ES2624353T3

ES2624353T3 - 2'-Metil nucleósidos en combinación con interferón y mutación de Flaviviridae

Info

Publication number: ES2624353T3
Application number: ES03796412.9T
Authority: ES
Inventors: Jean-Pierre Sommadossi; Paolo La Colla; David Standring; Vadim Bichko; Lin Qu
Original assignee: Universita degli Studi di Cagliari; Idenix Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Universita degli Studi di Cagliari; Idenix Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2017-07-13
Anticipated expiration: 2023-11-17
Also published as: PT1576138T; DK1576138T3; PL377342A1; US20160166597A1; JP2014166183A; SI1576138T1; RU2005118421A; EP1576138A2; JP2016136946A; HUE033832T2; MXPA05005192A; NO20052920D0; KR20050088079A; NO20052920L; JP6063073B2; WO2004046331A2; US20140286900A1; US7824851B2; CN1849142A; EP1576138B1

Abstract

Un nucleósido con metilo en 2', o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método de tratamiento del virus de la hepatitis C en un hospedador, en donde el método comprende administrar dicho nucleósido con metilo en 2' o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y administrar interferón, en donde dicho nucleósido con metilo en 2' ha causado una mutación en el nucleótido 8.443 (de G a C) del genoma del virus de la hepatitis C o del aminoácido 282 Serina a Treonina de la región de la ARN polimerasa del virus de la hepatitis C.

Description

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o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; alquilsulfonilo, arilsulfonilo, aralquilsulfonilo, lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable que proporciona un compuesto en donde R1, R2 o R3 es independientemente H o fosfato cuando se administra in vivo;

R6 es alquilo (incluyendo alquilo inferior y alquilo halogenado), CH3, CF3, azido, ciano, alquenilo, alquinilo, Brvinilo, 2-Br-etilo, -C(O)O(alquilo), -C(O)O(alquilo inferior), -O(acilo), -O(acilo inferior), -O(alquilo), -O(alquilo inferior), -O(alquenilo), CF3, cloro, bromo, flúor, yodo, NO2, NH2, -NH(alquilo inferior), -NH(acilo), -N(alquilo inferior)2, -N(acilo)2; y

R7 es hidrógeno, OR3, hidroxi, alquilo (incluyendo alquilo inferior), azido, ciano, alquenilo, alquinilo, Br-vinilo, C(O)O(alquilo), -C(O)O(alquilo inferior), -O(acilo), -O(acilo inferior), -O(alquilo), -O(alquilo inferior), -O(alquenilo), flúor, cloro, bromo, yodo, NO2, NH2, -NH(alquilo inferior), -NH(acilo), -N(alquilo inferior)2, -N(acilo)2; y

X es O, S, SO2 o CH2; y

Base es una purina o pirimidina como se describe además en la presente memoria.

También como se describe en la presente memoria, el nucleósido ramificado en 2’ es de fórmula general:

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en donde:

Base es una purina o pirimidina como se define en la presente memoria;

R6 es alquilo (incluyendo alquilo inferior y alquilo halogenado), CH3, CF3, azido, ciano, alquenilo, alquinilo, Brvinilo, 2-Br-etilo, -C(O)O(alquilo), -C(O)O(alquilo inferior), -O(acilo), -O(acilo inferior), -O(alquilo), -O(alquilo inferior), -O(alquenilo), CF3, flúor, cloro, bromo, yodo, NO2, NH2, -NH(alquilo inferior), -NH(acilo), -N(alquilo inferior)2, -N(acilo)2;

R7 es OR2, hidroxi, alquilo (incluyendo alquilo inferior), azido, ciano, alquenilo, alquinilo, Br-vinilo, halo-vinilo, C(O)O(alquilo), -C(O)O(alquilo inferior), -O(acilo), -O(acilo inferior), -O(alquilo), -O(alquilo inferior), -O(alquenilo), flúor, cloro, bromo, yodo, NO2, NH2, -NH(alquilo inferior), -NH(acilo), -N(alquilo inferior)2, -N(acilo)2;

R9 es hidrógeno, OR3, hidroxi, alquilo (incluyendo alquilo inferior), azido, ciano, alquenilo, alquinilo, Br-vinilo, C(O)O(alquilo), -C(O)O(alquilo inferior), -O(acilo), -O(acilo inferior), -O(alquilo), -O(alquilo inferior), -O(alquenilo), cloro, bromo, yodo, NO2, NH2, -NH(alquilo inferior), -NH(acilo), -N(alquilo inferior)2, -N(acilo)2;

R10 es H, alquilo (incluyendo alquilo inferior), flúor, cloro, bromo o yodo;

R1, R2 y R3 son independientemente H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un fosfato estabilizado); alquilo de cadena lineal, ramificado o cíclico (incluyendo alquilo inferior); acilo (incluyendo acilo inferior); COalquilo, CO-arilo, CO-alcoxialquilo, CO-ariloxialquilo, arilo sustituido con CO, éster de sulfonato (incluyendo alquil

o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; alquilsulfonilo, arilsulfonilo, aralquilsulfonilo, lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable que proporciona un compuesto en donde R1, R2 o R3 es independientemente H o fosfato cuando se administra in vivo; y

X es O, S, SO2 o CH2.

En el caso de la infección por BVDV, los nucleósidos ramificados en 2' y, en particular, los nucleósidos de pirimidina ramificados en 2’ tales como el compuesto β-D-2'-CH3-riboC inducen una mutación de una guanina (G) a citidina C) en el resto 1.214 de la ARN polimerasa del BVDV, que produce un cambio en el resto de aminoácido serina a treonina de la posición 405 de la enzima. Este resto de serina se ubica en la secuencia de consenso conservada (XRXSGXXXT) del dominio B de la ARN polimerasa (Figuras 5 y 11), identificado por análisis mutacional Lai V. C., Kao C. C., Ferrari E., Park J., Uss A.S., Wright-Minogue J., Hong Z., y J. Y. Lau. "Mutational analysis of bovine viral diarrhea virus RNA-dependent RNA polymerase" J Virol. 1999, 73, 10129-36).

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tal como un ser humano, que comprende una cantidad eficaz de un nucleósido ramificado en 2’, por ejemplo, nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco, tal como el profármaco del 3’valinaéster, o un profármaco y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente, en un vehículo

o diluyente farmacéuticamente aceptable, en combinación con interferón. Los interferones incluyen: Intron-A (interferón alfa-2b) de Schering, PEG-INTRON (interferón alfa-2b pegilado) de Schering, Roferon-A (interferón alfa-2a) de Roche, PEGASYS (interferón alfa-2a pegilado) de Roche, INFERGEN (interferón alfacon-1) de InterMune, OMNIFERON (interferón natural) de Viragen, ALBUFERON de Human Genome Sciences, REBIF (interferón beta-1a) de Ares-Serono, interferón Omega de BioMedicine, interferón alfa oral de Amarillo Biosciences e Interferón gamma-1b de InterMune.

(iii) Una composición farmacéutica eficaz para el tratamiento de una infección por Flaviviridae en un hospedador, tal como un ser humano, que comprende:

una cantidad eficaz de un profármaco 2', 3' y/o 5' de un nucleósido ramificado en 2’, por ejemplo, un nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2', por ejemplo β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco, incluyendo el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco, incluyendo el profármaco del 3’-valinaéster, o un profármaco y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en combinación con uno o más fármacos que inducen directa o indirectamente una mutación en un Flaviviridae, en una ubicación distinta de una mutación de un nucleótido que genera un cambio de la serina a un aminoácido diferente en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT, del dominio B de la región de ARN polimerasa, y/o uno o más fármacos que están asociados con dicha mutación.

(iv): Un método de tratamiento de una infección por Flaviviridae en un hospedador, tal como un ser humano, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un nucleósido ramificado en 2’, tal como un nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o su profármaco y/o sal farmacéuticamente aceptable al ser humano, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en combinación y/o alternancia con uno o más fármacos que inducen directa o indirectamente una mutación en un Flaviviridae en una ubicación distinta de una mutación de un nucleótido que genera un cambio de serina a un aminoácido diferente en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa, por ejemplo, distinto del nucleótido 1214 (de G a C) o Ser 405 a Thr de la región de la ARN polimerasa del BVDV o nucleótido 8443 (de G a C) del genoma del VHC o Ser 282 A Thr de la región de la ARN polimerasa del VHC (Figura 11; Lai et al. J Virol., 1999, 73, 1012936), y/o uno o más fármacos que están asociados con dicha mutación.

(v): Un método de tratamiento de una infección por Flaviviridae en un hospedador, tal como un ser humano, que comprende administrar una cantidad eficaz de un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3ribo-6-N-metilaminopurina, o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o un profármaco y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al hospedador, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en combinación y/o alternancia con interferón. Los interferones incluyen: Intron-A (interferón alpha-2b) de Schering, PEG-INTRON (interferón alfa-2b pegilado) de Schering, Roferon-A (interferón alfa-2a) de Roche, PEGASYS (interferón alfa-2a pegilado) de Roche, INFERGEN (interferón alfacon-1) de InterMune, OMNIFERON (interferón natural) de Viragen, ALBUFERON de Human Genome Sciences, REBIF (interferón beta-1a) de Ares-Serono, Interferón Omega de BioMedicine, Interferón Alfa Oral de Amarillo Biosciences, e Interferón gamma-1b de InterMune.

(vi): Un método de tratamiento de un paciente infectado con un virus Flaviviridae que es resistente a un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC o a un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende administrar una cantidad eficaz de interferón, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, de una manera que elimine sustancialmente la carga vírica.

(iv): Un método de tratamiento de un paciente infectado con Flaviviridae que comprende:

administrar una cantidad eficaz de un profármaco 2', 3' y/o 5' de un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por

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ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;

en combinación y/o alternancia con uno o más fármacos que inducen directa o indirectamente una mutación en un Flaviviridae en una ubicación distinta de una mutación de un nucleótido que genera un cambio de serina a un aminoácido diferente en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa, y/o uno o más fármacos que están asociados con dicha mutación.

(v): Un método de tratamiento de un paciente infectado con Flaviviridae que comprende:

(a): administrar al paciente una cantidad eficaz de un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina, o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;

(b): ensayar la sangre del paciente para analizar la seroconversión del virus de tipo silvestre al mutante; y

(c): administrar una cantidad eficaz de interferón; opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

(vi): Un método de ensayo de una muestra sospechosa de contener un Flaviviridae resistente a un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; que comprende:

(a): poner en contacto una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico de Flaviviridae con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria al codón que codifica una serina en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa de Flaviviridae (Figura 11);

(b): permitir que la sonda se hibride con la secuencia; y

(c): detectar la hibridación de la secuencia de la sonda.

(vii) Un método de ensayo de una muestra sospechosa de contener un Flaviviridae resistente a un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o -un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico de Flaviviridae con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria a la citidina del nucleótido

1.214 de la región de la ARN polimerasa del BVDV o la citidina del nucleótido 8443 del VHC;

(b): permitir que la sonda se hibride con la secuencia; y

(c): detectar la hibridación de la sonda a la citidina del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa del BVDV o del nucleótido 8.443 del VHC.

(viii) Un método de tratamiento de un paciente infectado con Flaviviridae que comprende:

(a): administrar una cantidad eficaz de un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;

(b): obtener una muestra vírica del paciente;

(c): determinar la capacidad de replicación del virus;

(d): determinar si la capacidad de replicación del virus de la muestra es inferior a la capacidad de replicación del virus de tipo silvestre, que indica resistencia hacia el nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de

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pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina, o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

(e) administrar una cantidad eficaz de interferón a los pacientes que son resistentes al nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina, o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

(ix): Un método de tratamiento de un paciente infectado con Flaviviridae que comprende:

(b): obtener una muestra de cultivo vírico del paciente;

(c): cultivar la muestra y comparar el crecimiento de placa entre la muestra y el virus de tipo silvestre;

(d): determinar si el crecimiento de la placa de la muestra es inferior al crecimiento de la placa del tipo silvestre, que indica resistencia hacia el nucleósido ramificado en 2’; y

(e): administrar una cantidad eficaz de interferón a los pacientes que son resistentes al nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

(x): Un método de diagnóstico de la presencia de un Flaviviridae resistente a un nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en un paciente que comprende:

(a): obtener una muestra sospechosa de contener una secuencia de ácido nucleico de Flaviviridae;

(b): poner en contacto la muestra con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria al codón que codifica una serina en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa de Flaviviridae (Figura 11);

(b): permitir que la sonda se hibride con la secuencia; y

(c): detectar la hibridación de la secuencia de la sonda para determinar la presencia de un Flaviviridae resistente al nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-Nmetilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

(xi): Un método de diagnóstico de la presencia de un Flaviviridae resistente al nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en un paciente que comprende:

(b): poner en contacto la muestra con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria a la citidina del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa del BVDV o la citidina del nucleótido 8.443 del VHC;

(b): permitir que la sonda se hibride con la secuencia; y

(c): detectar la hibridación de la sonda a la citidina del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa del

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BVDV o del nucleótido 8.443 del VHC para determinar la presencia de un Flaviviridae resistente al nucleósido ramificado en 2’, tal como nucleósido de pirimidina ramificado en β-D-2’, por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o un nucleósido de purina ramificado en β-D-2', por ejemplo, β-D-2'-CH3-riboA o β-D-2'-CH3-ribo-6-N-metilaminopurina o un profármaco tal como el profármaco de 3’-valinaéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La combinación descrita y/o las pautas de alternancia son útiles en la prevención y el tratamiento de infecciones por Flaviviridae, incluyendo BVDV, BDV, CSFV, DHF, virus de la fiebre amarilla, síndrome de choque, virus de encefalitis japonesa y VHC.

Además, las secuencias de aminoácidos correspondientes de los marcadores víricos de Flaviviridae que diagnostican la respuesta a largo plazo de los portadores de Flaviviridae a la terapia con nucleósido ramificado en 2' pueden determinarse a partir de las secuencias de nucleótidos ilustrativas de Flaviviridae.

Además de identificar marcadores víricos con el fin de identificar cepas de Flaviviridae que estén asociadas con un fallo del nucleósido ramificado en 2’, la presente invención también se puede utilizar para identificar cepas de Flaviviridae que respondan a la terapia con nucleósido ramificado en 2'. En este sentido, se puede usar la ausencia de marcadores víricos correlacionados con la terapia de nucleósido ramificado en 2' para prescribir un curso de tratamiento que incluya el nucleósido ramificado en 2' como una modalidad para los individuos que portan Flaviviridae carentes de marcadores víricos correlacionados con un fracaso de la terapia de nucleósido ramificado en 2'.

También se describe un cebador de oligonucleótido para amplificar una secuencia de ácido nucleico de Flaviviridae. El oligonucleótido puede tener al menos 14 nucleótidos de longitud y puede hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas específicas de la secuencia a una secuencia de nucleótidos que contiene el marcador correlacionado con el fracaso de la terapia.

Las secuencias de oligonucleótidos usadas como la región de hibridación de un cebador también se pueden usar como la región de hibridación de una sonda. La idoneidad de una secuencia de cebador para su uso como una sonda depende de las características de hibridación del cebador. De forma similar, se puede usar como cebador un oligonucleótido usado como sonda.

Además, en la presente memoria, se describe un método, materiales y un kit para detectar proteínas, péptidos o fragmentos peptídicos que contengan aminoácidos (como se describe ampliamente en la presente memoria) que son predictivos de la respuesta a largo plazo de un portador de Flaviviridae a la terapia con nucleósido ramificado en 2' o anticuerpos contra aquellas proteínas, péptidos o fragmentos peptídicos. Los sueros o tejidos del hospedador se pueden ensayar bien para la proteína o para el péptido o el anticuerpo contra la proteína o el péptido, dependiendo de la conveniencia y, tal vez, de la concentración del material de diagnóstico.

La proteína, el péptido o el fragmento peptídico pueden confirmarse mediante la reacción con un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, usando un método de transferencia Western. Como alternativa, la proteína o el péptido se pueden aislar y secuenciar o identificarse de otro modo mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo mediante PAGE 2D. Un anticuerpo reactivo puede unirse a una secuencia de proteína o secuencia peptídica de Flaviviridae que incluye una treonina en lugar de una serina en la secuencia de consenso altamente conservada, XRXSGXXXT, del dominio B de la región de la ARN polimerasa, por ejemplo, en la posición 405 de la región de la ARN polimerasa del genoma del BVDV o en la posición 282 de la región de la ARN polimerasa del genoma del VHC.

El anticuerpo reactivo puede unirse específicamente a una secuencia peptídica que incluye una treonina en lugar de una serina en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa, por ejemplo, en la posición 405 de la región de la ARN polimerasa del genoma del BVDV o en la posición 282 de la región de la ARN polimerasa del genoma del VHC, que representan mutaciones puntuales específicas en la región de la ARN polimerasa de Flaviviridae que está correlacionada con el fracaso terapéutico.

Se puede usar un anticuerpo que se una al menos a un péptido o un fragmento peptídico codificado por las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-31.

Para la presente invención, se usa un anticuerpo que se une al menos a un péptido o fragmento peptídico codificado por las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32-62.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 de referencia muestra la aparición de BVDV resistente a β-D-2'-CH3-riboC de BVDV sin tratar.

La Figura 2 de referencia ilustra el fenotipo de formación de focos por (A) BVDV de tipo silvestre (wt) (cepa I-N-dIns) y por (B) el BVDV resistente a β-D-2'-CH3-riboC (I-N-dIns β-D-2'-CH3-riboC-R).

La Figura 3 de referencia muestra la cinética de crecimiento de I-N-dIns de BVDV de tipo silvestre y su mutante

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resistente a β-D-2'-CH3-riboC, I-N-dIns β-D-2'-CH3-riboC-R (mutante resistente).

La Figura 4 de referencia muestra el efecto de β-D-2'-CH3-riboC en el rendimiento del virus en células MDBK infectadas de novo (en las que I-N-dIns es BVDV wt y el mutante resistente es I-N-dIns β-D-2'-CH3-riboC-R (BVDV resistente a β-D-2'-CH3-riboC)).

La Figura 5 de referencia es una representación esquemática de la región NS5B de BVDV que muestra los dominios funcionales propuestos, basándose en el análisis mutacional (Vassilev, V. B. y R. O. Donis. (2000) “Bovine viral diarrhea virus induced apoptosis correlates with increased intracellular viral RNA accumulation”. Virus Res. 69 (2): 95-107). La flecha grande indica la posición del único cambio de aminoácido encontrado en la región NS5B del BVDV resistente a β-D-2'-CH3-riboC (Ser 405 a Thr 405).

La Figura 6 de referencia muestra el efecto del interferón alfa-2b en el rendimiento del virus en células MDBK infectadas de novo (I-N-dIns: BVDV wt; I-N-dIns β-D-2'-CH3-riboC-R: BVDV resistente a β-D-2'-CH3-riboC (mutante resistente)).

La Figura 7 de referencia muestra el efecto de β-D-2'-CH3-riboC y del interferón alfa-2b en los títulos de BVDV (cepa I-N-dlns) en células MDBK infectadas persistentemente.

La Figura 8 de referencia muestra el efecto de β-D-2'-CH3-riboC en combinación con interferón alfa-2b en los títulos de BVDV de tipo silvestre (cepa I-N-dlns) en células MDBK infectadas persistentemente.

La Figura 9 de referencia muestra el efecto β-D-2'-CH3-riboC y del interferón alfa-2b (Intron A) en los títulos de BVDV (cepa NY-1) en células MDBK infectadas persistentemente.

La Figura 10 de referencia ilustra el efecto de β-D-2'-CH3-riboC y del interferón alfa-2b (Intron A) en los títulos de BVDV de tipo silvestre (cepa I-N-dlns) en células MDBK infectadas persistentemente.

La Figura 11 ilustra la alineación de la ARN Polimerasa en el dominio B de diversos Flaviviridae; la fuente en negrita de mayor tamaño muestra los aminoácidos que están 100 % conservados; los restos de aminoácidos de serina subrayados son aquellos que pueden ser mutados a treonina después del tratamiento con un nucleósido ramificado en 2’. [El resto de serina conservado al 100 % también está subrayado y representa el aminoácido que se ha mutado a Treonina tras el tratamiento con un nucleósido ramificado en 2’ (Ser405 de la región de la ARN polimerasa de BVDV; Ser282 de la región de la ARN polimerasa del VHC). Véase Lai et al. J Virol. 1999, 73, 10129-36.

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto que el uso prolongado de un nucleósido ramificado en 2', por ejemplo, un nucleósido ramificado en 2’ representado a continuación y, en particular, un nucleósido de pirimidina ramificado en 2' tal como el compuesto β-D-2'-CH3-riboC, se asocia con una mutación en un nucleótido que codifica la serina en la secuencia de consenso altamente conservada, XRXSGXXXT, del dominio B de la región de ARN polimerasa (Figura 11) de Flaviviridae, generando un cambio en el resto de aminoácido serina a un aminoácido diferente, por ejemplo, treonina. Este dominio se encuentra en la región NS5B del genoma del VHC, así como en genomas de otros flavivirus. Está altamente conservado entre todos los genomas de hepacivirus, pestivirus y flavivirus (Figura 11, Lai et al. J Virol. 1999, 73, 10129-36).

En el caso de la infección por BVDV, los nucleósidos ramificados en 2’ y, en particular, los nucleósidos de pirimidina ramificados en 2’ tales como el compuesto β-D-2'-CH3-riboC, inducen una mutación de una guanina (G) a citidina C) en el resto 1.214 de la ARN polimerasa del BVDV, generando un cambio en el resto de aminoácido serina a treonina de la posición 405 de la enzima. Este resto de serina se ubica en la secuencia de consenso conservada (XRXSGXXXT) del dominio B de la ARN polimerasa (Figuras 5 y 11), identificado por análisis mutacional (Lai V. C., Kao C.C., Ferrari E., Park J., Uss A. S., Wright-Minogue J., Hong Z., y J.Y. Lau. "Mutational analysis of bovine viral diarrhea virus RNA-dependent RNA polymerase" J Virol. 1999, 73, 10129-36).

En el caso de la infección por VHC, los nucleósidos ramificados en 2’ y, en particular, los nucleósidos de pirimidina ramificados en 2’ tales como el compuesto β-D-2'-CH3-riboC inducen una mutación en un nucleótido que codifica la Serina282 en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa (Figura 11), generando un cambio del resto serina a un aminoácido diferente, tal como treonina.

Además, se ha descubierto que los nucleósidos ramificados en 2’ y el interferón actúan sinérgicamente para inhibir Flaviviridae. En particular, los nucleósidos de pirimidina ramificados en 2’ tales como el compuesto β-D-2'-CH3-riboC y el interferón alfa-2b administrados en combinación y/o alternancia actúan sinérgicamente para inhibir Flaviviridae. Además, se ha descubierto que las poblaciones víricas resistentes, que surgen después del tratamiento con nucleósido ramificado en 2’, por ejemplo, el tratamiento con β-D-2'-CH3-riboC, muestran mayor sensibilidad al tratamiento posterior con interferón. Por lo tanto, la terapia secuencial y/o de combinación de un nucleósido ramificado en 2’ e interferón puede reducir sustancialmente las infecciones por Flaviviridae.

La presente invención proporciona un nucleósido con metilo en 2’, o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método de tratamiento

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de la hepatitis C en un hospedador, en donde el método comprende administrar dicho nucleósido con metilo en 2’ o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y administrar interferón, en donde dicho nucleósido con metilo en 2' ha causado una mutación en el nucleótido 8443 (de G a C) del genoma del virus de la hepatitis C o del aminoácido 282 Serina a Treonina de la región de la ARN polimerasa del virus de la hepatitis C.

La presente invención también proporciona interferón para su uso en un método de tratamiento de la hepatitis C en un hospedador, en donde el hospedador ha recibido un nucleósido con metilo en 2’, o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, que ha causado una mutación en el nucleótido 8.443 (de G a C) del genoma del virus de la hepatitis C o del aminoácido 282 Serina a Treonina de la región de la ARN polimerasa del virus de la hepatitis C.

Dicho nucleósido con metilo en 2’ es como se define en las reivindicaciones.

Dicho método puede comprender además las etapas definidas en las reivindicaciones.

I. Definiciones

Como se usa en la presente memoria, la expresión “virus resistente” se refiere a un virus que presenta un aumento del triple y, más normalmente, del quíntuple o superior en la CE50 en comparación con el virus sin tratamiento previo.

El término “aminoácido” incluye aminoácidos α, β, γ o δ naturales y sintéticos, e incluye, pero no está limitado a, los aminoácidos encontrados en las proteínas, es decir, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, aspargina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina, e histidina. En una realización preferida, el aminoácido está en la configuración L, pero también puede estar en la configuración D. Como alternativa, el aminoácido puede ser un derivado de alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenilalalinilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaroilo, lisinilo, argininilo, histidinilo, β-alanilo, β-valinilo, β-leucinilo, βisoleucinilo, β-prolinilo, β-fenilalaninilo, β-triptofanilo, β-metioninilo, β-glicinilo, β-serinilo, β-treoninilo, β-cisteinilo, βtirosinilo, β-asparaginilo, β-glutaminilo, β-aspartoilo, β-glutaroilo, β-lisinilo, β-argininilo o β-histidinilo.

Las abreviaturas de los aminoácidos usadas en la presente memoria se describen en la Tabla 1.

Tabla 1

Aminoácidos Codones

Alanina: Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína: Cys C UGC UGU

Ácido aspártico Asp D: GAC GAU GAC GAU

Ácido glutámico Glu: E GAA GAG

Fenilalanina: Phe F UUC UUU

Glicina: Gly G GGA GCG GGG GGU

Histidina: His H CAC CAU

Isoleucina: Ile I AUA AUC AUU

Lisina: Lys K AAA AAG

Leucina: Leu L UUA UUG CUA CUC CUG GUU

Metionina: Met M AUG

Asparagina: Asn N AAC AAU

Prolina: Pro P CCA CCC CCG CCU

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que amplifiquen secuencias alternativas. Un cebador puede marcarse, si se desea, incorporando un marcador detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos de electrones, enzimas (como se usan comúnmente en un ELISA), biotina o haptenos y proteínas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales. También se puede usar un marcador para "capturar" el cebador, con el fin de facilitar la inmovilización del cebador o de un producto de extensión del cebador, tal como ADN amplificado, sobre un soporte sólido.

"Sonda" se refiere a un oligonucleótido que se une a través de un emparejamiento de bases complementarias a una subsecuencia de un ácido nucleico diana. El experto en la técnica entenderá que normalmente las sondas se unirán esencialmente a secuencias diana carentes de complementariedad completa con la secuencia de sonda dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas se marcan preferiblemente directamente con isótopos o se marcan indirectamente tal como con biotina a la que un complejo de estreptavidina puede unirse más tarde. Mediante el ensayo de la presencia o ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia

o ausencia de la diana.

"Subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que comprenden una parte de una secuencia más larga de ácidos nucleicos.

La expresión “región diana” se refiere a una región de un ácido nucleico que se va a analizar y que puede incluir una región polimórfica.

El término alquilo, como se usa en la presente memoria, a menos que se especifique lo contrario, se refiere a un hidrocarburo saturado lineal, ramificado o cíclico, primario, secundario o terciario, normalmente, de C1 a C10, e incluye en concreto metilo, CF3, CCl3, CFCl2, CF2Cl, etilo, CH2CF3, CF2CF3, propilo, isopropilo, ciclopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, 3metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo y 2,3-dimetilbutilo. El término incluye grupos alquilo tanto sustituidos como no sustituidos, y en particular, incluye grupos alquilo halogenados, e incluso más concretamente, grupos alquilo fluorados. Las fracciones con las que el grupo alquilo puede estar sustituido se seleccionan del grupo que consiste en halógeno (flúor, cloro, bromo o yodo), hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato o fosfonato, bien desprotegidos o protegidos según sea necesario, como es conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Greene et al., “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda edición 1991.

El término alquilo inferior, como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, se refiere a un grupo alquilo C1 a C4 saturado, lineal, ramificado o, si procede, cíclico (por ejemplo, ciclopropilo), incluyendo tanto formas sustituidas como no sustituidas. A menos que se especifique de otro modo en la presente solicitud, cuando alquilo es una fracción adecuada, se prefiere alquilo inferior. De manera similar, cuando alquilo o alquilo inferior es una fracción adecuada, se prefiere alquilo o alquilo inferior no sustituido.

El término alquilamino o arilamino se refiere a un grupo amino que tiene uno o dos sustituyentes alquilo o arilo, respectivamente.

El término "protegido", como se usa en la presente memoria, y a menos que se defina lo contrario, se refiere a un grupo que se añade a un átomo de oxígeno, nitrógeno o fósforo para evitar su reacción posterior o para otros fines. Los expertos en la técnica de la síntesis orgánica conocen una amplia variedad de grupos protectores de oxígeno y nitrógeno.

El término arilo, como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, se refiere a fenilo, bifenilo o naftilo, y preferiblemente, a fenilo. El término incluye fracciones tanto sustituidas como no sustituidas. El grupo arilo puede estar sustituido con una o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en halógeno (flúor, cloro, bromo o yodo), hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato o fosfonato, bien desprotegidos o protegidos según sea necesario, como es conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Greene, et al., “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda edición, 1991.

El término alcarilo o alquilarilo se refiere a un grupo alquilo con un sustituyente arilo. El término aralquilo o arilalquilo se refiere a un grupo arilo con un sustituyente alquilo.

El término halo, como se usa en la presente memoria, incluye cloro, bromo, yodo y flúor.

El término base se refiere a cualquier base de purina o pirimidina incluyendo, pero no se limitan a, guanina, adenina, hipoxantina, 2,6-diaminopurina, 6-cloropurina, N6-alquilpurinas, N6-acilopurinas (en donde acilo es C(O)(alquilo, arilo, alquilarilo, o arilalquilo), N6-bencilpurina, N6-halopurina, N6-vinilpurina, N6-purina acetilénica, N6-acil-purina, N6hidroxialquil-purina, N6-tioalquil-purina, N2-alquilpurinas, N2-alquil-6-tiopurinas, timina, citosina, 5-fluorcitosina, 5metilcitosina, 6-azapirimidina, incluyendo 6-azacitosina, 2-y/o 4-mercaptopirimidina, uracilo, 5-halouracilo, incluyendo 5-fluoruracilo, C5-alquilpirimidinas, C5-bencilpirimidinas, C5-halopirimidinas, C5-vinilpirimidina, C5pirimidina acetilénica, C5-acil-pirimidina, C5-hidroxialquil-purina, C5-amidopirimidina, C5-cianopirimidina, C5nitropirimidina, C5-amino-pirimidina, N2-alquilpurinas, N2-alquil-6-tiopurinas, 5-azacitidinilo, 5-aza-uracililo,

triazolopiridinilo, imidazolopiridinilo, pirrolopirimidinilo, pirazolopirimidinilo, una base de fórmula:

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5 en donde: G y L son cada uno independientemente CH o N; D es N, CH, C-CN, C-NO2, C-3alquilo C1-3, C-NHCONH2, C-CONQ11Q11, C-CSNQ11Q11, CCOOQ11, C

C(=NH)NH2, C-hidroxi, C-alcoxi C1-3, C-amino, C-alquilamino C1-4, C-di(alquil C1-4)amino, C-halógeno, C-(1,3oxazol-2-ilo), C-(1,3-tiazol-2-ilo) o C-(imidazol-2-ilo); en donde alquilo no está sustituido o está sustituido con de 10 uno a tres grupos seleccionados independientemente entre halógeno, amino, hidroxi, carboxi y alcoxi C1-3; E es N o CQ5; W es O, S, o NR; R es H, OH, alquilo; Q6 es H, OH, SH, NH2, alquilamino C1-4, di(alquil C1-4)amino, cicloalquilamino C3-6, halógeno, alquilo C1-4, alcoxi 15 C1-4 o CF3;

Q5 es H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilamino C1-4, CF3, halógeno, N, CN, NO2, NHCONH2, CONQ11Q11, CSNQ11Q11, COOQ11, C(=NH)NH2, hidroxi, alcoxi C1-3, amino, alquilamino C1-4, di(alquil C1-4)amino, halógeno, 1,3-oxazol-2-ilo, 1,3-tiazol-2-ilo, o imidazol-2-ilo; en donde alquilo no está sustituido o está sustituido con de uno a tres grupos seleccionados independientemente entre halógeno, amino, hidroxi, carboxi y alcoxi C1-3;

20 Q7 y Q14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, CF3, OH, SH, OR, SR alquilo C1-4, amino, alquilamino C1-4, cicloalquilamino C3-6 y di(alquil C1-4)amino;

Q11 es independientemente H o alquilo C1-6;

Q8 es H, halógeno, CN, carboxi, alquiloxicarbonilo C1-4, N3, amino, alquilamino C1-4, di(alquil C1-4)amino, hidroxi, alcoxi C1-6, alquiltio C1-6, alquilsulfonilo C1-6, (alquil C1-4)0-2aminometilo, NH2, CN, NO2, alquilo C1-3, NHCONH2,

25 CONQ11Q11, CSNQ11Q11, COOQ11, C(=NH)NH2, 1,3-oxazol-2-ilo, 1,3-tiazol-2-ilo o imidazol-2-ilo, en donde alquilo no está sustituido o está sustituido con de uno a tres grupos seleccionados independientemente entre halógeno, amino, hidroxi, carboxi y alcoxi C1-3;

una base de fórmula:

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sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo, CO-alquilo, CO-arilo, CO-alcoxialquilo, cloro, bromo, flúor, yodo, OR4, NR4R5 o SR5, Br-vinilo, -O-alquilo, -O-alquenilo, -O-alquinilo, -O-arilo, -O-aralquilo, -O-acilo, -Ocicloalquilo, NH2, NH-alquilo, N-dialquilo, NH-acilo, N-arilo, N-aralquilo, NH-cicloalquilo, SH, S-alquilo, S-acilo, Sarilo, S-cicloalquilo, S-aralquilo, CN, N3, COOH, CONH2, CO2-alquilo, CONH-alquilo, CON-dialquilo, OH, CF3, CH2OH, (CH2)mOH, (CH2)mNH2, (CH2)mCOOH, (CH2)mCN, (CH2)mNO2, (CH2)mCONH2, alquilamino C1-4, di(alquil C1-4)amino, cicloalquilamino C3-6, alcoxi C1-4, alcoxicarbonilo C1-4, alquiltio C1-6, alquilsulfonilo C1-6, (alquil C1-4)02aminometilo o -NHC(=NH)NH2;

T5 es NH;

R4 y R5 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, acilo (incluyendo acilo inferior), o alquilo (incluyendo pero no se limitan a metilo, etilo, propilo y ciclopropilo);

m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

T6, T7, T8, T9, T10, T11 y T12 se seleccionan independientemente entre N o CH;

U2 es H, alquilo de cadena lineal, ramificado o cíclico, CO-alquilo, CO-arilo, CO-alcoxialquilo, cloro, bromo, flúor, yodo, OR4, NR4R5 o SR5;

Y2 es O, S, NH, NR o CQ24Q26, donde R es H, OH o alquilo;

Q24 y Q26 se seleccionan independientemente entre H, alquilo, alquilo de cadena lineal, ramificado o cíclico, COalquilo, CO-arilo, CO-alcoxialquilo, cloro, bromo, flúor, yodo, OR4, NR4R5 o SR5.

Otros ejemplos adicionales de bases de purina incluyen, pero no se limitan a, guanina, adenina, hipoxantina, 2,6diaminopurina, 6-cloropurina y 6-N-metilamino-purina. Los grupos funcionales de oxígeno y nitrógeno en la base se pueden proteger según sea necesario o se desee. Los grupos protectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen trimetilsililo, dimetilhexilsililo, t-butildimetilsililo y t-butildifenilsililo, tritilo, grupos alquilo y grupos acilo tales como acetilo y propionilo, metanosulfonilo y p-toluenosulfonilo.

El término acilo o la expresión éster enlazado a O se refieren a un grupo de fórmula C(O)R', en donde R' es un alquilo lineal, ramificado o cíclico (incluyendo alquilo inferior), aminoácido, arilo incluyendo fenilo, alcarilo, aralquilo incluyendo bencilo, alcoxialquilo incluyendo metoximetilo, ariloxialquilo tal como fenoximetilo; o alquilo sustituido (incluyendo alquilo inferior), arilo incluyendo fenilo opcionalmente sustituido con cloro, bromo, flúor, yodo, alquilo C1 a C4 o alcoxi C1 a C4, éster de sulfonatos tal como alquil-o aralquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo, el éster de mono-, di-o trifosfato, tritilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido, alcarilo, aralquilo incluyendo bencilo, alcoxialquilo incluyendo metoximetilo, ariloxialquilo tal como fenoximetilo. Los grupos arilo de los ésteres comprenden óptimamente un grupo fenilo. En particular, los grupos acilo incluyen acetilo, trifluoracetilo, metilacetilo, ciclopropilacetilo, propionilo, butirilo, hexanoílo, heptanoílo, octanoílo, neo-heptanoílo, fenilacetilo, 2-acetoxi-2fenilacetilo, difenilacetilo, α-metoxi-α-trifluormetil-fenilacetilo, bromoacetilo, 2-nitro-bencenoacetilo, 4clorobencenoacetilo, 2-cloro-2,2-difenilacetilo, 2-cloro-2-fenilacetilo, trimetilacetilo, clorodifluoroacetilo, perfluoroacetilo, fluoroacetilo, bromodifluoroacetilo, metoxiacetilo, 2-tiofeneacetilo, clorosulfonilacetilo, 3metoxifenilacetilo, fenoxiacetilo, terc-butilacetilo, tricloroacetilo, monocloro-acetilo, dicloroacetilo, 7Hdodecafluoroheptanoilo, perfluoro-heptanoílo, 7H-dodeca-fluoroheptanoilo, 7-clorododecafluoro-heptanoilo, 7-clorododecafluoro-heptanoilo, 7H-dodecafluoroheptanoilo, 7H-dodeca-fluorheptanoilo, nona-fluor-3,6-dioxa-heptanoilo, nonafluor-3,6-dioxaheptanoilo, perfluoroheptanoílo, metoxibenzoílo, metil-3-amino-5-feniltiofene-2-carboxilo, 3,6dicloro-2-metoxi-benzoílo, 4-(1,1,2,2-tetrafluoroetoxi)-benzoílo, 2-bromo-propionilo, omega-aminocaprilo, decanoílo, n-pentadecanoílo, estearilo, 3-ciclopentil-propionilo, 1-benceno-carboxilo, O-acetilmandelilo, pivaloilacetilo, 1adamantanocarboxilo, ciclohexano-carboxilo, 2,6-piridindicarboxilo, ciclopropano-carboxilo, ciclobutano-carboxilo, perfluorociclohexilcarboxilo, 4-metilbenzoílo, clorometilisoxazolil-carbonilo, perfluorociclohexil-carboxilo, crotonilo, 1metil-1H-indazol-3-carbonilo, 2-propenilo, isovalerilo, 1-pirrolidincarbonilo, 4-fenilbenzoílo.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "esencialmente exento/a de" o "esencialmente en ausencia de" se refiere a una composición de nucleósido que incluye al menos del 95 % al 98 % en peso, e incluso más preferiblemente del 99% al 100 % en peso, del enantiómero designado de ese nucleósido. En una realización preferida, en los métodos y compuestos de la presente invención, los compuestos están esencialmente exentos de enantiómeros.

Del mismo modo, el término "aislado/a" se refiere a una composición de nucleósido que incluye al menos del 95 % al 98 % en peso, e incluso más preferiblemente del 99% al 100 % en peso, del nucleósido, comprendiendo el resto otras especies químicas o enantiómeros.

El término "hospedador", como se usa en la presente memoria, se refiere a un organismo unicelular o multicelular en el que el virus puede replicarse, incluyendo líneas celulares y animales, y preferiblemente un ser humano. Como alternativa, el hospedador puede ser portador de una parte del genoma vírico de Flaviviridae, cuya replicación o función puede ser alterada por los compuestos de la presente invención. El término hospedador se refiere específicamente a células infectadas, células transfectadas con todo o parte del genoma de Flaviviridae y animales,

en particular, primates (incluyendo chimpancés) y seres humanos. En la mayoría de las aplicaciones animales de la presente invención, el hospedador es un paciente humano. Las aplicaciones veterinarias, en ciertas indicaciones, sin embargo, están claramente anticipadas por la presente invención (tal como los chimpancés).

II. Nucleósidos con metilo en 2'

5 La presente invención proporciona un nucleósido con metilo en 2’ como se define en las reivindicaciones, o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método de tratamiento de la hepatitis C en un hospedador, en donde el método comprende administrar dicho nucleósido con metilo en 2’ o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y administrar interferón, en donde dicho nucleósido con metilo en 2' ha causado una

10 mutación en el nucleótido 8.443 (de G a C) del genoma del virus de la hepatitis C o del aminoácido 282 Serina a Treonina de la región de la ARN polimerasa del virus de la hepatitis C.

En una realización específica, el nucleósido 2'-metil-pirimidina se representa mediante el compuesto β-D-2'-CH3riboC, que se representa por la fórmula:

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15 en donde R3 es H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un fármaco de fosfato estabilizado); acilo (incluyendo acilo inferior); alquilo (incluyendo alquilo inferior); éster de sulfonato (incluyendo alquil-o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable

20 que proporciona un compuesto en donde R3 es H o fosfato cuando se administra in vivo.

En otra realización específica, el nucleósido 2'-metil-purina se representa mediante el compuesto β-D-2'-CH3-ribo-6N-metilaminopurina, que se representa por la fórmula:

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en donde R3 es H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un fármaco de fosfato estabilizado); acilo (incluyendo

25 acilo inferior); alquilo (incluyendo alquilo inferior); éster de sulfonato (incluyendo alquil-o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable que proporciona un compuesto en donde R3 es H o fosfato cuando se administra in vivo.

30 En una realización de la invención, el nucleósido con metilo en 2' es de fórmula general:

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en donde:

LG es un grupo saliente;

R1, R2, y R3 son independientemente H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un profármaco de fosfato

5 estabilizado); acilo (incluyendo acilo inferior); alquilo (incluyendo alquilo inferior); éster de sulfonato (incluyendo alquil-o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable que proporciona un compuesto en donde R1, R2 o R3 es independientemente H o

10 fosfato cuando se administra in vivo; y

R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo (incluyendo alquilo inferior), azido, ciano, alquenilo, alquinilo, Brvinilo, -C(O)O(alquilo), -C(O)O(alquilo inferior), -O(acilo), -O(acilo inferior), -O(alquilo), -O(alquilo inferior), O(alquenilo), cloro, bromo, flúor, yodo, NO2, NH2, -NH(alquilo inferior), -NH(acilo), -N(alquilo inferior)2 o -N(acilo)2.

2. Modificación de un nucleósido previamente formado

15 El material de partida clave para este proceso puede ser un nucleósido apropiadamente sustituido con un 2'-OH y 2'-

H. El nucleósido puede adquirirse o puede prepararse mediante cualquier medio conocido incluyendo técnicas de acoplamiento convencionales. Opcionalmente, el nucleósido puede protegerse con grupos protectores adecuados, preferiblemente, con grupos acilo o sililo, mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Greene et al. “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda edición, 1991.

20 El nucleósido adecuadamente protegido se puede oxidar luego con el agente oxidante apropiado en un disolvente compatible a una temperatura adecuada para producir el azúcar modificado en 2'. Los agentes oxidantes posibles son el reactivo de Jones (una mezcla de ácido crómico y ácido sulfúrico), el reactivo de Collins (óxido de Cr (VI) y dipiridina, reactivo de Corey (clorocromato de piridinio), dicromato de piridinio, dicromato ácido, permanganato de potasio, MnO2, tetróxido de rutenio, catalizadores de transferencia de fase tales como ácido crómico o

25 permanganato soportado sobre un polímero, Cl2-piridina, H2O2-molibdato de amonio, NaBrO2-CAN, NaOCI en

HOAc, cromito de cobre, óxido de cobre, níquel Raney, acetato de paladio, reactivo de Meerwin-Pondorf-Verley (tbutóxido de aluminio con otra cetona) y N-bromosuccinimida.

Posteriormente, el nucleósido puede desprotegerse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Greene et al. “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda 5 edición, 1991.

Se puede desear el ribonucleósido ramificado en 2'-C. La síntesis de un ribonucleósido se muestra en el Esquema

2. Como alternativa, se puede usar el desoxirribonucleósido. Para obtener estos nucleósidos, el ribonucleósido formado se puede proteger opcionalmente mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Greene et al. “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda edición,

10 1991, y luego se puede reducir el 2'-OH con un agente reductor adecuado. Opcionalmente, el 2'-hidroxilo puede activarse para facilitar la reducción; es decir, mediante la reducción de Barton.

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en donde:

R1 y R3 son independientemente H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un profármaco de fosfato

15 estabilizado); acilo (incluyendo acilo inferior); alquilo (incluyendo alquilo inferior); éster de sulfonato (incluyendo alquil-o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable que proporciona un compuesto en donde R1 o R3 es independientemente H o

20 fosfato cuando se administra in vivo; y

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Síntesis general de nucleósido de pirimidina ramificado en 2’

1. Glicosilación de la pirimidina con un azúcar modificado apropiadamente

En el Esquema 3 se describe un método general representativo para la preparación de nucleósido de pirimidina ramificado en 2'. Este esquema ilustra el nucleósido de pirimidina ramificado en 2’ en la configuración β-D-ribo. Como alternativa, un experto en la técnica podría modificar el esquema general para producir nucleósido de 2'-β-Lpirimidina. El material de partida clave para este proceso puede ser un azúcar apropiadamente sustituido con un 2'-OH y 2'-H, con el grupo saliente apropiado (LG), por ejemplo, un grupo acilo o un grupo cloro, bromo, flúor o yodo. El azúcar puede adquirirse o puede prepararse mediante cualquier medio conocido incluyendo técnicas convencionales de epimerización, sustitución, oxidación y reducción. El azúcar sustituido se puede oxidar luego con el agente oxidante apropiado en un disolvente compatible a una temperatura adecuada para producir el azúcar modificado en 2'. Los agentes oxidantes posibles son el reactivo de Jones (una mezcla de ácido crómico y ácido sulfúrico), el reactivo de Collins (óxido de Cr (VI) y dipiridina, reactivo de Corey (clorocromato de piridinio), dicromato de piridinio, dicromato ácido, permanganato de potasio, MnO2, tetróxido de rutenio, catalizadores de transferencia de fase tales como ácido crómico o permanganato soportado sobre un polímero, Cl2-piridina, H2O2-molibdato de amonio, NaBrO2-CAN, NaOCI en HOAc, cromito de cobre, óxido de cobre, níquel Raney, acetato de paladio, reactivo de MeerwinPondorf-Verley (t-butóxido de aluminio con otra cetona) y N-bromosuccinimida.

El acoplamiento de un nucleófilo de carbono organometálico, tal como un reactivo de Grignard, un organolitio, dialquilcobre y litio o R4-SiMe3 en TBAF con la cetona con el disolvente no prótico apropiado a una temperatura adecuada, proporciona el azúcar alquilado en 2’. El azúcar alquilado puede protegerse opcionalmente con un grupo protector adecuado, preferiblemente con un grupo acilo o sililo, mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Greene et al. “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda edición, 1991.

El azúcar opcionalmente protegido se puede acoplar entonces a una base de pirimidina mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Townsend, “Chemistry of Nucleosides and Nucleotides”, Plenum Press, 1994. Por ejemplo, se puede acoplar un azúcar acilado a una pirimidina sililada, tal como citidina, con un ácido de Lewis, tal como tetracloruro de estaño, tetracloruro de titanio o trimetilsililtriflato en el disolvente apropiado a una temperatura adecuada. Como alternativa, se puede acoplar un halo-azúcar a una pirimidina sililada, tal como una citidina, con la presencia de trimetilsililtriflato.

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en donde:

R1, R2, y R3 son independientemente H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un profármaco de fosfato estabilizado); acilo (incluyendo acilo inferior); alquilo (incluyendo alquilo inferior); éster de sulfonato (incluyendo alquil-o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente

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estabilizado); acilo (incluyendo acilo inferior); alquilo (incluyendo alquilo inferior); éster de sulfonato (incluyendo alquil-o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable que proporciona un compuesto en donde R1 o R3 es independientemente H o fosfato cuando se administra in vivo; y

Síntesis general de nucleósido de purina ramificado en 2’:

1. Glicosilación de la pirimidina con un azúcar modificado apropiadamente

En el siguiente Esquema 5, se describe un método general representativo para la preparación de nucleósido de purina ramificado en 2’. Dicho esquema ilustra la síntesis de nucleósido de purina ramificado en 2’ en la configuración β-D-ribo. Como alternativa, es bien apreciado que los expertos en la técnica son capaces de preparar la configuración β-L-ribo usando el material de partida apropiado. El material de partida es un furanosuro de alquilo 3,5-bis-protegido, tal como furanosuro de metilo, de fórmula estructural (i). El grupo hidroxilo C-2 se oxida luego con un agente oxidante adecuado, tal como un trióxido de cromo o reactivo de cromato o peryodinano de Dess-Martin, o mediante oxidación de Swern, para proporcionar una cetona C-2 de fórmula estructural (ii). La adición de un reactivo de Grignard, tal como un haluro de alquil-, alquenil-o alquinil-magnesio (por ejemplo, MeMgBr, EtMgBr, vinil-MgBr, alil-MgBr y etinil-MgBr) o un alquil-, alquenil-o alquinil-litio, tal como MeLi, a través del doble enlace de carbonilo (ii) en un disolvente orgánico adecuado, tal como tetrahidrofurano, éter dietílico y similares, proporciona el alcohol terciario C-2 de fórmula estructural (iii). A continuación, se introduce un buen grupo saliente (tal como F, Cl, Br y I) en la posición C-1 (anornérica) del derivado de azúcar de furanosa mediante el tratamiento del furanósido de fórmula

(iii) con un haluro de hidrógeno en un disolvente orgánico adecuado, tal como bromuro de hidrógeno en ácido acético, para proporcionar el haluro de furanosilo intermedio (iv). Un C-sulfonato, tal como metanosulfonato (MeSO2O-), trifluorometanosulfonato (CF3SO2O-) o p-toluenosulfonato (-OTs), también puede servir como un grupo saliente útil en la reacción subsiguiente para generar el enlace glucosídico (nucleosídico). El enlace nucleosídico se construye mediante el tratamiento del compuesto intermedio de fórmula estructural (iv) con la sal metálica (tal como litio, sodio o potasio) de una 1H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (v) apropiadamente sustituida, tal como una 4-halo-1Hpirrolo[2,3-d]pirimidina apropiadamente sustituida, que puede generarse in situ mediante el tratamiento con un hidruro alcalino (tal como hidruro sódico), un hidróxido alcalino (tal como hidróxido potásico), un carbonato alcalino (tal como carbonato de potasio) o una hexametildisilazida alcalina (tal como NaHMDS) en un disolvente orgánico anhidro adecuado, tal como acetonitrilo, tetrahidrofurano, 1-metil-2-pirrolidinona o N,N-dimetilformamida (DMF). La reacción de desplazamiento puede catalizarse usando un catalizador de transferencia de fase, tal como TDA-1 o cloruro de trietilbencilamonio, en un sistema bifásico (sólido-líquido o líquido-líquido). Los grupos protectores opcionales del nucleósido protegido de fórmula estructural (vi) se escinden después siguiendo metodologías de desprotección establecidas, tales como las descritas en T. W. Greene'y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", P ed., John Wiley & Sons, 1999. La introducción opcional de un grupo amino en la posición 4 del núcleo de pirrolo[2,3-d]pirimidina se efectúa mediante el tratamiento del compuesto intermediario 4-halo (vi) con la amina apropiada, tal como amoníaco alcohólico o amoníaco líquido, para generar una amina primaria en la posición C-4 (-NH2), una alquilamina para generar una amina secundaria (-NHR), o una dialquilamina para generar una amina terciaria (-NRR'). Un compuesto de 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4(3H)-ona puede derivarse mediante la hidrólisis de (vi) con base acuosa, tal como hidróxido sódico acuoso. La alcohólisis (tal como la metanólisis) de 1-6 proporciona un alcóxido C-4 (-OR), mientras que el tratamiento con un alquilmercaptido proporciona un derivado de alquiltio C-4 (-SR). Pueden requerirse manipulaciones químicas subsiguientes bien conocidas por los expertos en la técnica de la química orgánica/medicinal para obtener los compuestos deseados de la presente invención.

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en donde:

P1 y P2 son independientemente un grupo protector; como alternativa, P1 y P2 pueden unirse para formar un

grupo protector cíclico;

R5 y R6 son independientemente grupo alquilo;

M es Li, Na o K;

X1 y X2 son independientemente F, Cl, Br o I;

R7, R8, y R9 son independientemente hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi, amino, alquilamino o alquilo.

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en donde:

LG es un grupo saliente; y

R1, R2 y R3 son independientemente H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un profármaco de fosfato

10 fosfato cuando se administra in vivo.

2. Modificación de un nucleósido con metilo en 2’ previamente formado

El material de partida clave para este proceso puede ser un nucleósido de 2'-metil-citidina apropiadamente sustituido con un 2'-OH y 2'-H. El nucleósido puede adquirirse o puede prepararse mediante cualquier medio conocido incluyendo técnicas de acoplamiento convencionales. Opcionalmente, el nucleósido puede protegerse con grupos

15 protectores adecuados, preferiblemente, con grupos acilo o sililo, mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Greene et al. “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda edición, 1991.

El nucleósido de 2’-metil-citidina adecuadamente protegido se puede oxidar luego con el agente oxidante apropiado en un disolvente compatible a una temperatura adecuada para producir el azúcar con metilo en 2'. Los agentes 20 oxidantes posibles son el reactivo de Jones (una mezcla de ácido crómico y ácido sulfúrico), el reactivo de Collins (óxido de Cr (VI) y dipiridina, reactivo de Corey (clorocromato de piridinio), dicromato de piridinio, dicromato ácido, permanganato de potasio, MnO2, tetróxido de rutenio, catalizadores de transferencia de fase tales como ácido crómico o permanganato soportado sobre un polímero, Cl2-piridina, H2O2-molibdato de amonio, NaBrO2-CAN, NaOCI en HOAc, cromito de cobre, óxido de cobre, níquel Raney, acetato de paladio, reactivo de Meerwin-Pondorf

25 Verley (t-butóxido de aluminio con otra cetona) y N-bromosuccinimida.

Posteriormente, el nucleósido puede desprotegerse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Greene et al. “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons, Segunda edición, 1991.

En el Esquema 7, se muestra la síntesis de un nucleósido de 2’-metil-citidina.

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en donde:

R1 y R3 son independientemente H, fosfato (incluyendo mono-, di-o trifosfato y un profármaco de fosfato estabilizado); acilo (incluyendo acilo inferior); alquilo (incluyendo alquilo inferior); éster de sulfonato (incluyendo alquil-o arilalquil-sulfonilo incluyendo metanosulfonilo); bencilo, en donde el grupo fenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes como se describe en la definición de arilo dada en el presente memoria; lípido (incluyendo un fosfolípido); aminoácido; hidrato de carbono; péptido; colesterol; o un grupo saliente farmacéuticamente aceptable que proporciona un compuesto en donde R1 o R3 es independientemente H o fosfato cuando se administra in vivo.

Profármacos farmacéuticamente aceptables

El término "profármaco y/o sal farmacéuticamente aceptable" se usa en toda la memoria descriptiva para describir cualquier forma farmacéuticamente aceptable (tal como un éster, éster de fosfato, sal de un éster o un grupo relacionado) de un compuesto nucleósido que, tras la administración a un paciente, proporciona el compuesto nucleósido precursor. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de bases y ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. Las sales adecuadas incluyen las derivadas de metales alcalinos tales como potasio y sodio, metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio, entre muchos otros ácidos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Los profármacos farmacéuticamente aceptables se refieren a un compuesto que se metaboliza, por ejemplo, se hidroliza o se oxida, en el hospedador para formar el compuesto. Los ejemplos típicos de profármacos incluyen compuestos que tienen grupos protectores biológicamente lábiles sobre una fracción funcional del compuesto activo. Los profármacos incluyen compuestos que se pueden oxidar, reducir, aminar, desaminar, hidroxilar, deshidroxilar, hidrolizar, deshidrolizar, alquilar, desalquilar, acilar, desacilar, fosforilar, desfosforilar para producir el compuesto activo. Los compuestos poseen actividad antivírica frente a Flaviviridae, o se metabolizan en un compuesto que presenta dicha actividad.

Los nucleósidos ramificados en 2’, incluyendo el nucleósido de pirimidina ramificado en 2', tal como β-D-2'-CH3riboC, o compuestos relacionados administrados como profármacos acilados o nucleósidos se pueden usar en terapia de combinación o de alternancia.

Cualquiera de los nucleósidos descritos en la presente memoria u otros compuestos que contienen una función hidroxilo o amina pueden administrarse como un profármaco nucleósido para aumentar la actividad, la biodisponibilidad, la estabilidad o alterar de otro modo las propiedades del nucleósido. Se conoce un número de ligandos de profármaco nucleósido. En general, la alquilación, acilación u otra modificación lipófila del grupo hidroxilo del compuesto o del mono, di o trifosfato del nucleósido aumentará la estabilidad del nucleósido. Los ejemplos de grupos sustituyentes que pueden sustituir uno o más hidrógenos en la fracción fosfato o hidroxilo son alquilo, arilo, esteroides, hidratos de carbono, incluyendo azúcares, 1,2-diacilglicerol y alcoholes. Muchos se describen en R. Jones y N. Bischofberger, “Antiviral Research”, 27 (1995) 1-17. Cualquiera de estos se puede usar en combinación con los nucleósidos descritos u otros compuestos para conseguir un efecto deseado.

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El nucleósido activo u otro compuesto que contiene hidroxilo también puede proporcionarse como un lípido de éter (y, en particular, un lípido de éter en 5’ para un nucleósido), como se describe en las siguientes referencias: Kucera,

L. S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E. K., D. L. W., y C. Piantadosi. 1990. "Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation". AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6:491-501; Piantadosi, C., J. Marasco C. J., S. L. Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J. R. Surles, K.

S. Ishaq, L. S. Kucera, N. Iyer, C. A. Wallen, S. Piantadosi y E. J. Modest. 1991. "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity". J. Med. Chem. 34:1408.1414; Hosteller, K. Y., D. D. Richman,

D. A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. M. T. van Wijk y H. van den Bosch. 1992. "Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3,-deoxythymidine". Antimicrob. Agents Chemother. 36:2025.2029; Hostetler, K. Y., L. M. Stuhmiller, H. B. Lenting, H. van den Bosch y D. D. Richman, 1990. "Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides". J. Biol. Chem. 265:61127. Los ejemplos no limitantes de patentes de EE.UU. que describen sustituyentes lipófilos adecuados que se pueden incorporar covalentemente al nucleósido u otro compuesto que contiene hidroxilo o amina, preferiblemente en la posición 5'-OH del nucleósido o preparaciones lipófilas, incluyen las patentes de EE.UU. n.º 5.149.794 (22 de septiembre de 1992, Yatvin et al.); 5.194.654 (16 de marzo de 1993, Hostetler et al., 5.223.263 (29 de junio de 1993, Hostetler et al.);

5.256.641 (26 de octubre de 1993, Yatvin et al.); 5.411.947 (2 de mayo de 1995, Hostetler et al.); 5.463.092 (31 de octubre de 1995, Hostetler et al.); 5.543.389 (6 de agosto de 1996, Yatvin et al.); 5.543.390 (6 de agosto de 1996, Yatvin et al.); 5.543.391 (6 de agosto de 1996, Yatvin et al.); y 5.554.728 (10 de septiembre de 1996; Basava et al.). Las solicitudes de patentes extranjeras que describen sustituyentes lipófilos que se pueden unir a los nucleósidos de la presente invención, o preparaciones lipófilas, incluyen los documentos WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4 y WO 91/19721.

Los profármacos 2', 3' y 5' de nucleósidos β-D ramificados en 2’, o sus sales farmacéuticamente aceptables o formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen estos compuestos pueden usarse para tratar infecciones por Flaviviridae. En concreto, el profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC representado por la fórmula.

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o su sal farmacéuticamente aceptable, se puede administrar a un sujeto para el tratamiento de una infección por

Flaviviridae.

El profármaco 2’ de nucleósido β-D ramificado en 2’ puede incluir fracciones biológicamente escindibles en las posiciones 2' y/o 5'. Las fracciones preferidas son ésteres de D-o L-aminoácidos naturales o sintéticos, incluyendo D-o L-valilo, aunque preferiblemente son ésteres de L-aminoácidos, tales como L-valilo, y ésteres de alquilo incluyendo acetilo. La presente invención incluye específicamente éster de D-o L-aminoácido en 2’ y éster de D-o L-diaminoácido en 2’,5’, preferiblemente éster de L-aminoácido de nucleósidos β-D o β-L con metilo en 2’ con cualquier base de purina o pirimidina deseada, en donde el fármaco precursor tiene opcionalmente una CE50 inferior a 15 micromolar, e incluso más preferiblemente inferior a 10 micromolar; 2'-(alquil)éster o 2',5'-di(alquil)éster de nucleósidos β-D o β-L con metilo en 2’ con cualquier base de purina o pirimidina deseada, en donde el fármaco precursor tiene opcionalmente una CE50 inferior a 10 o 15 micromolar; y 2',5'-diésteres de nucleósidos β-D o β-L con metilo en 2’ en donde (i) el éster 2' es un éster de D-o L-aminoácido natural o sintético, aunque preferiblemente un éster de L-aminoácido, y el éster 5’ es un éster de alquilo; (ii) ambos ésteres son independientemente éster de D-o L-aminoácido natural o sintético, aunque preferiblemente ambos son ésteres de L-aminoácido; (iii) ambos ésteres son independientemente ésteres de alquilo e (iv) el éster 2’ es independientemente un alquiléster y el éster 5’ es un éster de D-o L-aminoácido natural o sintético, aunque preferiblemente un éster de L-aminoácido, en donde el fármaco precursor tiene opcionalmente una CE50 inferior a 10 o 15 micromolar.

Los ejemplos englobados por la invención son 2’-D-o L-valinaéster de β-D-2'-metil-citidina; β-D-2',6-dimetil-citidina; 2’-L-valinaéster de β-D-2',6-dimetil-timidina; 2’-L-valinaéster de β-D-2',8-dimetil-adenosina; 2’-L-valinaéster de β-D2',8-dimetil-guanosina; 2’-L-valinaéster de β-D-2',6-dimetil-5-fluorocitidina; 2’-L-valinaéster de β-D-2',6-dimetil-uridina; 2'-acetiléster de β-D-2',6-dimetil-citidina; 2'-acetiléster de β-D-2',6-dimetil-timidina; 2'-acetiléster de β-D-2',8-dimetiladenosina; 2'-acetiléster de β-D-2',8-dimetil-guanosina; 2'-acetiléster de β-D-2',6-dimetil-5-fluor-citidina; y 2'-ésteres

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p es un número entero 2 o 3; R2 se selecciona del grupo que consiste en R3 y --H; R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, alicíclico y aralquilo; R12 se selecciona del grupo que consiste en --H y acilo inferior; M se selecciona del grupo que, unido a PO32-, P2O63-o P3O94-, es un nucleósido ramificado en 2’, y está unido al

fósforo a través de un átomo de carbono, oxígeno, azufre o nitrógeno. En un ejemplo no limitante, el profármaco está unido al nucleósido como en los siguientes compuestos:

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Síntesis general de profármacos 2’ y/o 3’:

10 El material de partida clave para este proceso es un nucleósido β-D ramificado en 2’ apropiadamente sustituido. El nucleósido ramificado puede adquirirse o puede prepararse mediante cualquier medio conocido incluyendo las técnicas descritas en la presente memoria. Opcionalmente, el nucleósido ramificado puede protegerse con un grupo protector adecuado, preferiblemente, con grupos sililo, mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, según las enseñanzas de Greene et al. “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley y Sons,

15 Segunda edición, 1991. El nucleósido ramificado protegido se puede acoplar luego con un donante de acilo adecuado, tal como un cloruro de acilo y/o un anhídrido de acilo con el disolvente prótico o aprótico apropiado a una temperatura adecuada, para dar el profármaco 2' y/o 3' de nucleósido β-D ramificado en 2’. Como alternativa, el nucleósido ramificado protegido se puede acoplar luego con un acilo adecuado, tal como un ácido carboxílico, tal como ácido alcanoico y/o resto de aminoácido, opcionalmente con un agente de acoplamiento adecuado, con el

20 disolvente aprótico apropiado a una temperatura adecuada, para dar el profármaco 2' y/o 3' de nucleósido β-D ramificado en 2'. Los posibles reactivos de acoplamiento son cualquier reactivo que potencie el acoplamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, reactivos de Mitsunobu (por ejemplo, azodicarboxilato de diisopropilo y azodicarboxilato de dietilo) con trifenilfosfina o diversas carbodiimidas.

Por ejemplo, los amino-alcoholes simples pueden esterificarse usando cloruros de ácido en una mezcla de

25 acetonitrilo-benceno a reflujo (Véase el siguiente Esquema 8: Synthetic Communications, 1978, 8(5), 327-333). Como alternativa, la esterificación puede conseguirse usando un anhídrido, como se describe en J. Am. Chem. Soc., 1999, 121(24), 5661-5664.

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centro infeccioso, el ensayo de indicador inducible por el virus, el ensayo de transformación, el ensayo de dilución de punto final o la tecnología de RT-PCR para cuantificar los títulos víricos (Flint et al. “Principles of Virology (ASM)” Capítulo 2; Wagner & Hewlett. Basic Virology (Blackwell), Capítulos 9 y 10).

Se puede realizar un ensayo de placa para cuantificar el crecimiento de la placa vírica y/o la capacidad de replicación. Se puede aplicar una solución diluida del virus a una placa de cultivo que contiene una monocapa de células hospedadoras. Se pueden cubrir las células con una capa semisólida (tal como un medio viscoso, por ejemplo, agar) para evitar la difusión del virus de una célula infectada a otra. Después de la incubación se pueden reconocer las “placas” y estimarse el número de partículas de virus infeccioso en la suspensión original. Un método de reconocimiento de las placas es mediante el uso de métodos de tinción de anticuerpos para detectar antígenos víricos dentro de células infectadas en la monocapa. Estas células infectadas se pueden visualizar luego usando un cromógeno o un marcador fluorescente en el anticuerpo específico del virus. Las placas se pueden observar para el análisis fenotípico y/o contarse para determinar los títulos víricos. Los títulos víricos se pueden calcular en unidades de formación de enfoque (UFE)/ml, usando la siguiente ecuación: TUFE/ml = N x 5 x D; donde T es un título vírico en UFE/ml; N es un número de placas por pocillo; y D es un factor de dilución para la muestra de virus correspondiente. (Por ejemplo, si se encontraron 12 placas en un pocillo correspondiente a una dilución de 10-5 de la muestra de virus, entonces T = 12 x 5 x 105 = 6 x 106 UFE/ml), y entonces se puede determinar la capacidad de replicación vírica, que es la capacidad replicativa global para producir progenie infectada en un ambiente hospedador definido.

También se describe un método de detección de la presencia de la mutación del nucleótido 1.214 de G a C de la región de ARN polimerasa del BVDV (causante de una mutación de serina a treonina en el aminoácido 405). Dado que se reconoce que Ser405, la posición de aminoácido del dominio B de NS5B funcional putativo del BVDV, está altamente conservada entre todos los genomas de hepacivirus, pestivirus y flavivirus (Figura 11, Lai et al., J. Virol., 1999, 73, 10129-36), se pueden detectar los restos de serina correspondientes del dominio B de NS5B funcional putativo del BVDV de otros Flaviviridaes que están mutados de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, Ser405 del dominio de ARN polimerasa del BVDV corresponde a Ser282 del dominio de la ARN polimerasa del VHC. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención también incluyen una mutación de G a C en el nucleótido 8443 del genoma del VHC (que corresponde al nucleótido 1214 del dominio de ARN polimerasa del BVDV).

También se describe un proceso de detección de una mutación que indica resistencia a β-D-2'-CH3-riboC, que incluye poner en contacto una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico de Flaviviridae con una sonda de oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria a una parte del genoma de Flaviviridae que incluye la mutación; y luego determinar si el oligonucleótido se hibrida con el ácido nucleico vírico.

También se describe un método de tratamiento de un paciente infectado con Flaviviridae que comprende:

(i): administrar una cantidad eficaz de β-D-2'-CH3-riboC o un profármaco tal como un profármaco de 3’-valinaéster de β-D-2'-CH3-riboC, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(ii): ensayar la sangre del paciente para analizar la seroconversión del virus de tipo silvestre al mutante;

(iii) administrar una cantidad eficaz de interferón.

La presente invención proporciona un nucleósido con metilo en 2’ como se define en las reivindicaciones, o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método de tratamiento de la hepatitis C en un hospedador, en donde el método comprende administrar dicho nucleósido con metilo en 2’ o su sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y administrar interferón, en donde dicho nucleósido con metilo en 2’ ha causado una mutación en el nucleótido 8.443 (de G a C) del genoma del virus de la hepatitis C o del aminoácido 282 Serina a Treonina de la región de la ARN polimerasa del virus de la hepatitis C, en donde el método comprende además la etapa de ensayar la sangre del hospedador para analizar la seroconversión del virus de tipo silvestre al mutante tras la administración del nucleósido con metilo en 2’ al hospedador.

También se describe un método de ensayo de una muestra sospechosa de contener un Flaviviridae resistente a β-D-2'-CH3-riboC que comprende:

(i): poner en contacto una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico de Flaviviridae con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria a la citidina del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa del BVDV o nucleótido 8.443 del genoma del VHC;

(ii): permitir que la sonda se hibride con la secuencia;

(iii) detectar la hibridación de la sonda a la citidina del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa del BVDV o nucleótido 8.443 del genoma del VHC;

También se describe un método de ensayo de una muestra sospechosa de contener una Thr en lugar de una Ser en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa de

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un Flaviviridae, lo que indica que el virus es hipersensible al tratamiento con interferón, que comprende:

(i): poner en contacto una muestra sospechosa de contener una secuencia de ácido nucleico de Flaviviridae con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria a un codón que codifica la Thr de la posición de Ser en la secuencia de consenso conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa de un Flaviviridae;

(ii): permitir que la sonda se hibride con la secuencia;

(iii) detectar la hibridación de la sonda a la secuencia.

También se describe un método de ensayo de una muestra sospechosa de contener una Thr en lugar de una Ser en la posición del aminoácido 405 o una citidina en el nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa del BVDV, lo que indica que el virus es hipersensible al tratamiento con interferón, que comprende:

(i): poner en contacto una muestra sospechosa de contener una secuencia de ácido nucleico de BVDV con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria a la citidina del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa;

(ii): permitir que la sonda se hibride con la secuencia;

(iii) detectar la hibridación de la sonda a la citidina del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa del BVDV.

La invención proporciona un método de ensayo de una muestra sospechosa de contener una Thr en lugar de una Ser en la secuencia de consenso altamente conservada XRXSGXXXT del dominio B de la región de la ARN polimerasa en la posición altamente conservada del aminoácido 282 o una citidina en el nucleótido 8.433 del genoma del VHC, lo que indica que el virus es hipersensible al tratamiento con interferón, que comprende:

(i): poner en contacto una muestra sospechosa de contener una secuencia de ácido nucleico del VHC con una sonda de oligonucleótido detectable que tiene una secuencia complementaria a la citidina del nucleótido 8.443;

(ii): permitir que la sonda se hibride con la secuencia;

(iii) detectar la hibridación de la sonda a la citidina del nucleótido 8.443 del genoma del VHC.

Sondas de oligonucleótido

Se describen sondas de oligonucleótidos que son capaces de detectar la presencia de una mutación de Flaviviridae inducida por nucleósido de pirimidina ramificado en 2'. Las sondas son complementarias a las secuencias de ácidos nucleicos víricos que incluyen la mutación. Estas sondas se pueden usar en procesos y kits. Las sondas de oligonucleótidos pueden detectar el nucleótido citidina en el nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa de BVDV o en el nucleótido 8.443 de la región de la ARN polimerasa del VHC u otros nucleótidos de Flaviviridae que codifican la serina conservada del dominio B de la ARN polimerasa dentro del genoma de un Flaviviridae (Figura11).

Las sondas de oligonucleótidos son preferiblemente de al menos 14 nucleótidos de longitud, y preferiblemente, son de al menos 15, 20, 25 o 30 nucleótidos de longitud. En general, no se prefiere usar una sonda que sea superior a aproximadamente 25 o 30 nucleótidos de longitud. La sonda de oligonucleótido puede diseñarse para identificar el cambio de la base de guanina a citidina en el nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa de un BVDV. Para la presente invención, la sonda de oligonucleótido puede diseñarse para identificar el cambio de la base de guanina a citidina en el nucleótido 8.443 del VHC. La sonda de oligonucleótido puede diseñarse de manera que la región mutada esté situada en la parte interior del segmento hibridado o, como alternativa, puede estar bien en el extremo 3' o 5' del segmento hibridado. Se prefiere que la región mutada esté situada cerca del centro de la sonda para permitir una hibridación eficaz.

La siguiente Tabla 2 proporciona ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos del BVDV que incluyen la posición del nucleótido 1.214 de la región de la ARN polimerasa, denominada como alternativa posición de nucleótido 11.136 (véase el número de acceso de Genebank AJ133739, Vassilev y Donis (2000) Virus Res 69(2) 95107). Dadas estas secuencias, el experto en la técnica, usando algoritmos convencionales, puede construir sondas de oligonucleótidos que sean complementarias o esencialmente complementarias a las siguientes secuencias de nucleótidos. Las reglas para el emparejamiento complementario son bien conocidas: la citidina ("C") siempre se empareje con la guanina ("G") y la timina ("T"), o el uracilo ("U") siempre se una a la adenina ("A"). Se reconoce que no es necesario que la sonda sea un 100 % complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, siempre y cuando la sonda se hibride lo suficiente y pueda reconocer el nucleótido de diagnóstico. En general, se tolera un cierto grado de desapareamiento de pares de bases.

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