ES2618490T3 - Estirpes celulares aviares inmortalizadas - Google Patents
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Abstract
Célula aviar inmortalizada y células que derivan de dicha célula, caracterizadas por que dicha célula es obtenida mediante una transfección estable con un vector no vírico que comprende una secuencia de ácido nucleico de E1A y una secuencia de ácido nucleico que codifica una transcriptasa inversa de la telomerasa recombinante, en las que dicha célula no comprende una secuencia de ácido nucleico de E1B.
Description
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de ácido nucleico de E1A en el gen de HPRT. Al igual que entre los diversos miembros de una familia, las secuencias genómicas que codifican HPRT son muy homólogas, el experto en la materia puede asimismo diseñar las secuencias homólogas necesarias para dianizar el gen de HPRT de cada una de las células aviares.
Según una forma de realización más preferida de la invención, las secuencias homólogas se personalizan a fin de insertar la secuencia de ácido nucleico de E1A en dirección 3’ del promotor de HPRT de la célula. En esta forma de realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención está enlazada funcionalmente al promotor de HPRT endógeno de la célula. “Enlaza funcionalmente” hace referencia a que la secuencia de ácido nucleico de E1A está enlazada al promotor de una manera que permite su expresión en la célula.
Según esta forma de realización particular, la secuencia homóloga, en dirección 5’ de la molécula de ácido nucleico de la invención, presenta preferentemente una secuencia de ácido nucleico que es homóloga con por lo menos 500 pb contiguas, y más preferentemente con por lo menos 5000 pb contiguas, de la secuencia de ácido nucleico que empieza desde el nucleótido en la posición 1 y que finaliza con el nucleótido en la posición 8694 de la secuencia de ácido nucleico establecida en SEC ID nº: 2, con la condición de que dicha secuencia homóloga no sea homóloga con la secuencia de ácido nucleico que empieza con el nucleótido en la posición 8695 y que finaliza con el nucleótido en la posición 26916 de la secuencia de ácido nucleico establecida en SEC ID nº: 2. Además, esta secuencia homóloga en dirección 5’ está preferentemente enlazada directamente al codón de partida de la secuencia de ácido nucleico de E1A. Según una forma de realización incluso más preferida de la invención, la secuencia homóloga en dirección 5’ de la molécula de ácido nucleico de la invención consiste en la secuencia de ácido nucleico que empieza desde el nucleótido en la posición 1 y que termina con el nucleótido en la posición 8694 de la secuencia de ácido nucleico establecida en SEC ID nº: 2. La secuencia homóloga, en dirección 3’ de la secuencia de ácido nucleico de E1A, presenta preferentemente una secuencia de ácido nucleico que es homóloga con por lo menos 500 pb contiguas, y más preferentemente con por lo menos 5000 pb contiguas, de la secuencia de ácido nucleico que empieza desde el nucleótido en la posición 10580 y que termina con el nucleótido en la posición 18009 de la secuencia de ácido nucleico establecida en SEC ID nº: 2. Y más preferentemente, dicha secuencia homóloga, en dirección 3’ de la secuencia de ácido nucleico de E1A, consiste en la secuencia de ácido nucleico que empieza desde el nucleótido en la posición 10580 y que termina con el nucleótido en la posición 18009 de la secuencia de ácido nucleico establecida en SEC ID nº: 2.
En consecuencia, la presente invención se refiere asimismo a una célula aviar que comprende una secuencia de ácido nucleico de E1A caracterizada por que dicha célula se obtiene mediante un procedimiento que comprende la etapa de transfectar la célula con un vector no vírico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico de E1A, en la que dicha célula no comprende una secuencia de ácido nucleico de E1B, y en la que dicha secuencia de ácido nucleico de E1A está enlazada funcionalmente al promotor de HPRT endógeno de la célula.
Según una forma de realización preferida, el vector usado en el procedimiento según la invención comprende un primer marcador de selección, en el que este primer marcador de selección es un marcador de selección positivo, y en el que dicho primer marcador de selección está rodeado por las secuencias homólogas comprendidas en el vector. A este respecto, el procedimiento de recombinación homóloga que se produce entre el vector y el genoma de la célula conduce a la integración de la secuencia de ácido nucleico de E1A y del primer marcador de selección. Cuando el vector de transferencia es circular, “rodeado” significa que el primer marcador de selección y la secuencia de ácido nucleico de E1A están situados en la misma sección del vector, estando dicha sección delimitada por las secuencias homólogas.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión marcador de selección positivo se refiere de forma evidente a un gen que codifica un producto que permite que únicamente las células que presentan el gen sobrevivan y/o crezcan en ciertas condiciones. Los marcadores de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexano, o tetraciclina, complementan deficiencias auxotróficas, o suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de un medio complejo. En una forma de realización preferida según la invención, el primer marcador de selección codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos.
La integración del primer marcador de selección permite la selección de las células que han incorporado la secuencia de ácido nucleico de E1A. En consecuencia, el procedimiento según la invención puede comprender además una etapa en la que dichas células se cultivan en un medio que únicamente permite el crecimiento de las células que han incorporado el primer marcador de selección. Por ejemplo, en un medio que comprende un antibiótico.
Según una forma de realización más preferida de la invención, el primer marcador de selección, en el vector, está rodeado por secuencias que permiten su supresión. Dichas secuencias que permiten la supresión del primer marcador de selección no rodean a la secuencia de ácido nucleico de E1A. Cuando el vector es circular, las secuencias que permiten la supresión del primer marcador de selección, el primer marcador de selección y la secuencia de ácido nucleico de E1A están situados en la misma sección del vector de transferencia, estando dicha sección delimitada por las secuencias homólogas.
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significa que la etapa que consiste en suprimir el primer marcador de selección también conducirá a la supresión del tercer marcador de selección. La presencia del tercer marcador de selección permite la destrucción de las células en las que está presente el primer marcador de selección. Cuando el vector es circular, el hecho de que el tercer marcador de selección esté situado entre las secuencias que permiten la supresión del primer marcador de selección significa que el tercer marcador de selección y el primer marcador de selección están situados en la misma sección del vector de transferencia, estando dicha sección delimitada por las secuencias que permiten la supresión del primer marcador de selección.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión marcador de selección negativo se refiere de forma evidente a un gen que codifica un producto que elimina las células que poseen el gen bajo ciertas condiciones. Estos genes comprenden de forma evidente un “gen suicida”. Los productos codificados por estos genes pueden transformar un profármaco en un compuesto citotóxico. Actualmente están disponibles numerosos pares de genes suicidas/profármacos. Más particularmente, se pueden mencionar los pares:
-timidina cinasa del virus del herpes simple tipo I (HSV-1 TK) y aciclovir o ganciclovir (GCV) (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3, 1354-1361);
-citocromo p450 y ciclofosfamida (Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);
-purina nucleósido fosforilasa de Escherichia coli (E. coli) y 6-metilpurina desoxirribonucleósido (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238);
-guanina fosforribosil transferasa de E. coli y 6-tioxantina (Mzoz y Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595) y
-citosina desaminasa (CDasa) y 5-fluorocitosina (5FC).
-FCU1 y 5-fluoro-citosina (5FC) (documento WO9954481).
-FCU1-8 y 5-fluoro-citosina (5FC) (documento WO2005007857).
Dicho tercer marcador de selección permite la selección de las células en la que se ha producido la supresión del primer marcador de selección. Por lo tanto, el procedimiento según la invención puede comprender además una etapa en la que dicha célula se cultiva en un medio que no permite el crecimiento de la célula que comprende el tercer marcador de selección. Por ejemplo, un medio, que no permite el crecimiento de las células que comprenden FCU1 como un tercer marcador de selección, comprende 5-fluorocitosina.
Los primer, segundo y tercer marcadores de selección se pueden utilizar por separado. Por ejemplo, el vector usado en el procedimiento según la invención puede comprender el primer y el tercer marcador de selección, pero no el segundo, o el segundo y el tercer marcador de selección, pero no el primero.
Según una forma de realización preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico de E1A, el primer, el segundo y/o el tercer marcador de selección se colocan bajo el control de los elementos necesarios para su expresión en la célula que debe inmortalizarse.
Los elementos necesarios para la expresión consisten en el conjunto de elementos que permiten la transcripción de la secuencia nucleotídica a ARN y la traducción del ARNm a un polipéptido, en particular las secuencias promotoras y/o secuencias reguladoras que son eficaces en dicha célula, y opcionalmente las secuencias requeridas para permitir la excreción o la expresión de dicho polipéptido en la superficie de las células blancos. Estos elementos pueden ser regulables o constitutivos. Por supuesto, el promotor está adaptado al vector seleccionado y a la célula hospedadora. A título de ejemplo, se pueden mencionar los promotores eucarióticos de los genes MGP (fosfoglicerato cinasa), MT (metalotioneína; Mclvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), α-1 antitripsina, CFTR, los promotores del gen que codifica creatina cinasa muscular, el agente tensoactivo pulmonar de actina, inmunoglobulina o β-actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. 8, 466-472), el promotor temprano del virus SV40 (virus del simio), la LTR del RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor de MPSV, el promotor de TK-HSV-1, el promotor temprano del virus CMV (citomegalovirus). Se prefiere muy particularmente el promotor temprano del citomegalovirus (CMV).
La presente invención se refiere más particularmente, pero no se limita a, un procedimiento para inmortalizar una célula, que comprende las etapas:
-transferir a una célula aviar un vector que comprende:
• Una secuencia de ácido nucleico de E1A rodeada por secuencias homólogas.
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