ES2608033T3 - Nuevas lisil oxidasas - Google Patents

Abstract

Uso de un polipéptido que tiene actividad de lisil oxidasa y que comprende el siguiente motivo de aminoácidos, donde los residuos entre paréntesis indican redundancia admitida en dicho punto y los aminoácidos están en código de 1 letra: - IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK, para catalizar la desaminación oxidativa de grupos lisil en una proteína o péptido en los correspondientes aldehídos, con la posterior reducción de O2 en H2O2.

Description

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Un «polipéptido» se define en la presente memoria como una cadena que comprende más de 30 residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de (oligo)péptidos y polipéptidos en la presente memoria se escriben de izquierda a derecha en el sentido desde el extremo amínico hacia el extremo carboxílico, según la práctica habitual. El código de una letra de los aminoácidos utilizado en la presente memoria se conoce comúnmente en la técnica y puede encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Proteína láctea significa, leche, leche desnatada, leche sin grasa, leche de mantequilla, yogur, leche en polvo disuelta en agua hasta la concentración proteica deseada, caseinato disuelto en agua hasta la concentración proteica deseada, opcionalmente con proteínas de lactosuero, una disolución de glicomacropéptido (GMP) de kappa-caseína o una combinación de estos. Hidrolizado significa el producto que se forma mediante la hidrólisis de la proteína (o en pocas palabras, hidrolizado proteico o proteína hidrolizada), el hidrolizado soluble en ácido que es la fracción soluble del hidrolizado proteico que también se describe en la presente memoria como composición que contiene péptido soluble o composición que comprende productos soluble), o una mezcla de un hidrolizado proteico y un hidrolizado soluble en ácido.

El término nutracéutico tal como se usa en la presente memoria denota la utilidad tanto en el campo de aplicación nutritivo como farmacéutico. Por lo tanto, las nuevas composiciones nutracéuticas que comprenden la composición de la invención pueden utilizare como complemento para alimentos o bebidas y como formulaciones farmacéuticas o medicamentos para aplicación entérica o parenteral que pueden ser formulaciones sólidas tales como cápsulas o comprimidos, o formulaciones líquidas, tales como soluciones, suspensiones o emulsiones.

Los sustratos adecuados para la reticulación según la invención son proteínas, péptidos, hidrolizados, proteínas o péptidos modificados y otros compuestos que tiene una funcionalidad de amina.

Las enzimas de reticulación que se describieron anteriormente establecen enlaces covalentes entre moléculas proteicas. La enzima transglutaminasa cataliza la formación de enlaces directamente utilizando residuos de glutamina y lisina. Los efectos de la acción de la transglutaminasa a menudo se ven de forma inmediata, por ejemplo, como un aumento en la viscosidad o una mejora y firmeza (textura mejorada) (véase, por ejemplo, Información técnica de Ajinomoto: Activa®WM, Das enzym mit biss; Boletín informativo Thought TNO, TNO Research Institute, Países Bajos, No. 25, Octubre de 1998, página 3) y no requieren etapas de procesamiento adicionales para obtener los retículos. Otras estrategias de reticulación enzimática donde se utilizan, por ejemplo, enzimas que generan sulfhidrilo oxidasa o peróxido de hidrógeno también conducen a la reticulación proteica sin requerir etapas de procesamiento adicionales. Lo mismo sucede con las lisil oxidasas, que generan una función de aldehído reactivo mediante su acción en residuos de lisina en proteínas, y la aplicación de estas proteínas modificadas se ha descrito, por ejemplo, en EP 0988859. En esta solicitud de patente se describe el uso de lisil oxidasa para obtener reticulación proteica. Los autores indican específicamente que la proteína modificada debería tratarse a temperaturas por debajo de 80°C, preferiblemente por debajo de 60°C. Aparentemente, no se necesita el tratamiento térmico para obtener la reticulación proteica. La disolución de proteínas reticuladas a menudo muestra viscosidad aumentada y capacidad de unión a agua aumentada, en comparación con las proteínas no reticuladas en condiciones similares. Esta es una desventaja cuando las proteínas reticuladas deben procesarse adicionalmente antes del envío desde el proveedor de ingredientes a los usuarios tales como fabricantes de alimentos. La proteína reticulada es más difícil de manipular y más difícil de procesar (por ejemplo, filtración) debido a la alta viscosidad de la disolución que contiene la proteína reticulada; además otras etapas de procesamiento como por ejemplo el secado se vuelven más difíciles y costosas cuando se manipulan proteínas reticuladas. El proceso de secado de las proteínas reticuladas requiere más energía en comparación con el de las proteínas no reticuladas debido a que tiene mejor capacidad de unión al agua. Sería de interés que los intermediarios de proteína reactiva pudieran prepararse a partir del sustrato de proteína de partida que se reticula fácilmente en la aplicación cuando se desee. Evitaría la formación de preparaciones viscosas y de alta unión a agua en el sitio del fabricante de alimentos, evitando costes de operación y manipulación excesivos. Los intermediarios de proteína reactiva requieren la modificación (funcionalización) de los sustratos de proteína de partida. En la presente solicitud de patente mostramos que de forma sorprendente las proteínas modificadas con las lisil oxidasas descritas en la presente solicitud tienen características de dichos intermediarios de proteína reactiva. Las proteínas tales como proteínas de lactosuero y caseína que se modifican con la lisil oxidasa no exhiben viscosidad aumentada. Cuando las proteínas funcionalizadas posteriormente se calientan, los intermediarios de proteína reactiva forman retículos proteicos, que conducen a viscosidad aumentada de las soluciones proteicas y textura aumentada.

Tal como se indicó anteriormente, se han descrito diversas lisil oxidasas en la literatura. La mayoría son de origen mamífero y no se han expresado a niveles elevados debido a sus características de solubilidad escasa (Kuchar & Dooley, J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204). Además, la lisil oxidasa de Pichia pastoris se expresa escasamente (10 mg/L, Kuchar & Dooley, J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204) y esta enzima también se produce de forma intracelular. EP 1 466 979 describe una alegada lisil oxidasa, pero hemos argumentado anteriormente que creemos que no se trata de una lisil oxidasa. Además, demostramos en el ejemplo 1 que la clonación y expresión de la lisil oxidasa descrita en EP 1 466 979 (SEQ_ID NO: 2 en dicha patente) no conduce a la producción de actividad de lisil oxidasa.

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electrostáticas, enlaces de hidrógeno e interacciones covalentes. Las últimas conducen a retículos permanentes en la red de gel. Las propiedades viscoelásticas y de fractura de un gel alimentario y, por consiguientes, su textura tal como la perciben los consumidores, dependen del equilibro entre las fuerzas que estabilizan en el gel, incluidas las interacciones covalentes. Dado que las lisil-oxidasas pueden utilizarse para la formación de enlaces covalentes intramoleculares, son útiles para la modificación de la textura de los alimentos. Hallamos que la enzima, cuando se incuba con proteínas, conduce a la modificación de la textura de los geles proteicos. Además, existe una necesidad en la industria de enzimas de reticulación proteica que se inactivan durante los procesos de pasteurización utilizados normalmente en la industria de alimentos. Mostramos que las lisil oxidasas descritas en la presente memoria cumplen con los criterios de labilidad térmica.

Un polipéptido que tiene actividad de lisil oxidasa puede estar en forma aislada. Tal como se define en la presente memoria, un polipéptido aislado es un polipéptido producido endógenamente o recombinante que está esencialmente libre de otros polipéptidos no lisil oxidasa y es típicamente al menos aproximadamente 20 % puro, preferiblemente al menos aproximadamente 40 % puro, más preferiblemente al menos aproximadamente 60 % puro, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 80 % puro, todavía más preferiblemente aproximadamente 90 % puro y más preferiblemente aproximadamente 95 % puro, tal como se determina mediante SDS-PAGE. El polipéptido puede aislarse mediante centrifugación y métodos cromatográficos, o cualquier otra técnica conocida en la técnica para obtener proteínas puras a partir de soluciones brutas. Se entenderá que el polipéptido puede mezclarse con vehículos o diluyentes que no interfieren con el objetivo previsto del polipéptido y, por consiguiente, el polipéptido de esta forma se considerará aun así como aislado. En general comprenderá el polipéptido en una preparación en la que más del 20 %, por ejemplo, más del 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %, en peso de las proteínas de la preparación es un polipéptido para uso en la invención.

Preferiblemente, el polipéptido utilizado en la invención se puede obtener a partir de un microorganismo que posee un gen que codifica para una enzima con actividad de lisil oxidasa. Más preferiblemente, el polipéptido se secreta a partir de este microorganismo. Incluso más preferiblemente, el microorganismo es fúngico, y de forma óptima es un hongo filamentoso. Los organismos donantes preferidos son, por lo tanto, del género Fusarium, tales como los de la especie Fusarium graminearum, o del género Aspergillus, tales como los de la especie Aspergillus nidulans, del género Cryptococcus, tales como los de la especie Cryptococcus neoformans o del género Podospora, tales como los de la especie Podospora anserina.

La presente invención proporciona el uso de un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 817 de la SEQ_ID NO:1 (es decir, el polipéptido) de al menos 30 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, incluso más preferiblemente al menos 90 %, todavía más preferiblemente al menos 95 % y más preferiblemente al menos 97 % y que tiene actividad de lisil oxidasa.

A los efectos de la presente invención, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos se determina mediante el programa de búsqueda en base de datos proteica BLAST P (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402) con la matriz Blosum 62 y un umbral esperado de 10.

Un polipéptido utilizado en la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ_ID NO:1 o una secuencia sustancialmente homóloga, o un fragmento de cualquier secuencia que tenga actividad de lisil oxidasa. En general, se prefiere la secuencia de aminoácidos de origen natural que se muestra en SEQ_ID NO:1.

El polipéptido utilizado en la invención también puede comprender una variante o homólogo de especie de origen natural del polipéptido de SEQ_ID NO:1.

Una variante es un polipéptido que se origina naturalmente en, por ejemplo, células fúngicas, bacterianas, de levadura o vegetales, la variante tiene actividad de lisil oxidasa y una secuencia sustancialmente similar a la proteína de SEQ_ID NO:1. El término «variantes» hace referencia a polipéptidos que tienen el mismo carácter esencial o funcionalidad biológica básica que la lisil oxidasa de SEQ_ID NO: 1 e incluye variantes alélicas. Preferiblemente, un polipéptido variante tiene al menos el mismo nivel de actividad de lisil oxidasa que el polipéptido de SEQ_ID NO: 1. Las variantes incluyen variantes alélicas de la misma cepa que el polipéptido de SEQ_ID NO: 1 o de una cepa diferente del mismo género o especie.

De forma similar, un homólogo de especie de la proteína de la invención es una proteína equivalente con secuencia similar que es una lisil oxidasa y se origina de forma natural en otras especies. Los ejemplos de homólogos de especie del polipéptido de SEQ_ID NO: 1 se indican en SEQ_ID NO: 2, 3 y 4.

Las variantes y homólogos de especie pueden aislarse utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria que se utilizaron para aislar el polipéptido de SEQ_ID NO: 1 y llevar a cabo dichos procedimientos en una célula fuente adecuada, por ejemplo, una célula bacteriana, de levadura, fúngica o vegetal. También es posible utilizar una sonda para sondear bibliotecas hechas con células de levadura, bacterianas, fúngicas o vegetales a efectos de obtener clones que expresan variantes u homólogos de especie del polipéptido de SEQ_ID NO: 1. Los

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métodos que pueden utilizarse para aislar variantes y homólogos de especie de un gen conocido se describen exhaustivamente en la literatura y son conocidos para los expertos en la técnica. Estos genes pueden manipularse mediante técnicas convencionales para generar un polipéptido para uso en la invención, que posteriormente puede producirse mediante técnicas recombinantes o sintéticas conocidas per se.

La secuencia del polipéptido de SEQ_ID NO: 1 y de variantes y homólogos de especie también pueden modificarse para proporcionar polipéptidos para uso en la invención. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse, por ejemplo, de 1, 2 o 3 hasta 10, 20 o 30 sustituciones. También puede hacerse la misma cantidad de supresiones e inserciones. Estos cambios pueden hacerse fuera de regiones esenciales para la función del polipéptido, de tal forma que el polipéptido modificado conserve su actividad de lisil oxidasa.

Los polipéptidos para uso en la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos de longitud completa mencionados anteriormente y de variantes de los mismos, incluidos los fragmentos de la secuencia establecida en SEQ_ID NO: 1. Dichos fragmentos típicamente conservarán la actividad de una lisil oxidasa. Los fragmentos pueden tener una longitud de al menos 50, 100 o 200 aminoácidos o pueden ser la sustracción de esta cantidad de aminoácidos de la secuencia de longitud completa que se muestra en SEQ_ID NO: 1.

Los polipéptidos para uso en la invención, si es necesario, pueden producirse mediante medios sintéticos aunque habitualmente se producirán recombinantemente tal como se describe más adelante. Los polipéptidos sintéticos pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de residuos de histidina o una etiqueta T7 para auxiliar en su identificación o purificación, o mediante la adición de una secuencia señal para promover su secreción a partir de una célula.

Por lo tanto, las secuencias variantes pueden comprender aquellas derivadas de cepas de Aspergillus distintas de la cepa de la cual se aisló el polipéptido de SEQ_ID NO: 1. Las variantes se pueden identificar a partir de otras cepas de Aspergillus al buscar actividad de lisil oxidasa y clonarlas y secuenciarlas tal como se describe en la presente memoria. Las variantes pueden incluir la supresión, modificación o adición de aminoácidos simples o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia proteica, siempre que el péptido mantenga la funcionalidad biológica básica de la lisil oxidasa de SEQ_ID NO: 1.

Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse, por ejemplo, de 1, 2 o de 3 hasta 10, 20 o 30 sustituciones. El polipéptido modificado generalmente conservará la actividad de una lisil oxidasa. Se pueden hacer sustituciones conservadoras; dichas sustituciones se conocen en la técnica.

Las secuencias polipeptídicas más cortas están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un péptido de al menos 50 aminoácidos o hasta 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700 o 800 aminoácidos de longitud se considera que está dentro del alcance de la invención siempre que demuestre la funcionalidad biológica básica de la lisil oxidasa de SEQ_ID NO: 1. En particular, pero no de forma exclusiva, este aspecto de la invención abarca la situación en la que la proteína es un fragmento de la secuencia proteica completa.

La presente invención también describe un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de lisil oxidasa, dicho polinucleótido comprende

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una secuencia de polinucleótidos que codifica para los aminoácido SEQ_ID NO:1, y

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una secuencia de polinucleótidos que codifica para los aminoácido SEQ_ID NO:2, y

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una secuencia de polinucleótidos que codifica para los aminoácido SEQ_ID NO:3, y

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una secuencia de polinucleótidos que codifica para los aminoácido SEQ_ID NO:4.

Para la presente invención, los polipéptidos que contienen las secuencias consenso de lisil oxidasa de SEQ_ID NO: 11 están dentro de la invención. Para la presente invención es especialmente relevante que la proteína de interés se secrete activamente en el medio de crecimiento. Las proteínas secretadas normalmente se sintetizan originalmente como preproteínas y la presecuencia (secuencia señal) se elimina posteriormente durante el proceso de secreción. El proceso de secreción es básicamente similar en procariotas y eucariotas: la preproteína secretada activamente se enrosca a través de una membrana, la secuencia señal se elimina mediante una peptidasa señal específica y la proteína madura se (re)pliega. También se puede reconocer una estructura general para la secuencia señal. Las secuencias señal para secreción se ubican en el extremo amínico de la preproteína y tienen generalmente 15-30 aminoácidos de longitud. El extremo amínico preferiblemente contiene aminoácidos cargados positivamente y preferiblemente ningún aminoácido ácido. Se cree que esta región cargada positivamente interactúa con los grupos principales cargados negativamente de los fosfolípidos de la membrana. A esta región le sigue una región central transmembranaria hidrófoba. Esta región generalmente tiene 10-20 aminoácido de longitud y consiste principalmente en aminoácidos hidrófobos. Los aminoácidos cargados normalmente no están presentes en esta región. A la región transmembranaria sigue el sitio de reconocimiento para la peptidasa señal. El sitio de reconocimiento consiste en aminoácidos con la preferencia por pequeño-X-pequeño. Los aminoácidos pequeños pueden ser alanina, glicina,

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procariota o fúngica, preferiblemente de una cepa de Aspergillus, llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones adecuadas para la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, al purificar la mezcla de reacción sobre un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para contener sitios de reconocimiento de enzima de restricción adecuados de forma que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación adecuado.

Alternativamente, se pueden construir genes sintéticos que abarcan la región codificante de la lisil oxidasa secretada

o variantes de la misma. Los polinucleótidos que se alteran en muchas posiciones, pero que todavía codifican la misma proteína pueden diseñarse convenientemente y construirse utilizando estas técnicas. Esto tiene la ventaja de que el uso del codón puede adaptarse al hospedador de expresión preferido, de forma de que se puede mejorar la productividad de la proteína en este hospedador. Además, la secuencia de polinucleótidos de un gen se puede cambiar para mejorar la estabilidad del ARNm o reducir el recambio. Esto puede conducir a una expresión mejorada de la proteína deseada o variantes de la misma. Además, se puede cambiar la secuencia de polinucleótidos en un gen sintético para producir mutaciones en la secuencia proteica que tienen un efecto positivo sobre la eficacia de la secreción, estabilidad, vulnerabilidad proteolítica, temperatura óptima, actividad específica u otras propiedades relevantes para la producción industrial o aplicación de la proteína. Las empresas que proporcionan servicios para construir genes sintéticos y optimizar el uso de codones están disponibles en general.

Dichas técnicas pueden utilizarse para obtener todos o parte de los polinucleótidos que codifican para las secuencias de lisil oxidasa descritas en la presente memoria. Los intrones, promotores y regiones remolque están dentro del alcance de la invención y también pueden obtenerse de forma análoga (por ejemplo mediante medios recombinante, PCR o técnicas de clonación), partiendo de ADN genómico de una célula fúngica, de levadura, bacteriana, vegetal o procariota.

Los polinucleótidos o cebadores pueden portar una etiqueta reveladora. Las etiquetas adecuadas incluyen radioisótopos tales como 32P o 35S, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas u otras etiquetas proteicas tales como biotina. Dichas etiquetas pueden agregarse a los polinucleótidos o cebadores para uso en la invención y pueden detectarse utilizando técnicas conocidas para los expertos en la técnica.

Los polinucleótidos o cebadores (o fragmentos de los mismos) etiquetados o no etiquetados pueden utilizarse en pruebas basadas en ácido nucleico para la detección o secuenciación de una lisil oxidasa o una variante de la misma en una muestra fúngica. Dichas pruebas de detección comprenderán en general poner en contacto una muestra fúngica que se sospecha que contiene el ADN de interés con una sonda que comprende un polinucleótido o cebador descrito en la presente memoria en condiciones de hibridación y detectar cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico en la muestra. La detección puede lograrse utilizando técnicas tales como PCR o inmovilizando la sonda sobre un soporte sólido, eliminando cualquier ácido nucleico en la muestra que no hibridó con la sonda y detectando luego cualquier ácido nucleico que hibridó con la sonda. Alternativamente, el ácido nucleico de la muestra se puede inmovilizar en un soporte sólido, hibridar con la sonda y detectar la cantidad de sonda unida a dicho soporte tras la eliminación de cualquier sonda no unida.

Las sondas para uso en la invención pueden envasarse de modo conveniente en forma de un kit de prueba en un recipiente adecuado. En dichos kits, la sonda puede unirse con un soporte sólido cuando el formato del ensayo para el cual se diseñó el kit requiere dicha unión. El kit también puede contener reactivos adecuados para tratar la muestra que se va a someter a sondeo, para hibridar la sonda con ácido nucleico en la muestra, reactivos testigo, instrucciones y similares. Las sondas y polinucleótidos también se pueden utilizar en un microensayo.

Preferiblemente, el polinucleótido para uso en la invención se puede obtener del mismo organismo que el polipéptido, tal como un hongo, en particular un hongo del género Aspergillus.

Producción de polinucleótidos

Los polinucleótidos que no tienen 100 % de identidad con SEQ_ID NO: 6 pero que pueden utilizarse en la invención pueden obtenerse de diversas formas. Por lo tanto, las variantes de la secuencia de lisil oxidasa descritas la presente pueden obtenerse, por ejemplo, sometiendo a sondeo bibliotecas de ADN genómico hecha con una gama de organismos, tales como los tratados como fuentes de los polipéptidos para uso en la invención. Además, otros homólogos fúngicos, vegetales o procariotas se pueden obtener y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar con SEQ_ID NO: 6. Dichas secuencias pueden obtenerse sometiendo a sondeo bibliotecas de ADNc o bibliotecas de ADN genómico de otras especies y sometiendo a sondeo dichas bibliotecas con sondas que comprenden toda o parte de SEQ_ID NO: 6 en condiciones de rigurosidad baja, media hasta alta (tal como se describió anteriormente). Las sondas de ácido nucleico que comprenden toda o parte de SEQ_ID NO: 6 pueden utilizarse para someter a sondeo bibliotecas de ADNc o genómico de otras especies, tales como las descritas como fuentes para los polipéptidos para uso en la invención.

Los homólogos de especie también pueden obtenerse utilizado PCR redundante, que utiliza cebadores diseñados para dirigirse a secuencias dentro de variantes y homólogos que codifican para secuencias de aminoácidos conservadas. Los cebadores pueden contener una o más posiciones redundantes y se utilizarán en condiciones de

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rigurosidad más bajas que las utilizadas para clonar secuencias con cebadores de secuencia simples contra secuencias conocidas. Un modo preferido de obtener homólogos de especie de lisil oxidasa es diseñar cebadores que se dirigen a secuencias que codifican para las secuencias consenso descritas en SEQ_ID NO: 11.

Alternativamente, dichos polinucleótidos pueden obtenerse mediante mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias de lisil oxidasa o variantes de las mismas. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando se necesitan cambios de codón silenciosos para optimizar las preferencias codónicas para una célula hospedadora específica en la cual se expresan las secuencias de polinucleótidos. Se pueden hacer otros cambios de secuencias a efectos de introducir sitios de reconocimiento de enzima de restricción o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

Los polinucleótidos bicatenarios que comprenden un polinucleótido descritos en la presente memoria y su complemento pueden utilizarse en la invención.

En la presente memoria se describen polinucleótidos que codifican para los polipéptidos para uso en la invención descritos anteriormente. Dado que dichos polinucleótidos serán útiles como secuencias para la producción recombinante de polipéptidos para uso en la invención, no es necesario que sean capaces de hibridar con la secuencia de SEQ_ID NO: 6, aunque esto será en general deseable. De otra forma, dichos polinucleótidos pueden etiquetarse, utilizarse y producirse tal como se describió anteriormente si se desea.

Polinucleótidos recombinantes.

En la presente memoria se describen vectores que comprenden un polinucleótido para uso en la invención, incluidos vectores de clonación y expresión, y en otro aspecto, métodos para cultivar, transformar o transfectar dichos vectores en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo, en condiciones en las que se produce la expresión de un polipéptido para, o codificado por una secuencia para, uso en la invención. Además se proporcionan células hospedadoras que comprenden a polinucleótido o vector descrito en la presente memoria donde el polinucleótido es heterólogo para el genoma de la célula hospedadora. El término «heterólogo», generalmente con respecto a una célula hospedadora, significa que el polinucleótido no se produce de forma natural en el genoma de la célula hospedadora o que el polipéptido no se produce naturalmente a partir de dicha célula. Preferiblemente, la célula hospedadora es un célula de levadura, por ejemplo, una célula de levadura del género Kluyveromyces, Pichia, Hansenula o Saccharomyces o una célula de hongo filamentoso, por ejemplo, del género Aspergillus, Trichoderma o Fusarium.

Vectores

El vector en el que el casete de expresión descrito en la presente memoria se inserta puede ser cualquier vector que se puede someter de forma conveniente a procedimientos de ADN recombinante y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedadora en la que se va a introducir. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, tal como un plásmido. De manera alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el o los cromosomas en el o los que se integró.

Preferiblemente, cuando un polinucleótido tal como se describe en la presente memoria está en un vector, está unido funcionalmente a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante mediante la célula hospedadora, es decir, el vector es un vector de expresión. La expresión «unido funcionalmente» se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos de esta manera están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de expresión «unido funcionalmente» a una secuencia codificante se posiciona de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones de producción.

Los vectores, por ejemplo, en el caso de vectores de plásmido, cósmido, virus o fago, pueden proporcionarse con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un potenciador y/o regulador del promotor. La secuencia de terminación puede estar presente, tal como una secuencia de poliadenilación. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo, un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a la neomicina para un vector mamífero. Los vectores pueden utilizarse in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o pueden utilizarse para transfectar o transformar una célula hospedadora.

La secuencia de ADN que codifica para el polipéptido se introduce preferiblemente en un hospedador adecuado como parte de una construcción de expresión en la cual la secuencia de ADN está unida funcionalmente con señales de expresión que son capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las células hospedadoras. Para la transformación del hospedador adecuado con la construcción de expresión existen procedimientos de transformación disponibles conocidos para los expertos. La construcción de expresión se puede utilizar para la transformación del hospedador como parte de un vector que lleva un marcador seleccionable, o la construcción de

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expresión se cotransforma como una molécula aparte junto con el vector que lleva un marcador seleccionable. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables.

Los marcadores seleccionables preferidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que complementan un defecto en la célula hospedadora o confieren resistencia a un fármaco. Incluyen, por ejemplo, genes marcadores versátiles que pueden utilizarse para la transformación de la mayor parte de los hongos filamentosos y levaduras tales como genes acetamidasa o ADNc (los genes amdS, niaD, facA o ADNc de A.nidulans, A.oryzae o A.niger), o genes que proporcionan resistencia a antibióticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, fleomicina o benomil (benA). Alternativamente, se pueden utilizar marcadores de selección específicos tales como marcadores auxótrofos que requieren las cepas hospedadores mutantes correspondientes: por ejemplo, URA3 (de S.cerevisiae o genes análogos de otras levaduras), pyrG o pyrA (de A.nidulans o A.niger), argB (de A.nidulans o A.niger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección se suprime de la célula hospedadora transformada después de la introducción de la construcción de expresión con el fin de obtener células hospedadoras transformadas capaces de producir el polipéptido que carecen de genes marcadores de selección.

Otros marcadores incluyen la subunidad 9 de ATP sintetasa (oliC), orotidina-5’-fosfato-decarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia a G418 bacteriano (útil en levadura, pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica para glucuronidasa (GUS). Los vectores pueden utilizarse in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula hospedadora.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, la construcción de expresión preferiblemente se integra en el genoma de la célula hospedadora a efectos de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también están disponibles sistemas de vectores episomáticos adecuados en los cuales se puede incorporar la construcción de expresión para una expresión estable y a nivel elevado. Los ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de plásmidos de 2 µm, CEN y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus). Cuando las construcciones de expresión se integran en los genomas de la célula hospedadora, las construcciones se integran en un loci aleatorio en el genoma, o en un loci objetivo predeterminado utilizando recombinación homóloga, donde en tal caso el loci objetivo comprende preferiblemente un gen expresado de forma elevada. Un gen expresado de forma elevada es un gen cuyo ARNm puede componer al menos 0,01 % (p/p) del ARNm celular total, por ejemplo, en condiciones inducidas o, alternativamente, un gen cuyo producto génico puede componer al menos 0,2 % (p/p) de la proteína celular total o, en caso de un producto génico secretado, puede secretarse a un nivel de al menos 0,05 g/l.

Una construcción de expresión para una célula hospedadora dada generalmente contendrá los siguientes elementos unidos funcionalmente entre sí en orden consecutivo desde el extremo 5’ al extremo 3’ con respecto a la cadena codificante de la secuencia que codifica para el polipéptido del primer aspecto: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido en la célula hospedadora dada, (2) preferiblemente, una región no traducida en dirección a 5' (líder), (3) opcionalmente, a secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido a partir de la célula hospedadora dada en el medio de cultivo, (4) la secuencia de ADN que codifica para una forma madura y preferiblemente activa del polipéptido y además preferiblemente (5) una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción posterior a la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido.

Posteriormente a la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido, la construcción de expresión preferiblemente contiene una región no traducida en dirección a 3' que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción, también denominado terminador. El origen del terminador es menos esencial. El terminador por ejemplo puede ser natural de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente se utiliza un terminador bacteriano en células hospedadoras bacterianas, se utiliza un terminador de levadura en células hospedadoras de levadura y se utiliza un terminador de hongo filamentoso en células hospedadoras de hongo filamentoso. Más preferiblemente, el terminador es endógeno con respecto a la célula hospedadora en la que se expresa la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido.

También se puede lograr una expresión mejorada del polinucleótido que codifica para el polipéptido para uso en la invención mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, de secuencia señal y terminador, que sirven para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del hospedador de expresión elegido y/o para proporcionar el control inducible de la expresión del polipéptido para uso en la invención.

Aparte del promotor natural para el gen que codifica para el polipéptido para uso en la invención, se pueden utilizar otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido para uso en la invención. El promotor se puede seleccionar por su eficacia para dirigir la expresión del polipéptido para uso en la invención en el hospedador de expresión deseado.

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Los promotores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión pueden seleccionarse para que sean compatibles con la célula hospedadora para la cual se diseñó el vector de expresión. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores procariotas, en especial aquellos adecuados para uso en cepas de E.coli. Cuando la expresión del polipéptido para uso en la invención se lleva a cabo en células de mamíferos, se pueden utilizar promotores de mamíferos. También se pueden utilizar promotores específicos para tejido, por ejemplo, promotor específico para hepatocito. Los promotores virales también pueden utilizarse, por ejemplo, la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR, por sus siglas en inglés), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés), el promotor de SV40, el promotor IE del citomegalovirus (CMV) humano, promotores del virus del herpes simple o promotores del adenovirus.

Los promotores de levadura adecuados incluyen los promotores GAL4 y ADH de S. cerevisiae y el promotor nmt1 y adh de S. pombe. Los promotores de mamíferos incluyen el promotor de la metalotioneína que puede inducirse en respuesta a metales pesados tales como cadmio. También se pueden utilizar promotores virales tales como el promotor de antígeno T grande de SV40 o promotores de adenovirus. Todos estos promotores están disponibles en la técnica.

Se pueden utilizar promotores de mamíferos tales como los promotores de ß-actina. Los promotores específicos de tejido, en especial los promotores específicos de células endoteliales o neuronales (por ejemplo, los promotores DDAHI y DDAHII) se prefieren especialmente. Los promotores virales también pueden utilizarse, por ejemplo, la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de SV40, el promotor IE del citomegalovirus (CMV) humano, adenovirus, promotores de HSV (tales como los promotores IE de HSV) o promotores de HPV, en especial la región reguladora anterior del HPV (URR, por sus siglas en ingles). Los promotores virales están disponibles en la técnica.

Se puede utilizar una variedad de promotores que son capaces de dirigir la transcripción en las células hospedadoras tal como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, la secuencia promotora deriva de un gen expresado de forma muy elevada tal como se definió anteriormente. Los ejemplos de genes que se expresan de forma muy elevada preferidos de los cuales se derivan preferiblemente los promotores y/o que están comprendidos en el loci objetivo predeterminado preferido para la integración de las construcciones de expresión incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican para enzimas glicolíticas tales como triosa-fosfato isomerasas (TPI), gliceraldehídofosfato deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato cinases (PGK), piruvato cinasas (PYK), alcohol deshidrogenasas (ADH), así como también genes que codifican para amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, ß-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas, factores de alargamiento y proteínas ribosómicas. Los ejemplos específicos de genes que se expresan de forma elevada adecuados incluyen, por ejemplo, el gen LAC4 de Kluyveromyces sp., los genes de metanol oxidasa (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes de glucoamilasa (glaA) de A.niger y A.awamori, el gen de TAKA-amilasa de A.oryzae, el gen de gdpA de A.nidulans y los genes de celobiohidrolasa de T.reesei.

Los ejemplos de promotores fuertes constitutivos y/o inducibles que se prefieren para uso en hospedadores de expresión fúngica son aquellos que pueden obtenerse de los genes fúngicos para promotores de xilanasa (xlnA), fitasa, subunidad 9 de ATP-sintetasa (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG -del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Los ejemplos de promotores de levadura fuertes que pueden utilizarse incluyen aquellos que se pueden obtener de los genes para alcohol deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato cinasa, ATPasa de membrana plasmática (PMA1) y triosafosfato isomerasa.

Los ejemplos de promotores bacterianos fuertes que pueden utilizarse incluyen los promotores de amilasa y SPo2 así como los promotores de genes de proteasa extracelular.

Los promotores adecuados para células vegetales que pueden utilizarse incluyen promotores de napalina sintasa (nos), octopina sintasa (ocs), manopina sintasa (mas), subunidad pequeña de ribulosa (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CMV) y circovirus.

El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido que dan lugar a ARN que comprende secuencias homólogas a algunas de las secuencias genómicas eucariotas, secuencias genómicas fúngicas o secuencias genómicas de levadura. Esto permitirá la introducción de polinucleótidos tales como se describen en la presente memoria en el genoma de hongos o levaduras mediante recombinación homóloga. En especial, se puede utilizar un vector plasmídico que comprende el casete de expresión flanqueado por secuencias fúngicas para preparar un vector adecuado para suministrar los polinucleótidos descritos en la presente memoria a una célula fúngica. Las técnicas de transformación que utilizan estos vectores fúngicos son conocidas para los expertos en la técnicas.

El vector puede contener un polinucleótido tal como se describe en la presente orientado en un sentido complementario para proporcionar la producción de ARN complementario. El mismo se puede utilizar para reducir, si se desea, los niveles de expresión del polipéptido.

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Células hospedadoras y expresión

En un aspecto adicional, la invención proporciona un proceso para preparar un polipéptido para uso en la invención que comprende cultivar una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión tal como se describió anteriormente en condiciones adecuadas para la expresión mediante el vector de una secuencia codificante que codifica para el polipéptido, y recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos tales como se describen en la presente memoria pueden incorporarse en un vector replicable recombinante tales como un vector de expresión. El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. En la presente memoria además se describe un método para producir un polinucleótido al introducir un polinucleótido tal como se describe en la presente memoria en un vector replicable, introducir el vector en una célula hospedadora compatible y cultivar la célula hospedadora en condiciones que provocan la replicación del vector. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias tales como E. coli, levadura, líneas celulares de mamíferos y otras líneas celulares eucariotas, por ejemplo, células de insectos tales como células Sf9 y células fúngicas (por ejemplo filamentosas).

Preferiblemente el polipéptido se produce como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de ADN que codifica para una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión puede unirse funcionalmente con una secuencia de ADN que codifica para una secuencia señal. En el caso donde el gen que codifica para la proteína secretada tiene en la cepa natural una secuencia señal, preferiblemente la secuencia señal utilizada será natural (homóloga) para la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido. Alternativamente, la secuencia señal es externa (heteróloga) para la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferiblemente endógena para la célula hospedadora en la que se expresa la secuencia de ADN. Los ejemplos de secuencias señal adecuadas para células hospedadoras de levadura son las secuencias señal derivadas de genes MFalpha de levadura. De forma similar, una secuencia señal adecuada para células hospedadoras de hongo filamentoso es, por ejemplo, una secuencia señal derivada de un gen de amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentoso, por ejemplo el gen glaA de A.niger. Esta secuencia señal puede utilizarse en combinación con el propio promotor de amiloglucosidasa (también denominada (gluco) amilasa), así como en combinación con otros promotores. También se pueden utilizar secuencias señal híbridas dentro del contexto de la presente invención.

Las secuencias líder de secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan del gen de amiloglucosidasa (AG) fúngico (glaA, las versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus), el gen MFalpha (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen alfa-amilasa (Bacillus).

Los vectores pueden transformarse o transfectarse en una célula hospedadora adecuada tal como se describió anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido para uso en la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión tal como se describió anteriormente en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado.

También se describen en la presente memoria células hospedadoras transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector para uso en la invención. Preferiblemente, el polinucleótido se incluye en un vector que permite la replicación y expresión del polinucleótido. Las células se elegirán para ser compatibles con dicho vector y pueden ser por ejemplo células procariotas (por ejemplo, bacterianas), o eucariotas, fúngicas, de levadura o vegetales.

La invención abarca procesos para la producción de un polipéptido para uso en la invención por medio de expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido. A estos efectos, la secuencia de ADN descrita en la presente memoria puede utilizarse para amplificación génica y/o intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias señal de secreción, a efectos de permitir una producción económica del polipéptido en una célula hospedadora homóloga o heteróloga adecuada. Una célula hospedadora homóloga se define en la presente memoria como una célula hospedadora que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie de la especie de la cual se derivó la secuencia de ADN.

Las células hospedadoras adecuadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como bacterias, o más preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo, hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos o células vegetales. En general, se prefieren las células de levadura con respecto a las células de hongos filamentosos porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se secretan escasamente a partir de levaduras, o en algunos casos no se procesan adecuadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levadura). En estos casos, se debe seleccionar un organismo hospedador de hongo filamentoso.

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como hospedadores heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospedadores son aquellas de los géneros Streptomyces y Pseudomonas. Una célula hospedadora de levadura preferida para expresión de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido es una del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia o Schizosaccharomyces. Más preferiblemente, una célula hospedadora de levadura se selecciona del grupo que consiste en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como

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Los ejemplos de un agente de mutagénesis físico o químico adecuada para el presente fin incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico y análogos nucleotídicos.

Cuando se utilizan dichos agentes, la mutagénesis típicamente se lleva a cabo incubando la célula que se someterá a mutagénesis en presencia del agente de mutagénesis elegido en condiciones adecuadas y seleccionando las células que exhiben expresión reducida o ninguna expresión de la actividad de lisil oxidasa.

La modificación o inactivación de la producción de un polipéptido adecuado para uso en la presente invención se puede lograr mediante la introducción, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido o un elemento regulador necesario para la transcripción o traducción del mismo. Por ejemplo, se pueden insertar o eliminar nucleótidos a efectos de resultar en la introducción de un codón de terminación, la eliminación del codón de inicio o un cambio en el marco de lectura abierto. Dicha modificación o inactivación se puede lograr mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por PCR de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.

Aunque, en principio, la modificación se puede llevar a cabo in vivo, es decir, directamente en la célula que expresa la secuencia de ácido nucleico que se va a modificar, se prefiere que la modificación se lleve a cabo in vitro tal como se ejemplifica más adelante.

Un ejemplo de un modo conveniente para inactivar o reducir la producción de la lisil oxidasa por parte de una célula hospedadora elegida se basa en técnicas de reemplazo génico o interrupción génica. Por ejemplo, en el método de interrupción génica, una secuencia de ácido nucleico que corresponde al gen o fragmento de gen endógeno de interés se somete a mutagénesis in vitro para producir una secuencia de ácido nucleico defectuosa que luego se transforma en la célula hospedadora para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación homóloga, la secuencia de ácido nucleico defectuosa reemplaza al gen o fragmento de gen endógeno. Preferiblemente, el gen o fragmento de gen defectuoso también codifica para un marcador que puede utilizarse para seleccionar los transformantes en los que se ha modificado o destruido el gen que codifica para el polipéptido.

Alternativamente, la modificación o inactivación de la secuencia de ácido nucleico que codifica para una polipéptido para uso en la presente invención puede lograrse mediante técnicas antisentido establecidas utilizando una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia que codifica para el polipéptido. Más específicamente, la producción del polipéptido por parte de una célula se puede reducir o eliminar mediante la introducción de una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido. El polinucleótido complementario a continuación típicamente se transcribirá en la célula y será capaz de hibridar con el ARNm que codifica para la lisil oxidasa. En condiciones que permiten que la secuencia de nucleótidos antisentido complementaria hibride con el ARNm, la cantidad de lisil oxidasa producida en la célula se reducirá o eliminará.

Se prefiere que la célula que se va a modificar según los métodos de la presente invención sea de origen microbiano, por ejemplo, una cepa fúngica que es adecuada para la producción de productos proteicos deseados, ya sean homólogos o heterólogos con respecto a la célula.

En la presente memoria se describe además una célula mutante de una célula genitora que comprende una alteración o supresión de la secuencia de ácido nucleico endógena que codifica para el polipéptido o una secuencia de control del mismo, que resulta en que la célula mutante produce menos del polipéptido que la célula genitora.

Las células mutantes deficientes para el polipéptido creadas de esta forma son particularmente útiles como células hospedadoras para la expresión de polipéptidos homólogos y/o heterólogos. Por lo tanto, existen métodos descritos en la presente memoria para producir un polipéptido homólogo o heterólogo que comprenden (a) cultivar la célula mutante en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. En el presente contexto, el término «polipéptidos heterólogos» se define en la presente memoria como polipéptidos que no son naturales con respecto a la célula hospedadora, una proteína natural en la que se han hecho modificaciones para alterar la secuencia natural o una proteína natural cuya expresión se ha alterado cuantitativamente como resultado de una manipulación de la célula hospedadora mediante técnicas de ADN recombinante.

También se describe en la presente memoria un método para producir un producto proteico esencialmente libre de actividad de lisil oxidasa mediante fermentación de una célula que produce un polipéptido de lisil oxidasa para uso en la presente invención así como el producto proteico de interés. El método comprende agregar una cantidad eficaz de un agente capaz de inhibir la actividad de lisil oxidasa en el caldo de fermentación durante o después de que se haya completado la fermentación, recuperar el producto de interés del caldo de fermentación y opcionalmente someter el producto recuperado a purificación adicional. Alternativamente, tras el cultivo el caldo de cultivo resultante se puede someter a una tratamiento de pH o temperatura tratamiento con el fin de reducir la actividad de lisil oxidasa sustancialmente, y permitir la recuperación del producto del caldo de cultivo. El tratamiento combinado de pH o temperatura puede llevarse a cabo en una preparación proteica recuperada del caldo de cultivo.

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Los métodos descritos en la presente memoria para producir un producto esencialmente libre de lisil oxidasa son especial interés para la producción de polipéptidos eucariotas, en especial en la producción de proteínas fúngicas tales como enzimas. Las células deficientes para lisil oxidasa también pueden utilizarse para expresar proteínas heterólogas de interés para la industria de los alimentos, o de interés farmacéutico.

Motivos peptídicos para identificar genes

Se puede utilizar un motivo peptídico para identificar genes que codifican para proteínas que contienen este motivo peptídico. En lugar de un motivo peptídico, también se pueden utilizar una combinación de dos o más motivos peptídicos para identificar genes que codifican para proteínas que contienen los motivos peptídicos. Cuando se identifican uno o varios motivos peptídicos que codifican para lisil oxidasas específicas es posible, por lo tanto, identificar genes que codifican para lisil oxidasas utilizando uno o una combinación de varios de estos motivos peptídicos. Las lisil oxidasas se utilizan como un ejemplo de cómo pueden identificarse dichos genes, pero los métodos descritos se pueden aplicar en general. Una posibilidad es la de usar la secuencia del motivo de SEQ_ID NO: 11 para buscar en secuencias de ADN traducidas de un banco de datos de ADN o secuencias proteicas de un banco de datos de secuencias proteicas mediante el uso de un programa como Patscan (http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/). La secuencia de aminoácidos se debe ingresar en un formato especial que se describe en el sitio web. Otro método que se puede llevar a cabo es el de usar la secuencia del motivo de SEQ_ID NO: 11 para buscar en secuencias de ADN traducidas de un banco de datos de ADN o secuencias proteicas de un banco de datos de secuencias proteicas mediante el uso de un programa como http://myhits.isbsib.ch/cgi-bin/. Para este programa el motivo se ingresa en el campo de búsqueda en el formato denominado Prosite y se busca en las bases de datos para presencia del motivo en la secuencia proteica o en la secuencia de ADN traducida. Este método se describe adicionalmente en el Ejemplo 1 de la presente invención, utilizando el motivo de aminoácidos de SEQ_ID NO: 11, y se utiliza para identificar genes fúngicos que codifican para lisil oxidasas útiles. Los genes que se identifican utilizando uno de estos métodos luego pueden traducirse en una secuencia proteica utilizando programas conocidos para los expertos en la técnica e inspeccionarse para detectar la presencia de una secuencia señal en su extremo amínico. Para detectar una secuencia señal se puede utilizar un programa como SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). En la presente invención, hallamos que una secuencia proteica que contiene las secuencias consensos y una secuencia señal prevista es probablemente una lisil oxidasa secretada. Buscar estas propiedades combinadas proporciona una gran ventaja para la producción industrial de dicha enzima.

Otra posibilidad para identificar los genes de lisil oxidasa utilizando motivos peptídicos es diseñar cebadores de oligonucleótidos basados en la retrotraducción de la secuencia de aminoácidos del motivo de SEQ_ID NO: 11 en una secuencia de nucleótidos con uso de codón preferido de un organismo en el que se quiere identificar un gen de lisil oxidasa y utilizar este oligonucleótido para hibridación con una biblioteca génica, o en un cebador de PCR en una concentración de ARNm transcrito de forma inversa. Mediante el uso del motivo de secuencia peptídica SEQ_ID NO: 11, también es posible aislar genes que codifican para lisil oxidasa cuando la secuencia génica es desconocida. Se han descrito métodos en la literatura para diseñar cebadores de oligonucleótidos redundantes que pueden utilizarse para este fin (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Además, se han descrito métodos para aislar genes de un organismo utilizando un oligonucleótido redundante como sonda o cebador.

Los oligonucleótidos que codifican para el motivo peptídico de SEQ_ID NO: 11 son útiles para aislar los genes que codifican para propiedades de lisil oxidasa. La redundancia de dicho grupo de oligonucleótidos puede reducirse mediante la introducción de bases de inosina (I) en las posiciones donde el nucleótido no se conoce. Además, las posiciones donde las bases citosina (C) y timidina (T) son posibles pueden reemplazarse por uracilo (U), y en las posiciones donde adenina (A) y guanina (G) son posibles se puede introducir solo guanina, a efectos de reducir la redundancia con apenas un pequeño efecto sobre la especificidad del cebador de oligonucleótidos. Además, para someter a barrido la presencia de genes que codifican para lisil oxidasas en organismos de los cuales se conocen la preferencia codónica, la redundancia de los oligonucleótidos puede reducirse adicionalmente tomando en cuenta la preferencia codónica en el diseño de los oligonucleótidos. Un experto en la técnica sabrá cómo hacerlo. Además, todas las combinaciones posibles de cebadores de oligonucleótidos, sin redundancia, pueden sintetizarse por separado y utilizarse en experimentos de barrido individuales.

En primer lugar, se construye una biblioteca genómica, de ADNc o EST a partir de las especies de interés en un vector universal. En la literatura se describen métodos adecuados para la construcción de bibliotecas (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). En segundo lugar, se utiliza un oligonucleótido redundante descrito anteriormente en una reacción de PCR junto con un oligonucleótido universal que se ceba el vector, en el borde del inserto de ADN recombinante, en ADN aislado de la biblioteca. Se han descrito estrategias útiles en la literatura para aislar un gen deseado cuando solo hay disponible un cebador de oligonucleótido redundante simple (por ejemplo, Minambres et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 272, 477-479; PCR technology (1989) Ed. H.A. Erlich pp. 99-104, Stockton Press). En tercer lugar, el fragmento amplificado por PCR a continuación se etiqueta y utiliza como sonda para someter a barrido la biblioteca mediante

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Figura 4. Perfiles de SDS-PAGE de κ-caseína, α-caseína y una mezcla de κ y α-caseína y los mismos perfiles tras la incubación con lisil oxidasa ZGR

Secuencias

SEQ_ID NO 1: Proteína ZGR de Aspergillus nidulans

SEQ_ID NO 2: Proteína ZGT de Cryptococcus neoformans

SEQ_ID NO 3: Proteína GLO1 de Fusarium graminearum

SEQ_ID NO 4: Proteína ZGY de Podospora anserina

SEQ_ID NO 5: Proteína GLO2 de Fusarium graminearum

SEQ_ID NO 6: ADN sintético de ZGR de Aspergillus nidulans

SEQ_ID NO 7: ADN sintético de ZGT de Cryptococcus neoformans

SEQ_ID NO 8: ADN genómico de GLO1 de Fusarium graminearum

SEQ_ID NO 9: ADN sintético de ZGY de Podospora anserina

SEQ_ID NO 10: ADN genómico de GLO2 de Fusarium graminearum

SEQ_ID NO 11: motivo consenso: IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK

Ejemplos

Ejemplo 1

Identificación de genes que codifican para lisil oxidasa putativos en una secuencia genómica fúngica.

Las lisil oxidasas secretadas a partir de un origen fúngico son interesantes para producir en grandes cantidades dado que se utilizan en aplicaciones alimentarias. Actualmente, la única lisil oxidasa descrita secretada a partir de un hongo filamentoso es de Aspergillus oryzae, y se describe en SEQ_ID NO: 2 de EP 1466979 A1. En la presente memoria hemos intentado sobreexpresar esta enzima de Aspergillus oryzae en el hongo Aspergillus niger. De forma sorprendente, no se logró medir ninguna actividad de lisil oxidasa en el fluido de cultivo tras la sobreexpresión de esta secuencia en Aspergillus niger. Para explicar este resultado sorprendente, examinamos la secuencia de aminoácidos descrita en EP 1466979 A1 con mayor detalle. De forma sorprendente, la secuencia de lisil oxidasa de Aspergillus oryzae putativa es diferente en algunos aspectos en posiciones importantes con respecto a la secuencia de otras lisil oxidasas y amina oxidasas de cobre. Es decir, la posición 164 de la proteína comentada del gen de Asperillus oryzae descrita en SEQ_ID NO: 2 de EP 1466979 A1 es una alanina, mientras que en todas las otras amina y lisil oxidasas descritas esta posición está altamente conservada como prolina. Además, la posición 78 en esta proteína comentada es una metionina, mientras que la leucina está altamente conservada en las amina oxidasas en esta posición. Además, la proteína descrita en EP 1 466 979 A1 contiene una inserción adicional de 2 aminoácidos tras el residuo 109 en comparación con la lisil oxidasa de mamífero y Pichia. Además la posición 499 en la proteína descrita en EP 1466979 A1 es una treonina, mientras que esta posición es siempre un residuo hidrófobo en otras amina oxidasas y residuo. Las posiciones conservadas en las proteínas con frecuencia se asocian con la función primaria de una enzima y no pueden cambiarse sin cambiar la actividad catalítica de la enzima. Por lo tanto, es dudoso que la secuencia proteica descrita en EP 1466979 A1 sea de hecho correcta y codifique para una lisil oxidasa funcional. La actividad de oxidasa que se ha medido en algunos de los transformantes en EP 1466979 A1, por lo tanto, podría no deberse a la sobreexpresión del gen descrito.

Dado que el abordaje de sobreexpresar el gen de EP 1466979 A1 no fue exitoso, examinamos cuidadosamente la secuencia de aminoácidos de lisil oxidasas y propusimos en la presente memoria un motivo de secuencia de aminoácidos que es útil para la identificación de lisil oxidasas de hongos. El motivo que proponemos como útil para identificar lisil oxidasas fúngicas genuinas es:

I-H-D-[NS]-L-S-G-S-M-H-D-H-V-[IL]-N-F-K (SEQ_ID NO:11)

En este motivo cada aminoácido está representado con el código de una letra de IUPAC estándar y cuando más aminoácidos son posibles en una única posición, los posibles aminoácidos están entre paréntesis.

Hicimos una búsqueda en trEMBL (base de datos de ADN DNA traducido) con el motivo SEQ_ID NO:11 con la opción de búsqueda de patrón en http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/. Este programa puede buscar en bases de datos de ADN traducido o proteína con un motivo definido tal como SEQ_ID NO:11. Con este fin, el motivo se ingresa en el campo de búsqueda de patrón en el formato denominado Prosite, tal como se representó anteriormente, y se busca

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describe cómo seleccionar los transformantes sobre placas de agar que contienen acetamida y seleccionar integrantes con múltiples copias objetivo. Preferiblemente, los transformantes de A. niger que contienen múltiples copias del casete de expresión se seleccionan para generación adicional de material de muestra. Para los vectores de expresión de lisil oxidasa se purificaron 30 transformantes de A. niger para cada plásmido transformado; primero colocando en placas los transformantes individuales sobre placas de medio selectivo y posteriormente colocándolos en placas con una colonia simple en placas de PDA. Las esporas de transformantes individuales se recogieron después de cultivo durante 1 semana a 30 grados Celsius. Las esporas se almacenaron refrigeradas y se utilizaron para la inoculación de medios líquidos.

Una cepa de A. niger que contenía múltiples copias del casete de expresión se utilizó para generación material de muestra mediante cultivo de la cepa en cultivos de matraz de agitación. Un método útil para el cultivo de cepas de A. niger y separación del micelio del caldo de cultivo se describe en WO 98/46772. El medio de cultivo fue CSM-MES (150 g de maltosa, 60 g de Soytone (Difco), 15 g de (NH4)2SO4, 1 g de NaH2PO4·H2O, 1 g de MgSO4·7H2O, 1 g de L-arginina, 80 mg de Tween-80, 20 g de MES pH6,2 por litro de medio). Se tomaron muestras de 5 ml en los días 48 de la fermentación, se centrifugaron durante 10 min a 5000 rpm en un Hereaus labofuge RF y los sobrenadantes se almacenaron a -20°C hasta llevar a cabo análisis adicionales.

La Figura 2 muestra perfiles de expresión proteica, tales como se determinaron mediante SDS-PAGE (tinción con Coomassie) de los sobrenadantes tras el cultivo. De forma clara, las lisil oxidasas clonadas de Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Fusarium graminearum y Podospora anserina muestran una sobreexpresión excelente, lo cual demuestra que se expresan y excretan bien. Esto es muy sorprendente e inesperado dado que la enzima de Aspergillus oryzae, que está más estrechamente relacionada con el hospedador Aspergillus niger, no se pudo sobreexpresar aunque se informó anteriormente (EP1 466 979) que dicha lisil oxidasa de Aspergillus oryzae comentada podía expresarse en un hospedador heterólogo. Los cuatro genes de lisil oxidasa de los cuales todos los organismos donantes están menos relacionados con Aspergillus niger se expresaron de forma eficaz en este hospedador. Además, el gen GLO2 de Fusarium graminearum se expresó de forma eficaz y secretó a partir de Aspergillus niger.

Ejemplo 3

Purificación de la lisil oxidasa sobreexpresada a partir del sobrenadante de A. niger.

Las lisil oxidasas derivadas de Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Fusarium graminearum y Podospora anserina que se sobreexpresaron en Aspergillus niger se cultivaron en grandes cantidades tal como se explica a continuación. Las cepas de A. niger transformadas que expresaban la lisil oxidasa relevantes se cultivaron en una medio de cultivo que contenía por litro maltosa.H2O: 40 g; Soytone (Difco): 30 g; (NH4)2SO4: 15 g, NaH2PO4·H2O: 1g; MgSO4·7H2O: 1, L-arginina: 1 g, Tween-80: 0,08 g, Na-citrato: 70 g. Se ajustó el pH hasta 6,2. Luego de 5-6 días de cultivo a 30 grados C, las células se destruyeron mediante la adición de 3,5 g/l de benzoato de sodio y prolongación de la incubación durante 6 horas más. Luego se agregaron 10 g/l de CaCl2 y 45 g/l de auxiliar de filtración (Dicalite BF; Gent, Bélgica) al caldo. El micelio se extrajo mediante una filtración por tela inicial y posteriormente mediante filtración a través de filtros Z-2000 y Z-200 (Pall). La ultrafiltración se llevó a cabo utilizando una celda de ultrafiltración Amicon con una membrana de 10 kDa hasta una reducción en el volumen de 2-4 veces. La purificación de las lisil oxidasas se llevó a cabo de la siguiente forma:

Lisil oxidasa ZGR (derivada de Aspergillus nidulans)

El sobrenadante de cultivo concentrado que contenía la lisil oxidasa ZGR se equilibró en 20 mM de Tris.HCl (pH7,5; disolución amortiguadora A1) hasta una conductividad de 1,8 mS/cm en la celda de ultrafiltración Amicon. La muestra posteriormente se cargó en una columna de Q-Sepharose (5 ml Q-FF Hitrap, Pharmacia) utilizando un caudal de 5 ml/min. Después del lavado con 3 volúmenes de columna (cv) de disolución amortiguadora A1 la lisil oxidasa se eluyó utilizando un gradiente lineal de 20 cv de disolución amortiguadora A1 a B1 (B1 = disolución amortiguadora A1 + 1M NaCl). Las fracciones que contenían lisil oxidasa, que eluyeron con alrededor de 340 mM de NaCl, se identificaron a través de SDS-PAGE, se concentraron y se transfirieron a una celda de concentración Amicon con una membrana de 10 kDa para cambiar la disolución amortiguadora a 25 mM de Na-fosfato (pH6,6; disolución amortiguadora A2). La muestra posteriormente se aplicó en una columna de Q-Sepharose (5 ml Q-FF Hitrap, Pharmacia, 5 ml/min) equilibrada en disolución amortiguadora A2. Después del lavado con 3 cv de disolución amortiguadora A2 la lisil oxidasa se eluyó en gradiente lineal de 20 cv de disolución amortiguadora A2 a disolución amortiguadora B2 (B2 = disolución amortiguadora A2 + 1M NaCl). Las fracciones que contenían lisil oxidasa se concentraron. La enzima era al menos 95 % pura, tal como se determinó mediante SDS-PAGE (tinción con Coomassie).

Lisil oxidasa ZGT (derivada de Cryptococcus neoformans)

La lisil oxidasa ZGT se purificó esencialmente tal como se describió para ZGR con las siguientes adaptaciones: las soluciones amortiguadoras A1 y B1 estaban a pH7,1 en lugar de pH7,5. La lisil oxidasa se eluyó en la primera etapa

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