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CN107106668A - 用于免疫中的有效抗体生产的新颖蛋白质结构 - Google Patents

用于免疫中的有效抗体生产的新颖蛋白质结构 Download PDF

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CN107106668A
CN107106668A CN201580061360.5A CN201580061360A CN107106668A CN 107106668 A CN107106668 A CN 107106668A CN 201580061360 A CN201580061360 A CN 201580061360A CN 107106668 A CN107106668 A CN 107106668A
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Abstract

一种增进免疫应答的方法，其包含将两亲性肽共价结合至抗原以形成抗原复合体合成物，以及给予所述抗原复合体合成物予受试者。有着两亲性螺旋结构的抗原复合物，具有其增进抗原递送的能力。

Description

用于免疫中的有效抗体生产的新颖蛋白质结构
相关申请案的交互参照
本申请案声明于2014年12月10日递交申请的美国临时专利申请案号62/090,180的优先权，其全部的揭露内容并入本文中作为参考。
技术领域
本发明的示范性实施例相关于一种增进免疫应答的方法。特别是，本发明的示范性实施例相关于一种通过使用有着两亲性螺旋结构的抗原复合物用于增进免疫应答的方法。
背景技术
传染性所需的许多微生物蛋白随着在微生物传染机制的深远影响研究已经鉴定且被指为具潜力的候选疫苗。这些候选疫苗囊括多种分子类型，包含来自病原微生物的肽、蛋白质、糖蛋白、以及多聚糖。然而，当通过合成或纯化所产生的这些候选者的抗原性的缺乏，使这些候选疫苗无法作为有用的疫苗。
因此，目前有一些已知的方法以增进这些候选疫苗的抗原性，其包含在疫苗制剂中添加佐剂，或是通过融合这些候选疫苗到一免疫原以增加这些候选疫苗的抗原性。然而，佐剂通常诱导造成注射位置的肿胀和疼痛的先天性免疫。此外，在族群中对特定佐剂成分的反应的变异性导致接种疫苗的混合结果以及来自高剂量的佐剂添加的严重不良事件。
多种免疫原已经被发展使用于与潜在的候选疫苗融合以增加其抗原性。举例来说，乙型肝炎核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBcAg)、百日咳毒素CyaA、以及来自大肠杆菌的外毒素已经被用以透过不同的机制增加接触蛋白的免疫原性。然而，由于这些免疫原的大小较大，异源的蛋白的插入或融合通常干扰融合蛋白的正确折叠。虽然异常折叠的蛋白质可以数个程序重折叠，但实际上会增加生产成 本。因此，高度需要一种能够使融合蛋白的高抗原性以及对蛋白质折叠不具干扰性的小肽。
另一方面，在特异性免疫应答中，效应T细胞应答对于记忆T细胞以及记忆B细胞的建立很重要。效应T细胞应答的一个是2型辅助T细胞，在其中初始T细胞是通过接合在抗原递呈细胞上的MHC II类分子上的T细胞表位所刺激。这些表位是衍生自胞内体(endosome)途径处理的抗原，其中所述表位与MHC II类分子接合且输出到细胞表面。如此在抗原递呈细胞中抗原到胞内体途径的递送是用于刺激2型辅助T细胞应答(或Th2应答)的标准。Th2应答的特征在于增进IgG型切换至IgG1副型。另一方面，Th1应答增进IgG型切换至IgG2a及IgG3。如此IgG1效价与IgG2q/IgG3效价之间的比值可作为通过特定免疫原诱发的效应T细胞应答的类型的替代标记。
发明内容
本发明提供一种增进免疫应答的方法，其包含：结合两亲性肽与抗原以形成抗原复合物合成物；以及将所述抗原复合物合成物给予受试者。
在一个实施例中，本发明提供所述增进免疫应答的方法，其中所述两亲性肽可涵盖范围从4至45个氨基酸。
在一个实施例中，本发明提供所述增进免疫应答的方法，其中所述两亲性肽可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明提供所述增进免疫应答的方法，其中所述两亲性肽包含含有A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的氨基酸序列，其中，A1、A2、A3及A4是每个个别地选自由精氨酸(R)及赖氨酸(K)所组成的群组；B1是选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；B2是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、及色氨酸(W)所组成 的群组；B3是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；B4是选自由苯基丙氨酸(F)、色氨酸(W)及酪氨酸(Y)所组成的群组；以及B5是选自由苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)及丝氨酸(S)组成的群组。
在另一个实施例中，本发明提供所述增进免疫应答的方法，其中所述两亲性肽可包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:6的氨基酸序列、SEQ ID NO:7的氨基酸序列、SEQ ID NO:8的氨基酸序列、SEQ ID NO:9的氨基酸序列、SEQ ID NO:10的氨基酸序列或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明提供所述增进免疫应答的方法，其中所述抗原可为选自由A型流感病毒(Type A of Influenza virus)、B型流感病毒(Type B of Influenza virus)、C型流感病毒(Type C of Influenza virus)、登革病毒(Dengue virus)、人类乳突病毒(Human papillomavirus)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster virus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、单纯性疱疹病毒1及2型(Herpes simplex virus 1 and 2)、疟原虫物种(Plasmodium species)、麻疹病毒(Measles virus)、中东呼吸综合症冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、百日咳博德特式杆菌(Bordetella pertussis)、小儿麻痹病毒(Poliovirus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、呼吸道合胞体病毒(Respiratory syncytial virus)、轮状病毒(Rotavirus)、风疹病毒(Rubella virus)、严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS coronavirus)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus  aureus)、艰难梭菌(Clostridium difficile,)、脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)以及沙门氏杆菌(Salmonella enterica subsp.enterica)所组成的群组的病原体的一部份。
在另一个实施例中，本发明提供所述增进免疫应答的方法，其中所述抗原是选自由低聚糖、多肽、蛋白质、多聚糖、肽及其组合所组成的群组。
在另一个实施例中，本发明提供所述增进免疫应答的方法，其中受试者是温血动物。
本发明提供一种抗原复合物合成物，其包含：A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序；第一肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的N-端；第二肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的C-端；抗原，共价接合至所述第一肽或所述第二肽，其中：A1、A2、A3及A4是每个个别地选自由精氨酸(R)及赖氨酸(K)所组成的群组；B1是选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；B2是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、及色氨酸(W)所组成的群组；B3是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；B4是选自由苯基丙氨酸(F)、色氨酸(W)及酪氨酸(Y)所组成的群组；以及B5是选自由苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)及丝氨酸(S)组成的群组；且所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序、所述第一肽以及所述第二肽形成两亲性螺旋二级结构。
在另一个实施例中，本发明提供所述抗原复合物合成物，其中所述第一肽可范围涵盖从0至20个氨基酸，且所述第二肽可范围涵盖从0至20个氨基酸。
在另一个实施例中，本发明提供所述抗原复合物合成物，其中所述抗原是选自由低聚糖、多肽、蛋白质、多聚糖、肽以及其组合所组成的群组。
本发明提供一种增进抗原递送的方法，其包含：给予抗原复合物 合成物予受试者，其中所述抗原复合物合成物包含：A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序；第一肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的N-端；第二肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的C-端；抗原，共价接合至所述第一肽或所述第二肽，其中：A1、A2、A3及A4是每个个别地选自由精氨酸(R)及赖氨酸(K)所组成的群组；B1是选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；B2是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、及色氨酸(W)所组成的群组；B3是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；B4是选自由苯基丙氨酸(F)、色氨酸(W)及酪氨酸(Y)所组成的群组；以及B5是选自由苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)及丝氨酸(S)组成的群组；且所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序、所述第一肽以及所述第二肽形成两亲性螺旋二级结构。
在一实施例中，本发明提供增进抗原递送的方法，其中所述第一肽可范围涵盖从0至20个氨基酸，且所述第二肽可范围涵盖从0至20个氨基酸。
在一实施例中，本发明提供增进抗原递送的方法，其中所述抗原是选自由低聚糖、多肽、蛋白质、多聚糖、肽及其组合所组成的群组。
本发明提供一种两亲性肽，其包含：SEQ ID NO:1的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:3的氨基酸序列、SEQ ID NO:4的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:6的氨基酸序列、SEQ ID NO:7的氨基酸序列、SEQ ID NO:8的氨基酸序列、SEQ ID NO:9的氨基酸序列、SEQ ID NO:10的氨基酸序列或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
有着这些与其他目的，本发明的优点及特征可在下文中变得显而易见，本发明的性质可通过参考本发明的详细描述、实施例以及参考本文的几幅附图而更清楚地被理解。
附图说明
本发明的示范性实施例将从下述详细描述以及本发明的多个实施例的附图更全面地理解，然而本发明的实施例的描述以及附图不应当被作为本发明对特定实施例的限制，而是仅用于解释和理解。
图1A显示纯化的His-GFP、AH1-GFP及AH2-GFP蛋白质的SDS-PAGE以及考马斯蓝染色(coomassie blue staining)结果。
图1B显示来自当通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定，来自被His-GFP、AH1-GFP或AH2-GFP使免疫的小鼠血清制品的抗-GFP IgG效价的结果。使用His-GFP、AH1-GFP或AH2-GFP融合蛋白任一的50μg蛋白质，在连同完全弗氏佐剂乳化后(第0天)或是与不完全弗氏佐剂乳化后(第14、28及42天)透过腹膜腔注射以使小鼠免疫。促升剂量7日后收集血清(第21天、35及49天)，N＝5。
图2A显示来自通过在完全弗氏佐剂中乳化的20μg的His-GFP或AH2-GFP蛋白的每个免疫小鼠的血清制品的抗-GFP IgG效价的结果。这些小鼠在第0天透过腹膜腔注射且在第7、14、21、28及35天收集血清用于酶联免疫吸附测定。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图2B显示来自通过在不完全弗氏佐剂中乳化的每个20μg的His-GFP或AH2-GFP蛋白的免疫小鼠的血清制品的抗-GFP IgG效价的结果。这些小鼠在第0天透过腹膜腔注射且在第7、14、21、28及35天收集血清用于酶联免疫吸附测定。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图2C显示来自通过与10μg的TLR5配体，鞭毛蛋白一起的每个20μg的His-GFP或AH2-GFP蛋白的使免疫小鼠的血清制品的抗-GFP IgG效价的结果。这些小鼠在第0天透过腹膜腔注射且在第7、14、21、28及35天收集血清用于酶联免疫吸附测定。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图2D显示来自谨通过20μg的His-GFP或AH2-GFP蛋白的每个免疫小鼠的血清制品的抗-GFP IgG效价的结果。这些小鼠在第0天透过 腹膜腔注射且在第7、14、21、28及35天收集血清用于酶联免疫吸附测定。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图3显示来自以每个20μg的His-GFP、AH2-GFP或AH2M3-GFP蛋白的免疫小鼠的血清制品的抗-GFP IgG效价的结果。小鼠透过肌内注射在第0天及第14天被免疫两次。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图4A显示在小鼠中血浆IL-6水平的测定结果。小鼠透过肌内注射被注以50μg的AH2-GFP、50μg的GFP、20μl的PBS、10μg的鞭毛蛋白或1μg鞭毛蛋白。注射后两小时，透过麻醉心脏穿刺取出血液制备血浆。血浆IL-6水平通过与标准曲线比较定量的双抗原夹心酶联免疫吸附测定来测定(N＝5)。
图4B显示在小鼠中血浆MCP-1水平的测定结果。小鼠透过肌内注射被注以50μg的AH2-GFP、50μg的GFP、20μl的PBS、10μg的鞭毛蛋白或1μg鞭毛蛋白。注射后两小时，透过麻醉心脏穿刺取出血液制备血浆。血浆MCP-1水平通过与标准曲线比较定量的双抗原夹心酶联免疫吸附测定来测定(N＝5)。
图4C显示两亲性螺旋肽对细胞凋亡的效应的测定结果。生长在6孔盘上的MDCK细胞，在细胞收集之前，以10μM、30μM或100μM浓度的AH2、AH2M3或Udorn肽处理24小时，并以SYTOX AADvanced死细胞染色培养且通过流式细胞仪分析。从每个实验组中3个样品计算并平均Sub-G1组分。
图5显示来自通过GFP、AH2-GFP、AH3-GFP或AH5-GFP融合蛋白免疫的小鼠血清的抗-GFP IgG效价的结果。这些小鼠在两周间通过20g的各种蛋白质的两次肌内注射使其免疫。使用第28天的抗-GFP IgG效价于比较。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图6A显示纯化的MAGE-A3、AH2-MAGE-A3、m2eX5及AH2-m2eX5的SDS-PAGE以及考马斯蓝染色的结果。
图6B显示通过加入AH2对抗-MAGE-A3及抗-m2eX5 IgG效价的 刺激作用。在第0天及第14天，将20μg的MAGE-A3、20μg的AH2-MAGE-A3、8μg的m2eX5或8μg的AH2-m2eX5融合蛋白通过肌内注射免使小鼠免疫。在第28天收集血清以测量针对MAGE-A3或m2eX5蛋白的IgG效价。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图7A显示抗-GFP IgG效价的折线图。分别在第0天及第14天，将20μg的每个His-GFP、AH2-GFP、NSP1-GFP、GRK5-GFP、HAfp23-GFP以及AH1-GFP分别通过肌内注射使小鼠免疫。在第0、14及28天所收集的血清用于酶联免疫吸附测定以侦测抗-GFP IgG效价。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图7B显示在初次免疫之后第28天的抗-GFP IgG效价的条形图。在第0天及第14天，将20μg的每个His-GFP、AH2-GFP、NSP1-GFP、GRK5-GFP以及HAfp23-GFP通过肌内注射使小鼠免疫。第28天血清的抗-GFP IgG效价被用于比较。几何均数效价以Log4显示(N＝5)。
图8A显示与AH2肽融合的GFP蛋白质的细胞结合及内在化的结果。纯化的His-GFP、AH1-GFP及AH2-GFP融合蛋白以200μg/ml的浓度与培养的MDCK细胞一起培养于96-孔盘4小时，之后以200μl的PBS洗涤两次。附接至细胞的GFP融合蛋白数量接着通过荧光计来测定。来自4个分开的孔的荧光水平被用于定量以及统计分析。
图8B显示通过荧光显微镜的GFP融合蛋白的侦测的结果。与GFP融合蛋白一同培养4小时的细胞被洗涤且被使用于在荧光显微镜下侦测GFP融合蛋白。从GFP途径获得的图像与DIC影像在相同的视野合并以显示GFP信号的位置。
图8C显示使用共聚焦显微镜的内在化的GFP融合蛋白的侦测结果。200μg/ml浓度的AH2-GFP蛋白与培养的MDCK细胞一同培养4小时。AH2-GFP融合蛋白包括在细胞的定位接着使用共聚焦显微镜来侦测。
图8D显示使用透射电子显微镜的内在化的AH2肽的鉴定结果。与 AH2肽共轭的10nm尺寸的纳米金颗粒与10μM的AH2肽混合且与培养的MDCK细胞一同培养4小时，之后经固定且处理用于在透射电子显微镜下观察。通过AH2肽形成的囊泡以"V"标记。比例尺为0.5μm。
图8E显示通过透射电子显微镜的AH2肽/脂质复合物的鉴定结果。在透射电子显微镜下，在通过AH2肽形成的囊泡里有个网格状的结构，如箭头所指。比例尺为0.5μm。
图8F显示箭头指向通过AH2肽、与纳米金颗粒共轭的AH2肽以及膜形成的网格状结构被分泌至胞外。比例尺为0.5μm。
图8G显示箭头指向通过AH2肽、与纳米金颗粒共轭的AH2肽以及膜所形成的网格状结构被围封进多泡体(multiple vesicle body，MVB)结构中，成为胞内体系统的部份。比例尺为0.5μm。
图9A显示以FITC示踪的合成的两亲性肽的细胞结合及内在化的结果。合成相应于来自不同A型流感病毒株的M2蛋白的两亲性肽的肽，且所述肽与培养的MDCK细胞一同培养4小时，之后洗涤并在荧光计中侦测。SEQ ID NO:4，来自H1N1。SEQ ID NO:5，来自H5N1。AH4，DRLFFKCVYRLFKHGLKRG，来自H3N2。SEQ ID NO:6是来自H7N9。每个数据是从4重复样品定量(N＝4)。
图9B显示GFP融合蛋白的细胞结合测定的结果。从来自塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)的Nsp1蛋白的第245-264个氨基酸残基衍生的两亲性肽，Nsp1；从G-蛋白偶联受体激酶5的第546-565个氨基酸残基衍生的两亲性肽，Grk5；血细胞凝集素的融合发夹肽衍生的两亲性肽，HAfp23，使用DNA重组工艺在pET28a载体中与GFP融合。GFP融合蛋白被基因表达且纯化并且用以与培养的MDCK细胞一同培养4小时，之后洗涤并在荧光计中侦测。每个数据是从4重复样品定量(N＝4)。
图10A显示可提供细胞结合与内在化活性的肽序列的排比。来自Grk5、AH2、AH3、AH5、SWS-AH、TYLCV-AH、ANMV-AH、以 及AHV-AH的肽序列已经被对齐以显示RLFK/RLFFK基序。
图10B显示被用以细胞结合与内在化测定的相应的AH2、ANMV-AH、TYLCV-AH、SWS-AH以及AHV-AH序列的合成肽的传输结果。所有的肽以FITC荧光基团标记N-端。MDCK细胞以10μM的每个测试肽一同培养4小时，之后以PBS洗涤两次并通过荧光计侦测荧光。背景荧光使用PBS阴性对照减去。
图11A显示负载GFP融合蛋白的细胞的荧光水平的衰败。MDCK细胞以AH2-GFP、GRK5-GFP或SWS-GFP融合蛋白培养4小时，之后洗涤并以0.4U的凝血酶溶解20分钟。经凝血酶处理之后，细胞以PBS洗涤且通过荧光计侦测(4小时)或继续培养另外24小时，之后在洗涤并侦测(4+24小时)(N＝4)。
图11B显示在培养基中分泌GFP融合蛋白的侦测。将从4+24小时组别细胞培养移除的培养基用于在荧光计中测量荧光水平。来自类比的PBS控制组的培养基用于测定背景荧光。将每组的背景荧光扣除。
图12A显示抗-GFP IgG效价的测定。8周大的BALB/c小鼠在第0天及第14天肌内注射每个20μg的His-GFP、AH2-GFP或AH1-GFP以使免疫。在初次免疫作用后第28天收集血清以测定整体抗-GFP IgG的效价(N＝5)。
图12B显示抗-GFP IgG亚型的效价。8周大的BALB/c小鼠在第0天及第14天肌内注射每个20μg的His-GFP、AH2-GFP或AH1-GFP以使免疫。在初次免疫作用后第28天收集血清以测定IgG亚型对GFP的效价。与山羊抗小鼠IgG1、山羊抗小鼠IgG2a、山羊抗小鼠IgG2b及山羊抗小鼠IgG3的第二抗体共轭的HRP被使用在酶联免疫吸附测定中。
图12C显示通过SWS-GFP融合蛋白诱导的抗-GFP IgG亚型效价的测定。BALB/c小鼠在大腿通过肌内注射20μg的His-GFP或SWS-GFP来使免疫。在免疫作用后第14天收集血清以通过酶联免疫吸附测定测定抗-GFP IgG或IgG亚型。结果以Log4显示(N＝5)。
具体实施方式
在通过使用有着两亲性肽结构的抗原复合物增进免疫应答的方法的内文中，在这里描述本发明的示范性实施例。
那些本领域技术人员将理解的是遵照示范性实施例的详细描述仅仅是说明性的且非意图以任何方式限制。其他实施例将使它们让本领域技术人员可立即想到本发明公开的效益。如附图图式所说明的，可参考示范性实施例的详细实施方式。在通篇图式中将使用相同的附图标记且下列详细的描述将参考相同或相似的部份。
如本文所使用的，冠词"一"指称冠词的受词对象的一个或多个(即，至少一个)。作为示范，"一元件"意思为一个元件或多余一个元件。
术语"受试者"可指具有免疫应答的脊椎动物或是被认为需要免疫应答的脊椎动物。受试者包括所有温血动物，诸如哺乳类，像是灵长类。术语受试者包括驯养动物，诸如猫、狗等，家畜(举例来说，牛、马、猪、绵羊、山羊等)以及实验动物(举例来说，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。如此，兽医用途和医药制剂是本文所预期的。
如本文所使用的，"抗原复合物"指由各种两亲性肽以及与宿主生物相容的外源性分子，像是绿色荧光蛋白(GFP)，所组成的重组蛋白质。外源性分子可选自由，举例来说，但不限于，低聚糖、多肽、蛋白质、多聚糖、肽及其组合所组成的群组。
本发明使用的术语"两亲性螺旋结构"、"两亲性肽"、"两亲性分子"、或"两亲性螺旋体"表明分子，特别是含有氨基酸的肽，形成α螺旋并拥有疏水元素与亲水元素两者。两亲性肽包含从，举例来说但不限于，病毒的基因组、来自蛋白偶联受体激酶的短片段以及融合肽域所获得的氨基酸序列。
在相关的实施例中，两亲性肽包含，举例来说，病毒的基因组、来自蛋白偶联受体激酶的短片段以及融合肽域。示范性实施例肽列表 于表1。
表1，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11
材料与方法
首先，使用克隆技术以获得融合蛋白。接着，蛋白纯化之后，使用多粘菌素树酯(polymyxin resin)移除内毒素以获得有内毒素水平小于5EU/mg的蛋白制品。注射这些纯化的蛋白质进入小鼠以诱导免疫。进而，在蛋白质注射后第7、14、21、28及35天，分离小鼠血清用于通过酶联免疫吸附测定做抗体效价测定。以下描述每个步骤的详细流程。
不含内毒素蛋白的表达与纯化
蛋白表达
pET28a载体编码靶蛋白使用热休克转化进入BL21(DE3)细胞。热休克转型作用的流程如下。
第一天3:00pm，1ng的质粒与50μl的解冻感受态细胞，BL21(DE3)混合，且静置冰上10分钟，之后以42℃热休克处理40秒。热休克之后，混合物置于冰上1分钟，随后加入1ml的LB并接着在220rpm中37℃下振动1小时。接着将细菌在13000rpm旋转减慢1分钟。细菌沉淀物在100μl的LB中被重新回溶且涂在有着100μg/ml的氨青霉素的LB平皿上并在37℃培养。
第二天，10:00am，在平皿上应该有少于100个菌落。挑选一个菌落并接种3ml的LB/氨青霉素培养基并在37℃/225rpm下培养。到12:00am，将3ml的培养物转移到500ml的LB/氨青霉素培养基且通过分光光度计监控培养物的生长。当光密度OD600到达0.5-0.7，添加1mM的IPTG至所述培养物以诱导蛋白表达。蛋白表达之后3小时收成培养物。细菌通过5000rpm离心10分钟来旋转浓缩。移除上清液且保留沉淀物用于后续流程。
蛋白纯化
用于蛋白纯化及凝胶过滤(gel filtration，GF)的缓冲液：20mM的NaPO4，pH 7.4、300mM的NaCl(GF缓冲液)。至于Ni-NTA树酯纯化： 用于细菌溶菌的5mM的咪唑于GF中(裂解缓冲液)、用于洗涤的10mM咪唑于GF中(洗涤液)、用于蛋白质洗脱的200mM的咪唑于GF中(洗脱缓冲液)。从500ml的LB培养物的细菌沉淀物通过漩涡振荡器被重新回溶在40ml的裂解缓冲液中，接着使用超声的超声发生器(Misonix 3000)以启动10秒/关闭5秒循环5分钟溶解细菌沉淀物。在超声处理的过程中将重新回溶的细菌保持于冰水中。通过使用Sorval SS34转子于4℃以10000rpm离心10分钟将不溶的残渣移除。将含有靶蛋白的上清液通过含有来自德国凯杰(Qiagen)的2ml的Ni-NTA树酯的聚丙烯柱。当靶蛋白结合至Ni-NTA树酯之后，以洗涤液的10倍的床体积(20ml)洗涤所述聚丙烯柱。洗涤之后，使用5ml的洗脱缓冲液洗脱靶蛋白。使用Ni-NTA树酯纯化的靶蛋白进一步在蛋白纯化仪(AKTA prime)上使用来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)的的凝胶过滤柱(HiLoad 16/600 Superdex 200pg)。
凝胶过滤
设定这些程序用于研究蛋白质的纯化。程序30：针对靶蛋白的凝胶过滤纯化。程序33：使用120ml的0.5M NaOH对HiLoad 16/600superdex 200pg现场清洁。流速是0.8ml/分钟。程序34：现场清洁之后使用150ml的GF缓冲液用于平衡管柱。每两次蛋白质纯化后洗涤管柱。5ml的样品环连接至机器，AKTA prime，用于控制蛋白样品。样品环首先使用25ml的GF缓冲液冲洗以移除在先前纯化过程中残留的蛋白质。在填充靶蛋白进入样品环之前，加入额外的0.5ml的GF缓冲液进入Ni-NTA纯化蛋白质中。放置蛋白质溶液于5ml的注射器中并装填进样品环中。在经洗脱的靶蛋白的相应部份中的玻璃管在每次纯化之前以新管取代。在凝胶过滤实验中使用的所有缓冲液通过0.2μm的滤膜单元过滤以灭菌和去除杂质。这些缓冲液进一步以真空脱气10分钟。当UV280所监控的含有靶蛋白的快速液相层析部份被收集并被汇集在一起。汇集的蛋白质溶液通过2nd Ni-NTA的管柱以与第一个相 同的床体积浓缩。在蛋白从第二个Ni-NTA管柱洗脱之后，蛋白质浓度以BCA方法来测定。有着最高的蛋白质浓度的两个部份被汇集并对1L的PBS透析隔夜。在透析之后，使用来自G-生物科学公司(G-Bioscience)的EndotoxinOUTTM树酯移除内毒素污染物。聚丙烯柱在装载1.5ml靶蛋白之前，先以4ml的EndotoxinOUTTM树酯填充并以1％的脱氧胆酸钠的5倍床体积于LAL试剂水(LAL Reagent Water，LRW)中、LRW的5倍床体积及PBS/LRW的5倍床体积洗涤。在靶蛋白完全装填之后，置放管柱于冷房中1小时，使内毒素被树酯完全吸收。蛋白质使用逐步添加0.5ml的第一部份以及1ml的PBS的随后部份来洗脱。蛋白质在第三至第六部份中洗脱。
鲎变形细胞溶解物(limulus amoebocyte lysate，LAL)测定
使用美国ACC公司(Associate of Cape Cod,Inc.)提供的PYROTELL-T LAL测定内毒素水平。在冻干粉中供应的每个LAL试剂首先先溶于5ml的LRW中，且接着等分至小体积并存在-80℃。使用PYROTELL-T的典型浊度测定中，供应包括内毒素标准品的100μl的样品于微孔板中。使用反应动力学使用荧光VICTOR3荧光读取器于光密度OD405，且于37℃时测量。在每个读取之间的延时为70秒且读取重复60次。样品和空白品之间在光密度OD405中，以达成0.1的差异的反应所需的时间被记录且与内毒素标准品比较以测定在样品中的内毒素单位。内毒素活性的log对时间(秒)标示出位置以达成在OD405中的0.1的差异；使用对数趋势线作为标准曲线。在蛋白样品中的经鉴定内毒素活性进而与蛋白浓度结合，如通过BCA测定，以测定特定的内毒素活性(单位为EU/mg)。在所有样品中的特定内毒素活性的上限是5EU/mg。
不含佐剂的小鼠的免疫作用
在免疫作用程序中使用的小鼠均在6至8周龄之间。小鼠在没有麻醉的情况下通过剪去2-3mm的尾巴采血。对尾巴间歇按摩并使用自动 移液器收集血液。每次采血收集大约100μl的血液。血液留置室温下2小时，接着在微型离心机中以2000rpm离心10分钟，在微型管中收集血清。在微型离心机中使用2000rpm 10分钟移除剩余的红血球细胞。在酶联免疫吸附测定中使用以前将血清存放在-80℃中。通过加热的焊铁并且以拇指与食指加压尾巴使小鼠尾巴止血。至于初次免疫作用，在大腿或后肢注射20μg的纯化蛋白质。免疫后第14天，从尾巴采血，且与纯化蛋白相同的促升剂量以相同的方式注射。
用于测定抗体效价的酶联免疫吸附测定
以涂层缓冲液洗脱GFP蛋白质并以10μg/ml的浓度的GFP涂层酶联免疫吸附测定平皿的适当的孔。以黏着性塑料覆盖平皿并在4℃培养隔夜。以300μl的洗涤液洗涤平皿三次。加入200μl的封闭缓冲液以阻断在涂层孔中的非特异性结合位点。以黏着性塑料覆盖平皿并在37℃培养1小时。以300μl的洗涤液洗涤平皿三次。以封闭缓冲液洗脱第一抗体或抗血清，并在平皿的每个孔加入100μl的洗脱的抗体。以黏着性塑料覆盖平皿并在37℃培养1小时。以300μl的洗涤液洗涤平皿三次。以封闭缓冲液洗脱与HRP共轭的第二抗体，并在平皿的每个孔中加入100μl的洗脱第二抗体。以黏着性塑料覆盖平皿并在37℃培养30分钟。以300μl的洗涤液洗涤平皿五次。以多通道吸量管将每个孔添加100μl的四甲基联苯氨(Tetramethylbenzidine，TMB)试剂。在足够的色彩显影之后，添加100μl的终止缓冲液至孔中。使用450nm读取每个孔的锡光值。当测量针对MAGE-A3以及m2eX5的抗体效价时，使用有着组氨酸标签(His-Tag)的MAGE-A3与m2eX5以10μg/ml的浓度涂层平皿。涂层缓冲液包含0.2M的pH 9.4的碳酸盐/重碳酸盐缓冲液。洗涤液包含0.05％的吐温20(Tween 20)在1X的PBS中。封闭缓冲液包含在1g的BSA在100ml的洗涤液中。终止缓冲液包含2M的硫酸。
荧光标记的肽与GFP融合蛋白内在化及再循环测定
通过首先接种4x104个MDCK细胞于96孔板的一个孔上来测定 GFP融合蛋白的内在化活性，且每个样品以一式四份来测定。第二天，在培养基中添加200μg/ml的GFP融合蛋白并培养4小时。在培养之后，移除培养基并以200μl的PBS洗涤三次。GFP融合蛋白被内在化的数量通过荧光计测定。针对荧光标记的肽，在内在化测定的肽的浓度是10μM。为了估计GFP融合蛋白再循环回到培养基的效率，细胞首先以GFP融合蛋白培养，如上所述。以PBS洗涤之后，使用100μl的PBS与0.4单位的凝血酶将GFP从接合在质膜的胞外表面上的两亲性肽切割出。凝血酶酶切作用在37℃培养相中执行20分钟。细胞以200μl的PBS再次洗涤三次，接着在新鲜的培养基中培养24小时。通过移除80μl的培养基用于荧光水平的侦测以及使用PBS控制组设定以校正背景荧光，来测定再循环回到培养基中的GFP融合蛋白。
血浆细胞因子水平测定
为了测定血液细胞因子水平，以肌内注射方式注射小鼠实验蛋白质。注射后两小时，小鼠被麻醉，之后透过以预先充填10μl的0.5M的Na2EDTA的注射器对其心脏穿刺收集血液。收集的血液在桌上离心机中以2000rpm离心20分钟。所收集的血浆等分成20μl的部份且在干冰上急速冷冻。通过双抗原夹心酶联免疫吸附测定连同购自美国eBioscience公司的标准品来测定血浆细胞因子水平。IL-6水平是使用小鼠IL-6ELISA Ready-SET-Go！(Mouse IL-6 ELISA Ready-SET-Go！)试剂组来侦测(目录号#88-7064，eBioscience公司，USA)。MCP-1是使用小鼠CCL2(MCP-1)ELISA Ready-SET-Go！(Mouse CCL2(MCP-1)ELISA Ready-SET-Go！)试剂组来侦测(目录号#88-7391，eBioscience公司，USA)。侦测程序遵照着供应商的标准流程。
通过流式细胞仪的细胞凋亡测定
MDCK细胞以3x10E5细胞/孔的密度接种在6孔板上。接种后24小时，加入10μM的浓度的肽，并在通过胰蛋白酶酶切收成细胞之前培养24小时。通过在1000rpm离心培养基5分钟收集由于细胞凋亡的 悬浮细胞。从胰蛋白酶酶切收集并且在培养基培养的细胞结合，并且1x105个细胞在-20度冷冻库中以3ml的70％乙醇固定隔夜。固定之后，细胞在1ml的PBS中洗涤并重新悬浮，且通过SYTOX AADvanced死细胞染色试剂组(SYTOX AADvanced Dead Cell Stain kit)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))，在100μg的RNaseA的存在中于4度冷室中染色30分钟，之后通过流式细胞仪(BD FACSCaliburTM)来分析。计算sub-G1部份且指定为凋亡细胞。
透射电子显微镜
MDCK细胞被种在6孔板中的ACLAR埋植膜(ACLAR Embedding film)上，以每孔3x105个细胞的密度种植。在隔夜培养之后，培养基的部份移除留下0.5ml的培养基，之后加入AH2肽至10μM，以及与AH2肽共轭的50μl的10nm的纳米金颗粒。使用的10nm的纳米金颗粒共轭的AH2的浓度是4.78x1012/ml。在4小时的培养之后，在无血清培养基中于室温下洗涤细胞，之后在2.5％的戊二醛/0.1％的单宁酸/0.1M的二甲胂酸缓冲液，pH 7.2在室温固定30分钟。接着细胞在室温下，于0.1M的二甲胂酸缓冲液(pH 7.2)/0.2M的蔗糖/0.1％的CaCl2中洗涤5分钟。之后，细胞在1％的OsO4/0.1M的二甲胂酸缓冲液(pH 7.2)于室温下后固定30分钟。细胞在室温下以ddH2O洗涤三次，每次5分钟。细胞进而在室温下以1％的醋酸铀酰染色30分钟，之后以ddH2O洗涤三次。细胞接着脱水并通过在60度被聚合24小时而包埋在EPON。接着将包埋的细胞切片以在透射电子显微镜下观察。
实例1
两亲性螺旋肽刺激对融合蛋白的体液免疫。为了估算在刺激体液免疫中两亲性肽对其融合抗原的效应，来自HCV NS3(AH1)及A型流感病毒株H1N1 M2蛋白质(AH2)的两亲性肽根据他们的融合蛋白的高溶解度而被挑选。合成寡核苷酸并使用在PCR反应中以产生这两条肽的编码序列，并转殖进含有绿色荧光蛋白(GFP)的pET28a载体里。 两亲性肽和GFP融合蛋白是使用细菌表达系统来表达并且使用Ni-NTA琼脂糖来纯化。从Ni-NTA树酯洗脱的蛋白质进而在HiLoad 16/600 superdex 200管柱中使用凝胶过滤纯化。来自凝胶过滤管柱洗脱的蛋白质通过Amicon Ultra 15以10K的切割分子量来浓缩。使用来自G-生物科学公司(G-Bioscience)的EndotoxinOUTTM树酯移除在蛋白质制品中的内毒素污染物。
在标准完全-不完全弗氏佐剂范例中，首先测试在佐剂反应中两亲性肽对刺激抗体生产的能力。在初次免疫，浓度1mg/ml的蛋白质与完全弗氏佐剂以1:1体积比混合直到乳化。腹膜注射50μg的蛋白质到每只C57BL/6小鼠，每种蛋白质注射5只小鼠。在第14、28及42天透过相同途径，连同以1：1体积比与不完全弗氏佐剂混合的蛋白质，与促升剂量一并给予。结果显示于图1B，其中AH1-GFP与AH2-GFP两者相较单独GFP都促进更多抗-GFP的抗体。
实例2
来自流感病毒H1N1M2蛋白的AH2肽诱导佐剂独立的抗体产生增强。先表达AH2-GFP并纯化以含有小于5EU/mg的内毒素水平。纯化的AH2-GFP蛋白可与a)完全弗氏佐剂，b)不完全弗氏佐剂，c)鞭毛蛋白或d)PBS组合以免疫小鼠。控制组蛋白质是表达并纯化以含有小于5EU/mg的内毒素水平的His-GFP。以乳化或是混合物形式的50μg的蛋白质，每组注射5只小鼠，且使用GFP蛋白涂层透过酶联免疫吸附测定来监控抗-GFP抗体水平。使用在注射后第0、7、14、21、28、35天所收集的血清。结果显示，针对以完全弗氏佐剂乳化的蛋白质，在AH2-GFP及His-GFP之间的抗-GFP IgG水平并没有显著差异(图2A)。针对以不完全弗氏佐剂乳化的蛋白质，在第7天，相较于His-GFP，诱导的AH2-GFP明显有较高的抗-GFP IgG水平。此在抗-GFP IgG产量上的差异持续到第35天(图2B)。针对与10μg的鞭毛蛋白混合的蛋白质，抗-GFP IgG水平在注射后第14天开始展现显著的差 异，且持续直到注射后的第35天(图2C)。当AH2-GFP及His-GFP与PBS一起注射时，抗-GFP IgG生产在注射后第14天开始展现显著的不同，且持续到第35天(图2D)。这些结果显示仅添加AH2肽序列足以诱导对抗原(GFP)的抗体有更高的产量。
实例3
在小鼠中增强抗-GFP IgG的产生需要AH2肽的疏水残基。为了测试AH2肽在抗-GFP IgG效价的增强的效应，以点突变将三个疏水的氨基酸：4F、8I、以及12F置换成丙氨酸(AH2M3)。完整的AH2M3的序列如下：DRLASKSAYRIAKHGLKRG。表达并纯化AH2M3-GFP产物蛋白，使用AH2M3-GFP产物蛋白以免疫小鼠。使用AH2-GFP作为正控制组。结果显示，以丙氨酸对3个疏水性氨基酸的置换，显著地降低了融合蛋白对促进抗-GFP IgG生产的能力(图3)。因此两亲性肽的完整性对于AH2-GFP融合蛋白刺激体液免疫是重要的。此外，被AH2融合蛋白刺激的抗体效价在初次免疫之后至少维持5个月，这暗示被融合AH2肽活化的体液免疫是持久的。
实例4
AH2-GFP融合蛋白刺激与激活先天免疫独立的体液免疫。为了测试AH2肽是否首先通过激活先天免疫应答来诱导体液免疫应答，使用酶联免疫吸附测定测定在AH2-GFP融合蛋白的肌内注射之后两小时的外周血炎性细胞因子水平。有着小于5EU/mg内毒素水平的His-GFP和AH2-GFP蛋白制品被肌内注射进5只小鼠，每只小鼠注以50μg的量。已知以诱导先天免疫应答的TLR5配体鞭毛蛋白作为正控制组，每只小鼠为10μg，或1μg/小鼠的剂量。在合适的麻醉条件下，透过心脏穿刺收集肌内注射后2小时的血液。用于血液收集的注射器以10μl的0.5M的EDTA预先充填避免血液凝固。收集的血液以2000rpm离心20分钟，在微量离心管钟微量离心以制备血浆。收集的血浆等分至20μl/管以及置放在干冰顶部以储存。在室温下解冻的血浆稀释 12倍，且每个血浆样品放置两份，根据制造商的指示通过酶联免疫吸附测定以测定IL-6或MCP-1细胞因子水平。从eBioscience购得的酶联免疫吸附测定试剂组，小鼠IL-6Ready-SET-Go！试剂组(目录号：88-7064-86)以及小鼠CCL2(MCP-1)Ready-SET-Go！试剂组(目录号：88-7391-86)。结果显示，鞭毛蛋白注射诱导高水平的IL-6和MCP-1两者，分别是当注射10μg的鞭毛蛋白时是1200pg/ml的水平和3000pg/ml的水平，或是当注射1μg的鞭毛蛋白时是380pg/ml及2600pg/ml。对于PBS、His-GFP或AH2-GFP注射，IL-6和MCP-1的表达较低，显示AH2-GFP蛋白不诱导先天免疫应答。
从特定的A型流感病毒株H1N1衍生的M2两亲性肽、已经显示的是乌隆(Udorn)透过质膜穿孔诱导细胞凋亡，且造成质膜完整性的缺失。为了测试是否AH2肽也可诱导细胞凋亡，三个不同浓度的AH2肽：10μM、30μM以及100μM与MDCK细胞一同培养24小时，之后收成细胞并以染色体DNA染色以侦测细胞凋亡。细胞凋亡水平是使用流式细胞仪来测定，在乙醇固定24小时并以核糖核酸酶A处理之后，接着以SYTOX AADvanced死细胞染色1分钟，随后在流式细胞仪(BD FACSCaliburTM)中执行。计算并表示有着sub-G1信号的细胞的百分比。结果显示，通过添加乌隆肽的MDCK细胞凋亡的诱导作用如文献所描述的。被不论是AH2或AH2M3诱导的细胞凋亡的水平，相似于PBS控制组的水平，这表示被AH2或AH2M3诱导的细胞凋亡是与背景水平一致的。
实例5
通过来自A型流感病毒株H5N1和H7N9的M2蛋白的两亲性肽诱导的体液免疫应答。从A型流感病毒株H5N1及H7N9衍生的M2两亲性螺旋肽序列在pET28a载体中使用DNA重组与GFP融合。通过热休克将AH3-GFP及AH5-GFP融合蛋白表达载体转殖进BL21(DE3)，挑选生长在LB/卡那霉素(50μg/ml)平皿上的菌落并在用于接种在3ml的LB培养 基中并隔夜培养。经隔夜的细菌培养基进而用于500ml的培养基的接种，并在同时以225rpm振动，在15℃培养直到光密度OD600达到0.5。加入1mM的IPTG之后，细胞培养基继续在相同的条件下培养隔夜使融合蛋白诱发。诱发之后，收成细胞并在裂解缓冲液中回溶用于超声处理以将细菌打破。在超声处理之后，细菌的溶菌液使用购自Sorvall的SS34 rotor以10000rpm离心10分钟。离心之后收集上清液。使用Ni-NTA树酯进行可溶性蛋白质的纯化，并使用BCA方法测定经纯化蛋白质的整体量。通过EndoFree树酯来移除内毒素污染物。在小鼠大腿的肌内注射以1mg/ml的浓度的20μg的纯化AH3-GFP及AH5-GFP。通过剪去小鼠尾巴的顶端而从尾巴静脉收集血液。收集的血液留在桌上几个小时以凝血。接着将血液在2000rpm离心15分钟并收集血清。通过使用使用GFP蛋白以10μg/ml的浓度涂层的酶联免疫吸附测定来测定血液中的抗-GFP IgG效价。结果显示，AH3或AH5肽与GFP蛋白质协力地添加能够增进抗-GFP IgG效价的上升，甚至比AH2肽更为显著(图5)。此暗示了AH3与AH5具有比AH2要高的诱导体液免疫应答的活性，且可能对于用在诱导保护性的免疫应答所需的疫苗的整体剂量的减少是有用处的。总的而言，当这些从三个不同A型流感病毒株衍生的两亲性螺旋肽与蛋白抗原融合时，皆刺激体液免疫应答。
实例6
通过与AH2肽融合的MAGE-A3与m2eX5蛋白的体液免疫的诱导。已经显示出，当与GFP融合时，来自A型流感疫苗株的AH2肽诱导出高的抗-GFP IgG效价。为了估计AH2在刺激体液免疫中针对各种抗原的功效，AH2肽透过DNA重组技术与MAGE-A3或m2eX5任一蛋白融合。表达并纯化AH2-MAGE-A3与AH2-m2eX5蛋白，以及他们个别的控制组蛋白。透过肌内注射将经纯化的蛋白用以免疫C57BL/6小鼠。透过使用酶联免疫吸附测定对抗-MAGE-A3或抗-m2eX5 IgG的效 价的侦测来监控体液免疫应答。结果显示，在MAGE-A3或m2eX5AH2蛋白质对AH2肽的添加，当相比于无AH2肽融合的蛋白时，两者在相应的IgG效价分别增加了50被和7倍。结果显示AH2肽以及其相关的两亲性螺旋肽是适合做为免疫平台以诱导针对致病抗原的体液免疫的高水平。
实例7
来自GRK5、HA以及NSP-1的两亲性螺旋肽也刺激对融合蛋白的体液免疫。为了估算是否除了A型流感病毒的M2蛋白以外的两亲性螺旋也享有相似的对融合蛋白诱导体液免疫应答中的相似活性，发明人浏览文献以鉴定当与荧光蛋白，GFP融合时与膜互相作用的已知肽序列。鉴定出三条肽序列：从塞姆利基森林病毒的Nsp1蛋白的第245-264个氨基酸残基衍生的两亲性螺旋肽，Nsp1；来自G-蛋白偶联受体激酶5的第546-565个氨基酸序列Grk5；血细胞凝集素的融合发夹肽，HAfp23。这些肽序列使用DNA重组技术与GFP融合，并且所述融合蛋白以如上述的方式表达和纯化。使用His-GFP、AH2-GFP、NSP1-GFP、GRK5-GFP及HAfp23-GFP融合蛋白以免疫小鼠。在小鼠免疫作用期间，每只小鼠在第0天和第14天以肌内注射20μg的纯化融合蛋白，且在每次注射后第14天收集血清。
来自NSP1、GRK5、以及HA蛋白的两亲性螺旋肽的融合，所有皆潜在地增进了对模范蛋白(GFP)的体液免疫应答(图7A、7B)。这些结果显示具备两亲性螺旋特性的短肽的简单附着可显著地增加抗原在诱导体液免疫的能力。
实例8
AH2能够诱导融合蛋白进入细胞作为膜结构的聚合作用和内在化作用。琼脂糖使用Ni-NTA琼脂糖树酯表达并纯化AH1-GFP、AH2-GFP以及His-GFP蛋白，并接着通过凝胶过滤并通过Ni-NTA琼脂糖树酯来浓缩。为了测试这些融合蛋白在结合培养的细胞的细胞膜的 能力，浓度为200μg/ml的融合蛋白被用于与MDCK细胞一同培养。在4小时的培养之后，使用PBD缓冲液洗去未结合的GFP融合蛋白。通过荧光计侦测结合的GFP融合蛋白。细胞仅与PBS培养作为背景荧光的校准。结果显示，细胞膜与AH2-GFP结合但不与AH1-GFP或His-GFP(图8A)。为了观察与培养的细胞结合的GFP融合蛋白，在培养的CLI-5/pENO1细胞中加入100μg/ml的蛋白并培养4小时。在培养结束后，以PBS洗涤细胞两次并接着使用在荧光显微镜下观察。针对与AH2-GFP培养的细胞，培养之后4小时观察细胞上的荧光。当使用His-GFP培养时，在细胞表面上没有观察到荧光亮点(图8B)。在与AH2-GFP培养之后4小时，有超过50％的细胞含有荧光亮点。这些结果显示，当AH2-GFP融合蛋白以可溶性蛋白提供于培养基内，其可聚合在细胞表面上。为了进而鉴定这些荧光亮点在细胞内的定位，而使用共聚焦显微镜。当在共聚焦显微镜下观察时，这些荧光亮点似乎呈现胞内囊泡的形状并主要为在细胞内而非质膜上(图8C)。这些结果显示，AH2-GFP融合蛋白能够内在化进入细胞的细胞质中并且形成囊泡状的结构。为了追踪这些形成在培养的细胞内的囊泡，发明人培养与细胞一起培养相应于AH2的两亲性螺旋序列，连同与AH2肽共轭的纳米金颗粒，通过添加AH2肽来追踪形成的囊泡。诱导囊泡成型的AH2肽的添加，在细胞内以V标记(图8D)。在这些囊泡中有些网格状结构，而纳米金颗粒沿着这些结构装饰，如箭头所指示，暗示著这些网格状结构可能是由磷脂和AH2肽所构成(图8E)。一些纳米金颗粒所装饰的网格状结构可在多泡体(multiple vesicle body，MVB)状的结构的中发现，暗示这些结构可被并入胞内体途径(图8G)。这些网格状结构也可在细胞外空间发现，一个指标是含有这些结构的囊泡可能与质膜融合且造成这些结构被分泌到培养基中(图8F)。
实例9
来自三个不同类型的A型流感病毒株以及G-蛋白偶联受体激酶5 的两亲性螺旋肽也介导膜出芽以及内在化。来自A型流感病毒的两亲性螺旋肽已经显示出对于病毒颗粒的ESCRT-独立出芽是重要的。同样在体外也显示，当从M2蛋白合成的两亲性螺旋肽与含有胆固醇的膜囊泡混合时，两亲性螺旋肽也介导出芽(罗斯曼·JS，2010)。为了测试来自病毒株(除了H1N1)的M2两亲性螺旋肽是否也享有相似的与培养细胞结合的特性，发明人合成从H5N1、H3N2及H7N9衍生的三个M2两亲性螺旋肽，并分别命名为AH3、AH4及AH5。用以比较，虽然这三条肽与细胞膜结合力不及AH2，但他们均以不同的水平结合并内在化至细胞中(图9A)。这结果建议这些衍生自不同的A型流感病毒株的M2蛋白质的胞质两亲性螺旋肽的肽均与培养细胞结合。一个指标是在所有A型流感病毒M2蛋白的同源区域共享诱导融合蛋白内在化的相似特性。为了鉴定其他也享有与细胞结合甚至内在化进入细胞的相似特性的两亲性螺旋肽，发明人使用文献搜索以鉴定当与GFP报告基因融合时已经显示与膜互相作用的两亲性螺旋肽。透过此方式，发明人鉴定符合标准的三个两亲性螺旋肽，HAfp23、Grk5及Nsp1。HAfp23是从血细胞凝集素融合域衍生，已知诱导膜弯曲的两亲性螺旋发夹蛋白。Grk5肽是从G蛋白偶联受体激酶5(Grk5)的第546-565个氨基酸残基衍生而来，其显示可形成两亲性螺旋且足以用于Grk5蛋白对细胞膜的靶向。Nsp1是从塞姆利基森林病毒复制酶蛋白nsP1的第245-264个氨基酸残基衍生，也已知的是可形成两亲性螺旋且是nsP1的膜定位所需。使用遗传重组，发明人在pET28a载体中于GFP编码序列之前重组这三肽的编码序列。发明人表达并纯化这三个GFP融合蛋白并在细胞结合测定中使用它们以测试其与培养细胞结合的能力。结果显示在这三个融合蛋白中，只有Grk5-GFP可与培养细胞结合，其结合活性大约为AH2-GFP的活性的30％。HAfp23-GFP及Nsp1-GFP在此测定中无法与培养细胞结合(图9B)。
实例10
将AH2、AH3、AH5及Grk5的两亲性螺旋肽序列比对，发明人鉴定出有著R-L/I/R-F-K的共有序列的功能基序。另外在AH2、AH3及AH5的第2-6个氨基酸中还有另一个相似的基序：R-L-F-S/F-K。为了测试这基序在两亲性螺旋肽对于结合及内在化进入细胞而言是重要与否，使用此基序的可能组合以搜寻病毒蛋白资料库。含有此基序的经鉴定的蛋白质进而通过二级结构预测程序来估计。只有在螺旋结构中包含此基序的那些蛋白质被挑选。四个肽序列包含这些RLFK或RLFFK基序是ANMV-AH、SWS-AH、TYLCV-AH及AHV-AH。合成有著相应序列的肽并以FITC标记。这些肽被使用于测试这些基序的存在是否足以用于细胞结合和内在化。在相同肽浓度的存在下，AHV-AH、SWS-AH、ANMV-AH、TYLCV-AH肽分别以40％、24％、15％以及25％的活性(与AH2肽相比)结合至细胞(图10B)。这结果显示在两亲性螺旋结构中的RLFK/RLFFK基序的存在是足以使两亲性螺旋结构肽以及其融合蛋白结合至膜并内在化。
实例11
含有RLFFK/RLFK基序的肽融合的蛋白于内在化之后回到培养基。从电子显微镜的结果，其指出诱导膜囊泡的AH2肽可与质膜融合并造成脂质-蛋白质复合物的释放。为了测试这个可能性，与AH2、GRK5或SWS两亲性肽融合的GFP与培养的MDCK细胞一同培养4小时，并以PBS洗涤，随后以凝血酶酶切以移除来自胞外融合蛋白的GFP。酶切之后，洗涤细胞并使其在生长培养基中培养额外24小时。通过荧光计测量从细胞释放的GFP融合蛋白的荧光水平。结果显示，在24小时培养之后，仍有40％、45％及30％的融合蛋白保留在细胞内(图11A)。且从细胞释放的融合蛋白可在培养基中鉴定(图11B)。
实例12
AH2肽介导的的免疫刺激偏于2型辅助T细胞应答。同样为了估计是否通过含有RLFFK/RLFK基序的肽所刺激的免疫应答有1型辅助T 细胞(Th1)或2型辅助T细胞(Th2)，免疫作用之后的抗-GFP IgG的效价或IgG亚类的效价通过酶联免疫吸附测定来测定。不含有RLFFK/RLFK基序的AH1作为对照组。纯化His-GFP、AH1-GFP以及AH2-GFP融合蛋白并在第0天和第14天将其肌内注射进入BALB/c品系的小鼠中，以诱导免疫应答。在第28天收集的血清用于酶联免疫吸附测定分析，其使用山羊抗-小鼠总IgG(图12A)或抗-IgG1、抗-IgG2a、抗-IgG2b以及抗-IgG3(图12B)。藉由比较IgG1与IgG2a加IgG3的比值，结果显示通过AH2-GFP触发的免疫应答是偏向Th2，且象征的指标是AH2肽可触发T-细胞相关的体液免疫。
为了测试当融合至抗原时，两亲性螺旋肽中RLFK的存在，是否足以刺激Th2型T细胞应答，则表达SWS-GFP且纯化用于小鼠免疫作用。在免疫作用14天之后，从经免疫的小鼠收集血清且抗-GFP IgG的效价及IgG亚类的效价通过酶联免疫吸附测定来测定。在图12C中的结果显示被SWS-GFP诱导的IgG亚类主要是IgG1，其为2型辅助T细胞应答被含有RLFK基序的SWS-AH肽的添加所活化的指标。这些结果针对在两亲性螺旋肽中的RLFK/RLFFK基序能够将抗原递送到在抗原递呈细胞的胞内体路径，并诱导T细胞相关的体液免疫。
虽然本发明的实施例已经显示并描述，但对本领域技术人员显而易见的是，基于本文的教示，变化和修饰可在不脱离本发明和较广范畴的前提下进行。因此，附录的权利要求书是旨在涵盖其所有这样的变化和修饰的范畴，如同本发明的示范性实施例的实际精神和范畴。

Claims (15)

  1. 一种增进免疫应答的方法，其特征在于，包含：
    结合两亲性肽与抗原以形成抗原复合物合成物；
    以及将所述抗原复合物合成物给予受试者。
  2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两亲性肽范围涵盖从4至45个氨基酸。
  3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述两亲性肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
  4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述两亲性肽包含含有A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的氨基酸序列，
    其中，
    A1、A2、A3及A4是每个个别地选自由精氨酸(R)及赖氨酸(K)所组成的群组；
    B1是选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；
    B2是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、及色氨酸(W)所组成的群组；
    B3是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；
    B4是选自由苯基丙氨酸(F)、色氨酸(W)及酪氨酸(Y)所组成的群组；以及
    B5是选自由苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)及丝氨酸(S)组成的群组。
  5. 如权利要求4所述之方法，其特征在于，所述两亲性肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:6的氨基酸序列、SEQ ID NO:7的氨基酸序列、SEQ ID NO:8的氨基酸序列、SEQ ID NO:9的氨基酸序列、SEQ ID NO:10 的氨基酸序列或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
  6. 如权利要求1所述之方法、其特征在于，所述抗原是选自由A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、登革病毒、人类乳突病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、埃博拉病毒、B型流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、单纯性疱疹病毒1及2型、疟原虫物种、麻疹病毒、中东呼吸综合症冠状病毒、腮腺炎病毒、百日咳博德特式杆菌、小儿麻痹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞体病毒、轮状病毒、风疹病毒、严重急性呼吸综合症冠状病毒、破伤风杆菌、结核杆菌、西尼罗河病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、脑膜炎球菌以及沙门氏杆菌所组成的群组的病原体的一部份。
  7. 如权利要求1所述之方法，其特征在于，所述抗原是选自由低聚糖、多肽、蛋白质、多聚糖、肽及其组合所组成的群组。
  8. 如权利要求1所述之方法，其特征在于，所述受试者是温血动物。
  9. 一种抗原复合物合成物，其特征在于，包含：
    A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序；
    第一肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的N-端；
    第二肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的C-端；
    抗原，共价接合至所述第一肽或所述第二肽，
    其中，
    A1、A2、A3及A4是每个个别地选自由精氨酸(R)及赖氨酸(K)所组成的群组；
    B1是选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；
    B2是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、及色氨酸(W)所组成的群组；
    B3是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；
    B4是选自由苯基丙氨酸(F)、色氨酸(W)及酪氨酸(Y)所组成的群组；以及
    B5是选自由苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)及丝氨酸(S)组成的群组；且
    所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序、所述第一肽以及所述第二肽形成两亲性螺旋二级结构。
  10. 如权利要求9所述的抗原复合物合成物，其特征在于，所述第一肽范围涵盖从0至20个氨基酸，且所述第二肽范围涵盖从0至20个氨基酸。
  11. 如权利要求9所述的抗原复合物合成物，其特征在于，所述抗原是选自由低聚糖、多肽、蛋白质、多聚糖、肽以及其组合所组成的群组。
  12. 一种增进抗原递送的方法，其特征在于，包含：
    给予抗原复合物合成物予受试者，
    其中所述抗原复合物合成物包含：
    A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序；
    第一肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的N-端；
    第二肽，接合至所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序的C-端；
    抗原，共价接合至所述第一肽或所述第二肽，
    其中：
    A1、A2、A3及A4是每个个别地选自由精氨酸(R)及赖氨酸(K)所组成的群组；
    B1是选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；
    B2是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、及色氨酸(W)所组成的群组；
    B3是选自由异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)及缬氨酸(V)所组成的群组；
    B4是选自由苯基丙氨酸(F)、色氨酸(W)及酪氨酸(Y)所组成的群组；以及
    B5是选自由苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)及丝氨酸(S)组成的群组；且
    所述A1B1B2A2及/或A3B3B4B5A4基序、所述第一肽以及所述第二肽形成两亲性螺旋二级结构。
  13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一肽范围涵盖从0至20个氨基酸，且所述第二肽范围涵盖从0至20个氨基酸。
  14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述抗原是选自由低聚糖、多肽、蛋白质、多聚糖、肽及其组合所组成的群组。
  15. 一种两亲性肽，其特征在于，包含：
    SEQ ID NO:1的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列、、SEQ ID NO:3的氨基酸序列、SEQ ID NO:4的氨基酸序列、SEQ ID NO:5的氨基酸序列、SEQ ID NO:6的氨基酸序列、SEQ ID NO:7的氨基酸序列、SEQ ID NO:8的氨基酸序列、SEQ ID NO:9的氨基酸序列、SEQ ID NO:10的氨基酸序列或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
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