DE19920704C1

DE19920704C1 - Verwendung eines gegen Harn-Trypsin-Inhibitors gerichteten Antikörpers für die Diagnose des Ausbruchs von AIDS

Info

Publication number: DE19920704C1
Application number: DE19920704A
Authority: DE
Inventors: Marina N Papuashvili
Original assignee: Technologie Integrale Ltd
Current assignee: Technologie Integrale Ltd
Priority date: 1999-01-26
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2000-08-31
Anticipated expiration: 2019-05-06
Also published as: EP1147420A1; DE60012140T2; ES2225081T3; AU2439600A; WO2000045175A1; PT1147420E; US6242197B1; AU770114B2; ATE271225T1; JP3534703B2; JP2002535679A; CA2361000C; EP1147420B1; DE60012140D1; CA2361000A1; DK1147420T3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Harn-Trypsin-Inhibitor zur Diagnose des Ausbruchs von AIDS. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Harn-Trypsin-Inhibitor zur Diagnose des Ausbruchs von AIDS in einem frühen Stadium der Erkrankung. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Bestimmung von UTI eines ELISA.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines gegen Harn-Trypsin-Inhibitor gerichteten Antikörpers für die Diagnose des Ausbruchs von AIDS. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eine Kits, bei dem ein gegen Harn- Trypsin-Inhibitor gerichteter Antikörper eingesetzt wird, zur Diagnose des Ausbruchs von AIDS, sowie ein Verfahren zur Bestimmung des Ausbruchs von AIDS.

In den frühen 80er Jahren wurden in Krankenhäusern Patienten beobachtet, die eine starke Immunschwäche aufwiesen. Einige davon entwickelten ungewöhnliche opportunistische Infektionen, während andere Kaposi's Sarkom, ein bis dato selten vorkommender Hauttumor, aufwiesen. Eine immunologische Überprüfung dieser Patienten zeigte eine erhebliche Schwäche der zellulären Immunfunktion und eine selektive Abnahme der Anzahl an T4 (Helfer-) Zellen, eine Subpopulation von T-Zellen, die die zelluläre Immunantwort vermitteln. Dieser Zustand mit allen seinen Begleitsymptomen wurde "erworbene Immunschwäche" genannt (AIDS). Nachfolgend wurde gefunden, daß die Erkrankung selbst durch ein pathogenes Virus hervorgerufen wird, das menschliches Immunschwächevirus (HIV-Virus) genannt wurde.

Kurz nachdem gefunden wurde, daß HIV die Ursache von AIDS war, wurde beobachtet, daß dieses Virus insbesondere für T4-Zellen zytopathisch war. Es wurde daher davon ausgegangen, daß die immunologischen Abnormalitäten bei AIDS zumindest teilweise von einer fortschreitenden Abnahme der Anzahl an T4-Zellen auf Grund deren Infektion und Zerstörung durch HIV herrühren.

Vom klinischen Gesichtspunkt wird die Erkrankung AIDS als Vorhandensein einer zuverlässig diagnostizierten Erkrankung definiert, die zumindest moderat auf eine zelluläre Immunschwäche hinweist, wobei keine andere bekannte Immunschwäche dafür verantwortlich ist und keine andere verringerte Widerstandsfähigkeit die bekanntermaßen mit der Erkrankung einher geht, wie beispielsweise eine immunsuppressive Therapie oder lymphoretikuläre maligne Erkrankungen.

Der Erkrankung AIDS, d. h. der letzten Stufe einer langsamen, jedoch konstant fort schreitenden Verschlechterung der normalen Konstitution des Körpers, gehen eine Vielzahl von Erkrankungen voraus, die im allgemeinen als "predromales AIDS" bezeichnet werden. Derartige Erkrankungen umfassen ARC (AIDS assoziierter Komplex), welcher für die Entwicklung von nachfolgendem AIDS als äußerst aussagekräftig gilt. ARC beinhaltet die Symptome von beispielsweise Fieber für mehr als 3 Monate, einen Gewichtsverlust von mehr als 10%, Durchfall und eine verringerte Anzahl von T4-Zellen. Dieser Erkrankungszustand entwickelt sich bekanntermaßen weiter zu dem sogenannten LAIDS (Lesser AIDS), der durch die Entwicklung von oraler Candidiasis, Herpes Zoster, idiopathischer Trombozytopenie und anderen Erkrankungen gekennzeichnet ist, die, obwohl nicht tödlich, eine Immununterdrückung anzeigen.

Ein weiteres hinweisendes Symptom für die zu erwartende Entwicklung von AIDS ist das sogenannte LAS (Lymphadenopathie Syndrom) das durch das Vorhandensein von mindestens drei oder mehr Lymphknoten außerhalb der Leistengegend mit einem Durchmesser von mehr als 1 cm gekennzeichnet ist.

Noch ein weiteres Anzeichen für die aufkommende Entwicklung von AIDS stellen die ADC-Symptome (AIDS Dementia Komplex) dar, die durch eine steigende Anzahl schädlicher Einflüsse auf die Gehirnaktivität erkennbar sind.

Mit der fortschreitenden Entwicklung von molekularbiologischen und zellbiologischen Techniken wurde die Bestimmung verschiedener antigener Determinanten des HIV-Virus selbst möglich. Diesbezüglich wurden Antikörper hergestellt, mit denen das Vorhandensein des Virus im Blut eines Patienten nachgewiesen werden kann. Diese Tests ermöglichen jedoch lediglich die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer HIV-Infektion, während die sich entwickelnde Manifestation der Erkrankung als solche damit nicht zuverlässig vorhergesagt werden kann. Auf Grund des komplexen Erscheinungsbildes der vorstehend aufgeführten predromalen Erkrankungszustände ist es für den Arzt häufig schwierig zu bestimmen, ob der Patient in der nächsten Zeit AIDS entwickeln wird oder nicht.

Es besteht daher Bedarf nach einem zuverlässigen und schnellen diagnostischen Instrument, um den Ausbruch der Erkrankung zuverlässig vorhersagen zu können.

Die Entwicklung einer HIV-Infektion im menschlichen Körper wird im Allgemeinen durch zwei interagierende Faktoren bestimmt, die einzigartige Eigenschaft von HIV das Immunsystem des infizierten Individuums zu schwächen, und die Immunantwort des Wirts gegen den Eindringling, die sich zusammen mit dem Fortschreiten der Infektion entwickelt.

Vor der Entwicklung des grundlegenden, immungeschwächten Zustandes kommt das Immunsystem seiner Aufgabe immer noch in einem gewissen Umfang nach und erzeugt bestimmte Moleküle, die in dem infizierten Individuum nachgewiesen werden können, lange bevor die unterschiedlichen, vorstehend aufgeführten Erkrankungszustände erkannt werden. Es wurde daher daran gedacht derartige Moleküle zur Bestimmung der Erkrankung zu verwenden.

Gegenwärtig zu diesem Zweck eingesetzte Moleküle sind beispielsweise β-Mikroglobulin oder Neopterin. Diese Verbindungen weisen jedoch den Nachteil auf, daß sie nicht besonders spezifisch für eine HIV-Infektion sind und aus Blutproben hergestellt werden müssen, was das Diagnoseverfahren kompliziert macht. Darüber hinaus kann der Anstieg der Menge dieser Moleküle in Körperflüssigkeiten lediglich bei einer Stufe bestimmt werden, bei der andere Parameter des Immunsystems und virologische Assays die Entwicklung von AIDS bereits klar zeigen.

In Hybridoma (1993 12(6), 745-54) wird von Ogloblina et al. die Herstellung von gegen Harn-Trypsin-Inhibitor gerichteter monoklonaler Antikörper durch Hybridisierung von Myeloma-Zellen mit Milz-Zellen einer mit Harn-Trypsin-Inhibitor immunisierten Maus beschrieben.

Kuajima et al. beschreiben im Japanese Journal of Clinical Pathology (1992 Jul. 40(7), 751- 715) eine mögliche Rolle von Harn-Trypsin-Inhibitor bei Infektionskrankheiten, wobei festgestellt wird, daß eine erhöhte Konzentration dieses Polypeptids innerhalb von einem bis zwei Tagen nach Auftreten der Erkrankung zu verzeichnen ist.

In Clinical Biochemistry (1990, Apr. 23(2), 167-71) wird die Verwendung von Harn- Trypsin-Inhibitor bei der Diagnose der Akut-Phasen-Antwort beschrieben, die auch über eine automatisierte Messung erfolgen kann.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, ein neues diagnostisches Instrument bereitzustellen, mit dem die Vorhersage des Ausbruchs von AIDS bereits bei einer sehr frühen Stufe der Entwicklung der Krankheit möglich ist, vorzugsweise bereits während predromalen AIDS-Erkrankungszuständen, so daß gezeigt werden kann, wie bald sich die HIV-Infektion in eine AIDS-Erkrankung umwandeln wird.

Die vorstehende Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß eine in Körperflüssigkeiten zu findende, bestimmte Verbindung, der Harn-Trypsin-Inhibitor, als diagnostisches In strument eingesetzt wird und dessen Menge in den Körperflüssigkeiten nachgewiesen wird.

Während der langwierigen Experimente, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde gefunden, daß die Menge an Harn-Trypsin-Inhibitor (UTI), der in einer gesunden Person im Urin normalerweise in einer Menge von bis zu 3 µg/ml vorhanden ist, in Patienten, die an einer HIV-Infektion leiden und bei denen die Erkrankung kurz vor ihrem Ausbruch steht, erhöht ist.

Erfindungsgemäß wird daher die Verwendung eines gegen UTI gerichteten Antikörpers zur Diagnose des Ausbruchs von AIDS bereitgestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Bestimmung der Menge an UTI unter Verwendung von Urin oder Blut als Körperflüssigkeitsprobe durchgeführt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an UTI in einer Körperflüssigkeit mittels Antikörpern, die polyklonale oder monoklonale Antikörper oder ein Antikörper enthaltendes Serum sein können, bestimmt, wobei die Antikörper vorzugsweise in einem ELISA zum Einsatz kommen.

Die Erfindung liefert weiter die Verwendung eines Kits zur Durchführung des Assays.

Die Manifestation vieler Proteinaseinhibitoren und die Abhängigkeit ihrer Mengen von einer Tumorentwicklung in einem immungeschwächten Körper wurde untersucht. Einer der Blutplasmainhibitoren ist der Inter-α-Trypsin-Inhibitor (ITI), ein Protein, dessen Funktion bis jetzt noch nicht voll aufgeklärt wurde. ITI ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 240 kDa, das in der Leber synthetisiert wird. Seine Konzentration im Blut beträgt etwa 450 µg/ml.

Es wurde gefunden, daß an ITI ein Inhibitor mit einem niedrigerem Molekulargewicht immunologisch gebunden ist. Dieser spezifische Inhibitor stellt ein Fragment der ITI- leichten Kette mit einer großen Anzahl an Disulfidbrücken dar, die dessen Säurestabilität begründen. Auf Grund der Tatsache, daß bei bestimmten pathologischen Zuständen dieser Inhibitor aus dem Blut in den Urin sezerniert wird, wurde das Molekül Harn-Trypsin- Inhibitor (UTI) genannt.

UTI ist ein saures Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 44 kDa. Etwa 30% seiner Masse besteht aus zwei größeren Kohlenhydratketten. Das Molekulargewicht von UTI ohne Kohlenhydrate beträgt 30 kDa. Hinsichtlich seiner Tertiärstruktur ist UTI ein Zwei-Domänenmolekül, obwohl es aus nur einer Polypeptid-Kette besteht. Zwischen beiden Domänen und dem Haupt-Pancreas-Proteinase-Inhibitor (MPPI) der in Organen von Rindern gefunden wurde, wurde eine strukturelle Homologie verzeichnet und darüber hinaus für die UTI-Trypsin-Bindungsdomäne und die Chymytropsin-Bindungsdomäne im Bereich der reaktiven Zentren.

Die strukturelle Homologie zu MPPI ermöglicht eine Korrelation von UTI zu den "Kunin"-Inhibitoren. Da beide Domänen zu MPPI homolog sind wird UTI gelegentlich "Bi-Kunin" genannt. Die Eigenschaft von UTI, sowohl Elastase als auch neutrophiles Granulocyten-G-Kathepsin zu inaktivieren, führte zu der Annahme, daß es möglicherweise anti-entzündliche Wirkungen zeigen könnte.

Andererseits wurde bereits im Jahre 1974 ein bestimmtes, EDC-1 genanntes Protein (MG = 27 kDa) aus dem Urin eines Patienten isoliert, der an akuter myeloider Leukose litt. In den meisten bis dato untersuchten Krebspatienten wurde gefunden, daß die Menge an EDC-1 im Urin dem klinischen Verlauf der Erkrankung entsprach. Sie nimmt vor dem Auftreten klinischer Zeichen der Rückbildung stark ab und steigt vor einem klinischen Rückfall an.

Die Analyse der Aminosäuresequenz von EDC-1 zeigte, daß dessen N-terminale Sequenz im allgemeinen der von UTI entspricht, wobei die C-terminalen Sequenzen unterschiedlich sind. Es wurde gelegentlich davon ausgegangen, daß EDC-1 und UTI durch Lyse verschiedener Peptidbindungen in ITI hervorgehen.

Zwischenzeitlich wurde ein potentieller Mechanismus für den Anstieg des Gehalts an EDC-1 in Krebspatienten vorgeschlagen. Während der ersten Stufen des Tumor wachstums führt die mit dem Tumor assoziierte proteolytische Aktivität zu einer erhöhten Bildung an α-1-Proteinase Inhibitor in dem Wirt, der im wesentlichen durch die Proteinasen des Tumors inaktiviert wird. Lediglich während der zweiten Runde zersetzen die mit dem Tumor assoziierten Proteinasen das ITI, bis EDC-1 gebildet wird. Als Ergebnis steigt die Konzentration an EDC-1 im Serum an, während die Konzentration an ITI abnimmt.

Im Urin und Blutserum von Patienten, die an unterschiedlichen Karzinomen litten, wie beispielsweise Magen-, Esophagus- und Dickdarm-Karzinom wurde eine erhöhte Menge an UTI nachgewiesen, die mit dem Fortschreiten der Erkrankung einhergeht. Nach erfolgreicher Anwendung einer Chemotherapie wurde gefunden, daß die Menge an UTI abnahm.

Darüber hinaus wurde in einer gesunden Niere gefunden, daß das UTI im Cytoplasma proximal liegender Kanal-Epithelzellen vorkommt, was deren Sekretion in den Urin über diese Zellen nahelegt. Das UTI wurde nicht in Glomerulen, distalen Kanälen oder Gefäßwänden gefunden. Darüber hinaus enthielten auch die Zwischenräume kein UTI, während das Gewebe in der Umgebung des Tumors eine Menge an UTI wie in einer gesunden Niere zeigte. Es wurde daher davon ausgegangen, daß Krebszellen offen sichtlich kein UTI bilden.

Erfindungsgemäß kann nun der Anstieg der Menge an UTI in Körperflüssigkeiten, wie Blut oder, mehr bevorzugt, Urin dazu verwendet werden, den Beginn der Entwicklung von mit AIDS assoziierten oder, mehr bevorzugt predromalem AIDS assoziierten Erkrankungen zu bestimmen. In einem mit HIV infizierten Patienten übersteigt die UTI- Menge in beispielsweise Urin das normale Niveau von etwa 3 µg/ml. Dies kann als Zeichen für den Beginn der Entwicklung bestimmter, mit AIDS assoziierter Erkrankungen genommen werden. Andererseits liefert die vorliegende Erfindung weiter die Möglichkeit, die Wirksamkeit bestimmter Arzneimittel in AIDS-Patienten zu überwachen, indem die Menge an UTI in jenen Patienten als Anzeichen einer erfolgreichen Behandlung dieser Patienten dienen kann.

Da der Assay an einem leicht erhältlichen biologischen Material, d. h. Urin, der von dem Patienten ohne zusätzliche Traumatisierung genommen werden kann, durchführbar ist, läßt sich der Assay leicht durchführen. Keine erfahrene Person, wie ein Arzt oder ein/e medizinisch technische/r Assistent/in, der/die das Blut entnimmt, ist von Nöten. Je nach Art des bereitgestellten Kits kann die betroffene Person den Assay für eine allgemeine Überprüfung mit beispielsweise Farbstoffen, die einen bestimmten UTI-Gehalt anzeigen, gut zu Hause durchführen. Darüber hinaus kann die UTI-Menge auch in einem Labor unter Verwendung von beispielsweise einem Photometer genau bestimmt werden.

Als besonders geeignet zur Bestimmung von UTI werden kompetitive Immunoassays an gesehen. Dabei wird eine gleichbleibende Menge an mit einem Marker versehenen Antikörpern gegen UTI, vorzugsweise monoklonale Antikörper, mit der Urinprobe zusammengebracht. Die Menge an Antikörper sollte dabei so gewählt werden, so daß auch bei hohen Mengen an UTI im Urin immer noch überschüssiger Antikörper verbleibt. Die Antikörper-Urin-Lösung kann dann in einen Probenbehälter überführt werden, an dessen Wandung UTI immobilisiert wurde. Der Antikörper bindet dann an das UTI an der Wandung in der Menge, in der er nach Reaktion mit dem im Urin vorhandenen UTI noch zur Verfügung steht, und kann dann im Probenbehälter durch im Stand der Technik bekannte Maßnahmen quantitativ bestimmt werden. Dabei wird mit ansteigender Konzentration von UTI im Urin die Menge an Antikörper, die an der Wandung des Probenbehälters gebunden wird (durch das dort immobilisierte UTI) proportional abnehmen.

Durch die hier dargelegte Lehre wird es möglich die Entwicklung von mit AIDS assoziierten Erkrankungen in einem relativ frühen Stadium zu bestimmen, so daß der Arzt unmittelbar damit beginnen kann, die entsprechenden Arzneimittel zu verabreichen.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung eines Kits zur Durchführung des Assays. Der Kit kann beispielsweise einfach die Form eines Streifens aufweisen, auf dem polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen UTI immobilisiert wurden. Eine Probe eines biologischen Materials wird daher einfach mit dem Streifen in Kontakt gebracht und eine Lösung mit einem Antikörper gegen UTI wird anschließend mit dem Streifen unter Bildung eines Sandwiches mit dem UTI-Molekül in Kontakt gebracht. Das Sandwich kann dann mittels herkömmlicher Mittel, wie beispielsweise Aufbringen eines mit einem Marker beispielsweise einem Farbstoff, Meerrettich-Peroxidase usw. verbundenen Antikörpers, der gegen den konstanten Teil des Antikörpers gerichtet ist, sichtbar gemacht werden.

Es ist klar, daß der Fachmann auf Grund seines eigenen Fachwissens den Kit entsprechend den jeweiligen Bedürfnissen entwerfen wird, wie ein ELISA und andere. Um daher eine genaue Ablesung der Menge an in einer Probe vorhandenem UTI bereitzustellen wird der Fachmann die Verwendung einer entsprechenden Vorrichtung in Betracht ziehen, wie beispielsweise eines Photometers. Es ist darüber hinaus klar, daß Techniken zur Erzeugung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen UTI dem Fachmann geläufig sind.

Der vorliegende Assay kann zur Diagnose des Beginns der Erkrankung eingesetzt werden und kann darüber hinaus als Bewertungskriterium für die Wirksamkeit einer angewandten Therapie dienen. Werden daher Arzneimittel, wie AZT, einem Patienten, der an mit AIDS assoziierten Erkrankungen leidet, verabreicht, so kann die Rückbildung der Erkrankung durch Bestimmung der UTI-Menge im Patienten überwacht werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu begrenzen.

Beispiel 1

Zum Nachweis des UTI wurde das folgende Verfahren verwendet.

Drei gegen UTI gerichtete monoklonale Antikörper - M2, B6, P1 wurden in einer an sich bekannten Art und Weise erzeugt und in Anwesenheit der Trypsinbindungsdomäne auf deren Bindungskapazität untersucht. Der M2-Antikörper zeigte die höchste Affinität für diese Domäne. Auf Basis des monoklonalen Antikörpers M2 wurde ein kompetitiver ELISA der UTI-Konzentration im Urin durchgeführt.

Die Vorgehensweise, die zum Nachweis von UTI im Hinblick auf dessen Verwertbarkeit bei der Voraussage des Fortschreitens einer HIV-Infektion in verschiedenen Stadien der Erkrankung verwendet wurde zeigte das Folgende:

Patientengruppen

17 HIV-1-infizierte Patienten und 30 gesunde Freiwillige wurde untersucht; 4 Patienten zeigten keine klinischen Symptome; 8 Patienten wiesen unterschiedliche opportunistische Infektionen auf; und 5 Patienten hatten bereits AIDS entwickelt.

Material und Methoden

UTI-ELISA (mAk gegen UTI: sezernierende Hybridoma wurden von einer Fusion von nicht sezernierenden Maus-Myeloma-Zellen (Klon P3 O1) mit Milzzellen von BALB/c Mäusen, die mit menschlichem UTI immunisiert worden waren, abgeleitet); die UTI- Menge im Urin, die Harnstoff, Reststickstoff und Kreatinin-Konzentrationen und eine Anzahl immunologischer Parameter (CD4, CD8, CD16, B-Lymphozyten, HLA-DR), p24 Konzentration wurden untersucht.

Die Herstellung von Harn-Protein-Konzentraten

1. Gewinnung von Urin (vorzugsweise am Morgen); er sollte vor Behandlung mit Aceton nicht mehr als 2 Stunden herumstehen.
2. Die Acetonausfällung von Harn-Proteinen (5 ml Urin + 10 ml auf 4°C gekühltes Aceton); kann bei 4°C für einen Monat gelagert werden.
3. Abzentrifugieren von Proteinausfällungen (1000 G, 10 min.)
4. Herstellung einer Suspension der erhaltenen Ausfällungen (Präzipitat + 2,5 ml 0,05 M-Puffer, pH 7,8, die Ausfällung wird mit einem Glasstab gelöst) die Konzen tration und die Depigmentierung des Urins.
5. Nicht gelöste Ausfällung wird zentrifugiert.
6. Der so erhaltene Überstand wird zur Bestimmung des UTI eingesetzt.

ELISA-Test

1. Die UTI-Lösung wird auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen für eine Nacht bei einer Temperatur von 4°C absorbiert;
2. Die Platte wird mit Wasser gespült und abgeschüttet;
3. Die Auffüllung freier Bindungsstellen mit Albumin (in jede Vertiefung + 200 µl 1 % Albumin-Lösung in 0,05 M Phosphat-Puffer, pH 7,4, eine Stunde Inkubation);
4. Die Platte wird mit Wasser gewaschen und abgeschüttet.
5. In die Vertiefung der Platte wird titriert (a) Urinprobe (siehe Punkt 6, vorstehend); (b) die Standard-UTI-Lösung für die Kalibrierungskurve; und (c) die Kontrollprobe mit bekanntem UTI-Gehalt; dazu die Lösung der monoklonalen UTI-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, wird zugesetzt, und eine Stunde Inkubation; die Bindung von UTI aus der Probe und der auf der Platte absorbierten mit den Antikörpern.
6. Die Platte wird mit Puffer gespült (mit 0,1% Albumin und Tween-20) und mit Wasser und abgeschüttet.
7. Entwicklung: Zugabe des Substrates (Ortho-Phenylen-Diamin in dem Citratphosphat-Puffer); inkubieren für 10 Minuten.
8. Stoppen der Reaktion: +10% Schwefelsäure
9. Messung der optischen Dichte mit einem ELISA-Lesegerät bei 492 nm.
10. Zeichnen einer Kalibrierungskurve und Bestimmen der UTI-Konzentration der Probe daraus.

Zur Bestimmung der UTI-Konzentration in Blut kann die folgende Ausrüstung eingesetzt werden:

1. Eine 80 Kanal-Pipette, 40 × 200 µl.
2. Eine Eppendorf-Zentrifuge für Teströhrchen (Mikrofuge).
3. Ein ELISA-Lesegerät mit einem Filter für 492 mn für Platten.
4. Platten für die Mittel.
5. Die Messung der UTI-Aktivität zusätzlich zur Konzentration würde ein Photometer mit einem 405-nm Filter erfordern.
6. Eine Waschvorrichtung.

Beispiel 2 Enzym-Immunoassay für die quantitative Bestimmung von UTI in vitro

Zur Durchführung der genannte Methode wurde im wesentlichen das in in der Druckschrift "Ogloblina O., et al. Hybridome 12 (1993), 745" beschriebene Verfahren eingesetzt, welches hiermit unter Bezugnahme mitaufgenommen werden soll.

Kompetitiver Enzym-Immunoassay

Die Inkubation einer gleichbleibenden Menge monoklonaler, mit Meerrettich- Peroxidase konjugierter Antikörper gegen UTI mit unterschiedlichen Konzentrationen einer Urinprobe (oder einem Standard) in mit UTI beschichteten Vertiefungen (1 µg/Vertiefung) einer Mikrotiterplatte führte zur Bildung von zwei Typen an Antigen- Antikörper-Komplexen, in Lösung frei vorliegenden Komplexen und an der Wandung der Mikrotiterplatte gebundenen Komplexen. Die Konzentration des verbleibenden, überschüssigen Antikörpers verhält sich umgekehrt proportional zur Menge an UTI in der Probe (oder dem Standard). Nach Abtrennen des Überstandes aus der Vertiefung und Waschen der Vertiefung werden die an der Wand gebundenen Antigen-Anti körper-Komplexe mittels enzymatischer Reaktion der Peroxidase mit H₂O₂/o- Phenylenediamin (Chromogen) und nachfolgender spektrophotometrischer Messung bei 492 nm bestimmt.

Aufgrund der umgekehrt proportionalen Beziehung der gebundenen Enzym-Aktivität und der Antigenkonzentration sinkt die gemessene Absorption bei steigender UTI- Konzentration in der Probe. Die Ergebnisse werden durch Erstellen einer Referenz kurve mit Standards bekannter Konzentration bewertet.

Leitwerte für Urin

a) gesund 3,5 mg/L
b) Nierenkrankheiten mit ausreichender Nierenfunktion 1,4-7,7 mg/L
c) Nierenkrankheiten mit ungenügender Nierenfunktion 5,6-35,1 mg/L

Dieser Test ist für die Prognose der Entwicklung einer HIV-Infektion äußerst nützlich.

Probenmaterial

Urinproteine

Vorbereitung der Probe

1 Teil (beispielsweise 5 ml) frischer Morgenurin (bis zu zwei Stunden nach dem Wasserlassen) und 2 Teile (beispielsweise 10 ml) gekühltes Aceton (4°C) werden ver mischt. Dieses Gemisch wird mindestens zwei Stunden bei 4°C zur Ausfällung stehengelassen und kann einen Monat bei der gleichen Temperatur aufbewahrt werden.

Vor Verwendung wird das Gemisch 10 min. bei ca. 1500 g zentrifugiert, die ausge fällten Proteine werden in 2,5 ml eines 0,05 M Phosphat-Puffers, pH 7,4, gelöst, wobei die ungelösten Proteine durch Zentrifugation abgetrennt werden. Der abgetrennte Überstand kann drei Tage lang bei 4°C gelagert werden.

Reagenzien

1. Beschichtungslösung: UTI (100 g), gefroren oder lyophilisiert
2. 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6
3. Verdünnungspufferkonzentrat: Albumin, Phosphatpuffer
4. Tween-20: 5%
5. UTI-Standard: UTI, 3 g je Behälter (gefroren oder lyophilisiert)
6. Anti-UTI-Antikörper-POD-Konjugat: Maus anti-Mensch IgG-POD-Konjugat
7. Substrat: o-Phenylenediamine, 3 mg je Behälter (lyoph.)
8. 0,05 M Citrat-Phosphatpuffer, pH 4,7

Zusätzlich erforderlich

- Wasserstoff-Peroxid (30%)
- Schwefelsäure (10%)
- PVC-Mikrotiterplatten (mit 96-Vertiefungen), für Immunoassays geeignet (beispielsweise Titertek (Flow Lab., USA)

Die Durchführung der Untersuchung nimmt zwei Tage in Anspruch

1. TAG

Der Inhalt des Behälters 1 wird in 10 ml Lösung 2 aufgelöst. Die ELISA- Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wird mit Lösung 1 (100 µl/Vertiefung) beschichtet, worauf eine Inkubation bei +4°C über Nacht erfolgt. Die Urinproteine werden aus der Probe abzentrifugiert, vom Aceton abgetrennt und in Puffer 4 gelöst. Die so erhaltene Probe ist bei +4°C fünf Tage lang stabil.

2. TAG

Der Inhalt des Behälters 3 wird mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 + 19 verdünnt und so verwendet. Die Lösung ist bei Temperaturen von 2 bis 8°C stabil bis zum angegebenen Verfalldatum. 20 ml der Lösung 3 werden mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 : 4 verdünnt und 1 ml aus dem Behälter 4 wird hinzugefügt.

Der Inhalt des Behälters 5 wird in 150 µl Verdünnungspuffer 4 gelöst und ist bei einer Temperatur von +15 bis 25°C einen Tag lang stabil.

Der Inhalt des Behälters 6 wird in 10 ml Verdünnungspuffer 4 gelöst und ist bei einer Temperatur von +2 bis 8°C ca. 24 Stunden stabil.

Der Inhalt des Behälters 7 wird in 10,5 ml Puffer 8 gelöst und 10 µl Wasserstoffperoxid (30%) wird hinzugefügt. Die Lösung ist bei +15 bis 25°C eine Stunde lang stabil.

ELISA

Wellenlänge: 492 nm

PVC-Mikrotiterplatte mit 96-Vertiefungen

Messung gegen Luft

Nach der Beschichtung wird die ELISA-Mikrotiterplatte dreimal mit destilliertem Wasser gereinigt und mit Lösung 3 behandelt um unspezifische Proteinbindungen vorhersagen zu können (200 µl/Vertiefung; 1 Stunde, 25° oder 37°C).

Proben oder Standards werden in die Mikrotiterplatten oder die Standards pipettiert.

Vorbereitung der Standardverdünnungen

Für jede neue Messung ist eine Referenzkurve zu erstellen. Unter Verwendung der Lösung 5 (Standard) werden serielle Verdünnungen in die Vertiefungen der Mikrotiter platte vorgelegt:

Vorbereitung der Probenverdünnung

Die Lösung 6 (60 µl/Vertiefung) wurde in jede Vertiefung der ELISA-Mikrotiterplatte pipettiert und 1 Stunde bei 25° oder 37°C inkubiert. Die Lösung wird dann abgesogen und die Vertiefung dreimal mit Lösung 4 und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen.

In jede Vertiefung der ELISA-Mikrotiterplatte wird die Lösung 7 (100 µl/Vertiefung) pipettiert und fit 15 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird. Schwefelsäure (10%) zugesetzt und nach 30 min. das Absorptionsvermögen bestimmt.

Im allgemeinen sollte bei der höchsten Verdünnung (0,32 mg/L) eine Absorption von 0,8 bis 1,2 erreicht werden. Eine Absorption im Bereich von 0,8 bis 1,2 zeigt, daß der optimale Meßzeitpunkt erreicht wurde. Eine Absorption unter 0,8 oder über 1,2 zeigt, daß die Inkubationszeit verlängert oder verkürzt werden sollte.

Referenzkurve und Interpretation

Die gemessene Absorption (Ordinate) wird auf Koordinatenpapier gegen die UTI- Konzentration (Abszisse) eingetragen und eine Referenzkurve durch die erhaltenen Punkte gezeichnet. Aus der Kurve kann dann die UTI-Konzentration der verdünnten Probe (in mg/l) abgelesen werden. Wird der Urin mit Aceton behandelt, so führt dies zur Konzentrierung der Probe. Der ursprüngliche UTI-Gehalt der Urinprobe kann dann durch Multiplizieren der erhaltenen Werte mit 0,5 und mit dem Verdünnungs koeffizienten der Probe auf der Mikrotiterplatte bestimmt werden.

Claims

1. Verwendung eines gegen Harn-Trypsin-Inhibitor gerichteten Antikörpers für die Diagnose des Ausbruchs von AIDS.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Menge an Harn-Trypsin-Inhibitor im Urin oder Blut eines Patienten bestimmt wird.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Harn-Trypsin- Inhibitor mittels polyklonaler oder monoklonaler Antikörper oder einem Antikörper enthaltenden Serum bestimmt wird.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Antikörper mit einem Marker markiert sind.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Marker ein Farbstoff, ein fluoreszierender oder ein radioaktiver Marker ist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Antikörper in einem ELISA-Assay eingesetzt werden.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der ELISA ein kompetitiver Assay ist.

8. Verwendung eines Kits zur Diagnose des Ausbruchs von AIDS, wobei der Kit mindestens einen gegen Harn-Trypsin-Inhibitor gerichteten Antikörper umfaßt.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Kit einen Träger beinhaltet, auf dem ein polyklonaler Antikörper immobilisiert wurde.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Kit zusätzlich einen monoklonalen Antikörper und einen Anti-Antikörper beinhaltet, an dem ein Marker befestigt wurde.

11. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Kit einen Träger umfaßt, auf dem der Harn-Trypsin-Inhibitor immobilisiert wurde.

12. Verfahren zur Bestimmung des Ausbruchs von AIDS, bei dem die extrakorporale Bestimmung von Harn-Trypsin-Inhibitor durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) Gewinnen einer Urinprobe aus einem Individuum,
b) Abtrennen der Proteine aus der Urinprobe,
c) Bestimmen der Menge an Harn-Trypsin-Inhibitor in den abgetrennten Proteinen, wobei die Bestimmung über einen kompetitiven Immunoassay erfolgt.