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ES2611034T3 - Secuencias y composiciones de péptidos - Google Patents

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ES2611034T3
ES2611034T3 ES11157382.0T ES11157382T ES2611034T3 ES 2611034 T3 ES2611034 T3 ES 2611034T3 ES 11157382 T ES11157382 T ES 11157382T ES 2611034 T3 ES2611034 T3 ES 2611034T3
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influenza
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Gregory Alan Stoloff
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Peptcell Ltd
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Abstract

Un polipéptido que consiste en no más de 100 aminoácidos, tal polipéptido comprende una o más secuencias de SEQ ID NO. 3y/o una o más secuencias que tienen al menos 85% de homología con la secuencia de 21 aminoácidos de la SEQ ID 3: SEQ ID NO: 3 DLIFLARSALILRGSVAHKSC en la que, el polipéptido es inmunogénico en un vertebrado que expresa un alelo del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y en la que el polipéptido es inmunogénico para una pluralidad de cepas del virus de lagripe.

Description

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Como se describió antes, las secuencias se han identificado después del análisis de todas las secuencias de la cepa viral de la gripe conocidas en todas las especies. Las secuencias en consecuencia son secuencias de consenso desarrolladas del análisis anterior. A pesar de ser secuencias de consenso, las secuencias en algunos casos corresponden exactamente a las secuencias naturales de las cepas del virus de la gripe conocidas. Debido a la marcada conservación de las secuencias en todos los virus de todas las especies, las secuencias de consenso, incluso cuando difieren de las secuencias reales, solo difieren en una pequeña cantidad de residuos, y en consecuencia contienen epitopes mucho más pequeños (8–mers, 9–mers, 10–mers, etc.) en los cuales no hay diferencias de las secuencias naturales. Las secuencias de consenso anteriores como un todo, por ende contienen muchos epitopes efectivos que son los mismos que los epitopes naturales, así como epitopes efectivos que difieren solo ligeramente de los epitopes naturales. Será evidente para los expertos que la invención extiende no solo a las secuencias de consenso y sus epitopes, pero también a las correspondientes secuencias reales en cualquier cepa del virus de la gripe. En consecuencia, las secuencias con alguna homología con las secuencias de consenso también están dentro del alcance de la invención. Tal homología permite la sustitución de aminoácidos en un epítope. Tales sustituciones son preferiblemente sustituciones conservadoras en línea con los esquemas de sustitución conocidos.
La numeración de secuencia a la que se hace referencia en la presente invención se define de acuerdo con principios bien reconocidos. Así, la numeración comienza en 1 a partir del codón de iniciación de traducción reconocido (ATG). Esto corresponde a una Metionina (M), para el segmento del genoma de la gripe que codifica la proteína de interés. En otras palabras, comienza en 1 con respecto a la Metionina mostrada como el primer aminoácido en la secuencia de la proteína de interés tal como se utiliza y y se define por las bases de datos en las que se han establecido las secuencias (es decir, GenBank, SwissProt, etc.).
La presente invención se describirá con más detalle por medio del ejemplo solo con referencia a las siguientes Figuras, en las que:
La Figura 1A a 1F muestra la producción de IFN–γ por cultivos de esplenocitos primarios de ratones vacunados con FLU–v y NRP estimulados con Con A (10 µg/ml), lisozima soluble (5 µg/ml), polipéptidos solubles purificados (P1 (Figura 1A), P2 (Figura 1B), P3 (Figura 1C), P4 (Figura 1D), P5 (Figura 1E) y P6 (Figura 1F); 5 µg/ml) y T1 apareado con HLA (T1) y células humanas JURKAT (Ju) no apareadas transfectadas con lisozima, P1, P2, P3, P4, P5 o P6 de acuerdo con el protocolo descrito en el siguiente Ejemplo 1 (la relación de esplenocito a células transfectadas es 10:1). La producción de IFN–γ está representada como el diferencial entre el nivel de producción en respuesta al antígeno considerado menos el IFN–γ producido en respuesta a cada lisozima soluble o la correspondiente célula transfectada con lisozima. Los niveles umbral de la producción de IFN–γ mediada por lisozima fueron para elantígeno soluble 25 ± 10 pg/ml, para el antígeno en T1 316 ± 43 pg/ml, y para el antígeno en Jurkat 19 ± 6 pg/ml;
La Figura 2 muestra la producción de IFN–γ por cultivos de esplenocitos primarios de ratones vacunados con FLU– v y NRP estimulados con Con A (10 µg/ml), lisozima soluble (5 µg/ml), preparación de polipéptido FLU–v soluble purificado (P1, P2, P3, P4, P5 y P6 todos juntos a 5 µg/ml) y T1 apareado con HLA (T1) y células humanas JURKAT (Ju) no apareadas infectadas con cepas de la gripe A/New Caledonia/20/99, A/NYMC/X–147 o B/Johannesburg/5/99 o transfectadas con lisozima de acuerdo con el protocolo descrito en el siguiente Ejemplo 1 (la relación de esplenocito a célula infectada/transfectada es 10:1); la producción de IFN–γ está representada como el diferencial entre el nivel de producción en respuesta al antígeno considerado menos el IFN–γ producido en respuesta a cada lisozima soluble o la correspondiente célula transfectada con lisozima; los niveles umbral de la producción de IFN–γ mediada por lisozima fueron para el antígeno soluble 25 ± 10 pg/ml, para el antígeno en T1 316 ± 43 pg/ml, y para el antígeno en Jurkat 19 ± 6 pg/ml; y
Las Figuras 3A y 3B muestran la supervivencia de los animales después de un estímulo letal con Gripe A/PR/8/34; los animales se inmunizaron por vía subcutánea con FLU–v o NRP–v en los días 1 y 15 y en el día 20 todos se estimularon por vía intranasal con 45 µl del virus (5x107 pfu por dosis) bajo anestesia; los animales de la Fig 3A se inocularon por vía intraperitoneal con 100 µg de suero CD8 anti–ratón de rata en los días 19 y 22; los animales de la Fig 3B se inocularon por vía intraperitoneal con un suero de rata irrelevante en los días 19 y 22; la flecha indica la fecha del estímulo intranasal mientras que los rombos indican la fecha en que los animales se inocularon con el suero anti–CD8.
El polipéptido descrito antes normalmente comprende uno o más (preferiblemente, dos o más) epitopes. Estos epitopes son preferiblemente epitopes de las células T, tales como epitopes del linfocito T citotóxico (CM). En general el polipéptido es inmunogénico para una cepa del virus de la gripe, y preferiblemente para una pluralidad de cepas del virus de la gripe. En el presente contexto, se considera que un polipéptido inmunogénico para una cepa viral de la gripe significa un polipéptido que es parte de una proteína del virus de la gripe y que induce una respuesta del sistema inmunológico, tal como exhibir reactividad CTL cuando se une a un MHC. Un método para determinar si un polipéptido posee tal inmunogenicidad se expone en el siguiente Experimento 1. Sin embargo, la presente invención no se limita a tales métodos, y los expertos pueden seleccionar cualquier método conocido para determinar la inmunogenicidad, según corresponda.
8
En la presente invención, el polipéptido comprende dos o más secuencias como se describió antes. Normalmente, dos, tres, cuatro, cinco o más epitopes pueden estar presentes en el polipéptido, según corresponda. Cuanto más de estos epitopes están presentes, mayor la amplitud de protección provista en una población de individuos humanos y/o animales con diferentes HLA oMHC.
5 El polipéptido de acuerdo con la presente invención también puede comprender una o más secuencias adicionales que no son epítopes, si se desea. Típicamente, las secuencias adicionales son de una o más proteínas del virus de la gripe. Estas secuencias pueden estar situadas entre dos o más de las secuencias (los epítopes) descritas antes,
o pueden estar situadas en uno o ambos extremos del polipéptido. La presencia de tales secuencias adicionales no debería afectar a la función del polipéptido, con la condición de que el polipéptido como un todo no se haga 10 demasiado grande, interfiriendo con la presentación de los epítopes en el sistema inmune del vertebrado. En realizaciones específicas de la invención, cuando el polipéptido es homólogo a SEQ ID NO: 1, las secuencias adicionales son preferiblemente una o más de una proteína M1 de la gripe (preferiblemente de una cepa de gripe A), cuando el polipéptido es homólogo a SEQ ID NO: 2, las secuencias adicionales son preferiblemente una o más de una proteína M1 de la gripe (preferiblemente de una cepa de la gripe B), cuando el polipéptido es homólogo a 15 SEQ ID NO: 3, las secuencias adicionales son preferiblemente una o más de una proteína NP de la gripe (preferiblemente de una cepa de la gripe A), cuando el polipéptido es homólogo a SEQ ID NO: 4, las secuencias adicionales son preferiblemente una o más de una proteína NP de la gripe (preferiblemente de una cepa de la gripe B), cuando el polipéptido es homólogo a SEQ ID NO: 5, las secuencias adicionales son preferiblemente una o más de una proteína PB1 de la gripe, y cuando el polipéptido es homólogo a SEQ ID NO: 6, las secuencias adicionales
20 son preferiblemente una o más de una proteína M2 de la gripe.
En las realizaciones más preferidas, las secuencias adicionales de las proteínas mencionadas anteriormente son aquellas dentro de las siguientes secuencias de consenso, o aquellas que tienen al menos 60% de homología con una secuencia dentro de las siguientes secuencias de consenso:
M1 Consenso de gripe A – SEQ ID NO: 7
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M1 Consenso de gripe B – SEQ ID NO: 8
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NP Consenso de gripe A – SEQ ID NO: 9
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Proteínas M1
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Claims (1)

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