C¹-C¹², alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH³ , OCN, Cl, Br, CN, F, CF³ , OCF³ , SOCH³ , SO²CH³ , ONO² , NO² , N³ , NH² , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En determinadas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2’-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que una sustitución 2’-MOE de este tipo tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2’-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2’-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para utilización in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "modificado en 2’" o "sustituido en 2’" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ distinto de H u OH. Entre los nucleósidos modificados en 2’ se incluyen, sin constituir limitación, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2’ y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2 no puente, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C¹-C¹⁰, -OCF³ , O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH²)²-ON(Rm)(Rn), u O-CH²-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2’ pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "2’-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2’ del anillo de azúcar.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "2’-OMe" o "2’-OCH3", "2’-O-metil" o "2’-metoxi" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH³ en la posición 2’ del anillo de azúcar.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "MOE" o "2’-MOE" o "2’-OCH2CH2OCH3" o "2’-O-metoxietilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo-OCH²CH²OCH³ en la posición 2’ del anillo de azúcar.

Los procedimientos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la materia. Algunas patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, las Patentes US4,981,957; US5,118,800; US5,319,080; US5,359,044; US5,393,878; US5,446,137; US5,466,786; US5,514,785; US5,519,134; US5,567,811; US5,576,427; US5,591,722; US5,597,909; US5,610,300; US5,627,053; US5,639,873; US5,646,265; US5,670,633; US5,700,920; US5.792.847 y US6,600,032 y la Patente US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como Patente WO2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).

En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (naturales, modificadas o una combinación de los mismas) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En determinadas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2’-MOE. En determinadas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2’-MOE están dispuestos en un motivo gápmero. En determinadas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo de puente (4’-CH(CH3)-0-2’). En determinadas realizaciones, los nucleósidos modificados (4’-CH(CH3)-0-2’) están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gápmero.

Nucleobases modificadas

Las modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles de nucleobases no modificadas de origen natural o sintético, aunque funcionalmente son intercambiables con las mismas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en el enlace de hidrógeno. Estas modificaciones de nucleobase pueden proporcionar estabilidad frente a las nucleasas, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Entre las nucleobases modificadas se incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Determinadas sustituciones de nucleobase, incluidas las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs.276-278). Entre las nucleobases modificadas adicionales se incluyen 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-Cl C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinílicos de bases pirimidínicas, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Entre los restos de bases heterocíclicas también se pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se sustituye con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Entre las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de compuestos antisentido se incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido acortados o alargados por espaciadores dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinadas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En determinadas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.

Composiciones y procedimientos para formular composiciones farmacéuticas

Se pueden mezclar oligonucleótidos antisentido con una sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de vahos criterios, entre los que incluyen, sin constituir limitación, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis a administrar.

El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de la ANGPTL3 se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para su utilización en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, una realización es una composición farmacéutica que comprende un compuesto u oligonucleótido modificado según la presente invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster o sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Entre las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas se incluyen, sin constituir limitación, sales de sodio y potasio.

Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que sean escindidos mediante nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.

Compuestos antisentido conjugados

Los compuestos antisentido se pueden enlazar covalentemente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Entre los grupos conjugados típicos se incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Entre los grupos conjugados adicionales se incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.

Los compuestos antisentido también se pueden modificar para que tengan uno o más grupos estabilizantes que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de los compuestos antisentido para mejorar propiedades, tales como, por ejemplo, estabilidad frente a las nucleasas. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tiene ácidos nucleicos terminales de la degradación por exonucleasas y pueden ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo 5’ (caperuza 5’) o en el extremo 3’ (caperuza 3’), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas abásicas desoxi invertidas. Entre otros grupos estabilizantes 3’ y 5’ que se pueden utilizar para proteger uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para proporcionar estabilidad frente a las nucleasas se incluyen los dados a conocer en la Patente WO03/004602 publicada el 16 de enero de 2003.

Tratamiento de cultivos celulares y compuestos antisentido

Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de la ANGPTL3 se pueden ensayar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para dichos análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, Virginia; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; Clonetics Corporation, Walkersville, Maryland) y las células se cultivan según las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California). Entre los tipos de células ilustrativos se incluyen, sin constituir limitación, células HepG2, células Hep3B, células Huh7 (carcinoma hepatocelular), hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2.

Ensayos in vitro de oligonucleótidos antisentido

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.

En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan, aproximadamente, un 60-80 % de confluencia en cultivo.

Un reactivo utilizado de manera común para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, California). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, California) para conseguir la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que normalmente varía de 2 a 12 |¿g/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.

Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, California). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, California) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que normalmente varía de 2 a 12 |¿g/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.

Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, California). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, California) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que normalmente varía de 2 a 12 |¿g/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.

Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Oligofectamine® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Oligofectamine® en medio de suero reducido Opti-MEM®-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de Oligofectamine® respecto a oligonucleótido de, aproximadamente, 0,2 a 0,8 |o.l por 100 nM.

Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, Indiana). El compuesto oligomérico antisentido se mezcló con FuGENE 6 en 1 ml de RPMI sin suero para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de FuGENE 6 respecto a compuesto oligomérico de 1 a 4 pl de FuGENE 6 por 100 nM.

Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001).

Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante procedimientos de rutina. Las células se recogen normalmente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos diana se miden mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria descriptiva. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos reptidos.

La concentración de oligonucleótido antisentido utilizada varía de una línea celular a otra. Los procedimientos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan normalmente a concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectin o Cytofectin. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan a concentraciones más elevadas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan utilizando electroporación.

Aislamiento de ARN

El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). El ARN se prepara utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, California) según los protocolos recomendados por el fabricante.

Análisis de inhibición de niveles o expresión diana

La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de la ANGPTL3 se puede ensayar de una variedad de formas conocidas en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede realizar de manera conveniente utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, California y utilizado según las instrucciones del fabricante.

Análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de los niveles del ARN diana

La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede realizar mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, California) según las instrucciones del fabricante. Los procedimientos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.

Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que posteriormente se utiliza como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, California). Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.

Las cantidades diana de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se pueden normalizar utilizando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como la ciclofilina A o el GADPH o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN® (Life Technologies®, Inc. Carlsbad, California). La expresión de la ciclofilina A o el GADPH se puede cuantificar mediante PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. El ARN total se puede cuantificar utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN®. Los procedimientos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, L. J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se puede utilizar un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN®.

Los procedimientos para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la utilización de software, tal como el software PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, California). Las sondas y los cebadores utilizados en la PCR en tiempo real se diseñaron para hibridar con secuencias específicas de la ANGPTL3 y se dan a conocer en los ejemplos siguientes. Las sondas de PCR específicas de la diana pueden tener FAM enlazado covalentemente al extremo 5’ y TAMRA o MGB enlazado covalentemente al extremo 3’, donde FAM es el colorante fluorescente y TAMRA o MGB es el colorante de extinción. Análisis de los niveles de proteína

La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de la ANGPTL3 se puede evaluar midiendo los niveles de proteína de la ANGPTL3. Los niveles de proteína de la ANGPTL3 se pueden evaluar o cuantificar en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), enzimoinmunoensayo de adsorción (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, Michigan), o se pueden preparar mediante procedimientos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.

Ensayo in vivo de compuestos antisentido

Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se ensayan en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de la ANGPTL3 y producir cambios fenotípicos. Los ensayos se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenterales. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, el ARN se aísla del tejido y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico de la ANGPTL3. También se miden los cambios en los niveles de proteína de la ANGPTL3.

Determinadas indicaciones

En determinadas realizaciones, en la presente memoria descriptiva se dan a conocer composiciones, según la presente invención, para su utilización en terapia. En determinadas realizaciones, en la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos u oligonucleótidos modificados, según la presente invención, para su utilización en el tratamiento, prevención o ralentización de la progresión de una enfermedad relacionada con ANGPTL3 elevada. En determinadas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad metabólica y/o enfermedad cardiovascular. En determinadas realizaciones, el individuo tiene hipercolesterolemia (por ejemplo, hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH), hipercolesterolemia heterocigótica familiar (HeFH)), dislipidemia, hipertrigliceridemia (por ejemplo, deficiencia de LPL heterocigótica, deficiencia de LPL homocigótica), arteriopatía coronaria (CAD) síndrome de quilomicronemia familiar (FCS), hiperlipoproteinemia tipo IV), lipodistrofia, hiperlipidemia (por ejemplo, hiperlipidemia combinada, hiperlipidemia familiar combinada (FCHL)), síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes (por ejemplo., diabetes tipo 2), engrosamiento de la pared vascular, presión arterial elevada (por ejemplo, hipertensión arterial pulmonar), esclerosis (por ejemplo, aterosclerosis, esclerosis sistémica, esclerosis cutánea progresiva y vasculopatía obliterante proliferativa, tal como úlceras digitales y afectación vascular pulmonar).

En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, modulan el metabolismo de lípidos y/o energía en un animal. En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, modulan marcadores fisiológicos o fenotipos de hipercolesterolemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome metabólico, NAFLD, NASH y/o diabetes. Por ejemplo, la administración de los compuestos a animales puede modular uno o más niveles de VLDL, ácidos grasos no esterificados (NEFA), LDL, colesterol, triglicéridos, glucosa, insulina o ANGPTL3. En determinadas realizaciones, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de la ANGPTL3 por los compuestos.

En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, reducen y/o previenen una o más de la acumulación de TG hepáticos (es decir, esteatosis hepática), aterosclerosis, engrosamiento de la pared vascular (por ejemplo, engrosamiento de la íntima-media arterial), hipercolesterolemia (por ejemplo, hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH), hipercolesterolemia heterocigótica familiar (HeFH)), dislipidemia, hipertrigliceridemia (por ejemplo, deficiencia de LPL heterocigótica, deficiencia de LPL homocigótica, síndrome de quilomicronemia familiar (FCS), hiperlipoproteinemia tipo IV), lipoidistrofia, hiperlipidemia (por ejemplo, hiperlipidemia combinada, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes (por ejemplo, diabetes tipo 2), presión arterial elevada y esclerosis. En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, mejoran la sensibilidad a la insulina.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido, según la presente invención, dan como resultado una reducción de la expresión de la ANGPTL3 en, aproximadamente, como mínimo, el 15 %, como mínimo, el 20 %, como mínimo, el 25 %, como mínimo, el 30 %, como mínimo, el 35 %, como mínimo, el 40 %, como mínimo, el 45 %, como mínimo, el 50 %, como mínimo, el 55 %, como mínimo, el 60 %, como mínimo, el 65 %, como mínimo, el 70 %, como mínimo, el 75 %, como mínimo, el 80 %, como mínimo, el 85 %, como mínimo, el 90 %, como mínimo, el 95 % o, como mínimo, el 99 %, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido, según la presente invención, dan como resultado una reducción de uno o más de los triglicéridos, colesterol LDL, colesterol no HDL, colesterol VLDL, colesterol total, ApoB y ApoC-III en, aproximadamente, como mínimo, un 5 %, como mínimo, un 10 %, como mínimo, un 15 %, como mínimo, un 20 %, como mínimo, un 25 %, como mínimo, un 30 %, como mínimo, un 35 %, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, un 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 %, como mínimo, un 95 % o, como mínimo, un 99 %, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.

En la presente memoria descriptiva se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a la ANGPTL3 para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece una enfermedad metabólica o enfermedad cardiovascular, o es susceptible a las mismas. En la presente memoria descriptiva se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a la ANGPTL3 en la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una o más de hipercolesterolemia (por ejemplo, hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH), hipercolesterolemia heterocigótica familiar (HeFH)), dislipidemia, hipertrigliceridemia (por ejemplo, síndrome de quilomicronemia familiar (FCS), hiperlipoproteinemia tipo IV), lipodistrofia, hiperlipidemia (por ejemplo, hiperlipidemia combinada, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL)), síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes (por ejemplo, diabetes tipo 2) engrosamiento de la pared vascular, presión arterial elevada y esclerosis.

Administración

En determinadas realizaciones, los compuestos y composiciones se administran por vía parenteral.

En determinadas realizaciones, la administración parenteral se realiza mediante infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En determinadas realizaciones, los agentes farmacéuticos infundidos se administran con una bomba.

En determinadas realizaciones, la administración parenteral se realiza mediante inyección. La inyección se puede administrar con una jeringa o una bomba. En determinadas realizaciones, la inyección es una inyección en bolo. En determinadas realizaciones, la inyección se administra directamente a un tejido u órgano. En determinadas realizaciones, la inyección es subcutánea.

Determinadas terapias combinadas

En determinadas realizaciones, un primer agente que comprende el oligonucleótido modificado se coadministra con uno o más agentes secundarios. En determinadas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que el primer agente descrito en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente a la del primer agente descrito en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas, tal como las que se describen en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para tratar un efecto no deseado del primer agente. En determinadas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto de combinación. En determinadas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto sinérgico.

En determinadas realizaciones, se administran al mismo tiempo un primer agente y uno o más segundos agentes. En determinadas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se administran en diferentes momentos. En determinadas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan juntos en una única formulación farmacéutica. En determinadas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan por separado.

En determinadas realizaciones, entre los segundos agentes se incluyen, sin constituir limitación, un agente hipoglucemiante o un agente hipolipemiante. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, un cambio de estilo de vida terapéutico, un agonista de PPAR, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa (IV), un análogo de GLP-1, insulina o un análogo de insulina, un secretágogo de insulina, un inhibidor de SGLT2, un análogo de amilina humana, una biguanida, un inhibidor de la alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, metformina, sulfonilurea, rosiglitazona, meglitinida, tiazolidindiona, inhibidor de alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. La sulfonilurea puede ser acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, una glipizida, una gliburida o una gliclazida. La meglitinida puede ser nateglinida o repaglinida. La tiazolidindiona puede ser pioglitazona o rosiglitazona. La alfa-glucosidasa puede ser acarbosa o miglitol. En determinadas realizaciones, la terapia hipolipemiante puede incluir, sin constituir limitación, un cambio de estilo de vida terapéutico, niacina, inhibidor de la HMG-CoA reductasa, inhibidor de la absorción de colesterol, inhibidor de MTP (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a MTP), fibrato, inhibidor de PCSK9 (por ejemplo, anticuerpos de PCSK9, polipéptidos, compuestos de ácido nucleico de moléculas pequeñas dirigidos a PCSK9), inhibidor de CETP (por ejemplo, moléculas pequeñas tales como torcetrapib y anacetrapib, polipéptidos, anticuerpos o compuestos de ácido nucleico dirigidos a CETP), inhibidor de apoC-III (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuestos de ácido nucleico dirigidos a apoC-III), inhibidor de apoB (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuestos de ácido nucleico direccionados a apoB), aceites beneficiosos ricos en ácidos grasos omega-3, ácidos grasos omega-3 o cualquier combinación de los mismos. El inhibidor de la HMG-CoA reductasa puede ser atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, simvastatina y similares. El inhibidor de la absorción de colesterol puede ser ezetimiba. El fibrato puede ser fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, clofibrato, gemfibrozil y similares. El aceite beneficioso rico en ácidos grasos omega-3 puede ser krill, aceite de pescado (por ejemplo, VascepaR), aceite de linaza y similares. El ácido graso omega-3 puede ser ALA, DHA, EPA y similares.

Determinados compuestos

Los oligonucleótidos antisentido que están dirigidos a la ANGPTL3 humano se describieron en una publicación anterior (véase la Patente WO2011/085271 publicada el 14 de julio de 2011). Varios oligonucleótidos (233676, 233690, 233710, 233717, 233721, 233722, 337459, 337460, 337474, 337477, 337478, 337479, 337481, 337484, 337487, 337488, 337490, 337491, 337492, 337497, 337498, 337503, 337505, 337506, 337508, 337513, 337514, 337516, 337520, 337521, 337525, 337526 y 337528) descritos en la misma, incluidos los diez compuestos antisentido más potentes in vitro, se utilizaron como referentes en los cribados in vitro seleccionados para nuevos compuestos antisentido descritos a continuación. De los compuestos más potentes descritos en la Patente WO 2011/085271, se descubrió que ISIS 233722 es muy variable en su capacidad para inhibir la ANGPTL3. Por consiguiente, aunque inicialmente se incluyó en algunos estudios in vitro, 233722 no fue seleccionado como referencia para estudios posteriores. De los compuestos de referencia in vitro potentes identificados anteriormente, se seleccionaron cinco (233710, 233717, 337477, 337478, 337479 y 337487) para ensayar in vivo, tal como se describe a continuación, en ratones transgénicos huANGPTL3 para evaluar el más potente en la reducción de la transcripción de ARNm humano y la expresión de proteínas (ejemplo 11). El oligonucleótido antisentido con la potencia in vivo inicial más elevada para reducir los niveles de la ANGPTL3 (233710) se utilizó como referente para la evaluación in vivo de los nuevos compuestos antisentido descritos a continuación.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido se benefician de una o más propiedades mejoradas con respecto a los compuestos antisentido descritos en la Patente WO2011/085271. Estas propiedades mejoradas se demuestran en los ejemplos de la presente memoria descriptiva y, a continuación, se proporciona un resumen no exhaustivo de los ejemplos para facilitar la referencia.

En un primer cribado descrito en la presente memoria descriptiva, se ensayaron, aproximadamente, 3000 compuestos antisentido de gápmero 5-10-5 MOE de nuevo diseño dirigidos a ANGPTL3 humana en células Hep3B para determinar su efecto sobre el ARNm de la ANGPTL3 humana in vitro (ejemplo 1). Los niveles de inhibición del ARNm de los nuevos compuestos antisentido se evaluaron con algunos compuestos antisentido anteriormente diseñados (233717, 337484, 337487, 337492 y 337516) utilizados como referentes en estudios seleccionados. De los, aproximadamente, 3000 compuestos antisentido diseñados recientemente de este primer cribado, se seleccionaron, aproximadamente, 85 compuestos antisentido para estudios de inhibición dependiente de la dosis in vitro para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) (ejemplos 2-3). De los, aproximadamente, 85 nuevos compuestos antisentido ensayados para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰), se seleccionaron, aproximadamente, 38 compuestos antisentido que demostraron una reducción potente dependiente de la dosis de la ANGPTL3 en ensayos de potencia y tolerabilidad in vivo (ALT y AST) en ratones (ejemplos 11-12) con el compuesto antisentido 233710 utilizado como referente.

En un segundo cribado descrito en la presente memoria descriptiva, se ensayaron también, aproximadamente, 2000 compuestos antisentido de nuevo diseño dirigidos a ANGPTL3 humano con un motivo de gápmero MOE o un motivo mixto (desoxi, 5-10-5 MOE y gápmeros cEt) en células Hep3B para determinar su efecto in vitro sobre el ARNm de la ANGPTL3 humana (ejemplos 4-6). Los niveles de inhibición de los nuevos compuestos antisentido se evaluaron con algunos compuestos antisentido diseñados anteriormente (233717, 337487, 337513, 337514 y 337516) utilizados como referentes en estudios seleccionados. De los, aproximadamente, 2000 compuestos antisentido diseñados recientemente de este segundo cribado, se seleccionaron, aproximadamente, 147 compuestos antisentido para estudios de inhibición dependiente de la dosis in vitro para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) (ejemplos 7-10). De los, aproximadamente, 147 nuevos compuestos antisentido ensayados para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰), se seleccionaron, aproximadamente, 73 compuestos antisentido que demostraron una reducción potente dependiente de la dosis de la ANGPTL3 en ensayos de potencia y tolerabilidad in vivo (por ejemplo, ALT y AST) en ratones (ejemplos 11-12) con el compuesto antisentido 233710 utilizado como referente.

De los, aproximadamente, 111 compuestos antisentido de los cribados uno y dos que se ensayaron para determinar la potencia y la tolerabilidad en ratones, se seleccionaron 24 para ensayos de tolerabilidad más exhaustivos en ratones mediante la evaluación de marcadores metabólicos hepáticos, tales como alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), albúmina y bilirrubina, así como los marcadores metabólicos de riñón BUN y creatinina y peso de órganos (ejemplo 12).

En paralelo con los estudios murinos in vivo, se seleccionaron diecisiete compuestos antisentido para el ensayo de viscosidad (ejemplo 13). Generalmente, los compuestos antisentido que no eran óptimos en viscosidad no se hicieron avanzar a estudios posteriores.

Basándose en los resultados del estudio de tolerabilidad en ratones, se seleccionaron veinte compuestos antisentido para el ensayo de tolerabilidad in vivo en ratas (ejemplo 14). En las ratas, se midieron marcadores metabólicos hepáticos, tales como ALT, AST, albúmina y bilirrubina, pesos corporales y de órganos, así como marcadores metabólicos renales, tales como BUN, creatinina y la relación proteína/creatinina total, para determinar la tolerabilidad de un compuesto in vivo.

También se evaluó la reactividad cruzada de los veinte compuestos antisentido ensayados en las ratas con una secuencia del gen ANGPTL3 de mono rhesus (ejemplo 15). Aunque los compuestos antisentido de este estudio se ensayaron en monos cynomolgus, la secuencia ANGPTL3 del mono cynomolgus no estaba disponible para la comparación con las secuencias de los compuestos de longitud completa, por lo tanto, las secuencias de los compuestos antisentido se compararon con las del mono rhesus, estrechamente relacionado. Se descubrió que las secuencias de ocho compuestos antisentido tenían 0-2 emparejamientos erróneos con la secuencia del gen de la ANGPTL3 de rhesus y se estudiaron adicionalmente en monos cynomolgus (ejemplo 15). Los ocho compuestos antisentido (ISIS 563580, ISIS 560400, ISIS 567320, ISIS 567321, ISIS 544199, ISIS 567233, ISIS 561011 e ISIS 559277) se ensayaron para determinar la inhibición del ARNm de la ANGPTL3 y la expresión de proteínas, así como la tolerabilidad en los monos. En los estudios de tolerabilidad, se midieron los pesos corporales, marcadores metabólicos hepáticos (ALT, AST y bilirrubina), marcadores metabólicos renales (BUN y creatinina), parámetros hematológicos (hemogramas, hemoglobina y hematocrito) y marcadores proinflamatorios (PCR y C3). Además, se midió la concentración de oligonucleótidos de longitud completa presente en el hígado y el riñón y se calculó la proporción de oligonucleótidos de longitud completa en el riñón/hígado.

Por consiguiente, en la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos antisentido con una o más características cualesquiera mejoradas, por ejemplo, mejoradas con respecto a los compuestos antisentido descritos en la Patente WO2011/085271. En determinados aspectos, en la presente memoria descriptiva, se dan a conocer compuestos antisentido que comprenden un oligonucleótido modificado, tal como se describe en la presente memoria descriptiva direccionado a una región de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-2, o específicamente hibridable con la misma.

En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son eficaces en virtud de su potencia para inhibir la expresión de la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones inhiben la ANGPTL3 en, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, un 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 % o, como mínimo, un 95 %.

En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son eficaces en virtud de una IC⁵⁰ in vitro de menos de 20 p.M, menos de 10 p.M, menos de 8 p.M, menos de 5 p.M, menos de 2 p.M, menos de 1 p.M, menos de 0,9 |j.M, menos de 0,8 p.M, menos de 0,7 p.M, menos de 0,6 p.M, o menos de 0,5 p.M cuando se ensayan en células humanas, por ejemplo, en la línea celular Hep3B (tal como se describe en los ejemplos 2-3 y 7-10). Entre los compuestos antisentido que tienen una IC⁵⁰ <1,0 p.M se incluyen las SEQ ID NO: 15, 20, 24, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44, 47, 50, 51, 57, 58, 60, 77, 79, 82, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 100, 101, 104, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 169, 170, 177, 188, 209, 210, 211,212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 y 232. Entre los compuestos antisentido que tienen una IC⁵⁰ <0,9 p.M se incluyen las SEQ ID NO: 15, 20, 35, 36, 42, 43, 44, 50, 57, 60, 77, 79, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 101, 104, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 177, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 y 232. Entre los compuestos antisentido que tienen una IC⁵⁰ <0,8 |¿M se incluyen las SEQ ID NO: 15, 20, 35, 36, 42, 43, 44, 50, 57, 60, 77, 79, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 101, 104, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 122, 123, 124,125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 177, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 228, 229, 230, 231 y 232. Entre los compuestos antisentido que tienen una IC⁵⁰ <0,7 pMI se incluyen las SEQ ID NO: 15, 20, 36, 42, 43, 57, 60, 114, 117, 127, 131, 177, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 228, 229, 230, 231 y 232. Entre los compuestos antisentido que tienen una IC⁵⁰ <0,6 p.M se incluyen las SEQ ID NO: 15, 20, 36, 42, 43, 57, 60, 114, 117, 127, 131, 177, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 224, 225, 228, 229, 230, 231 y 232. Entre los compuestos antisentido que tienen una IC⁵⁰ <0,5 p.M se incluyen las SEQ ID NO: 43, 114, 117, 127, 131, 177, 209, 210, 211, 212, 215, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 229, 230 y 232.

En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son eficaces en virtud de tener una viscosidad de menos de 40 cP, menos de 35 cP, menos de 30 cP, menos de 25 cP, menos de 20 cP, menos de 15 cP o menos de 10 cP cuando se miden mediante un ensayo (tal como se describe en el ejemplo 13). Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad superior a 40 cP tendrían una viscosidad inferior a la óptima. Entre los compuestos antisentido que tienen una viscosidad <20 cP se incluyen las SEQ ID NO: 16, 18, 20, 34, 35, 36, 38, 49, 77, 90, 93 y 94. Entre los compuestos antisentido que tienen una viscosidad <15 cP se incluyen las SEQ ID NO: 16, 18, 20, 34, 35, 38, 49, 90, 93 y 94. Entre los compuestos antisentido que tienen una viscosidad <10 cP se incluyen las SEQ ID NO: 18, 34, 35, 49, 90, 93 y 94.

En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son altamente tolerables, como lo demuestran las mediciones de tolerabilidad in vivo descritas en los ejemplos. En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son altamente tolerables, tal como se demuestra al tener un aumento en el valor de ALT y/o AST de no más de 3 veces, 2 veces o 1,5 veces, con respecto a los animales tratados con solución salina.

En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son eficaces en virtud de que tienen una o más de una potencia de inhibición mayor del 50 %, una IC⁵⁰ in vitro de menos de 1 p.M, una viscosidad de menos de 20 cP y un aumento no más de 3 veces en ALT y/o AST.

En determinadas realizaciones, es preferente el ISIS 563580 (SEQ ID NO: 77). Se descubrió que este compuesto era un potente inhibidor en ratones transgénicos ANGPTL3 y el compuesto antisentido más tolerable. Tenía una viscosidad aceptable de, aproximadamente, 16,83 cP y un valor de IC⁵⁰ de <0,8 p.M in vitro. En ratones, no tuvo más de un aumento de 3 veces en los niveles de ALT y/o AST respecto a los animales tratados con solución salina. Además, en los monos, se encontraba entre los compuestos más tolerables y potentes para inhibir la ANGPTL3 y tenía la mejor proporción de concentración de oligonucleótidos de longitud completa.

Se descubrió que el ISIS 544199 (SEQ ID NO: 20) era un compuesto antisentido potente y tolerable. Tenía una viscosidad aceptable de 1,7 cP y un valor de IC⁵⁰ de <0,5 p.M in vitro. En ratones, no tuvo más de un aumento de 3 veces en los niveles de ALT y/o AST respecto a los animales tratados con solución salina. Además, en los monos, se encontraba entre los compuestos más potentes para inhibir la ANGPTL3 y tenía una buena proporción de concentración de oligonucleótidos de longitud completa.

Se descubrió que el ISIS 559277 (SEQ ID NO: 110) era un compuesto antisentido potente y tolerable. Tenía un valor de IC⁵⁰ de <0,8 p.M in vitro. En ratones, no tuvo más de un aumento de 3 veces en los niveles de ALT y/o AST respecto a los animales tratados con solución salina. Además, en los monos, se encontraba entre los compuestos más potentes para inhibir la ANGPTL3 y tenía una buena proporción de concentración de oligonucleótidos de longitud completa.

EJEMPLOS

Si bien determinados compuestos, composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva se han descrito con especificidad según determinadas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva y no pretenden limitar a la misma.

Ejemplo 1: inhibición antisentido de la proteína de tipo angiopoyetina 3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE

Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de la proteína de tipo angiopoyetina 3 (ANGPTL3) y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con 4.500 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492 MGB (secuencia directa CCGTGGAAGACCAATATAAACAATT, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 4; AGTCCTTCTGAGCTGATTTTCTATTTCT; secuencia inversa, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 5; secuencia de sonda AACCAACAGCATAGTCAAATA, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 6) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3’ tiene una modificación 2’-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia de genes humanos. Cada gápmero enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humana, designado en la presente memoria descriptiva como la SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ iD NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncada de los nucleótidos 33032001 a 33046000). ’n/a’ indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.

Tabla 1

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Tabla 2

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Tabla 3

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( c o n t i n u a c i ó n )

T a b l a 4

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Tabla 5

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T a b l a 6

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Tabla 7

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Tabla 8

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Tabla 9

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( c o n t i n u a c ió n )

T a b l a 10

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T a b l a 11

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Tabla 12

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Tabla 13

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( c o n t i n u a c i ó n )

T a b l a 14

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Ejemplo 2: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE

Se seleccionaron los gápmeros 5-10-5 MOE de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in

vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,75 pM, 1,50 pM, 3,00 pM, 6,00 pM y 12,00 pM de oligonucleótido anti especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el

ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los

niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ArN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) de cada oligonucleótido. Los niveles de

ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas

con oligonucleótidos antisentido.

Tabla 15

Ejemplo 3: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE

Se seleccionaron los gápmeros 5-10-5 MOE de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,813 p.M, 1,625 p.M, 3,25 p.M, 6,50 p.M y 13,00 p.M de oligonucleótido antisentido, tal como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ArN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

T a b la 16

T a b la 17

( c o n t in u a c ió n )

T a b la 18

Tabla 19

Tabla 20

Tabla 21

Tabla 22

Tabla 23

(continuación)

Ejemplo 4: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros desoxi, MOE y (S)-cEt

Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con 4.500 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492 _MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en los que el nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o un residuo de desoxi azúcar. Las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido antisentido se describen como ’eek-d10-kke’, donde ’k’ indica una modificación de azúcar (S)-cEt; ’d’ indica desoxirribosa; el número indica el número de residuos de azúcares desoxirribosa; y ’e’ indica una modificación de azúcar MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada oligonucleótido son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada oligonucleótido son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. Cada oligonucleótido enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humano, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como S^eQ ID NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncada de nucleótidos 33032001 a 33046000). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.

Tabla 24

(continuación)

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Tabla 25

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Ejemplo 5: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros desoxi, MOE y (S)-cEt

Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. ISIS 337487 e ISIS 233717, que son gápmeros de 5-10-5 MOE, se incluyeron también en el ensayo como oligonucleótidos referentes. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño, en las tablas siguientes, se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt o gápmeros 5-10-5 MOE. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en los que el nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o un residuo de desoxi azúcar. Las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido antisentido se describen como ’eek-d10-kke’, donde ’k’ indica una modificación de azúcar (S)-cEt; ’d’ indica desoxirribosa; el número indica el número de residuos de azúcares desoxirribosa; y ’e’ indica una modificación MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de alas en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los enlaces internucleosídicos en cada oligonucleótido son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada oligonucleótido son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. Cada oligonucleótido enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humano, designado en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncado de nucleótidos 33032001 a 33046000). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.

:2 8 c O

c_o 8

coo

T a b l a 27

( c o n t i n u a c ió n )

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

( c o n t i n u a c ió n )

(continuación)

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(continuación)

(continuación)

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(continuación)

(continuación)

c c '3Cs

¡ ^c Q 'a

Tabla 30

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(continuación)

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Ejemplo 6: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE

Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE o 3-10-4 MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 3-10-4 MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden tres y cuatro nucleósidos, respectivamente. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3’ tiene una modificación 2’-MOE. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3’ tiene una modificación 2’-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el gápmero secuencia de genes humanos. Cada gápmero enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humana, designado en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como S^eQ ID NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncada de nucleótidos 33032001 a 33046000). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.

Tabla 31

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Ejemplo 7: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B

Se seleccionaron y ensayaron oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. ISIS 233717 e ISIS 337847, ambos gápmeros 5-10-5 MOE, se incluyeron también en los estudios. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas a continuación.

Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,813 pM, 1,625 pM, 3,25 pM, 6,500 pM y 13,00 pM de oligonucleótido antisentido, tal como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

T a b l a 32

T a b l a 33

T a b l a 34

Tabla 35

(continuación)

Ejemplo 8: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B

Se seleccionaron y ensayaron oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. ISIS 337847, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también en los estudios. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas a continuación.

Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,160 pM, 0,481 pM, 1,444 pM, 4,333 pM y 13,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

T a b l a 36

( c o n t i n u a c i ó n )

T a b l a 37

T a b l a 38

(continuación)

Ejemplo 9: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE

Se seleccionaron y ensayaron gápmeros MOE de los ejemplos anteriores que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,160 pM, 0,481 pM, 1,444 pM, 4,333 pM y 13,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el a Rn de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ArN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

Tabla 39

Ejemplo 10: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt

Se seleccionaron y ensayaron oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,111 pM, 0,333 pM, 1,00 pM, 3,00 pM y 9,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.

También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC⁵⁰) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

T a b l a 40

T a b la 42

Tabla 43

Ejemplo 11: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en ratones transgénicos huANGPTL3

De los oligonucleótidos antisentido descritos en los estudios anteriores, se evaluó adicionalmente su capacidad para reducir el transcrito de ARNm de la ANGPTL3 humana en ratones C57B1/6 con el transgén de la ANGPTL3 humana (ratones Tg).

Estudio 1

Se mantuvieron ratones Tg hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO, de Antisense oligonucleotides) en solución salina tamponada (PBS, de Phosphate Saline Buffer) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 50 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con los oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con RTS3492_MGB. Los niveles de ARNm también se midieron con el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS1984 (secuencia directa CTTCAATGAAACGTGGGAGAACT, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 7; secuencia inversa TCTCTAGGCCCAACCAAAATTC, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 8; secuencia de la sonda AAATATGGTTTTGGGAGGCTTGAT, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 9). Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3, en comparación con el control de PBS.

T a b l a 44

Análisis de proteínas

Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo # DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de proteína ANGPTL3.

T a b la 45

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 10° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

T a b l a 46

Estudio 2

Se mantuvieron ratones Tg macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 50 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. Los grupos inyectados con PBS sirvieron como grupos de control con los que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con RTS1984. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.

T a b l a 47

Análisis de proteínas

Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultados niveles reducidos de la proteína ANGPTL3.

Tabla 48

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 8° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 49

Estudio 3

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 2,5 mg/kg, 12,5 mg/kg o 25 mg/kg una vez por semana durante 3 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. Los grupos inyectados con PBS sirvieron como grupos de control con los que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022 (secuencia directa AAATTTTAGCCAATGGCCTCC, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 10; secuencia inversa TGTCATTAATTTGGCCCTTCG, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 11; secuencia de sonda TCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCC, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 12). Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS. Se presenta también la ED⁵⁰ de cada gápmero en la tabla siguiente. ’n.d.’ indica que no se pudo determinar la ED⁵⁰.

Tabla 50

Análisis de proteínas

Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultados niveles reducidos de la proteína ANGPTL3. ’n. d.’ indica que no se pudo determinar la ED⁵⁰.

Tabla 51

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 17° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 52

Estudio 4

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.

Tabla 53

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 10° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 54

Estudio 5

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE o gápmeros desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con RTS1984. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.

Tabla 55

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 9° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 56

Estudio 6

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con varios de los oligonucleótidos antisentido de ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.

Tabla 57

Análisis de proteínas

Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con varios de los oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de proteína ANGPTL3.

Tabla 58

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 10° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 59

Estudio 7

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.

Tabla 60

Análisis de proteínas

Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos ISIS dio resultados niveles reducidos de la ANGPTL3. En este caso, el valor’ 0’ implica que el tratamiento con el oligonucleótido ISIS no inhibió la expresión; en algunos casos, se puede haber registrado un aumento de los niveles de expresión.

Tabla 61

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 9° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 62

Estudio 8

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, también se incluyó como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.

Tabla 63

Análisis de proteínas

Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1: 20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con los oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de la ANGPTL3.

Tabla 64

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 8° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 65

Estudio 9

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos antisentido de ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS. En este caso, el valor ’0’ implica que el tratamiento con el oligonucleótido ISIS no inhibió la expresión; en algunos casos, se puede haber registrado un aumento de los niveles de expresión.

Tabla 66

Análisis de proteínas

Los niveles de proteína ANGPTL3 humana se cuantificaron utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de la ANGPTL3. En este caso, el valor ’0’ implica que el tratamiento con el oligonucleótido ISIS no inhibió la expresión; en algunos casos, se puede haber registrado un aumento de los niveles de expresión.

Tabla 67

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 9° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 68

Estudio 10

Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.

Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE u oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 5 mg/kg, 12,5 mg/kg o 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.

Análisis de ARN

Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022, y también con RTS3492_MGB. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos antisentido de ISIS dio como resultado una reducción del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.

Tabla 69

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 8° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 70

Ejemplo 12: tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a ANGPTL3 humano en ratones CD1 Los ratones CD1® (Charles River, Massachussets) son un modelo de ratones multipropósito, que se utiliza con frecuencia para ensayos de seguridad y eficacia. Se trataron ratones con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.

Estudio 1

Se inyectó por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (un animal por grupo de tratamiento) una dosis única de 200 mg/kg de oligonucleótido desoxi, MOE y cEt. Se inyectó por vía subcutánea a un ratón macho CD1 una dosis única de PBS. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 4° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 71

Pesos corporales

Se midieron los pesos corporales un día después de la dosis única de oligonucleótido ISIS y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.

Tabla 72

Estudio 2

Se inyectó por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (un animal por grupo de tratamiento) una dosis única de 200 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Se inyectó por vía subcutánea a un ratón macho CD1 una dosis única de PBS. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 5° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 73

Pesos corporales

Los pesos corporales se midieron el 5° día después de la dosis única de oligonucleótido ISIS y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido fueron excluidos de estudios adicionales.

Tabla 74

Estudio 3

Se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (cuatro animales por grupo de tratamiento) 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE administrados una vez a la semana durante 6 semanas. A un grupo de 4 ratones CD1 macho se le inyectó por vía intraperitoneal PBS administrado una vez a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional. Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS, se midieron los niveles plasmáticos de diversos marcadores de función hepática y renal el 45° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 75

Pesos corporales

Los pesos corporales se midieron el 43° día y se presentan en la tabla siguiente. Se midieron los pesos de riñón, hígado y bazo al final del estudio el 45° día. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 76

Estudio 4

Se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (cuatro animales por grupo de tratamiento) 50 mg/kg o 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE u oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt administrados una vez a la semana durante 6 semanas. A un grupo de 4 ratones CD1 macho se le inyectó por vía intraperitoneal PBS administrado una vez a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS, se midieron los niveles plasmáticos de diversos marcadores de función hepática y renal el 46° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 77

Pesos corporales

Los pesos corporales se midieron el 44° día y se presentan en la tabla siguiente. Se midieron los pesos de riñón, hígado y bazo al final del estudio el 46° día. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 78

Estudio 5

Se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (cuatro animales por grupo de tratamiento) 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt administrados una vez a la semana durante 6 semanas. A un grupo de 4 ratones CD1 macho se le inyectó por vía intraperitoneal PBS administrado una vez a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.

Marcadores de química plasmática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS, se midieron los niveles plasmáticos de diversos marcadores de función hepática y renal el 43° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 79

Pesos corporales

Los pesos corporales se midieron el 41° día y se presentan en la tabla siguiente. Se midieron los pesos de riñón, hígado y bazo al final del estudio el 43° día. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.

Tabla 80

Ejemplo 13: medición de la viscosidad de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a ANGPTL3 humana Se midió la viscosidad de oligonucleótidos antisentido seleccionados de los estudios descritos anteriormente con el objetivo de cribar oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad de más de 40 centipoise (cP). Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad superior a 40 cP tendrían una viscosidad inferior a la óptima.

Se pesaron oligonucleótidos ISIS (32-35 mg) en un vial de vidrio, se añadieron 120 |j.l de agua y se disolvió el oligonucleótido antisentido en una solución calentando el vial a 50 °C. Se pipeteó una parte (75 |j.l) de la muestra precalentada a un microviscosímetro (Cambridge). La temperatura del microviscosímetro se fijó en 25 °C y se midió la viscosidad de la muestra. Se pipeteó otra parte (20 |j.l) de la muestra precalentada en 10 ml de agua para lectura UV a 260 nM a 85 °C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, donde la concentración de cada oligonucleótido antisentido fue 350 mg/ml, e indican que la mayoría de las soluciones de oligonucleótidos antisentido son óptimas en su viscosidad bajo el criterio establecido anteriormente.

Tabla 81

Ejemplo 14: tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a ANGPTL3 humana en ratas Sprague-Dawley

Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito utilizado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Las ratas se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los ejemplos anteriores y se evaluaron los cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.

Estudio 1

Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. Se inyectaron por vía subcutánea, a grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno una vez a la semana durante 6 semanas, PBS o 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se recogieron los órganos y el plasma para análisis posteriores.

Función hepática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) el 45° día y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresados en UI/l. Se midieron también los niveles plasmáticos de bilirrubina utilizando el mismo analizador de química clínica y los resultados también se presentan en la tabla siguiente expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 82

Función renal

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Se midieron los niveles de proteína total en orina y creatinina en orina, y se evaluó la proporción entre proteína total en orina respecto a la creatinina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.

Tabla 83

Tabla 84

Pesos de órganos

Se midieron los pesos corporales el 42° día y se presentan en la tabla siguiente. Los pesos de hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio el 45° día y se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 85

Estudio 2

Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. Se inyectaron por vía subcutánea, a grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno una vez a la semana durante 6 semanas, PBS o con 50 mg/kg o 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE u oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se recogieron los órganos y el plasma para análisis posteriores.

Función hepática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) se midieron el 44° día y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresados en UI/l. Los niveles plasmáticos de bilirrubina también se midieron utilizando el mismo analizador de química clínica y los resultados también se presentan en la tabla siguiente expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 86

Función renal

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina el 44° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Se midieron los niveles de proteína total en orina y creatinina en orina, y se evaluó la proporción entre proteína total en orina respecto a la creatinina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.

Tabla 87

Tabla 88

Pesos de órganos

Los pesos corporales se midieron el 42° día y se presentan en la tabla siguiente. Los pesos de hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio el 44° día y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido fueron excluidos de estudios adicionales.

Tabla 89

Estudio 3

Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. Se inyectaron por vía subcutánea, a grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno una vez a la semana durante 6 semanas, PBS o 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se recogieron los órganos y el plasma para análisis posteriores.

Función hepática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) se midieron el 44° día y los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en Ul/l. Se midieron también los niveles plasmáticos de bilirrubina utilizando el mismo analizador de química clínica y los resultados se presentan también en la tabla siguiente expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 90

Función renal

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina el 44° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Se midieron los niveles de proteína total en orina y creatinina en orina, y se evaluó la proporción entre proteína total en orina respecto a la creatinina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.

Tabla 91

Tabla 92

Pesos de órganos

Los pesos corporales se midieron el 42° día y se presentan en la siguiente tabla. Los pesos de hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio el 44° día y se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.

Tabla 93

Ejemplo 15: efecto de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a ANGPTL3 humana en monos cynomolgus Se trataron monos cynomolgus con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos en los ejemplos anteriores. Se evaluaron la eficacia y la tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y el riñón.

En el momento en que se llevó a cabo este estudio, la secuencia genómica del mono cynomolgus no estaba disponible en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia del gen del mono cynomolgus. En cambio, se comparó la homología de las secuencias de los oligonucleótidos antisentido ISIS utilizados en los monos cynomolgus con una secuencia de mono rhesus. Se espera que los oligonucleótidos ISIS con homología con la secuencia del mono rhesus también presenten una reacción cruzada completa con la secuencia del mono cynomolgus. Los oligonucleótidos antisentido humanos ensayados presentan reactividad cruzada con la secuencia genómica de rhesus (GENBANK Accession No NW_001108682.1 truncado de los nucleótidos 3049001 a 3062000, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 3). Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia del mono rhesus, es más probable que el oligonucleótido humano pueda reaccionar de forma cruzada con la secuencia del mono rhesus. Los sitios de inicio y parada de cada oligonucleótido para SEQ ID NO: 3 se presentan en la tabla siguiente. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen del mono rhesus. "Emparejamiento erróneo" indica el número de nucleobases en el oligonucleótido humano que no coinciden con la secuencia genómica de rhesus.

Tabla 94

Tratamiento

Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante, como mínimo, un período de 30 días, durante el cual se observó a los animales diariamente para verificar su salud general. Los monos tenían entre 2 y 4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. Se inyectó por vía subcutánea, a nueve grupos de 5 monos cynomolgus macho asignados aleatoriamente cada uno, oligonucleótido ISIS o PBS en cuatro sitios en la espalda en una rotación en el sentido de las agujas del reloj (es decir, izquierda, superior, derecha e inferior), un sitio por dosis. Los monos recibieron dosis de administración de PBS o 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS cada dos días durante la primera semana (1°, 3°, 5° y 7° día) y posteriormente se les administró una dosis una vez a la semana durante 12 semanas (14°, 21°, 28°, 35°, 42°, 49°, 56°, 63°, 70°, 77° y 84° día) de PBS o 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS.

Durante el período de estudio, se observó a los monos dos veces al día en busca de signos de enfermedad o angustia. Cualquier animal que experimentara un dolor o angustia más que momentáneo o leve debido al tratamiento, lesión o enfermedad fue tratado por el personal veterinario con analgésicos o agentes aprobados para aliviar el dolor después de consultar con el director del estudio. Se identificó cualquier animal con mala salud o en un posible estado moribundo para un mayor seguimiento y posible eutanasia. Por ejemplo, en el 45° día se encontró moribundo un animal en el grupo de tratamiento con ISIS 567321 y se sacrificó. El sacrificio programado de los animales se llevó a cabo el 86° día (aproximadamente 48 horas después de la dosis final) mediante exanguinación después de anestesia inducida mediante ketamina/xilacina y la administración de pentobarbital sódico. Los protocolos descritos en el ejemplo fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Reducción en la diana hepática

Análisis de ARN

El 86° día, se extrajo el ARN del hígado para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS. El análisis de los niveles de ARNm de la ANGPTL3 reveló que ISIS 544199 e ISIS 559277, ambos con reactividad cruzada completa con la secuencia de rhesus, redujeron significativamente los niveles de expresión. Otros oligonucleótidos de ISIS, que staban dirigidos a la secuencia del mono con emparejamientos erróneos, también pudieron reducir los niveles de ARNm de la ANGPTL3.

Tabla 95

Análisis de proteínas

Se recogió, aproximadamente, 1 ml de sangre de todos los animales disponibles el día 85 y se colocó en tubos que contenían la sal potásica de EDTA. Las muestras de sangre se colocaron en hielo y se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a 4 °C) para obtener plasma.

Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo # DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. El análisis de ANGPTL3 plasmática reveló que ISIS 563580, 544199 e ISIS 559277 redujeron los niveles de proteína de manera sostenida. Otros oligonucleótidos de ISIS también pudieron reducir los niveles de la ANGPTL3.

Tabla 96

Estudios de tolerabilidad

Mediciones de peso corporal

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los pesos corporales estaba dentro del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de los pesos corporales de los monos.

Tabla 97

Función hepática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se extrajeron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la administración de la dosis. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y posteriormente se centrifugaron (aproximadamente 3000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Se midieron los niveles de diversos marcadores de función hepática utilizando un analizador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT y AST y los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en UI/l. La bilirrubina, un marcador de la función hepática, se midió de manera similar y se presenta en la tabla siguiente expresada en mg/dl. Los resultados indican que la mayoría de los oligonucleótidos antisentido no tuvo ningún efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de función hepática en monos.

Tabla 98

Tabla 99

Tabla 100

Función renal

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se extrajeron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y posteriormente se centrifugaron (aproximadamente 3000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Los niveles de BUN y creatinina se midieron utilizando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl.

Los datos de la química plasmática indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de la función renal de los monos.

Tabla 101

Tabla 102

Hematología

Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus sobre los parámetros hematológicos, se recogieron muestras de sangre de, aproximadamente, 0,5 ml de sangre de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K²-EDTA. Se analizó de las muestras el recuento de glóbulos rojos (RBC, de red blood cell), recuento de glóbulos blancos (WBC, de white blood cell), recuentos individuales de glóbulos blancos, tales como el de monocitos, neutrófilos, linfocitos, así como para el recuento de plaquetas, el contenido de hemoglobina y el hematocrito, utilizando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, EE. UU.). Los datos se presentan en las tablas siguientes.

Los datos indican que los oligonucleótidos no provocaron cambios en los parámetros hematológicos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de parámetros hematológicos de los monos.

Tabla 103

Tabla 104

Efecto sobre moléculas proinflamatorias

Para evaluar cualquier efecto inflamatorio de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus, se tomaron muestras de sangre para el análisis de la proteína C reactiva y los niveles de C3 el 84° día antes de la dosis. Se recogieron, aproximadamente, 1,5 ml de sangre de cada animal y se colocaron en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 min y posteriormente se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente para obtener suero. Se midió la proteína C reactiva (CRP) y el complemento C3, que sirven como marcadores de inflamación, utilizando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 563580 fue tolerable en monos.

Tabla 105

Tabla 106

Medición de la concentración de oligonucleótidos

Se midió la concentración de oligonucleótidos de longitud completa. El procedimiento utilizado es una modificación de los procedimientos publicados anteriormente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consisten en una extracción con fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida de una extracción en fase sólida. Se añadió un patrón interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 2’-O-metoxietilo 27-mero, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 13) antes de la extracción. Las concentraciones de las muestras de tejido se calcularon utilizando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ, de lower limit of quantitation) de, aproximadamente, 1,14 |¿g/g. Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados como |¿g/g de tejido de hígado o riñón. Se calculó la proporción de concentraciones de oligonucleótidos de longitud completa en el riñón respecto al hígado. Se descubrió que la proporción de concentraciones de oligonucleótidos de longitud completa en el riñón respecto al hígado después del tratamiento con ISIS 563580 era la óptima, en comparación con otros compuestos evaluados.

Tabla 107

Ejemplo 16: ensayo clínico ISIS 563580

Para evaluar el efecto del fármaco de estudio ISIS 563580, se realizó un estudio de fase 1, ciego, aleatorizado, controlado con placebo y de aumento de la dosis en voluntarios sanos con un perfil lipídico normal. El estudio evaluó la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética, efecto sobre los niveles plasmáticos de ANGPLT3 y el perfil de lipoproteínas de los individuos del estudio después de dosis únicas y múltiples del fármaco de estudio ISIS 563580. La población del estudio fueron hombres o mujeres sanos de entre 18 y 65 años inclusive. Entre los criterios de exclusión se incluyeron anomalías clínicamente significativas en la historia clínica y en los valores de laboratorio de detección de cualquiera de los individuos. Los individuos fueron aleatorizados 3:1 para recibir ISIS 563580 o placebo dentro de cada cohorte de dosis única y dosis múltiple. A los individuos se les administró el fármaco del estudio o el placebo por vía subcutánea (SC).

Se recogieron muestras de sangre y orina regularmente durante todo el estudio para los análisis de seguridad, farmacocinéticos y farmacodinámicos. Se evaluó la seguridad y tolerabilidad del ISIS 563580 determinando la incidencia, la gravedad y la relación de dosis de acontecimientos adversos, signos vitales y parámetros de laboratorio clínico. Los resultados de seguridad en individuos tratados con ISIS 563580 se compararon con los de individuos tratados con placebo.

Los acontecimientos adversos más frecuentes fueron reacciones locales leves en el lugar de la inyección. El tratamiento con ISIS 563580 fue generalmente bien tolerado y demostró un perfil de seguridad aceptable.

Fármaco de estudio y tratamiento para estudio de dosis única

Se proporcionó una solución del fármaco del estudio ISIS 563580 (200 mg/ml, 1,0 ml) contenida en viales de vidrio con tapón de 2 ml. Los viales eran para una sola utilización. La solución ISIS 563580 y el placebo se preparan por un farmacéutico (o delegado calificado). Un profesional capacitado administró una dosis única del fármaco del estudio en el abdomen, el muslo o el área externa de la parte superior del brazo en cada día de administración. En este estudio se inscribieron un total de 16 individuos. El diseño del estudio se presenta en la siguiente tabla:

Tabla 108: diseño de estudio para el estudio de dosis única con ISIS 563580

Los volúmenes de inyección subcutánea fueron de 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 ml para las cohortes A, B, C y D, respectivamente, con el volumen de 2,0 ml administrado como 2 inyecciones no contiguas de 1,0 ml. Para la cohorte A, se requirió un período de, como mínimo, 24 horas entre la administración del fármaco de estudio a los 2 primeros individuos y los 2 individuos restantes de la cohorte. El aumento de la dosis procedió cuando los individuos de la cohorte de dosis única anterior habían completado la administración de dosis y las evaluaciones de seguridad del 4° día demostraron un perfil de seguridad aceptable.

La duración de la participación de cada individuo fue de, aproximadamente, 8 semanas, incluido un período de cribado de 4 semanas, una dosis única y un período de evaluación posterior al tratamiento de 4 semanas. Los individuos tuvieron visitas de seguimiento en el centro de estudio el 2°, 4°, 8°, 15° día y un contacto telefónico el 30° día. Se está evaluando el efecto del fármaco del estudio.

Fármaco de estudio y tratamiento para el estudio de dosis múltiples

Se proporcionó una solución del fármaco de estudio ISIS 563580 (200 mg/ml, 1,0 ml) contenida en viales de vidrio con tapón. Los viales eran para una sola utilización. La solución de ISIS 563580 y el placebo se prepararon por un farmacéutico (o delegado calificado). Un profesional capacitado administró el fármaco del estudio en el abdomen, el muslo o el área exterior de la parte superior del brazo en cada día de administración. En este estudio se inscribieron un total de 32 individuos. El diseño del estudio se presenta en la siguiente tabla.

Tabla 109: diseño de estudio para el estudio de dosis múltiple con ISIS 563580

Los volúmenes de inyección subcutánea fueron 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 ml para las cohortes AA, BB, CC y DD, respectivamente, con el volumen de 2,0 ml administrado como 2 inyecciones no contiguas de 1,0 ml. La administración de dosis de la primera cohorte (Cohorte AA) comenzó después de que, como mínimo, 4 individuos en la cohorte de dosis única (Cohorte D) hubieran completado la administración de dosis y las evaluaciones de seguridad del 4° Día demostraron un perfil de seguridad aceptable. Los individuos recibieron 3 dosis subcutáneas del fármaco de estudio durante la semana 1 en días alternativos (1°, 3° y 5° día) seguidas de administraciones subcutáneas una vez a la semana durante las siguientes 5 semanas (8°, 15°, 22°, 29° y 36° día) para un total de 8 dosis.

La duración de la participación de cada individuo fue de, aproximadamente, 5,5 meses, incluido un período de evaluación de 4 semanas, un período de tratamiento de 6 semanas y un período de evaluación posterior al tratamiento de 13 semanas. Los individuos tuvieron visitas de seguimiento en el centro de estudio el 37°, 43°, 50°, 64°, 78°, 92°, 106° y 127° día. Los resultados de los perfiles de lípidos de los individuos en el 36° día se presentan en la tabla siguiente. Los asteriscos indican cambios estadísticamente significativos (p <0,05).

Generalmente, el tratamiento con ISIS 563580 produjo reducciones dependientes de la dosis en plasma de la ANGPTL3, triglicéridos, colesterol LDL, colesterol no HDL, colesterol VLDL, colesterol total, ApoB y ApoC-III el 36° día. En general, la magnitud de las reducciones estuvo asociada con los niveles de lípidos iniciales, con mayores reducciones observadas en individuos con valores iniciales más elevados.

Tabla 110. Cambio porcentual promedio en comparación con el valor inicial en el 36° día

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 17 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 1140 a 1159 la de SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 80 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1, y en el que el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, un azúcar modificado, como mínimo, un enlace internucleosídico modificado y/o, como mínimo, una nucleobase modificada, o una sal del mismo.

2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 18 a 24, 19 a 22 o 20 nucleósidos enlazados.

3. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado tiene, como mínimo, el 85 %, como mínimo, el 90 %, como mínimo, el 95 % o el 100 % de complementariedad con la SEQ ID NO: 1.

4. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, 17, como mínimo, 18, como mínimo, 19 o, como mínimo, 20 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 77.

5. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

(a) el oligonucleótido modificado es monocatenario;

(b) como mínimo, un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado, en el que opcionalmente, como mínimo, un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato;

(c) el oligonucleótido modificado comprende, como mínimo, un azúcar modificado en el que, opcionalmente, como mínimo, un azúcar modificado:

(i) es un azúcar bicíclico; o

(ii) comprende un puente 2'-O-metoxietilo, un etilo restringido, un 3'-fluoro-HNA o un puente 4'-(CH2)n-O-2', en el que n es 1 o 2; y/o

(d) como mínimo, un nucleósido comprende una nucleobase modificada, en la que, opcionalmente, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

6. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido modificado comprende:

un segmento espaciador que consiste en desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; y

un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados,

en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.

7. Compuesto, según la reivindicación 6, en el que el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y comprende:

un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y

un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados,

en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietílico, en el que, como mínimo, un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

8. Compuesto, según la reivindicación 6, en el que el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados.

9. Compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 14 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 77, o una sal del mismo, en el que el oligonucleótido modificado comprende:

un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y

un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados,

en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietílico, en el que, como mínimo, un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

10. Oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende, como mínimo, 14 nucleobases contiguas de la SEQ ID NO: 77, o una sal del mismo, en el que el oligonucleótido modificado comprende:

un segmento espaciador que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;

un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y

un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados,

en el que el segmento espaciador se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietílico, en el que, como mínimo, un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.

11. Composición que comprende un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, u oligonucleótido modificado, según la reivindicación 10, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. Composición que comprende un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11, u oligonucleótido modificado, según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, para su utilización en terapia.

13. Compuesto, según la reivindicación 9 u oligonucleótido modificado, según la reivindicación 10, para su utilización en el tratamiento, prevención o ralentización de la progresión de una enfermedad relacionada con ANGPTL3 elevada.

14. Compuesto u oligonucleótido modificado para su utilización, según la reivindicación 13, en el que la enfermedad es una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular y/o metabólica.

15. Compuesto u oligonucleótido modificado para su utilización, según la reivindicación 14, en el que la enfermedad, trastorno o afección cardiovascular y/o metabólica es obesidad, diabetes, aterosclerosis, dislipidemia, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH), lipodistrofia, cardiopatía coronaria, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hiperlipoacidemia o síndrome metabólico.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citada por el solicitante es únicamente para mayor comodidad del lector. No forman parte del documento de la Patente Europea. Incluso teniendo en cuenta que la compilación de las referencias se ha efectuado con gran cuidado, los errores u omisiones no pueden descartarse; la EPO se exime de toda responsabilidad al respecto.

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