ES2621235T3 - Formulación para sustancias de baja biodisponibilidad, que contiene una sal de N-acetilcisteína-quitosano - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende: a) un núcleo que comprende al menos un principio activo con baja biodisponibilidad, un polisorbato y una sal de N-acetilcisteína-quitosano; b) una capa de recubrimiento entérico que encierra dicho núcleo a), en donde dicha sal de N-acetilcisteína-quitosano comprendida en a) se obtiene mediante la protonación del grupo amino libre de quitosano por medio de N-acetilcisteína, comportándose como un ácido.

Description

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DESCRIPCION

Formulacion para sustancias de baja biodisponibilidad, que contiene una sal de N-acetilcistefna-quitosano Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una composicion que comprende: un nucleo que comprende al menos un principio activo con baja biodisponibilidad, un polisorbato y una sal de N-acetilcistefna-quitosano, en donde este nucleo esta encerrado en una capa de recubrimiento enterico, a un metodo para su produccion, a dicha composicion para su uso como medicamento, a un suplemento alimenticio o a una composicion nutraceutica que comprende dicha composicion.

Un gran numero de sustancias que se utilizan en formulaciones farmaceuticas y/o en suplementos nutraceuticos y alimenticios muestran una biodisponibilidad reducida o escasa debido al fallo de la absorcion y la metabolizacion entericas o a la desnaturalizacion qufmica que se puede producir en el lumen gastrointestinal como en los citocromos hepaticos. Debido a estos fenomenos fisiologicos, los suplementos alimenticios y las formulaciones farmaceuticas y nutraceuticas son a menudo totalmente ineficaces o marcadamente menos eficaces de lo esperado basandose en los datos in vitro. Los ejemplos generales y no limitantes de tales sustancias con baja biodisponibilidad son las vitaminas, los polifenoles, los terpenos esteroideos, los terpenos no esteroideos, los acidos grasos y las coenzimas.

La absorcion de sustancias hidrofilas a traves de la mucosa enterica esta gravemente limitada por factores bioffsicos y bioqufmicos que dan como resultado una biodisponibilidad reducida.

Las sustancias debilmente acidas, lipofilas y de bajo peso molecular (<1000 Dalton) (p. ej., acido acetilsalicflico) se absorben a traves de la mucosa gastrica a traves de mecanismos de transporte transcelulares activos o mediante difusion facilitada. En cambio, las sustancias debilmente alcalinas son ionizadas en el estomago donde el pH es de aproximadamente 1,5, por lo tanto no pueden ser absorbidas a traves de la mucosa gastrica. Tales sustancias ligeramente alcalinas alcanzan el fleon y el duodeno donde son absorbidas en virtud de la gran area de contacto superficial con la mucosa intestinal y de la mayor permeabilidad de las membranas celulares. Las sustancias con un marcado caracter lipofilo, tales como las vitaminas liposolubles (A, D, E, K, F), son asimiladas solo despues de su emulsificacion por sales biliares, lo que permite la formacion de micelas que facilitan el contacto entre las sustancias lipofilas y la superficie de las vellosidades intestinales. En el area de la mucosa gastrointestinal, los principales mecanismos que ralentizan o alteran la penetracion trans-mural de las sustancias introducidas por via oral son:

• el espesor de las secreciones mucosas, que puede atrapar el principio activo y hacer que no este disponible para la penetracion;

• el metabolismo por la enzima CYP3A (presente en los enterocitos villosos);

• la extrusion por P-glicoprotefna (presente en los enterocitos villosos);

• la naturaleza peptfdica de las sustancias (hidrolisis proteolftica por acido-gastrico);

• el flujo trans-mural reducido debido a las uniones estrechas entericas.

De hecho, la presencia de la barrera anatomica representada por "uniones estrechas" es extremadamente importante para comprender los mecanismos de absorcion enterica de los principios activos. Las uniones estrechas son estructuras proteicas de la placa que mantienen el contacto entre las celulas epiteliales, favoreciendo una continuidad anatomica del epitelio y un flujo trans-mural reducido de sustancias exogenas a traves de el.

Una posibilidad para la administracion a un sujeto de sustancias que son escasamente absorbidas en el intestino es formularlas utilizando nanoemulsiones (p. ej., Solicitud de patente IT2008VE00055) o la absorcion trans-lingual (p. ej., Solicitud de Patente WO2011161501).

Sin embargo, para algunas sustancias y algunas indicaciones terapeuticas, serfa preferible conseguir la liberacion y absorcion entericas.

Las sustancias de particular interes son la curcumina, un extracto de compuesto polifenolico de la rafz de Curcuma longa, y la berberina, un alcaloide extrafdo de plantas del genero Berberis con un sistema anular de isoquinolina, que han demostrado propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias interesantes y bien documentadas en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias inflamatorias, como la artritis y la colitis.

Estas sustancias, a pesar de sus potenciales farmacologicos y terapeuticos inequfvocos, tienen en la actualidad una aplicacion clfnica limitada, porque, en estudios in vitro (CACO-2) e in vivo (en voluntarios humanos sanos), muestran una muy baja biodisponibilidad despues de la ingesta oral, lo que da como resultado un pico en plasma muy bajo y una Cmax y un AUC bajos.

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Las principales razones comunes para la muy baja biodisponibilidad de la curcumina y la berberina se deben al menos a lo siguiente:

• extrusion de la sustancia por la accion de la bomba p-gp de enterocitos;

• biotransformacion de las sustancias por los citocromos de enterocitos (CYP3A);

• reduccion del flujo trans-mural relacionado con las "uniones estrechas".

El documento KR100750727 describe formulaciones que comprenden una mezcla binaria de quitosano y N- acetilcistefna, producida por condensacion de N-acetilcistefna con quitosano por formacion de enlaces covalentes. Dicha mezcla binaria demuestra excelentes propiedades de disolucion, asf como la capacidad para reducir la eficacia de las especies de oxfgeno activo y para absorber los lfpidos del intestino, reduciendo su absorcion sistemica, disminuyendo asf la concentracion de colesterol en la sangre.

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar una composicion para la ingesta oral que permita la liberacion y absorcion en el tracto enterico de sustancias normalmente con poca o ninguna biodisponibilidad, en particular de curcumina y berberina.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion que permita la absorcion de sustancias a nivel enterico, modulando los principales mecanismos bioffsicos y bioqufmicos que degradan estas sustancias, o que impiden su paso a traves del epitelio intestinal.

Otra tarea de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para la produccion de una formulacion farmaceutica o nutraceutica, o de un suplemento dietetico, que permitan la liberacion y absorcion en el tracto enterico de sustancias, que normalmente tienen poca o ninguna biodisponibilidad.

De acuerdo con la presente invencion, estos objetivos, y otros que seran mas evidentes mas adelante, se consiguen mediante una composicion que comprende:

a) un nucleo que comprende al menos un principio activo con baja biodisponibilidad, un polisorbato y una sal de N- acetilcistefna-quitosano y

b) una capa de recubrimiento enterico que incluye el nucleo a) en donde dicha sal de N-acetilcistefna-quitosano comprendida en el apartado a) se obtiene mediante la protonacion del grupo amino libre del quitosano por medio de N-acetilcistefna, comportandose como un acido.

Estos objetos tambien se han conseguido a traves de dicha composicion para su uso como medicamento. De acuerdo con la presente invencion, estos fines tambien se han conseguido a traves de un suplemento dietetico o composicion nutraceutica que comprenden dicha composicion.

Estos objetivos se alcanzaron tambien mediante un metodo para la formacion de dicha composicion que comprende las etapas de:

i. preparacion de una solucion o una dispersion acuosa que comprenden al menos un polisorbato a una concentracion entre 1 y 30% en peso/peso total de la solucion y una sal de N-acetilcistefna-quitosano en donde la N- acetilcistefna y el quitosano estan a una concentracion entre 0,01 y 3% en peso/peso total de la solucion;

ii. granulacion en humedo de una composicion que comprende al menos el principio activo con baja biodisponibilidad con la solucion o dispersion acuosa obtenidas en la etapa i.;

iii. secado hasta una peso constante y tamizado del producto granulado obtenido en la etapa ii;

iv. formacion del nucleo a) de la composicion por compresion del solido obtenido en la etapa iii; y

v. recubrimiento del nucleo a) obtenido en la etapa iv con una capa enterica gastro-resistente.

En otro aspecto, a continuacion se describe una sal de quitosano salificada con N-acetilcistefna, es decir una sal de N-acetilcistefna-quitosano.

En el contexto de la presente invencion, una biodisponibilidad baja significa una biodisponibilidad por debajo de 30%, o 20%, o 10% o 5%.

En el contexto de la presente invencion, el termino quitosano significa un polisacarido de origen natural o semisintetico, y sus formas ionizadas, con un peso molecular superior a 5000 D (Dalton o unidades de masa

molecular) y un grado de desacetilacion superior a 90%. Preferiblemente, el peso molecular de quitosano en la

composicion de la presente invencion es de 100.000 Dalton, o superior.

En el contexto de la presente invencion, la expresion "aceites esenciales" se refiere a productos obtenidos por extraccion de las "esencias" de material vegetal adecuado.

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Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "capa de recubrimiento enterico" significa una capa que forma una barrera continua, que consiste en, o esta recubierta con sustancias que son resistentes a los jugos gastricos acidos y se disuelven en el tracto intestinal superior. Dicha capa de recubrimiento enterico puede aplicarse directamente sobre el nucleo (p. ej., para obtener un comprimido o granulo con pelfcula) o puede estar en forma de una envuelta (p. ej., una cubierta de capsula dura o blanda con recubrimiento enterico que comprende el nucleo a) que incluye dicho nucleo en forma de polvo o de uno o mas comprimidos, granulos o microgranulos.

En el contexto de la presente invencion, "pelfcula enterica" significa una pelfcula que se aplica directamente sobre el nucleo, es decir, se adhiere al nucleo, y es capaz de proteger la composicion de la accion de los jugos gastricos en el estomago y de liberar el principio activo en el intestino superior.

En el contexto de la presente invencion, "extracto titulado" significa un extracto de una planta que contiene una cantidad normalizada de una sustancia particular, medida mediante uno de los metodos analfticos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica (p. ej., referentes a Farmacopeas de los Estados Unidos, Reino Unido o Europea).

A menos que se especifique lo contrario, en el contexto de la presente invencion, los porcentajes de los componentes de una mezcla se refieren al peso del componente sobre el peso total de la mezcla (p/p).

Segun se utiliza en la presente memoria, se entiende que el termino "comprende", referido a un componente de una composicion, abarca tambien la posibilidad de que dicho componente constituya el 100% de la composicion, es decir, una mezcla "que comprende" el componente A tambien puede consistir en 100% de A.

En un aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende:

a) un nucleo que comprende al menos un principio activo con una baja biodisponibilidad, un polisorbato y una sal de N-acetilcistefna-quitosano;

b) una capa de recubrimiento enterico que incluye el nucleo a) en donde dicha sal de N-acetilcistefna-quitosano comprendida en a) se obtiene mediante la protonacion del grupo amino libre del quitosano por medio de N- acetilcistefna, comportandose como un acido.

Se encontro sorprendentemente que la composicion de acuerdo con la invencion permite la liberacion y absorcion por las paredes intestinales de principios activos normalmente poco biodisponibles.

Sin pretender estar limitado por la teorfa, se cree que las ventajas de la composicion de la presente invencion estan, al menos parcialmente, relacionadas con la presencia de la sal de quitosano, que ejerce por su parte una modulacion de las uniones estrechas del epitelio enterico, con una sustancia que tiene una accion mucolftica, es decir la N-acetilcistefna (NAC).

El quitosano es un polisacarido compuesto de unidades repetitivas de N-acetilglucosamina y D-glucosamina. El quitosano puede formar geles macrocoloidales acuosos despues de la acidificacion. Dicha gelificacion se produce despues de la protonacion de los grupos amino libres de la N-acetilglucosamina, que sigue a la formacion de una sal de polication de amonio. Precisamente este proceso de polisalificacion determina la solubilidad en agua del quitosano y su relativa capacidad de gelificacion.

La NAC, que se comporta como un acido, protona el grupo amino libre del quitosano que forma la sal. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "sal de N-acetilcistefna-quitosano" se refiere al producto de esta reaccion acido-base formadora de sal. Este proceso implica solamente la formacion de enlaces ionicos (es decir entre una especie cargada positivamente y una cargada negativamente), en ausencia de enlaces covalentes. Se encontro que la forma ionizada del quitosano ejerce una interaccion con las uniones estrechas que es muy superior a la ejercida por la forma no ionica.

El quitosano tiolado o conjugado, definido como moleculas producidas por condensacion de NAC con quitosano por formacion de enlaces covalentes (promovidos por agentes de condensacion tales como las carbodiimidas) ya han sido descritos en la tecnica anterior como potenciadores de la absorcion intestinal (Schmitz, T. et al. Drug Deliv. 2008,15, 245; Chen, H. et al., J. Liposome Res. 2011, publicacion electronica antes de impresion; Sakloesakun, D. et al. Drug Dev. Ind. Pharm. 2011,37, 648; Schmitz, T. et al. Int. J. Pharm. 2008, 347, 79).

La sal ionica en la composicion de la invencion es diferente de los compuestos descritos en la tecnica anterior, p. ej. que derivan de la union covalente de NAC a quitosano, por formacion de enlaces amida entre el grupo amino primario del polfmero y el grupo acido carboxflico de NAC (Hombach, J. et al. Eur. J. Pharm. Sci. 2008, 33, 1-8).

Una de las ventajas de la sal en las composiciones de la presente invencion consiste en proporcionar quitosano en la forma cationica, que es soluble en agua y puede actuar como agente mucolftico sobre la secrecion intestinal, con una eficacia superior en comparacion con los compuestos conjugados (con enlaces covalentes entre NAC y quitosano) de la tecnica anterior.

En la sal de N-acetilcistefna-quitosano en la composicion de acuerdo con la presente invencion, la razon en peso de

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quitosano y NAC puede ser de 1:1 a 3:1, en particular de 2 a 1. Preferiblemente, en la sal de N-acetilcistefna- quitosano en la composicion de la invencion, la N-acetilcistefna esta en una cantidad tal que una solucion acuosa obtenida disolviendo dicha sal en agua y que contiene 1% p/p de quitosano tiene un pH entre 3,5 y 4,0.

La presencia de al menos un polisorbato facilita adicionalmente la penetracion en la circulacion de sustancias tomadas por via oral. Los tensioactivos de polisorbato son lfquidos oleosos, derivados de sorbitan (un derivado de sorbitol) pEGilado por esterificacion con acidos grasos, que se utilizan ampliamente en la formulacion de emulsion de aceite/agua, de detergentes a base de tensioactivos y de formas topicas. Los polisorbatos actuan como promotores de la absorcion que ejercen una accion de formacion de micelas de los ingredientes activos insolubles o poco solubles en agua y que actuan como "tensioactivos celulares", alterando realmente la permeabilidad de la membrana. En la composicion de la presente invencion, los polisorbatos contribuyen de este modo a hacer que el ingrediente activo este disponible mas libremente para la absorcion intestinal.

Como ejemplos no limitantes, la composicion de la presente invencion puede presentarse en una de las siguientes formas: un comprimido con pelfcula, un granulo con pelfcula, una capsula que comprende granulos o microgranulos con pelfcula enterica, o una capsula dura o blanda con un recubrimiento gastro-resistente que comprende el nucleo a) en forma de polvo, granulos, microgranulos, solucion o suspension.

Preferiblemente, en la composicion de acuerdo con la invencion la capa b) es una pelfcula enterica que recubre directamente dicho nucleo a), es decir, una pelfcula que incluye el nucleo y se aplica en contacto directo con el mismo.

Preferiblemente, en la composicion de acuerdo con la invencion, el al menos un principio activo con baja disponibilidad se selecciona entre trans-resveratrol, melatonina, acidos grasos omega-3, terpenos esteroideos como los acidos boswelicos, terpenos no esteroideos, saponinas, aceites esenciales, polifenoles tales como curcumina, berberina y mezclas de los mismos, peptidos y oligopeptidos tales como glutation. Mas preferiblemente, en la composicion de acuerdo con la invencion al menos el principio activo con baja disponibilidad es la curcumina o la berberina. El contenido de ingrediente activo en la composicion en forma de un comprimido de acuerdo con la invencion puede estar entre 0,01 y 1000,0 mg, preferiblemente entre 50 y 500 mg, mas preferiblemente entre 100 y 300 mg por comprimido.

El polisorbato incluido en el nucleo a) de la composicion de la presente invencion puede ser uno de los polisorbatos disponibles comercialmente, tales como polisorbato 20, 40, 60, 65, 80 y mezclas de los mismos, en una cantidad entre 20 y 300 mg por comprimido individual. Preferiblemente, en la composicion de acuerdo con la invencion, el polisorbato es polisorbato 80.

Preferiblemente, el nucleo a) de la composicion de acuerdo con la invencion comprende tambien un extracto de Citrus x paradisi titulado a al menos 40% en peso/peso total del extracto de Citrus x paradisi en bioflavonoides, y titulado especfficamente en Naringina y Naringenina, y un extracto de Piper nigrum titulado a 95% en peso/peso total del extracto de Piper nigrum en piperina.

Los extractos de pomelo y pimienta negra modulan la actividad de varias enzimas responsables de la biotransformacion de los xenobioticos y en particular del citocromo P450 hepatico y CYP3A de tipo intestinal.

Estos extractos pueden estar en forma de fitocomplejos, es decir, de una mezcla que comprende todas las sustancias extrafbles de la planta que estan dotadas de, y que contribuyen a conseguir, una actividad biologica especffica.

De hecho, se sabe que algunas sustancias son capaces de interaccionar con la bomba de P-gp localizada en la membrana externa del enterocito inhibiendola. Este efecto da como resultado un aumento del pase a la circulacion entero-portal y una disminucion del metabolismo por citocromo intestinal y hepatico, lo que conduce a una mayor eficacia de los ingredientes activos tomados oralmente. Este mecanismo de accion es realizado en particular por algunos flavonoides del genero Citrus.

Tales complejos de flavonoides son tambien capaces de inhibir la enzima CYP-3A de los enterocitos, y en algunos casos tambien la del hfgado, reduciendo de este modo la biotransformacion pre-sistemica.

Se encontro que tambien a traves de este mecanismo, es posible inducir con las composiciones de acuerdo con la presente invencion un aumento en las concentraciones en plasma de sustancias que de otro modo serfan biotrasformadas masivamente antes de entrar en la circulacion.

El nucleo a) de la composicion de acuerdo con la presente invencion se somete a un proceso de adicion de pelfcula, por ejemplo en una bandeja de recubrimiento, con una dispersion de una sustancia capaz de formar una pelfcula resistente a los jugos digestivos, para obtener la gastro-proteccion. Las sustancias activas y las destinadas a actuar como promotores de la absorcion enterica se liberan realmente solo en los tractos enterico y gastrico. La liberacion temprana de quitosano en el ambiente gastrico, de hecho, harfa que el polfmero se hinchara, debido al entorno altamente acido por el acido clorhfdrico, e inducirfa la formacion de un gel. Los principios activos y otras sustancias podrfan ser liberados en el estomago y ser degradados. Preferiblemente, el recubrimiento enterico (b) comprende al

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menos uno o una combinacion de derivados de acido metacrflico y metacrilato de metilo (como ejemplos no limitantes: Eudragit™ L100, Eudragit™ L12,5, Eudragit™ S100, Eudragit™ S12,5), goma laca (Shellac™) o metil celulosa y sus derivados. Preferiblemente, el recubrimiento b) comprende o consiste en goma laca (Shellac™). Dicho recubrimiento se puede conseguir recubriendo con pelfcula el nucleo a) con una dispersion de goma laca en agua.

Preferiblemente, la composicion de acuerdo con la invencion se encuentra en forma de un granulo enterico, en donde el nucleo a) esta incluido en la pelfcula enterica b), o de una capsula gastro-resistente en donde dicho nucleo a) esta incluido en una envuelta (capa b) dura o blanda que esta recubierta entericamente).

En otra realizacion preferida, la composicion de la presente invencion se encuentra en forma de comprimido y comprende una capa c), externa al recubrimiento b), que comprende al menos un excipiente adecuado para la compresion. Preferiblemente, dicho excipiente de la capa externa se selecciona entre almidon, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, fosfato calcico, talco, sflice y mezclas de los mismos.

En la composicion de acuerdo con la presente invencion, el nucleo a), el recubrimiento b) y la capa exterior c) pueden comprender excipientes y/o ingredientes activos adicionales ademas de los enumerados anteriormente.

Los ejemplos no limitantes de ingredientes adicionales son: fosfato de calcio dibasico anhidro, sflice coloidal, sflice amorfa, sorbitol y almidon.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona dicha composicion que comprende el nucleo a) y el recubrimiento b) como se ha descrito anteriormente para su uso como medicamento.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona un suplemento dietetico o una composicion nutraceutica que comprende la composicion que comprende el nucleo a) y el recubrimiento b) como se ha descrito anteriormente.

La administracion de dicha composicion o suplemento dietetico a un sujeto da como resultado ventajosamente un grado de absorcion enterica de sustancias escasamente biodisponibles que es mas alto comparado con el conseguido a traves de las formulaciones de la tecnica anterior.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para la preparacion de dicha composicion que comprende las etapas de:

i. preparar una solucion o dispersion acuosa que comprende al menos un polisorbato a una concentracion entre 1 y 30% en peso/peso total de la solucion y una sal de N-acetilcistefna-quitosano, en donde la N-acetilcistefna y el quitosano se encuentran a una concentracion entre 0,01 y 3% en peso/peso total de la solucion;

ii. granular en humedo una composicion que comprende al menos un principio activo con baja biodisponibilidad con la solucion o dispersion acuosa obtenidas en la etapa i;

iii. secar hasta un peso constante y tamizar el producto granulado obtenido en la etapa ii;

iv. formar el nucleo a) de la composicion por compresion del solido obtenido en la etapa iii;

v. recubrir el nucleo a) obtenido en la etapa iv con una capa enterica gastro-resistente.

En la sal de N-acetilcistefna-quitosano de la etapa i, la cantidad de N-acetilcistefna es tal que una solucion acuosa obtenida disolviendo dicha sal en agua y con un contenido de 1% p/p de quitosano tiene un pH entre 3,5 y 4,0.

Preferiblemente, en el metodo de acuerdo con la invencion, la granulacion de la etapa ii se realiza combinando la solucion o dispersion acuosa obtenidas en la etapa i y una composicion que comprende la sustancia activa con baja biodisponibilidad, un extracto de Citrus x paradisi titulado a al menos 40% en peso/peso total del extracto de Citrus x paradisi en bioflavonoides, y titulado especfficamente en Naringina y Naringenina, y/de un extracto de Piper nigrum titulado a 95% de piperina en peso/peso total del extracto de Piper nigrum y, en caso necesario, N- acetilcistefna y quitosano en cantidades tales que se obtiene en una unica unidad de dosificacion una cantidad de quitosano entre 1 y 150 mg, una cantidad de N-acetilcistefna entre 1 y 75 mg, una cantidad de extracto de pomelo (Citrus x paradisi) entre 1 y 300 mg, y una cantidad de extracto de Piper nigrum entre 1 y 30 mg.

Preferiblemente, dicha composicion que comprende los extractos activos de baja biodisponibilidad de pomelo y pimienta y opcionalmente quitosano y N-acetilcistefna comprende ademas al menos un excipiente para productos farmaceuticos, nutraceuticos y/o alimenticios.

El recubrimiento del nucleo a) de la etapa iv del metodo de acuerdo con la presente invencion se puede realizar, por ejemplo, en una bandeja de recubrimiento con una solucion o dispersion en agua de un agente capaz de formar una pelfcula enterica, preferiblemente con una dispersion acuosa al 25% p/p de goma laca (SHELLAC™).

Preferiblemente, en el metodo de la invencion, la etapa de granulacion en humedo ii se lleva a cabo mediante un procedimiento de lecho fluido.

La composicion en forma de granulos se puede obtener directamente mediante un metodo que comprende las etapas i-v como se describio anteriormente.

Preferiblemente, para la formacion de la composicion en forma de comprimido, el metodo de acuerdo con la invencion comprende adicionalmente:

5 vi. anadir al nucleo recubierto con pelfcula obtenido en la etapa v al menos un excipiente adecuado para la formacion de comprimidos;

vii. comprimir la composicion obtenida en la etapa vi para obtener la composicion en forma de comprimido.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir realizaciones particulares de la presente invencion, sin pretender limitar su alcance.

10 Ejemplo 1

Preparacion del producto granulado que contiene el ingrediente activo.

Ingrediente activo:

Curcuma Longa (Extracto seco, 95% p/p de Curcumina) 200 mg por comprimido Etapa 1

15 Nucleo del comprimido granular:

Se prepara una mezcla de polvos secos que contiene:

Extracto seco de Curcuma Longa (95% p/p de curcumina) 100 g.

Quitosano HD 100 Malla 75,0 g N-acetilcistefna 25,0 g

20 Extracto seco de semilla de pomelo (50% p/p de bioflavonoides) 25,0 g (opcional).

Extracto seco de fruto de pimienta negra (95% p/p de Piperina) 2,50 g (opcional).

Almidon de mafz 75,0 g blanco.

Tot 302,5 g.

Etapa 2

25 La solucion de granulacion se obtiene como sigue:

Se introduce agua desionizada para osmosis inversa (120 ml) en un matraz conico de 250 ml y se dispersan bajo agitacion con una placa magnetica 2 g de quitosano (PM > 5000 D, grado de desacetilacion > 90%); se anaden 1,0 gramos de NAC para obtener un pH entre 3,5 y 4,0, medido con un medidor de pH, verificando simultaneamente la solubilizacion del quitosano y la formacion concomitante de un gel. Con la solucion asf obtenida se combinan 29,0 30 gramos de polisorbato 80 hasta que se obtiene una dispersion completa, obteniendose un sistema translucido de color amarillo claro. A continuacion se anade agua desionizada (obtenida mediante osmosis inversa) para obtener un volumen final de 200 ml.

Etapa 3

Granulacion

35 La mezcla de polvos obtenida en la etapa 1 (302,5 g) se coloca en un vaso de precipitados de plastico y la solucion de granulacion obtenida en la Etapa 2 se anade bajo agitacion mecanica constante en porciones subsiguientes, verificando el desencadenamiento progresivo del procedimiento de granulacion (solucion de granulacion total anadida a la mezcla en polvo: 140 g). Despues de obtener el nucleo granulado, este se seca en un horno ventilado a 50°C hasta peso constante (anhidrificacion). El producto granulado seco se tamiza a continuacion. Finalmente se 40 obtienen granulos finos con un peso de 414,5 gr.

Etapa 4

Obtencion de comprimidos

Los granulos asf obtenidos (248,7 g) se anaden a continuacion a celulosa microcristalina (12,3 g), hidrogenofosfato de calcio anhidro (Fujicalin) (60,0 g), celulosa microcristalina (CEOLUS KG802) (30,0 g), estearato de magnesio (5,4

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Ejemplo 2

1. Introduccion y objetivo

La absorcion intestinal es un proceso complejo en el que se distinguen dos tipos de transporte: el llamado transporte transcelular y paracelular pasivo y el transporte activo o difusion facilitada, mediada por receptores especfficos.

El proceso puede estar influenciado por el metabolismo intestinal, por la accion de los transportadores de eflujo, asf como por algunas caracterfsticas del compuesto qufmico que debe ser absorbido, incluyendo el peso molecular, el tamano y la conformacion de la molecula, el grado de ionizacion, el caracter lipofilo, la solubilidad y la disolucion en el contenido gastrico. Para predecir la absorcion intestinal y el transporte a traves de la mucosa, se propone un modelo de estudio in vitro utilizando la monocapa de celulas Caco-2, cuyos protocolos estan siendo validados como una alternativa a los ensayos con animales en ECVAM (Le Ferrec E. et al., 2001 ECVAM workshop 46).

La buena correlacion in vivo/in vitro para el transporte pasivo de farmacos caracteriza la relevancia y diseminacion del modelo Caco-2 en el estudio de absorcion intestinal.

La lfnea Caco-2 es ampliamente utilizada como un modelo in vitro de epitelio intestinal para estudios de toxicidad de la barrera y para el escrutinio cualitativo de la absorcion intestinal, especialmente en la industria farmaceutica durante las etapas de investigacion y desarrollo para la identificacion y optimizacion de compuestos principales (Garate M.A. et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 1671; Artursson, P, y Borchardt R.T. "Intestinal drug adsortion and metabolism in cell cultures: Caco-2 and beyond". Pharma. Res. 1997, 14, 1655-1658). Las celulas se hacen crecer sobre soportes porosos especfficos alojados en pocillos para cultivos celulares, que permiten tener dos sectores distintos: un sector apical, correspondiente al lumen intestinal in vivo, y un sector basolateral correspondiente al segmento de la circulacion sangufnea y linfatica del organismo.

La diferenciacion se lleva a cabo en 21 dfas: las celulas diferenciadas Caco-2 en este momento forman un epitelio continuo con uniones estrechas funcionales y microvellosidades.

El ensayo de absorcion en el modelo Caco-2 se utiliza para la evaluacion del pase intestinal pasivo de la composicion nucleo de acuerdo con la invencion en forma de un producto granulado que comprende Curcuma dispersado en agua (en lo sucesivo Composicion A) a dosis que se definen basandose en un ensayo de citotoxicidad preliminar.

2. Diseno experimental

Antes de someter a ensayo la tasa de permeabilidad de la sustancia de ensayo, se evalua la citotoxicidad sobre la monocapa de Caco-2 mediante el ensayo MTT (de acuerdo con los procedimientos internos, 2 ensayos realizados despues de 2h y 1h de tratamiento respectivamente) a diferentes concentraciones por triplicado para la definicion de la dosis no citotoxica:

1) PRIMERA RONDA: 0,25%/0,5%/1% > 2 h de tratamiento

2) SEGUNDA RONDA: 0,025%/0,05%/0,1%/0,25% > 1 h de tratamiento.

La concentracion elegida para la absorcion intestinal de curcumina es de 0,25% p/p de producto granulado que contiene 0,052% p/p de curcumina (1,404 mM), con 1 hora de tratamiento. El producto granulado que contiene curcuma (sin pelfcula) de la composicion de acuerdo con la presente invencion (como el obtenido en la etapa 3 del Ejemplo 1, en lo sucesivo indicado como Composicion A) se somete a ensayo para el pase intestinal, despues de la disolucion/suspension en tampon HBSS-MES al 1% (tampon a pH 6,5 utilizado en la parte apical).

El pase a traves de una monocapa de celulas Caco-2 de la Composicion A a una concentracion no citotoxica se controla en momentos definidos (0 min, 15 min, 30 min y 60 min). El lfquido del compartimento basolateral se recoge y se cuantifica la sustancia activa de interes (curcumina) por medio de HPLC.

Los siguientes parametros se evaluan para verificar la integridad de la monocapa y para medir los cambios de permeabilidad que se producen despues del pase intestinal:

• Ensayo de integridad de la barrera, midiendo la resistencia transepitelial (TEER);

• Pase paracelular con evaluacion de la toxicidad de la sustancia de ensayo sobre la integridad de la funcion de la barrera mediante el uso de un marcador del pase paracelular (amarillo Lucifer) utilizando la concentracion no citotoxica mas alta de acuerdo con los resultados del analisis MTT.

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3. Materiales

3.1. Sistema de ensayo

3.1.1 Lfnea celular CACO-2

La lfnea Caco-2 consiste en celulas derivadas de celulas intestinales (adenocarcinoma colorrectal humano) proporcionadas por la ATCC.

Las celulas Caco-2 crecen en monocapa en medio DMEM que contiene 4,5 g/l de glucosa con la adicion de FBS al 10%, aminoacidos no esenciales al 1%, glutamina 4 mM, Hepes 10 mM y antibioticos (Pen/Estrep).

Las celulas alcanzan la confluencia en aproximadamente 6 dfas y alcanzan una fase estacionaria en 10 dfas. La diferenciacion se completa en aproximadamente 21 dfas. Las celulas diferenciadas tienen altos niveles de fosfatasa alcalina, aminopeptidasa e isomaltasa.

La diferenciacion estructural y funcional de las microvellosidades se asocia con la polarizacion de la monocapa despues de la confluencia. La polaridad tambien es evidente para la presencia de uniones estrechas que se forman durante la diferenciacion.

La integridad de la monocapa se confirma por la baja permeabilidad de la monocapa al manitol o al amarillo Lucifer (Hidalgo et. al. "Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model for intestinal epithelial permeability" Gastroenterology 1989, 96, 736-749 y Le Ferrec E. "In vitro models of the intestinal barrier" ECVAM workshop 46, ATLA 2001, 29,649-668).

3.1.2 Condiciones de cultivo y uso del sistema de ensayo

Las celulas (150.000/inserto, contadas utilizando una camara Buerker) se cultivan en placa en insertos con filtro de PET (Millipore, 10 mm de diametro con un tamano de poro de 0,4 mm) para placas de 12 pocillos y se incuban a 37°C con CO2 al 5% y se hacen crecer durante 21 dfas. Se anaden 0,5 ml adicionales de medio sobre el inserto y se anaden 1,5 ml de medio en la placa.

El medio se cambia en dfas alternos. A partir del dfa 21 el analisis morfologico revela una diferenciacion completa de las celulas Caco-2.

3.2.1 Instrumental

Escala Analftica XS 204 (Mettler-Toledo)

Incubadora con CO2 Hera Cell (Heraeus)

Autolector de microplaca M200-Infinite (Tecan)

ERS-Millicell (Milipore)

Microscopio DM-IL (Leica)

Camara de Buerker (Marienfeld)

3.2.2 Reactivos DMEM 12-614F LONZA GLUTAMINA BE17-605E LONZA PEN/STREP DE17-602E LONZA SOLUCION NEAA 100X BE13-114E LONZA FBS DE14-701F LONZA

HBSS BE10-527F LONZA HEPES 1M 17-737F LONZA MES M2933 SIGMA AMARILLO LUCIFER L0144 SIGMA

HBSS - Solucion APICAL MES 1% (Preparada en laboratorio y utilizada en el plazo de una semana)

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Solucion HBSS - Solucion HEPES BASOLATERAL 1% (Preparada en laboratorio y utilizada en el plazo de una semana)

4. Metodos

Las ensayos se llevan a cabo en un centro de ensayo certificado por GLP.

4.1 Analisis MTT: Citotoxicidad de las sustancias de ensayo en la linea Caco-2

4.1.1 Principio del metodo

Se evalua el efecto citotoxico potencial de las sustancias en celulas Caco-2 en fase proliferativa utilizando el analisis MTT.

El analisis MTT se considera un patron internacional para la cuantificacion de la citotoxicidad (ISO 10993-5). El metodo permite la cuantificacion de un efecto citotoxico inducido por el producto a traves de la medicion de la viabilidad celular. La citotoxicidad se cuantifica midiendo la disminucion en la viabilidad celular en comparacion con un control negativo no tratado. Se basa en la reaccion metabolica que se produce entre la sal de tetrazolio (MTT) y las enzimas mitocondriales (succinato deshidrogenasa) despues de que se produzca el contacto con el producto para diferentes tiempos de tratamiento: solamente la celula viva puede transformar la sal de tetrazolio en el derivado insoluble (formazano). La reaccion se revela mediante la formacion de una coloracion purpura en la base del inserto.

El derivado de color purpura se extrae en isopropanol y se lleva a cabo la cuantificacion a traves de una espectrofotometrfa a 570 nm.

4.1.2 Procedimiento

Se evaluan las siguientes concentraciones:

3) 0,25% / 0,5% / 1 % (PRIMERA RONDA MTT): 2 horas de tratamiento

4) 0,025%/ 0,05% / 0,1% / 0,25% (SEGUNDO ENSAYO MTT): 1 h de tratamiento Las celulas Caco-2 se cultivan en placa en una placa MultiWall de 96 pocillos (por triplicado) a una densidad celular de 120.000 celulas por pocillo (camara de recuento celular por Buerker).

Despues de la incubacion durante 1 h o 2 h con la sustancia que se iba a someter a ensayo, se evalua el contenido en formazano para cada pocillo por medio de espectrofotometrfa a una longitud de onda de 570 nm (A).

Despues de realizar la sustraccion del blanco, se obtiene el % de vitalidad con respecto al control no tratado de acuerdo con la formula:

% VITALIDAD = (D.O. TRATADO / OR CONTROL NO TRATADO) * 100

4.2 Analisis para la resistencia electrica transepitelial (TEER): verificacion de la integridad de la funcion de la barrera.

4.2.1 Principio del metodo

La resistencia electrica transepitelial (TEER) es una medida directa de la funcionalidad de la barrera cutanea: refleja la resistencia global del tejido debido tanto a su espesor como a su estructura. La TEER mide la integridad de la barrera a nivel de las uniones estrechas.

El valor de la resistencia electrica trans-epitelial (TEER) de la monocapa, que consiste en celulas Caco-2 diferenciadas, representa una indicacion del nivel de integridad de la monocapa, por lo tanto de la misma formacion de las uniones estrechas entre los enterocitos. La medicion del valor de la resistencia transepitelial (expresada en Q * cm2) se realiza utilizando un voltfmetro-ohmiometro (Millicell ERS) (rango 0-2000 Q). Los valores de TEER de la monocapa diferenciada varfan en funcion de la linea celular y son aceptables por encima de 150-200 Q* cm2.

4.2.2 Procedimiento

En una monocapa diferenciada de celulas Caco-2, despues de 21 dfas de cultivo, se evalua TEER realizando una medicion de inserto a traves de un electrodo especial, colocando el extremo corto del electrodo dentro del inserto en 0,5 mL de medio. La parte larga del electrodo se sumerge en 1,5 mL de medio en el pocillo que contiene el inserto.

4.3 Analisis con amarillo Lucifer: verificacion de la integridad de las uniones celulares en presencia de la sustancia que se va a evaluar.

4.3.1 Principio del metodo

El amarillo Lucifer es un marcador fluorescente impermeable a la membrana celular.

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Se utiliza para estudiar la permeabilidad de una sustancia a nivel paracelular.

Cuando las uniones no estan danadas, el amarillo Lucifer tiene una permeabilidad muy baja.

4.3.2 Procedimiento

Los experimentos de transporte se realizan sobre una monocapa de celulas Caco-2 aplicando a nivel del compartiiriento apical del inserto 100 pmoles/L de amarillo Lucifer (LY) junto con la sustancia de ensayo (la mas alta no citotoxica en el ensayo de MTT), disuelto en tampon HBSS-MES al 1% (0,5 mL). Se anaden 1,5 mL de tampon HBSS-Hepes al 1% a nivel basolateral.

El transporte de LY se evalua como el pase desde el compartimento apical al compartimento basolateral despues de un perfodo de incubacion definido de 1 h a 37°C.

La lectura se realiza en el espectrofluorometro (TECAN) con una excitacion a 428 nm y una emision a 535 nm. La medicion de fluorescencia (UFR) se realiza a los niveles apical y basolateral y el flujo y la permeabilidad del marcador se calculan de acuerdo con las siguientes formulas:

Flujo LY = (UFR BL / UFR AP) x 100

Permeabilidad aparente (PAPP, cm /seg) =

(Concentracion BL / Concentracion AP) x (Volumen BL / area x tiempo)

Para derivar la concentracion de LY en el compartimento basolateral, se utiliza una curva patron que se obtiene a partir de diferentes concentraciones de LY en la placa de 96 pocillos (100 pl por triplicado):

LY: 0-6-12 pM (concentraciones bajas de patron)

LY: 0-6,12,25-100 pM (altas concentraciones de patron)

En una monocapa intacta, el flujo de LY es menor de 10% y el coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) es menor de 2,3 * 10-6 cm/seg (controles internos).

4.4 PRUEBA DE PASE INTESTINAL

4.4.1 Principio del metodo

Las celulas Caco-2 desarrolladas en forma de monocapa sobre un soporte artificial permeable reproducen la capa epitelial intestinal (monocapa de celulas que estan polarizadas y acopladas por medio de uniones estrechas). El flujo a traves de la monocapa permite establecer la permeabilidad de una sustancia.

4.4.2 Procedimiento

Despues de 21 dfas de crecimiento en el inserto, las celulas diferenciadas muestran un lado apical, correspondiente al lumen intestinal in vivo, y uno que corresponde al compartimento basolateral de la circulacion sangufnea y linfatica del organismo.

El medio de cultivo se aspira desde todas las monocapas celulares antes de los experimentos de permeabilidad. Todas las monocapas de celulas se lavan una vez con solucion de HBSS (Solucion Salina Equilibrada de Hank) y se deja que se equilibren a 37°C durante 20 min. La sustancia de ensayo (composicion A) se prepara extemporaneamente en 1X HBSS que contiene MES al 1% (pH 6,5 para reproducir la baja acidez duodenal) a una concentracion de 0,25% p/p de la Composicion A. La solucion de ensayo se anade a la monocapa desde el lado del donante (0,5 ml por triplicado), es decir, desde la region apical. Paralelamente, la misma cantidad de sustancia se divide en partes alfcuotas iguales y representa la muestra apical en el punto temporal = 0 minutos (0'AP). En el lado receptor de la monocapa se anaden 1,2 mL de 1X HBSS-Hepes al 1% (pH 7,4). Las placas asf tratadas se colocan en una incubadora a 37°C durante un perfodo de incubacion definido (15-30-60 minutos).

En correspondencia de cada punto temporal de la cinetica definida, se recogen muestras del lado receptor de las monocapas (0,6 mL). Los estudios se realizan en 60 min. Las muestras se toman a los 15, 30, 60 minutos (definido como basolateral BL). Los volumenes del compartimento basolateral se mantienen constantes, restaurando el 1X HBSS despues de cada toma de muestras. Al final de los tratamientos, se recupera la cantidad de sustancia que queda en la porcion apical (T = 60'AP) y se solubilizan las celulas en 0,5 mL de agua destilada, se resuspenden y se conservan a 4°C para su analisis y para la determinacion del equilibrio de masas.

El analisis de la cantidad de curcumina se realiza por medio de HPLC-UV.

Los coeficientes de permeabilidad aparente Papp (cm/seg) se determinan mediante la siguiente formula:

Papp = dQ / (dt x A x C0)

en donde:

• DQ/dt es la pendiente del perfil de permeabilidad de la curcumina en el tiempo (segundos) a traves de la monocapa de celulas Caco-2 (masa transferida por unidad de tiempo)

• A es el area de superficie del inserto (1 cm2)

5 • C0 es la concentracion del ensayo inicial del donante

Con los resultados obtenidos a partir del analisis de HPLC, el calculo del equilibrio de masa se realiza como sigue:

% EQUILIBRIO DE MASA TOTAL = (C 60' AP * 0,5 ml * 100) / (Cd * 0,5 ml + C 60' BL + C sedimento * 0,5 ml)

• C60' AP: concentracion final de curcumina encontrada en el compartimento apical despues de 60 minutos

• C60' BL: concentracion de curcumina en el compartimento basolateral despues de 60 minutos

10 • Cd: Concentracion inicial (donante) aplicada al nivel superior que tiene en cuenta el factor de dilucion dentro del

intervalo de tiempo pertinente.

4.4.3 Metodo de calculo

Utilizando las formulas matematicas descritas por Arturrson, se calculan las relaciones entre concentraciones de sustancias en los compartimentos basolateral (receptor) y apical (donador) en cada momento de muestreo.

15 Los valores de "fraccion acumulada de farmaco transportado" (cm) se calculan a partir de los datos de concentracion encontrados experimentalmente a nivel basolateral (Tavelin S. "Application of epithelial cell culture in studies of drug transport" Methods in Molecular Biology vol. 188 "Epithelial cell culture protocols"; Le Ferrec E. "In vitro models of the intestinal barrier" ECVAM workshop 46. ATLA 2001, 29, 649-668).

20 El resultado de la sustancia cuantificada en cada compartimento se muestra en la siguiente tabla 1:

Tabla 1

COMPARTIMENTO

Resultado

Apical

NO PENETRADO

Producto Homogeneizado Celular

Internalizado

Basolateral

PENETRADO

El producto homogeneizado celular y el compartimento basolateral contienen la fraccion de curcumina que es absorbida por el transporte pasivo.

25 5. Analisis estadfstico

No se realiza ningun analisis estadfstico especffico, con la excepcion del calculo de las desviaciones tfpicas.

6. Resultados

6.1 Evaluacion de la toxicidad de la composicion nucleo de la invencion (Composicion A) a tres concentraciones p/p ensayo MTT

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Muestra

Control (CN) Composicion A (0,25% p/p) Suspension de la Composicion A (0,5% p/p) Suspension de la Composicion A (1% p/p)

% de vitalidad celular

100 36,892 35,812 32,161

Ensayo MTT despues de 2 horas de incubacion con la composicion nucleo de la invencion (Composicion A) a tres concentraciones diferentes p/p: 0,25% / 0,5% / 1%.

La citotoxicidad de la Composicion A se somete a ensayo a tres concentraciones diferentes durante 2 horas de tratamiento: a las tres concentraciones (altas) el producto muestra un efecto citotoxico que no es dependiente de la dosis.

Dado que se espera que la absorcion intestinal sea mayor en el plazo de 1 hora, se decide tratar las celulas solo durante 1 h a 4 concentraciones mas bajas (Tabla 3). Tambien en este caso, se encuentran valores de vitalidad que son lfmite, pero superiores a los de 2 h y, en todos los casos, superiores al 50%.

Tabla 3

Muestra

Control (CN) Comp. A (0,025% p/p) Comp. A (0,05% p/p) Comp. A (0,1% p/p) Comp. A (0,25% p/p)

% de vitalidad celular

100 59,048 54,392 53,091 50,485

Ensayo MTT despues de 1 hora de incubacion con la COMPOSICION A a cuatro concentraciones diferentes: 0,025% / 0,05% / 0,1% / 0,25%.

Basandose en estos datos, la concentracion no citotoxica mas alta que se va a utilizar para evaluar el pase intestinal de la Composicion A es 0,25%.

La concentracion teorica de curcumina dentro de los granulos sometidos a ensayo a 0,25% corresponde a 0,052% p/p = 1,404 mM.

6.2 Pase paracelular: evaluacion de la toxicidad en las uniones estrechas via Ly y TEER

Todos los insertos preparados para el estudio presentaron valores iniciales de TEER de aproximadamente 200 Q * cm2 (Tabla 4), que son validos para evaluar la toxicidad de la composicion nucleo de la invencion (COMPOSICION A) 0,25% por LY.

Los insertos se tratan durante 1 h con COMPOSICION A/LY; El inserto CN (control no tratado negativo) y el inserto en blanco se tratan solo con LY.

Tabla 4

Control Composicion A

Valores TEER iniciales (Q * cm2)

188,7 190,65

Valores TEER despues de 1 h (Q * cm2)

159,15 170,4

Medicion de TEER despues de 1 hora de incubacion con una solucion de COMPOSICION A a 0,25% p/p No se observa ninguna diferencia en los valores de TEER despues del tratamiento con la composicion nucleo de la

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invencion en comparacion con las celulas en HBSS-CN MES al 1%.

Los resultados confirman una accion neutra a nivel de la estructura de las uniones estrechas. En la Tabla 5 se muestran los valores del flujo de amarillo Lucifer paracelular medido despues de 1 h de tratamiento con la COMPOSICION A a 0,25%.

Tabla 5

Control (CN) Composicion A Valores aceptables

Flujo LY %

1,246% ± 0,021 1,148% ± 0,016 <10%

Papp

1,129* 10'6 8,040* 10'7 <2,3* 10-6 cm/seg

La composicion nucleo de la invencion a la concentracion sometida a ensayo se confirma como no toxica para las uniones (flujo de Amarillo Lucifer <10% y Papp <2,3 * 10-6 cm/seg)

6.3 Pase intestinal

6.3.1 Ensayo de permeabilidad para la dosificacion de curcumina

Los resultados de la deteccion de curcumina por medio de HPLC-UV se resumen en la Tabla 6.

En la bibliograffa se demostro que la curcumina tiene una biodisponibilidad baja, debido a la baja solubilidad en agua, y un alto metabolismo (Wahlang B, YB Pawar, AK Bansal. " Identification of permeability-related hurdles in oral delivery of curcumin using the Caco-2 cell model" Eur J Pharm Biopharm. 2011 Feb; 77 (2) :275-82).

Para evaluar la linealidad y la estabilidad de la curcumina, se utiliza rizoma de curcuma a 95% como referencia y se debe utilizar tetrahidrofurano (THF) como disolvente a una razon de 1:3 con el disolvente acuoso (que contiene acido cftrico al 1%), considerando la muy baja solubilidad de la curcuma.

Se ha encontrado que el metodo analftico utilizado para el patron es preciso y exacto para las concentraciones utilizadas (LOQ 0,05 mg/L, LOD 0,017 mg/L), pero no es suficientemente exacto para detectar la curcumina solamente en presencia de los tampones requeridos para el estudio de la absorcion, que en parte restringen la solubilidad de la curcumina.

Los resultados analfticos muestran que hay menos de la cantidad teorica de curcumina presente en la muestra inicial en la solucion al 0,25% p/p de la composicion nucleo de la invencion (Composicion A), como se indica en la siguiente tabla 6 que muestra una perdida de aproximadamente 23% en el tftulo.

Esta perdida se debe a la solubilidad incompleta de las muestras que contienen curcumina en los tampones necesarios para el estudio: la solucion, de hecho, parece muy turbia y con tendencia a la precipitacion.

Tabla 6

EXTRACTO TURMERICO que contiene curcumina al 95% (p/p) CANTIDAD TEORICA DE CURCUMINA en la solucion al 0,25% (p/p) CANTIDAD DE CURCUMINA detectada por la tecnica de HPLC- UV en la solucion 0,25

Concentraciones

21,93 g/100 g 0,052% = 1,404 mM 0,04% mM = 1,080 mM

Las concentraciones de curcumina en % detectadas en diferentes compartimentos, analizadas por triplicado (3 insertos) despues del tratamiento con la composicion nucleo de acuerdo con la invencion (COMPOSICION A) durante 1 h, se muestran en la siguiente tabla 7:

Curcumina

Compartimento

% pM % Recuperado en comparacion con 0'AP

Apical a los 60 min

1) 0,01 1) 270 1) 25%

2) 0,02 2) 540 2) 50%

3) 0,01 3) 270 3) 25%

Producto homogeneizado

1) 0,01 1) 270 1) 25%

celular

2) 0,01 2) 270 2) 25%

A los 60 min

3) 0,02 3) 540 3) 50%

Basolateral

1) 0,00075 1) 20,25 1) 1,875%

(15 min +30 min

2) 0,00075 2) 20,25 2) 1,875%

+60 min)

3) 0,00075 3) 20,25 3) 1,875%

TOTAL:

1) 0,02075 1) 560,25 1) 51,875%

Apice +

2) 0,03075 2) 830,25 2) 76,875%

Basolateral + producto homogeneizado CELULA

3) 0,03075 3) 830,25 3) 76,875%

(Apical = diferencia entre la lectura en la solucion

inicialmente aplicada y la residual despues de 60 min,

Basolateral y producto homogeneizado = lectura en los tiempos especificados)

Es evidente que las dosificaciones de curcumina en las muestras biologicas analizadas estan significativamente influenciadas por la escasa solubilidad de la curcumina.

5 De hecho, los valores de recuperacion de la curcumina en (52% - 77%) muestran que un porcentaje significativo de curcumina no se ha cuantificado en las condiciones Experimentales sometidas a ensayo, lo que no permite un calculo correcto del equilibrio de masa final.

Sin embargo, el analisis de la distribucion en los diferentes compartimentos, aunque subestimado debido a la escasa solubilidad (por ejemplo: en el inserto 1 solo se cuantifica 0,01% en el producto homogeneizado celular y 0,01% en 10 la porcion apical al final del perfodo de incubacion, despues de la aplicacion inicial de 0,04% de una cantidad inicial de una sustancia), muestra a los 60 minutos una distribucion equivalente de curcumina entre la apical y el producto homogeneizado celular, que confirma su internalizacion en el epitelio intestinal.

No es detectable ningun pase de curcumina en el compartimento basolateral.

7. Conclusiones

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El estudio in vitro del pase intestinal de la Composicion A que contiene curcumina se lleva a cabo en celulas Caco-2 a la concentracion de ensayo de 0,25% segun se define basandose en los valores de los ensayos preliminares de citotoxicidad.

Los datos tanto del pase paracelular con amarillo Lucifer como de la medida de TEER muestran que el producto granulado de curcumina (composicion nucleo de la invencion) no inducen toxicidad a nivel de las uniones intercelulares.

En este estudio no es posible calcular el equilibrio de masa (Equilibrio de masa, MB), es decir, el porcentaje de curcumina recuperada en los diversos compartimentos al final del pase intestinal, debido a la solubilidad incompleta de la composicion nucleo de la invencion en los tampones utilizados para el estudio.

Un 23% del contenido teorico de curcumina no se detecta en la solucion, por lo que esta perdida tambien es aplicable al analisis de las muestras generadas en el estudio.

A continuacion se calcula la suma de las cantidades de compuesto recuperado en el compartimento apical y en el compartimento basolateral, junto con la fraccion asociada con el componente celular (producto homogeneizado) en comparacion con la cantidad real inicialmente aplicada (51,875% y 76,875% en los insertos 1 y 2, respectivamente).

En el presente estudio, la curcumina, una molecula lipofila que es propensa a la acumulacion intracelular, demuestra una baja permeabilidad con un Papp (A-B) de 8,040 * 10-7.

Esto se confirma en la bibliograffa (Wahlang B, YB Pawar, AK Bansal. "Identification of permeability-related hurdles in oral delivery of curcumin using the Caco-2 cell model" Eur J Pharm Biopharm. 2011 Feb; 77 (2) 275-82). De hecho, la curcumina no se detecta en el compartimento basolateral.

Sin embargo, el analisis de la distribucion en los diferentes compartimentos, aunque subestimado debido a la escasa solubilidad de la curcumina en los tampones, muestra ya a los 60 minutos una distribucion equivalente de curcumina entre el compartimento apical y el producto homogeneizado celular, confirmando su internalizacion a nivel del epitelio intestinal.

Debido a que la absorcion de curcumina en el agua, que forma una solucion opaca que contiene materia en partfculas, es regulada por dos fases, es decir, disgregacion/disolucion y absorcion a traves de la membrana mucosa, la internalizacion de la forma granulada es mas rapida que otras formas de administracion.

Para la curcumina, que es una sustancia lipofila, el factor limitante para la internalizacion es de hecho su solubilidad en solucion acuosa: la fraccion molecular que esta disponible se puede internalizar y acumular mas rapidamente a nivel de la monocapa celular.

En apoyo de este comportamiento, se ha demostrado en la bibliograffa que, utilizando celulas lisadas, 11,78% de la curcumina se metaboliza durante el transporte y se acumula en las celulas (a traves de estudios cineticos de absorcion y liberacion de curcumina). La cantidad acumulada es de 20%. Esta cifra es comparable con los resultados de acumulacion observados en el producto homogeneizado celular: 25% (en 2 insertos) e incluso 50% (en 1 inserto).

De este modo, la composicion nucleo de acuerdo con la presente invencion proporciona un metodo seguro y mas eficaz para el suministro con una alta tasa de absorcion de una sustancia activa de otra manera escasamente biodisponible.

Claims (15)

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   1. Una composicion que comprende:

   a) un nucleo que comprende al menos un principio activo con baja biodisponibilidad, un polisorbato y una sal de N-acetilcistefna-quitosano;

   b) una capa de recubrimiento enterico que encierra dicho nucleo a),

   en donde dicha sal de N-acetilcistefna-quitosano comprendida en a) se obtiene mediante la protonacion del grupo amino libre de quitosano por medio de N-acetilcistefna, comportandose como un acido.
2. 2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la capa b) es una pelfcula enterica aplicada directamente sobre el nucleo a).
3. 3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde el al menos un principio activo con baja disponibilidad se selecciona entre trans-resveratrol, melatonina, acidos grasos omega-3, terpenos esteroideos como acidos boswellicos, terpenos no esteroideos, saponinas, aceites esenciales y polifenoles incluyendo curcumina, berberina y mezclas de los mismos.
4. 4. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde el al menos un principio activo con baja disponibilidad es curcumina o berberina.
5. 5. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde el polisorbato es polisorbato 80.
6. 6. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde el nucleo a) comprende adicionalmente un extracto de Citrus x paradisi titulada a al menos 40% en peso/peso total del extracto de Citrus x paradisi en bioflavonoides, y titulados especfficamente en Naringina y Naringenina, y/o un extracto de Piper nigrum titulado en piperina al 95% en peso/peso total del extracto de Piper nigrum.
7. 7. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde el recubrimiento b) comprende o consiste en goma laca.
8. 8. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en forma de un granulo enterico, en donde el nucleo a) esta incluido en una pelfcula enterica b, o de una capsula gastro-resistente en donde dicho nucleo a) esta incluido en una envuelta dura o blanda con recubrimiento enterico (capa b)).
9. 9. Un comprimido que comprende la composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho comprimido comprende adicionalmente, por fuera de la capa b), una capa c) que comprende al menos un excipiente adecuado para la formacion de comprimidos.
10. 10. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde al menos un excipiente de la capa exterior c) adecuado para la compresion se selecciona entre almidon, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, fosfato de calcio, talco, sflice y mezclas de los mismos.
11. 11. La composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, para su uso como medicamento.
12. 12. Un suplemento dietetico o una composicion nutraceutica que comprenden la composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-9.
13. 13. Un metodo para la formacion de la composicion de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de:

    i. preparar una solucion o dispersion acuosa que comprende al menos un polisorbato a una concentracion entre 1 y 30% en peso/peso total de la solucion o dispersion acuosa y una sal de N-acetilcistefna-quitosano, en donde la N-acetilcistefna y el quitosano estan a una concentracion entre 0,01 y 3% en peso/peso total de la solucion;

    ii. granular en humedo una composicion que comprende al menos el principio activo con baja biodisponibilidad con la solucion o dispersion acuosa obtenida en la etapa i;

    iii. secar hasta un peso constante y tamizar el producto granulado obtenido en la etapa ii

    iv. formar el nucleo a) de la composicion por compresion del solido obtenido en la etapa iii;

    v. recubrir el nucleo a) obtenido en la etapa iv con una capa enterica gastro-resistente.
14. 14. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la granulacion de la etapa ii se realiza combinando la solucion o dispersion acuosa obtenida en la etapa i y una composicion que comprende la sustancia activa con baja biodisponibilidad, un extracto de Citrus x paradisi titulada a al menos 40% en peso/peso total del extracto de Citrus x

    paradisi en flavonoides y titulado especfficamente en Naringina y Naringenina y un extracto de Piper nigrum titulado en piperina hasta 95% en peso/peso total del extracto de Piper nigrum y, en caso necesario, N-acetilcistefna y quitosano en cantidades tales que se obtenga en una unica forma de dosificacion, una cantidad de quitosano entre 1 y 150 mg, una cantidad de N-acetilcistefna entre 1 y 75 mg, una cantidad de extracto de pomelo (Citrus x paradisi) entre 1 y 300 mg, y una cantidad de extracto de Piper nigrum entre 1 y 30 mg.
15. 15. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, que comprende adicionalmente:

    vi. anadir al nucleo recubierto con pelfcula obtenido en la etapa v al menos un excipiente adecuado para la formacion de comprimidos;

    vii. comprimir la composicion obtenida en la etapa vi, obteniendo la composicion en forma de un comprimido de acuerdo con la reivindicacion 9.