ES2617090T3

ES2617090T3 - Métodos y reactivos para la detección temprana del melanoma

Info

Publication number: ES2617090T3
Application number: ES10251223.3T
Authority: ES
Inventors: Dmitri Talantov; John F. Palma; Tim Jatkoe; Tatiana Vener; Yixin Wang; Haiying Wang
Original assignee: Janssen Diagnostics LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2030-07-08
Also published as: EP2272989A1; KR20110004800A; EP2272989B1; BRPI1006640B1; CN101948915B; CN101948915A; BRPI1006640B8; BRPI1006640A2; CA2709106A1; MX2010007514A; JP2011015679A; CA2709106C; DK2272989T3; US20110009288A1; IL206810A0; IL206810A

Abstract

Un método para identificar un melanoma en una muestra de tejido que comprende los pasos de a) medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican el ARNm correspondiente a SILV; b) medir el nivel de expresión de un gen que codifica la tirosinasa; y c) medir el nivel de expresión de SILV en relación con tirosinasa; donde los niveles de expresión de SILV en relación con tirosinasa son indicativos de la presencia de un melanoma.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] El melanoma cutáneo maligno es un problema severo de la atención de la salud con al menos 62,000 nuevos casos de melanoma invasivo diagnosticados en personas esperados en 2008 en Estados Unidos, de los cuales 8,200 morirán por esta enfermedad. La incidencia de melanoma continúa aumentando más rápido que las otras neoplasias. También es una de las neoplasias más comunes en adultos jóvenes, y así es el tipo de cáncer número dos en términos de años promedio de vida perdidos.

[0002] Se ha demostrado que ciertas proteínas están asociadas con el melanoma y sus metástasis. Estas proteínas

o sus actividades se han usado en histoquímica para identificar las metástasis e incluyen L1CAM (Thies et al. (2002); Fogel et al. (2003)); y S-100 (Diego et al. (2003)). Se han aplicado microdisposiciones de alta densidad para monitorizar simultáneamente la expresión de miles de genes en muestras biológicas. Los estudios han resultado en la identificación de genes que se expresan de forma diferente en las lesiones benignas y malignas, así como genes que podrían tener valor pronóstico. Luo et al. (2001); y Wang et al. (2004). El perfil de expresión genética del melanoma maligno se realizó con una microdisposición que contiene sondas que monitorizan la expresión de 8,150 trascritos de mRNA. Bittner et al. (2000). Estos investigadores identificaron varios genes que podrían asociarse con una conducta agresiva del tumor. En un trabajo reciente, la comparación de los perfiles de expresión genética de líneas de melanoma y melanocitos normales condujo a la identificación de genes que se expresan de forma diferencial y vías moduladas en el melanoma. Takeuchi et al. (2004). Adicionalmente, el factor de diferenciación prostática GDF15, la molécula de adherencia L1CAM y la kinesina semejante 5, osteopontina, catepsina B, cadherina 3 y presenilina 2 se identificaron como marcadores prometedores para la detección del melanoma. (Talantov et al. (2005); Wang et al. (2007)). Kauffman et al. (2009) discutieron cinco marcadores para diferenciar el melanoma de los nevos, o dos marcadores para diferenciar el melanoma de los nevos atípicos. Arenberger et al. (2005) consideran la RT-PCR para la detección de células de melanoma, usando seis marcadores. McMasters et al. (2004) revisan los datos del ensayo de melanoma Sunbelt. Rothberg et al. (2008) muestran la expresión de gp100 nuclear a no nuclear como discriminador entre las lesiones benignas y melanocíticas malignas. Adema et al. (1994) caracterizaron al antígeno gp100* específico del linaje melanocítico. WO-2006-002433 muestra un método para identificar un melanoma midiendo los niveles de PLAB, L1CAM y NTRK3. Wagner et al. (1997) discuten el análisis de la expresión de gp100 en muestras de tejido humano primario, y sus implicaciones para la inmuno y geneterapia del melanoma. Alexan-drescu et al. (2010) discuten la expresión de marcadores específicos del melanoma en tejidos de biopsia de piel como herramienta para facilitar el diagnóstico del melanoma.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0003] La invención proporciona un método para identificar un melanoma en una muestra de tejido comprendiendo los pasos de (a) medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican el mRNA correspondiente a SILV; (b) medir el nivel de expresión de un gen que codifica la tirosinasa; y (c) medir el nivel de expresión de SILV en relación con la tirosinasa; donde los niveles de expresión de SILV en relación con la tirosinasa son indicativos de la presencia de un melanoma.

[0004] La invención también proporciona el uso de un kit en el método de la invención, donde el kit comprenden reactivos de amplificación y detección de ácidos nucleicos.

RESUMEN DE LA DECLARACIÓN

[0005] La presente invención proporciona un método para identificar un melanoma en una muestra de tejido, comprendiendo evaluar y medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican el mRNA correspondiente a SILV (me20m), y tirosinasa (TYR), como se define en las afirmaciones. TYR se usó como control de normalización que confirma la presencia de melanocitos en la muestra evaluada. También se muestra aquí un método de identificar un melanoma obteniendo una muestra de tejido; y evaluar y medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican el mRNA correspondiente a GDF15 o L1CAM y reconocido por los juegos de cebador/sonda SEQ. ID NOs.: 5-7 y 8-10, respectivamente, donde la expresión genética está por encima de un punto de corte predeterminado es indicativo de la presencia de un melanoma.

[0006] También se muestra aquí un método de distinguir un melanocitos maligno de un melanocito benigno obteniendo una muestra de tejido, y evaluando y midiendo los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican SILV donde los niveles de expresión genética por encima del punto de corte predeterminado son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra.

[0007] También se muestra aquí un método para distinguir un melanocito maligno de un melanocito benigno obteniendo una muestra de tejido; y evaluando y midiendo los niveles de expresión en la muestra para genes que codifican GDF15 y L1CAM y reconocidos por los juegos de cebadores/sondas SEQ/ ID NO.: 5-7 y 8-10. Los niveles

de expresión genética por encima del punto de corte predeterminado son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra.

[0008] También se muestra aquí un método para determinar el protocolo del tratamiento del paciente obteniendo

5 una muestra de tejido del paciente; y evaluando y midiendo los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican SILV donde los niveles de expresión genética por encima del punto de corte predeterminado son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra.

[0009] También se muestra aquí un método para determinar el protocolo de tratamiento del paciente obteniendo

10 una muestra de tejido del paciente; y evaluando y midiendo los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican GDF15 y L1CAM reconocidos por los juegos de cebadores/sondas SEQ. ID NOs.: 5-7 y 8-10 donde los niveles de expresión genética por encima de niveles de corte predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra.

15 [0010] El Marcador final es SILV y se define aquí como el gen que codifica cualquier variante, alelo, etc. SILV también se describe como PROTEÍNA MELANOCÍTICA 17; PMEL 17; PROTEÍNA PREMELANOSOMAL; PMEL; GP 100; ME20; SI; SIL; D12S53E y está representado por el Consentimiento No. NM_006928.3. La invención proporciona el uso de un kit para conducir una prueba para determinar la presencia del melanoma en una muestra celular que comprende: reactivos de amplificación y detección de ácido nucleico.

20 [0011] La invención proporciona juegos de cebadores/sondas para la amplificación y detección de los productos de PCR obtenidos en los métodos de la invención. Estos juegos incluyen los siguientes:

SEQ. ID NO: 1, SILV, Cebador hacia delante, AGCTTATCATGCCTGGTCAA

25 SEQ. ID NO: 2, SILV, Cebador en reversa, AGCTTATCATGCCTGGTCAA SEQ. ID NO: 3, SILV, Sonda, FAM-AGGTTCCGCTATCGTGGGCAT-BHQ1 SEQ. ID NO: 4, ABI AoD*, Hs00165976_ml

[0012] También se muestran aquí juegos de cebadores/sondas para la amplificación y detección de los productos 30 de PCR obtenidos en los métodos declarados. Estos juegos incluyen los siguientes:

SEQ. ID NO: 5, GDF15, Cebador hacia delante, CGCCAGAAGTGCGGCT SEQ. ID NO: 6, GDF15, Cebador en reversa, CGCCAGAAGTGCGGCT SEQ. ID NO: 7, GDF15, Sonda MGB, FAM

35 ATCCGGCGGCCAC SEQ. ID NO: 8, L1CAM, Cebador hacia delante, ACTATGGCCTTGTCTGGGATCTC SEQ. ID NO: 9, L1CAM, cebador en reversa, AGATATGGAACCTGAAGTTGCACTG SEQ. ID NO: 10, L1CAM, Sonda MGB, FAM-CACCATCTCAGCCACAGC

[0013] También se muestran amplicones obtenidos por métodos de PCR utilizados en los métodos de la invención. 40 Estos amplicones incluyen los siguientes:

SEQ. ID NO: 11, GDF15 PCR amplicon:

SEQ. ID NO: 12 L1CAM PCR amplicon:

55 SEQ. ID NO: 13 SILV PCR amplicon:

SEQ. ID NO: 14 TYR PCR amplicon:

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0014]

Figura 1 es un gráfico que muestra el desempeño de SILV, GDF15 y L1CAM distinguiendo las lesiones benignas y malignas de piel. Figura 2 es un gráfico de la sensibilidad versus especificidad de SILV, GDF15 y L1CAM distinguiendo melanomas inequívocos y nevos benignos. Figura 3 es un gráfico del desempeño de SILV distinguiendo entre melanomas y nevos atípicos. Figura 4 es un gráfico de la sensibilidad versus especificidad de SILV distinguiendo melanomas inequívocos y nevos benignos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0015] La presente invención proporciona métodos para identificar cualitativa y cuantitativamente un melanoma, como se define en las afirmaciones. También se descubren aquí los métodos para distinguir un melanocito maligno de un melanocito benigno; diagnosticar lesiones melanocíticas con rasgos patológicos inciertos; y determinar un protocolo de tratamiento para el paciente con melanoma. Los métodos proporcionan ayudas en pronóstico del paciente, monitorización del paciente y desarrollo de medicamentos. Los métodos se basan en evaluar y medir los niveles de expresión de SILV (me20m) como un marcador final para los ensayos de biopsia del melanoma donde cierto nivel de expresión genética, en relación con el control de la normalización de TYR, es indicativo de la presencia de un melanocito maligno en la muestra evaluada.

[0016] La presente invención se enfoca en la utilidad de marcadores identificados de expresión genética para diagnosticar el melanoma maligno entre varias lesiones de piel, incluyendo lesiones con rasgos morfológicos inciertos o lesiones melanocíticas primarias sospechosas denominadas casos equívocos usado tejidos embebidos en parafina ("FFPE"). Esta situación es donde ocurren discrepancias entre las opiniones de los dermatopatólogos. Así, la utilidad de esta invención es identificar marcadores de expresión genética que diferencian lesiones de piel melanocítica benigna de melanomas primarios en pruebas de expresión genética, basadas en RT-PCR, para el diagnóstico de melanoma en lesiones sospechosas.

[0017] Se aisló el RNA total de 47 melanomas primarios, 48 nevos de piel benignos y 98 nevos atípicos/sospechosos incluyendo 48 nevos atípicos y se analizaron 50 muestras de tejido de melanomas (asignados por dermatopatólogos) usando RT-PCR. La expresión genética diferencial de tres genes específicos de melanoma, SILV, GDF15, y L1CAM, se evaluó con una prueba de RT-PCR cuantitativa de un paso en melanomas, nevos benignos y muestras de piel atípicas/sospechosas. Los resultados demostraron la capacidad de usar SILV como un marcador final para diferenciar muestras de tejido clínicamente relevantes que contienen melanocitos benignos o malignos.

[0018] Microdisposiciones de cADN y oligonucleótidos de alta densidad permiten la monitorización simultánea de la expresión de miles de genes. La tecnología de microdisposición proporciona una medición cuantitativa de abundancia de mRNA y ha ganado aceptación como herramienta para el descubrimiento de marcadores basada en la expresión genética. En el contexto de la investigación en cáncer, el análisis de microdisposición ha identificado que se expresan diferencialmente en lesiones benignas y malignas para diferentes tipos de cáncer o que tienen significado pronóstico. Luo et al. (2001); Su et al. (2001); Henshall et al. (2003); and Wang et al. (2004). El primer perfil de expresión genética de melanoma maligno usó una microdisposición conteniendo sondas para 8,150 trascritos de mADN e identificaron genes que podrían estar asociados con una conducta agresiva del tumor. Bittner et al. (2000). Debido a que las muestras analizadas en su estudio no incluyeron tejidos que contenían melanocitos normales o benignos, los genes expresados de forma diferencial en melanoma maligno no se identificaron. En contraste con la piel normal, el contenido de melanocitos en los nevos benignos es cercano al del melanoma.

[0019] En otro estudio, se hibridizaron dos muestras agrupadas derivados de melanomas o tejidos de nevos benignos a una disposición de cADN y se encontraron genes preferencialmente expresados en muestras derivadas de melanoma o nevos. Seykora et al. (2003). Otros investigadores usaron la hibridización sustractiva o análisis de bibliotecas SAGE generadas en líneas celulares de melanoma, para monitorizar la expresión genética en el melanoma. Hipfel et al. (2000); y Weeraratna (2004). Recientemente, la comparación de los perfiles de expresión genética de algunas líneas celulares de melanoma y células melanocíticas condujo a la identificación de genes expresados de forma diferencial y vías moduladas en el melanoma. Hoek et al. (2004). Aunque estos estudios proporcionan una base sólida para la genómica del melanoma, no hay un marcador que pueda diferenciar claramente

al melanoma del tejido benigno. Varios marcadores actualmente usados tales como tirosinasa, HMB-45, marta/Melanin-a y MITF no han probado tener valor pronóstico para la identificación del tumor melanocítico Phsie etal. (2008) En consecuencia, estos marcadores han encontrado un uso clínico limitado.

[0020] Como se muestra en la Patente de Estados Unidos Publicación No. 20070154889, se demostró que la PCR tiene suficiente especificidad y sensibilidad para detectar las metástasis del melanoma. En la presente invención, se proporciona un método con mejor desempeño diagnóstico diferenciando el melanoma de lesiones no melanomatosas de biopsias primarias de piel. El ensayo de la invención es útil diagnosticando lesiones claras, o inequívocas, de las sospechosas o equívocas. Así, la invención instantánea puede encontrar utilidad particular evaluando muestras tisulares en etapa temprana. Preferiblemente, una medición de probabilidad distinguirá los tejidos que tienen melanoma en relación con los melanocitos benignos o el tejido normal.

[0021] Los métodos de la invención emplean una técnica rápida para extraer ácidos nucleicos de muestras de tejidos FFPE y un método para amplificar y detectar fragmentos de ácidos nucleicos indicativos de melanoma en lesiones primarias de piel. Los fragmentos de ácidos nucleicos miden cualitativa y cuantitativamente el mRNA codificado por el gen marcador. Las muestras tisulares incluyen lesiones de piel derivadas de biopsias por punción, aguja, escisionales o por hojilla. Los métodos proporcionados aquí permiten la detección del melanoma en muestras primarias de biopsias de piel permitiendo que un médico determine si debe implementar inmediatamente un protocolo de tratamiento apropiado para la enfermedad en etapa temprana. En los métodos de la invención, es importante tomar una muestra adecuada del tejido usado para conducir el estudio. Esto incluye la escisión y procesamiento apropiados de la muestra tisular, así como la extracción del RNA. Una vez obtenidas, es importante procesar las muestras tisulares apropiadamente de forma que se detecte cualquier célula cancerosa presente.

[0022] En un método de la invención, se aísla RNA de un bloque de muestra tisular FFPE. Puede usarse un kit comercial idóneo de parafina, como High Pure RNA Paraffin Kit de Roche (Cat. #3270289). Preferiblemente, las muestras FFPE se seccionan de acuerdo con el tamaño del tumor embebido como sigue: ≤ 2 a 5 mm seccionado a 9 x 10 mm; ≥ 6 a 8 mm seccionado a 6 x 10 mm. Las secciones son deparafinadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el RNA aislado puede almacenarse en agua libre de RNase a -80° C.

[0023] En el caso de medir los niveles de mRNA para determinar la expresión genética, los ensayos pueden ser por cualquier método conocido por los expertos en la materia e incluyen métodos tales como la Amplificación en Círculo Rodante (RCA), Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR), Amplificación por Desplazamiento de la Hebra (SDA), Amplificación Basada en la Secuencia de Ácido Nucleico (NASBA), y otros. El diagnóstico molecular rápido involucrado es más preferiblemente métodos cuantitativos por PCR, incluyendo QRT-PCR. La detección puede ser por cualquier método conocido por expertos en la materia incluyendo microdisposiciones, chips genéticos y fluorescencia.

[0024] Una PCR típica incluye múltiples pasos de amplificación, o ciclos que amplifican selectivamente especies albo de ácido nucleico. Una PCR típica incluye tres pasos: un paso denaturalizante en el cual un ácido nucleico se denaturaliza; un paso de recocido en el cual un grupo de cebadores de PCR (cebadores hacia delante y a la inversa) se acoplan a hebras de ADN complementario; y un paso de elongación en el cual una ADN polimerasa termostable elonga los cebadores. Repitiendo este paso múltiples veces, un fragmento de ADN se amplifica para producir un amplicon, correspondiente a la secuencia albo de ADN. La PCR típica incluye 20 o ciclos más de desnaturalización, recocido y elongación. A menudo, los pasos de recocido y elongación pueden realizarse concomitante, en cuyo caso el ciclo contiene solo dos pasos.

[0025] En una representación de la invención, la reacción de amplificación de RT-PCR puede ser conducida en un tiempo de forma que las duraciones de cada uno de estos pasos pueden estar en el rango de segundos, en vez de minutos. Específicamente, con ciertos nuevos cicladores térmicos que son capaces de generar una aceleración térmica de al menos unos 5C° por segundo, se usan amplificaciones de RT-PCR en 30 minutos o menos. Más preferiblemente, las amplificaciones se conducen en menos de 25 minutos. Con esto en mente, los siguientes tiempos proporcionados para cada paso del ciclo de PCR no incluyen tiempos de aceleración. El paso de denaturación puede conducirse por tiempos de 10 segundos o menos. De hecho, algunos cicladores térmicos tienen ajustes para "0 segundos" la cual puede ser la duración óptima del paso de denaturación. Es decir, es suficiente que el ciclador térmico alcance la temperatura de denaturacion. Los pasos de recocido y elongación son más preferiblemente menores de 10 segundos cada uno, y cuando se conducen a la misma temperatura, la combinación del paso recocido/elongación puede ser menor de 10 segundos. Algunos métodos de detección de sonda homogénea pueden requerir un paso separado para la elongación para maximizar el desempeño de la prueba rápida. Para minimizar el tiempo de amplificación total y la formación de reacciones colaterales inespecíficas, las temperaturas de recocido están típicamente por encima de 50°C. Más preferiblemente las temperaturas de recocido están por encima de 55°C.

[0026] Una sola reacción combinada para la RT-PCR, sin intervención del experimentador, es deseable por varias razones:

(1) menor riesgo de error del experimentador; (2) menor riesgo de contaminación del producto albo; y (3) mayor

velocidad del ensayo. La reacción puede consistir en una o dos polimerasas. En el caso de dos polimerasas, una de 5

estas enzimas es una ADN polimerasa basada en RNA (trascriptasa inversa) y una es una ADN polimerasa termostable basada en ADN. Para maximizar el desempeño de la prueba, es preferible emplear una forma de tecnología de "arranque en caliente" para ambas funciones enzimáticas. Las Patentes US 5,411,876 y 5,985,619 proporcionan ejemplos de diferentes abordajes de "arranque en caliente". Los métodos preferidos incluyen el uso de uno o más métodos de termoactivación que secuestran uno o más de los componentes requeridos para una polimerización eficiente del ADN. Las Patentes US 5,550,044 y 5,413,924 describen métodos para preparar reactivos para el uso en tales métodos. La Patente US 6,403,341 describe un abordaje de secuestro que implica la alteración química de uno de los componentes reactivos de la PCR. En la representación más preferida, ambas actividades polimerasas dependientes de RNA y ADN residen en una sola enzima. Otros componentes que se requieren para una amplificación eficiente incluyen trifosfatos de nucleósidos, sales divalentes y componentes amortiguadores. En algunos casos, estabilizadores no específicos de ácidos nucleicos y enzimas pueden ser beneficiosos.

[0027] En la RT-PCR preferida, las cantidades de ciertas trascriptasas inversas y los componentes de la PCR son atípicos para tomar ventaja de los tiempos de aceleración más rápidos de algunos cicladores térmicos. Específicamente, las concentraciones del cebador son muy altas.

[0028] Las concentraciones típicas del cebador específico del gen para las reacciones de la trascriptasa inversa son menores de 20 nM. Para lograr una reacción de trascriptasa inversa rápida del orden de uno a dos minutos, la concentración del cebador de trascriptasa inversa se eleva a más de 20 nM, preferiblemente al menos 50 nM, y típicamente 100 nM. Las concentraciones estándar del cebador de PCR están entre 100 nM y 300 nM. Pueden usarse concentraciones mayores en la PCR estándar para compensar las variaciones de Tm. Sin embargo, para los propósitos aquí, las concentraciones referenciadas del cebador son para circunstancias donde no se necesita compensación de Tm. Concentraciones proporcionalmente mayores de cebadores pueden determinarse empíricamente y usarse si la compensación de Tm es necesaria o deseable. Para lograr una PCR rápida, las concentraciones del cebador de PCR son mayores de 250 nM, preferiblemente mayores de 300 nM y típicamente de 500 nM.

[0029] Los diagnósticos comercialmente usados también emplean preferiblemente uno o más controles positivos internos que confirman la operación de una reacción de amplificación particular en caso de un resultado negativo. Causas potenciales de resultados falsos negativos que deben controlarse en una RT-PCR incluyen: cantidad inadecuada de RNA, degradación del RNA, inhibición de la RT o de la PCR y error del experimentador.

[0030] En el caso de medir los niveles de proteína para determinar la expresión genética, cualquier método conocido por la técnica es idóneo en tanto resulte en una especificidad y sensibilidad adecuadas. Por ejemplo, los niveles de proteína pueden medirse uniendo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para la proteína y midiendo la cantidad de proteína unida al anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser etiquetados con reactivos radiactivos, fluorescentes u otros detectables para facilitar la detección. Los métodos de detección incluyen, sin limitación, ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y técnicas de inmunomancha.

[0031] La invención proporciona una especificidad y sensibilidad suficientes para identificar un melanocito maligno en una muestra de tejido. Los métodos determinan la expresión de un gen marcador particular, SILV, midiendo el mRNA codificado por el marcador. Los resultados presentados aquí muestran que SILV es un marcador importante demostrando una clara discriminación entre el melanoma y casos benignos inequívocos así como entre subgrupos de diferente atipia en muestras de grupo de tejido sospechoso. El marcador SILV se define aquí como el gen que codifica cualquier variante, alelo, etc., incluyendo la SEQ ID NO: 1-3.

[0032] En los métodos de la invención, la tirosinasa se usa como un gen control para demostrar la presencia de melanocitos en la muestra de tejido y normalizar el contenido melanocítico. La tirosinasa es descrita por Mandelcorn-Monson et al. (2003); y la Patente US No. 6,153,388 y está representada por la Adhesión No. NM_000372. La tirosinasa también es definida como el gen que codifica el mRNA reconocido por el ensayo ABI a demanda (Hs00165976_m1) con el amplicon PCR SEQ ID NO: 14.

[0033] La especificidad de cualquier diagnóstico molecular basado en amplificación se basa alta, pero no exclusivamente, en la identidad de los juegos de cebadores. Los juegos de cebadores son pares de cebadores oliglonucleotídicos hacia delante y en reversa que se acoplan a una secuencia albo de ADN para permitir la amplificación de la secuencia albo, produciendo así un amplicon específico de la secuencia albo. Los cebadores deben poder amplificar los marcadores de la enfermedad de interés. En el caso de la invención de este caso, el marcador está dirigido al melanoma.

[0034] La reacción también debe contener algún medio de detección de una señal específica. Esto se logra preferiblemente a través del uso de un reactivo que detecta una región de la secuencia de ADN derivada de la polimerización de la secuencia albo de interés. Los reactivos preferidos para la detección dan un diferencial de señal medible cuando se une a una secuencia de ácido nucleico específica de interés. A menudo, estos métodos involucran sondas de ácidos nucleicos que dan una fluorescencia aumentada cuando se unen a la secuencia de interés. Típicamente, el progreso de las reacciones de los métodos de la invención se monitoriza analizando las tasas relativas de la producción de amplicon para cada juego de cebadores de PCR.

[0035] La invención además incluye el uso de juegos de cebadores/sondas en los métodos afirmados, donde las secuencias IDs son: SEQ, ID NOs.: 1-3. Monitorizar la producción del amplicon puede lograrse con algunos reactivos y métodos de detección, incluyendo sin limitación los cebadores fluorescentes y sondas fluorogénicas y tintes fluorescentes que se unen al ADN de doble hebra. También pueden usarse balizas moleculares, Scorpions y otros esquemas de detección. Un método común para monitorizar una PCR emplea una sonda de hidrólisis fluorescente. Este método explota la actividad 5’ nucleasa de ciertas ADN polimerasas termostables (como Taq o Tfl ADN polimerasas) para clivar una sonda oligomérica durante el proceso de la PCR.

[0036] Se muestran aquí los amplicones obtenidos por métodos de PCR utilizados en los métodos de la invención. Estos amplicones incluyen las secuencias: SEQ. ID Nos: 11-14.

[0037] El oligómero es seleccionado para acoplarse a la secuencia albo amplificada bajo condiciones de elongación. La sonda tiene un reportero fluorescente en su extremo 5’ y un apagador fluorescente del reportero en el extremo 3’. En tanto el oligómero esté intacto, la señal fluorescente del reportero está apagada. Sin embargo, cuando el oligómero es digerido durante el proceso de elongación, el reportero fluorescente ya no está en proximidad con el apagador. La acumulación relativa del reportero fluorescente libre para un amplicon dado puede compararse con la acumulación de los mismos amplicones para una muestra control o con un gen control, como, sin limitación, -Actina

o PBGD para determinar la abundancia relativa de un producto cADN de un RNA en una población de RNA. Los productos y reactivos para la sonda de hidrólisis fluorescente están comercialmente disponibles, por ejemplo en Applied Biosystems.

[0038] Los reactivos de detección más preferidos son sondas TaqMan® (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ) y se describen en las patentes US 5,210,015; 5,487,972; y 5,804,375. Esencialmente, estas sondas involucran la detección de ácidos nucleicos en virtud de la separación de una combinación flúor-apagador en una sonda a través de la actividad 5’-3’ exonucleasa de la polimerasa usada en la PCR. Puede usarse cualquier fluoróforo para cualquiera de los marcadores o controles. Tales fluoróforos incluyen, sin limitación, Texas Red, Cal Red, Fam, Cy3 y Cy5. En una representación, los siguientes fluoróforos corresponden a los marcadores notados: PLAB: Fam; L1CAM: Texas Red o Cal Red, tirosinasa: C1; PBGD: Cy5. El equipo y el software también están disponibles para controlar y monitorizar la acumulación de amplicones en la PCR y QRT-PCR incluyendo el termociclador comercial Smart Cycler disponible a través de Cepheid of Sunnyvale, California, y el Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7900, disponible comercialmente en Applied Biosystems.

[0039] En la comercialización de los métodos descritos para QRT-PCR ciertos kits para la detección de ácidos nucleicos específicos son particularmente útiles. En una representación, el kit incluye reactivos para amplificar y detectar marcadores. Opcionalmente, el kit incluye reactivos de preparación de muestra o artículos (p.ej., tubos) para extraer ácidos nucleicos del tejido del ganglio linfático. Los kits también pueden incluir artículos para minimizar el riesgo de contaminación de la muestra (p.ej., escalpelo desechable y campo para la disección y preparación del ganglio linfático).

[0040] En un kit preferido, se incluyen los reactivos necesarios para el proceso de QRT-PCR de un tubo descrito antes como la trascriptasa inversa, un cebador de trascriptasa inversa, un juego de cebador PCR correspondiente (preferiblemente para marcadores y controles), una ADN polimerasa termostable, tal como Taq polimerasa y un reactivo de detección idóneo, tal como, sin limitación, una sonda scorpion, una sonda para una prueba con sonda de hidrólisis fluorescente, una baliza molecular, un cebador de tinte único o un tinte fluorescente específico del ADN de doble hebra, como el bromuro de etidio. Los cebadores están preferiblemente en cantidades que rinden las altas concentraciones descritas antes. Las ADN polimerasas termostable están disponibles común y comercialmente a partir de una variedad de fabricantes. Los materiales adicionales en el kit pueden incluir; tubos idóneos de reacción

o viales, una composición de barrera, típicamente un lecho de cera, incluyendo opcionalmente magnesio; mezclas de reacción (típicamente 10X) para las etapas de trascriptasa inversa y de PCR , incluyendo los amortiguadores y reactivos necesarios tales como dNTPs; agua libre de nucleasa o RNasa; inhibidor de RNasa; ácidos nucleicos control o cualquier amortiguador, compuestos, cofactores, constituyentes iónicos, proteínas y enzimas, polímeros, etc., adicionales que pueden usarse en las etapas de trascriptasa inversa o PCR de la QRT-PCR. Opcionalmente, los kits incluyen reactivos y materiales para la extracción de ácido nucleico. Las instrucciones también se incluyen preferiblemente en los kits.

Ejemplo 1

Características Clínicas y Patológicas del Paciente

[0041] Se seleccionaron 204 muestras de tejido de biopsia de piel en FFPE de pacientes con lesiones melanocíticas primarias de piel diagnosticadas en el Hospital Universitario de Georgetown. La serie de pacientes incluyeron muestras con 102 rasgos inequívocos de melanoma invasivo o nevos benignos y 102 muestras con varios grados de atipia celular. Estas muestras atípicas se clasificaron inicialmente como sospechosas/atípicas y posteriormente fueron resueltas por dermatopatólogos expertos como nevos atípicos o melanoma maligno. Dos muestras de pacientes fueron excluidas debido a una cantidad insuficiente de RNA (menos de 350 ng) luego de un paso de

preparación de la muestra. Se excluyeron nueve muestras adicionales de RNA debido a la falla del control de PCR. La muestra final elegible para el análisis consistió en 193 tejidos de biopsia (95% de la muestra original) representando 47 melanomas, 48 nevos benignos y 98 atípicos/sospechosos, incluyendo 48 nevos atípicos y 50 melanomas asignados por dermatopatólogos. Un resumen de las características clínicas y patológicas de las muestras de melanoma se presenta en la Tabla 1.

Tabla 1.

Características del Paciente: Melanoma Avanzado Melanoma Atipia Severa Atipia Moderada Nevos Benignos

Promedio de Edad: 59 51 42 440 42

Sexo

Mujeres: 8 35 20 8 33

Hombres: 6 48 15 5 15

Estadio T (grosor)

Tis: 21

T1 (< 1 mm): 1 62

T2 (1.01 -2 mm): 7

T3 (2.01 -4 mm): 3

T4 (> 4 mm): 1

M: 2

(continúa)

Diagnóstico

Diseminación superficial melanoma: 6 50

Melanoma nodular: 5

Melanoma in situ: 21

Lentigo maligno: 11

Melanoma otro: 3 1

Nevo compuesto: 31

Nevo compuesto inflamado: 13

Nevo intradérmico: 4

Nevo atípico atipia severa: 2

Nevo compuesto severo atipia: 29

Nevo compuesto moderado atipia: 13

Nevo severo atipia de la unión: 4

n total por categoría: 14 83 35 13 48

Melanoma inequívoco, n=47: 12 35

Melanoma atípico, n=50: 2 48

Benigno inequívoco, n=48: 48

Nevos atípicos, n=48: 35 13

[0042] Las muestras se ordenaron de los casos más benignos a los casos más malignos, según los datos clínicos proporcionados por patología. Usando un diagnóstico histológico, se crearon cinco categorías mayores: melanoma

55 avanzado, melanoma, atipia severa, atipia moderada y nevos benignos, ajustando cada una de las 193 muestras a uno de estos grupos. El melanoma lentigo maligno, melanoma in situ y los melanomas invasivos superficiales se combinaron en una sola categoría de melanoma. Dos grupos de melanomas con rasgos avanzados (diseminación superficial con T2 y más y nodulares o metastásicos) se agregaron a un grupo de melanoma avanzado. Una clasificación binaria se basó en dividir los melanomas avanzados y los melanomas en malignos, y las clases

60 restantes en benignas. Esta estratificación contenía 97 casos malignos con 47 lesiones inequívocas y 50 severamente atípicas clasificadas como melanomas, y 96 casos benignos representando 48 nevos benignos y 48 nevos atípicos. El análisis de todos los datos posteriores se presenta para los casos inequívocos clasificados en uno de los 3 grupos: melanoma avanzado, melanoma y benignos y para los casos equívocos en uno de los 4 grupos: melanoma avanzado, melanoma, atipia severa y moderada.

Ejemplo 2

Preparación del Tejido

[0043] Se recolectaron doscientas cuatro muestras de individuos con diagnóstico de lesiones de piel melanocíticas primarias. Las muestras se recolectaron usando biopsia escisional, por pinchazo o por raspado dependiendo del tamaño de la lesión, profundidad y juicio del médico y se incluyeron en bloques de FFPE.

[0044] El RNA total se aisló de los bloques de FFPE usando un kit de parafina High Pure estándar de RNA Roche (catálogo # 3270289) con las siguientes modificaciones. Las muestras de tejido incluido en parafina se seccionaron de acuerdo con el tamaño de tumor incluido (2-5 mm o menos= 9 x 10 mm, 6-8 mm o más= 6 x 10 mm). Las secciones fueron deparafinadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El RNA aislado se almacenó en agua libre de RNasa a -80° C hasta usarse.

[0045] La distribución según tipo de biopsia y producción de RNA extraído se presentan en las Tablas 2a y 2b, respectivamente. La mediana de las producciones de RNA, correspondientes a un promedio total de 10.5, 4.5 y 6 láminas fueron equivalentes entre los tres tipos de biopsias. No se observó sesgo en el desempeño de la prueba basado en las diferencias en las técnicas de biopsia.

Tabla 2a

Diagnóstico Patológico: Escisión Pinchado Raspado Total

Melanoma: 21 7 23 51

Benigno: 6 4 41 51

Atípico/Sospechoso: 39 22 41 102

Total: 66 (32%) 33 (16%) 105 (52%) 204 (100%)

Tabla 2b

Tipo de Biopsia: Número (%) Mediana del Tamaño Sección # Mediana de la Producción de RNA (ng) Rango (ng)

Escisión: 66 (32) 13x10.5x8 3-6 1360.6 496-26879

Pinchazo: 33 (16) 8x7x3 6 1534.1 397-7368

Raspado: 105 (52) 7x6x1.5 9-12 1400.4 318-12140

Ejemplo 3

Pruebas de un solo paso de qRTPCR Usando cebadores específicos de RNA y Establecimiento del Punto de Corte

[0046] La evaluación de la expresión de genes seleccionados se llevó a cabo con RT-PCR de un paso con RNA de tejido con melanoma, nevos benignos y atípico/sospechoso en FFPE. Las muestras incluyeron dos series: 1) casos inequívocos, o claros, de melanoma y benignos y 2.) muestras con varios grados de atipia. Se usó Tirosinasa ("TYR") como gen organizador para controlar la cantidad y calidad de la entrada de RNA en las reacciones. No se usó tratamiento con ADNsa. Más bien, se diseñaron cebadores o sondas para que ahorraran un intrón de forma que no reportarían el ADN genómico. Todos los juegos de cebador/sonda se preevaluaron en un grupo de 20 muestras de RNA aisladas de 10 tejidos con melanoma y 10 tejidos con nevos benignos en FFPE de un proveedor comercial (Oncomatrix). Se seleccionó el juego de cebador-sonda de mejor desempeño para cada uno de los cuatro marcadores. Las secuencias se enumeran en la Tabla 3 a continuación.

[0047] Se evaluaron los marcadores de expresión genética GDF-15, SILV, y L1CAM junto con la tirosinasa de control de normalización ("TYR") en la biopsia de melanoma usando un solo formato de reacción RT-PCR en la plataforma ABI7900. Las pruebas de un paso de qRT-PCR se corrieron de acuerdo con el siguiente protocolo. Se usaron 50 ng de RNA total para qRT-PCR. El RNA total fue sometido a trascriptasa inversa usando la mezcla de 40X Multiscribe e inhibidor de RNasa contenida en el Kit de Reactivos TAQMAN® One Step PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Luego el cADN fue sometido a la 2x Master Mix usando UNG y la amplificación de la PCR se llevó a cabo l en el Sistema de Detección de Secuencia ABI 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) en el formato de 384 platillos usando un tamaño de reacción de 10µl. Cada reacción estaba compuesta por 5.0 ml de Mezcla Maestra 2X One Step RT-PCR, 0.5 µl de mezcla cebador/sonda, 0.25 µl de enzima 40X Multiscribe, y

Mezcla Inhibitoria RNasa, 0.25 µl de dNTP y 4 ml de 12.5 ng/µl de RNA total. La mezcla cebador/sonda final estaba compuesta por una concentración final de 900 nM de cebadores hacia delante y en reversa, enumerados en la Tabla 3, y 250 nM de sonda fluorescente. La mezcla de dNTP contenía una concentración final de 20 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP, y dTTP. La mezcla de reacción se incubó a 48° C para 30 min. para la transcripción inversa,

5 seguida por un paso de activación Amplitaq de 95° C por 10 minutos y finalmente 40 ciclos de 95° C por 15 seg. de denaturalización y 60° C por 1 minuto de acoplamiento y extensión. Las secuencias usadas en las reacciones fueron las siguientes, cada una escrita en la dirección 5’ a 3’.

Tabla 3 10

Símbolo: Cebador/Sond a Secuencia ID. No.

GDF15: Hacia delante CGCCAGAAGTGCGGCT 5

Inversa: CGGCCCGAGGATACGC 6

Sonda MGB: FAM-ATCCGGCGGCCAC 7

(continúa)

Símbolo: Cebador/Sonda Secuencia ID. No.

L1CAM: Hacia delante ACTATGGCCTTGTCTGGGATCTC 8

Inversa: AGATATGGAACCTGAAGTTGCACTG 9

Sonda MGB: FAM-CACCATCTCAGCCACAGC 10

SILV: Hacia delante AGCTTATCATGCCTGGTCAA 1

Inversa: GGGTACGGAGAAGTCTTGCT 2

Sonda: FAM-AGGTTCCGCTATCGTGGGCAT-BHQ1 3

TYR: ABI AoD* Hs00165976_m1 4

[0048] Para cada muestra se calculó ∆Ct=Ct (Gen Albo) -Ct TYR. Ct se ha usado ampliamente en las pruebas 35 clínicas de RT-PCR y se escogió como un método sencillo. Cronin et al. (2004).

[0049] Los valores de Ct obtenidos con los archivo de salida de ABI7900 se usaron para el análisis de datos. En la configuración de prueba de una sola reacción, se analizaron solo las muestras que generaron TYR Ct < 30. Se presentan los valores de Ct para cada uno de los marcadores como Cts crudos normalizados contra el marcador

40 específico de melanocitos, TYR, usando la siguiente ecuación:

45 El diagnóstico producido por la prueba se comparó con el examen dermatopatológico. Para estimar el desempeño de la prueba, se calcularon los valores AUC basados en el análisis de la curva ROC usando el paquete de software R versión 2.5.0. (team RDC www.r-project.org).

[0050] Para los casos claros (inequívocos), se demostró una mayor expresión en melanoma comparado con las

50 lesiones benignas para los tres marcadores específicos de melanoma (Tabla 4, Figura 1a). Se observó una expresión diferencial significativa para SILV y GDF15 entre nevos benignos y muestras de melanoma en los casos claros (inequívocos) (2.8 y 1.2 veces con valores de p <0.001 y 0.003, respectivamente). Sin embargo, L1CAM demostró una mucho menos diferenciación con un cambio de 0.2 veces sin significancia estadística para la diferencia (p=0.47) entre los casos benignos y malignos claros (Figura 1). Así, este marcador se excluyó del análisis posterior. SILV

55 demostró el mejor desempeño con una respuesta lineal a través de los tres grupos de pacientes (melanoma avanzado, melanoma y casos benignos), representando cambios continuamente cambiantes del estado de enfermedad definido por la patología.

Tabla 4

Marcador Normalizado para TYR: Melanoma Avanzado Melanoma Nevos Benignos Valores de p (benignos vs malignos) AUC (clasificación como benignos o malignos)

L1CAM: 6.85 7.5 7.66 0.47 0.49

SILV: 1.18 2.09 4.93 <0.001 0.94

GDF15: 5.02 7.17 8.34 0.003 0.67

[0051] El desempeño de SILV y GDF15 se evaluó para la diferenciación entre los melanomas inequívocos y nevos benignos usando un análisis de curva ROC univariado. Como se muestra en la Figura 2, los valores de AUC fueron

15 0.94 y 0.67, respectivamente. Según el análisis multivariado con un modelo de regresión lineal, la combinación de SILV y GDF15 no mejoró el desempeño de la prueba más allá del AUV de 0.94 en los casos inequívocos. Por tanto, no se procuró GDF15 para el análisis posterior de los sospechosos (casos equívocos). Finalmente, la normalización a TYR mejoró el desempeño de SILV a 0.94 comparado con 0.78 cuando se usan los valores de Ct crudos.

20 [0052] El desempeño de SILV se evaluó comparando los casos sospechosos con los casos benignos inequívocos. La ∆Ct promedio de SILV en las muestras equívocas en cada una por histología, excluyendo el melanoma avanzado debido a que n=2, se comparó con la ∆Ct promedio del grupo benigno inequívoco. Los valores promedio de Ct y valores de p para las comparaciones de las pruebas t con las muestras benignas inequívocas se enumeran en la Tabla 5 a continuación. SILV era significativamente diferente entre el grupo sospechoso de melanoma y cada grupo

25 sospechoso de atipia: melanoma versus atipia severo con una p =0.0077 y melanoma vs. atipia moderada con una p = 0.0009.

[0053] Las Figuras 1 a 4 confirman que SILV es el marcador principal y demostró una clara discriminación entre los casos de melanoma y benignos equívocos así como entre los diferentes subgrupos con atipia en el grupo

30 sospechoso de muestras de tejido.

Tabla 5

Marcador Normaliza do a TYR: Valores Normalizados de ⊗Ct Valores de p

Melanoma: Atipia Severa Atipia Moderada Benignos Inequívocos Benignos vs Benignos vs Benignos vs

Moderad: Severos Melanoma

os

SILV: 1.7 2.49 3.15 4.93 0.002 3.35E-09 9.98E-16

[0054] Desde una perspectiva dermatopatológica, no hay un solo criterio para determinar si una lesión pigmentada es un nevo severamente atípico o ha alcanzado el umbral del melanoma. Los dermatopatólogos lidian al menos con 45 10 rasgos histológicos separados. Ningún marcador inmunohistoquímico puede distinguir entre las proliferaciones benignas de las malignas tampoco.

[0055] La invención aquí presenta una prueba de biopsia de melanoma con un mejor desempeño diagnóstico diferenciando el melanoma de las lesiones melanocíticas identificando y validando una firma genética específica del 50 melanoma. Los resultados de la prueba demuestran un aumento progresivo en al menos dos genes que se expresan de forma diferente en el melanoma: SILV y GDF15. Sin embargo, según el análisis multivariado con un modelo de regresión lineal, a adición de GDF15 no mejoró el desempeño de SILV más allá del AUC de 0.94 en los casos claros. Por tanto, SILV está designado como el marcador final para la prueba de biopsia de melanoma. También se observó una diferencia significativa entre los nevos severamente atípicos y melanoma para SILV con una p de 0.0077

55 haciendo este marcador aplicable para el diagnóstico de los casos claros (inequívocos) y sospechosos (equívocos), siendo los últimos el reto más difícil para los patólogos expertos.

Tabla 6.

Descripciones de secuencia, Nombres y SEQ ID NOs

SEQ ID No.: PSID Affymetrix Símbolo de gen Nombre de secuencia, Adhesión No. Secuencia 5’ -3’ Nombre del gen en NCBI

1: 209848_s_at SILV Cebador hacia delante NM_006928.3 Homólogo plateado de Homo sapiens (ratón) (SILV), mRNA

2: SILV Cebador inverso

3: Sonda SILV

4: 206630_at TYR ABI AoD*, NM_000372.4 Hs00165976_m1 Tirosinasa de Homo sapiens (albinismo oculocutáneo

5: 221577_x_at GDF15 Cebador hacia delante NM_004864.1 CGCCAGAAGTGCGGCT Factor de diferenciación del crecimiento de Homo sapiens 15 (GDF15), mRNA

6: GDF15 Cebador inverso CGGCCCGAGAGATACGC

7: GDF15 Sonda MGB FAM-ATCCGGCGGCCAC

(continúa)

Descripciones de secuencia, Nombres y SEQ ID NOs

SEQ ID No.: PSID Affymetrix Símbolo de gen Nombre de Adhesión No. Secuencia 5’ -3’ Nombre del gen en NCBI

8: 204585_s_at L1CAM Cebador hacia NM_000425.2 Molécula de adherencia celular L1 de Homo sapiens, mRNA

9: L1CAM Cebador inverso

10: L1CAM Sonda MGB

Secuencias a longitud completa de 4 marcadores como se proporciona en la base de datos NCBI. [0056]

>gi|113722118|ref|NM_000372.4| Tirosinasa de Homo sapiens (albinismo oculocutáneo IA) (TYR), mRNA

>gi|153792494|ref|NM_004864.2| Factor 15 de diferenciación de crecimiento de Homo sapiens (GDF15), mRNA

>gi|42542384|ref|NM_006928.3| Homólogo plateado (ratón) de Homo sapiens (SILV), mRNA

>gi|13435354|ref|NM_000425.2| Molécula de adherencia celular L1 de Homo sapiens (L1CAM), variante 1 del trascripto, mRNA

LISTADO DE SECUENCIA

[0057]

<110> VERIDEX, LLC 45 <120> MÉTODOS Y REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN PRECOZ DEL MELANOMA

<130> P055082EP

<150> uS61/223,894

<151> 2009-07-08

<160> 17

<170> seqwin99, versión 1.02 55

<210> 1

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1

agcttatcat gcctggtcaa 20 65

<210> 2 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Cebador

5 <400> 2 gggtacggag aagtcttgct 20

<210> 3

<211> 21 10 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Sonda 15

<220>

<221> misc_feature

<222> 1

<223>: N = A marcado con carboxifluoresceína 20

<220>

<221> misc_feature

<222> 21

<223>: N = T marcado con 2,5-di-tert-butilhidroquinona-1 25

<400> 3 nggttccgct atcgtgggca n 21

<210> 4 30 <211> 2082

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 4 35

30 35: <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador

40: <400> 5 aggttccgct atcgtgggca t 21

45: <210> 6 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador

50: <400> 6 cggcccgaga gatacgc 17

55: <210> 7 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

60: <220> <223> Sonda <220> <221> misc_feature

65: <222> 1 <223> N = A marcado con carboxifluoresceína

<400> 7 ntccggcggc cac 13

5: <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador

<400> 8 actatggcct tgtctgggat ctc 23

15: <210> 9 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador

25: <400> 9 agatatggaa cctgaagttg cactg <210> 10 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
25

<220> <223> Sonda

35: <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> N = C marcado con carboxifluoresceína

<400> 10 naccatctca gccacagc: 18

45: <210> 11 <211> 57 <212> ADN <213> Homo Sapiens

<400> 11 cgccagaagt gcggctggga tccggcggcc acctgcacct gcgtatctct cgggccg: 57

<210> 12 <211> 89 <212> ADN <213> Homo Sapiens

55: <400> 12

<210> 13

<211> 137

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 13

<211> 70

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 1220 15 <212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 2143

<212> ADN 45 <213> Homo Sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 4525

<212> ADN

40: <213> Homo Sapiens

<400> 17

45

50

55

60

65

Claims

Reivindicaciones

1. Un método para identificar un melanoma en una muestra de tejido que comprende los pasos de

5 a) medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican el ARNm correspondiente a SILV; b) medir el nivel de expresión de un gen que codifica la tirosinasa; y c) medir el nivel de expresión de SILV en relación con tirosinasa;

donde los niveles de expresión de SILV en relación con tirosinasa son indicativos de la presencia de un melanoma. 10
2.

El método de la reivindicación 1 donde la muestra es una muestra de biopsia primaria de piel.
3.

El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde la expresión genética se mide en una microdisposición

o genechip. 15
4. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2 donde la expresión genética se determina por la amplificación de ácidos nucleicos conducida por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ARN extraído de la muestra.
5.

El método de la reivindicación 4 donde la reacción en cadena de la polimerasa es la qRT-PCR. 20
6. El uso de un kit en el método de cualquiera de las afirmaciones 1 a 4, donde el kit comprende reactivos de amplificación y detección de ácidos nucleicos.
7.

El uso de la reivindicación 6 donde los reactivos de amplificación de ácidos nucleicos comprenden cebadores 25 con la secuencia de las SEQ ID NOs 1 y 2 y una sonda con la secuencia de la SEQ ID NO: 3.

Benigno Maligno

ESTADO