ES2631608T3 - Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 - Google Patents

Abstract

Uso de una glicoproteína de la envoltura aislada de la cepa BG505 del VIH-1, diseñada para tener una sustitución L por A en la posición correspondiente a L111 en la env de la cepa HxB2 del VIH-1 y opcionalmente una sustitución T por N en la posición correspondiente a N332 en la env de la cepa HxB2 del VIH-1 cuando las secuencias de env de BG505 y HxB2 están alineadas para la detección de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro que comprende poner en contacto dicha glicoproteína con un suero animal o humano, aislar la glicoproteína en complejo con los anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, seleccionando así un anticuerpo neutralizante de amplio espectro.

Description

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DESCRIPCION

Variante de la glicoprotema Env del VIH-1 Campo de la invencion

Esta memoria descriptiva se refiere a una nueva glicoprotema de la envoltura del VIH-1 que puede utilizarse como un inmunogeno de la vacuna del VIH-1, como mimetico del tnmero de la Env nativa, para la identificacion de moleculas pequenas para su uso como inmunogeno que se une a anticuerpos neutralizantes de amplio espectro del VIH-1 espedficos, para la identificacion de moleculas pequenas para su uso como un compuesto antiviral que se une a monomeros y/o tnmeros de la glicoprotema de la envoltura del VIH-1 espedficos, como antigenos para cristalizacion y para la identificacion de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro.

Antecedentes de la invencion

El SIDA, o Smdrome de Inmunodeficiencia Adquirida, esta causado por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y se caracteriza por varias caractensticas clmicas incluyendo smdrome consuntivo, degeneracion del sistema nervioso central e inmunosupresion profunda que es el resultado de infecciones oportunistas y neoplasias malignas. El VIH es un miembro de la familia de los lentivirus de retrovirus animales, que incluyen el virus visna de ovejas y los virus de la inmunodeficiencia bovina, felina y de simio (SIV). Hasta el momento se han identificado dos tipos estrechamente relacionados del VIH, denominados VIH-1 y VIH-2, de los cuales el VIH-1 es con mucho la causa mas comun de SIDA. Sin embargo, el VIH-2, que difiere en su estructura genomica y antigenicidad, causa un smdrome clmico similar.

Una partmula infecciosa del VIH consiste en dos hebras identicas de ARN, cada una de aproximadamente 9,2 kb de longitud, empaquetadas dentro de un nucleo de protemas virales. Esta estructura de nucleo esta rodeada por una envoltura de dos capas de fosfolfpidos derivada de la membrana de la celula hospedadora que tambien incluye protemas de membrana codificadas por el virus (Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4a edicion, W.B. Saunders Company, 2000, pag. 454). El genoma del VIH tiene la organizacion 5'-LTR-Gag-Pol-Env-LTR-3' caractenstica de la familia de los retrovirus. Las repeticiones terminales largas (LTR) en cada extremo del genoma viral sirven como sitios de union para las protemas reguladoras transcripcionales del hospedador y regulan la integracion viral en el genoma del hospedador, la expresion genica viral y la replicacion viral.

El genoma del VIH codifica varias protemas estructurales. El gen gag codifica protemas estructurales de la nucleocapside, del nucleo y de la matriz. El gen pol codifica las enzimas transcriptasa inversa (RT), integrasa (IN) y proteasa viral (PR) necesarias para la replicacion viral. El gen tat codifica una protema que se requiere para la elongacion de los transcritos virales. El gen rev codifica una protema que promueve la exportacion nuclear de ARN virales cortados y empalmados incompletos o no cortados y empalmados. El producto del gen vif aumenta la infectividad de las partmulas virales. El producto del gen vpr promueve la importacion nuclear de ADN viral y regula la detencion del ciclo celular G2. Los genes vpu y nef codifican protemas que regulan a la baja la expresion de la celula hospedadora CD4 y mejoran la liberacion del virus de las celulas infectadas. El gen env codifica la glicoprotema de la envoltura viral que se traduce como un precursor de 160 kilodaltons (gp160) y que se escinde por una proteasa celular para producir la glicoprotema externa de la envoltura de 120 kDa (gp120) y la glicoprotema transmembrana de la envoltura de 41 kDa (gp41), las cuales son necesarias para la infeccion de las celulas (Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4a edicion, W.B. Saunders Company, 2000, pags. 454-456). gp140 es una forma modificada de la glicoprotema Env, que contiene la porcion de la glicoprotema de la envoltura de 120 kDa externa y la parte extracelular de la porcion gp41 de Env y tiene caractensticas tanto de gp120 como de gp41. El gen nef esta conservado entre los lentivirus de los primates y es uno de los primeros genes virales que se transcribe tras la infeccion. In vitro se han descrito varias funciones, incluyendo la regulacion a la baja de la expresion en la superficie de CD4 y de MHC de clase I, la alteracion de la senalizacion y activacion de linfocitos T y la potenciacion de la infectividad viral.

La infeccion por el VIH se inicia con la union de gp120 de la partmula viral a las moleculas receptoras de CD4 y quimiocina (por ejemplo, CXCR4, CCR5) de la membrana celular de celulas diana tales como los linfocitos T CD4+, macrofagos y celulas dendnticas. El virus unido se fusiona con la celula diana y se transcribe inversamente el genoma del ARN. El ADN viral resultante se integra en el genoma celular, donde dirige la produccion de nuevo ARN vmco y con ello protemas virales y nuevos viriones. Estos viriones brotan de la membrana celular infectada y establecen infecciones productivas en otras celulas. Este proceso tambien destruye a la celula originalmente infectada. El VIH tambien puede destruir celulas indirectamente porque el receptor CD4 de los linfocitos T no infectados tiene una fuerte afinidad por gp120 expresada en la superficie de las celulas infectadas. En este caso, las celulas no infectadas se unen, a traves de la interaccion receptor de CD4-gp120, a las celulas infectadas y se fusionan para formar un sincitio, el cual no puede sobrevivir. La destruccion de los linfocitos T CD4+, que son cnticos para la defensa inmunitaria, son una causa importante de la disfuncion inmunitaria progresiva que es el sello distintivo de la progresion de la enfermedad del SIDA. La perdida de linfocitos T CD4+ perjudica seriamente la capacidad del cuerpo para combatir a la mayona de los invasores, pero tiene un impacto particularmente grave en las defensas contra virus, hongos, parasitos y ciertas bacterias, incluyendo micobacterias.

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La investigacion sobre la glicoprotema Env ha demostrado que el virus tiene muchos mecanismos protectores eficaces con pocas vulnerabilidades (Wyatt y Sodroski, Science. 1998 Jun 19; 280(5371):1884-8). Para la fusion con sus celulas diana, el VIH-1 utiliza un complejo de Env trimerico que contiene las subunidades gp120 y gp41 (Burton et al., Nat Immunol. 2004 Mar; 5(3):233-6). El potencial de fusion del complejo Env es desencadenado por el acoplamiento del receptor CD4 y un co-receptor, habitualmente CCR5 o CXCR4. Los anticuerpos neutralizantes parecen funcionar bien mediante la union al tnmero maduro en la superficie del virion y evitando eventos iniciales de compromiso del receptor, o por union despues de la union del virion e inhibicion del procedimiento de fusion (Parren y Burton, Adv Immunol. 200177: 195-262). En este ultimo caso, los anticuerpos neutralizantes pueden unirse a epttopos cuya exposicion aumenta o se desencadena mediante la union al receptor. Sin embargo, dados los potenciales efectos antivmcos de los anticuerpos neutralizantes, no es inesperado que el VIH-1 haya desarrollado multiples mecanismos para protegerse de la union al anticuerpo (Johnson & Desrosiers, Annu Rev Med. 2002; 53:499-518).

La mayona de las vacunas experimentales del VIH-1 ensayadas en primates humanos y/o no humanos sugieren que una vacuna exitosa incorporara inmunogenos que provocan anticuerpos neutralizantes de amplio espectro (bNab) y una inmunidad celular robusta. La glicoprotema de la envoltura del VIH-1 (Env) es la principal protema viral implicada en la entrada del virus y tambien es la diana primaria para neutralizar los anticuerpos, pero debido a las estrategias de evasion inmunitaria y a la variabilidad extrema de la secuencia de las Env, la generacion de bNab ha sido una tarea desalentadora (Phogat S, Wyatt R. Curr Pharm Des. 2007;13:213-27, Phogat S, et al. J Intern Med. 2007 262:26-43, Karlsson Hedestam GB, et al Nat Rev Microbiol. 2008 6:143-55).

La capacidad de obtener anticuerpos neutralizantes de amplio espectro y potentes es un reto importante en el desarrollo de una vacuna del VIH-1. Concretamente, el VIH-1 ha desarrollado una serie impresionante de estrategias para evadir la neutralizacion mediada por anticuerpos, los bNAb se desarrollan con el tiempo en una proporcion de individuos infectados por el VIH-1 y un punado de anticuerpos monoclonales neutralizantes de amplio espectro se han aislado de donantes infectados con el clado B. Estos anticuerpos tienden a mostrar un menor espectro de neutralizacion y potencia frente a los virus que no son del clado B y reconocen epttopos sobre el virus que hasta el momento no han logrado provocar respuestas neutralizantes de amplio espectro cuando se incorporan en una amplia gama de inmunogenos. Presumiblemente, debido a la capacidad de estos bNab para reconocer dianas escondidas conservadas en Env del VIH que son inaccesibles por anticuerpos provocados o diffciles de redisenar con precision y presentar al sistema inmunitario.

Recientemente, utilizando una seleccion de micro-neutralizacion sensible de alto rendimiento de sobrenadantes de aproximadamente 30.000 linfocitos B de memoria IgG+ de un donante africano infectado con el clado A del VIH-1, los solicitantes identificaron dos nuevos bNab PG9 y PG16 que son anticuerpos neutralizantes de amplio espectro y excepcionalmente potentes (Walker L, Phogat S, et al. Science. 2009;326:285-9. Epub 2009 Sep 3). Estos anticuerpos reconocen una nueva diana de vacuna conservada, pero accesible, (que consta de elementos conservados en los bucles variables 2 y 3) de Env y que muestran una union preferente al tnmero del VIH (Modelo de epftopos PG9 y 16 en el tnmero del VIH-1). Cuando se ensayo la union, estos anticuerpos no mostraron union a muchos tnmeros de Env del VIH solubles disenados empmcamente (Env gp140) y que se cree que imitan a las espmulas de la Env del VIH-1, lo que sugiere que estos disenos de la Env son incorrectos o se unen en una forma no reconocida por PG9 y PG 16.

El documento WO 2011/109511 A2 trata de la identificacion de las isoformas de la envoltura del VIH-1.

Finzi et al., J. Virol. Meth. 2010, Vol. 168, No. 1-2, pp. 155-161 describe la caracterizacion conformacional de dfmeros de gp120 del VIH-1 unidos por puentes disulfuros aberrantes secretados por celulas que presentan sobreexpresion.

Sumario de la invencion

Basandose en la propiedad de union y amplitud/potencia de los nuevos anticuerpos para neutralizar > 75 % de los virus probados, los solicitantes postulan que PG9, PG16 y ciertos anticuerpos espedficos del sitio de union a CD4 reconocen una diana de vacuna relevante en la Env nativa en la superficie del virus y la identificacion de las glicoprotemas de la envoltura de VIH-1 que presentan estas dianas en formas solubles de la envoltura de del VIH-1 senan buenas vacunas candidatas del VIH-1 para provocar anticuerpos similares a PG9 y PG16 y tambien para usarse como reactivos para cartograffa y estudios de cristalizacion.

Las glicoprotemas de la envoltura identificadas como parte de la presente invencion muestran una union significativamente mejor con los nuevos anticuerpos neutralizantes de amplio espectro identificados PG9 y/o PG16. Estas son las unicas formas solubles de la envoltura identificadas que muestran una union tan notable a PG9 y PG16. Las glicoprotemas de la envoltura Env tienen valor (a) como reactivos para la deteccion de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, tales como, pero sin limitarse a, PG9 y PG16, (b) como reactivos para la deteccion de moleculas pequenas que compiten por la union de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, tales como pero sin limitarse a, PG9 y PG16, (c) como monomero y tnmero de la envoltura nativa para estudios de cristalizacion y (d) como inmunogenos en diferentes formas para usar como componentes de vacuna del VIH-1, por ejemplo, para obtener anticuerpos neutralizantes de amplio espectro.

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Las glicoprotemas de la envoltura solubles pueden aislarse a partir de virus del Clado A del VIH-1, virus del Clado B del VIH-1, virus del Clado C del VIH-1, pseudovirus del Clado A del VIH-1, pseudovirus del Clado B del VIH-1 o pseudovirus del Clado C del VIH-1. Las glicoprotemas de la envoltura solubles pueden aislarse del virus 6535, del virus 13095, del virus 16055, del virus 25710, del virus 25925, del virus CAAN o del virus Zm109F. Las secuencias de estos virus estan disponibles en la base de datos del NCBI y los solicitantes las han usado para generar protemas Env recombinantes con secuencias unicas en las que los solicitantes han modificado la secuencia lfder, anadido His-tag y terminado la secuencia antes del sitio de escision para gp120 y antes de la transmembrana para gp140. Las secuencias de ADN son unicas ya que estan optimizadas dado que los codones estan basados en codones de mairnfero para la expresion en celulas de mairnfero.

Dentro de la presente memoria descriptiva, las glicoprotemas de la envoltura solubles tienen secuencias sustancialmente similares a las secuencias de protemas representadas en las Figs. 2A-2J. Dentro de la presente memoria descriptiva, la glicoprotema de la envoltura soluble tiene una secuencia de consenso sustancialmente similar a la secuencia consenso representad en las FIGS. 2A-2J.

De acuerdo con la presente invencion, la glicoprotema de la envoltura soluble puede aislarse de un virus BG505 y tener una mutacion L111A y opcionalmente T332N.

La presente memoria descriptiva tambien abarca un mimetico del tnmero de la glicoprotema de la envoltura del VIH- 1 soluble estable.

La presente invencion implica el uso del monomero de gp120 de Env identificado para la seleccion de moleculas pequenas que se unen a PG9 y anticuerpos que se unen a sitios CD4 y pueden usarse como inmunogenos.

Otra realizacion abarca el uso del monomero de gp120 de Env identificado para la seleccion de moleculas pequenas que se unen al sitio de union a PG9 o al sitio de union de anticuerpos que se unen a sitios CD4 sobre el monomero e inactivan el virus VIH-1 de manera similar a como lo hacen el anticuerpo PG9 y los anticuerpos que se unen a sitios CD4.

Una realizacion adicional implica el uso del mimetico del tnmero de Env gp140 descubierto para la seleccion de moleculas pequenas que se unen a anticuerpos PG9, PG16 y anticuerpos que se unen a sitios de union a CD4 y pueden usarse como inmunogeno.

Una realizacion adicional implica el uso del monomero y del tnmero para cartografiar la especificidad de PG9 y PG16 en sueros humanos y animales.

Otra realizacion incluye la identificacion de anticuerpos similares a PG9 y PG16 usando el monomero y tnmero de Env del VIH-1 identificados.

Estas y otras realizaciones se desvelan o son obvias y se incluyen en la siguiente descripcion detallada.

Breve descripcion de los dibujos

La siguiente descripcion detallada, proporcionada como ejemplo, pero que no se pretende que limite la invencion solamente a las realizaciones espedficas descritas, puede entenderse mejor junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 representa la union mediante ELISA de la glicoprotema de la envoltura gp120 recombinante BG505 del VIH-1 del clado A y el arbol filogenetico. El ELISA mostro una union significativa de los anticuerpos PG9, PG16 y b12 a gp120 BG505. La secuencia de la protema BG505 se selecciono mediante una estrategia bioinformatica que identifico la secuencia progenitora proxima a Env del clado del VIH-1 en la base de datos de protema Env. Las secuencias de Env del VIH-1 del clado A del donante (V1_011) que dieron lugar a los anticuerpos PG9 y PG16 se usaron para buscar en la base de datos de la protema Env de VIH-1.

Las Figuras 2A-9J representan la alineacion de las secuencias gp120 de la protema ENV de VIH-1 de ligantes de PG9 buenos (letras rojas), moderados (verdes) y no ligantes y se sometidas a analisis de logs en la web. Los restos importantes para la union de PG9 y PG16 estan incluidos en unos cuadros formando columnas verticales situadas en el tallo de los bucles variables V1/V2, bucle V2 y V3. Los restos (numeracion HxBC2) en las posiciones 156, 158, 159, 160, 162 en el tallo V1/V2, 168, 176, 181 en V2 y 299, 305, 307, 309, 317, 318 en el bucle V3 estan altamente conservados y se encuentran en todas las Env independientemente de su neutralizacion o union por anticuerpos PG. La Fig. 9J representa el de logs en la web de las secuencias Env del VIH-1 en el bucle variable 1, 2 y 3 alineadas en las Figs. 2A-2I, el tamano del resto representa la conservacion. Todos los restos implicados en la union de PG9 y PG16 se indican con “*”.

La Figura 3 representa un mutante L111A de BG505 que tiene una agregacion menor que la protema original. Las muestras en forma no reducida (NR) o reducida (Red) se separaron por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida). Cada muestra contiene 5 |jg de protema. Los solicitantes intentaron la purificacion de la gp120 BG505 pero se encontraron con una protema que estaba muy agregada y de baja actividad. Se preparo un mutante de la BG505 con un patron de agregacion inferior pronosticado (Finzi A et al., J Virol Methods. 2010

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Sep; 168(1-2):155-61) y se expreso en celulas HEK 293S y 293T.

La Figura 4 representa la union a gp120 BG505 L111A en sobrenadantes de cultivo celular. La union del anticuerpo a gp120 BG505 L111A secretada en medio de cultivo celular se midio mediante ensayo inmunoenzimatico ligado a enzimas (ELISA) en microplacas de 96 pocillos. El conjunto de anticuerpos utilizados para caracterizar la antigenicidad inclrna anticuerpos espedficos del tnmero (PG9, PG16), anticuerpos espedficos de union a CD4 (CD4bs) (b6, b12, VRC01, VRC04/PGV04) y la serie PGT (PGT121-130).

La Figura 5 representa la purificacion de BG505 en columnas de lectina y His-Trap. La protema modificada puede purificarse por dos procedimientos de cromatograffa de afinidad diferentes sin danarse y conservar su capacidad antigenica. El ensayo se realizo mediante inmunotransferencia Western con anticuerpo neutralizante anti-His, IgG espedfica de manosa de amplio espectro, 2G12 y un grupo de inmunoglobulinas de individuos VIH- positivos (HIVlG). SDS-PAGE: tincion de protemas (5 microgramos de protema por pocillo) y transferencia Western (0,5 microgramos de protema por pocillo) -deteccion de HIVIG, 2G12 y anti-His. La gpl2o BG505 L111A era de celulas 293S.

La Figura 6 representa un perfil de antigenicidad por ELISA de BG505 L111A purificada mediante 2 metodos cromatograficos diferentes. La union subsiguiente de los anticuerpos no se pudo distinguir por ELISA.

La Figura 7 representa la union del anticuerpo a la protema gp120 BG505 L111A purificada. Las protemas que portaban la mutacion L111A se purificaron con exito tanto a partir de celulas 293S como 293T mediante columna GNL y conservaron su antigenicidad que fue confirmada por ELISA de protemas purificadas. Con la excepcion de algunos anticuerpos PGT, los anticuerpos mas neutralizantes se unen a gp120 BG505 L111A. PGT135, 136 y 141 no se unen a la gp120 BG505.

La Figura 8 representa la union del anticuerpo espedfica del cebador y espedfica de CD4bs al tnmero BG505 recombinante. Debido a que las protemas nativas de la envoltura del VIH existen como una espmula en forma de tnmero en la superficie del virus, los solicitantes fabricaron tnmeros recombinantes para probar el efecto de la mutacion. Esta figura muestra que BG505 L111A conserva la capacidad de unir anticuerpos anti-gp120 en una conformacion de tnmero. El tnmero se preparo anadiendo el motivo de trimerizacion GCN4 a la molecula gp140 BG505 L111A.

La Figura 9 representa los anticuerpos PGT que se unen al tnmero BG505 L111A gp140 GCN4L4. Una observacion similar fue valida para un grupo de anticuerpos neutralizantes PGT de amplio espectro.

La Figura 10 representa un ensayo de neutralizacion (comparacion de los pseudovirus BG505 WT y BG505 L111A). El ensayo de neutralizacion se realizo con pseudovirus BG505 WT y L111A y un panel de anticuerpos neutralizantes humanos de amplio espectro. La mayona de los anticuerpos neutralizan ambas formas de virus en la misma medida. Esta es una clara indicacion de que la mutacion L111A no pone en peligro la gp160 totalmente funcional.

La Figura 11 representa los perfiles de union espedficos de clados y mutantes por citofluorimetna. Se realizo otro ensayo de la integridad de la protema de la envoltura gp160 con la mutacion L111A con gp160 expresada en celulas HEK 293T mediante transfeccion transitoria con un ADN plasirndico. En este estudio se midio la union de un panel de anticuerpos neutralizantes usando citofluorimetna (FACS). BG505 tema el patron de union mas amplio comparado con el Clado B (JR-FL) y el Clado C (16055). El patron de union a bG505WT y L111A fue similar.

La Figura 12 representa un ensayo de Neutralizacion con sueros de conejos inmunizados con gp120 BG505 L111A. Este estudio se realizo mediante la inmunizacion de conejos utilizando la estrategia de sensibilizacion- refuerzo. En este experimento los solicitantes usaron dos inmunizaciones de ADN (sensibilizacion 2X) y un refuerzo con protemas con gp120 BG505 L111A. Los antisueros de los conejos del experimento se diluyeron y se aplicaron en el ensayo de neutralizacion de pseudovirus. Los resultados se muestran como tttulos de IC50. Los conejos que fueron sensibilizados con ADN y reforzados con protema desarrollaron actividad de neutralizacion frente a los pseudovirus del Clado A, B y C.

La Figura 13 representa la union a gp120 BG505 L111A. La union del anticuerpo a gp120 BG505 L111A secretada en medio de cultivo celular se midio mediante ensayo inmunoenzimatico ligado a enzimas (ELISA) en microplacas de 96 pocillos. El conjunto de anticuerpos utilizados para caracterizar la antigenicidad inclrna anticuerpos espedficos del tnmero (PG9, PG16), anticuerpos espedficos del sitio de union a CD4 (CD4bs) (b6, b12, VRC01, VRC04/PGV04) y la serie PGT (pGt121-136). Los anticuerpos que demostraron diferencia en las propiedades de union se muestran en rojo.

Descripcion detallada

Se usaron anticuerpos neutralizantes de amplio espectro PG9 y PG16 para cribar y seleccionar cepas aisladas de VIH-1 de un panel consistente en sesenta y cuatro aislados virales del clado B y C de VIH-1 por su capacidad para neutralizar y unir la forma soluble de la glicoprotema de la envoltura del VIH-1. Los solicitantes identificaron nueve envolturas del VIH-1 que fueron neutralizadas y mostraron union por los bNab PG9 y/o PG16. Dos de las env del VIH-1 solubles DU422 (clado C) e YU2 (clado B) ya estaban identificados y descritas (Walker L, Phogat S, et al. Sciencie. 2009; 326:285-9. Epub 2009 Sep 3). Como parte de la presente invencion, los Solicitantes identificaron tres nuevos Env solubles del VIH-1 cada uno de aislados del virus del clado B y del clado C del VIH-1 que muestran union al bNab PG9. Ademas, los solicitantes identificaron una Env soluble del clado C del VIH-1 que mostro union a ambos bNab, PG9 y PG16. Las Env identificadas como parte de la presente invencion muestran una union significativamente mejor a los bNabs PG9 y PG16 en comparacion con las env DU422 y YU2. Estas Env recien identificadas son las unicas formas solubles de Env identificadas hasta la fecha que muestran una union tan notable

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a PG9 y/o PG16. Ademas de la identificacion de gp120 soluble que muestra una union significativa a PG9, los solicitantes identificaron un mimetico de las moleculas del tnmero de la envoltura nativo gp140, que muestra union significativa tanto a PG9 como a PG 16.

Estas Env pueden tener las siguientes utilidades:

Reactivos para la deteccion de nuevos anticuerpos neutralizantes de amplio espectro como PG9 y PG16, cartograffa de sueros humanos con amplia actividad serica neutralizante y sueros animales despues de estudios de inmunizacion

Para la deteccion de moleculas pequenas que compiten por la union de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, tales como PG9 y PG16. La molecula pequena identificada podna ser utilizada como inmunogeno o compuestos antivirales

Los estudios de cristalizacion con PG9 y PG16 unido a monomero para determinar la superficie molecular exacta en la que PG9 y PG16 se unen para disenar nuevos inmunogenos del VIH-1

Los estudios de cristalizacion con el tnmero unido a PG9 y PG16 y cualquier otro ligando para determinar la estructura exacta de un tnmero Env nativo

Inmunogenos en diferentes formas para utilizar como componentes de la vacuna del VIH-1 para provocar la produccion de bNab. Las diferentes formas de la envoltura del VIH-1 se utilizaran en una sensibilizacion, como ADN/vector que expresa la protema/protema y como un refuerzo como protema. Las envolturas tambien podnan usarse como inmunogeno particulado por reticulacion con partmulas virales tales como Qbeta, virus del mosaico del caupf, CRM, HPV, HBsAg, etc.

Las glicoprotemas de la envoltura solubles pueden aislarse a partir de virus del Clado A del VIH-1, virus del Clado B del VIH-1, virus del Clado C del VIH-1, pseudovirus del Clado A del VIH-1, pseudovirus del Clado B del VIH-1 o pseudovirus del Clado C del VIH-1. Las glicoprotemas de la envoltura solubles se pueden aislar del virus 6535, del virus 13095, del virus 16055, del virus 25710, del virus 25925, del virus CAAN o del virus Zm109F. Los solicitantes han generado protemas Env recombinantes con secuencias unicas en las que los solicitantes han modificado el lfder, anadido His-tag y terminado la secuencia antes del sitio de escision para gp120 y antes de la transmembrana para gp140. Las secuencias de ADN son unicas ya que estan optimizadas respecto a los codones.

En una realizacion particularmente ventajosa, las glicoprotemas de la envoltura de la presente invencion se afslan a partir del virus BG505.

Como se muestra en la presente solicitud, las glicoprotemas de la envoltura solubles tienen secuencias sustancialmente similares a las secuencias de las protemas representadas en las Figs. 2A-2J. Concretamente, la glicoprotema de la envoltura soluble tiene una secuencia de consenso sustancialmente similar a la secuencia de consenso representada en las FIGS. 2A-2J.

En una realizacion, la Env soluble de la presente invencion puede utilizarse como reactivos para detectar e identificar nuevos anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, tales como PG9 y PG16. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo neutralizante puede inhibir la entrada del virus VIH-1 con un mdice de neutralizacion> 1,5 o > 2,0. Los potentes anticuerpos neutralizantes de amplio espectro pueden neutralizar mas de aproximadamente 50 % de virus VIH-1 (de clados diversos y diferentes cepas dentro de un clado) en un ensayo de neutralizacion. La concentracion inhibitoria del anticuerpo monoclonal puede ser inferior a aproximadamente 25 mg/ml para neutralizar aproximadamente el 50 % del virus de entrada en el ensayo de neutralizacion.

La presente divulgacion abarca un procedimiento para identificar nuevas protemas de la envoltura del VIH que se unen a anticuerpos PG9 y PG16 usando una combinacion de un enfoque bioinformatico basado en las secuencias de la envoltura del virus en los pacientes y el ensayo de union de las protemas homologas. La proximidad evolutiva de estas protemas a las protemas de la envoltura de los pacientes puede mejorar la generacion de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro administrados solos o en combinacion con otras protemas de union a PG9 y PG16. La presente solicitud tambien abarca protemas identificadas por este procedimiento, tales como, por ejemplo, gp120 BG505 del clado A.

Esencialmente, el enfoque sera generar la secuencia de Env del VIH-1 del donante que da lugar a cualquier anticuerpo neutralizante de amplio espectro (nuevo o existente). Hasta ahora, en todos los casos, los solicitantes han encontrado que la secuencia Env en sueros donantes escapa a la neutralizacion por los anticuerpos neutralizantes de amplio espectro aislados del donante. Como resultado, la secuencia aislada no es buena para su uso como inmunogeno. El nuevo enfoque utiliza la secuencia de Env del VIH-1 aislada del donante, las secuencias se utilizan para identificar a su progenitor cercano, la alineacion de secuencias se realiza con todas las secuencias Env utilizando programas como clustalW y luego el arbol filogenico se genera para determinar las secuencias de Env que estan estrechamente relacionadas y tienen menos distancias geneticas. Estos homologos mas cercanos se someten entonces a ensayo de union para identificar un nuevo inmunogeno que se une a anticuerpos neutralizantes de amplio espectro y son candidatos potenciales para provocar una respuesta neutralizante.

En particular, tal procedimiento se ejemplifica en la FIG. 1, La Figura 1 representa la union mediante ELISA de la glicoprotema de la envoltura gp120 recombinante BG505 del VIH-1 del clado A y el arbol filogenetico. El ELISA

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mostro una union significativa de los anticuerpos PG9, PG16 y b12 a gp120 BG505. La secuencia de la protema BG505 se selecciono mediante una estrategia bioinformatica que identifico la secuencia progenitora proxima a Env del clado del VIH-1 en la base de datos de protema Env. Las secuencias de Env del VIH-1 del clado A del donante (V1_011) que dieron lugar a los anticuerpos PG9 y PG16 se usaron para buscar en la base de datos de la protema Env de VIH-1.

El procedimiento de la patente US-7.386.232 tambien se puede utilizar para la deteccion de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro. Se puede construir una protema de fusion de la envoltura-enzima uniendo una enzima al extremo C-terminal de una protema de la envoltura. Las partmulas de virus que comprenden la protema de fusion y la glicoprotema de la envoltura de tipo silvestre y/o soluble se pueden generar y utilizar para infectar celulas diana en presencia de sueros de pacientes. Las actividades de la enzima medidas en tales celulas infectadas son medidas de union al virus y de entrada a las celulas diana que estan mediadas por la protema de la envoltura viral de tipo silvestre. Ejemplos de enzimas que pueden usarse para generar la protema de fusion incluyen, pero no se limitan a, luciferasa, fosfatasa alcalina bacteriana o placentaria, p-galactosidasa y protemas fluorescentes tales como protema fluorescente verde o toxinas. El ensayo, en general, tambien se puede llevar a cabo en placas de 96 pocillos. Las actividades enzimaticas disminuidas en presencia de los sueros indican que hay anticuerpos neutralizantes en el suero.

Las glicoprotemas de la envoltura solubles pueden cristalizarse en la combinacion con PG9 o PG16 o con cualquier otro anticuerpo neutralizante, incluyendo los identificados por los procedimientos anteriores, para determinar la superficie molecular exacta en la que la glicoprotema de la envoltura soluble se une con el anticuerpo neutralizante para disenar nuevas moleculas de inmunogenos del VIH-1.

Los cristales se pueden obtener por medios convencionales como son bien conocidos en la tecnica de la cristalograffa de protemas, incluyendo los procedimientos por lotes, puente lfquido, dialisis, difusion de vapor y gota colgante (ver, p.ej., Johnson et al., Biochemistry. 1982 Sep 28;21(20):4839-43; Brayer & McPherson, J Biol Chem. 1982 Apr 10;257(7):3359-61; McPherson & Weickmann, J Biomol Struct Dyn. 1990 Apr;7(5):1053-60; and Koszelak et al., J Mol Biol. 1989 Sep 20;209(2):323-5; Weber et al., Acta Crystallogr B. 1991 Feb 1;47 ( Pt 1):116-27 and Weber, Methods Enzymol. 1991;202:727-41).

Generalmente, los cristales se hacen crecer disolviendo un anticuerpo neutralizante sustancialmente puro, tal como PG9 o PG16 y la glicoprotema de la envoltura soluble en un tampon acuoso que contiene un precipitante a una concentracion justo por debajo de la necesaria para precipitar la protema. El agua se elimina por evaporacion controlada para producir condiciones de precipitacion, las cuales se mantienen hasta que cesa el crecimiento del cristal.

Los cristales, y particularmente las coordenadas de estructura atomica obtenidos a partir de los mismos, tienen una amplia variedad de usos. Los cristales y las coordenadas de estructura son particularmente utiles para identificar compuestos que se unen a un anticuerpo neutralizante, tales como PG9 o PG16 y, por lo tanto, son utiles para provocar anticuerpos anti-VIH. Tales compuestos pueden ser utiles en la obtencion de anticuerpos anti-VIH del clado B y C, sin embargo las variantes pueden ser utiles para obtener anticuerpos anti-VIH del clado A, D o E.

Las coordenadas de la estructura pueden utilizarse como modelos de fase para determinar las estructuras cristalinas de un anticuerpo neutralizador sintetico o mutado, tales como PG9 o PG16, dominios, asf como las estructuras de co-cristales de dichos dominios con ligandos.

La disposicion de la estructura cristalina de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, formando un complejo con una glicoprotema de la envoltura soluble, proporciona al experto en la materia una vision detallada de los mecanismos de accion de un anticuerpo neutralizante, tales como PG9 o PG16. Esta vision proporciona un medio para disenar compuestos que se unen a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16 y, por lo tanto, a ciertos anticuerpos anti-VIH y, por lo tanto compuestos que provocan anticuerpos anti-VIH, que son utiles en el diagnostico, tratamiento o prevencion del VIH en un individuo que lo necesita.

La provision de la estructura cristalina de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, formando un complejo con una glicoprotema de la envoltura soluble, permite un nuevo enfoque para el descubrimiento, identificacion y diseno de un farmaco o compuesto para compuestos que se unen a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16 y, por lo tanto, a anticuerpos anti-VIH, y por lo tanto compuestos que provocan anticuerpos anti-VIH, que son utiles en el diagnostico, tratamiento o prevencion del VIH en un individuo que lo necesite. Por consiguiente, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento informatizado de diseno o identificacion racional de un farmaco o compuesto que comprende: proporcionar la estructura de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, formando un complejo tal como se define por las coordenadas o la las coordenadas de identificacion, proporcionar una estructura de un compuesto candidato y ajustar la estructura del candidato a la estructura de un anticuerpo neutralizante, tal como Pg9 o PG16.

En un aspecto alternativo, el procedimiento puede usar las coordenadas de atomos de interes de un anticuerpo neutralizante, tales como PG9 o PG16, que estan en las proximidades del sitio activo o region de union con el fin de modelar la cavidad en la que el sustrato o ligando se une. Estas coordenadas pueden usarse para definir un espacio

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que se proyecta entonces “in silico” frente a una molecula candidata. Por lo tanto, la divulgacion proporciona un procedimiento informatizado de diseno o identificacion racional de un farmaco o compuesto que comprende: proporcionar las coordenadas de al menos las coordenadas seleccionadas; proporcionar la estructura de un compuesto candidato y ajustar la estructura del candidato a las coordenadas seleccionadas.

En la practica, puede ser deseable modelar un numero suficiente de atomos de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, como se define por sus coordenadas que representan el sitio activo o region de union. De este modo, se pueden proporcionar las coordenadas de al menos 5, ventajosamente al menos 10, mas ventajosamente al menos 50 e incluso mas ventajosamente al menos 100 atomos de la estructura.

Por consiguiente, los procedimientos pueden emplear un sub-dominio de interes de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, que esta en la proximidad del sitio activo o region de union y la aplicacion puede proporcionar un procedimiento informatizado para identificar o racionalmente disenar un compuesto o farmaco que comprende: proporcionar las coordenadas de al menos un subdominio de; proporcionar la estructura de un modulador o inhibidor candidato de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16 y ajustar la estructura del candidato a las coordenadas del sub-dominio proporcionado.

Estos procedimientos pueden incluir opcionalmente sintetizar el candidato y opcionalmente pueden incluir ademas poner en contacto el candidato con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, para analizar si hay union y/o inhibicion y/o administrar el compuesto a un animal capaz de desarrollar anticuerpos y analizar si el compuesto provoca anticuerpos anti-VIH. Los compuestos que provocan anticuerpos anti-VIH son utiles para propositos de diagnostico, asf como para composiciones inmunogenas, inmunologicas o incluso vacunales, asf como composiciones farmaceuticas.

La “adaptacion” puede significar la determinacion, por medios automaticos o semiautomaticos, de interacciones entre al menos un atomo del candidato y al menos un atomo de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16 y calcular el grado en que dicha interaccion es estable. Las interacciones pueden incluir atraccion, repulsion, provocada por la carga, consideraciones estericas y similares. Un “sub-dominio” puede significar al menos uno, por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro elementos completos de la estructura secundaria.

La etapa de proporcionar la estructura de una molecula candidata puede implicar la seleccion del compuesto mediante la seleccion computacional de una base de datos de compuestos para la interaccion con el sitio activo. Por ejemplo, se puede derivar un descriptor 3-D para el modulador potencial, incluyendo el descriptor restricciones geometricas y funcionales derivadas de la arquitectura y naturaleza qmmica del sitio activo. El descriptor puede usarse entonces para buscar en la base de datos de compuestos, siendo un modulador potencial un compuesto que tiene una buena concordancia con las caractensticas del descriptor. En efecto, el descriptor puede ser un tipo de farmacoforo virtual.

En cualquier caso, la determinacion de la estructura tridimensional de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, formando complejo, proporciona una base para el diseno de compuestos nuevos y espedficos que se unen a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PGl6, y son utiles para provocar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, a partir del conocimiento de la estructura tridimensional de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, formando un complejo, se pueden usar programas de modelado informatico para disenar o identificar diferentes moleculas que se espera que interactuen con sitios activos posibles o confirmados, tales como sitios de union u otras caractensticas estructurales o funcionales de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16.

Mas espedficamente, un compuesto que potencialmente se une (“ligante”) a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, puede analizarse en cuanto a su actividad mediante el uso de modelado por ordenador usando un programa de acoplamiento tal como GRAM, DOCK o AUTODOCK (ver Walters et al. Drug Discovery Today, vol. 3, no. 4 (1998), 160-178 y Dunbrack et al. Folding and Design 2 (1997), 27-42). Este procedimiento puede incluir el ajuste por ordenador de ligantes potenciales a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, para determinar hasta que punto la forma y la estructura qmmica del ligante potencial se unira al anticuerpo.

Tambien se puede realizar un examen manual asistido por ordenador del sitio activo o sitio de union de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16. Tambien pueden usarse programas como GRID (P. Goodford, J. Med. Chem, 1985, 28, 849-57), programa que determina sitios de interaccion probables entre moleculas con diversos grupos funcionales y el anticuerpo, para analizar el sitio activo o sitio de union para predecir estructuras parciales de compuestos de union.

Se pueden emplear programas informaticos para estimar la atraccion, repulsion o impedimento esterico de los dos componentes de la union, por ejemplo, un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16 y un enlazante candidato. Generalmente, cuanto mas ajustado sea el ajuste, menos obstaculos estericos existan y mayores sean las fuerzas atractivas, mas potente sera el ligante potencial, ya que estas propiedades son consistentes con una constante de union mas estrecha. Ademas, cuanto mas espedfico sea el diseno de un adhesivo candidato, mas probable es que no interactue con otras protemas tambien.

En un aspecto adicional, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para determinar la estructura de un ligante de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, unido a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o

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PG16, comprendiendo dicho procedimiento: (a) proporcionar un cristal de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, (b) empapar el cristal u otro cristal con dicho ligante y (c) determinar la estructura de dicho complejo anticuerpo neutralizante-ligante. Este otro cristal puede tener esencialmente las mismas coordenadas descritas en la presente memoria, sin embargo debido a alteraciones menores en el polipeptido o secuencia, el cristal puede formarse en un grupo espacial diferente.

La divulgacion implica ademas, en lugar de o ademas de procedimientos in silicio, la deteccion de alto rendimiento de compuestos para seleccionar compuestos con actividad de union. Aquellos compuestos que muestran actividad de union pueden seleccionarse como posibles ligantes candidatos y cristalizarse adicionalmente con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, por ejemplo, por co-cristalizacion o remojo, para analisis de rayos X. La estructura de rayos X resultante se puede comparar con coordenadas conocidas para una variedad de propositos. Por ejemplo, cuando los contactos establecidos por tales compuestos se solapan con los establecidos por un anticuerpo neutralizante, tales como PG9 o PGl6, se pueden proporcionar nuevas moleculas que comprenden residuos que contienen contactos de un anticuerpo neutralizante, tales como PG9 o PG16, y otros compuestos.

Habiendo disenado, identificado o seleccionado los posibles ligantes candidatos de union determinando aquellos que tienen propiedades de ajuste favorables, por ejemplo, atraccion fuerte entre un anticuerpo candidato y un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, estos pueden ser seleccionados en cuanto a su actividad. En consecuencia, la solicitud implica ademas: obtener o sintetizar el modulador o inhibidor candidato y poner en contacto el ligante candidato con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, para determinar la capacidad del candidato para unirse con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16. En la ultima etapa, el candidato se pone en contacto ventajosamente con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, en condiciones para determinar su funcion. En lugar de, o ademas de realizar dicho ensayo, la solicitud puede comprender: obtener o sintetizar el modulador candidato, formar un complejo de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, y el candidato, y analizar el complejo, por ejemplo, por difraccion de rayos X o RMN u otros medios, para determinar la capacidad del candidato para interactuar con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16. Puede obtenerse informacion estructural detallada sobre la union del candidato a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, y a la luz de esta informacion, pueden hacerse ajustes en la estructura o funcionalidad del modulador potencial, por ejemplo para mejorar su union a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16. Estas etapas pueden repetirse cuantas veces sea necesario. Como alternativa o adicionalmente, se pueden administrar ligantes potenciales a un animal capaz de provocar una respuesta de anticuerpos, para determinar si el ligante potencial provoca anticuerpos anti-VIH.

Una vez alineada la secuencia de aminoacidos de los polipeptidos con estructuras conocidas y desconocidas, las estructuras de los aminoacidos conservados en una representacion informatica del polipeptido con estructura conocida se transfieren a los correspondientes aminoacidos del polipeptido cuya estructura es desconocida. Por ejemplo, una tirosina en la secuencia de aminoacidos de estructura conocida puede ser reemplazada por una fenilalanina, el correspondiente aminoacido homologo en la secuencia de aminoacidos de estructura desconocida. Las estructuras de aminoacidos situadas en regiones no conservadas pueden asignarse manualmente utilizando geometnas peptfdicas estandar o mediante tecnicas de simulacion molecular, tales como dinamica molecular. El refinado de toda la estructura puede ser por dinamica molecular y/o minimizacion de energfa.

Los aspectos de la invencion que emplean el anticuerpo neutralizante, tal como la estructura in silico de PG9 o PG16 pueden aplicarse igualmente a modelos homologos de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, obtenidos por el aspecto anterior de la invencion y esto constituye otra realizacion de la invencion. Por lo tanto, despues de haber determinado una conformacion de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, mediante los procedimientos descritos en el presente documento, dicha conformacion se puede usar en un procedimiento informatizado de diseno o identificacion racional de un farmaco o compuesto como se describe en la presente memoria.

La memoria descriptiva proporciona ademas un procedimiento para determinar la estructura de un ligante de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, unido a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, que comprende: proporcionar un cristal de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, remojando el cristal con el ligante y determinando la estructura del complejo anticuerpo neutralizante-ligante. Como alternativa o adicionalmente, el anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, y el ligante pueden co-cristalizarse.

La divulgacion proporciona ademas sistemas, tales como sistemas informaticos, destinados a generar estructuras y/o realizar un diseno racional de un farmaco o un compuesto para un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, o el complejo de anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16 y un potencial ligante. El sistema puede contener: datos de coordenadas atomicas, definiendo dichos datos la estructura tridimensional de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, o al menos un sub-dominio de los mismos; o datos del factor de estructura para anticuerpos neutralizantes, tales como PG9 o PG16", pudiendose derivar dichos datos del factor de estructura de los datos de las coordenadas atomicas. La solicitud tambien implica medios legibles por ordenador con: datos de coordenadas atomicas por modelacion de homologfa, definiendo dichos datos la estructura tridimensional de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, o al menos un sub-dominio del mismo; o datos del factor de estructura para el anticuerpo neutralizante, tales como PG9 o PG16, pudiendose derivar dichos datos del factor de estructura de los datos de coordenadas atomicas. “Medio legible por ordenador” se refiere a cualquier medio que

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pueda ser lefdo y accedido directamente a traves de un ordenador, e incluye, pero no se limita a: medios de almacenamiento magneticos tales como discos flexibles, medio de almacenamiento en disco duro y cinta magnetica; medios de almacenamiento opticos tales como discos opticos o CD-ROM; medios de almacenamiento electricos tales como RAM y ROM e tnbridos de estas categonas, tales como medios magneticos/opticos. Proporcionando tales medios legibles por ordenador, se puede acceder rutinariamente a los datos de coordenadas atomicas para modelar un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, o un sub-dominio del mismo. Por ejemplo RASMOL (Sayle et al., TIBS vol. 20 (1995), 374) es un paquete de software disponible publicamente que permite el acceso y el analisis de datos de coordenadas atomicas para la determinacion estructural y/o el diseno racional de farmacos. La divulgacion comprende ademas procedimientos comerciales proporcionando acceso a dichos medios legibles por ordenador y/o sistemas informaticos y/o datos de coordenadas atomicas a los usuarios; por ejemplo, los medios y/o los datos de coordenadas atomicas pueden ser accesibles para un usuario, por ejemplo, por suscripcion, a traves de Internet o de una red global de comunicacion/informatica; o, el sistema informatico puede estar disponible para un usuario por suscripcion. Los datos del factor de estructura, que pueden derivarse de datos de coordenadas atomicas (ver, p.ej., Blundell et al., en Protein Crystallography, Academic Press, NY, Londres y San Francisco (1976)), son particularmente utiles para calcular mapas de densidad de electrones, por ejemplo, mapas de densidad electronica por transformada de Fourier diferenciales. Por lo tanto, existen usos adicionales para los medios legibles por ordenador y/o sistemas informaticos y/o datos de coordenadas atomicas y razones adicionales para ofrecerlos a los usuarios. Un “sistema informatico” se refiere a los medios de hardware, medios de software y medios de almacenamiento de datos utilizados para analizar los datos de coordenadas atomicas. Los medios ffsicos mmimos de los sistemas basados en ordenador pueden comprender una unidad central de procesamiento (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Deseablemente, se proporciona un monitor para visualizar los datos de la estructura. Los medios de almacenamiento de datos pueden ser RAM u otros medios para acceder a medios legibles por ordenador. Ejemplos de estos sistemas son las estaciones de trabajo de microordenadores disponibles de Silicon Graphics Incorporated y Sun Microsystems que trabajan con sistemas operativos basados en Unix, Linux, Windows NT o IBM OS/2.

Por consiguiente, la memoria descriptiva comprende ademas procedimientos de transmision de informacion obtenida en cualquier procedimiento o etapa de la misma descrita en el presente documento o cualquier informacion descrita en el presente documento, por ejemplo, a traves de telecomunicaciones, telefono, comunicaciones masivas, medios de comunicacion, presentaciones, Internet, correo electronico, etc.

La memoria descriptiva proporciona tambien un procedimiento para analizar un complejo de un anticuerpo neutralizante, tal como Pg9 o PG16, y un ligante potencial que comprende: emplear datos de difraccion cristalografica de rayos X procedentes del complejo y una estructura tridimensional de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, o al menos un sub-dominio del mismo, para generar un mapa diferente de densidad electronica por transformada de Fourier del complejo; estando ventajosamente, la estructura tridimensional definida por sus datos de coordenadas atomicas.

Tales complejos pueden cristalizarse y analizarse usando procedimientos de difraccion de rayos X, por ejemplo, de acuerdo con los enfoques descritos por Greer et al., 1994, y los mapas de densidad electronica por transformada de Fourier diferenciales se pueden calcular basandose en los patrones de difraccion de rayos X del anticuerpo neutralizante empapado o cristalizado, tal como PG9 o PG16, y la estructura resuelta de un anticuerpo neutralizante no en complejo, tal como PG9 o PG16. Estos mapas pueden usarse entonces para determinar si y donde un ligante potencial particular se une a un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, y/o cambia la conformacion de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16. Los mapas de densidad electronica se pueden calcular utilizando programas como los del paquete informatico CCP4 (Collaborative Computing Project, N.1 4. La serie CCP4: Programas para Cristalograffa de Protemas, Acta Crystallographica, D50, 1994, 760-763). Para la visualizacion de mapas y construccion de modelos pueden usarse programas tales como "QUANTA" (1994, San Diego, CA: Molecular Simulations, Jones et al., 1991).

La determinacion de la estructura 3D de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, proporciona informacion importante sobre el sitio o sitios activos/de union probables de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16. Esta informacion puede utilizarse para el diseno racional de ligantes de anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, mediante tecnicas computacionales que identifican posibles ligandos de union para el sitio o sitios activos, permitiendo enfoques de fragmentos enlazados al diseno de farmacos y permitiendo la identificacion y localizacion de ligandos unidos usando analisis tales como analisis cristalografico de rayos X.

Greer et al., supra, se refiere a un enfoque iterativo para el diseno de ligandos basado en secuencias repetidas de modelado por ordenador, formacion de complejo protema-ligando y analisis de rayos X. Los inhibidores de timidilato sintasa fueron disenados por Greer; y, los ligantes de anticuerpos neutralizantes Fab pueden disenarse tambien de esta manera. Usando, por ejemplo, GRID (P. Goodford, 1985) o la estructura 3D resuelta del anticuerpo neutralizante Fab, tal como PG9 o PG16, se puede disenar un ligante potencial de un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, que complementa las funcionalidades del sitio o sitios activos del anticuerpo neutralizante. El ligante potencial puede sintetizarse, formarse en un complejo con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16 y el complejo se analiza a continuacion, por ejemplo, mediante cristalograffa de rayos X, RMN o una combinacion de los mismos, para identificar la posicion real del enlace compuesto.

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La determinacion de la posicion del compuesto ligante potencial en el complejo permite la determinacion de las interacciones de este con un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16. Esto permite al experto en la materia analizar la afinidad y especificidad del compuesto por un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, y proponer modificaciones al compuesto para aumentar o disminuir cualquiera o ambas de estas propiedades. De este modo, la estructura y/o grupos funcionales del compuesto pueden ser ajustados, si es necesario o deseado, en vista de los resultados del analisis (por ejemplo, analisis de rayos X) y la secuencia de smtesis y analisis se repite hasta que se obtiene un compuesto optimizado. Los enfoques relacionados con el diseno de compuestos y farmacos basados en la estructura se discuten tambien en otros documentos citados en el presente documento, asf como en Bohacek et al., 1996.

Como resultado de la determinacion de la estructura 3D del anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, tambien se pueden usar tecnicas mas puramente computacionales para el diseno racional de farmacos y compuestos para disenar anticuerpos neutralizantes, tales como PG9 o PG16, ligantes y por lo tanto compuestos que provocan anticuerpos anti-VIH; por ejemplo, los programas automatizados de acoplamiento de receptor-ligando (ver Jones et al., 1995) que requieren informacion precisa sobre las coordenadas atomicas de receptores diana, se pueden usar para disenar o identificar ligantes de un anticuerpo neutralizante potencial, tal como PG9 o PG16.

Los enfoques de fragmentos enlazados al diseno de farmacos o compuestos tambien requieren informacion precisa sobre las coordenadas atomicas de una diana. Los compuestos pequenos que tienen el potencial de unirse a regiones de un anticuerpo neutralizante, tales como PG9 o PG16, los cuales por sf mismos pueden no ser compuestos ligantes pueden ser ensamblados por enlace qmmico para proporcionar ligantes potenciales. Por lo tanto, la idea basica que se esconde detras de estos enfoques es determinar los lugares de union de mas de una, por ejemplo, plural o una pluralidad de ligandos a una molecula diana, y luego construir un armazon molecular para conectar los ligandos entre sf de tal manera que se conservan las posiciones de union relativas. Los ligandos pueden proporcionarse computacionalmente y modelarse en un sistema informatico, o proporcionarse en un entorno experimental, en el que se proporcionan cristales y mas de uno, por ejemplo, plural o una pluralidad de ligandos empapados por separado o en mezclas en el cristal antes del analisis, por ejemplo, analisis de rayos X y determinacion de su ubicacion.

Se determina el sitio de union de dos o mas ligandos y pueden conectarse para formar asf un compuesto prototipo potencial que puede refinarse adicionalmente, por ejemplo, la tecnica iterativa de Greer et al. Para un enfoque virtual de fragmentos unidos, vease Verlinde et al., 1992 y para estudios de RMN y rayos X, vease Skuker et al., 1996; y Stout et al., 1998. El uso de estos u otros enfoques para disenar y/o identificar anticuerpos neutralizantes, tales como PG9 o PG16, ligantes y por lo tanto compuestos que provocan anticuerpos anti-VIH (ver, p.ej, los documentos de patente citados en el presente documento, como en la Seccion de Antecedentes y los documentos citados en el presente documento, supra) es posible gracias a la determinacion de la estructura del anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16.

Muchas de las tecnicas y enfoques basados en la estructura descritos en el presente documento emplean analisis de rayos X para identificar la posicion de union de un modulador potencial en un complejo con una protema. Una manera habitual de hacer esto es realizar la cristalograffa de rayos X en el complejo, producir un mapa de densidad electronica por transformada de Fourier diferencial y asociar un patron particular de densidad de electrones con el modulador de potencial. Sin embargo, para producir un mapa (Ver Blundell et al., supra), es importante conocer previamente la estructura 3D de la protema (o al menos los factores de estructura de la protema). Por lo tanto, la determinacion de la estructura del anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, tambien permite producir mapas de densidad electronica por transformada de Fourier diferenciales de complejos de anticuerpos neutralizantes, tales como PG9 o PG16, con un modulador potencial, los cual puede ayudar en gran medida al procedimiento de diseno o identificacion racional del compuesto y/o farmaco.

Los enfoques para el diseno o la identificacion de farmacos o de compuestos basados en la estructura descritos en el presente documento implican la identificacion inicial de posibles compuestos para la interaccion con la molecula diana (en este caso un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16) y asf provocar anticuerpos anti-VIH. A veces estos compuestos son conocidos, por ejemplo, a partir de la bibliograffa de investigacion. Sin embargo, cuando no lo son, o cuando se desean nuevos compuestos, una primera etapa del diseno del farmaco o del compuesto o del programa de identificacion puede implicar una deteccion in silico informatizada en bases de datos de compuestos (tales como la base de datos estructural de Cambridge) con el objetivo de identificar compuestos que interaccionan con el sitio o sitios activos de la biomolecula diana (en este caso un anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16). Los criterios de deteccion pueden basarse en propiedades farmacocineticas tales como la estabilidad metabolica y la toxicidad. Sin embargo, la determinacion de la estructura del anticuerpo neutralizante, tal como PG9 o PG16, permite identificar la arquitectura y naturaleza qmmica de cada anticuerpo neutralizador, tal como PG9 o PG16, lo que a su vez permite las limitaciones geometricas y funcionales de un descriptor para obtener el posible ligante. El descriptor puede ser, por lo tanto, un tipo de farmacoforo 3D virtual, que tambien puede usarse como criterio de seleccion o filtro para la deteccion en bases de datos.

Los compuestos que tienen una estructura qmmica seleccionada usando la invencion, en los que dichos compuestos son anticuerpos neutralizantes, tales como PG9 o PG16, ligantes, forman un aspecto adicional de la invencion; y tales compuestos pueden usarse en procedimientos de tratamientos medicos, tales como para el diagnostico, la

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prevencion o el tratamiento del VIH o para la obtencion de anticuerpos para el diagnostico del VIH, incluyendo el uso en vacunas. Ademas, dichos compuestos pueden usarse en la preparacion de medicamentos para tales tratamientos o prevencion, o composiciones para propositos de diagnostico. Los compuestos se pueden emplear solos o en combinacion con otros tratamientos, vacunas o agentes preventivos y los compuestos pueden usarse en la preparacion de medicamentos combinados para tales tratamientos o prevencion, o en kits que contienen el compuesto y el otro tratamiento o agente preventivo.

En otra realizacion mas, la presente invencion tambien abarco el uso de las glicoprotemas de la envoltura solubles descritas en el presente documento como inmunogenos, ventajosamente como componentes de vacuna del VIH-1.

Los terminos “protema”, “peptido”, “polipeptido” y “secuencia de aminoacidos” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polfmeros de restos de aminoacidos de cualquier longitud. El polfmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados o analogos de aminoacidos y puede estar interrumpido por restos qmmicos distintos de los aminoacidos. Los terminos incluyen tambien un polfmero de aminoacido que ha sido modificado naturalmente o por intervencion; por ejemplo, mediante la formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente marcador o bioactivo.

Como se usa en el presente documento, los terminos “antigeno” o “inmunogeno” se usan indistintamente para referirse a una sustancia, generalmente una protema, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto. El termino tambien se refiere a protemas que son inmunologicamente activas en el sentido de que una vez administradas a un sujeto (ya sea directamente o administrando al sujeto una secuencia de nucleotidos o vector que codifica la protema) es capaz de provocar una respuesta inmunitaria del tipo humoral y/o celular dirigida contra esa protema.

El termino “anticuerpo” incluye moleculas intactas asf como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, Fv y scFv que son capaces de unirse al determinante del epftopo. Estos fragmentos de anticuerpo conservan cierta capacidad para unirse selectivamente con su antfgeno o receptor e incluyen, por ejemplo:

Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente de union al antfgeno de una molecula de anticuerpo puede producirse por digestion de anticuerpo completo con la enzima papama para producir una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada;

Fab', el fragmento de una molecula de anticuerpo se puede obtener tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido de reduccion, para producir una cadena ligera intacta y una porcion de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molecula de anticuerpo;

F(ab')2, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reduccion subsiguiente; F(ab')2 es un dfmero de dos fragmentos Fab' unidos entre sf por dos enlaces disulfuro;

scFv, incluyendo un fragmento geneticamente modificado que contiene la region variable de una cadena pesada y una cadena ligera como una molecula de cadena simple fusionada.

Los procedimientos generales de fabricacion de estos fragmentos son conocidos en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988)).

Un “anticuerpo neutralizante” puede inhibir la entrada del virus VIH-1 por ejemplo SF162 y/o JRCSF con un mdice de neutralizacion >1,5 o >2,0. Los potentes anticuerpos neutralizantes de amplio espectro pueden neutralizar mas de aproximadamente 50 % de virus VIH-1 (de clados diversos y diferentes cepas dentro de un clado) en un ensayo de neutralizacion. La concentracion inhibitoria del anticuerpo monoclonal puede ser inferior a aproximadamente 25 mg/ml para neutralizar aproximadamente el 50 % del virus de entrada en el ensayo de neutralizacion.

Debe entenderse que las protemas, incluyendo los anticuerpos y/o antfgenos descritos, pueden diferir de las secuencias exactas ilustradas y descritas en el presente documento. Por lo tanto, la invencion contempla deleciones, adiciones y sustituciones a las secuencias mostradas, siempre y cuando las secuencias funcionen de acuerdo con los procedimientos divulgados. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas seran generalmente de naturaleza conservadora, es decir., aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos. Por ejemplo, los aminoacidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) acidos - aspartato y glutamato; (2) basicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano y (4) polares no cargados - glicina, asparagina, glutamina, cistema, serina treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina se clasifican a veces como aminoacidos aromaticos. Es razonablemente predecible que una sustitucion aislada de leucina con isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato con un glutamato o viceversa; una treonina con una serina o viceversa; o una sustitucion conservadora similar de un aminoacido con un aminoacido estructuralmente relacionado, no tenga un efecto importante sobre la actividad biologica. Las protemas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos que las secuencias ilustradas y descritas pero que poseen sustituciones de aminoacidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la protema estan, por lo tanto, dentro del alcance de la invencion.

Como se usan en el presente documento, las expresiones “secuencias de nucleotidos” y “secuencias de acido

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nucleico” se refieren a secuencias de acido desoxirribonucleico (ADN) o acido ribonucleico (ARN), incluyendo, sin limitacion, ARN mensajero (ARNm), tubridos de ADN/ARN o acidos nucleicos sinteticos. El acido nucleico puede ser monocatenario, o parcialmente o completamente bicatenarios (duplex). Los acidos nucleicos duplex pueden ser homoduplex o heteroduplex.

Como se usa en el presente documento, el termino “transgen” puede usarse para referirse a secuencias de nucleotidos “recombinantes” que pueden derivarse de cualquiera de las secuencias de nucleotidos que codifican las protemas de la presente invencion. El termino “recombinante” significa una secuencia de nucleotidos que ha sido manipulada “por el hombre” y que no ocurre en la naturaleza, o que esta unida a otra secuencia de nucleotidos o que se encuentra en una disposicion diferente en la naturaleza. Se entiende que manipulado “por el hombre” significa manipulado por algunos medios artificiales, incluso mediante el uso de maquinas, optimizacion de codones, enzimas de restriccion, etc.

Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos pueden ser mutadas de tal manera que quede anulada la actividad de las protemas codificadas in vivo. Como alternativa, las secuencias de nucleotidos pueden estar optimizadas en cuanto a los codones, por ejemplo, los codones pueden optimizarse para uso humano. Preferentemente, las secuencias de nucleotidos estan mutadas para anular la funcion normal in vivo de las protemas codificadas y codones optimizados para uso humano. Por ejemplo, cada una de las secuencias Gag, Pol, Env, Nef, RT e Int puede ser alterada de estas maneras.

En cuanto a la optimizacion de codones, las moleculas de acido nucleico tienen una secuencia de nucleotidos que codifica los antigenos y pueden disenarse para emplear codones que se utilizan en los genes del sujeto en el que se va a producir el antigeno. Muchos virus, incluyendo el VIH y otros lentivirus, usan un gran numero de codones raros y, al alterar estos codones para que correspondan a codones comunmente utilizados en el sujeto deseado, se puede conseguir una expresion mejorada de los antigenos. En una realizacion preferida, los codones utilizados son codones “humanizados”, es decir, los codones son aquellos que aparecen frecuentemente en genes humanos altamente expresados (Andre et al., J. Virol. 72: 1497-1503, 1998) en lugar de los codones que son utilizados con frecuencia por el VIH. Tal uso de codones proporciona una expresion eficiente de las protemas transgenicas del VIH en celulas humanas. Se puede usar cualquier procedimiento adecuado de optimizacion de codones. Tales procedimientos y la seleccion de tales procedimientos, son bien conocidos por los expertos en la materia. Ademas, hay varias compares que optimizaran codones de secuencias, como Geneart (geneart.com). De este modo, las secuencias de nucleotidos pueden ser optimizadas en cuanto a los codones.

La memoria descriptiva comprende ademas secuencias de nucleotidos que codifican variantes y derivados funcionalmente y/o antigenicamente equivalentes de los antfgenos y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos. Estas variantes, derivados y fragmentos funcionalmente equivalentes muestran la capacidad de retener la actividad antigenica. Por ejemplo, los cambios en una secuencia de ADN que no cambia la secuencia de aminoacidos codificada, asf como los que dan como resultado sustituciones conservadoras de restos de aminoacidos, una o algunas deleciones o adiciones de aminoacidos y sustitucion de restos de aminoacidos por aminoacidos analogos son aquellos que no afectaran significativamente a las propiedades del polipeptido codificado. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; acido aspartico/acido glutamico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina y fenilalanina/tirosina/triptofano. Por lo tanto, las variantes tienen al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homologfa o identidad con el antfgeno, epftopo, inmunogeno, peptido o polipeptido de interes.

Para los propositos de la presente invencion, la identidad u homologfa de secuencia se determina comparando las secuencias cuando estan alineadas para maximizar la superposicion y la identidad a la vez que se minimizan los huecos de secuencia. En particular, la identidad de secuencia se puede determinar usando cualquiera de una serie de algoritmos matematicos. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:5873-5877.

Otro ejemplo de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS 1988, 4:11-17. Este algoritmo se incorpora al programa ALIGN (version 2.0) que forma parte del paquete de software de alineacion de secuencias gCg. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoacidos, se puede usar una tabla de restos de peso PAM120, una penalizacion de longitud de hueco de 12 y una penalizacion de hueco de 4. Otro algoritmo util para identificar regiones de similitud de secuencia local y alineacion es el algoritmo FASTA como se describe en Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444-2448.

Es ventajoso para el uso de acuerdo con la presente invencion el software WU-BLAST (Washington University BLAST) version 2.0. Los programas ejecutables de WU-BLAST version 2.0 para varias plataformas UNIX se pueden descargar desde
ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa se basa en WU-BLAST version 1.4, que a su vez se basa en el dominio publico NCBI-BLAST version 1.4 (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics,

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Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; todos los cuales se incorporan aqu como referencia).

Las diversas secuencias de nucleotidos recombinantes y anticuerpos y/o antigenos se preparan usando ADN recombinante estandar y tecnicas de clonacion. Dichas tecnicas son bien conocidas por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edicion (Sambrook et al., 1989).

Las secuencias de nucleotidos pueden insertarse en “vectores”. El termino “vector” es ampliamente utilizado y comprendido por los expertos en la materia y como se usa en el presente documento, el termino “vector” se utiliza de acuerdo con su significado para los expertos en la materia. Por ejemplo, el termino “vector” es comunmente usado por los expertos en la materia para referirse a un vehmulo que permite o facilita la transferencia de moleculas de acido nucleico de un entorno a otro o que permite o facilita la manipulacion de una molecula de acido nucleico.

Se puede usar cualquier vector que permita la expresion de los anticuerpos y/o antigenos. Por ejemplo, se pueden usar los antigenos y/o anticuerpos in vitro (tales como el uso de sistemas de expresion libres de celulas) y/o en celulas cultivadas crecidas in vitro con el fin de producir los antfgenos del VIH y/o anticuerpos que pueden utilizarse entonces para diversas aplicaciones tales como en la produccion de vacunas protemicas. Para tales aplicaciones, se puede usar cualquier vector que permita la expresion de los antigenos y/o anticuerpos in vitro y/o en celulas cultivadas.

Para aplicaciones en las que se desea que los anticuerpos y/o antigenos se expresen in vivo, por ejemplo, cuando los transgenes se usan en ADN o vacunas que contienen ADN, se puede usar cualquier vector que permita la expresion de los anticuerpos y/o antigenos y sea seguro para su uso in vivo. Preferentemente, los vectores utilizados son seguros para su uso en seres humanos, mairnferos y/o animales de laboratorio.

Para que los anticuerpos y/o antfgenos se expresen, la secuencia codificante de la protema debena estar “ligada operativamente” a las secuencias reguladoras o de control de acidos nucleicos que dirigen la transcripcion y la traduccion de la protema. Como se usa en la presente memoria, se dice que una secuencia codificante y una secuencia o promotor de control de acido nucleico estan “ligadas operativamente” cuando estan unidas covalentemente de tal manera que colocan la expresion o transcripcion y/o traduccion de la secuencia codificante bajo la influencia o control de la secuencia de control del acido nucleico. La “secuencia de control de acido nucleico” puede ser cualquier elemento de acido nucleico, tal como, pero sin limitarse a, promotores, potenciadores, IRES, intrones y otros elementos descritos en el presente documento que dirigen la expresion de una secuencia de acido nucleico o secuencia codificante que esta operativamente ligada a la misma. El termino “promotor” se usara en el presente documento para referirse a un grupo de modulos de control de la transcripcion que estan agrupados alrededor del sitio de iniciacion para la ARN polimerasa II y que cuando estan operacionalmente unidos a las secuencias codificantes de protemas conducen a la expresion de la protema codificada. La expresion de los transgenes puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible, que inicia la transcripcion solo cuando se expone a algun estfmulo externo particular, tal como, sin limitacion, antibioticos tales como tetraciclina, hormonas tales como ecdisona o metales pesados. El promotor tambien puede ser espedfico de un tipo celular, tejido u organo particular. Se conocen en la tecnica muchos promotores y potenciadores adecuados y cualquier promotor o potenciador adecuado se puede usar para la expresion de los transgenes. Por ejemplo, se pueden seleccionar promotores y/o potenciadores adecuados de la Base de Datos de Promotores Eucarioticos (EPDB).

La presente divulgacion se refiere a un vector recombinante que expresa un epftopo extrano. Ventajosamente, el

epftopo es un epftopo del VIH. Ventajosamente, el epftopo del VIH es una glicoprotema de la envoltura soluble, sin embargo, la presente solicitud puede incluir antfgenos, epftopos o inmunogenos del VIH adicionales. Ventajosamente, el epftopo del VIH es un antfgeno del VIH, un epftopo del VIH o un inmunogeno del VIH, tal como,

pero sin limitacion, los antfgenos del VIH, epftopos del VIH o inmunogenos del VIH de las patentes de los Estados

Unidos numeros 7.341.731; 7.335.364; 7

7.285.289

7.223.844

7.195.768

7.153.509

7.101.552

7.060.273

7.001.759

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6.855.539

6.812.025

6.773.920

6.713.301

6.657.055

6.605.427

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7.223

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7.147.

7.097

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6.953

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648

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345;

.923

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.471

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7.273.695

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7.129.219

7.094.405

7.049.136

6.979.535

6.946.075

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6.838.477;

6.806.055

6.753.015

6.699.722

6.653.066

6.600.023

329.807; 7 7.270.997 7.220.554 7.186.507 7.122.188 7.091.049 7.048.929 6.974.574 6.927.031 6.893.869 6.821.955; 6.803.231 6.750.005 6.699.656 6.649.409 6.596.477

.323.553; 7 7.262.270: 7.214.530: 7.179.645: 7.118.859: 7.090.648: 7.033.593: 6.972.126: 6.919.319: 6.884.785: 6.818.392; 6.800.613: 6.737.239: 6.696.291 6.649.372: 6.596.172:

.320.859;

7.244.819;

7.211.659;

7.175.843;

7.118.855;

7.087.377;

7.030.094;

6.969.609;

6.919.318;

6.884.435;

6.818.222;

6.800.288;

6.737.067;

6.692.745;

6.645.732;

6.593.103;

7.311.920;

7.244.575

7.211.432

7.172.761

7.118.751

7.083.787

7.022.326

6.964.769

6.919.077

6.875.435

6.815.217

6.797.811

6.730.304

6.670.181

6.641.816

6.593.079

7.306.798;

7.232.567

7.205.159

7.169.550

7.118.742

7.070.787

7.009.037

6.964.762

6.913.752

6.867.005

6.815.201

6.780.967

6.720.310

6.670.115

6.635.469

6.579.673

7.285.646

7.232.566

7.198.934

7.157.083

7.105.655

7.070.781

7.008.622

6.958.158

6.911.315

6.861.234

6.812.026

6.780.598

6.716.823

6.664.406

6.613.530

6.576.758

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6.573.245

6.573.040 6.569.418 ; 6.569.340 ; 6.562.800;

6.544.752

6.544.728 6.534.482 ; 6.534.312 ; 6.534.064;

6.521.449

6.518.030 6.518.015 ; 6.514.691 6.514.503

6.503.882

6.495.676 6.495.526 ; 6.495.347 6.492.123

6.465.634

6.461.615 6.458.560 ; 6.458.527 ; 6.458.370;

6.428.970

6.428.952 6.428.790 ; 6.420.139 6.416.997

6.403.092

6.399.295 6.392.013 ; 6.391.657 6.384.198

6.355.248

6.355.247 6.348.450 ; 6.342.372 ; 6.342.228;

6.329.202

6.329.173 6.328.976 ; 6.322.964 6.319.666

6.309.633

6.306.625 6.296.807 ; 6.294.322 6.291.239

6.270.956

6.270.769 6.268.484 ; 6.265.562 6.265.149

6.258.358

6.248.332 6.245.331 ; 6.242.461 6.241.986

6.214.862

6.214.804 6.210.963 ; 6.210.873 6.207.185

6.190.871

6.190.666 6.168.923 ; 6.156.302 6.153.408

6.146.614

6.143.876 <J) LO O o "3- CD 6.140.043; 6.139.746;

6.114.507

6.114.143 6.110.466 6.107.020 6.103.521

6.090.392

6.087.476 6.083.903 ; 6.080.846 ; 6.080.725;

6.060.256

6.060.064 6.048.530 ; 6.045.788 ; 6.043.347;

6.030.770

6.030.618 6.025.141 6.025.125 ; 6.020.468;

6.013.484

6.013.432 6.007.838 6.004.811 ; 6.004.807;

5.985.641

5.985.545 5.981.537 5.981.505 5.981.170

5.961.979

5.961.970 5.958.765 ; 5.958.422 ; 5.955.647;

5.939.074

5.935.580 5.928.930 5.928.913 ; 5.928.644;

5.916.806

5.916.563 5.914.395 5.914.109 5.912.338

5.888.726

5.885.580 cn bo 00 cn cn 00 5.879.685; 5.876.731;

5.866.694

5.866.341 5.866.320 5.866.319 5.866.137

5.858.368

5.858.366 5.856.185 ; 5.854.400 ; 5.853.736;

5.849.475

5.849.288 5.843.728 ; 5.843.723 ; 5.843.640;

5.834.599

5.834.441 5.834.429 ; 5.834.256 ; 5.830.876;

5.827.723

5.824.497 5.824.304 5.821.047 5.817.767

5.807.707

5.804.604 5.804.371 ; 5.800.822 ; 5.795.955;

5.776.703

5.773.260 5.770.572 ; 5.766.844 5.766.842

5.756.666

5.753.258 5.750.373 ; 5.747.641 ; 5.747.526;

5.728.385

5.721.095 5.716.826 5.716.637 5.716.613

5.703.057

5.702.707 5.698.178; 5.688.914; 5.686.078;

5.667.783

5.665.536 5.665.355 ; 5.660.990 ; 5.658.745;

5.637.677

5.637.455 5.633.234 5.629.153 ; 5.627.025;

5.601.819

5.597.688 5.593.972 5.591.829 5.591.823

5.580.739

5.580.563 5.573.916 5.571.667 ; 5.569.468;

5.541.057

5.534.406 ; 5.529.765 ; 5.523.232 5.516.895

5.470.701

5.468.606 ; 5.462.852 5.459.127 5.449.601

5.399.501

5.397.695 5.391.479 ; 5.384.240 5.374.519

5.354.654

5.344.755 ; 5.335.673 ; 5.332.567 ; 5.320.940;

5.268.265

5.264.356 ; 5.264.342 ; 5.260.308 ; 5.256.767;

5.225.347

5.221.610 CD OO CM LO 5.208.321; 5.206.136;

5.166.050

5.156.951 ; 5.135.864 5.122.446 5.120.662

5.070.010

5.068.174 ; 5.066.782 ; 5.055.391 ; 5.043.262;

5.019.387

5.013.556 ; 5.008.183 ; 5.004.697 ; 4.997.772;

4.918.166

4.900.548 ; 4.888.290 ; 4.886.742 ; 4.885.235;

4.833.072 y 4.795.739.

6.558.961

6.551.828 6.551.824 ; 6.548.275 ; 6.544.780;

6.531.572

6.531.313 6.525.179 ; 6.525.028 ; 6.524.582;

6.511.845

6.511.812 6.511.801 6.509.313 ; 6.506.384;

6.489.131

6.489.129 6.482.614 ; 6.479.286 ; 6.479.284;

6.451.601

6.451.592 6.451.323 ; 6.436.407 ; 6.432.633;

6.410.318

6.410.028 6.410.014 ; 6.407.221 6.406.710

6.380.170

6.376.170 ; 6.372.426 6.365.187 ; 6.358.739;

6.338.952

6.337.179 6.335.183 6.335.017 6.331.404

6.319.665

6.319.500 6.319.494 6.316.205 6.316.003

6.291.157

; 6.287.568 ; 6.284.456 6.284.194 ; 6.274.337;

6.262.029

6.261.762 6.261.571 6.261.569 ; 6.258.599;

6.235.526

; 6.235.466 6.232.120 ; 6.228.361 6.221.579

6.203.974

6.197.755 6.197.531 6.197.496 6.194.142

6.153.393

6.153.392 6.153.378 6.153.377 6.146.635

6.132.992

6.124.306 6.124.132 6.121.006 6.120.990

6.100.234

; 6.099.848 ; 6.099.847 ; 6.096.291 ; 6.093.405;

6.074.650

; 6.074.646 6.070.126 ; 6.063.905 ; 6.063.564;

6.043.248

; 6.042.831 6.037.165 ; 6.033.672 ; 6.030.772;

6.019.979

6.017.543 6.017.537 6.015.694 6.015.661

6.004.763

5.998.132 5.993.819 ; 5.989.806 ; 5.985.926;

5.976.551

; 5.972.339 ; 5.965.371 ; 5.962.428 5.962.318

5.955.342

5.951.986 5.951.975 ; 5.942.237 ; 5.939.277;

5.928.642

5.925.513 ; 5.922.550 ; 5.922.325 5.919.458

5.912.176

5.912.170 ; 5.906.936 ; 5.895.650 5.891.623

5.876.716

5.874.226; 5.872.012 5.871.747 ; 5.869.058;

5.861.290

; 5.858.740 ; 5.858.647 ; 5.858.646 ; 5.858.369;

5.853.725

; 5.853.724 5.852.186 5.851.829 5.851.529

5.843.635

; 5.840.480 5.837.510 ; 5.837.250 ; 5.837.242;

5.830.641

; 5.830.475 ; 5.830.458 ; 5.830.457 ; 5.827.749;

5.817.754

5.817.637 5.817.470 5.817.318 5.814.482

5.795.743

; 5.795.572 ; 5.789.388 ; 5.780.279 ; 5.780.038;

5.766.625

; 5.763.574 5.763.190 ; 5.762.965 ; 5.759.769;

5.747.028

; 5.736.320 5.736.146 ; 5.733.760 5.731.189

5.714.374

; 5.709.879 ; 5.709.860 ; 5.709.843 5.705.331

5.681.831

5.679.784; 5.674.984 5.672.472 ; 5.667.964;

5.658.569

; 5.643.756 5.641.624 ; 5.639.854 ; 5.639.598;

5.622.705

5.614.413 5.610.035 ; 5.607.831 ; 5.606.026;

5.589.466

; 5.587.285 ; 5.585.254 ; 5.585.250 ; 5.580.773;

5.558.865

; 5.556.745 ; 5.550.052 ; 5.543.328 5.541.100

5.514.541

5.510.264 5.500.161 ; 5.480.967 ; 5.480.966;

5.447.838

; 5.447.837 ; 5.439.809 ; 5.439.792 5.418.136

5.374.518

5.374.516 ; 5.364.933 ; 5.359.046 ; 5.356.772;

5.317.009

5.312.902 ; 5.304.466 ; 5.296.347 ; 5.286.852;

5.256.561

; 5.252.556 ; 5.230.998 ; 5.230.887 5.227.159

5.198.346

5.185.147 5.178.865 5.173.400 5.173.399

5.103.836

5.100.777 5.100.662 ; 5.093.230 ; 5.077.284;

5.039.604

; 5.039.522 5.030.718 ; 5.030.555 ; 5.030.449;

4.983.529

; 4.983.387 ; 4.965.069 ; 4.945.082 4.921.787

4.870.003

; 4.869.903 4.861.707 ; 4.853.326 ; 4.839.288;

El VIH o los fragmentos inmunogenicos del mismo, pueden utilizarse como epftopo del VIH. Por ejemplo, tambien

son utiles los nucleotidos del VIH de las patentes de los Estados Unidos numeros 7.393.949

7.303.754. 7.173.014. 7.122.180. 7.078.516. 6.887.977. 6.870.045. 6.803.187. 6.794.129. 6.649.409. 6.627.442. 6.610.476. 6.602.705. 6.429.306. 6.420.545. 6.410.013. 6.407.077. 6.300.056. 6.277.561. 6.270.975. 6.261.564. 6.114.109. 6.090.392. 6.060.587. 6.057.102. 6.020.123. 6.015.661. 6.010.895. 6.001.555. 5.866.701. 5.866.694. 5.866.320. 5.866.137. 5.840.480. 5.821.046. 5.801.056. 5.786.177. 5.693.752. 5.688.637. 5.688.511. 5.684.147. 5.545.726. 5.527.895. 5.527.894. 5.223.423. 5

7.022.814. 6.974.866. 6.958.211. 6.949.337. 6.773.915. 6.768.004. 6.706.268. 6.696.291. 6.582.920. 6.557.296. 6.531.587. 6.531.137. 6.395.891. 6.355.789. 6.335.158. 6.323.185. 6.225.045. 6.222.024. 6.194.391. 6.194.142. 6.054.565. 6.043.081. 6.037.165. 6.034.233. 5.985.661. 5.980.900. 5.972.596. 5.939.538. 5.864.027. 5.861.242. 5.858.785. 5.858.651. 5.786.145. 5.773.247. 5.770.703. 5.756.674. 5.665.577. 5.585.263. 5.578.715. 5.571.712. 204.259. 5.144.019. 5.051.496 y 4.942.122.

. 7.374.877. 7.306.901. 6.946.254. 6.896.900. 6.692.955. 6.656.706. 6.500.623. 6.448.078. 6.316.183. 6.303.293. 6.162.631. 6.114.167. 6.033.902. 6.030.769. 5.912.338. 5.869.339. 5.849.475. 5.843.638. 5.741.706. 5.705.612. 5.567.603. 5.554.528.

En la presente solicited se puede utilizar cualquier epftopo reconocido por un anticuerpo anti-VIH. Por ejemplo, son

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6.768.004. 5.919.457. 4.983.529. las patenti RE39.057. 6.900.010. 6.689.118. 6.506.384. 6.391.657. 6.316.003. 6.228.361. 6.114.143. 5.993.812. 5.911.989. 5.849.288. 5.795.572. 5.707.814. 5.610.035. 5.478.753. 5.256.561. 5.156.951.

6.613.743.

6.534.312. 6.511.830. 6.489.131. 6.242.197. 6.114.143. 6.074.646. 6.063.564. 6.060.254.

5.916.806.

5.871.732. 5.824.304. 5.773.247. 5.736.320. 5.637.455. 5.587.285. 5.514.541. 5.317.009.

4.886.742.

4^ CO -M O O o CO < 4.795.739. Ademas, tambien son utiles los anticuerpos monoclonales anti-VIH de

i de los Estados Unidos numeros

7.074.556. 7.074.554. 7.070.787. 7.060.273. 7.045.130. 7.033.593.

7.008.622.

6.984.721. 6.972.126. 6.949.337. 6.946.465. 6.919.077. 6.916.475. 6.911.315. 6.905.680.

6.825.217.

6.824.975. 6.818.392. 6.815.201. 6.812.026. 6.812.024. 6.797.811. 6.768.004. 6.703.019.

6.657.050.

6.608.179. 6.600.023. 6.596.497. 6.589.748. 6.569.143. 6.548.275. 6.525.179. 6.524.582.

6.498.006.

6.489.131. 6.465.173. 6.461.612. 6.458.933. 6.432.633. 6.410.318. 6.406.701. 6.395.275.

6.391.635.

6.384.198. 6.376.170. 6.372.217. 6.344.545. 6.337.181. 6.329.202. 6.319.665. 6.319.500.

6.312.931.

6.309.880. 6.296.807. 6.291.239. 6.261.558. 6.248.514. 6.245.331. 6.242.197. 6.241.986.

6.221.580.

6.190.871. 6.177.253. 6.146.635. 6.146.627. 6.146.614. 6.143.876. 6.132.992. 6.124.132.

6.103.238.

6.060.254. 6.039.684. 6.030.772. 6.020.468. 6.013.484. 6.008.044. 5.998.132. 5.994.515.

5.985.545.

5.981.278. 5.958.765. 5.939.277. 5.928.930. 5.922.325. 5.919.457. 5.916.806. 5.914.109.

5.906.936.

5.889.158. 5.876.716. 5.874.226. 5.872.012. 5.871.732. 5.866.694. 5.854.400. 5.849.583.

5.840.480.

5.840.305. 5.834.599. 5.831.034. 5.827.723. 5.821.047. 5.817.767. 5.817.458. 5.804.440.

5.783.670.

5.776.703. 5.773.225. 5.766.944. 5.753.503. 5.750.373. 5.747.641. 5.736.341. 5.731.189.

5.702.707.

5.698.178. 5.695.927. 5.665.536. 5.658.745. 5.652.138. 5.645.836. 5.635.345. 5.618.922.

5.607.847.

5.604.092. 5.601.819. 5.597.896. 5.597.688. 5.591.829. 5.558.865. 5.514.541. 5.510.264.

5.374.518.

5.374.516. 5.344.755. 5.332.567. 5.300.433. 5.296.347. 5.286.852. 5.264.221. 5.260.308.

5.254.457.

5.230.998. 5.227.159. 5.223.408. 5.217.895. 5.180.660. 5.173.399. 5.169.752. 5.166.050.

5.140.105.

5.135.864. 5.120.640. 5.108.904. 5.104.790. 5.049.389. 5.030.718. 5.030.555. 5.004.697.

4^ oo 00 00 k) CD o

4.886.742 y CD CM CO CO LO OO

Los vectores deben elegirse generalmente de manera que contengan una region reguladora del gen adecuada, tal como un promotor o potenciador, de manera que los antigenos y/o anticuerpos se puedan expresar.

Por ejemplo, cuando el objetivo es expresar los anticuerpos y/o antigenos in vitro, o en celulas cultivadas, o en cualquier sistema procariota o eucariota con el fin de producir la protema(s) codificada(s) por ese anticuerpo y/o antigeno, puede utilizarse cualquier vector adecuado dependiendo de la aplicacion. Por ejemplo, pueden usarse plasmidos, vectores vmcos, vectores bacterianos, vectores protozoarios, vectores de insectos, vectores de expresion de baculovirus, vectores de levadura, vectores de celulas de mairnferos y similares. Los vectores adecuados pueden ser seleccionados por el experto en la materia teniendo en cuenta las caractensticas del vector y los requisitos para expresar los anticuerpos y/o antigenos bajo las circunstancias identificadas.

Cuando el objetivo es expresar los anticuerpos y/o antigenos in vivo en un sujeto, por ejemplo para generar una respuesta inmunitaria contra un antigeno de VIH-1 y/o una inmunidad protectora contra el VIH-1, debenan elegirse los vectores de expresion que son adecuados para la expresion en ese sujeto y que son seguros para el uso in vivo. Por ejemplo, puede ser deseable expresar los anticuerpos y/o antfgenos en un animal de laboratorio, tal como para pruebas preclmicas de las composiciones inmunogenas del VIH-1 y las vacunas. A veces, sera deseable expresar los anticuerpos y/o antfgenos en sujetos humanos, tales como en ensayos clmicos y para el uso clmico real de las composiciones inmunogenas y la vacuna. Pueden emplearse cualesquiera vectores que sean adecuados para tales usos y esta dentro de las capacidades del experto en la materia seleccionar un vector adecuado. Se puede preferir que los vectores usados para estas aplicaciones in vivo esten atenuados para que el vector se amplifique en el sujeto. Por ejemplo, si se usan vectores plasmfdicos, estos preferentemente careceran de un origen de replicacion que funcione en el sujeto para aumentar la seguridad para su uso in vivo en el sujeto. Si se utilizan vectores vmcos, preferentemente se atenuan o son defectuosos en la replicacion en el sujeto, de nuevo, con el fin de aumentar la seguridad para el uso in vivo en el sujeto.

Se pueden usar vectores virales. Los vectores de expresion viral son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, virus tales como adenovirus, virus adenoasociados (AAV), alfavirus, herpesvirus, retrovirus y poxvirus, incluyendo virus avipox, poxvirus atenuados, virus vaccinia y particularmente, el virus vaccinia Ankara modificado (mVa, N.° de Acceso ATCC VR-1566). Tales virus, cuando se usan como vectores de expresion, son innatamente no patogenos en los sujetos seleccionados, tales como seres humanos o han sido modificados para hacerlos no patogenos en los sujetos seleccionados. Por ejemplo, los adenovirus y los alfavirus defectuosos de replicacion son bien conocidos y pueden usarse como vectores de administracion genica.

Las secuencias de nucleotidos y los vectores se pueden suministrar a las celulas, por ejemplo si el objetivo es expresar los antfgenos del VIH-1 en las celulas con el fin de producir y aislar las protemas expresadas, tales como de las celulas cultivadas en cultivo. Para expresar los anticuerpos y/o antfgenos en celulas, pueden usarse procedimientos de transfeccion, transformacion o administracion genica adecuados. Tales procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia y el experto en la materia facilmente podna seleccionar un procedimiento adecuado dependiendo de la naturaleza de las secuencias de nucleotidos, vectores y tipos de celulas utilizados. Por ejemplo, se podna usar transfeccion, transformacion, microinyeccion, infeccion, electroporacion, lipofeccion o administracion mediada por liposomas. La expresion de los anticuerpos y/o antfgenos puede llevarse a cabo en cualquier tipo adecuado de celulas hospedadoras, tales como celulas bacterianas, levaduras, celulas de insecto y celulas de marnffero. Los anticuerpos y/o antfgenos tambien pueden expresarse usando incluyendo la

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transcripcion/traduccion in vitro. Todos estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia y el experto en la materia facilmente podna seleccionar un procedimiento adecuado dependiendo de la naturaleza de las secuencias de nucleotidos, vectores y tipos de celulas utilizados.

En realizaciones preferidas, las secuencias de nucleotidos, anticuerpos y/o antigenos se administran in vivo, por ejemplo si el objetivo es producir una respuesta inmunogenica en un sujeto. Un “sujeto” en el contexto de la presente invencion puede ser cualquier animal. Por ejemplo, en algunas realizaciones se puede desear expresar los transgenes en un animal de laboratorio, tal como para pruebas preclmicas de las composiciones inmunogenas del VIH-1 y vacunas. Por ejemplo, sera deseable expresar los anticuerpos y/o antigenos en sujetos humanos, tales como en ensayos clmicos y para el uso clmico real de las composiciones inmunogenas y la vacuna. En realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano, por ejemplo un ser humano que esta infectado con, o esta en riesgo de infeccion con el VlH-1.

Para tales aplicaciones in vivo, las secuencias de nucleotidos, anticuerpos y/o antigenos se administran preferentemente como un componente de una composicion inmunogenica que comprende las secuencias de nucleotidos y/o antigenos en mezcla con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Las composiciones inmunogenicas son utiles para estimular una respuesta inmunitaria contra el VIH-1 y pueden usarse como uno o mas componentes de una vacuna profilactica o terapeutica contra el VIH-1 para la prevencion, mejora o tratamiento del SIDA. Los acidos nucleicos y vectores son particularmente utiles para proporcionar vacunas geneticas, es decir, vacunas para administrar los acidos nucleicos que codifican los anticuerpos y/o antfgenos a un sujeto, tal como un ser humano, de manera que los anticuerpos y/o antfgenos se expresan entonces en el sujeto para provocar una respuesta inmunitaria.

Las composiciones de la divulgacion pueden ser suspensiones inyectables, soluciones, pulverizaciones, polvos liofilizados, jarabes, elixires y similares. Puede utilizarse cualquier forma adecuada de composicion. Para preparar dicha composicion, se mezcla un acido nucleico o vector, que tiene el grado de pureza deseado, con uno o mas vehfculos y/o excipientes farmaceuticamente aceptables. Los vehfculos y excipientes deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de la composicion. Los vehfculos, excipientes o estabilizadores aceptables no son toxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol o combinaciones de los mismos, tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butflico o bendlico, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol); polipeptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); protemas, tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn- protema) y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN®, PLURONICs® o polietilenglicol (PEG).

Tambien se puede formular una composicion inmunogenica o inmunologica en forma de una emulsion de aceite en agua. La emulsion de aceite en agua puede basarse, por ejemplo, en aceite de parafina lfquido ligero (del tipo descrito en la Farmacopea Europea); aceite de isoprenoide tal como escualano, EICOSANE® o tetratetracontano; aceite resultante de la oligomerizacion de alqueno(s), p.ej., isobuteno o deceno; esteres de acidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; esteres de acidos grasos ramificados o alcoholes, p.ej, esteres de acido isoestearico. El aceite se utiliza ventajosamente en combinacion con emulsionantes para formar la emulsion. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no ionicos, tales como esteres de sorbitan, mannide (p. ej., oleato de anhidromannitol), glicerol, poliglicerol, propilenglicol y acido oleico, acido isoestearico, ricinoleico o hidroxiestearico, los cuales estan opcionalmente etoxilados y copolfmeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, tales como los productos Pluronic®, p.ej., L121. El adyuvante puede ser una mezcla de emulsionante(s), agente formador de micelas y aceite tal como el que esta disponible comercialmente con el nombre de Provax® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA).

Las composiciones inmunogenicas pueden contener sustancias adicionales, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes o adyuvantes para aumentar la eficacia de las vacunas (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, Mack Publishing Company, (ed.) 1980).

Tambien pueden incluirse adyuvantes. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, sales minerales (por ejemplo, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH(SO4)2, sflice, alumbre, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, caolm o carbono), polinucleotidos con o sin complejos estimulantes del sistema inmunitario (ISCOM) (por ejemplo, oligonucleotidos CpG, tales como los descritos en Chuang, T.H. Et al., (2002) J. Leuk. Biol. 71(3): 538-44; Ahmad-Nejad, P. et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32(7):1958-68; Acidos poli IC o poli AU, poliarginina con o sin CpG (tambien conocida en la tecnica como IC31, vease Schellack, C. et al (2003) Proceedings of the 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology; Lingnau, K. et al (2002) Vaccine 20(29-30): 3498-508), JuvaVax™ (patente US-6.693.086), determinadas sustancias naturales (por ej., cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias encontradas en Cornyebacterium parvum,

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Bordetella pertussis, o miembros del genera Brucella), flagelina (ligando del receptor de tipo Toll 5); vease McSorley, S.J. et al (2002) J. Immunol. 169(7):3914-9), saponinas tales como QS21, QS17 y QS7 (patentes Us-5.057.540; uS- 5.650.398; US-6.524.584; US-6.645.495), monofosforil lfpido A, en particular, 3-des-O-acilcado monofosforil Upido A (3D-MPL), imiquimod (tambien conocido en la tecnica como IQM y comercialmente disponible como Aldara®; patentes US-4.689.338; US-5.238.944; Zuber, A.K. et al. (2004) 22(13-14): 1791-8) y el inhibidor de CCR5 CMPD167 (vease Veazey, R.S. et al (2003) J. Exp. Med. 198: 1551-1562).

El hidroxido o el fosfato de aluminio (alumbre) se usan comunmente en una solucion al 0,05 a 0,1 % en solucion salina tamponada con fosfato. Otros adyuvantes que pueden usarse, especialmente con vacunas de ADN, son la toxina del colera, especialmente CTA1-Dd/ISCOM (vease Mowat, A.M. et al (2001) J. Immunol. 167(6): 3398-405), polyphosphazenes (Allcock, H.R. (1998) App. Organometallic Chem. 12(10-11): 659-666; Payne, L.G. et al (1995) Pharm. Biotechnol. 6: 473-93), citoquinas tales como, pero sin limitarse a, IL-2, IL-4, GM-CsF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-a, IFN-p e IFN-y (Boyer et al., (2002) J. Liposome Res. 121:137-142; WO01/095919), protemas inmunorreguladoras tales como CD40L (ADX40, vease, por ejemplo, WO03/063899) y el ligando CD1a de celulas asesinas naturales (tambien conocido como CRONY o a-galactosil ceramida; Green, T.D. et al., (2003) J. Virol. 77(3): 2046-2055), protemas de fusion inmunoestimuladoras tales como IL-2 fusionadas con el fragmento Fc de inmunoglobulinas (Barouch et al., Science 290:486-492, 2000) y las moleculas coestimuladoras B7.1 y B7.2 (Boyer), todas las cuales pueden administrarse como protemas o en forma de ADN, en los mismos vectores de expresion que los que codifican los antfgenos o en vectores de expresion separados.

Los adyuvantes pueden ser lecitina combinada con un polfmero acnlico (Adjuplex-LAP), gotitas de aceite recubiertas de lecitina en una emulsion de aceite en agua (Adjuplex-LE) o lecitina y polfmero acnlico en una emulsion de aceite en agua (Adjuplex-LAO ) (Advanced BioAdjuvants (ABA)).

Las composiciones inmunogenicas pueden disenarse para introducir los acidos nucleicos o vectores de expresion en un sitio de accion deseado y liberarlos a una velocidad apropiada y controlable. Los procedimientos para preparar formulaciones de liberacion controlada son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las preparaciones de liberacion controlada pueden producirse mediante el uso de polfmeros para formar complejo o absorber el inmunogeno y/o la composicion inmunogenica. Se puede preparar una formulacion de liberacion controlada utilizando macromoleculas apropiadas (por ejemplo, poliesteres, poliaminoacidos, polivinilpirrolidona, etilenvinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina) conocidas por proporcionar las caractensticas de liberacion controlada o el perfil de liberacion deseados. Otro procedimiento posible para controlar la duracion de la accion por una preparacion de liberacion controlada es incorporar los principios activos en partmulas de un material polimerico tales como, por ejemplo, poliesteres, poliaminoacidos, hidrogeles, acido polilactico, acido poliglicolico, copolfmeros de estos acidos o copolfmeros de etileno-acetato de vinilo. En otra alternativa, en lugar de incorporar estos principios activos en partmulas polimericas, es posible atrapar estos materiales en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsula de poli(metilmetacrilato) respectivamente, en sistemas coloidales de administracion de farmacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Tales tecnicas se desvelan en New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore, Md., 1978 and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion.

Las dosis adecuadas de los acidos nucleicos y vectores de expresion (colectivamente, los inmunogenos) de la composicion inmunogenica pueden determinarse facilmente por los expertos en la materia. Por ejemplo, la dosis de los inmunogenos puede variar dependiendo de la via de administracion y del tamano del sujeto. Las dosis adecuadas pueden ser determinadas por los expertos en la materia, por ejemplo midiendo la respuesta inmunitaria de un sujeto, tal como un animal de laboratorio, usando tecnicas inmunologicas convencionales y ajustando las dosis segun sea apropiado. Tales tecnicas para medir la respuesta inmunitaria del sujeto incluyen, pero no se limitan a, ensayos de liberacion de cromo, ensayos de union a tetramero, ensayos ELISPOt de IFN-y, ensayos ELISPOT de IL-2, ensayos de citoquinas intracelulares y otros ensayos de deteccion inmunologica, por ej., como se detalla en el texto “Antibodies: A Laboratory Manual” de Ed Harlow y David Lane.

Cuando se proporcionan profilacticamente, las composiciones inmunogenicas se administran idealmente a un sujeto antes de la infeccion por VIH o signos de la infeccion por VIH, o antes de cualquier smtoma debido al SIDA, especialmente en sujetos de alto riesgo. La administracion profilactica de las composiciones inmunogenicas puede servir para proporcionar inmunidad protectora de un sujeto contra la infeccion por VIH-1 o para prevenir o atenuar la progresion del SIDA en un sujeto ya infectado con VIH-1. Cuando se proporcionan terapeuticamente, las composiciones inmunogenicas pueden servir para mejorar y tratar los smtomas del SIDa y se utilizan ventajosamente despues de la infeccion tan pronto como sea posible, preferentemente antes de la aparicion de cualquier smtoma del SIDA, pero tambien pueden usarse en (o despues) el inicio de los smtomas de la enfermedad.

Las composiciones inmunogenicas pueden administrarse utilizando cualquier procedimiento de administracion adecuado incluyendo, pero sin limitarse a, administracion intramuscular, intravenosa, intradermica, mucosa y topica. Dichas tecnicas son bien conocidas por los expertos en la materia. Ejemplos mas espedficos de procedimientos de administracion son inyeccion intramuscular, inyeccion intradermica e inyeccion subcutanea. Sin embargo, la administracion no debe limitarse a los procedimientos de inyeccion. Ademas, la administracion de ADN al tejido

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animal se ha conseguido mediante liposomas cationicos (Watanabe et al., (1994) Mol. Reprod. Dev. 38:268-274 y documento WO 96/2013), inyeccion directa de ADN desnudo en tejido muscular animal (Robinson et al., (1993) Vaccine 11:957-960; Hoffman et al., (1994) Vaccine 12:1529-1533; Xiang et al., (1994) Virology 199:132-140; Webster et al., (1994) Vaccine 12:1495-1498; Davis et al., (1994) Vaccine 12:1503-1509 y Davis et al., (1993) Hum. Mol. Gen. 2:1847-1851) o la inyeccion intradermica de ADN mediante la tecnologfa de la “pistola genica” (Johnston et al., (1994) Meth. Cell Biol. 43: 353-365). Como alternativa, las vfas de administracion pueden ser orales, intranasales o por cualquier otra via adecuada. La administracion tambien se lleva a cabo a traves de una superficie de la mucosa tal como la mucosa anal, vaginal u oral.

Los esquemas (o regfmenes) de inmunizacion son bien conocidos en los animales (incluyendo seres humanos) y pueden determinarse facilmente para el sujeto particular y la composicion inmunogenica. Por lo tanto, los inmunogenos se pueden administrar una o mas veces al sujeto. Preferentemente, existe un intervalo de tiempo establecido entre administraciones separadas de la composicion inmunogenica. Aunque este intervalo vana para cada sujeto, normalmente oscila entre 10 dfas y varias semanas y suele ser de 2, 4, 6 u 8 semanas. Para los seres humanos, el intervalo es generalmente de 2 a 6 semanas. Los regfmenes de inmunizacion tienen generalmente de 1 a 6 administraciones de la composicion inmunogenica, pero pueden tener tan solo una o dos o cuatro. Los procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria tambien pueden incluir la administracion de un adyuvante con los inmunogenos. En algunos casos, la vacunacion de refuerzo anual, bianual u otro intervalo largo (5-10 anos) puede complementar el protocolo de inmunizacion inicial.

Los presentes procedimientos tambien incluyen una variedad de regfmenes de sensibilizacion-refuerzo, por ejemplo regfmenes de refuerzo con refuerzo de ADN de adenovirus. En estos procedimientos, una o mas inmunizaciones de sensibilizacion van seguidas por una o mas inmunizaciones de refuerzo. La composicion inmunogenica real puede ser igual o diferente para cada inmunizacion y el tipo de composicion inmunogenica (por ejemplo, que contiene protema o vector de expresion), la via y la formulacion de los inmunogenos tambien se pueden variar. Por ejemplo, si se usa un vector de expresion para las etapas de sensibilizacion y refuerzo, puede ser del mismo o de diferente tipo (por ejemplo, ADN o vector de expresion bacteriano o viral). Un regimen de sensibilizacion-refuerzo util proporciona dos inmunizaciones de sensibilizacion, con un intervalo de cuatro semanas, seguidas por dos inmunizaciones de refuerzo a las 4 y 8 semanas despues de la ultima inmunizacion de sensibilizacion. Tambien debe ser facilmente evidente para un experto en la materia que hay varias permutaciones y combinaciones que estan abarcadas utilizando los vectores de expresion de ADN, bacteriano y vmco para proporcionar regfmenes de sensibilizacion y de refuerzo.

La divulgacion proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria contra el VIH en un sujeto administrando una composicion inmunogenica, que comprende preferentemente un vector de adenovirus que contiene ADN que codifica uno o mas de los epftopos, una o mas veces a un sujeto en el que los epttopos se expresan a un nivel suficiente para inducir una respuesta inmunitaria espedfica en el sujeto. Dichas inmunizaciones pueden repetirse varias veces a intervalos de tiempo de al menos 2, 4 o 6 semanas (o mas) de acuerdo con un regimen de inmunizacion deseado.

Las composiciones inmunogenicas pueden administrarse solas, o pueden coadministrarse o administrarse secuencialmente, con otros inmunogenos del VIH y/o composiciones inmunogenas del VIH, por ejemplo, con “otras” composiciones inmunologicas, antigenicas o vacunales o terapeuticas, proporcionando asf composiciones multivalentes o “coctel” o composiciones combinadas de la invencion y procedimientos para emplearlas. De nuevo, los componentes y la forma (secuencial o coadministracion) de la administracion, asf como las dosis pueden determinarse teniendo en cuenta factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condicion del sujeto particular y la via de administracion.

Cuando se usan en combinacion, los otros inmunogenos del VIH pueden administrarse al mismo tiempo o en momentos diferentes como parte de un regimen de inmunizacion global, por ejemplo, como parte de un regimen de sensibilizacion-refuerzo u otro protocolo de inmunizacion. En una realizacion ventajosa, el otro inmunogeno del VIH es env, preferentemente el tnmero env del HIV.

Muchos otros inmunogenos del VIH son conocidos en la tecnica, uno de tales inmunogenos preferido es el HIVA (descrito en el documento WO 01/47955), el cual se puede administrar como una protema, en un plasmido (por ejemplo, pTHr.HIVA) o en un vector viral (por ejemplo, MVA.HIVA). Otro de estos inmunogenos del VIH es RENTA (descrito en el documento PCT/US2004/037699), el cual tambien se puede administrar como una protema, en un plasmido (por ejemplo, pTH.RENTA) o en un vector viral (por ejemplo, MVA.RENTA).

Por ejemplo, un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra el VIH en un sujeto humano comprende administrar al menos una dosis de sensibilizacion de un inmunogeno del VIH y al menos una dosis de refuerzo de un inmunogeno del VIH, en el que el inmunogeno en cada dosis puede ser el mismo o diferente, siempre que al menos uno de los inmunogenos sea un epftopo de la presente solicitud, un acido nucleico que codifica un epftopo de la solicitud o un vector de expresion, preferentemente un vector VSV, que codifica un epftopo de la solicitud y en el que los inmunogenos se administren en una cantidad o se expresan a un nivel suficiente para inducir una respuesta inmunitaria espedfica del VIH en el sujeto. La respuesta inmunitaria espedfica del VIH puede incluir una respuesta inmunitaria de linfocitos T espedfica del VIH o una respuesta inmunitaria de linfocitos B espedfica del VIH. Dichas

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inmunizaciones pueden realizarse a intervalos, preferentemente de al menos 2-6 semanas o mas.

La invencion se describira ahora adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Identificacion de Env solubles del VIH-1 con mejor union a PG9/PG16

La gp120 desprendida se detecto como se indica a continuacion. Se ensayaron mas de 50 Env del VIH-1 del Clado B y C, panel del clado C de la India, algunos clados B de nivel I y unas pocas envolturas del virus fundador.

El procedimiento para la seleccion de la gp120 desprendida fue el siguiente:

- Transfectar celulas 293T con los plasmidos de enlace posterior NL4-3 y Env del VIH-1;

- Recoger el sobrenadante;

- Capturar la gp120 desprendida en placa ELISA revestida con D7324 (anti-C5 policlonal) y

- Determinar mediante sonda la Env capturada para la union a b12, PG9 y PG16.

Los solicitantes tienen codones optimizados de las versiones gp120 y gp140 de las cuatro cepas del Clado C de la India que muestran una union excepcional a PG9. Los solicitantes han ensayado las Env por transfeccion transitoria y mantienen la propiedad de union como se ve en la gp120 desprendida. Los solicitantes pueden usar estas Env para estudios de inmunogenicidad, para generar herramientas para cartografiar anticuerpos similares a PG9 en sueros y/o generar gp120 reestructurados para una mejor presentacion de un epftopo PG9.

Ejemplo 2: Mutacion estabilizadora BG505 L111A para protemas de la envoltura del VIH

El Ejemplo se refiere a una forma de estabilizar una protema de la envoltura (Env) del VIH del Clado recombinante. Es una mutacion L111A que elimina los agregados pero tambien estabiliza las protemas. La mutacion se describio anteriormente como la reduccion de la formacion de dfmeros en una protema del Clado B (Finzi A et al. J Virol Methods. 2010 Sep; 168(1-2): 155-61). La misma mutacion introducida en la protema Env del Clado A no solo tuvo el mismo efecto sino que tambien permitio la purificacion de las protemas gap120 del VIH, lo cual antes no era posible, aumentando asf la estabilidad general de la protema. Un analisis adicional de las protemas que llevan esta mutacion confirmo que estas protemas conservan la antigenicidad completa de la protema de tipo silvestre, es decir, la union de anticuerpos neutralizantes asociados con la resistencia al VIH. Los solicitantes han ensayado la union de anticuerpos para varias variantes de conformacion de la protema de la envoltura: gp120 secretada y purificada de celulas de mairnfero, gap140 con un motivo de trimerizacion artificial y gp160 sobre una superficie celular. Tambien se ensayo un pseudovirus del VIH en un ensayo de neutralizacion asf como celulas infectadas con un virus VSV recombinante. Para una aplicacion de vacuna es importante retener las propiedades de un inmunogeno en una formulacion que se puede administrar a sujetos vacunados. Con este fin, los solicitantes confirmaron que la protema de la envoltura del Clado A mutada adsorbida sobre la superficie de las partmulas de aluminio (fosfato de aluminio) (coadyuvante de vacuna ampliamente utilizado) conserva su capacidad de interactuar con anticuerpos neutralizantes. Se uso la gp120 L111A del Clado A para la inmunizacion de conejos en un experimento de inmunizacion de sensibilizacion con ADN - refuerzo con protema. Los sueros resultantes de los animales inmunizados mostraron anticuerpos que se unen a protemas de la envoltura afines y alternativas. Tambien fue capaz de neutralizar los pseudovirus del VIH de Nivel 1 y Nivel 2.

El valor universal de esta mutacion se confirmo mediante la creacion de otra protema de la envoltura, Clado C, con mejores propiedades de agregacion.

Las secuencias de tipo silvestre originales se alinearon con la cepa de referencia HxB2 de la protema de la envoltura del HIV. La leucina en la posicion correspondiente a 111 en HxB2 fue reemplazada por alanina. La mutagenesis real se realizo por GeneArt (Life Technologies) y el ADN se suministro en un plasmido pCI-Neo o pCDNA. Se hicieron varias versiones de BG505 del Clado A: gp120, gp140, gp140 con motivo de trimerizacion GCN4 y gp160 delta CT (sin cola citoplasmatica).

Las protemas de la envoltura que llevan la mutacion L111A y las versiones no mutadas (tipo silvestre) se produjeron por transfeccion transitoria de ADN de celulas HEK 293T o HEK 293S. Las celulas 293T y 293 S difieren en el tipo de glicosilacion de las protemas recombinantes secretadas. Las primeras producen protemas con oligosacaridos complejos, mientras que las segundas producen protemas con glicanos de tipo oligomanosa.

Las protemas secretadas en los medios de cultivo celular se purificaron usando cromatograffa de afinidad en columna con lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno) (GNL). (Gilljam G. AIDS Res Hum Retroviruses. 1993 May; 9 (5):431-8)

La antigenicidad (union a anticuerpos) se midio con multiples anticuerpos humanos aislados de sujetos infectados con el VIH. Procedimientos utilizados para medir la antigenicidad: ELISA para Env recombinantes solubles capturadas mediante His-tags y citometna de flujo (FACS) para Env gp160 expresadas en la superficie celular.

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Para el ensayo de neutralizacion, se generaron pseudovirus del VIH en celulas 293T con gp160 del Clado A sobre la superficie del virus. Se midio la actividad del anticuerpo neutralizante mediante la monitorizacion de la reduccion en la expresion del indicador Luciferasa tras un unico ciclo de infeccion viral en celulas TZM-bl (Li M et al. J Virol. 2005 Aug; 79(16): 10108-25).

Se realizaron estudios de inmunogenicidad en conejos. Con sensibilizacion con ADN para gp120 L111A del Clado A, seguido de refuerzo con protema gp120 L111A del Clado A purificada. Para este estudio la protema se purifico a partir de celulas HEK 293s. Se recogio sangre y se analizo la totalidad de los tttulos de gp120 anti-VIH mediante ELISA con gp120 JR-CSF como patron. Se realizo un analisis adicional midiendo la neutralizacion de un panel de pseudovirus de Nivel 1 y Nivel 2 en el ensayo TZM-bl mediante sueros de conejo (Li M et al. J Virol. 2005 Aug; 79(16):10108-25 y Mascola JR et al. J Virol. 2005 Aug; 79 (16): 10103-7).

La Figura 3 representa un mutante L111A de BG505 que tiene una agregacion menor que la protema original. Las muestras en forma no reducida (NR) o reducida (Red) se separaron por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida). Cada muestra contiene 5 |jg de protema. Los solicitantes intentaron la purificacion de la gp120 BG505 pero se encontraron con una protema que estaba muy agregada y de baja actividad. Se preparo un mutante de la BG505 con un patron de agregacion inferior pronosticado (Finzi A et al., J Virol Methods. 2010 Sep; 168(1- 2):155-61) y se expreso en celulas HEK 293S y 293T.

La Figura 4 representa la union a gp120 BG505 L111A en sobrenadantes de cultivo celular. La union del anticuerpo a gp120 BG505 L111A secretada en medio de cultivo celular se midio mediante ensayo inmunoenzimatico ligado a enzimas (ELISA) en microplacas de 96 pocillos. El conjunto de anticuerpos utilizados para caracterizar la antigenicidad inclrna anticuerpos espedficos del tnmero (PG9, PG16), anticuerpos espedficos de union a CD4 (CD4bs) (b6, b12, VRC01, VRC04/PGV04) y la serie PGT (PGT121-130).

La Figura 5 representa la purificacion de BG505 en columnas de lectina y His-Trap. La protema modificada puede purificarse por dos procedimientos de cromatograffa de afinidad diferentes sin danarse y conservar su capacidad antigenica. El ensayo se realizo mediante inmunotransferencia Western con anticuerpo neutralizante anti-His, IgG espedfica de manosa de amplio espectro, 2G12 y un grupo de inmunoglobulinas de individuos VIH-positivos (HIVIG). SDS-PAGE: tincion de protemas (5 microgramos de protema por pocillo) y transferencia Western (0,5 microgramos de protema por pocillo) -deteccion de HIVIG, 2G12 y anti-His. La gp120 BG505 L111A era de celulas 293S.

La Figura 6 representa un perfil de antigenicidad por ELISA de BG505 L111A purificada mediante 2 metodos cromatograficos diferentes. La union subsiguiente de los anticuerpos no se pudo distinguir por ELISA.

La Figura 7 representa la union del anticuerpo a la protema gp120 BG505 L111A purificada. Las protemas que portaban la mutacion L111A se purificaron con exito tanto a partir de celulas 293S como 293T mediante columna GNL y conservaron su antigenicidad que fue confirmada por ELISA de protemas purificadas. Con la excepcion de algunos anticuerpos PGT, los anticuerpos mas neutralizantes se unen a gp120 BG505 L111A. PGT135, 136 y 141 no se unen a la gp120 BG505.

La Figura 8 representa la union del anticuerpo espedfica del cebador y espedfica de CD4bs al tnmero BG505 recombinante. Debido a que las protemas nativas de la envoltura del VIH existen como una espmula en forma de tnmero en la superficie del virus, los solicitantes fabricaron tnmeros recombinantes para probar el efecto de la mutacion. Esta figura muestra que BG505 L111A conserva la capacidad de unir anticuerpos anti-gp120 en una conformacion de tnmero. El tnmero se preparo anadiendo el motivo de trimerizacion GCN4 a la molecula gp140 BG505 L111A.

La Figura 9 representa los anticuerpos PGT que se unen al tnmero BG505 L111A gp140 GCN4L4. Una observacion similar fue valida para un grupo de anticuerpos neutralizantes PGT de amplio espectro.

La Figura 10 representa un ensayo de neutralizacion (comparacion de los pseudovirus BG505 WT y BG505 L111A). El ensayo de neutralizacion se realizo con pseudovirus BG505 WT y L111A y un panel de anticuerpos neutralizantes humanos de amplio espectro. La mayona de los anticuerpos neutralizan ambas formas de virus en la misma medida. Esta es una clara indicacion de que la mutacion L111A no pone en peligro la gp160 totalmente funcional.

La Figura 11 representa los perfiles de union espedficos de clados y mutantes por citofluorimetna. Se realizo otro ensayo de la integridad de la protema de la envoltura gp160 con la mutacion L111A con gp160 expresada en celulas HEK 293T mediante transfeccion transitoria con un ADN plasmfdico. En este estudio se midio la union de un panel de anticuerpos neutralizantes usando citofluorimetna (FACS). BG505 tema el patron de union mas amplio comparado con el Clado B (JR-FL) y el Clado C (16055). El patron de union a BG505Wt y L111A fue similar.

La Figura 12 representa un ensayo de Neutralizacion con sueros de conejos inmunizados con gp120 BG505 L111A. Este estudio se realizo mediante la inmunizacion de conejos utilizando la estrategia de sensibilizacion-refuerzo. En este experimento los solicitantes usaron dos inmunizaciones de ADN (sensibilizacion 2X) y un refuerzo con protemas con gp120 BG505 L111A. Los antisueros de los conejos del experimento se diluyeron y se aplicaron en el ensayo de neutralizacion de pseudovirus. Los resultados se muestran como tftulos de IC50. Los conejos que fueron

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

sensibilizados con ADN y reforzados con protema desarrollaron actividad de neutralizacion frente a los pseudovirus del Clado A, B y C.

Las protemas de este ejemplo pueden ser utiles para la produccion de protemas de la envoltura recombinantes estables solubles como componentes de la vacuna del VIH, como cebo para la identificacion de anticuerpos neutralizantes. Las protemas purificadas de este Ejemplo pueden ser utiles como patron analftico para la inmunizacion pasiva con anticuerpos para caracterizar el tipo de anticuerpos neutralizantes inducidos por vacunas para el VIH o para cristalizacion para identificar epftopos para anticuerpos neutralizantes y diseno de nuevos inmunogenos. Las protemas de este ejemplo pueden ser utiles en el diseno de inmunogenos geneticos (ADN, vector viral) que llevan protemas de la envoltura con la mutacion estabilizadora o de partmulas similares a virus que llevan protemas de la envoltura con la mutacion estabilizadora.

Ejemplo 3: Mutacion de estabilizacion BG505 L111A T332N para las protemas de la envoltura del VIH

El Ejemplo se refiere a procedimientos para mejorar la union de ciertos anticuerpos PGT a una protema de la envoltura del VIH del Clado A recombinante. La mutacion T332N que introduce un potencial sitio de glicosilacion es importante como parte de epftopos para algunos anticuerpos PGT (Walker LM et al. Nature. 2011,477 (7365):466-70 y Pejchal R et al. Science. 2011, 334(6059):1097-103). La protema se expreso como gp120 BG505 L111A T332N. Un analisis adicional de las protemas que llevan esta mutacion confirmo que estas protemas conservan la antigenicidad completa de la protema de tipo silvestre, es decir, la union de anticuerpos neutralizantes asociados con la resistencia al VIH. Ademas de esos anticuerpos, una familia de anticuerpos PGT135 y PGT136 se uman a la protema mutante. Otros anticuerpos, por ejemplo la familia PGT121, mejoraron sus propiedades de union. La union a la protema T332N mutante no depende de la lmea celular utilizada para la expresion. Se usaron celulas HEK 293T (que producen oligosacaridos complejos) y celulas HEK 293 S (oligosacaridos altamente manosilados) sin cambios en las propiedades de union.

Las secuencias de tipo silvestre originales se alinearon con la cepa de referencia HxB2 de la protema de la envoltura del VIH. La treonina en la posicion correspondiente a 332 en HxB2 fue reemplazada por alanina. La mutagenesis real se realizo por GeneArt (Life Technologies) y el ADN se administro en un plasmido pCI-Neo o pCDNA. Se produjo la gp120 BG505 del Clado A.

Las protemas de la envoltura que llevan la mutacion T332N y las versiones no mutadas (tipo silvestre) fueron producidas por transfeccion transitoria de ADN de celulas HEK 293T o HEK 293S. Las celulas 293T y 293S difieren en el tipo de glicosilacion de protemas recombinantes secretadas. Las primeras producen protemas con oligosacaridos complejos, mientras que las segundas producen protemas con glicanos de tipo oligomanosa.

Las protemas secretadas a los medios de cultivo celular se purificaron usando cromatograffa de afinidad en la columna de lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno) (GNL).

La antigenicidad (union a anticuerpos) se midio con multiples anticuerpos humanos aislados de sujetos infectados con el VIH. Procedimientos utilizados para medir la antigenicidad: ELISA para Env recombinantes solubles capturadas mediante His-tag.

La Figura 13 representa la union a gp120 BG505 L111A. La union del anticuerpo a gp120 BG505 L111A secretada en medio de cultivo celular se midio mediante ensayo inmunoenzimatico ligado a enzimas (ELISA) en microplacas de 96 pocillos. El conjunto de anticuerpos utilizados para caracterizar la antigenicidad inclma anticuerpos espedficos del tnmero (PG9, PG16), anticuerpos espedficos del sitio de union a CD4 (CD4bs) (b6, b12, VRC01, VRC04/PGV04) y la serie PGT (PGT121-136). Los anticuerpos que demostraron diferencia en las propiedades de union se muestran en rojo.

Las protemas de este Ejemplo pueden ser utiles para la produccion de protemas de la envoltura recombinantes solubles como componentes de la vacuna del VIH, como cebo para la identificacion de anticuerpos neutralizantes. Las protemas purificadas de este Ejemplo pueden ser utiles como patron analftico para inmunizacion pasiva con anticuerpos, para caracterizar el tipo de anticuerpos neutralizantes inducidos por las vacunas del VIH o para cristalizacion para identificar epftopos para anticuerpos neutralizantes y diseno de nuevos inmunogenos. Las protemas de este ejemplo pueden ser utiles en el diseno de inmunogenos geneticos (ADN, vector viral) o partmulas similares a virus que llevan envolturas con propiedades antigenicas e inmunogenicas mejoradas.

La divulgacion se describe adicionalmente mediante los siguientes parrafos numerados:

1. Una glicoprotema de la envoltura del VIH-1 soluble aislada o no natural.

2. La glicoprotema del parrafo 1, en la que la glicoprotema se afsla de un virus del Clado A del VIH-1, virus del Clado B del VIH-1, virus del Clado C del VIH-1, pseudovirus del Clado A del VIH-1, pseudovirus del Clado B del VIH-1 o pseudovirus del Clado C del VIH-1.

3. La glicoprotema del parrafo 1 o 2, en la que la glicoprotema se une a un anticuerpo ampliamente neutralizante.

4. La glicoprotema del parrafo 3, en la que el anticuerpo es PG9 y/o PG16.

5. La glicoprotema de cualquiera de los parrafos 1-4, en la que las glicoprotemas de la envoltura solubles se afslan de un virus del Clado A del VIH-1, virus del Clado B del VIH-1, virus del Clado C del VIH-1, pseudovirus del Clado A

del VIH-1, pseudovirus del Clado B del VIH-1 o pseudovirus del Clado C del VIH-1, el virus 6535, el virus 13095, el virus 16055, el virus 25710, el virus 25925, el virus CAAN o el virus Zm109F.

6. La glicoprotema de cualquiera de los parrafos 1-5, en la que una secuencia de aminoacidos de la glicoprotema tiene una secuencia de consenso sustancialmente similar a la secuencia de consenso representada en las Figs. 2A-

5 2J.

7. Un procedimiento para detectar anticuerpos neutralizantes de amplio espectro que comprende poner en contacto la glicoprotema de cualquiera de los parrafos 1 a 6 con un suero animal o humano, aislar la glicoprotema en complejo con los anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, seleccionando asf un anticuerpo neutralizante de amplio espectro.

10 8. Un procedimiento para identificar un sitio de union de una glicoprotema de la envoltura del VIH-1 soluble a un

anticuerpo neutralizante de amplio espectro que comprende poner en contacto la glicoprotema de cualquiera de los parrafos 1-6 con un anticuerpo neutralizante de amplio espectro, aislar la glicoprotema en complejo con el anticuerpo y determinar la estructura cristalina del complejo glicoprotema-anticuerpo, en el que la estructura cristalina identifica el sitio de union de la glicoprotema y el anticuerpo, identificando asf un sitio de union de una glicoprotema de la 15 envoltura del VIH-1 soluble a un anticuerpo neutralizante de amplio espectro.

9. El procedimiento del parrafo 6, en el que el anticuerpo es PG9 y/o PG16.

10. Un procedimiento para producir una respuesta inmunitaria que comprende administrar a un mairnfero la glicoprotema de cualquiera de los parrafos 1-6.

11. Un procedimiento para obtener una respuesta inmunitaria que comprende administrar a un mamnfero el vector de 20 cualquiera de los parrafos 1-6.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de una glicoprotema de la envoltura aislada de la cepa BG505 del VIH-1,

   disenada para tener una sustitucion L por A en la posicion correspondiente a L111 en la env de la cepa HxB2 del VIH-1 y opcionalmente una sustitucion T por N en la posicion correspondiente a N332 en la env de la cepa HxB2 del 5 VIH-1 cuando las secuencias de env de BG505 y HxB2 estan alineadas

   para la deteccion de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro que comprende poner en contacto dicha glicoprotema con un suero animal o humano, aislar la glicoprotema en complejo con los anticuerpos neutralizantes de amplio espectro, seleccionando asf un anticuerpo neutralizante de amplio espectro.
2. 2. Uso de una glicoprotema de acuerdo con la reivindicacion 1 como reactivo para la deteccion de moleculas 10 pequenas que compiten por la union de anticuerpos neutralizantes de amplio espectro.
3. 3. Uso de una glicoprotema de acuerdo con la reivindicacion 1 como monomero y mimetico del tnmero de la envoltura nativa para estudios de cristalizacion.
4. 4. El uso de la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo es PG9 y/o PG16.
5. 5. Glicoprotema de acuerdo con la reivindicacion 1 para su uso como inmunogeno en diferentes formas como 15 componentes de la vacuna del VIH-1.