MX2007000291A

MX2007000291A - Metodos y reactivos para la deteccion de melanoma.

Info

Publication number: MX2007000291A
Application number: MX2007000291A
Authority: MX
Inventors: Yixin Wang; Abhijit Mazumder; Dimitri Talantov
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2007-08-07
Also published as: BRPI0512587A; KR20070048701A; EP1812590A2; AU2005258331B2; NZ552324A; PT1812590E; AU2005258331A1; DK1812590T3; ES2323972T3; ATE428808T1; DE602005013998D1; CN101258249A; WO2006002433A3; IL180208A0; EP1812590B1; JP2008504034A; CA2572338A1; WO2006002433A2

Abstract

Se describe un ensayo para identificar un melanocito maligno al determinar si la expresion diferencial de genes particulares que son indicativos de melanoma excede un valor limite; el ensayo se puede llevar a cabo intraoperatoriamente sobre tejido de nodulo linfatico.

Description

MÉTODOS Y REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN DE MELANOMA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El melanoma maligno cutáneo es un cáncer agresivo común con incidencia cada vez mayor. Es un grave problema del cuidado de la salud con más de 55,100 casos nuevos anticipados en 2004 en Estados Unidos y una tasa de mortalidad de aproximadamente 14.5%. Cáncer Facts and Figures 2003. American Cáncer Society, 2003. La incidencia de melanoma continúa aumentado más rápido que la de cualquier otro cáncer. De Braud et al. (2003). Aunque el pronóstico del melanoma local temprano es favorable con una supervivencia general a 5 años superior a 90%, la relación de los nodulos linfáticos regionales disminuye la tasa de supervivencia general a 10-46%. Balch et al (2001). Por lo tanto, el estado de los nodulos linfáticos (LN) regionales se vuelve un factor de pronóstico más significativo en la supervivencia de un paciente con melanoma. La introducción de la técnica de los nodulos linfáticos centinelas (SLN) (Morton (1992)) ha aumentado la sensibilidad de detección de micrometástasis de melanoma en comparación con la tinción de H y E sola. Yu et al. (1999) y Messina et al. (1999). No obstante, incluso cuando se incrementa por IHC, el análisis histológico está limitado por la capacidad de la microscopía óptica para reconocer las células tumorales. Recientemente se ha propuesto que el análisis de reacción en cadena de polimerasa y transcripción inversa (RT-PCR) para una detección más sensible de células de melanoma en LN. Muchos estudios, cuando utilizan marcadores específicos de melanocito bien caracterizados, tales como tirosinasa y MART-1 han demostrado la presencia de estos transcritos de gen en los LN que de otra manera se consideran negativos al realizar un análisis cistológico sistemático e IHC. Shivers et al. (1998); y Kuo et al. (2003). No obstante, estos genes no son específicos para células tumorales y no se pueden utilizar para discriminar entre tejido benigno y maligno. De hecho, general resultados falsos positivos en presencia de nevo capsular benigno. Takeuchi et al. (2004); Starz et al. (2003); y Gutzmer et al. (2002). Considerando que los nevos benignos no son eventos rayos en el SLN con melanoma, los ensayos de RT-PCR actuales no son clínicamente útiles para el diagnóstico de micrometástasis de melanoma. Un estudio reciente, que propone un conjunto de marcador múltiple, incluye marcadores específicos de cáncer para ensayo RT-PCR con el fin de incrementar la especificidad del ensayo. Hoon et al. (2004). La identificación de marcadores específicos novedosos para melanoma permanece como una de las cuestiones claves en la investigación de melanomas. Se ha demostrado que algunas proteínas están asociadas con melanoma y su metástasis. Estas proteínas o sus actividades se han utilizado en IHC para identificar metástasis e incluyen L1CAM (Thies et al. (2002); Fogel et al. (2003)) y S-100 (Diego et al. 2003)). Se han propuesto pruebas con ácido nucleico para aumentar la sensibilidad de detección del melanoma metastásico. Las publicaciones de patentes de E.U.A. números 2002/0110820 y 2003/0232356. Los estudios han utilizado marcadores que incluyen MAGE3, tirosinasa, MART-1 , MITF-M o IL.1 , R1 , endotelina-2, efrina-A5, proteína 7 de unión de IGF, cadena pesada de HLA-A0202, activina A (subunidad ßA), TNF Rll, SPC4, CNTF Ra o genes para gp100 (HMB45). Bostick et al. (1999); Hoon et al. (2001); Palmieri et al. (2001); Wrighston et al. (2001); Gutzmer et al. (2002); Davids et al. (2003); Starz et al. (2003); Rimboldi et al. (2003); Cook et al (2003); Reintgen et al. (2004); Publicaciones de patentes de E.U.A. números 2002/0098535; 2003/0049701 ; Patentes de E.U.A. números 5,512,437; 5,512,444; 5,612,201 ; 5,579,783; 5,844,075; 6,025,474; 6,057,105; 6,235,525; 6,291 ,430; 6,338,947; 6,369,211 ; 6,426,217; 6,475,727; 6,500,919; 6,527,560; 6,599,699; WO 96/29430. Cuando se determinan, estos marcadores no se ha encontrado que sean adecuados para uso único en diagnóstico de melanoma. Riccioni et al. (2002); Gutzmer et al. (2002); Davids et al. (2003); Goydos et al. (2003); y Prichard et al. (2003). Muchos de estos marcadores también se ha demostrado que son indicativos de otras neoplasias tales como ME20M (GP100) para sarcoma de células claras, carcinoma de tracto biliar y carcinoma gástrico. Hiraga et al. (1997); Okada et al. (2001 ); Okami et al. (2001 ); Antonescu et al. (2002); Segal et al. (2003). MAGE3 también es indicativo de numerosas neoplasias que incluyen cáncer de mama, hepatocelular, renal, neural, de pulmón y esofágico. Yamanaka et al. (1999); Ooka et al. (2000); Suzuki et al. (200); Cheung et al. (2001 ); y Weiser et al. (2001). Varios genes que codifican para antígeno de melanina también se expresan en cáncer de pulmón Yoshimatsu et al (1998) Estos marcadores demostraron ser sensibles pero no específicos dado que muestran expresión positiva en otros cánceres y melanocitos benignos Adicionalmente, la tirosinasa se expresa en células de Schwann las cuales están presentes en nodulos linfáticos normales La carencia de especificidad sola hace necesario el desarrollo de ensayos con marcadores nuevos o adicionales La histología por H y E e IHC permanece como la "norma principal para la identificación de melanoma y células de nevo en SLN" Starz et al (2003) Los temas de la detección en un ámbito intraoperatopo vuelven esta necesidad incluso más aguda La relación de los nodulos linfáticos es el factor de pronóstico más fuerte en muchos tumores sólidos y la detección de micrometástasis en nodulo linfático es de gran interés para los patólogos y cirujanos La evaluación actual de los nodulos linfáticos involucra examen microscópico de cortes de tejido teñidos con H y E e IHC y adolece de tres limitaciones principales (a) focos pequeños de células, se pierden con facilidad, (b) el resultado no está disponible rápidamente, lo que significa que cualquier posible resultado en un procedimiento SLN requiere una segunda cirugía para extracción de los nodulos linfáticos axilares, y (c) únicamente se estudian una o dos secciones de tejido y por lo tanto la gran mayoría de cada nodulo permanece sin examinar El seccionamiento en serie puede ayudar a corregir este error de muestreo e IHC puede ayudar a identificar focos pequeños de células. No obstante, esta combinación es costosa y consume tiempo para un análisis sistemático. Las decisiones quirúrgicas de extirpación de nodulos linfáticos regionales se puede basar en análisis de cortes congelados intraoperatorios de los nodulos linfáticos; no obstante, la sensibilidad de estos métodos es relativamente pobre, y varía de 50 a 70% en relación a la patología H y E estándar, lo que genera una alta tasa de cirugías adicionales. De esta manera, los patólogos habitualmente no realizan un análisis de un corte congelado intraoperatorio o análisis de citología de impresión al tacto para pacientes con melanoma. Las mejoras en la sensibilidad y especificidad de ensayos intraoperatorios para melanoma puede beneficiar de manera significativa a la oncología. Se han aplicado microarreglos de alta densidad para monitorear simultáneamente la expresión en muestras biológicas de miles de genes. Los estudios han resultado en la identificación de genes que se expresan de manera diferencial en lesiones benignas y cancerosas, asi como genes que pueden ser de valor pronóstico. Luo et al. (2001); y Wang et al. (2004). La expresión de un gen que se perfila de un melanoma maligno o canceroso se ha llevado a cabo utilizando sondas que contienen microarreglos para 8,150 ADNc. Bittner et al. (2000). Estos investigadores identificaron varios genes que pueden ser asociados con un comportamiento de tumor agresivo. En investigaciones recientes, la comparación de los perfiles de expresión de genes de algunos melanomas y líneas de células de melanocitos normales llevaron a la identificación de genes que se expresan de manera diferencial y vías moduladas en melanoma Takeuchi et al (2004) BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente invención se proporciona un perfilado de expresión de gen de un conjunto extenso de muestras de tejido clínicamente relevantes El ARN total de cuarenta y cinco melanomas malignos primarios, 18 nevos cutáneos benignos y 7 tejidos cutáneos normales se hibpdizan en un microarreglo Affymetrix Hu133A que contiene 22,000 conjuntos de sondas Se identificaron genes que se expresan de manera diferencial en melanoma maligno en comparación con tejido benigno El análisis de la vía de los genes que se expresan de manera diferencial mostró una representación excesiva de genes asociados con desarrollo de tejido neural y activación de la vía de señalización de procesamiento amiloide Se utilizo un ensayo de RT-PCR cuantitativo de una etapa para probar una combinación de dos genes específicos para melanoma, PLAB y L1CAM en un conjunto de muestras clínicamente relevantes que incluyen melanoma maligno primario, nevos benignos, metástasis de LN de melanoma y muestras de nodulo linfático libre de melanoma La presente invención proporciona un método para identificar un melanoma al obtener una muestra de tejido, y realizar un ensayo y medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican para ARNm que corresponden al factor de diferenciación de próstata (PLAB, MIC1 ) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 y molécula de adhesión celular L1 (L1CAM) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2); o PLAB, L1CAM y receptor de tirosina cinasa neurotrófica tipo 3 (NTRK3) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3) en donde los niveles de expresión de gen por encima de los niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. La invención proporciona adicionalmente un método para identificar un melanoma al obtener una muestra de tejido; y ensayar y medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican para ARNm reconocidos por los conjuntos de cebador/sonda SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15; o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18 en donde los niveles de expresión de gen por encima de los niveles límite predeterminados anteriores son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. La invención también proporciona un método para distinguir un melanocito maligno de un melanocito benigno al obtener una muestra de tejido; y realizar un ensayo y medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican para PLAB y LICAM; o PLAB, L1CAM y NTRK3, en donde los niveles de expresión de gen por encima de los niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. La invención también proporciona un método para distinguir un melanocito maligno de un melanocito benigno al obtener una muestra de tejido; y ensayar y medir los niveles de expresión en la muestra de genes reconocidos por los conjuntos de cebador/sonda SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15; o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18 en donde los niveles de expresión de gen por encima de los niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. La invención proporciona adicionalmente un método para determinar el protocolo de tratamiento de un paciente al obtener una muestra de tejido del paciente; y ensayar y medir los niveles de expresión en la muestra de genes que codifican para PLAB y LICAM; o PLAB, L1CAM y NTRK3, en donde los niveles de expresión de gen por encima de los niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. La invención proporciona adicionalmente un método para determinar un protocolo de tratamiento en un paciente al obtener una muestra de tejido del paciente; y ensayar y medir los niveles de expresión en la muestra de genes reconocidos por los conjuntos de cebador/sonda SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15; o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18 en donde los niveles de expresión de gen por encima de los niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. La invención proporciona adicionalmente un marcador adicional y genes control, la expresión de los cuales ayuda en los métodos que se reclaman. Estos genes adicionales incluyen las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-467 reguladas por aumento y las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 468-978 regualadas por disminución. El marcador primario puede ser PLAB y se define en la presente como el gen que codifica para cualquier variante, alelo, etc., que incluye la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1. También se describe PLAB por Paralkar et al. (1998) y está representada por el número de acceso AF003934. PLAB también se define como el gen que codifica para ARNm reconocido por los conjuntos de cebador/sonda de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-9. El marcador secundario puede ser L1 CAM y se define en la presente como el gen que codifica para cualquier variante, alelo, etc., que incluye la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2. L1CAM también se describe por Haspel et al (2003); y la patente de E.U.A. número 6,107,476 y está representada por el número de acceso NM_000425. L1CAM también se define como el gen que codifica para ARNm reconocido por los conjuntos de cebador/sonda de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-15. La invención proporciona adicionalmente un equipo para llevar a cabo un ensayo para determinar la presencia de melanoma en una muestra de células que comprende: amplificación de ácido nucleico y reactivos de detección. La invención proporciona adicionalmente conjuntos de cebador/sonda para amplificación y detección de productos de PCR obtenidos en los métodos de la invención. Estos conjuntos incluyen lo siguiente: SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 (cebador directo PLAB) ggcagaatcttgtccgca SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 (cebador inverso PLAB) ggacagtggtccccgttg SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 (sonda PLAB) cccagctggagttgcacttgcggcc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 7 (cebador superior PLAB) gaacaccgacctcgtccc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 8 (cebador inferior PLAB) ggcggcccgagagata SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 9 (sonda PLAB) cgccagaagtgcggctgggattt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 10 (L1CAM directo) gctgggactgggaacagaact SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 11 (L1 CAM inverso) ggagcagagatggcaaagaaa SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 12 (sonda L1CAM) ttccccaccatctgctgt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 13: L1CAM superior) ccacagatgacatcagcctcaa SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 14 (L1CAM inferior) ggtcacacccagctcttcctt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 15 (sonda L1 CAM) tggcaagcccgaagtgcagttcctt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 16 (cebador NTRK3) gccccggcacccttta SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 17 (cebador NTRK43) aaccctgccagtggtggat SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 18 (sonda NTRK3) cagatgggtgttttc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 19 (Tyr superior) actcagcccagcatcattcttc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 20 (Tyr inferior) atggctgttgtactcctccaatc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO. 21 (sonda Tyr) cttctcctcttggcagattgtctgtagctt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 22 (PBGD superior) ccacacacagcctactttccaa SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23 (PBGD inferior) tacccacgcgaatcactctca SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24 (sonda PBGD) aacggcaatgcggctgcaacggcggaatt La invención proporciona adicionalmente amplicones que se obtienen por métodos de PCR utilizados en los métodos de la invención. Estos amplicones incluyen a los siguientes: SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25 (Amplicón PLAB) gaacaccgacctcgtcccggcccctgcagtccggatactcacgccagaagtgcggctgggatccggcggc cacctgcacctgcgtatctctcgggccgcc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26 (Amplicón L1CAM) ccacagatgacatcagcctcaagtgtgaggccagtggcaagcccgaagtgcagttccgctggacagagg ggatggtgtcacttcaaaccaaggaagagctgggtgtgacc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27 (Amplicón tirosinasa) actcagcccagcatcattcttctcctcttggcagattgtctgtagccgattggaggagtacaacagccat SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28 (Amplicón PBGD) ccacacacagcctactttccaagcggagccatgtctggtaacggcaatgcggctgcaacggcggaagaa aacagcccaaagatgagagtgattcgcgtgggta Otros genes descritos en la presente incluyen marcadores regulados por aumento (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29- 467), marcadores regulados por disminución (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 468-978), PBGD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 979), MART1 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 980), ME20M (GP100; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 981) y MAGE-3 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 982) y varios cebadores y sondas (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 983-1011 ) utilizadas en detectar su expresión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama de flujo de análisis de datos. Las figuras 2, 2A-2E son un agrupamiento jerárquico en los 15,795 genes que tienen por lo menos dos llamadas de "presente" en todas las muestras. Cada columna es una muestra y cada hilera es un gen. El color rojo es regulación por aumento y el color verde es regulación por disminución. El color púrpura indica muestras de melanoma; el amarillo indica nevos benignos y el color azul indica piel normal. Las figuras 3A-3B son la expresión de microarreglo (A) y datos de validación de RT-PCR en tiempo real (B) de los genes seleccionados. Las primeras catorce muestras desde la izquierda son muestras de tejido de melanoma (rojo); los siguientes siete son muestras de nevos benignosmalignos (amarillo) y los últimos cinco son piel normal (azul). Para gráficas de microarreglo el eje de las abscisas muestran valores de intensidad; para gráficas de PCR, el eje de las abscisas es 2?CT, en donde ?Ct (gen objetivo) - Ct de PBDG. La figura 4 es la vía de procesamiento amiloide. Adoptada de la aplicación de análisis software de vía lngenuityMR. Los genes regulados por aumento en melanoma están en rojo y los regulados por disminución en melanoma están en verde. Cada simbolo de gen es seguido por un múltiplo de cambio en el nivel de expresión entre el melanoma y muestras benignas/normales.

Las figuras 5A y 5B son un ensayo de RT-PCR cuantitativo de una etapa de PLAB y L1 CAM (A) y marcadores de melanoma convencionales gp100, tirosinasa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 999) y MART1 (B). Para cada gráfica, el eje de las abscisas representa la calificación para marcadores nuevos o los marcadores convencionales. Se marcan las medianas de calificaciones para cada categoría de muestras. Dos niveles límite basados en muestras normales (verdes) y benignas (rojas) se marcan en cada gráfica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para identificar cualitativa y cuantitativamente un melanoma; distinguir un melanocito maligno de un melanocito benigno; diagnosticar lesiones melanocíticas con características patológicas inciertas; y determinar un protocolo de tratamiento para un paciente con melanoma. Los métodos proporcionan adicionalmente ayuda en el pronóstico de pacientes, monitoreo de pacientes y desarrollo de medicamentos. Los métodos se basan en ensayar y medir los niveles de expresión de diversos genes marcadores que codifican para ARNm que se proporcionan en la presente, en donde la expresión del gen sobre un nivel límite predeterminado es indicativo de la presencia de un melanocito maligno en la muestra ensayada.

El melanoma cutáneo es un cáncer agresivo común con incidencia cada vez mayor. La identificación de genes desregulados específicos de melanoma puede proporcionar marcadores moleculares para ensayos de etapa de LN y una percepción adicional de la tumorigénesis del melanoma. Se analizaron el ARN total aislado de 45 melanomas primarios, 18 nevos cutáneos benignos y 7 tejidos de especímenes de piel normal en un microarreglo Affimetrix U133A que contiene 22,000 conjuntos de sonda. El agrupamiento jerárquico mostró una separación distinta de las muestras de melanoma de los especímenes benignos y normales. Se identificaron genes novedosos asociados con melanoma maligno. Se prueba la expresión diferencial de gen de dos genes específicos de melanoma, PLAB y L1 CAM mediante un ensayo de RT-PCR cuantitativo de una etapa sobre el melanoma maligno primario, nevos benignos y muestras de piel normal y también sobre metástasis de LN de melanoma maligno y nodulos linfáticos libres de melanoma. Se compara el funcionamiento de los marcadores con marcadores de melanoma convencionales tales como tirosinasa, GP100 y MART1. Los resultados demuestran la capacidad de utilizar una combinación de PLAB y L1CAM en un ensayo RT-PCR para diferenciar muestras de tejido clínicamente relevantes que contienen melanocitos benignos o malignos. El ADNc de alta densidad y los microarreglos oligonucleotídicos permiten el monitoreo simultáneo de la expresión de miles de genes. La tecnología de microarreglo proporciona una medición cuantitativa de la abundancia de ARNm y ha ganado aceptación como herramienta para el descubrimiento de marcador en base en la expresión de genes. En el contexto de la investigación del cáncer, el análisis de microarreglo ha identificado genes que se expresan de manera diferencial en lesiones benignas y malignas, diferentes tipos de cáncer que tienen significancia de pronóstico. Luo et al. (2001); Su et al. (2001); Henshall et al. (2003); y Wang et al. (2004). La primera expresión de gen que se perfila de melanoma maligno utilizó un microarreglo que contiene sondas para 8,150 ADNc e identificó genes que pueden estar asociados con un comportamiento de tumor agresivo. Bittner et al. (2000). Dado que las muestras analizadas en su estudio no incluyen tejido que contiene melanocitos normales o benignos, no se identificaron genes que se expresen de manera diferencial en melanoma maligno. En contraste con la piel normal, el contenido de melanocitos en los nevos benignos es cercano al que se encuentra en melanoma. En otro estudio, dos muestras acumuladas derivadas ya sea de tejidos de melanoma o de nevos malignos de hibridizan a un arreglo de ADNc y se encontraron genes que se expresan de manera preferencial en muestras derivadas de melanoma o de nevos. Seykora et al. (2003). Otros investigadores utilizaron la hibridación sustractiva o análisis de bibliotecas SAGE generadas en líneas de células de melanoma, para monitorear la expresión de genes en melanoma. Hipfel et al. (2000); y Weeraratna (2004). Recientemente, la comparación de los perfiles de expresión de gen de algunas líneas de células de melanoma y de melanocitos llevó a la identificación de genes que se expresan de manera diferencial y vías moduladas en melanoma. Hoek et al. (2004). Aunque estos estudios proporcionaron un fundamento sólido para la genética del melanoma, no hay un marcador que pueda diferenciar con claridad al melanoma de un tejido benigno. Varios marcadores utilizados actualmente tales como tirosinasa y Mart-1 no pueden diferenciar entre tejido benigno y maligno. Takeuchi et al. (2004). En consecuencia, estos marcadores tienen uso limitado en aplicaciones tales como establecimiento de la enfermedad intraoperatoria basada en nodulos linfáticos. Las dificultades en obtener suficientes muestras de ARN de melanoma maligno y de lesiones de melanocitos benignas, heterogeneidad de tejido y la presencia de melanina en ARN purificado permanecen como los principales retos en estos estudios. En el estudio que se presenta aquí, el ARN total aislado de 45 melanomas malignos primarios, 18 nevos cutáneos benignos y 7 tejidos cutáneos normales se hibridizan en un microarreglo Affymetrix Hu133A que contiene 22,000 conjuntos de sonda. Se desarrolló un método de extracción de ARN modificado para producir muestras de ARN libres de melanina que incrementaron las señales de hibridación de microarreglo. El agrupamiento jerárquico mostró una separación distinta de las muestras de melanoma en comparación con especímenes benignos y normales. El método de análisis de significancia de microarreglo (SAM), la prueba t y el análisis percentil identificaron 439 genes regulados por aumento (SECUECNIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-467) y 51 1 genes regulados por disminución (SECUECNIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 468-978) en las muestras de melanoma. Además de los genes bien caracterizados tales como me20m (gp100), el receptor 1 de melanocortina y L1CAM, se identificaron muchos genes novedosos previamente no asociados con melanoma que incluyen a NTKR3 y PLAB. El análisis de la vía de los genes expresados diferencialmente mostró una representación excesiva de genes asociados con desarrollo de tejido neural y función, activación de procesamiento amiloide y vías de señalización de integrina. Se realizaron ensayos RT-PCR para confirmar la expresión diferencial de los genes seleccionados. Los métodos proporcionados tienen especificidad y sensibilidad suficientes para detectar metástasis de melanoma. Una comparación de los métodos actuales disponibles indica que los métodos tradicionales de H y E e IHC clínicamente son aceptables mientras que, antes de la presente invención, los métodos de PCR eran inaceptables. El cuadro 1 muestra los inconvenientes y ventajas de los métodos actuales antes de la invención que se reclama en la presente.

CUADRO 1 En la presente invención, la especificidad preferiblemente es de por lo menos 95%, de manera más preferible la especificidad es de por lo menos 97%, y de manera más preferible la especificidad es de por lo menos 99% en base en una comparación de nodulos negativos por H y E e IHC. Preferiblemente, la sensibilidad es de por lo menos de 80%, de manera más preferible, la sensibilidad es de por lo menos 85% y de manera mucho más preferible la sensibilidad es de por lo menos 90%, en base en una comparación de nodulos positivos a H y E e IHC. Preferiblemente, la especificidad y sensibilidad son de por lo menos 97%, en base en una comparación de nodulos negativos por H y E e IHC, y de por lo menos 85% en base en una comparación de nodulos positivos por H y E e IHC, respectivamente. Preferiblemente, los niveles límite predeterminados son por lo menos dos veces la expresión excesiva en tejido que tiene melanoma metastásico en relación a melanocitos benignos o tejido normal. Los métodos preferidos de la invención utilizan una técnica rápida para extraer ácidos nucleicos de una muestra de tejido y un método de amplificación y detección de fragmentos de ácido nucleico indicativos de metástasis. Los fragmentos de ácido nucleico miden cualitativa y cuantitativamente ARNm codificado por los genes marcadores. Las muestras de tejido incluyen módulo linfático, tanto regional como centinela, lesiones cutáneas y otro material de biopsia.

Los métodos que se proporcionan en la presente permiten la detección intraoperatoria de micrometástasis lo que permite al médico determinar si se extirpan nodulos linfáticos adicionales y si se implementa de inmediato un protocolo de tratamiento apropiado. Como se muestra en el cuadro 2, si se encuentra que un LN es positivo para melanoma, se extirpan los LN regionales y se puede sugerir un tratamiento con interferón. Los métodos de biopsia estándar pueden necesitar más de una semana y un resultado positivo requiere una cirugía adicional para extirpar los LN y existe un retardo concomitante en el tratamiento con interferón.

CUADRO 2 Es importante muestrear adecuadamente el tejido utilizado para llevar a cabo el ensayo. Esto incluye una extirpación adecuada y procesamiento de la muestra de tejido así como extracción del ARN. Una vez que se obtiene, es importante procesar las muestras de tejido apropiadamente de manera que se detecte cualquier célula cancerosa presente. En la modalidad más preferida de la invención, el muestreado de los nodulos también proporciona atención tanto intraoperatoriamente como extraoperatoriamente. Dado que la distribución de células cancerosas en los nodulos no es uniforme, es preferible que se tomen muestras de secciones múltiples de los nodulos. Cada SLN identificado debe ser enviado para evaluación patológica. El material SLN habitualmente se fija en formalina y se examina como una muestra de tejido embebida en parafina y fijada en formalina. Se procesan partes igualmente representativas de SLN para análisis molecular (tejido fresco) e histología (tejido fijado). Los procedimientos de muestreo de LN generales se describen en Cochran et al. (2001) y Cochran et al. (2004). Un método para llevar a cabo tanto una prueba basada en moléculas como un examen de la misma muestra de nodulo por patología, es bisectar el nodulo a través de su diámetro más largo. Después, cada mitad se divide en por lo menos cuatro secciones de cara completa con por lo menos una sección exterior e interior para patología, como material fijado, y por lo menos una sección exterior e interior para pruebas moleculares. Dado que la distribución de metástasis y micrometástasis no es uniforme en los nodulos u otros tejidos, se debe obtener una muestra suficientemente grande de que no se han perdido metástasis. Una solución a este tema de muestreo en el presente método es homogeneizar una muestra de tejido grande y posteriormente realizar una dilución de la muestra homogeneizada y bien mezclada para ser utilizada en pruebas moleculares subsecuentes. En el caso de muestras de tejido LN, es preferible extraer cualquier tejido adiposo antes de la ruptura celular. La ruptura de células y de tejido de manera manual puede ser por cualquier método conocido en la técnica tal como un molino de tejido desechable descrito en la patente de E.U.A. 4,715,545 o un homogeneizador comercial tal como Omni GLH115 con sondas desechables (Omni International, Warrenton, VA). El tiempo de homogeneízación está dentro de 1 a 2 minutos y, de manera más preferible es de 30-45 segundos. La muestra después se puede procesar para purificar el ARN antes de realizar el ensayo y medir los niveles de expresión de marcador. Los métodos de purificación de ARN adecuados incluyen columnas tales como, (por ejemplo, la minicolumna RNeasy, QIAshredder, QIAGEN Inc., Valencia, CA o un sustituto adecuado). Están disponibles una diversidad de técnicas para extraer ácidos nucleicos de muestras de tejido. Los equipos de extracción de ácido nucleico disponibles comercialmente típicos requieren por lo menos 15 minutos para extraer el ácido nucleico. En los métodos preferidos intraoperatorios de la presente invención, el ácido nucleico se extrae en menos de 8 minutos y de manera preferible en menos de 6 minutos.

El aislamiento exitoso de ARN intacto generalmente involucra cuatro etapas: ruptura eficaz de las células o del tejido, desnaturalización de los complejos de núcleo proteína, inactivación de la ribonucleada (RNasa) endógena y separación del ADN y las proteínas contaminantes. Las propiedades de ruptura y protectoras del isotiocianato de guanidinio (GITC) y ß-mercaptoetanol (ß-me) para inactivar las ribonucleosas presentes en extractos celulares los vuelven los reactivos preferidos para la primera etapa. Cuando se utiliza junto con un tensioactivo tal como dodeciisulfato de sodio (SDS), la ruptura de los complejos de nucleoproteína se obtiene permitiendo que el ARN sea liberado en solución y se aisle libre de proteína. Los tejidos son homogeneizados en el amortiguador de lisos que contiene GICT, además de que el etanol genera las condiciones apropiadas para que el ARN se una a la membrana de sílice. La centrifugación puede depurar el lisado de las proteínas precipitadas y el ADN celular y preferiblemente se realiza a través de una columna. La purificación de ARN preferiblemente se lleva a cabo en una columna giratoria que contiene sílice u otro material. El ARN se precipita por medio de la columna de centrifugación como se describe en lo anterior y los tiempos de centrifugación preferiblemente son no mayores a 30 segundos. Típicamente, la muestra se diluye con un volumen igual de etanol 70% y se mezcla perfectamente antes de aplicarlo a la columna. Después del lavado, la columna se seca por centrifugación y se eluye ARN en agua libre de ribonucleasa y se recolecta por centrifugación. El tiempo total de este protocolo rápido es menor de 8 minutos y preferiblemente menor de 6 minutos. En resumen, el método de extracción rápida de ARN involucra las siguientes etapas: obtención de una muestra de tejido; homogeneización del tejido para producir un homogeneizado; poner en contacto el homogeneizado con un sustrato que contiene, o al cual se ha fijado, un material de unión de ARN; permitir que el ARN se una a un material de unión de ARN; lavar el sustrato bajo condiciones suficientes para eliminar cualquier contaminante, interferencia o ARN no unido; y eluir el ARN unido del sustrato. Los reactivos involucrados en este procedimiento de extracción rápida pueden ser aquellos proporcionados por el fabricante o pueden ser, por ejemplo: amortiguador de lisis/unión (preferiblemente GITC 4.5M, NaPO4 100 mM), amortiguador 1 de lavado (preferiblemente, etanol 37% en GITC 5M, Tris-HCl 20 mM) amortiguador de lavado II (preferiblemente, etanol 80% en NaCI 20 mM, Tris-HCl 2 mM) y agua bidestilada estéril, libre de nucleasa para elución.

En un método, antes del procedimiento para aislar ácidos nucleicos como se describe en lo anterior, las muestras de tejido se pesan y colocan en tubos de cultivo de polipropileno de 8 ó 14 ml y se preenfrían en hielo seco. Las muestras de tejido congeladas después se dividen en piezas de aproximadamente 50 mg o menos sin permitir que se recalienten. Todos los amortiguadores son aquellos proporcionados por QIAGEN en su miniequipo RNeasy. Se agrega un volumen de amortiguador de homogeneización (lisis) al tejido que se encuentra en el cuadro 3.

CUADRO 3 *Tejido superior a 550 mg se divide en partes equivalentes y se procesa como muestras individuales. Un método alternativo para calcular el volumen de amortiguador de lisis para tejidos superiores a 100 mg es agregar 1 ml por tejido de 50 mg; utilizar 2 ml para tejidos menores de 100 mg. La muestra de tejidos después se homogeneiza, por ejemplo por el equipo Omni GLH115 a un ajuste de potencia a grado 6, un adaptador A1000 y sondas desechables. El homogeneizado después se mezcla con un volumen igual de etanol 70% y se mezcla perfectamente, por ejemplo mediante remolino en un equipo VWR modelo G560 ajustado a una velocidad 10 (máxima) durante aproximadamente 10 segundos o al pipetear 4-5 veces. La mezcla de homogeneizado/etanol después se aplica a una minicolumna RNeasy montada en un múltiple de vacío en un volumen de acuerdo con el cuadro 4, de manera que se carga una cantidad consistente del tejido original (aproximadamente 5 mg/columna) y de esta manera se producen rendimientos de ARN comparables para cada muestra de tejido.

CUADRO 4 Después se aplica vacío a la columna para extraer el líquido. Se obtiene el vacío y se aplican dos lavados de 700 ml, primero con amortiguador RWI y el segundo con amortiguador RPE, cada uno separado por filtración. En cada caso el vacío es a 800-1200 mbar. La columna después se coloca en un tubo de recolección d 1.5 ml y se centrifuga en una centrífuga Eppendorf 5415D a 13,200 rpm durante 30 segundos para que seque. La columna se transfiere a un tubo de recolección de 1.5 ml. Se agregan directamente a la membrana 50 µl de agua libre de ribonucleasa, y la columna se centrífuga en una centrífuga Eppendorf 5415D durante 30 segundos a 13,200 rpm para eluir el ARN. Se determina la calidad del ARN con un equipo Agilent Bioanalyzer y el ARN se almacena a -70°C. La melanina puede perjudicar la eficiencia de la transcripción revertida y las reacciones de amplificación. En consecuencia, se lleva a cabo un proceso de separación de melanina cuando se sospecha que la muestra contiene una cantidad significativa de melanina (como en el caso de muestras de un melanoma primario o nevos cutáneos benignos) y es una preocupación menor cuando se realiza el ensayo en un SLN dado que el contenido de melanocitos es bajo. Si es necesario, se separa la melanina para mejorar la transcripción inversa y/o la amplificación de ácido nucleico. Típicamente, la melanina se separa durante las etapas de filtración proporcionadas en lo anterior. En el caso de tejido con una concentración elevada de melanina, debe utilizarse menos tejido, aproximadamente 5 mg por minicolumna Qiagen RNeasy.

Si se utiliza otro método que resulte en melanina residual en la muestra, su separación involucra el uso de una matriz que utiliza un sistema de esferas de polímero tal como Bio-Gel P-60 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Dicho método se describe por Satyamoorthy et al. (2002). Esencialmente, esté método involucra preparar una mezcla 50% (p/v) del material Bio-Gel en acetato de sodio 10 mM (pH 4.2). Se colocan aproximadamente 300 µl de la mezcla en un tubo de microcentrifuga y se centrífuga a 1000 rpm durante 1 min. Se desecha el sobrenadante y las esferas se colocan en una minicolumna o un recipiente similar. El homogeneizado después se hace pasar a través de un recipiente que contiene las esferas (después de primero incubarlas en el recipiente). Se recolecta el sobrenadante. El lavado adicional de las esferas con alícuotas adicionales de 100 µl de acetato de sodio 10 mM se puede utilizar para captar volúmenes adicionales de muestra libre de melanina si es necesario para un volumen de ensayo adecuado. La melanina oscura será visible claramente en las esferas retenidas en el recipiente. También se pueden utilizar otros filtros basados en sílice para separar el pigmento de melanina como se describe por Wang et al. (2001 ). Un aspecto importante de los métodos intraoperatorios de la invención es una detección rápida del marcador. En la medida en que dichos métodos se puedan llevar a cabo dentro de un periodo aceptable para un ensayo intraoperatorio (es decir, no mayor de aproximadamente 35 minutos), se puede utilizar cualquier método confiable, sensible y específico.

En el caso de medición de las concentraciones de ARNm para determinar la expresión de un gen, los ensayos pueden ser por cualquier medio conocido en la técnica e incluyen métodos tales como PCR, amplificación de círculo giratorio (RCA), reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) y otros. Los diagnósticos moleculares rápidos involucrados de manera más preferible son métodos de PCR cuantitativos que incluyen QRT-PCR. La detección puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica que incluye microarreglos, chips de genes y fluorescencia. Una prueba PCR típica incluye etapas múltiples de amplificación o ciclos que amplifican selectivamente especies objetivo de ácido nucleico. Una prueba PCR típica incluye tres etapas: una etapa de desnaturalización en la cual se desnaturaliza el ácido nucleico objetivo; una etapa de reasociación en la cual un conjunto de cebadores de PCR (cebadores directos e inversos) se reasocian a cadenas de ADN complementarias; y una etapa de alargamiento en la cual un ADN polimerasa termoestable alarga los cebadores. Al repetir esta etapa múltiple de veces, se amplifica un fragmento de ADN para producir un Amplicón que corresponde a la secuencia de ADN objetivo. Una prueba de PCR típica incluye 20 o más ciclos de desnaturalización, reasociación y alargamiento. Con frecuencia, las etapas de reasociación y alargamiento se pueden realizar de manera concurrente, en cuyo caso el ciclo contiene únicamente dos etapas.

En el método preferido de la invención, utilizando RT-PCR, la reacción de amplificación de RT-PCR se lleva a cabo en un tiempo adecuado para diagnóstico intraoperatorio, las donaciones de cada una de estas etapas puede estar en el intervalo de segundos en vez de minutos. Específicamente, con ciertos cicladores térmicos nuevos que son capaces de generar una velocidad paulatina térmica de por lo menos aproximadamente 5°C por segundo, se utilizan amplificaciones de RT-PCR en 30 minutos. De manera más preferible, las amplificaciones se llevan a cabo en menos de 25 minutos. Con esto en mente, los siguientes tiempos proporcionados para cada etapa del ciclo de PCR no incluyen tiempos paulatinos. La etapa de desnaturalización se puede llevar a cabo durante tiempos de 10 segundos o menos. De hecho, algunos cicladores térmicos tienen ajustes para "0 segundos" lo cual puede ser una duración óptima de la etapa de desnaturalización. Es decir, es suficiente que el ciclador térmico alcance la temperatura de desnaturalización. Las etapas de reasociación y alargamiento de manera más preferible son de menos de 10 segundos cada una, y cuando se realizan a la misma temperatura, la etapa combinada de reasociación/alargamiento puede ser menor de 10 segundos. Algunos métodos de detección de sonda homogéneos pueden requerir una etapa separada para elongación con el fin de maximizar un funcionamiento de ensayo rápido. Para minimizar tanto el tiempo de amplificación total como la formación de reacciones secundarias no específicas, las temperaturas de reasociación típicamente son superiores a 50°C. De manera más preferible las temperaturas de reasociación son superiores a 55°C. Una reacción combinada única para RT-PCR sin intervención del experimentador es deseable por varias razones: (1) riesgo disminuido de error del experimentador, (2) riesgo disminuido de contaminación del objetivo o producto; y (3) velocidad aumentada del ensayo. La reacción puede consistir en ya sea uno o dos polimerasas. En el caso de dos polimerasas, una de estas enzimas típicamente es un ADN polimerasa basada en ARN (transcriptasa inversa) y una es una ADN polimerasa basada en ADN termoestable. Para maximizar el funcionamiento del ensayo, es preferible utilizar una forma de tecnología de "inicio caliente" para ambas funciones enzimáticas. Las patentes de E.U.A. 5,411 ,876 y 5,985,619 proporcionan ejemplos de estas soluciones de "inicio caliente". Los métodos preferidos incluyen el uso de uno o más métodos de termoactivación que secuestran a uno o más de los componentes requeridos para una polimerización eficaz de ADN. Las patentes de E.U.A. 5,550,044 y 5,413,924 describen métodos para preparar reactivos para uso en dichos métodos. La patente de E.U.A. 6,403,341 describe una solución de secuestrado que involucra alteración química de uno de los componentes reactivos de PCR. En la modalidad más preferida, las actividades de polimerasa dependientes tanto de ARN como de ADN se encuentran en una sola enzima. Otros componentes que se requieren para una amplificación eficaz incluyen trifosfatos de nucleósido, sales divalentes y componentes amortiguadores. En algunos casos, puede ser benéfico un ácido nucleico no específico y estabilizantes de enzima. En la RT-PCR preferida, las cantidades de cierta transcriptasa inversa y los componentes de PCR son atípicos con el fin de aprovechar tiempos paulatinos más rápidos de algunos cicladores térmicos. Específicamente, las concentraciones de cebador son muy altas. Las concentraciones de cebador especifico para gen típicas para reacciones de transcriptasa inversa son menores de aproximadamente 20 mM. Para obtener una reacción rápida de transcriptasa inversa en el orden de 1 a 2 minutos, se incrementa la concentración del cebador de transcriptasa inversa a más de 20 nm, preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 nM y típicamente a aproximadamente 100 nM. Las concentraciones de cebador de PCR estándar varían entre 100 nM y 300 nM. Se pueden utilizar concentraciones más altas en PCR estándar para compensar las variaciones de Tm. No obstante, para los propósitos en la presente, las concentraciones de cebador mencionadas son para circunstancias en donde no se necesita compensación de Tm. Se pueden determinar empíricamente y utilizar concentraciones de cebadores proporcionalmente mayores si es necesaria o deseada la compensación de Tm. Para obtener un PCR rápida, las concentraciones de cebador de PCR tipicamente son mayores de 250 nM, preferiblemente mayores de aproximadamente 300 nM y típicamente de aproximadamente 500 nM.

Los diagnósticos utilizados comercialmente también utilizan preferiblemente uno o más controles positivos internos que confirman la operación de una reacción de amplificación particular en el caso de un resultado negativo. Las causas potenciales de resultados falsos negativos que deben ser controladas en un RT-PCR incluyen: cantidad inadecuada de ARN, degradación de ARN, inhibición de RT y/o PCR y error experimental. En el caso de medir concentraciones de proteína para determinar la expresión de un gen, cualquier método conocido en la técnica es adecuado con la condición de que resulte en una especificidad y sensibilidad adecuadas. Por ejemplo, se pueden medir las concentraciones de proteína por unión a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para la proteína y al medir la cantidad de proteína unida a anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser marcados por reactivos radioactivos, fluorescentes o detectables de alguna otra manera para facilitar la detección. Los métodos de detección incluyen, sin limitación ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y técnicas de inmunotransferencia. La invención proporciona especificidad y sensibilidad suficientes para identificar un melanocito maligno en una muestra de tejido. Los métodos determinan la expresión de genes marcadores particularmente al medir ARNm codificado por los marcadores. Los marcadores preferidos de la invención muestran por lo menos una sobreexpresión doble en tejido que tienen melanocitos malignos en relación a melanocitos benignos o tejido normal. Los resultados que se presentan en este documento demuestran que un marcador primario es insuficiente para proporcionar información clínicamente relevante pero cuando se combinan con uno o más marcadores secundarios, la información que se obtiene se compara con el "estándar dorado" de H y E e IHC en el cual se basan actualmente los médicos. Los marcadores terciarios y genes de control pueden aumentar a los marcadores primarios y secundarios para incrementar adicionalmente la especificidad y/o sensibilidad. Como se describe en los siguientes ejemplos, los marcadores se identifican por el protocolo que se muestra en la figura 1. Por lo tanto, la invención proporciona un método para identificar marcadores específicos de melanoma por el siguiente protocolo en la figura 1 y en los ejemplos que se proporcionan en la misma. El marcador primario puede ser PLAB y se define en la presente como un gen que codifica para cualquier variante, alelo, etc., que incluye la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1. PLAB también se describe por Paralkar et al. (1998) y está representado por el número de acceso AF003934. PLAB se relaciona con la patogénesis de cáncer de próstata (Liu et al. (2003); Karan et al., (2003); y Nakamura et al. (2003); Patentes de E.U.A. números 5,994,102; 6,107,476; 6,465,181 ; 6,500,638; 6,521 ,227; Publicaciones de Patente de E.U.A. números 2002/0048784; 2003/0013097; y 2003/0059431 ) y cáncer colorrectal (Brown et al. (2003); Buckhaults et al., (2001) y Publicación de Patente de E.U.A. número 2002/016382). El marcador secundario es L1CAM y se define en la presente como el gen que codifica para cualquier variante, alelo, etc., que incluye la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2. LICAM también se describe por Haspel et al., (2003); y las Patentes de E.U.A. números 5,872,225 y 5,969,124 y está representada por el número de acceso NM 000425. La invención proporciona adicionalmente marcadores terciarios que se encuentran dentro de varias categorías funcionales. Por lo tanto se pueden utilizar los marcadores adicionales que se encuentran en estas categorías funcionales. Como se describe con mayor detalle en los ejemplos, los genes que regulan por aumento, específicos de melanoma, se encuentran dentro de las categorías funcionales de desarrollo de tejido neural y control de ciclo celular así como genes regulados por disminución específicos de melanoma que se encuentran dentro de las categorías funcionales de desarrollo de tejido y diferenciación celular. Los marcadores terciarios incluyen las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 3, 29-978 y 999. En el cuadro 5 se describen numerosos marcadores terciarios y todos se resumen en el cuadro 15. Se describe NTRK3 por Strausberg et al. (2002); Marchetti et al. (2003); Hisaoka et al. (2002); McGregor et al. (1999); Ryden et al. (1996); Patentes de E.U.A. 5,348,856; 5,844,092; 5,910,574; y las Publicaciones de Patente de E.U.A. números 2002/0155480; y 2003/014283 y están representadas por los números de acceso BC013693 o S76476.1. NTRK3 también se define como un gen que codifica para ARNm reconocido por los conjuntos de cebador/sonda de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18.

La tirosinasa se describe por Mandelcorn-Monson et al. (2003); y la patente de E.U.A. número 6,153,388 y está representada por el número de acceso NM 000372. La tirosinasa también se define como el gen que codifica para ARNm reconocido por los conjuntos de cebador/sonda de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 19-21.

CUADRO 5 Los marcadores terciarios son capaces de sustituir y/o suplementar marcadores primarios o secundarios con la condición de que los ensayos resultantes tengan la sensibilidad y especificidad adecuadas. La especificidad de cualquier diagnóstico molecular basado en amplificación dado se basa principalmente, aunque no de manera exclusiva en la identidad de los conjuntos de cebador. Los conjuntos de cebador son pares de cebadores oligonucleotídicos directo e inverso que se reasocian a una secuencia de ADN objetivo para permitir la amplificación de la secuencia objetivo y de esta manera producir un amplicón específico para la secuencia objetivo. Los cebadores deben ser capaces de amplificar marcadores del estado de enfermedad de interés. En el caso de la presente invención, estos marcadores se dirigen a melanoma. La reacción también debe contener algún medio de detección de una señal específica. Esto preferiblemente se lleva a cabo mediante el uso de un reactivo que detecta una región de una secuencia de ADN derivada de la polimerización de la secuencia objetivo de interés. Los reactivos preferidos para detección proporcionan una diferencial de señal mensurable cuando se unen a una secuencia de ácido nucleico de interés. Con frecuencia, estos métodos involucran sondas de ácido nucleico que proporcionan fluorescencia aumentada cuando se unen a la secuencia de interés. Típicamente, el progreso de las reacciones de los métodos de la invención son monitoreados al analizar las velocidades relativas de producción de amplicón para cada conjunto de cebadores de PCR. La invención incluye adicionalmente conjuntos de cebador/sonda y su uso en los métodos que se reclaman. Las secuencias son: SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 (cebador directo PLAB) ggcagaatcttgtccgca SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 (cebador inverso PLAB) ggacagtggtccccgttg SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 (sonda PLAB) cccagctggagttgcacttgcggcc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 7 (cebador superior PLAB) gaacaccgacctcgtccc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 8 (cebador inferior PLAB) ggcggcccgagagata SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 9 (sonda PLAB) cgccagaagtgcggctgggattt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 10 (L1 CAM directo) gctgggactgggaacagaact SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 11 (L1CAM inverso) ggagcagagatggcaaagaaa SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 12 (sonda L1CAM) ttccccaccatctgctgt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 13: L1 CAM superior) ccacagatgacatcagcctcaa SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 14 (L1CAM inferior) ggtcacacccagctcttcctt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 15 (sonda L1CAM) tggcaagcccgaagtgcagttcctt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 16 (cebador NTRK3) gccccggcacccttta SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 17 (cebador NTRK43) aaccctgccagtggtggat SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 18 (sonda NTRK3) cagatgggtgttttc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 19 (Tyr superior) actcagcccagcatcattcttc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 20 (Tyr inferior) atggctgttgtactcctccaatc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 21 (sonda Tyr) cttctcctcttggcagattgtctgtagctt SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 22 (PBGD superior) ccacacacagcctactttccaa SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 23 (PBGD inferior) tacccacgcgaatcactctca SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 24 (sonda PBGD) aacggcaatgcggctgcaacggcggaatt El monitoreo de la producción de amp cón se puede llevar a cabo por numerosos reactivos y métodos de detección que incluyen, sin limitación, cebadores fluorescentes y sondas fluorogénicas así como colorantes fluorescentes que se unen a ADN de cadena doble Las balizas moleculares, Scorpions y otros esquemas de detección también se pueden utilizar Un método común de monitoreo de una PCR utiliza un ensayo de sonda de hidrólisis fluorescente Este método aprovecha la actividad de 5' nucleasa de ciertas ADN pohmerasas termoestables (tales como las ADN po merasas Taq o Tfl) para separar una sonda oligomepca durante el procedimiento de PCR La invención proporciona adicionalmente amplicones que se obtienen por métodos de PCR utilizados en los métodos de la invención Estos amphcones incluyen a los siguientes SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 25 (Amplicón PLAB) gaacaccgacctcgtcccggcccctgcagtccggatactcacgccagaagtgcggctgggatccggcggc cacctgcacctgcgtatctctcgggccgcc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 26 (Amplicón L1CAM) ccacagatgacatcagcctcaagtgtgaggccagtggcaagcccgaagtgcagttccgctggacagagg ggatggtgtcacttcaaaccaaggaagagctgggtgtgacc SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27 (Amplicón tirosinasa) actcagcccagcatcattcttctcctcttggcagattgtctgtagccgattggaggagtacaacagccat SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28 (Amplicón PBGD) ccacacacagcctactttccaagcggagccatgtctggtaacggcaatgcggctgcaacggcggaagaa aacagcccaaagatgagagtgattcgcgtgggta El oligómero se selecciona para reasociarse con la secuencia objetivo amplificada bajo condiciones de alargamiento. La sonda típicamente tiene un indicador fluorescente en su extremo 5' y un extintor fluorescente del indicador en el extremo 3'. En la medida en que el oligómero este intacto, se extingue la señal fluorescente del indicador. No obstante, cuando el oligómero se digiere durante el procedimiento de alargamiento, el indicador fluorescente ya no está en proximidad al extintor. La acumulación relativa del indicador fluorescente libre para un amplicón dado se puede comparar con la acumulación de los mismos amplicones para una muestra control y/o con la de un gen control, tal como, sin limitación, ß-actina o PBDG para determinar la abundancia relativa de un producto de ADNc dado de un ARN dado en una población de ARN. Los productos y reactivos para ensayos con sonda de hidrólisis fluorescente están disponibles fácilmente de manera comercial, por ejemplo de Applied Biosystems.

Los reactivos de detección adecuados comúnmente se les denominan como "Scorpions" y se les describe en las patentes de E.U.A. 6,326,145 y 5,525,494. Estos reactivos incluyen una o más moléculas que comprenden un cebador con cola y un sistema de señalización integrado. El cebador tiene una región de unión a plantilla y una cola que comprenden un enlazante y una región de unión a objetivo. La región de unión a objetivo en la cola hibridiza con una secuencia complementaria en un producto de extensión del cebador. Este evento de hibridación específico objetivo se acopla a un sistema de señalización en donde la hibridación genera un cambio detectable. En PCR, la región de unión de objetivo y la región de cola ventajosamente se distribuyen de manera tal que la región de cola permanece como una cadena única, es decir, sin copiar. Por lo tanto, la región de cola es no amplificable en los productos de amplificación por PCR. El enlazante comprende una porción de bloqueo que evita la extensión de la cadena mediada por polimerasa en la plantilla de cebador. Los reactivos de detección más preferidos son sondas TaqManMR (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ) y se describen en las patentes de E.U.A. 5,210,015; 5,487,972 y 5,804,375. Esencialmente, estas sondas involucran detección de ácido nucleico en virtud de la separación de una combinación de sustancia fluorescente-extintor sobre una sonda a través de la actividad de exonucleasa 5'-3' de la polimerasa utilizada en la PCR. Se puede utilizar cualquier fluoróforo adecuado para cualquiera de los marcadores o controles. Dichos fluoróforos incluyen, sin limitación, Texas Red, Cal Red, Fam, Cy3 y Cy5. En una modalidad, los siguientes fluoróforos corresponden a los marcadores indicados: PLAB; Fam; L1CAM: Texas Red o Cal Red, tirosinasa: C1 ; PBGD; Cy5. El equipo y software también está disponible fácilmente para controlar y monitorear la acumulación de amplicón en PCR y QRT-PCR que incluye un termociclador Smart Cycler disponible comercialmente de Cepheid of Sunnyvale, California y el sistema ABI Prism 7700 Sequence Detection System, disponible comercialmente de Applied Bíosystems. En el caso de ensayos de expresión de gen, es preferible utilizar un gen que se expresa constitutivamente en el tejido de interés. PBDG comúnmente se utiliza como un control interno debido a varios factores: no contiene pseudogenes conocidos en humanos, se expresa de manera constitutiva en tejidos humanos y se expresa a un nivel relativamente bajo y por lo tanto es menos probable que provoque inhibición de la amplificación de las secuencias objetivo de interés. El uso de PBGD como un control minimiza o elimina la presentación de resultados erróneos que surjan de todas las fuentes potenciales de resultados falsos negativos. En la comercialización de los métodos descritos para QRT-PCR, ciertos equipos para detección de ácidos nucleicos específicos son particularmente útiles. En una modalidad, el equipo incluye reactivos para amplificar y detectar marcadores. Opcionalmente, el equipo incluye reactivos de preparación de muestra y/o artículos (por ejemplo tubos) para extraer ácidos nucleicos de tejido de nodulo linfático. Los equipos también pueden incluir artículos para minimizar el riesgo de contaminación de muestra (por ejemplo un bisturí desechable y superficie para disección y preparación de nodulos linfáticos). En un equipo preferido, los reactivos necesarios para el procedimiento de QRT-PCR de un tubo descritos en lo anterior se incluyen, tales como transcriptasa inversa, un cebador de transcriptasa inversa, un conjunto de cebador de PCR correspondiente (preferiblemente para los marcadores y controles), una ADN polimerasa termoestable tal como polimerasa Taq y uno o varios reactivos de detección adecuados tales como, sin limitación, una sonda escorpión, una sonda para un ensayo de sonda de hidrólisis fluorescente, una sonda de baliza molecular, un cebador de colorante único o un colorante fluorescente específico para ADN de cadena doble tal como bromuro de etidio. Los cebadores preferiblemente están en cantidades que proporcionan las altas concentraciones descritas en lo anterior. Las ADN polimerasas termoestables están disponibles de manera común y comercial a partir de diversos fabricantes. Los materiales adicionales en el equipo pueden incluir: tubos de reacción o frascos adecuados, una composición de barrera, típicamente una esfera de cera que opcionalmente incluye magnesio; mezclas de reacción (típicamente 10X) para la transcriptasa inversa y las etapas de PCR, que incluyen los amortiguadores y reactivos necesarios tales como dNTP; agua libre de ARNasa o nucleasa; inhibidor de RNasa; uno o varios ácidos nucleicos de control y/o cualquier amortiguador adicional, compuestos, cofactores, constituyentes iónicos, proteínas y enzimas, polímeros y similares que pueden ser utilizados en transcriptasa inversa y/o en etapas de PCR de QRT-PCR. Opcionalmente, los equipos incluyen reactivos y materiales de extracción de ácido nucleico. Las instrucciones también se incluyen preferiblemente en los equipos. Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no para limitar la invención que se reclama. Todas las referencias mencionadas en la presente se incorporan en este documento como referencia.

EJEMPLO 1 Preparación de tejido Se obtienen melanoma maligno congelado fresco, nevos cutáneos benignos, piel normal, metástasis de nodulo linfático de melanoma y muestras de nodulo linfático libre de melanoma de Genomics Collaborative, Inc. (Cambridge, MA), Asterand (Detroit, Ml), Clinomics (Pittsfield, MA) y Proteogenex (Los Angeles, CA), Ardáis (Lexington, MA) e Impath (Westborough, MA). Todos los vendedores de tejido declararon que los especímenes de tejido utilizados en el estudio se recolectaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el consejo de revisión institucional de los hospitales correspondientes y respetando los principios de bioética. También se recolecto información respecto a los antecedentes demográficos de los pacientes y la patología. Las características histopatológicas de cada muestra se revisaron para confirmar el diagnóstico y para calcular la conservación de la muestra y el contenido de tumor.

El melanoma y los tejidos primarios de nevos se seleccionan para análisis de microarreglo que presentan un contenido de melanocito mayor de 50% sin histología mixta. Los nodulos linfáticos positivos de melanoma se recolectan de pacientes con melanoma maligno; se confirma el diagnóstico de melanoma por H y E en combinación con IHC (S100 y HMB45). Los nodulos linfáticos libres de melanoma derivados de pacientes que no presentan melanoma en sus antecedentes clínicos y la ausencia de melanoma se conforma por H y E e IHC utilizando anticuerpos para S100 y HMB45. El ARN de un total de 70 muestras de tejido primario se utiliza para perfilado de expresión de gen e identificación de gen específico de melanoma. Las muestras incluyen 45 melanomas malignos primarios, 18 nevos cutáneos benignos y 7 tejidos cutáneos normales. La mayor parte de los melanomas primarios incluidos en el estudio presentan una etapa temprana de enfermedad y tienen un espesor menor de 4 mm, lo cual es consistente con la población estándar de pacientes con melanoma. Aitken et al. (2004). Los antecedentes demográficos y clínicos de los pacientes así como las características patológicas se presentan en el cuadro 6 y se resumen en el cuadro 7. Además, 77 metástasis LN de melanoma malignos y 18 muestras de tejido de LN sin melanoma se utilizan para un ensayo de PCR cuantitativo de una etapa. Los nodulos linfáticos positivos para melanoma incluyen nodulos linfáticos axilares, cervicales e inguinales con metástasis derivada de melanomas primarios de células epitelioides y en uso. De los 18 LN libres de melanoma, 10 se recolectaron de otros pacientes con cáncer pero no se encontraron células cancerosas en estos nodulos por los patólogos y 8 LN son de lesiones no malignas.

CUADRO 6 CUADRO 7 EJEMPLO 2 Aislamiento de ARN de melanoma maligno y muestras de nevos cutáneos benignos Se utiliza el miniequipo RNeasyMR de Qiagen (QIAGEN Inc., Valencia, CA), con un protocolo modificado para minimizar la melanina residual en la muestra de ARN. Para tejidos que contienen melanocitos se utilizan y se procesan por separado cuatro muestras de tejido por duplicados derivados de pacientes individuales, cada uno con un peso de aproximadamente 5 mg y se utilizan y procesan por separado. Las muestras de tejido se homogeneizan en 1.0 ml de amortiguador RLT (QIAGEN) que contiene 10 µl de ß-mercaptoetanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) por un homogeneizador mecánico (UltraTurrex T8, IKA-Werke, Staufen, Alemania). Después de la homogeneización se cargan las muestras en columnas QIAGEN RNeasyMR y son seguidas por centrifugación. Después de desechar el flujo pasante, se agregan 700 ml de amortiguador RW1 ; la columna se mantiene durante 5 min a temperatura ambiente y después se centrifuga. Esta etapa se repite tres veces. Después se sigue el protocolo del miniequipo QIAGEN RNeasyMR estándar. Para separar ARN de la membrana de gel de sílice se realiza una elución en dos etapas. El ARN total derivado del mismo tejido de paciente individual se acumula y utiliza para análisis posterior. Se utiliza el protocolo Trizol estándar para aislamiento de ARN a partir de tejidos que no contienen una proporción significativa de melanocitos.

El tejido se homogeneiza en reactivo Trizol (Invitrogen, Carisbad, CA). Después de centrifugación la fase líquida superior se recolecta y el ARN total se precipita con alcohol isopropílico a -20°C. Los sedimentos de ARN se lavan con etanol 75%, se separan en agua y se almacenan a -80°C hasta su uso. Se examina la calidad del ARN con un nanoensayo Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Se prepara ARNc marcado y se hibridiza con el arreglo oligonucleotídico de alta densidad Hu133A Gene Chip (Affymetrix, Santa Clara, CA) que contiene un total de 22,000 conjuntos de sondas, de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante. Los arreglos se examinan utilizando protocolos y analizadores Affymetrix. Para análisis subsecuente cada conjunto de sondas se considera como un gen separado. Los valores de expresión para cada gen se calculan mediante la utilización del software de análisis Affymetrix Gene Chip MAS 5.0. Todos los chips satisfacen tres estándares de control de calidad: la llamada de "presente" es mayor de 35%, el factor de escala es menor de 12 cuando se amplia a una intensidad objetivo de 600 y el nivel de fondo es menor de 150. Se selecciona un porcentaje menor al habitual de límite de llamadas de "presente" debido a que es difícil aislar ARN de células cutáneas (Hipfel et al. (1998)) lo que resulta en niveles de expresión generales menores de genes.

EJEMPLO 3 Análisis de datos Los datos de expresión de genes se filtran para incluir únicamente genes llamados como "presentes" en dos o más muestras. Este filtro se utiliza para separar genes que no cambian la expresión en las muestras. De los 22,000 genes presentados en el arreglo, 15,795 pasaron este filtro y se utilizaron para agrupamiento jerárquico. Antes del agrupamiento, cada señal de expresión de gen se divide por la mediana de expresión en todas las muestras en el conjunto de datos. Esta etapa de estandarización minimiza el efecto de la magnitud de la expresión del gen y agrupa juntos genes con patrones de expresión similares en el análisis de agrupamiento. El agrupamiento jerárquico de enlace promedio utilizando la correlación de Pearson se realiza tanto en los genes como en las muestras utilizando GeneSpring 6.1. Con el fin de identificar de manera diferencial los genes expresados, comparamos las muestras de melanoma con los nevos benignos y las muestras cutáneas normales por separado. El primer análisis consiste de 45 muestras cutáneas de melanoma y 7 normales; el segundo análisis consiste de 45 muestras de melanoma y 18 nevos. Estos dos conjuntos de datos se analizan por separado en los siguientes procedimientos, como se muestra en la figura 1. El análisis de significancia del microarreglo (SAM; Tusher et al. (2001 ) y la prueba t de Student se utilizan en la selección del gen. Los parámetros para SAM se establecen como ? = 2.5 y múltiplo de cambio = 2.0 con 1 ,000 permutaciones. FDR es 1 %. No hay datos perdidos y se utiliza el número aleatorio implícito. Después se lleva a cabo el análisis percentil. Para genes regulados por aumento el 30% percentil en las muestras de melanoma se compara con el máximo de las muestras normales o el de las muestras de los nevos. La prueba t de Student con corrección de Bonferroni también se realiza con un límite p < 0.05 con el fin de asegurar que los genes seleccionados tengan una expresión diferencial significativa entre los dos grupos de las muestras. Como una etapa final, identificamos genes comunes entre las listas de genes de melanoma/benignos y melanoma/normales lo que resulta en una lista única de genes regulados por aumento en melanoma, que se muestra en la figura 1 , en donde 439 genes comunes corresponden a las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-467, como se describe en el cuadro 15, y los resultados se muestran en el cuadro 8.

CUADRO 8 Seleccionamos una lista corta de genes con una sobreexpresión de por lo menos diez veces en melanoma, en comparación con los especímenes benignos. El conjunto de datos de arreglo completo se ha enviado a la base de datos GEO de NCBI/GenBank (series de entrada pendientes).

El agrupamiento jerárquico mostró 4 grupos distintos (figuras 2, 2A-2E). Dos grupos consisten de la mayor parte de las muestras de melanoma (43 de 45); el tercer grupo incluye la mayor parte de las muestras de nevos benignos (15 de 18) y el cuarto grupo contiene la totalidad de los 7 especímenes de piel normal. Las muestras de melanoma en si mismos formaron dos grupos con 35 muestras en un grupo y 10 muestras en el otro. Las muestras que formaron el grupo pequeño representan únicamente melanoma epitelioide, visualmente contienen menos melanina y demuestran una mayor expresión de genes PRAME y MÍA (p < 0.05). Los pocos tumores en etapa lll y IV se agrupan todos en el grupo pequeño. El grupo grande muestra una expresión mayor de NTRK3 y NESTINA (NES) (p < 0.05). Todas las muestras de melanoma y de nevos benignos demuestran expresión igualmente alta de marcadores conocidos de melanocitos tales como tirosinasa y MART-1 , confirmando que existe un contenido comparable de melanocitos en estas muestras. Nuestros datos indican que el melanoma, los nevos malignos y las muestras de piel normales tienen perfiles de expresión de genes distintos y pueden ser separados en una base molecular. Los genes seleccionados que se expresan en gran medida en melanoma y sus categorías funcionales asociadas se resumen en el cuadro 9.

CUADRO 9 EJEMPLO 4 Identificación de genes que se expresan de manera diferencial en melanoma Se utilizaron para análisis un total de 70 perfiles de expresión de genes. La mediana de porcentajes de "llamadas de presentes" para los grupos de las muestras de melanoma, benignos y normales son de 43.8%, 46.9% y 41.7%. Sesenta microarrreglos (86%) presentan factores de aumento dentro del intervalo de tres veces del valor mínimo. Igualmente se distribuyeron entre las categorías de muestras, de melanoma, benignos y normales 10 chips con factores de aumento mayores de 3.

Un resultado de agrupamiento jerárquico no supervisado mostró una separación distinta del melanoma, de los nevos benignos y de las muestras cutáneas normales (figuras 2, 2A-2E) Observamos cuatro grupos, que incluyen dos grupos que consisten de la mayor parte de las muestras de melanoma (43 de 45), el tercer grupo contiene la totalidad de 7 muestras de piel normal, 3 nevos benignos y 2 especímenes de melanoma y el cuarto grupo, que incluye 14 de los 18 muestras de nevos benignos Las fuentes de las muestras no afectan el agrupamiento Los especímenes originados de fuentes diferentes se agrupan juntos, de acuerdo con el tipo de muestra (melanoma, benigno o normal) Para probar adicionalmente la estabilidad de los patrones de agrupamiento, utilizamos un limite alternativo de filtrado de genes antes del análisis de grupos Específicamente, retuvimos genes que tienen por lo menos 10% de llamadas de "presente" en cada una de las muestras de melanoma, de nevos benignos y cutáneas Con este limite, obtuvimos 15,306 genes y un agrupamiento jerárquico repetido El patrón de agrupamiento en las muestras de pacientes fue el mismo que uno de 15,795 de las dos llamadas de "presente" confirmando la estabilidad del agrupamiento La muestra de nevos única que se agrupa con las muestras de melanoma es una muestra de nevos atípicas (grado moderado) sin melanoma presente in situ La totalidad de las tres muestras de nevos que se agrupan con piel normal son muestras de nevos compuestas y una de ellas presenta un contenido de melanocitos menor que los otros especímenes de nevos Las muestras de melanoma en si mismas formaron dos grupos con 34 muestras en el grupo grande y 9 muestras en el grupo pequeño. Las muestras que formaron el grupo pequeño representan únicamente melanoma epitelioide y visualmente contienen menos melanina. Los pocos tumores en etapa lll y IV utilizados en nuestro estudio, todos se agruparon en el grupo pequeño. El grupo grande estaba constituido de especímenes epitelioides, de células en uso y melanoma de histología mixta con una presencia más significativa de melanina, el grupo grande incluye únicamente especímenes en etapa I y etapa II. Se encontraron grupos de genes distintos en asociación con melanoma. Esto puede ser caracterizado por genes regulados por aumento (figura 2, 2A, 2B y 2C) o regulados por disminución (figura 2, 2E) en muestras de melanoma. Al mismo tiempo, las muestras de melanoma y de nevos benignos demuestran una alta expresión de marcadores de melanocitos conocidos tales como MART-1 (figura 2, 2D) confirmando un contenido comparable de melanocitos en estas muestras y la incapacidad de los marcadores específicos para melanocitos de diferenciarlos. Nuestros datos indican que el melanoma, los nevos benignos y las muestras cutáneas normales tienen perfiles de expresión de genes distintos y se pueden separar en una base molecular. Con el fin de identificar genes regulados por aumento en melanoma maligno, aplicados SAM en combinación con la prueba t con la corrección de Bonferroni y análisis percentil (figura 1). La prueba t ajustada por Bonferroni y el análisis percentil se utilizaron para corregir la preocupación de pruebas múltiples y la heterogeneidad de las muestras de tumor, respectivamente. Como el resultado de este análisis se seleccionan 439 genes y se resumen en el cuadro 15 como las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 29-467. De los 439 genes regulados por aumento en el melanoma, seleccionamos una lista corta de 33 genes que tienen una sobreexpresión mayor de 10 veces en las muestras de melanoma en comparación con los de los especímenes benignos. Estos incluyen muchos genes con asociación conocida con melanoma maligno tal como NTRK3 (Xu et al. (2003)), L1 CAM (Fogel et al. (2003); y Thies et al., (2002)), me20m (Adema et al. (1994)) así como genes novedosos. En el cuadro 10 se presentan los genes con una sobreexpresión de más de 10 veces en el melanoma.

CUADRO 10 Seleccionamos adicionalmente tres genes que se sobreexpresan en el melanona, que incluyen NTRK3, PLAB, L1CAM para una validación cuantitativa de RT-PCR en tiempo real de los resultados del microarreglo (figuras 3A-3B). PLAB es un gen noveodoso cuya expresión diferencial en melanoma no se ha reportado antes, hasta nuestro mejor conocimiento. Para L1CAM y NTRK3, la expresión diferencial en melanoma se demuestra únicamente a nivel de proteínas. Xu et al. (2003); Fogel et al. (2003); y Thies et al. (2002). Además, identificamos un PLAB y L1CAM como la mejor combinación, sobre una base complementaria, para separar melanoma de tejidos benignos/normales en nuestro estudio. GP100 es conocido como un marcador específico de melanoma y se selecciona como un control positivo. Para el ensayo RT-PCR utilizamos un panel de 47 melanomas primarios, 7 nevos benignos y 5 muestras de piel normal, aislados de los mismos tejidos de los utilizados para el estudio de microarreglo. El valor de expresión de cada gen se normaliza con el gen de control casero PBGD. Los coeficientes de correlación entre RT-PCR y los resultados de microarreglo para L1 CAM, NTRK3, PLAB y GP100 son 0.79, 0.86, 0.87 y 0.88, respectivamente. Este resultado indica que los resultados de RT-PCR son altamente consistentes con los datos de microarreglo.

EJEMPLO 5 Análisis de guía de genes que se expresan diferencialmente El análisis funcional de los genes que se expresan diferencialmente en melanoma se realiza utilizando la aplicación de software de análisis de vía lngenuityMR (Ingenuity, Mountain View, CA). Se seleccionan categorías funcionales o vías canónicas que tienen un valor p de menos de 0.05. La especificidad de identificación de las vías canónicas se prueba utilizando genes seleccionados aleatoriamente. Con el fin de obtener una percepción adicional respecto a un mecanismo potencial que diferencie melanona de tejido benigno y normal, utilizamos el software de análisis de via Ingenuity para identificar vías canónicas asociadas con melanoma. El análisis de los resultados reveló que muchos de los genes en procesamiento amiloide son regulados por aumento en las muestras de melanoma. Para verificar la especificidad de nuestra observación, seleccionamos tres listas aleatorias de genes del microarreglo Affymetrix Hu133A y se les sometió al análisis de vía Ingenuity. Ninguna de estas listas produjo una asociación significativa con el procesamiento amiloide o con cualquier otra vía canónica. Para confirmar la activación de esta via canónica en melanoma, se recuperaron datos de expresión de gen para todos los genes en la vía. Se calculó los múltiplos de cambio y el valor p de la expresión diferencial entre melanoma y tejidos benignos/normales. De los 34 genes incluidos en la vía de procesamiento amiloide (Esler et al, (2001 ); y Giancotti et al. (1999)), 25 demostraron una tendencia de regulación por aumento y para 19 de ellas (56%) la expresión diferencial fue estadísticamente significativa (valor p < 0.05; figura 4). Respecto al control tradicional, seleccionamos aleatoriamente dos vías metabólicas con números de genes similares. De los 63 genes en la vía de síntesis de alanina, 8 de ellos (13%) mostraron regulación por aumento significativa con un valor p menor de 0.05. De los 47 genes en la vía de síntesis de histidina, solo dos genes (4%) se encontraron utilizando los mismos criterios. Por primera vez, nuestros datos indican fuertemente que la activación de la vía de procesamiento amiloide está involucrada en melanoma maligno.

EJEMPLO 6 Validación por RT-PCR de resultados de microareglo Una cantidad de diez µg de ARN total de cada muestra se trata con DNasel y se somete a transcripción inversa con el cebador oligo(dT) utilizando transcriptasa inversa Superscript II de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carisbad, CA). Un gen control PBGD fue probado previamente y se ha reportado como un gen casero. Vandesompele et al., (2003). Los cebadores y las sondas de MGB para me20m (gp100), L1CAM, NTRK3 y el gen control PBGD se diseñan utilizando el software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA). La sonda del gen PLAB (MIC1 ) está basada en FAM-TAMRA dado que las secuencias son inadecuadas para diseñar sondas basadas en MGB. Las secuencias de cebador/sonda son como siguen: CUADRO 11 Todos los cebadores y sondas se prueban para eficacia óptima de amplificación superior a 90%. La curva estándar está constituida de seis diluciones decimales del producto de PCR del gen objetivo con números de copias que varían de 10 a 106. La amplificación por RT-PCR se lleva a cabo en una mezcla de reacción de 20 µl que contiene 50 ng de plantilla de ADNc 2 x TaqManMR de mezclador maestro PCR universal (12.5 µl) (Applied Biosystems. Foster City, CA), cebadores directo e inverso de 500 nM y una sonda de 250 nM. Las reacciones se llevan a cabo en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones de ciclado son: 2 min de activación de UNG con AmpErase a 50°C, 10 min de activación de polimerasa a 95°C y 50 ciclos a 90°C durante 15 seg y temperatura de reasociación (60°C) durante 60 segundos. En cada ensayo, una curva estándar y un control sin plantilla junto con el ADNc plantilla se incluyen por duplicado para el gen de interés y el gen control. La cantidad relativa de cada gen objetivo se representa como ?Ct, lo cual es igual a Ct del gen objetivo restado por Ct del gen control. Para confirmaridentificar los genes específicos de melanoma identificados en el análisis de microarreglo se seleccionaron cuatro genes (L1CAM, NTRK3, PLAB y gp100) para validación de RT-PCR en tiempo real cuantitativa (figura 4). El valor de expresión de cada gen se normaliza con PBGD control casero. El coeficiente de correlación entre RT-PCR y los resultados de microarreglo para L1CAM, NTRK3, PLAB y gp100 son 0.79, 0.86, 0.87 y 0.88, respectivamente, lo que indica que los resultados de RT-PCR son altamente concordantes con los datos de microarreglo.

EJEMPLO 7 Ensayos de qRTPCR de una etapa utilizando cebadores específicos de ARN y establecimiento de límite La evaluación de expresión de los genes seleccionados se lleva a cabo con RT-PCR de una etapa con ARN a partir de melanona primario, nevos benignos, piel normal, metástasis de LN de melanoma y nodulos linfáticos sin melanoma. Se utiliza actina ß como un gen casero para control para la cantidad introducida en la calidad del ARN en las reacciones. No se utiliza el tratamiento de DNasa. En vez de esto, los cebadores o sondas se diseñan para abarcar un intrón de manera que no se reporten en el ADN genómico. Se utilizan 8 ng de ARN total para la RT-PCR. El ARN total se somete a transcripción inversa utilizando una mezcla de Multiscribe 40X e inhibidor de ribonucleasa contenida en un equipo de reactivos de mezcla maestro PCR de una etapa TaqMan R (Applied Biosystems, Foster City, CA). El ADNc después se somete al equipo Master Mix 2x sin UNG y se lleva a cabo la amplificación por PCR en un sistema de detección de secuencia ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) en el formato de bloque de 384 pozos utilizando un tamaño de reacción de 10 µl. Las concentraciones de cebador y sonda son de 4 µM y 2.5 µM, respectivamente. La mezcla de reacción se incuba a 48°C durante 30 min para la transcripción inversa, seguida por la etapa de activación Amplitaq de 95°C durante 10 min y finalmente 40 ciclos de 95°C durante 15 seg de desnaturalización y 60°C durante 1 min de reasociación y extensión. En cada placa se genera una curva estándar de 8 pg a 80 ng y cuando el valor de R2 es mayor de 0.99, se aceptan los valores de umbral ciclo (Ct) Las secuencias utilizadas en las reacciones son las siguientes, cada una escrita en la dirección 5' a 3' CUADRO 12 Para cada muestra se calcula ?Ct = Ct (gen objetivo) - Ct para ß-actina. Se ha utilizado ampliamente ?Ct en ensayos clínicos de RT-PCR y se selecciona como un método directo. Cronin et al. (2004). Se realiza la prueba T en ?Ct entre muestras de melanoma y muestras que no son de melanoma que incluyen muestras tanto primarias como LN. Posteriormente utilizamos ?Ct para construir dos calificaciones para cada paciente. Una calificación se deriva de una combinación de dos genes específicos de melanoma, PLAB y L1CAM; y la otra calificación se deriva de una combinación de tres marcadores convencionales de melanoma, tirosinasa, gp100 y MARTÍ La calificación se define como la suma ponderada de los valores ?Ct de los genes probados con la estadística t correspondiente como la ponderación. Las dos calificaciones se normalizan para tener la misma media con el fin de compararlas en la misma escala. Examinamos una combinación de dos altamente sobreexpresados en genes de melanoma, PLAB y L1CAM, en una diversidad de muestras de tejido clínico que contienen melanocitos malignos (melanoma primario y metástasis de LN de melanoma), melanocitos benignos (nevos cutáneos benignos) y muestras normales (piel normal) y LN libre de melanoma) por RT-PCR. Los tejidos primarios fueron los mismos a aquellos utilizados para el estudio de microarreglo mientras que todos los especímenes de LN se derivaron de pacientes independientes. También se probaron en las mismas muestras como controles marcadores de melanona convencionales tales como tirosinasa, gpl OO y MART1 , debido a que son los marcadores utilizados más comúnmente para los ensayos moleculares de melanoma en los estudios clínicos actuales. Rimboldi et al. (2003); Abrahamsen et al. (2005) y Kammula et al. (2004). Las calificaciones calculadas se presentan en la figura 5A para PLAB y L1CAM y en la figura 5B para tirosinasa, gp100 y MART1. Los resultados demuestran una diferencia significativa en la expresión de PLAB y L1CAM entre muestras de melanoma malignos (primarios y metástasis de LN) y nevos benignos y LN normal. En contraste, tres marcadores convencionales mostraron niveles de expresión similares en muestras benignas y de melanoma. Para demostrar adicionalmente la capacidad de los marcadores de gen para separar tejidos benignos y malignos, probamos dos valores límite; el primero se establece como la calificación más alta en muestras normales primarias y el segundo como la calificación más alta en muestras de nevos benignos. Para cada límite se calculó la sensibilidad del ensayo en las muestras LN. Con el límite determinado en las muestras normales, los marcadores nuevos y los marcadores convencionales proporcionan una sensibilidad de 90% y 83%, respectivamente. Utilizando el límite determinado en las muestras benignas, la sensibilidad para los marcadores nuevo y convencional es de 88% y 42%. Los resultados indican que los marcadores nuevos tienen potencialmente mejores capacidades para diferenciar tejidos que contienen melanocitos benignos y malignos.

EJEMPLO 8 Ensayo múltiple Materiales y Métodos Cada reacción se establece en un volumen final de 25 µl que contiene lo siguiente: cebador directo 400 nM cebador inverso 500 nM sonda PLAB 150 nM sonda de tirosinasa 300 nM sonda LICAM 200 nM sonda PBGD 200 nM Tth 5 U Ab TP 6-25 1 µg Glicerol 10% Tris-HCl 3.7 nM NaCI 4 mM EDTA 0.004 mM Tween-20 0.22% NP-40 0.02% DTT 0.04 mM Hidróxido de potasio 20.5 mM Bicina 50 mM Acetato de potasio 115 mM Albúmina bovina 5 µg Trehalosa 0.15 M dNTP 0.2 mM de cada uno MgCI2 0.5 mM MnSO4 3.5 mM Cebadores 300nM de cada uno Sondas 200 nM de cada una Las secuencias del cebador y sondas se proporcionan en el cuadro 13.

CUADRO 13 Las reacciones se siguen con PLAB en Fam, tirosinasa en Cy3, L1CAM en Texas Red y PBGD en los canales Cy5. El protocolo de ciclado utilizado como se describe en lo siguiente y requiere 30 minutos para completarse. 95°C x 15 seg 65°C x 420 seg 40 ciclos de 95°C durante 5 seg 62°C durante 15 seg - leer fluorométricamente Los umbrales utilizados son 30 canales en Fam, 20 en Cy3, 20 en Texas Red y 20 en Cy5. Los umbrales utilizados en los canales Cy3 y Texas Red pueden disminuir. Los resultados obtenidos se resumen en el cuadro 14.

CUADRO 14 Combinaciones del mejor marcador Límites de Ct L1CAM 27 PLAB 29 Tirosinasa 23 ME20M (GP100) 23.5 Nota: estos datos se pueden ajustar contra patología H y E únicamente. La eficiencia de amplificacióin de cada uno de las 4 reacciones es elevada y la reacción también es lineal sobre 5 unidades logarítmicas (considerando el valor R2 el cual es >0.99% en todos los casos). Por lo tanto, estos datos demuestran un ensayo rápido de trabajo cuádruple. Estos datos sugieren que PLAB es el marcador primario y la complementación, que se obtiene con L1CAM incrementa más la sensibilidad. Si se requiere, la adición de tirosinasa y un tercer marcador complementan adicionalmente a L1CAM y PLAB e incrementa la sensibilidad. La tirosinasa puede ser retirada del ensayo, si se necesita, sin que afecte el funcionamiento de los marcadores restantes.

Discusión Realizamos un análisis de perfilado de expresión de gen de melanoma primario, nevos benignos y especímenes de tejido cutáneo normal con el fin de encontrar marcadores de gen especifico de melanoma para uso potencial en el ensayo de establecimiento de etapa molecular LN. Los genes novedosos que se expresan de manera elevada diferenciada en muestras de melanoma maligno fueron identificados. La inclusión de nevos benignos en nuestro diseño experimental fue la clave de nuestro estudio. En contraste con la piel normal, el contenido de melanocitos en los nevos benignos es cercano al del melanoma. Esto se confirma, además de una determinación histológica, por un nivel de expresión igualmente alto de marcadores de melanoma convencionales tales comon tirosinasa y MART1 tanto en especímenes de tejido de melanoma como de nevos. La composición celular similar nos permite analizar los cambios de expresión de gen asociados específicamente con transformación maligna de melanocitos, no solo con diferenciación de líneas de melanocitos. Como resultado, hemos identificado genes novedosos que se sobreexpresan específicamente en melanomas. Uno de los que se sobreexpresan en gran cantidad novedosos en genes de melanoma, el factor de diferenciación de próstata (PLAB, MIC1) es un miembro de la superfamilia del factor ß de crecimiento transformante y también se sabe que está asociado con otros cánceres. Bae et al. (2003);: y Welsh et al. (2003). PLAB reduce la adhesión celular (Yamauchi et al. (2003)), lo que implica su papel potencial en el progreso de melanoma. El análisis de la vía de los genes que se sobreexpresan en melanoma indican que muchos de estos genes pertenece a funcionamiento y desarrollo de tejido neural, lo que sugiere que la diferenciación de melanocitos y activación del proceso se relaciona con una célula progenitora pluripotente puede ser importante para el desarrollo y progreso de melanoma. Además, el análisis de las vías canónicas muestran tejido neural asociado con el procesamiento amiloide y es modulado de manera significativa en el melanoma. La vía de procesamiento amiloide (APP) en si misma no ha sido asociada con el desarrollo y progreso de melanoma antes. Muchos genes en la vía APP tales como los miembros de la familia de ß y Y secretasa (BACE2, PSEN2) también participan en la via de Notch y juegan un papel en la separación de las proteínas de membrana integral tanto en Notch y APP. Esler et al (2001). Notch suprime la diferenciación y ayuda a mantener las células pluripotenciales de la cresta neural en estado no diferenciado (Gangemi et al., (2004)) y la relación de Notch en el melanoma y particularmente el papel de la secretasas y es el foco de muchos estudios Hoek et al. (2004); Baldi et al. (2003); y Wilson et al. (2000). Hemos comparado nuestros resultados con el estudio reciente de Haqq et al. (2005). En su investiogación, se utiliza un microarreglo de ADNc que contiene 20,862 sondas para perfilar especímenes de nevos benignos, melanomas primarios y melanoma metastásico. El conjunto de muestras incluye melanomas metastásicos y primarios y nevos benignos. Agrupamientos similares resultan de separación de los nevos benignos y tejidos de melanoma maligno primario se encuentran en su estudio. Se reportaron genes comunes en ambos estudios que pueden discriminar melanomas de nevos benignos que incluyen similar a cinesina 5 (KNSL5), factor de diferenciación de próstata (PLAB), CITED1 , osteopontina (SPP1), catepsina B (CSTB), cadherina 3 (CDH3), presenilina 2 (PSEN2). Nuestros resultados del ensayo de RT-PCR en una etapa demuestran que el gen específico para melanoma novedoso PLAB y L1 CAM expresaron no solo en tejidos de melanona primarios sino también en metástasis de LN de melanoma. Además, la capacidad para diferenciar melanoma maligno de nevos benignos los vuelven mejores candidatos que los marcadores convencionales para pruebas moleculares de diagnóstico de melanoma. Con validación adicional en estudios clínicos, estos genes pueden ser desarrollados como marcadores específicos para un ensayo de establecimiento de etapa molecular para detectar micrometástasis de melanoma durante un procedimiento de biopsia de nodulo linfático centinela (SLN). Otra aplicación potencial de los genes es para el diagnóstico de lesiones de melanocitos con ciertas características patológicas. Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de compresión, las descripciones y ejemplos no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.

CUADRO 15 Descripciones de la secuencia, nombres y secuencias de identificación números 1 Referencias Citadas: WO96/29430 2003/0232356 2002/0160382 2002/0155480 2002/0110820 2002/0098535 2003/0059431 2003/0049701 2002/0048784 2003/014283 2003/0013097 6,500,919 4,715,545 5,210,015 5,348,856 5,411 ,876 5,413,924 5,487,972 5,512,437 5,512,444 5,525,494 5,550,044 5,612,201 5,759,783 5,804,375 5,844,075 5,844,092 5,872,225 5,910,574 5,969,124 5,985,619 5,994,102 6,025,474 6,057,105 6,107,476 6,153,388 6,235,525 6,291,430 6,326,145 6,338,947 6,369,211 6,403,341 6,426,217 6,465,181 6,475,727 6,500,638 6,521 ,227 6,527,560 6,599,699 Abrahamsen et al. (2004) Quantification of melanoma mRNA markers in sentinel nodes: pre-clinical evaluation of a single-step real-time reverse transcriptase- polymerase chain reaction assay J Molec Diag 6:253-259 Abrahamsen et al. 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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para identificar un melanoma, caracterizado porque comprende medir los niveles de expresión en una muestra de genes que codifican para ARNm que corresponden a: PLAB (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1) y L1CAM (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2); o PLAB, L1CAM y NTRK3 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3) en donde los niveles de expresión de gen por encima de los niveles de límite predeterminados anteriores son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. 2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que codifica para tirosinasa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 999). 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que se expresa constitutivamente en la muestra. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el gen codifica para PBGD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 979). 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende medir los niveles de expresión de por lo menos un gen que codifica para un ARNm que corresponde a un psid que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-978. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque la muestra es de un nodulo linfático. 7 '.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el nodulo linfático es un nodulo linfático centinela. 8 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque la muestra es de una biopsia. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque el melanoma es un micrometástasis. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son suficientes para detectar metástasis de melanoma. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 95% en base en una comparación de nodulos negativos por hematoxilina y eosina (HyE) e inmunohistoquímicamente (IHC). 12 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC. 13 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 99% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC. 14 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 80% en base en la comparación de los nodulos positivos por hematoxilina y eosina (HyE) e inmunohistoquímicamente (IHC). 15 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 85% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC. 16 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 90% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son de por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC y por lo menos 85% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC, respectivamente. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque los niveles límite predeterminados son por lo menos dos veces la sobreexpresión en tejido que presenta melanoma metastásico en relación a melanocitos benignos o tejido normal. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque la expresión del gen se mide en un microarreglo o chip de gen. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque la expresión del gen se determina por amplificación de ácido nucleico llevada a cabo por reacción en cadena de polimerasa (PCR) o ARN extraído de la muestra. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque los productos de PCR comprenden por lo menos una de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 25-28. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque los productos de PCR incluyen fluoróforos. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque los fluoróforos se seleccionan del grupo que consiste de Fam, Texas Red, Cal Red, C1 , Cy5 y Cy3. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque los fluoróforos corresponden a PLAB: Fam; L1CAM; Texas Red, o Cal Red, tirosinasa: C1 ; PBGD: Cy5, cuando sea aplicable. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la PCR es reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la RT-PCR comprende además uno o más reactivos de control internos. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el ARN se extrae de la muestra al: a. homogeneizar la muestra para producir un homogeneizado; b. poner en contacto el homogeneizado con un sustrato que contiene, o del cual se fija, un material que une ARN; c. permitir que el ARN se una al material que une ARN; b. lavar el sustrato bajo condiciones suficientes para eliminar cualquier contaminante, sustancia de interferencia o ARN no unido; y e. eluir el ARN unido del sustrato. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque comprende reducir melanina en la muestra. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la concentración de melanina se reduce al homogeneizar la muestra para producir un homogeneizado y hacer pasar el homogeneizado a través de una matriz a la cual se adhiere, se une o se fija la melanina. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la matriz comprende esferas poliméricas. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la matriz comprende sílice. 32 - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 8 minutos. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caractepzado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 6 minutos. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque la expresión del gen se mide al medir la proteína codificada por el gen. 35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la proteína se detecta por un anticuerpo específico para la proteína. 36.- Un método para identificar un melanoma, que comprende medir los niveles de expresión en una muestra de genes que codifican para ARNm reconocidos por los conjuntos de cebador/sonda que se seleccionan del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15; o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15 y SECUENCIAS DE I DENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18, en donde los niveles de expresión de gen por encima de niveles límite predeterminados anteriores son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. 37 - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que codifica para tirosinasa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 999). 38 - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen expresado constitutivamente en la muestra. 39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque el gen codifica para PBGD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 979). 40.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque comprende medir los niveles de expresión de por lo menos un gen que codifica para un ARNm que corresponde a un psid que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-978. 41. El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque la muestra es de un nodulo linfático. 42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque el nodulo linfático es un nodulo linfático centinela. 43.- El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque la muestra es de una biopsia. 44.- El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque el melanoma es una micrometastásis. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son suficientes para detectar metástasis de melanoma. 46.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 95% en base en una comparación de nodulos negativos por hematoxilina y eosina (HyE) e inmunohistoquímicamente (IHC). 47.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC. 48.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 99% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC. 49.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 80% en base en una comparación de los nodulos positivos por hematoxilina y eosina (HyE) e hinmunohistoquímicamente (IHC). 50.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 85% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC. 51.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 90% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC. 52.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son de por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC y de por lo menos 85% en base en una comparación de nodulos positivos por HyE e IHC respectivamente. 53 - El método de conformidad con las reivindicaciones 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque los niveles límite predeterminados son por lo menos la sobreexpresión de dos veces en tejido que tienen un melanoma metastásico en relación a melanocitos benignos o tejido normal. 54.- El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque la expresión del gen se mide en un microarrego o un chip de gen. 55.- El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque la expresión del gen se determina por amplificación de ácido nucleico llevado a cabo por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de ARN extraído de la muestra. 56.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque los productos de PCR comprenden por lo menos una de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 25-28. 57.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque los productos de PCR incluyen fluoróforos. 58.- El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque los fluoróforos se seleccionan del grupo que consiste de: Fam, Texas Red, Cal Red, C1 , Cy5 y Cy3. 59.- El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque los fluoróforos corresponden a PLAB: Fam; L1CAM: Texas Red o Cal Red, tirosinasa: C1 ; PBGD: Cy5, cuando sea aplicable. 60.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque la PCR es reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). 61.- El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque la RT-PCR comprende además uno o más reactivos de control internos. 62.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el ARN se extrae de la muestra al: a. homogeneizar la muestra para producir un homogeneizado; b. poner en contacto el homogeneizado con un sustrato que contiene, o del cual se fija, un material que une ARN; c. permitir que el ARN se una al material de unión de ARN; d. lavar el sustrato bajo condiciones suficientes para separar cualquier contaminante, sustancia de interferencia o ARN no unido; y e. eluir el ARN unido del sustrato. 63.- El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque comprende reducir melanina en la muestra. 64.- El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado además porque la concentración de melanina se reduce al homogeneizar la muestra para producir un homogeneizado y hacer pasar el homogeneizado a través de una matriz a la cual la melanina se adhiere, se une o se fija. 65.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque la matriz comprende esferas poliméricas. 66.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque la matriz comprende sílice. 67.- El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 8 minutos. 68.- El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 6 minutos. 69 - El método de conformidad con la reivindicación 36, 37, 38, 39 ó 40, caracterizado además porque la expresión del gen se mide al medir la proteína codificada por el gen 70 - El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque la proteína se detecta por un anticuerpo específico para la proteína 71 - Un método para distinguir un melanocito maligno de un melanocito benigno, caracterizado además porque comprende obtener una muestra de tejido, y b medir los niveles de expresión en una muestra de los genes que codifican para PLAB (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 1 ) y L1CAM (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2) o PLAB, L1CAM y NTRK3 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 3) en donde los niveles de expresión del gen por encima de los niveles limite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanocito maligno en la muestra 72 - El método de conformidad con la reivindicación 71 , caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que codifica para tirosinasa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 999) 73 - El método de conformidad con la reivindicación 71 , caractepzado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que se expresa constitutivamente en la muestra 1 74.- El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque el gen codifica para PBGD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 979). 75.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , caracterizado además porque comprende medir los niveles de expresión de por lo menos un gen que codifica para un ARNm que corresponde a un psid que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-978. 76.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque la muestra es de un nodulo linfático. 77.- El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado además porque el nodulo linfático es un nodulo linfático centinela. 78.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque la muestra es de una biopsia. 79.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque el melanoma es una micrometastasis. 80.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son suficientes para detectar metástasis de melanoma. 81.- El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 95% en base en una comparación de nodulos negativos por hematoxilina y eosina (HyE) e inmunohistoquímicamente (IHC). 82 - El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 97% en base en una comparación de nodulos negativos por HyE e IHC. 83.- El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 99% en base en una comparación de nodulos negativos por HyE e IHC. 84.- El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 80% en base en una comparación de nodulos positivos por hematoxilína y eosina (HyE) e inmunohistoquímícamente (IHC). 85.- El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 85%, en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC. 86.- El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 90% en una base en comparación con nodulos positivos por HyE e IHC. 87.- El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son de por lo menos 97% en base en una comparación de nodulos negativos por HyE e IHC y de por lo menos 85% en base en una comparación de nodulos positivos por HyE e IHC respectivamente. 88.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque los niveles límite predeterminados son por lo menos la sobreexpresión dos veces en tejido que tienen melanoma metastásico en relación a melanocitos benignos o tejido normal. 89.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque la expresión del gen se mide en un microarrego o chip de gen. 90.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque la expresión se determina por amplificación de ácido nucleico llevada a cabo por reacción en cadena de polimerasa (PCR) o ARN extraído de la muestra. 91.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque los productos de PCR comprenden por lo menos una de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 25-28. 92.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque los productos de PCR incluyen fluoróforos. 93.- El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado además porque los fluoróforos se seleccionan del grupo que consiste de Fam, Texas Red, Cal Red, C1 , Cy5 y Cy3. 94.- El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado además porque el producto de PCR, si está presente, se identifica por el patrón de fluorescencia de PLAB: Fam; L1CAM; Texas Red o Cal Red, tirosinasa, C1 ; PBGD: Cy5, cuando sea aplicable. 95.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque la PCR es reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). 96 - El método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado además porque la RT-PCR comprende además uno o más reactivos de control interno. 97 - El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque el ARN se extrae de la muestra al: a. homogeneizar la muestra para producir un homogeneizado; b. poner en contacto el homogeneizado con un sustrato que contiene, o al cual se fija un material que une ARN; c. permitir que el ARN se una al material de unión de ARN; d. lavar el sustrato bajo condiciones suficientes para eliminar cualquier contaminante, sustancia de interferencia y ARN no unido; y e. eluir el ARN unido del sustrato. 98.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque comprende reducir la melanina en la muestra. 99 - El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado además porque la concentración de melanina se reduce al homogeneizar la muestra para producir un homogeneizado y hacer pasar el homogeneizado a través de una matriz a la cual la melanina se adhiere, se une o se fija. 100.- El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado además porque la matriz comprende esferas poliméricas. 101.- El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado además porque la matriz comprende sílice. 102.- El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 8 minutos. 103.- El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 6 minutos. 104.- El método de conformidad con la reivindicación 71 , 72, 73, 74 ó 75, caracterizado además porque la expresión del gen se mide al medir la proteína codificada por el gen. 105 - El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado además porque la proteína se detecta por un anticuerpo específico para la proteína. 106 - Un método para distinguir un melanocito maligno de un melanocito benigno, que comprende medir los niveles de expresión en una muestra de genes reconocidos por los conjuntos de cebador/sonda que se seleccionan del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15; o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18, en donde los niveles de expresión por encima de niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanocito maligno en la muestra. 107.- El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que codifica para tirosinasa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 999). 108.- El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen expresado constitutivamente en la muestra. 109 - El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado además porque el gen codifica para PBGD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 979). 110.- El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado además porque comprende medir los niveles de expresión de por lo menos un gen que codifica para un ARNm que corresponde a un psid que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-978. 111.- El método de conformidad con la reivindicación 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque la muestra es de un nodulo linfático. 112.- El método de conformidad con la reivindicación 111 , caracterizado además porque el nodulo linfático es un nodulo linfático centinela. 113.- El método de conformidad con la reivindicación 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque la muestra es de una biopsia. 114 - El método de conformidad con la reivindicación 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque el melanoma es una micrometastasis. 115.- El método de conformidad con la reivindicación 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son suficientes para detectar metástasis de melanoma. 116 - El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 95% en base en una comparación de nodulos negativos por hematoxilina y eosina (HyE) e inmunohistoquímicamente (IHC). 117 - El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC. *- 118.- El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 99% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC. 119.- El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 80% en base en la comparación de los nodulos positivos por hematoxilina y eosina (HyE) e inmunohistoquímicamente (IHC). 120.- El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 85% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC. 121.- El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 90% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC. 122.- El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son de por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por HyE e IHC y por lo menos 85% en base en una comparación de los nodulos positivos por HyE e IHC, respectivamente. 123.- El método de conformidad con las reivindicación 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque los niveles límite predeterminados son por lo menos dos veces la sobreexpresión en tejido que presenta melanoma metastásico en relación a melanocitos benignos o tejido normal. 124.- El método de conformidad con las reivindicaciones 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque la expresión del gen se mide en un microarreglo o chip de gen. 125.- El método de conformidad con las reivindicaciones 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque la expresión del gen se determina por amplificación de ácido nucleico llevada a cabo por reacción en cadena de polimerasa (PCR) o ARN extraído de la muestra. 126.- El método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado además porque los productos de PCR comprenden por lo menos una de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 25-28. 127.- El método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado además porque los productos de PCR incluyen fluoróforos. 128.- El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado además porque los fluoróforos se seleccionan del grupo que consiste de Fam, Texas Red, Cal Red, C1 , Cy5 y Cy3. 129.- El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado además porque el producto de PCR, sí está presente, se identifica por el patrón de fluorescencia de PLAB: Fam; L1CAM: Texas Red o Cal Red, tirosinasa: C1 ; PBGD: Cy5, cuando sea aplicable. 130.- El método de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado además porque la PCR es fracción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). 131 - El método de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado además porque RT-PCR comprende además uno o más reactivos de control interno. 132.- El método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado además porque el ARN se extrae de la muestra al: a. homogenizar la muestra para producir un homogenizado; b. poner en contacto el homogenizado con un sustrato que contiene, o al cual se fija un material que une ARN; c. permitir que el ARN se una al material de unión de ARN; d. lavar el sustrato bajo condiciones suficientes para eliminar cualquier contaminante, sustancia de interferencia o ARN no unido; y e. eluir el ARN unido del sustrato. 133.- El método de conformidad con la reivindicación 106, 107, 108, 109 ó 110, caracterizado además porque comprende reducir la melanina en la muestra. 134 - El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado además porque la concentración de melanina se reduce al homogenizar la muestra para producir un homogenizado y hacer pasar el homogenizado a través de una matriz a la cual la melanina se adhiere, se une o se fija. 135 - El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado además porque la matriz comprende esferas poliméricas. 136.- El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado además porque la matriz comprende sílice. 137 - El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 8 minutos. 138.- El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 6 minutos. 139.- El método de conformidad con la reivindicación 106, 107, 1 08, 109 ó 110, caracterizado además porque la expresión del gen se mide al medir la proteína codificada por el gen. 140.- El método de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado además porque la proteína se detecta por un anticuerpo específico para la proteína. 141.- Un método para determinar el protocolo de tratamiento de un paciente, que comprende medir los niveles de expresión en una muestra de los genes que codifican para PLAB (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 ) y L1 CAM (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2); o PLAB, L1 CAM y NTRK3 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3), en donde los niveles de expresión del gen por encima de los niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. 142.- El método de conformidad con la reivindicación 141 , caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que codifica para tirosinasa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 999). 143.- El método de conformidad con la reivindicación 141 , caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que se expresa constitutivamente en la muestra. 144.- El método de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado además porque el gen codifica para PBGD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 979). 145 - El método de conformidad con la reivindicación 141 , caracterizado además porque comprende medir los niveles de expresión de por lo menos un gen que codifica para un ARNm que corresponde a un psid que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-978. 146.- El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado además porque la muestra se obtiene de un nodulo linfático. 147.- El método de conformidad con la reivindicación 146, caracterizado además porque el nodulo linfático es un nodulo linfático centinela. 148 - El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado además porque la muestra es de una biopsia. 149 - El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado además porque el melanoma es una micrometástasis. 150.- El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son suficientes para detectar metástasis de melanoma 151 - El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 95% en base en una comparación de nodulos negativos por hematoxilina y eosina (H y E) e inmunohistoquimicamente (IHC) 152 - El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por H y E e IHC 153 - El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 99% en base en una comparación de nodulos negativos por H y E e IHC 154 - El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 80% en base en una comparación de nodulos positivos por hematoxihna y eosma (H y E) e inmunohistoquimicamente (IHC) 155 - El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 85% en base en una comparación de los nodulos positivos por H y E e IHC 156 El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 90% en base en una comparación de los nodulos positivos por H y E e IHC 157 - El método de conformidad con la reivindicación 155, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son por lo menos 97% en base en una comparación de los nodulos negativos por H y E e IHC y de por lo menos 85% en base en una comparación de los nodulos positivos por H y E e IHC, respectivamente 158 - El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado ademas porque los niveles límite predeterminado son por lo menos la sobrexpresión de dos veces en tejido que tiene melanoma metastásico en relación a melanocitos benignos o tejido normal 159 - El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado además porque la expresión del gen se mide en un microarreglo o un chip de genes 160 - El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado ademas porque la expresión del gen se determina por amplificación por acido nucleico al llevar a cabo en reacción en cadena de polimerasa (PCR) o ARN extraído de la muestra 161 - El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado además porque los productos de PCR comprenden por lo menos una de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 25-28 162 - El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado además porque los productos de PCR incluyen fluoróforos 163 - El método de conformidad con la reivindicación 162, caracterizado ademas porque los fluoroforos se seleccionan del grupo que consiste de Fam, Texas Red, Cal Red, C1 , Cy5 y Cy3 164 - El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado además porque los fluoróforos corresponden a PLAB Farm, L1 CAM Texas Red o Cal Red, tirosmasa C1 , PBGD Cy5, cuando sea aplicable 165 - El método de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado además porque la PCR es reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) 166 - El método de conformidad con la reivindicación 165, caracterizado además porque RT-PCR comprende además uno o más reactivos de control interno 167 - El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado además porque el ARN se extrae de la muestra al a homogenizar la muestra para producir un homogenizado, b poner en contacto el homogenizado con un sustrato que contiene, o al cual se fija un material que une ARN, c permitir que el ARN se una al material de unión de ARN, d lavar el sustrato bajo condiciones suficientes para eliminar cualquier contaminante, sustancia de interferencia o ARN no unido, y e eluir el ARN unido del sustrato 168 - El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado además porque comprende reducir la melanina en la muestra 169 - El método de conformidad con la reivindicación 168, caracterizado además porque la concentración de melanina se reduce al homogenizar la muestra para producir un homogenizado y hacer pasar el homogenizado a través de una matriz a la cual la melanina se adhiere, se une o se fija. 170.- El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado además porque la matriz comprende esferas poliméricas. 171.- El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado además porque la matriz comprende sílice. 172.- El método de conformidad con la reivindicación 167, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 8 minutos. 173.- El método de conformidad con la reivindicación 167, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 6 minutos. 174.- El método de conformidad con la reivindicación 141 , 142, 143, 144 ó 145, caracterizado además porque la expresión del gen se mide al medir la proteína codificada por el gen. 175.- El método de conformidad con la reivindicación 174, caracterizado además porque la proteína se detecta por un anticuerpo específico para la proteína. 176.- Un método para determinar un protocolo de un tratamiento de un paciente, que comprende medir los niveles de expresión en una muestra de genes identificados por los conjuntos de cebador/sonda que se seleccionan del grupo que consiste de SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15; o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12 o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18, en donde los niveles de expresión de gen por encima de niveles límite predeterminados son indicativos de la presencia de un melanoma en la muestra. 177.- El método de conformidad con la reivindicación 176, caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que codifica para tirosinasa (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN: 999). 178.- El método de conformidad con la reivindicación 176, caracterizado además porque comprende medir el nivel de expresión de un gen que se expresa de manera constitutiva en la muestra. 179.- El método de conformidad con la reivindicación 176, caracterizado además porque el gen codifica para PBGD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 979). 180.- El método de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado además porque comprende medir los niveles de expresión de por lo menos un gen que codifica para un ARNm que corresponde a un psid que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 29-978. 181.- El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque la muestra es de un nodulo linfático. 182 - El método de conformidad con la reivindicación 181 , caracterizado además porque el nodulo linfático es un nodulo linfático centinela. 183.- El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque la muestra es de una biopsia. 184.- El método de conformidad con la reivindicación 181 , 182, 183, 184 ó 185, caracterizado además porque el melanoma es una micrometástasis. 185.- El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque la especificidad y selectividad son suficientes para detectar metástasis de melanoma. 186.- El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 95% en base en una comparación de nodulos negativos por hematoxilina y eosina (H y E) e inmunohistoquimicamente (IHC). 187.- El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 97% en base en una comparación de nodulos negativos por H y E e IHC. 188.- El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 99% en base en una comparación de nodulos negativos por H y E e IHC. 189.- El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 80% en base en una comparación de nodulos positivos de hematoxilina y eosina (H y E) e inmunohistoquimicamente (IHC). 190 - El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 85% en base en una comparación de nodulos positivos por H y E e IHC. 191 - El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 90% en base en una comparación de nodulos positivos por H y E e IHC. 192 - El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado además porque la especificidad y sensibilidad son de por lo menos 97% en base en una comparación de nodulos negativos por H y E y IHC y de por lo menos 85% en base en una comparación de nodulos positivos por H y E e IHC, respectivamente. 193 - El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque los niveles limite predeterminados son la sobrexpresión de por lo menos dos veces en el tejido que tiene melanoma metastásico en relación a melanocitos benignos o tejido normal. 194 - El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque la expresión del gen se mide en un microarreglo o chip de gen. 195.- El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque la expresión del gen se determina por amplificación por ácido nucleico llevada a cabo por reacción en cadena de polimerasa (PCR) o ARN extraído de la muestra. 196.- El método de conformidad con la reivindicación 195, caracterizado además porque los productos de PCR comprende por lo menos una de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 25-28. 197.- El método de conformidad con la reivindicación 195, caracterizado además porque los productos de PCR incluyen fluoróforos. 198.- El método de conformidad con la reivindicación 197, caracterizado además porque los fluoróforos se seleccionan del grupo que consiste de: Fam, Texas Red, Cal Red, C1 , Cy5 y Cy3. 199.- El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado además porque los fluoróforos corresponden a PLAB: Farm; L1CAM: Texas Red o Cal Red, tirosinasa: C1 ; PBGD: Cy5, cuando sea aplicable. 200.- El método de conformidad con la reivindicación 195, caracterizado además porque la PCR es reacción en cadena de polimerasa por transcripción inversa (RT-PCR). 201.- El método de conformidad con la reivindicación 200, caracterizado además porque RT-PCR comprende además uno o más reactivos de control interno. 202.- El método de conformidad con la reivindicación 195, caracterizado además porque el ARN se extrae de la muestra al: a. homogenizar la muestra para producir un homogenizado; b. poner en contacto el homogenizado con un sustrato que contiene o al cual se fija un material que une ARN; c. permitir que el ARN se una al material de unión de ARN; d. lavar el sustrato bajo condiciones suficientes para eliminar cualquier contaminante, sustancia de interferencia o ARN no unido; y e. eluir el ARN unido del sustrato. 203.- El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque comprende reducir la melanina en la muestra. 204.- El método de conformidad con la reivindicación 203, caracterizado además porque la concentración de melanina se reduce al homogenizar la muestra para producir un homogenizado y hacer pasar el homogenizado a través de una matriz a la cual la melanina se adhiere, se une o se fija. 205.- El método de conformidad con la reivindicación 204, caracterizado además porque la matriz comprende esferas poliméricas. 206.- El método de conformidad con la reivindicación 204, caracterizado además porque la matriz comprende sílice. 207.- El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 8 minutos. 208.- El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado además porque el ARN se extrae en menos de aproximadamente 6 minutos. 209.- El método de conformidad con la reivindicación 176, 177, 178, 179 ó 180, caracterizado además porque la expresión del gen se mide al medir la proteína codificada por el gen. 210.- El método de conformidad con la reivindicación 209, caracterizado además porque la proteína se detecta por un anticuerpo específico para la proteína. 211.- Una composición caracterizada porque comprende por lo menos un conjunto de cebador/sonda que se selecciona del grupo que consiste de SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-6, SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 7-9, SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 46-48, SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13-15; SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 16-18, SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 19-21 y SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 22-24. 212.- Una composición caracterizada porque comprende por lo menos un amplicón que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 25-28. 213.- Un equipo para llevar a cabo un ensayo para determinar la presencia de melanoma en una muestra de tejido, caracterizado además porque comprende: reactivos de amplificación y detección de ácido nucleico. 214.- El equipo de conformidad con la reivindicación 213, caracterizado porque los reactivos comprenden cebadores que tienen secuencias para detectar la expresión de por lo menos un gen que codifica para un ARNm que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1-3. 215. El equipo de conformidad con la reivindicación 213, caracterizado además porque comprende los reactivos de RT-PCR.