ES2604978T3 - Separación virtual de marcador unido y libre en un ensayo de ligando para realizar inmunoensayos de fluidos biológicos, incluyendo sangre completa - Google Patents
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Abstract
Un método para realizar un inmunoensayo de analito diana de una muestra de fluido (20) que reside de forma quiescente en una cámara, que comprende las etapas de distribuir la muestra de fluido dentro de la cámara; proporcionar un marcador detectable dentro de la muestra (20), que es un marcador funcional para unirse al analito diana para producir analito diana marcado (22), que es el analito diana marcado (22) detectable en la muestra (20); proporcionar al menos una primera área superficial (17) dentro de la cámara que es la primera área superficial (17) que tiene ligandos específicos de analito diana (19) fijados a la misma, que son ligandos específicos de analito diana (19) funcionales para unir selectivamente el analito diana presente en la muestra a la primera área superficial (17); proporcionar al menos una segunda área superficial (18) en la cámara que está libre de ligandos específicos de analito diana (19) funcionales para unir selectivamente el analito diana presente en la muestra a la segunda área superficial (18), en el que la cámara tiene al menos una pared, y la al menos una primera área superficial (17) y la al menos una segunda área superficial (18) están dispuestas sobre la al menos una pared; explorar ópticamente la al menos una primera área superficial (17) para detectar y registrar una distribución de intensidad promedio de la señal del marcador por píxel del analito diana marcado (22) en la al menos una primera área superficial (17); explorar ópticamente la al menos una segunda área superficial (18) para detectar y registrar una distribución de intensidad promedio de la señal del marcador por píxel del analito diana marcado (22) en la al menos una segunda área superficial (18); y determinar al menos uno de una cantidad de analito diana marcado (22) en la al menos una primera área superficial (17), una cantidad de analito diana marcado (22) en la al menos una segunda área superficial (18), y una relación de analito diana marcado (22).
Description
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DESCRIPCION
Separacion virtual de marcador unido y libre en un ensayo de ligando para realizar inmunoensayos de fluidos biologicos, incluyendo sangre completa
Antecedentes de la invencion
1. Campo tecnico
La presente invencion se refiere a la deteccion virtual, cuantificacion y caracterizacion de sustancias detectadas inmunologicamente de forma electronica en fluidos biologicos humanos y animales, tales como sangre completa, suero, plasma, orina, leche, fluido pleural y peritoneal, y semen, cuya deteccion, cuantificacion y caracterizacion se realizan en una camara delgada sobre una muestra de fluido quiescente, teniendo dicha camara al menos dos paredes planas paralelas, al menos una de las cuales es transparente.
2. Informacion antecedente
Esta invencion se refiere a la mejora en el rendimiento de todos los inmunoensayos que implican actualmente la separacion ffsica de un analito unido del libre realizando, en cambio, una separacion virtual del marcador unido y libre detectado opticamente en un ensayo de ligando, donde el marcador es preferiblemente un marcador fluorescente, aunque sera suficiente cualquier marcador opticamente detectable y cuantificable. Las camaras para su uso en este ensayo y los instrumentos para medir los analitos en estas camaras se describen en las siguientes patentes de Estados Unidos expedidas n.° 6.929.953 expedida para S. C. Wardlaw; 6.869.570 expedida para S. C. Wardlaw; 6.866.823 expedida para S. C. Wardlaw; y la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2007/0087442, de S. C. Wardlaw, publicada el 19 de abril de 2007.
La separacion ffsica de los analitos unidos de los libres se ha conseguido, en la tecnica anterior, por multiples medios incluyendo, aunque sin limitacion, la adsorcion del marcador libre por carbon vegetal o talco, separacion magnetica de perlas que contienen el analito unido o no unido, adsorcion del analito marcado unido por el recipiente, tal como anticuerpos acoplados a la pared de un tubo de ensayo y el uso de anticuerpos secundarios de precipitacion dirigidos contra el anticuerpo que se une al analito seguido de centrifugacion, asf como los metodos descritos en las patentes y publicaciones indicadas anteriormente.
Algunos de los tipos de separacion ffsica de la tecnica anterior de ensayos de analito diana unido se describen en las siguientes patentes de Estados Unidos: 5.834.217; 5.776.710; 5.759.794; 5.635.362; 5.593.848; 5.342.790; 5.460.979; 5.480.778; y 5.360.719, todas expedidas para R. A. Levine et al. En las patentes mencionadas anteriormente, la separacion del analito unido del libre se realiza por centrifugacion, u otros metodos ffsicos, tales como decantacion, filtracion o similares.
La tecnica anterior tambien describe un tipo de inmunoensayo, que se llama un "inmunoensayo homogeneo". Los inmunoensayos homogeneos no requieren la separacion ffsica del analito unido del no unido o libre. La "separacion del unido del libre" se consigue utilizando la interferencia esterica de una enzima por el anticuerpo relativamente grande y cuantificando los productos coloreados o fluorescentes de la accion enzimatica. Metodos adicionales de ensayos homogeneos utilizan la inactivacion fluorescente de fluoroforos para distinguir el analito unido del libre. Aunque estos metodos simplifican enormemente el rendimiento de los inmunoensayos, generalmente son utiles solamente para altas concentraciones de analitos con bajo peso molecular ya que el gran peso molecular de analitos diana tales como protemas (por ejemplo, insulina), hormonas del crecimiento y similares tambien interferira con la enzima y puede afectar a la inactivacion. Ademas, los inmunoensayos de este tipo homogeneo ffpicamente no tiene la alta sensibilidad de los inmunoensayos convencionales.
Sena muy deseable proporcionar un ensayo de ligando de un analito diana donde la cuantificacion del analito diana es una virtual que puede realizarse electronicamente teniendo de ese modo las ventajas de un inmunoensayo homogeneo manteniendo al mismo tiempo la sensibilidad de los inmunoensayos convencionales, asf como la capacidad de tener analitos diana de gran tamano tales como hormonas como insulina, hormona del crecimiento y similares.
Los inmunoensayos se usan para analizar una amplia gama de analitos, tales como hormonas en la sangre, etc. Trabajan por la tecnica general de encontrar un agente de union espedfico que se una espedficamente al analito diana que se esta midiendo. Un agente de union se menciona en este documento como ligando. Los ligandos se definen en este documento como incluyendo, aunque sin limitacion, los anticuerpos, lectinas, aptameros o sustancias de origen natural, que son funcionales para unirse a un analito diana. La muestra a medirse se mezcla con el ligando que es espedfico para el analito diana, y una version marcada del analito a medirse. Segun se incuba esta mezcla, las moleculas de analito diana marcadas y no marcadas compiten por los sitios de union sobre el ligando. Despues de un periodo adecuado, el ligando se retira por cualquiera de varios medios, y se compara el marcador unido al ligando con el marcador que no esta unido y permanece libre en la mezcla. Esta relacion de unido/libre se refiere a la concentracion del analito diana originalmente en la muestra, aunque el marcador unido o
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libre puede dar la misma informacion. El uso de las relaciones permite la comprobacion del control de calidad donde el total de unido mas libre es relativamente constante so el volumen es constante. Este control de calidad tambien puede emplearse en la practica de esta invencion.
De acuerdo con aspectos de la presente invencion, se proporciona un metodo expuesto en las reivindicaciones 1 y 7. Se describe un metodo para ensayar una muestra de fluido biologico para un material de analito diana que puede estar en la muestra de fluido. El metodo utiliza una separacion virtual del analito diana libre y unido dispuesto dentro de la muestra de fluido, que implica la exploracion electronica de la muestra. El metodo implica colocar la muestra de fluido en una camara de ensayo que tiene una altura predeterminada y fija para producir una capa fina de la muestra de fluido en la camara. Al menos una pared de la camara es transparente, habitualmente la pared superior, de modo que muestra pueda observarse en la camara. En ciertos casos, tanto la pared superior como la inferior de la camara son transparentes. La altura de la camara (por ejemplo, tfpicamente de pm a 200 pm) puede variar de acuerdo con la aplicacion disponible. Por ejemplo, cuando se esta analizando sangre completa anticoagulada, una altura de camara de 6 pm es ventajosa porque crea una monocapa de globulos rojos y lagunas de plasma intercaladas dentro de la muestra de sangre.
La altura de la estructura fija o la perla recubierta de ligando debe ser, optimamente, de no menos de una decima parte de la de la camara y, de forma ideal, aproximandose a la altura de la camara. La razon de esto es que si la cantidad total de marcador (por ejemplo, fluoroforo) presente en el estado libre, que rodea la partfcula o estructura a la que el marcador esta unido, es mucho mayor que la cantidad de la cantidad mas baja de marcador unido a detectarse, la capacidad de determinar de forma precisa la cantidad de marcador unido a la perla o estructura se disminuye debido a la influencia de las relaciones de senal a ruido. Matematicamente, no existe lfmite a la altura de la camara, pero los lfmites practicos debido a la senal a ruido del marcador detectado requieren una camara delgada y estructuras que ocupan al menos el diez por ciento del volumen de un cilindro trazado alrededor de la periferia de la estructura y que se extiende desde la base hasta la punta de la camara para la funcion optima. En ejemplos donde el ligando es adherente a la parte superior o inferior de la camara, en lugar de una estructura o perla, se aplican las relaciones anteriores, pero el ensayo debe formularse de forma optima de modo que el volumen cilmdrico por encima del area de ligando unido contenga no mas de diez veces la cantidad mas baja unida al area de ligando que se desea detectar. Esta restriccion puede disminuirse haciendo la camara lo mas delgada posible o alterando la estequiometna de la reaccion.
El metodo de esta invencion puede usarse para ensayar alergias a farmacos o sensibilidades a alergenos en pacientes en el lugar de asistencia. Las alergias a farmacos y sensibilidades a alergenos son un problema comun e importante. Es caro para el paciente y la sociedad. Tratar a un paciente alergico a la penicilina con un farmaco de la clase de la penicilina, por ejemplo, puede causar la muerte o reacciones graves. La penicilina se usa en este analisis como un farmaco representativo y porque es el tipo de farmaco que es la causa mas comun de reacciones alergicas severas. La presente invencion no se limita al ensayo de alergias a la penicilina, y puede usarse para ensayar la sensibilidad a otros farmacos (por ejemplo, antibioticos, relajantes musculares, anestesicos, etc.) y alergenos.
La penicilina es un farmaco economico, eficaz y generalmente no toxico. Los pacientes que creen tener una alergia a la penicilina pueden tratarse con otro farmaco dirigido menos microbiano en vista de la alergia percibida. Dichos farmacos de remplazo pueden causar graves efectos secundarios en los pacientes, sin embargo, y generar enormes costes para el sistema de asistencia sanitaria, ya que las medicaciones mas nuevas pueden ser cientos o miles de veces mas caras que los farmacos de penicilina. Son igual de importantes los costes para la sociedad asociados con el desarrollo aumentado de bacterias, virus u otros agentes infecciosos resistentes a farmacos que sucede cuando se usan farmacos de amplio espectro en lugar de farmacos mas centrados en el organismo diana. Es importante, por lo tanto, para los pacientes individuales, los asistentes sanitarios y la sociedad, determinar la presencia o ausencia de alergias a farmacos o sensibilidades a alergenos por metodos, ademas del historial dado por el paciente. Un objetivo de esta invencion es detectar la presencia o ausencia de alergias a farmacos y/o sensibilidades a alergenos en una muestra de sangre completa o plasma de un paciente.
Esta bien documentado que muchos pacientes que reivindican ser alergicos a la penicilina no son alergicos y asimismo algunos pacientes que piensan que no son alergicos pueden haber desarrollado una alergia desde su ultima exposicion. Existen muchos informes de que el 80 % de los individuos que creen que son alergicos a la penicilina toleraran, de hecho, el uso de la penicilina, de modo que para estos pacientes las restricciones sobre la eleccion de antibioticos, que potencialmente producen un tratamiento menos eficaz, mas toxico y mas caro, son innecesarias.
En ninguna parte se necesita mas la capacidad de detectar la alergia a farmacos que en los encuentros con el paciente en el lugar de asistencia. Los medicos que van a prescribir una medicacion en su consulta, la sal de urgencias o el hospital no tienen el lujo de poder esperar muchas horas o un dfa para que se realice el ensayo in vitro o por ensayos cutaneos. El ensayo cutaneo puede exponer al paciente, ademas, al riesgo de reaccion a la sustancia de ensayo y tiene la posibilidad teorica de inducir alergia o aumentarla mediante una respuesta anamnesica. Los ensayos in vitro actuales son complejos, se tarda mucho tiempo en realizarlos y proporcionan informacion al medico mucho despues del momento en que sena mas util. Ademas, la naturaleza alergica de muchos farmacos, incluyendo farmacos de tipo penicilina, puede deberse a mas de un epttopo y el ensayo preciso
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requerina el ensayo de todos los epftopos comunes que pueden ser la causa de la respuesta alergica. El ensayo de RAST, bien descrito en la bibliograffa, se realiza generalmente sobre una cantidad limitada de alergenos de ensayo y sus epftopos.
Generalmente se esta de acuerdo en que la respuesta inmunitaria mediada por IgE es la causa de la reaccion alergica mas severa, incluyendo anafilaxia, urticaria, inflamacion intestinal con diarrea y obstruccion respiratoria debido a inflamacion de las vfas respiratorias. Se sugiere por algunos expertos que otras clases de inmunoglobulinas tambien pueden contribuir a la respuesta alergica a los farmacos, pero generalmente la respuesta alergica a alergias a farmacos mediadas por IgG e IgM no es potencialmente mortal y muy probablemente sera una erupcion.
Una ventaja de la presente invencion es que proporciona un medio para realizar, de forma optima en el lugar de asistencia, una determinacion de la presencia de IgE o cualquier otra inmunoglobulina que tiene una afinidad por uno o mas farmacos que se indica o pueden indicarse para su uso en una situacion dada.
El marcador de eleccion es el uso de un fluoroforo que se detecta facilmente y fija al ligando. La presente invencion no esta limitada al uso de marcadores fluorometricos, sin embargo. Puede usarse mas de un fluoroforo de color, si se desea, para comprobar la presencia o ausencia de mas de una clase de inmunoglobulina que pueda llegar a fijarse a las perlas en la misma camara. Las perlas sin el antfgeno fijado se usan como controles. Las perlas de control pueden ser qrnmica o geometricamente similares a las perlas recubiertas, difiriendo solamente en el color u otro medio que posibilite su deteccion (por ejemplo, la fluorescencia o combinaciones de colorantes de fluorescencia incorporados en su estructura). Las perlas de control proporcionan un control de modo que la deteccion, por ejemplo, de una senal fluorescente significativa desde el anticuerpo marcado fluorescente dirigido contra la IgE que esta fijada a las perlas que contienen un determinante (epftopo) del farmaco que se esta ensayando como alergeno potencial, puede compararse con la senal que esta presente en perlas similares no recubiertas o unidas al epftopo. Por tanto, se controla la union no espedfica y no producira un falso positivo.
Descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es una vista lateral esquematica de una superficie que alberga ligando que puede usarse para realizar una inmunoensayo sobre una muestra de sangre u otra muestra de acuerdo con la tecnica anterior.
La FIG. 1(a) es una vista similar a la FIG. 1, pero que muestra la superficie despues de que la muestra se haya retirado por lavado de la misma de acuerdo con la tecnica anterior.
La FIG. 2 es una vista lateral esquematica similar a la FIG. 1, pero que muestra una superficie que alberga ligando, que puede usarse para realizar un inmunoensayo tipo sandwich sobre una muestra de sangre u otra muestra de acuerdo con la tecnica anterior.
La FIG. 2(a) es una vista similar a la FIG. 2, pero que muestra la muestra despues de haber anadido un segundo marcador a la muestra de acuerdo con la tecnica anterior.
La FIG. 2(b) es una vista similar a la FIG. 2(a), pero que muestra la superficie despues de que la muestra se haya retirado por lavado de la misma de acuerdo con la tecnica anterior.
La FIG. 3 es una vista en planta de una primera realizacion de una camara de muestreo formada de acuerdo con esta invencion, que contiene una muestra de sangre completa anticoagulada a la que se ha anadido partfculas de captura del analito que albergan el ligando de la muestra de sangre.
La FIG. 4 es una vista lateral seccionada de una parte de la camara de muestreo de la FIG. 3 que contiene una de las partfculas de captura del analito diana recubiertas con ligando.
La FIG. 5 es una vista en planta de una camara de ensayo como la mostrada en la FIG. 4, que muestra un area de la muestra, que contiene una de las partfculas de captura del analito diana recubiertas con ligando y tambien que muestra otra area de la muestra que no contiene una de las partfculas de captura del analito diana recubiertas con ligando, sino que solamente contiene el analito diana marcado libre en la muestra de sangre.
La FIG. 6 es una vista fragmentada en seccion transversal de una superficie de captura del analito diana parcialmente recubierta con ligando, donde partes de la superficie estan recubiertas con ligandos y otras partes de la superficie no.
FIG. 7 es una vista esquematica seccionada de una camara cerrada que tiene una superficie superior, tal como la mostrada en la FIG. 6.
La FIG. 8 es una vista en planta de la superficie mostrada en la FIG. 6.
La FIG. 9 es un trazo de las emisiones de las bandas de ligando sobre la superficie de captura mostrada en las FIG. 6 y 8.
Descripcion detallada de la invencion
Con referencia ahora a los dibujos, las FIG. 1 y 1(a) ilustran un inmunoensayo competitivo de la tecnica anterior (tambien mencionado como un "ensayo de equilibrio") que se usa habitualmente para analitos de bajo peso molecular, tales como la hormona tiroidea, tiroxina, donde el numero 1 se refiere a una superficie a la que un ligando 2, que es espedfico para el analito diana, se fija por cualquiera de varios medios bien conocidos en la tecnica. La superficie 1 puede ser una pared transparente de un tubo o una partfcula de vidrio o plastico. Una solucion 3 contiene una mezcla del analito diana sin marcar 4 (el desconocido) y un analito diana marcado 5. Despues de un
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periodo de tiempo, que puede ser de minutos a horas, dependiendo de la diana y el marcador, el analito diana marcado 5 y el analito diana no marcado 4 estaran en un equilibrio entre sf, donde mucho, pero generalmente no todos, los sitios del ligando 2 estaran ocupados con un analito diana marcado 5 o analito diana no marcado 4. En este punto (FIG. 1a), la mezcla 3 se separa de la superficie 1 que alberga el ligando de un modo que conserva los analitos diana marcados 5 que se unen al ligando 2. Los analitos diana marcados 5 unidos a la superficie 1 se mide despues (vease la FIG. 1a), y los analitos diana marcados libres tambien pueden medirse o pueden calcularse como: Total = Libre + Unido, o Unido = Total - Libre. La relacion de analito diana unido a libre esta inversamente relacionada con la cantidad total de analito diana en la muestra.
Las FIG. 2 - FIG. 2 (b) muestran un ensayo de ligando a menudo mencionado como un ensayo tipo "sandwich", donde se utilizan dos ligandos diferentes. La superficie 1 tiene el ligando 2 unido ("ligando unido") a la misma de una manera similar a la descrita anteriormente, y la muestra que contiene el analito diana 4 se introduce en la solucion 3 y se incuba con la superficie 1. De forma inmediata, o despues de un periodo adecuado de tiempo, se introduce un ligando marcado diferente 6 en la solucion, que es un ligando marcado 6 que se une a un sitio en el analito diana 4 que es diferente del ligando unido 2 (FIG. 2a). Esto, en efecto, crea un "sandwich", que contiene el analito diana 4 en el centro. El ligando marcado libre 6 despues se retira por lavado de la superficie 1 para dejar la superficie 1 cubierta con sitios marcados (FIG. 2b). Los analitos diana marcados 4 unidos a la superficie 1 despues se cuantifican, y la serial, por lo tanto, es directamente proporcional a la cantidad del analito diana 4 en la muestra original. Generalmente se reconoce que el ensayo de tipo sandwich es mas preciso y algo mas exacto, pero puede aplicarse solamente para moleculas de analito diana que tienen al menos dos sitios diferentes a los que pueden unirse los ligandos.
En cualquiera de los ensayos anteriores, la separacion del marcador unido del marcador libre se reconoce como uno de los aspectos desafiantes del procedimiento, y a menudo requiere una o mas etapas mecanicamente complejas, tales como centrifugacion, decantacion, lavado, etc. Como resultado, la instrumentacion para automatizar estos ensayos ha sido relativamente completa, que requiere multiples operaciones.
En cambio, aspectos de la presente invencion proporcionan un medio de "separacion virtual", donde el marcador unido y libre no se separan ffsicamente, sino que en su lugar se separan por una combinacion de configuracion de celda de ensayo y manipulacion matematica de las senales de diferentes regiones en la celda de ensayo. Como resultado, pueden realizarse metodos y aparatos de ensayo de ligando simplificados y automatizados.
De acuerdo con aspectos de la presente invencion, se realizan inmunoensayos o ensayos de ligando donde el agente de union es un ligando u otra sustancia que tiene una alta afinidad por el analito diana.
Los ensayos de acuerdo con la presente invencion pueden realizarse, por ejemplo, usando los recipientes de muestra y los sistemas instrumentales de imagenes descritos en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2007/0243117 y 2007/0087442 y la patente de Estados Unidos n.° 6.866.823. Los presentes ensayos no estan limitados a estas camaras y dispositivos de imagenes, sin embargo.
El termino "inmunoensayo", como se usa en la descripcion y reivindicaciones significara agentes de union a basados en anticuerpo y tambien agentes de union no basados en anticuerpo. Ejemplos de los ultimos incluyen, aunque sin limitacion, factores intrmsecos para la union de la vitamina B12, y avidina para la union de dianas marcadas con biotina o viceversa.
En aspectos de la presente invencion, se proporciona una superficie bien defina y ffsicamente delimitada a la que se fija el ligando, y despues la senal del marcador unido a esa superficie se distingue matematicamente de la de cualquier marcador libre adyacente que pueda residir en la solucion. Existes dos casos generales que se describen a continuacion.
La FIG. 3 es una vista en planta de una seccion de un ensamblaje de camara de muestra 40, conteniendo dicho ensamblaje de camara 40 una muestra de sangre completa anticoagulada. El ensamblaje de camara 40 incluye paredes superiores e inferiores 7 (vease la FIG. 4), al menos una de las cuales es transparente. Preferiblemente, las dos paredes 7 son transparentes. El ensamblaje de camara 40 incluye miembros espaciadores 42 (vease la FIG. 3) que se localizan aleatoriamente dentro del ensamblaje de camara 40. Los miembros espaciadores 42 son preferiblemente esfericos y determinan y controlan la altura del ensamblaje de camara 40. En el caso de ensayo de una muestra de sangre completa anticoagulada, los miembros espaciadores 42 que tienen un diametro de aproximadamente 6 pm funcionan particularmente bien. La muestra de sangre que esta contenida en el ensamblaje de camara 40 incluira globulos rojos individuales 44 y aglomeraciones de globulos rojos 46. La muestra de sangre tambien incluye areas de lagunas de plasma claras 48 que no contienen ningun componente sangumeo formado. Finalmente, la muestra de sangre tambien incluye una pluralidad de partfculas de captura 8 del analito diana recubiertas con ligando que estan preferiblemente en forma de esferas. Las partfculas de captura 8 del analito diana se distribuyen aleatoriamente en toda la muestra de sangre, y pueden ser de aproximadamente 3 mm - 4 mm de diametro para un analisis de muestra de sangre, de modo que puedan detectarse facilmente en la muestra de sangre.
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La FIG. 4 muestra la estructura del ensamblaje de camara 40 de la FIG. 3. El ensamblaje de camara 40 esta limitado por la pared superior e inferior 7, al menos una de las cuales debe ser transparente. Dentro de la camara esta una partmula 8, cuya superficie esta cubierta con un ligando 9. La partmula 8 puede ser de cualquier forma siempre que pueda determinarse su volumen, pero es preferiblemente una esfera. La partmula 8 puede ser de cualquier material al que pueda fijarse un ligando, tal como vidrio, poliestireno o similares. Las partmulas no estan limitadas a ningun diametro particular (por ejemplo, 2 pm - 100 pm), y el diametro puede variar dependiendo del fluido que se este ensayando y la altura de la camara que se este usando. La distancia entre las paredes 7 es tfpicamente de no menos del diametro de la partmula 8, pero el lfmite superior de distancia dependera de la naturaleza de la partmula 8.
Una mezcla 10 contiene tanto un analito diana 11 como un analito diana marcado 12 de un modo similar al descrito en relacion con la FIG. 1 anterior. Despues de un periodo adecuado de incubacion, las senales del analito diana unido y libre se procesan.
La FIG. 5 es una vista desde arriba de un ensamblaje de camara de ensayo como el mostrado en la FIG. 4, que muestra una extension indefinida 13 de la mezcla 10. Dentro de esta extension, la senal total del marcador 12 se recoge sobre un area definida 14, que es un area que no esta limitada a ninguna forma particular. El medio de recogida puede ser un detector de fluorescencia, en el caso de un marcador fluorescente, o un detector de radionucleotidos, en el caso de un radiomarcador. El area se elige de modo que incluya al menos una partfcula 8, con un diametro conocido o medible. Tambien se mide un area definida adyacente 16, que no contiene una partmula. La senal del area 16 representa la del marcador no unido, ya que no hay sitios de union en esa localizacion. La senal del area 14, sin embargo, tiene una senal del marcador tanto unido como el libre. Las influencias de cada uno pueden determinarse de varios modos. Si la partfcula es esferica, que es una forma preferida, su volumen (Vp) puede calcularse a partir de su diametro, que puede medirse con el mismo sistema optico que recoge la senal del marcador. El volumen de las areas definidas 14 (V14) y 16 (V16) puede calcularse facilmente a partir de su anchura y la profundidad de la camara. Asumiendo que los volumenes de la camara asociados con areas definidas 14 y 16 son identicos, la senal del marcador libre es igual al de la senal del area 16 (S16). Esto significa que en ausencia de senal desde la partmula (el marcador unido), la senal desde el area 14 (Sf) debe ser: Sf = S16 x (V14 - Vp). Cualquier senal en exceso de esta cantidad es del marcador unido (Sb): Sb= S 14 - Sf. Si el volumen de la partmula es de un mmimo en comparacion con el volumen dentro del area 14, entonces no es necesaria la correccion del volumen. Lo que se determina es la intensidad promedio de la senal de marcador por pixel (o grupo colectivo de pfxeles) de las exploraciones. El termino pixel, como se usa en esta solicitud puede incluir el significado de uno o mas pfxeles adyacentes.
En una segunda y mas preferida realizacion, los ligandos se fijan a al menos una superficie de la propia camara. La FIG. 6 muestra una superficie de camara (superior) transparente 17, que puede ser de vidrio o de plastico, tal como acnlica o de poliestireno, a la que se ha fijado un recubrimiento uniforme de los ligandos por cualquiera de varios medios bien conocidos en la tecnica. Despues de formarse el recubrimiento uniforme, el ligando se retira de forma selectiva de una o mas regiones 18, por medios mecanicos o qrnmicos, o por ablacion con laser, dejando, por consiguiente, ligandos activos en regiones adyacentes 19.
La FIG. 7 muestra esta superficie 17 como parte de una camara delgada que contiene la mezcla 20, que comprende el analito diana no marcado 21 y el analito marcado 22. La camara es preferiblemente de menos de aproximadamente 1 mm de altura, y es mas preferiblemente de menos de 200 pm (por ejemplo, en un intervalo de 1 a 200 pm). Como anteriormente, despues de un periodo adecuado de tiempo, el analito marcado y no marcado alcanzara el equilibrio con el ligando, dejando una parte del analito marcado 23 unido a la superficie, pero solamente en la region donde permanece el ligando. En el caso de un marcador fluorescente, la superficie de la camara 17 se ilumina con la fuente de luz 24 de la longitud de onda apropiada para excitar la fluorescencia en el marcador. La lente 25 recoge las emisiones fluorescentes, que se filtran por el filtro optico 26 y se proyectan sobre un dispositivo de diseccion de imagenes 27, que puede ser un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD), semiconductor de oxido metalico complementario (CMOS) o similares. Como alternativa, la fuente de luz puede ser un laser que enfoca una mancha pequena en movimiento sobre la camara, y el dispositivo que recoge la luz 27 sena, en ese caso, un fototubo simple o fotomultiplicador.
El resultado neto de cualquier proceso se muestra en la FIG. 8, que es una vista esquematica desde arriba de la camara 28, donde el ligando activo 29 y el ligando escindido 30 aparecen como una serie de franjas verticales. Las lmeas de exploracion del aparato de la FIG. 7 estan representadas por las lmeas a-a. La FIG. 9 es una representacion de la forma de onda tomada a traves de las lmeas de exploracion a-a, donde los picos 31 son la senal desde el ligando activo, y los valles 32 son de las areas inactivas. Por tanto, la concentracion de marcador unido esta representada por la distancia desde los picos hasta los valles, y la altura de los valles representa el marcador libre. Las areas activas y las areas inactivas no estan limitadas a ninguna geometna particular.
En algunas realizaciones, puede usarse una pared de camara 17 que sea suficientemente flexible que pueda deformarse elasticamente de forma local sometiendola a una carga puntual relativamente pequena. La naturaleza elastica de la pared de la camara 17 permite una opcion unica para capturar senales "unidas" muy debiles. Si la pared de la camara 17 se comprime, tal como por un estilete pequeno justo fuera del area de la que se han tomado
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imagenes, el marcador libre 22 se expulsa lateralmente desde el campo local de vision y, por tanto, su senal se reduce marcadamente. Con esta senal de "fondo" reducida, pueden detectarse senales muy debiles desde el marcador unido 23.
Podna medirse multiples analitos simultaneamente si los marcadores emiten fluorescencia en diferentes longitudes de onda, o si el ligando para el analito 1 estuviera en una localizacion ffsica diferente en la camara de la del ligando para el analito 2.
Un ejemplo de un metodo de acuerdo con el metodo de la presente invencion incluye realizar un ensayo para determinar si un paciente puede ser alergico a uno o mas farmacos (por ejemplo, antibioticos, incluyendo penicilina, etc.) o alergenos. El ensayo se realiza usando un cartucho que tiene una camara de analisis que contiene una gran cantidad (por ejemplo, miles) de perlas recubiertas con epftopo de antibiotico y perlas de control no recubiertas. Para aquellos analisis dirigidos hacia mas de un epftopo de antibiotico, cada epftopo de antibiotico particular se acopla con un tipo particular de perla con fines de identificacion. Los grupos de perlas asociadas con diferentes epftopos pueden distinguirse entre sf usando caractensticas tales como el color, tamano, forma, etc. de la perla; por ejemplo, el epftopo A se recubre sobre perlas blancas, el epftopo B se recubre sobre perlas rojas, etc. Una pequena cantidad de muestra (por ejemplo, 0,5 a 5 microlitros) de sangre completa anticoagulada capilar o venosa se deposita en la camara (por ejemplo, se extrae en la camara por accion capilar) y tras cerrar la camara, la sangre se dirige a un area dentro de la camara que contiene las perlas. Despues de incubacion durante un primer periodo de tiempo (por ejemplo, minutos a una hora) la inmunoglobulina presente dentro de la muestra se une a aquellas perlas recubiertas con un farmaco (o alergeno) por el que la molecula de inmunoglobulina tiene una afinidad espedfica. Diferentes moleculas de inmunoglobulina presentes dentro de la muestra pueden tener diferentes afinidades espedficas para diferentes farmacos (o alergenos). Las perlas combinadas y la muestra de sangre se mezclan adicionalmente con uno o mas anticuerpos marcados, dirigidos contra la inmunoglobulina que se esta ensayando (por ejemplo, inmunoglobulina E ("IgE"), etc.) y se dejan incubar durante un segundo periodo de tiempo (por ejemplo, segundos a minutos). Un fluoroforo puede marcarse en los anticuerpos dirigidos contra la inmunoglobulina que se esta ensayando para crear el "anticuerpo marcado". La muestra despues se dirige a la camara de analisis del tipo descrito anteriormente. Los tiempos reales necesarios para la incubacion para las dos etapas pueden determinarse empfticamente y probablemente dependera de la avidez y la concentracion de los anticuerpos presentes. La muestra distribuida entro de la camara se analiza recogiendo la senal de los anticuerpos marcados tanto libre como unidos de uno o mas de los modos descritos anteriormente. Si el ensayo implica la determinacion de susceptibilidad alergica de mas de un farmaco, o la sensibilidad a mas de un alergeno, el analisis incluira distinguir los anticuerpos marcados unidos como una funcion de los diferentes tipos de perlas recubiertas tambien. El marcador unido representa aquellos anticuerpos marcados que estan unidos a la inmunoglobulina que se esta ensayando, que es la inmunoglobulina unida a la partfcula recubierta con el farmaco (o alergeno) con que la partfcula de inmunoglobulina particular tiene una afinidad espedfica. La cantidad de marcador unido sobre una partfcula puede calcularse midiendo la senal total de la partfcula de la que se han tomado imagenes y sustrayendo la senal libre adyacente en el area inmediata que rodea la partfcula que esta incluida en la imagen. Las relaciones de la cantidad de marcador sobre una clase dada de perlas recubiertas pueden calcularse midiendo perlas recubiertas y no recubiertas marcadas del mismo tipo. Por tanto, la determinacion de si una muestra contiene moleculas de inmunoglobulina que tienen una afinidad por un farmaco dado (o alergeno) puede realizarse poniendo en practica la presente invencion. Ademas, puede realizarse la deteccion simultanea de una alergia a mas de un farmaco (o sensibilidad a mas de un alergeno) en la presente invencion usando diferentes tipos de perlas o partfculas detectables, con cada tipo recubierto con un farmaco diferente (o alergeno). Puede usarse un unico tipo de partfcula (o perla) como partfcula de control para todos los ensayos de alergia a farmacos (sensibilidad a alergenos) si la partfcula es igual en tamano y composicion que las partfculas recubiertas. Si fuera necesario, puede usarse mas de un tipo de partfcula de control coincidiendo el tamano de la partfcula de control con el tamano de las partfculas recubiertas con farmaco o alergeno con las que se esta comparando.
En algunas realizaciones, despues de la segunda incubacion (la que contiene el ligando marcado) el metodo incluye la etapa de anadir un ftquido que no contiene marcador a la muestra que contiene marcador no unido distribuida dentro de la camara, dejando de ese modo principalmente el marcador fijado a las perlas o estructuras inmovilizadas. La separacion virtual del unido del libre se realiza posteriormente como se ha indicado previamente, pero la retirada del ftquido que contiene el marcador puede servir para aumentar la sensibilidad del ensayo a expensas de la complejidad. Como la capacidad total de la camara y la cantidad de ftquido en la camara esta en el intervalo de menos de uno a varios microlitros, la adicion de un fluido sin marcador a la camara en un volumen sustancial (por ejemplo, decenas de microlitros) retirara la mayor parte del fluido que contiene marcador y la senal restante de marcador libre se retirara por la utilizacion del proceso de separacion virtual del unido del libre.
La metodologfa descrita anteriormente proporciona una tecnica novedosa y deseable para determinar la cantidad de analito diana marcado unido y libre dentro de areas de una camara que contiene ligandos o estan libres de ligandos espedficos para ese analito diana dentro de una muestra, y de ese modo proporciona informacion cualitativa y cuantitativa respecto a la muestra. En algunos casos, la informacion cualitativa, tal como saber si el analito diana esta presente o ausente en la muestra, es suficiente informacion para el analisis disponible. Un ejemplo de dicho caso es la determinacion de si una muestra tiene una IgE espedfica dirigida contra un farmaco dado, cuando la ausencia de dicha IgE es el estado normal. Si se desea mas informacion cuantitativa (por ejemplo, la concentracion
del analito diana en la muestra), la informacion de unido/libre obtenida puede usarse con una curva patron, que es una curva que se obtiene empmcamente para el analito diana particular y la muestra que se esta considerando, para determina la informacion cuantitativa; por ejemplo, la cantidad de analito diana dentro de la muestra. Las curvas patron funcionales a usarse con todos los tipos de inmunoensayos son conocidas y la presente invencion no esta 5 limitada a ninguna curva patron particular. Las curvas de muestra pueden realizarse antes de o de forma concurrente con el ensayo y los resultados pueden almacenarse en el instrumento que realiza el analisis.
Aunque la invencion se ha mostrado y descrito con respecto a realizaciones detalladas espedficas de la misma, los expertos en la materia entenderan que pueden hacerse diversos cambios en la forma y detalle de la misma sin 10 alejarse del alcance de la invencion.
Claims (8)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un metodo para realizar un inmunoensayo de analito diana de una muestra de fluido (20) que reside de forma quiescente en una camara, que comprende las etapas dedistribuir la muestra de fluido dentro de la camara;proporcionar un marcador detectable dentro de la muestra (20), que es un marcador funcional para unirse al analito diana para producir analito diana marcado (22), que es el analito diana marcado (22) detectable en la muestra (20);proporcionar al menos una primera area superficial (17) dentro de la camara que es la primera area superficial (17) que tiene ligandos espedficos de analito diana (19) fijados a la misma, que son ligandos espedficos de analito diana (19) funcionales para unir selectivamente el analito diana presente en la muestra a la primera area superficial (17);proporcionar al menos una segunda area superficial (18) en la camara que esta libre de ligandos espedficos de analito diana (19) funcionales para unir selectivamente el analito diana presente en la muestra a la segunda area superficial (18), en el que la camara tiene al menos una pared, y la al menos una primera area superficial (17) y la al menos una segunda area superficial (18) estan dispuestas sobre la al menos una pared;explorar opticamente la al menos una primera area superficial (17) para detectar y registrar una distribucion de intensidad promedio de la serial del marcador por pixel del analito diana marcado (22) en la al menos una primera area superficial (17);explorar opticamente la al menos una segunda area superficial (18) para detectar y registrar una distribucion de intensidad promedio de la serial del marcador por pixel del analito diana marcado (22) en la al menos una segunda area superficial (18); ydeterminar al menos uno de una cantidad de analito diana marcado (22) en la al menos una primera area superficial (17), una cantidad de analito diana marcado (22) en la al menos una segunda area superficial (18), y una relacion de analito diana marcado (22).
- 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha camara tiene una altura de 1 a 200 pm.
- 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra de fluido (20) es sangre completa.
- 4. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la etapa de determinar una cantidad total del analito diana en la muestra de fluido usando una cantidad total determinada de analito diana marcado (22) dentro de la primera area superficial (17) de la camara y una cantidad total determinada de analito diana marcado (22) en la segunda area (18) de la camara.
- 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que la etapa de determinar la cantidad total del analito diana en la muestra de fluido usa una curva patron.
- 6. El metodo de la reivindicacion 4, que comprende adicionalmente la etapa de determinar una cantidad total de analito diana unido (23) en la muestra de fluido usando la cantidad total determinada de analito diana marcado (22) en la muestra de fluido, y la cantidad total determinada de analito diana marcado (22) en la segunda area (18) de la camara.
- 7. Un metodo para realizar un inmunoensayo de analito diana de una muestra de fluido (20) que reside de forma quiescente en una camara, que comprende las etapas de:distribuir la muestra de fluido (20) dentro de la camara;proporcionar dentro de la muestra (20) un marcador detectable fijado a un primer ligando, que es el primer ligando espedfico para un epftopo del analito diana, que es el primer ligando funcional para unirse al analito diana (22) para producir ligando de analito diana marcado, que es el ligando de analito diana marcado (22) detectable en la muestra;proporcionar una pluralidad de primeras areas superficiales dentro de la camara, que tienen las primeras areas superficiales segundos ligandos espedficos del analito diana fijados a las mismas, que son segundos ligandos espedficos de analito diana funcionales para unir selectivamente el analito diana presente en la muestra a las primeras areas superficiales, en el que las primeras areas superficiales estan distribuidas sobre primeras partfculas, y las primeras partfculas son un primer tipo de partfcula recubierta con un primer farmaco;proporcionar una pluralidad de segundas areas superficiales en la camara que estan libres de segundos ligandos espedficos de analito diana funcionales para unir selectivamente el analito diana presente en la muestra a lasegunda area superficial, en el que las segundas areas superficiales estan distribuidas sobre segundas partfculas, que son segundas partfculas del primer tipo y libres de recubrimiento con farmaco;explorar opticamente las primeras areas superficiales para detectar y registrar una distribucion de intensidad 5 promedio de la senal del marcador por p^xel del ligando de analito diana marcado (22) en las primeras areassuperficiales;explorar opticamente las segundas areas superficiales para detectar y registrar una distribucion de la intensidad promedio de la senal del marcador por pixel del ligando de analito diana marcado (22) en las segundas areas 10 superficiales; ydeterminar al menos uno de una cantidad del ligando de analito diana marcado (22) en las primeras areas superficiales, una cantidad de ligando de analito diana marcado (22) en las segundas areas superficiales, y una relacion del ligando de analito diana marcado (22) en las primeras (17) y segundas (18) areas superficiales.15
- 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el analito diana es una inmunoglobulina de un subtipo dado.
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