ES2602978T3 - Formas novedosas de éster metílico de CDDO - Google Patents

Abstract

2-ciano-3,12-dioxoleana-1,9(11)-dien-28-oato de metilo (éster metílico de CDDO) anhidro, cristalino, caracterizado por que su difractograma de rayos X de polvo comprende picos a 8,78º 2θ, 12,94 2θ, 13,35° 2θ, 14,18° 2θ, y 17,4° 2θ ± 0,2° 2θ basado en los datos recogidos en un difractómetro con radiación Kα de Cu.

Description

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DESCRIPCION

Formas novedosas de ester metilico de CDDO Referencia cruzada a solicitudes de patente relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional estadounidense 60/955.939, presentada el 15 de agosto de 2007.

Antecedentes de la invencion

Los triterpenoides se biosintetizan en plantas mediante la ciclacion de escualeno. Aunque son candidatas para uso medicinal, estas moleculas que se producen de manera natural presentan una actividad biologica relativamente debil. Por consiguiente, los qmmicos han tratado de sintetizar analogos de potencia aumentada (Honda et al., 1997 & 1998).

Se notifican varios analogos sinteticos para suprimir la formacion de novo de iNOS y COX-2 en macrofagos que se han estimulado mediante IFN-H o LPS (Suh et al., 1998; Honda et al., 2002). Otro triterpenoide sintetico, 2-ciano- 3,12-dioxolean-1,9(11)-dien-28-oato (CDDO), presenta actividad antiinflamatoria y antiproliferativa (Honda et al., 1998 & 2000).

El estudio del ester metilico de CDDO, que es 2-ciano-3,12-dioxoleana-1,9(11)-dien-28-oato de metilo (ester metflico de CDDO), Bore et al. (2002) determino una estructura cristalina. En esa forma, que esta hidratada, el agua coordina interacciones que generan una estructura y un empaquetamiento cristalinos particulares.

Sumario de la invencion

En una realizacion de la presente invencion, se proporciona una forma cristalina anhidra de 2-ciano-3,12-dioxoleana- 1,9(11)-dien-28-oato de metilo (ester metilico de CDDO),caracterizada por que su difractograma de rayos X de polvo comprende picos a 8,78° 20, 12,94 20, 13,35° 20, 14,18° 20, y 17,4° 20 ± 0,2° 20 basado en los datos recogidos en un difractometro con radiacion Ka de Cu. La forma cristalina no hidratada tiene preferiblemente un grupo espacial de P43 212 con dimensiones de la celda unidad de a = 14,2 A, b = 14,2 Ay c = 81,6 A. La invencion tambien contempla una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de la forma cristalina anhidra de ester metflico de CDDO y uno o mas vehfculos farmaceuticamente aceptables. Otra realizacion de la presente invencion es un hemobencenato ester metflico de CDDO cristalino, caracterizado por que su difractograma de rayos X de polvo comprende picos a 9,25° 20, 14,17° 20, 14,62° 20, 16,32° 20, y 17,11° 20 ±0,2° 20 basado en los datos recogidos en un difractometro con radiacion Ka de cobre.

Adicionalmente, la presente divulgacion incluye una forma solida vftrea de ester metflico de CDDO, que tiene un espectro de difraccion de rayos X de polvo con un pico de halo a aproximadamente 13,5° de 2D, tal como se muestra en la figura 2C, y una temperatura de transicion vftrea (Tg). En realizaciones particulares de la presente divulgacion, la Tg puede oscilar entre aproximadamente 120°C y aproximadamente 135°C. En otras realizaciones, la Tg oscila entre aproximadamente 125°C y aproximadamente 130°C. La forma solida vftrea de ester metflico de CDDO puede tener un espectro de PDF con picos similares a los de la figura 28 de desde aproximadamente 5 A hasta aprox 20 A.

Ademas, la invencion proporciona una composicion farmaceutica en forma de dosificacion solida, que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de una forma solida vftrea de ester metflico de CDDO con (ii) un vehnculo comestible. A este respecto, una aplicacion de la invencion es una metodologfa para tratar un paciente con cancer, que comprende: administrar una composicion farmaceutica de este tipo a un paciente con cancer. Una aplicacion de la invencion tambien contempla administrar la forma vftrea de ester metflico de CDDO en combinacion con otro farmaco anticancengeno. Por ejemplo, el farmaco anticancengeno puede ser gemcitabina y el cancer puede ser cancer de pancreas. Una aplicacion de la invencion engloba tambien una metodologfa para el tratamiento de enfermedades o trastornos que implican inflamacion y estres oxidativo agudos o cronicos, particularmente los que se caracterizan en parte por la sobreexpresion de oxido nftrico sintasa inducible (iNOS) o ciclooxigenasa inducible (COX-2).

Ademas, la presente divulgacion se centra en una forma de solvato de dimetanol de ester metflico de CDDO, que tiene un espectro de difraccion de rayos X de polvo con picos caractensticos tal como se muestra en la tabla 18 y un espectro de DSC tal como se muestra en la figura 24. De conformidad con la invencion, la forma de solvato de dimetanol puede usarse como producto intermedio para la produccion de una forma solida vftrea de ester metflico de CDDO. Un metodo para la produccion de la forma solida vftrea de ester metflico de CDDO, a traves de la forma de solvato de dimetanol, comprende preparar una forma de solvato de dimetanol de ester metflico de CDDO y secar la forma de solvato de dimetanol.

Segun otra realizacion, la presente divulgacion se centra en un metodo de crecimiento de un cristal de dimetanolato de ester metflico de CDDo, que comprende preparar una disolucion de ester metflico de CDDO purificado en metanol anhidro caliente, anadir la disolucion caliente a un recipiente de metanol enfriado, y fitrar los cristales

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resultantes.

Segun otra realizacion, la presente divulgacion se centra en una composicion farmaceutica que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de ester metflico de CDDO y (ii) un excipiente que es un formador de vidrio, de manera que la composicion tiene una Tg.

El excipiente puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en (A) un hidrato de carbono, derivado de hidrato de carbono, o polfmero de hidrato de carbono, (B) un polfmero organico sintetico, (C) una sal de acido organico, (D) una protema, un polipeptido, o peptido, y (E) un polisacarido de alto peso molecular. Son ilustrativos de la clase de excipientes de polfmero organico sintetico una hidroxipropil-metilcelulosa, tal como ester de ftalato de hidroxipropil-metilcelulosa, un poli[1-(2-oxo-1-pirrolidinil)etileno o copolfmero del mismo, tal como PVP/VA, y un copoKmero de acido metacnlico, tal como copolfmero de acido metacnlico- acrilato de etilo (1:1).

Otro excipiente a modo de ejemplo a este respecto es copovidona, que es copolfmero de 1 -vinil-2-pirrolidona - acetato de vinilo (3:2).

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 representa la estructura qmmica del ester metilico de CDDO.

La figura 2 presenta el espectro de XRPD de la forma A (parte superior) y la forma B (parte inferior). De arriba hacia abajo parte superior a parte inferior: forma A no micronizada; forma A micronizada; y forma B.

La figura 3 muestra la curva de DSC y TG del ester metilico de CDDO (forma A).

La figura 4 muestra en analisis en platina caliente de la forma A - no micronizada.

La figura 5 muestra la isoterma de sorcion dinamica de vapor de la forma A - no micronizada.

La figura 6 muestra las imagenes de SEM de la forma A -no micronizada.

La figura 7 muestra la forma A antes (parte superior) y despues (parte inferior) de estres a 195°C.

La figura 8 muestra el espectro de RMN de la forma A - no micronizada.

La figura 9 muestra la curva de MDSC de la forma B de ester metilico de CDDO.

La figura 10 muestra la forma B de ester metilico de CDDO antes (parte superior) y despues (parte inferior) de estres termico a 200°C/HR ambiental durante 60 minutos.

La figura 11 muestra el espectro de RMN de la forma B de ester metilico de CDDO.

La figura 12 muestra un dibujo de ORTEP de una molecula individual de la forma A con marcaje. Se representan los atomos mediante elipsoides termicos anisotropicos de una probabilidad del 50%.

La figura 13 muestra un dibujo de ORTEP del contenido de la unidad asimetrica de los cristales de la forma A. Se representan los atomos mediante elipsoides termicos anisotropicos de una probabilidad del 50%.

La figura 14 muestra un diagrama de empaquetamiento de los cristales de la forma A observados a lo largo del eje a cristalografico.

La figura 15 muestra un diagrama de empaquetamiento de los cristales de la forma A observados a lo largo del eje b cristalografico.

La figura 16 muestra un diagrama de empaquetamiento de los cristales de la forma A observados a lo largo del eje c cristalografico.

La figura 17 muestra el espectro de polvo de rayos X calculado de la forma A La figura 18 muestra el XRPD experimental de la forma A.

La figura 19 presenta una comparacion de los espectros de XRPD calculado y experimental para la forma A de ester metilico de CDDO.

La figura 20 muestra un grafico representativo del area bajo la curva para la forma Ay la forma B, tras una administracion oral de 4,1 mg/kg a monos macacos. Cada punto de dato representa la concentracion en plasma media de ester metilico de CDDO en 8 animales. Las barras de error representan la desviacion estandar dentro de la poblacion de la que se tomaron muestras.

La figura 21 muestra una comparacion de la concentracion en plasma de la forma B de ester metflico de CDDO

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frente a la forma A en el animal 505M (panel superior) y el animal n.° 507F (panel inferior).

La figura 22 presenta una comparacion de la concentracion en plasma de la forma B de ester metilico de CDDO frente a la forma A entre el animal n.° 508F (panel superior) y el animal n.° 502M (panel inferior).

La figura 23 representa termogramas de solvato de hemibenceno de ester metilico de CDDO.

La figura 24 muestra termogramas de solvato de dimetanol de ester metflico de CDDO.

La figura 25 representa datos de TGIR relativos al solvato de dimetanol de ester metflico de CDDO.

La figura 26 presenta espectros de XRPD de solvato de dimetanol de ester metflico de CDDO, antes (parte superior) y despues (parte inferior) de analisis TGIR (hasta 140°C).

La figura 27 es una representacion de superposicion de datos de PDF para la forma A frente a la forma B. El orden local es similar desde aproximadamente 5 A hasta aproximadamente 20A.

La figura 28 es una representacion de superposicion de espectros amorfos de rayos X para diferentes preparaciones de la forma B, que muestran una uniformidad sustancial entre las preparaciones.

La figura 29 es una representacion esquematica del grupo espacial P432i2 (n.° 96).

La figura 30 muestra las concentraciones en sangre medias de ester metflico de CDDO tras administraciones orales unicas de capsulas de ester metflico de CDDO a monos macacos macho (fases 2 y 3).

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

Tal como se indico, el estudio de los triterpenoides como supresores de la actividad de iNOS, y espedficamente en la inhibicion de la produccion de NO, ha demostrado la alta potencia de CDDO y ester metflico de CDDO (CI50 < nivel de 1 nM). Vease Honda et al. (2000). Estos estudios se centraron en el ester metflico de CDDO solubilizado, proporcionando una escasa caracterizacion de un solido de ester metflico de CDDO. El trabajo de Bore et al. (2002) elucido una estructura, la primera publicada para un triterpenoide, de una forma cristalina solvatada, individual de ester metilico de CDDO.

Para darse cuenta del potencial terapeutico del ester metflico de CDDO, representado en la figura 1 (estructura qmmica) y en la figura 12 (dibujo de ORTEP), los presentes inventores investigaron otras formas del compuesto que presentaban propiedades, tales como mayor solubilidad en agua y estabilidad qmmica, que son ventajosas para el desarrollo de una especialidad farmaceutica con farmacocinetica adecuada. Por consiguiente, los inventores descubrieron dos formas de ester metflico de CDDO, distintas de la forma cristalina elucidada por Bore et al. (2002), que tienen tales propiedades, y por tanto, son candidatos para el desarrollo de farmacos por derecho propio.

“La forma A” inventiva de ester metflico de CDDO no esta solvatada (no hidratada) y se caracteriza por una estructura cristalina distintiva, con un grupo espacial de P43 2i2 (n.°96), mostrada en la figura 29, dimensiones de la celda unidad de a = 14,2 A, b = 14,2 Ay c = 81,6 A, y por una estructura de empaquetamiento, representada en las figuras 14-16, mediante lo cual se empaquetan tres moleculas de modo helicoidal a lo largo del eje b cristalografico. La tabla 10 a continuacion enumera datos cristalinos adicionales para la forma A, junto con datos cristalograficos- parametros de recogida.

La otra “forma B” de la invencion esta en una monofase pero carece de una estructura cristalina definida de ese tipo. Mas bien, la forma B se tipifica mediante un espectro de difraccion de rayos X de polvo (XRPD) que difiere del de la forma A (vease la figura 2, entre otros). Ademas, la forma B presenta una biodisponibilidad que es sorprendentemente mejor que la de la forma A (vease el ejemplo 7).

Se ha publicado la metodologfa para la smtesis de ester metflico de CDDO. Veanse la patente estadounidense n.° 6.326.507, Honda et al. (1998), y Honda et al. (2000). Los inventores han descubierto que tanto la forma A como la forma B de ester metilico de CDDO se preparan facilmente a partir de una variedad de disoluciones del compuesto, ilustradas por las detalladas en la tabla 3-5, mas adelante. En particular, la forma B puede prepararse mediante evaporacion rapida o evaporacion lenta en MTBE, THF, tolueno o acetato de etilo. De igual modo, la forma A puede prepararse a traves de evaporacion rapida, evaporacion lenta o enfriamiento lento de una disolucion de ester metilico de CDDO en etanol o metanol. Las preparaciones de ester metilico de CDDO en acetona pueden producir o bien la forma A, usando evaporacion rapida, o la forma B, usando evaporacion lenta. A continuacion se describen metodos de preparacion adicionales, incluyendo las tablas proporcionadas en los mismos.

Puesto que no tiene una estructura cristalina definida, la forma B carece asimismo de picos de XRPD diferenciados, tales como los que tipifican la forma A, y en su lugar se caracteriza por un espectro de XRPD de “halo” general. En particular, la forma B no cristalina se clasifican en la categona de solidos “amorfos en rayos X” debido a que su espectro de XRPD presenta tres o menos halos de difraccion primarios (vease la figura 10, por ejemplo). Dentro de esta categona, la forma B es un material “vftreo”: Tal como se muestra mediante la PDF, las interacciones atomo- atomo de los vecinos mas proximos coinciden con las observadas para la forma A cristalina, pero no se aplica la

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nocion de una celda unidad promedio debido a que no se manifiesta ordenacion a larga distancia.

A diferencia de la forma A, por tanto, las muestras de la forma B no muestran una correlacion molecular a larga distancia, es decir, superior a aproximadamente 20 A (vease la figura 27). Ademas, el analisis termico de las muestras de la forma B revela una temperatura de transicion vftrea (Tg). En cambio, un material nanocristalino desordenado, no presenta una Tg sino en su lugar solo una temperatura de fusion (Tf), por encima de la cual la estructura cristalina se convierte en un lfquido.

La presente descripcion tambien caracteriza una forma de solvato de dimetanol de ester metflico de CDDO que puede usarse para preparar la forma B (vease el ejemplo 9). Tambien se caracteriza en el presente documento una forma de hemibencenato ester metflico de CDDO (vease el ejemplo 8).

Aunque se ha descubierto que la micronizacion de otros materiales cristalinos afecta los espectros de XRPD, el analisis de XRPD de la forma A micronizada da como resultado un espectro similar al de la forma A no micronizada. Vease la figura 2 para una comparacion de unas junto a otras de la forma A no micronizada, la forma A micronizada y la forma B de ester metflico de CDDO.

Pueden usarse diversos medios de caracterizacion en conjunto para distinguir la forma Ay la forma B de ester metflico de CDDO entre sf y de otras formas de ester metflico de CDDO. Son ilustrativas de las tecnicas adecuadas para este fin la resonancia magnetica nuclear de estado solido (RMN), difraccion de rayos X de polvo, cristalograffa de rayos X, calorimetna diferencial de barrido (DSC dynamic scanning calorimetry), sorcion/desorcion dinamica de vapor (DVS dynamic vapour sorption), analisis de Karl Fischer (KF), microscopfa de platina caliente, calorimetna diferencial de barrido modulada, FT-IR y espectroscopfa Raman.

En particular, el analisis de los datos de XRPD y DSC puede distinguir la forma A, la forma B y formas de hemibencenato de ester metilico de CDDO.

Las propiedades de las formas inventivas de ester metilico de CDDO son tanto distintivas, tal como se menciono anteriormente, como propicias para su uso como agentes farmaceuticos. Por ejemplo, la biodisponibilidad de la forma By la forma A de ester metilico de CDDO variaron en monos cuando los monos recibieron dosificaciones equivalentes de las dos formas por via oral, en capsulas de gelatina. Vease el ejemplo 7. Ademas, la establidad de las formas de ester metilico de CDDO recien identificadas sera util en la produccion de composiciones farmaceuticas. De manera similar a la distincion de la forma Ay la forma B de ester metflico de CDDO entre sf y de otras formas de ester metflico de CDDO, las dispersiones de ester metflico de CDDO que conservan un caracter “amorfo en rayos X”, tal como se describe con mayor detalle a continuacion, pueden distinguirse de dispersiones que contienen la forma A cristalina de ester metflico de CDDO mediante una variedad de tecnicas, incluyendo Analisis de XRPD y DSC. Por tanto, las dispersiones que contienen la forma A cristalina de ester metflico de CDDO presentan normalmente picos diferenciados caractensticos de la forma A pura de ester metflico de CDDO, particularmente los que aparecen a aproximadamente 13,35 y 8,78 (° de 2D) (por ejemplo, vease la tabla 17, mas adelante).

Las propiedades de una dispersion de excipiente de polfmero de ester metilico de CDDO de la invencion son tanto distintivas como propicias para su uso como agentes farmaceuticos. Por ejemplo, la biodisponibilidad de dispersiones seleccionadas de ester metilico de CDDO, formuladas con aditivos inactivos adicionales, vario en monos cuando los monos recibieron dosificaciones equivalentes de las dispersiones en capsulas de gelatina. Vease el ejemplo 7, mas adelante, fases del estudio 2 y 3. En varios casos, formulaciones que conteman Dispersiones de excipiente de polfmero de CDDO-metilo produjeron mejoras adicionales sorprendentes en la biodisponibilidad, incluso con relacion a formulaciones producidas a partir de la forma B pura de ester metilico de CDDO.

La presencia de multiples formas, incluyendo polimorfos, en solidos farmaceuticos se ha descrito previamente, por ejemplo, por Cui (2007). Las formas cristalinas y amorfas de un compuesto pueden presentar diferentes caractensticas ffsicas y qrnmicas. Por ejemplo, las formas amorfas pueden tener mayor solubilidad con relacion a la forma cristalina. Sin embargo, cada compuesto es unico a este respecto, y el grado en que un material amorfo diferira del estado cristalino debe investigarse en cada caso y no puede predecirse a priori. Ademas, algunos materiales amorfos se prestan a recristalizacion.

En el presente contexto, puede surgir variabilidad en la recogida de datos debido a una pluralidad de factores. Por consiguiente, esta descripcion usa los terminos “aproximadamente” o “de manera aproximada” para indicar variaciones en los datos usados para describir las formas de ester metflico de CDDO. Por ejemplo, una temperatura de fusion puede variar basandose en la instrumentacion o las condiciones. Con respecto a la precision de la medicion, la USP <891> establece que “En el caso de la fusion, pueden determinarse tanto una temperatura de “inicio” como una “maxima” de manera objetiva y reproducible, a menudo con un margen de unas pocas decenas de grado.” La experiencia practica indica que esto no es cierto para medir la Tg de un material. La Tg dependera de muchos factores: como se preparo la muestra, la historia termica de la muestra (relajacion), disolvente residual que puede volatilizarse o no antes de la Tg, el instrumento, la preparacion de muestras (masa de muestra, tamano de partfcula, empaquetamiento, diluyentes), los parametros usados para medir la Tg (particularmente, la velocidad de barrido), los parametros usados para determinar la ubicacion de la Tg (temperatura de inicio, temperatura de punto medio, temperatura de punto de inflexion o temperatura de desviacion), si esta presente una endoterma de

relajacion a Tg, y otros factores. Algunos factores disminuiran la Tg (plastificacion debida a disolvente/agua residual), mientras que otros aumentaran la Tg (velocidad de barrido mas rapida, relajacion) y pueden hacerlo en tanto como 10-15°C. El cambio en la capacidad calonfica a Tg (DCp) puede ser importante, tal como notificaron Zhou et al., J. Pharmaceutical Sciences 91: 1863-72 (2002).

5 La presente descripcion comenta diferentes espectros en cuanto a sus picos “caractensticos”. La coleccion o el grupo de tales picos es unico para una forma polimorfica dada, dentro de la incertidumbre que puede atribuirse a los instrumentos individuales y a las condiciones experimentales, respectivamente.

Para cada una de las formas cristalinas, se enumera un grupo de cinco picos caractensticos en las tablas 17-19, a continuacion. La variacion tfpica puede ser de + 0,1° de 2D, pero la posicion de pico puede variar hasta + 0,2° de 20 10 o mas en algunos experimentos.

Tabla 17 - Forma A Posicion de pico (° de 20) 13,35 8,78 17,4 12,94 14,18

Tabla 18 - Dimetanolato Posicion de pico (° de 20) 8,87 11,26 16,63 16,9 13,72

15 Tabla 19 - Hemibencenato

Posicion de pico (° de 20) 14,17 9,25 16,32 14,62 17,11

El espectro de XRPD del material vftreo (forma B) muestra un pico de halo ancho a aproximadamente 13,5° de 2D, que parecer ser caractenstico de la forma B. Otros halos no estan tan bien definidos, y la forma/posicion de este espectro puede cambiar en funcion del instrumento y las condiciones experimentales. La variacion en la posicion de 20 este pico ancho sera mayor que la de los picos caractensticos de las formas cristalinas respectivamente. En particular, puede esperarse una variabilidad de hasta + 1° de 2D para el pico ancho de la forma B en determinados instrumentos.

El espectro de XRPD de materiales vttreos producidos como dispersiones de excipiente de ester metflico de CDDO tambien muestran un pico de halo ancho, normalmente centrado a aproximadamente 13,5° de 2D. Estos materiales 25 presentan asimismo una Tg mediante calorimetna diferencial de barrido modulada (mDSC). De manera similar a las

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muestras de la forma B pura de ester metflico de CDDO, la forma y posicion del espectro de XRPD para una dispersion de excipiente puede cambiar en funcion del instrumento usado, las condiciones experimentales y el excipiente espedfico empleado para producir las dispersiones.

La presente invencion se refiere ademas a dispersiones de excipiente de la forma A, la forma B, y vftrea, amorfa en XRPD de ester metilico de CDDO, respectivamente, para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con inflamacion, incluyendo un estado canceroso y diversas patologfas que afectan al sistema nervioso central. Una aplicacion de la invencion incluye el tratamiento de estas enfermedades, comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de las formas novedosas de ester metflico de CDDO enumeradas en el presente documento. Estos compuestos tienen utilidad para mejorar o prevenir la inflamacion implicada en la etiologfa del cancer, la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis multiple (EM), esclerosis lateral amiotrofica (ELA), artritis reumatoide (AR) y otras enfermedades autoinmunitarias, enfermedad inflamatoria del intestino, y otros estados patologicos relacionados con la produccion excesiva o bien de oxido mtrico o bien de prostaglandinas.

Tal como se indico previamente, la expresion aberrante o excesiva o bien de ciclooxigenasa-2 (COX-2) o bien de oxido mtrico sintasa inducible (iNOS) se ha implicado en la patogenesis de muchos procesos patologicos, incluyendo carcinogenesis en el colon. Se ha notificado que varios analogos sinteticos de triterpenoides, incluyendo ester metflico de CDDO, suprimen la expresion de iNOS. Estudios relacionados han mostrado que la supresion de triterpenoides tanto de la expresion de iNOS como de COX-2 en macrofagos que se han estimulado mediante IFN-y o LPS (Suh et al., 1998; Honda et al., 2002). Por tanto, se espera que los tratamientos que administran formas de ester metilico de CDDO afecten la supresion de iNOS y COX-2.

La sobreexpresion del gen para COX-2 es un acontecimiento temprano y central en la carcinogenesis del colon (Prescott y White, 1996; Dubois et al., 1996). Los ratones con defectos en el gen de APC (poliposis adenomatosa colonica) desarrollan altos numeros de polipos intestinales a una edad temprana, y se han encontrado elevaciones notables en los niveles de la enzima COX-2 en estos polipos. Estos hallazgos en animales se correlacionan con el hallazgo de niveles elevados de protema y ARNm de cOX-2 en muchos canceres de colon primarios humanos y lmeas celulares de cancer de colon (Prescott y White, 1996), y se cree que esta elevacion en COX-2 conduce a una supresion de la apoptosis, que conducina habitualmente a la muerte de celulas pre-neoplasicas (Tsujii y DuBois, 1996). Se ha demostrado la relevancia funcional de COX-2 para la tumorigenesis intestinal mediante la desactivacion del gen de COX-2 (Oshima et al., 1996). Se aparearon ratones que portaban esta desactivacion con ratones formadores de polipos que portaban lesiones en el gen de APC; la desactivacion de COX-2 provoco una disminucion drastica en el numero de polipos en la descendencia. Ademas, se ha notificado que el tratamiento de animales de experimetancion o bien con inhibidores selectivos de COX-2 o bien con inhibidores no selectivos de COX-1/COX-2 es un enfoque potente para la quimioprevencion del cancer intestinal (Marnett, 1992; Oshima et al., 1996; Boolbol et al., 1996; Reddy et al., 1996; Sheng et al., 1997). En cuanto al papel de iNOS en la carcinogenesis, esta claro que NO es un mutageno potente (Tamir y Tannebaum, 1996), y que el oxido mtrico tambien puede activar COX-2 (Salvemini et al., 1993, 1994). Tambien existe un aumento notable en iNOS en tumores de colon de rata inducidos por el carcinogeno, azoximetano (Takahashi et al., 1997). De manera similar, se ha notificado la sobreexpresion de iNOS en tumores humanos como un factor de pronostico negativo (por ejemplo, Ekemekcioglu et al., 2006).

Las rutas de senalizacion inflamatorias y otras rutas de senalizacion asociadas con enfermedad, tal como se inducen por angiotensina II, estimulan frecuentemente la produccion excesiva de especies reactivas de oxfgeno o nitrogeno (RONS), incluyendo superoxido, peroxido de hidrogeno, oxido mtrico y peroxinitrito. Se ha mostrado que el ester metilico de CDDO es un potente inductor de actividad antioxidante y un potente inhibidor de procesos inflamatorios en muchos tipos celulares diferentes (Dinkova-Kostova et al., 2005; Liby et al., 2006; Ahmad et al., 2006; Shishodia et al., 2006). La inflamacion aguda, grave debida a una variedad de causas incluyendo infeccion, traumatismo, quemaduras y exposicion qmmica puede ser potencialmente mortal y puede provocar insuficiencia hepatica, insuficiencia renal, insuficiencia respiratoria o insuficiencia cardiaca. La inflamacion cronica y el estres oxidativo asociado contribuyen a la patologfa de muchas enfermedades importantes incluyendo enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus, soriasis y esclerosis multiple), enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis e insuficiencia cardiaca), diabetes (tipo I y tipo II), enfermedades respiratorias (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva cronica y asma), enfermedad renal cronica, insuficiencia renal, insuficiencia hepatica y smdromes de dolor (por ejemplo, dolor neuropatico, fibromialgia y migrana). Ademas, se ha mostrado que los triterpenoides inhiben la replicacion de VIH-1 en macrofagos (Vazquez et al., 2005) y asf pueden ser utiles en el tratamiento de enfermedades virales, particularmente aquellas en las que se produce una morbilidad significativa por inflamacion de un organo o tejido (por ejemplo, hepatitis viral, gripe, herpes simple).

Se sabe que la EM es un estado inflamatorio del sistema nervioso central (Williams, Ulvestad y Hickey, 1994; Merrill y Beneviste, 1996; Genain y Nauser, 1997). Pueden estar implicados mecanismos inflamatorios, oxidativos o inmunitarios en la patogenesis de EM, EA, EP y ELA (Bagasra et al., 1995; Griffin et al., 1995; McGeer y McGeer, 1995; Good et al., 1996; Simonian y Coyle, 1996; Kaltschmidt et al., 1997). Se han implicado tanto los astrocitos reactivos como la microglia activada en la causalidad de NDD/NID; ha habido un enfasis particular en la microglia como celulas que sintetizan tanto NO como prostaglandinas como productos de las respectivas enzimas, iNOS y

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COX-2. La formacion de novo de estas enzimas puede estar dirigida por citocinas inflamatorias tales como interferon-gamma o interleucina-1. A su vez, la produccion excesiva de NO puede conducir a cascadas inflamatorias y/o a dano oxidativo en las celulas y tejidos de muchos organos, incluyendo neuronas y oligodendrocitos del sistema nervioso, con las consiguientes manifestaciones en EA y EM, y posiblemente EP y ELA (Coyle y Puttfarcken, 1993; Goodwin et al., 1995; Beal, 1996; Good et al., 1996; Merrill y Benvenist, 1996; Simonian y Coyle, 1996; Vodovotz et al., 1996). Los datos epidemiologicos indican que el uso cronico de AINE, que bloquean la smtesis de prostaglandinas a partir de araquidonato, disminuye notablemente el riesgo de desarrollo de EA (McGeer et al., 1996; Stewart et al., 1997). Por consiguiente, la forma Ay la forma B de ester metilico de CDDO, como agentes que bloquean la formacion de NO y prostaglandinas, deben ser utiles en enfoques terapeuticos para tratar o prevenir NDD.

Tal como se describio anteriormente, en una variedad de estudios preclmicos CDDO-Me ha demostrado una capacidad para inhibir la expresion de COX-2 y iNOS, enzimas asociadas tanto con inflamacion como con carcinogenesis. Tambien se mostro que CDDO-Me inhibe la activacion del factor nuclear-kappa B (NF-KB) y el transductos de senales y activador de la transcripcion 3 (STAT3), factores de transcripcion asociados con inflamacion, progresion tumoral y resistencia tumoral a la terapia. Los estudios iniciales evidenciaron que CDDO-Me inhibio el crecimiento de muchas lmeas celulares de cancer; el valor de CI50 promedio para CDDO-Me en el panel de lmeas celulares tumorales de NCI-60 fue de aproximadamente 35 nM. Estudios in vivo confirmaron que CDDO-Me inhibio eficazmente el crecimiento de tumores formados por lmeas celulares tumorales humanas implantadas en roedores o lmeas celulares cancerosas singenicas implantadas en roedores (tabla 16). Las dosis usadas en estos estudios estuvieron generalmente en el intervalo de 10 a 100 mg/kg/dfa, dependiendo de la especie, raza y metodo de administracion.

Los estudios detallados a continuacion proporcionan datos de seres humanos que reflejan el efecto beneficioso del ester metilico de CDDO en pacientes que presentan un estado canceroso. Vease el ejemplo 10.

A la luz de lo anterior, la presente invencion engloba formas de dosificacion estables, de liberacion controlada que contienen una forma de ester metilico de CDDO. Una forma de dosificacion de la invencion puede ser para la administracion una vez al dfa, para liberacion retardada o para liberacion pulsatil, para optimizar de ese modo la terapia haciendo coincidir el rendimiento farmacocinetico con los requisitos farmacodinamicos.

Puede administrarse por via oral cualquiera de la forma B, la forma A, y formulaciones que contienen dipersiones de excipiente de ester metilico de CDDO. El compuesto activo puede recubrirse en un material para proteger el compuesto frente a la accion de acidos y otras condiciones naturales que puede inactivar el compuesto. Otros modos de administracion, tales como topico, subcutaneo, intravenoso e intraperitoneal tambien son parte de la presente invencion.

Para administrar el compuesto terapeutico, puede ser necesario recubrir el compuesto con o coadministrar el compuesto con un material para impedir su inactivacion. Por tanto, puede administrarse o bien la forma B o bien la forma A de ester metilico de CDDO a un sujeto en un vehmulo apropiado, tal como liposomas, o en un diluyente. Los diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen solucion salina y disoluciones tampon acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua asf como liposomas convencionales. Vease, por ejemplo, Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7: 27(1984).

El compuesto terapeutico puede administrarse por via oral, con aditivos, diluyentes inertes o un vehmulo comestible, para formar una composicion farmaceutica. Para ello, el compuesto terapeutico de la invencion, con otros componentes, puede encerrarse en una capsula de gelatina dura o blanda, someterse a compresion para dar comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administracion terapeutica oral, la forma A o la forma B pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos comestibles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. De manera similar, una dispersion de excipiente de la presente invencion puede presentarse en una variedad de tipos de forma de dosificacion, incluyendo los descritos en el presente documento para la forma A o la forma B. El porcentaje del compuesto terapeutico en las composiciones y preparaciones puede variarse, segun la practica convencional, para efectuar una dosificacion adecuada del principio activo.

Adicionalmente, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de la forma B de ester metflico de CDDO o la forma A, en asociacion con uno o mas vehmulos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables, no toxicos y, si se desea, otros principios activos. Tal como se indico anteriormente, el compuesto activo puede producirse como una dispersion homogenea de excipiente, partiendo o bien de la forma B o bien de la forma A. Una dispersion de excipiente de ester metflico de CDDO de este tipo es una disolucion solida y puede verse como una dispersion homogenea a nivel molecular. Tales dispersiones pueden formularse ventajosamente junto con otros aditivos farmaceuticamente aceptables, para estabilizar el compuesto activo y, en algunos casos, para proporcionar mejoras adicionales en la biodisponibilidad.

En la formulacion del ester metflico de CDDO como una dispersion de excipiente, la eleccion de un excipiente para la dispersion esta guiada por los criterios de que el excipiente sea tanto un buen “formador de vidrio” como farmaceuticamente aceptable. Mas generalmente, el excipiente debe formar una matriz vftrea homogenea, estable,

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que estabilice la dispersion proporcionando una Tg que es superior a las condiciones de almacenamiento tfpicas a la temperature ambiental. Un criterio adicional a este respecto es que el excipiente usado para la dispersion debe ser qmmicamente compatible con otros aditivos, tales como aglutinantes, cargas, lubricantes, deslizantes, y similares, que pueden emplearse en la formulacion final para conferir las propiedades funcionales deseadas.

Para satisfacer estos criterios, puede seleccionarse un excipiente, de conformidad con la invencion, a partir de varios compuestos caracterizados por valores de Tg adecuadamente altos, tales como (A) hidratos de carbono, derivados de hidratos de carbono y poftmeros de hidrato de carbono, (B) poftmeros organicos sinteticos, (C) sales de acidos organicos, (D) protemas, polipeptidos y peptidos, y (E) polisacaridos de alto peso molecular tales como heparina que es un polisacarido sulfatado, y acido hialuronico, un mucopolisacarido.

Son ilustrativos de la clase (A): derivados de celulosa, tales como hidroxipropil-celulosa (HPC), hidroxipropil- metilcelulosa (HPMC), y etil-celulosa; polisacaridos, tales como rafinosa, maltotriosa, estaquiosa, dextrinas (incluyendo maltodextrinas y cyclodextrinas, entre otros), dextranos y almidon soluble; alditoles, tales como manitol, xilitol y sorbitol; y disacaridos, tales como lactosa, trehalosa, maltosa, y sacarosa. Un excipiente preferido de esta clase es el ester ftalico de hidroxipropil-metilcelulosa (HPMC-P).

La clase (B) se ejemplifica mediante poli[1-(2-oxo-1-pirrolidinil)etileno, tambien conocido como povidona o polivinilpirrolidona (PVP) y copoftmeros relacionados, tales como PVP/VA, de pesos moleculares variables. Tambien esta incluida en esta clase familia de copoftmeros del acido metacnlico, tales como copoftmero de acido metacnlico tipo C (USP/NF).

La clase (C) se ilustra mediante sales, tales como sales de sodio, potasio, calcio y magnesio, de acido lactico, acido ascorbico, acido maleico, acido oxalico, acido malonico, acido malico, acido succmico, acido cftrico, acido gluconico y acido glutamico, respectivamente. Por tanto, sales representativas a este respecto son citrato de sodio, lactato de sodio, maleato de sodio, gluconato de magnesio y ascorbato de sodio.

Excipientes de la clase (D) a modo de ejemplo son: albumina serica humana; un poliaminoacido, por ejemplo, polialanina, poliarginina, poliglicina y poli(acido glutamico); casema; colageno; gelatina y protemas de gelatina purificadas; y determinados compuestos farmacologicamente activos, tales como insulina.

Los excipientes pueden alterar algunas de las caractensticas ffsicas de las formulaciones farmaceuticas, tal como se indico. Por ejemplo, la dispersion dentro de los diversos excipientes polimericos puede conducir a una reduccion en la Tg observada de la formulacion. Normalmente, la Tg es una propiedad aditiva basada en las proporciones de los materiales implicados. Por consiguiente, cuando se utilizan poftmeros con valores de Tg que son inferiores a los de la forma B amorfa, existen expectativas de una reduccion en la Tg observada para las dispersiones (mezclas). Adicionalmente, a menudo estan presentes trazas de humedad o disolvente organico residual, lo que tiende a reducir tambien la Tg. Para los fines de generar una dispersion solida de CDDO-Me, la eleccion optima del excipiente normalmente debe determinarse empmcamente. Por ejemplo, los intentos de producir dispersiones vftreas, amorfas en XRPD usando la familia de excipientes del polietilenglicol (PEG), tales como PEG 6000, produjeron mezclas que conternan picos caractensticos asociados con la presencia de la forma A de ester metftico de CDDO. Se obtuvieron resultados similares usando vitamina E - TPGS, un excipiente producido esterificando succinato acido de d-alfa- tocoferilo con polietilenglicol 1000, asf como usando copoftmeros de oxido de etileno - oxido de propileno tales como Pluronic®. Como ilustran los ejemplos a continuacion, determinados excipientes polimericos usados para formar dispersiones con CDDO-Me, de conformidad con la invencion, presentan mejoras sorprendentes en la biodisponibilidad oral con relacion al principio activo de la forma B pura.

Pueden variar los metodos para preparar dispersiones homogeneas, vftreas; amorfas en rayos X de CDDO-Me con excipientes farmaceuticamente aceptables, y los ejemplos presentados en el presente documento utilizan secado por pulverizacion para generar tales dispersiones. Pueden usarse otros metodos de fabricacion para producir dispersiones de la invencion con utilidad y propiedades equivalentes. Vease Repka et al., 2002, y la bibliograffa citada en el mismo. Otros metodos de este tipo incluyen evaporacion de disolvente y extrusion, tal como extrusion por fusion en caliente.

Ademas de un excipiente, pueden incluirse otros aditivos para ayudar en la establidad del principio activo, para ajustar el pH (es decir, un agente tamponante), para mejorar la dispersabilidad, para ayudar a proporcionar uniformidad de suministro, y para lograr otras caractensticas deseada para una formulacion farmaceutica.

La cantidad administrada del compuesto o composicion de la presente invencion variara, dependiendo del paciente y el modo de administracion, y puede ser cualquier cantidad eficaz.

Puede desarrollarse un regimen de tratamiento dado para la administracion de una composicion de la presente invencion por medio de pruebas precftnicas y cftnicas normales y rutinarias, cuyos detalles son una funcion de la indicacion terapeutica, entre otros factores. La cantidad del principio activo administrado puede variar en un amplio intervalo, para proporcionar de ese modo, en una dosificacion unitaria, una cantidad farmacologicamente eficaz basada en el peso corporal del paciente al dfa, para lograr el efecto deseado. La dosificacion deseada tambien puede variar segun el estado que este tratandose. Por ejemplo, el tratamiento de cancer agudo puede requerir una dosis significativamente mayor que el tratamiento de un estado inflamatorio tal como artritis.

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En particular, una composicion de la presente invencion se presenta como una dosis unitaria y se toma preferiblemente de desde 1 hasta 3 veces al dfa, lo mas preferiblemente una vez al d^a para lograr el efecto deseado.

Ademas, una composicion de la presente invencion puede tomarse cada dos dfas, cada tres dfas, cada cuatro dfas, cada cinco d^as, cada seis dfas o una vez a la semana.

Las composiciones de la presente invencion tambien pueden administrarse solas o en combinacion con otros farmacos basandose en las necesidades particulares de un paciente. En particular, las composiciones de la presente invencion pueden administrarse con agentes anticancengenos como parte de un regimen de tratamiento. Por ejemplo, el ester metflico de CDDO puede administrarse con gemcitabina, u otros agentes, durante el tratamiento de un cancer, tal como cancer de pancreas.

En general, se preparan las composiciones farmaceuticas de la invencion usando materiales y tecnicas convencionales, tales como mezclado, combinacion y similares. Ademas, un medicamento que contiene la forma A o la forma B tambien puede contener otros componentes, incluyendo adyuvantes, vehfculos, excipientes y estabilizantes adecuados, etc. Una formulacion terapeutica de la invencion es preferiblemente un solido pero, en principio, podna ser un lfquido, tal como una suspension o emulsion.

De conformidad con la invencion, la dosis de mantenimiento oral es normalmente de entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1000 mg, preferiblemente administrada una vez al dfa. La dosificacion puede variarse o adecuarse al peso de un sujeto. Dosificaciones tfpicas pueden ser de desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta 100 mg/kg, incluyendo las formas de dosificacion unitarias preferidas los comprimidos y las capsulas.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invencion. Los materiales y metodos empleados en los ejemplos se exponen a continuacion:

a. Materiales

Se adquirieron los disolventes y otros reactivos a proveedores comerciales y eran de calidad o bien HPLC o bien ACS.

b. Metodos experimentales

i. Metodo de adicion de disolvente - solubilidad aproximada

Se trato una muestra pesada con alfcuotas del disolvente de prueba a temperatura ambiente. Se determino la disolucion completa del material de prueba mediante inspeccion visual. Se estimo la solubilidad basandose en el disolvente total usado para proporcionar la disolucion completa. La solubilidad real puede ser mayor que el valor calculado por el uso de alfcuotas de disolvente que eran demasiado grandes o debido a una lenta velocidad de disolucion. La solubilidad se expresa como “menor que” si no se produjo disolucion durante el experimento. Si se logro la disolucion completa como resultado de solo una adicion de alfcuota, la solubilidad se expresa como “mayor que.”

ii. Seleccion de polimorfos

Se emplearon tecnicas de cristalizacion tanto termodinamicas como cineticas. Estas tecnicas se describen con mas detalle a continuacion. Una vez que se recogieron muestras solidas de los intentos de cristalizacion, o bien se examinaron bajo un microscopio para determinar la morfologfa o bien se observaron a simple vista. Se indico cualquier forma cristalina, pero a veces el solido presento una morfologfa desconocida, debido al pequeno tamano de partfcula. Entonces se analizaron muestras solidas mediante XRPD, y se compararon los espectros entre sf para determinar nuevas formas cristalinas o no cristalinas.

(i) Precipitacion en fno (CP, cold precipitation)

Se prepararon disoluciones en diversos disolventes a temperatura elevada. Entonces se filtraron las disoluciones a traves de un filtro de PTFE o nailon de 0,2 |im en un antidisolvente a temperatura inferior a la ambiente. Se indico la presencia o ausencia de solidos. Si no habfa solidos presentes, o si se evaluo que la cantidad de solidos era demasiado pequena para el analisis de XRPD, se puso el vial en un congelador. Se aislaron los solidos resultantes mediante filtracion y se secaron antes del analisis.

(ii) Evaporacion rapida (FE, fast evaporation)

Se prepararon disoluciones en diversos disolventes y se sonicaron entre adiciones de alfcuota para ayudar en la disolucion. Una vez que una mezcla alcanzo la disolucion completa, tal como se evaluo mediante observacion visual, se filtro la disolucion a traves de un filtro de nailon de 0,2 |im. Se permitio que la disolucion filtrada se evaporase a temperatura ambiente en un vial sin tapar. Se aislaron y se analizaron los solidos que se formaron.

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(iii) Liofilizacion (FD, freeze dry)

Se prepararon disoluciones en 1,4-dioxano, se filtraron a traves de un filtro de nailon de 0,2 |im, y se congelaron usando hielo seco. Se liofilizo la muestra congelada usando un sistema FTS Flexi-Dry. No se controlo la temperatura de liofilizacion.

(iv) Micronizacion

Puede lograrse la micronizacion de materiales en molinos de ene^a de fluido y puede reducirse el tamano de partfcula a de 1 a 20 micrometros. Puede hallarse una descripcion adicional de estos procedimientos en PERRY'S CHEMICAL ENGINEERS' HANDBOOK, 7a ed. (McGraw Hill, 1998).

(v) Trituracion

Se puso una muestra solida en un rotor de molienda de acero inoxidable con una pequena bola de metal. Algunas muestras teman una pequena cantidad de agua anadida (trituracion en humedo). Entonces se trituro la muestra a 30 Hz en un molino mezclador Retesh de tipo MM220 durante aproximadamente 20 minutos. Se aislaron y se analizaron los solidos resultantes.

(vi) Criotrituracion

Se puso una muestra solida en un recipiente de trituracion de acero inoxidable con una varilla de trituracion. Entonces se trituro la muestra a 15 Hz en un criomolino SPEX Certiprep modelo 6750 durante una cantidad de tiempo fijada. Se sumergio el recipiente de trituracion en un bano de nitrogeno lfquido durante el experimento. Se aislaron y se analizaron los solidos.

(vii) Fusion/enfriamiento rapido

Se puso una muestra solida sobre un portaobjetos de vidrio para microscopio y se nivelo. Entonces se puso el portaobjetos sobre una placa calefactora a una temperatura fijada hasta que se fundio el solido. Tras la fusion, se retiro el portaobjetos de la placa calefactora y se puso sobre una encimera fna para enfriarlo rapidamente. Se secaron los solidos resultantes bajo nitrogeno y se analizaron.

(viii) Evaporacion rotatoria

Se prepararon disoluciones en diversos disolventes y se filtraron a traves de un filtro de nailon de 0,2 |im. Se puso la muestra en el evaporador rotatorio y se retiro cuando se seco. Se aislaron y se analizaron los solidos resultantes.

(ix) Evaporacion lenta (SE, slow evaporation)

Se prepararon disoluciones en diversos disolventes y se sonicaron entre adiciones de alfcuota para ayudar en la disolucion. Una vez que una mezcla alcanzo la disolucion completa, tal como se evaluo mediante observacion visual, se filtro la disolucion a traves de un filtro de nailon de 0,2 |im. Se permitio que la disolucion filtrada se evaporase a temperatura ambiente o bajo nitrogeno en un vial cubierto con lamina de aluminio perforada con orificios. Se aislaron y se analizaron los solidos asf formados.

(x) Enfriamiento lento (SC, slow cool)

Se prepararon disoluciones saturadas en diversos disolventes a aproximadamente 60°C y se filtraron a traves de un filtro de nailon de 0,2 |im en un vial abierto mientras todavfa estaban calientes. Se cubrio el vial y se permitio que se enfriase lentamente hasta temperatura ambiente. Se indico la presencia o ausencia de solidos. Si no habfa solidos presentes, o si se evaluo que la cantidad de solidos era demasiado pequena para el analisis de XRPD, se puso el vial en una nevera. De nuevo, se indico la presencia o ausencia de solidos y, si no habfa ninguno, se puso el vial en un congelador. Se aislaron los solidos que se formaron mediante filtracion y se permitio que se secasen antes del analisis.

(xi) Experimentos con disolucion espesa

Se prepararon disoluciones anadiendo suficientes solidos a un disolvente dado de modo que estuvieran presentes solidos en exceso. Entonces se agito la mezcla en un vial sellado a temperatura ambiente. Despues de o bien 7 o bien 10 dfas, se aislaron los solidos mediante filtracion a vacfo y se analizaron.

(xii) Experimentos de estres

Se sometieron a estres los solidos en diferentes entornos de temperatura y/o humedad relativa (HR) durante un periodo de tiempo medido. Se lograron valores de HR espedficos poniendo las muestras dentro de camaras selladas que conteman disoluciones salinas saturadas o dentro de cabinas de humedad y temperatura ESPEC. Se seleccionaron las disoluciones salinas y se prepararon siguiendo un procedimiento de las normas ASTM. Se analizaron las muestras mediante XRPD inmediatamente despues de la retirada del entorno de estres.

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iii. Determinacion de la estructura de monocristal

(i) Preparacion de muestras

Se preparo una disolucion saturada de ester metilico de CDDO en metanol a ~60oC y se filtro a traves de un filtro de 0,2 |im en un vial abierto mientras todav^a estaba caliente. Se cubrio el vial y se permitio que se enfriase lentamente hasta temperatura ambiente. Se observo la presencia de pastillas piramidales despues de 1 dfa.

(ii) Recogida de datos

Se monto una placa incolora de CDDO-Me (C32H43NO4) que tema dimensiones aproximadas en dos lados de 0,01 x 0,01 mm, en una fibra de vidrio en una orientacion aleatoria. Se realizaron el examen preliminar y la recogida de datos con radiacion Ka de Mo (X = 0,71073 A) en un difractometro KappaCCD de Nonius equipado con un monocromador de haz incidente de cristal de grafito. Se realizaron refinamientos en un PC LINUX usando SHELX97 (Sheldrick, 1997) [1].

Se obtuvieron las constantes de celda y una matriz de orientacion para la recogida de datos a partir del refinamiento por mmimos cuadrados usando los angulos de ajuste de 46742 reflexiones en el intervalo de 2°< 0 < 22°. La mosaicidad refinada de DENZO/SCALEPACK [2] era de 0,32°, indicando una buena calidad del cristal. Se determino el grupo espacial mediante el programa xPReP [3]. A partir de la presencia sistematica de las siguientes condiciones: h00 h = 2n, 00l l = 4n, y a partir del posterior refinamiento por mmimos cuadrados, se determino que el grupo espacial era P432-|2 (n.° 96).

Se recogieron los datos hasta un valor de 20 maximo de 44,43°, a una temperatura de 150 + 1 K.

(iii) Reduccion de los datos

Se integraron tramas con DENZO-SMN [2]. Se recogio un total de 46742 reflexiones, de las que 9168 eran unicas. Se aplicaron correcciones de polarizacion y de Lorentz a los datos. El coeficiente de absorcion lineal es de 0,074 mm-1 para la radiacion Ka de Mo. Se aplico una correccion de absorcion empmca usando SCALEPACK [2]. Los coeficientes de transmision oscilaron entre 0,9995 y 0,9999. Se promediaron las intensidades de reflexiones equivalentes. El factor de concordancia para el promediado fue del 9,3% basado en la intensidad.

(iv) Refinamiento y resolucion de la estructura

Se resolvio la estructura mediante metodos directos usando SHELXS97 [1]. Se ubicaron los atomos restantes en sucesivas smtesis de diferencias de Fourier. Se incluyeron los atomos de hidrogeno en el refinamiento pero se limitaron a depender del atomo al que estan unidos. Se refino la estructura en mmimos cuadrados de matriz completa minimizando la funcion:

Z’*•(F,|2 - Al212

El peso w se define como 1[o2(Fo2) + (0,0176P)2 + (0,0000P)], donde P = (Fo2 +2Fc2)/3.

Se tomaron los factores de dispersion de las “International Tables for Crystallography” (Tablas internacionales de cristalograffa) [5]. De las 9168 reflexiones usadas en los refinamientos, solo se usaron las reflexiones con Fo2 > 2o(Fo2) en el calculo de R. Se uso un total de 5421 reflexiones en el calculo. El ciclo final de refinamiento incluyo 1024 parametros variables y convergio (el mayor cambio de parametro fue < 0,01 veces su desviacion estandar estimada) con factores de concordancia no ponderados y ponderados de:

R = Z IF, - F|/Z Fo = 0,051

R

w

ZwF2 -Fc2)2/Zw(fo2)2 )

0,085

La desviacion estandar de una observacion de peso unitario era de 1,05. El mayor pico en la Fourier de diferencia final tema una altura de 0,22 e/A3. El pico negativo mmimo tema una altura de -0,25 e/A3.

(v) Espectro de difraccion de rayos X de polvo (XRPD) calculado

Se genero un espectro de XRPD calculado para radiacion de Cu usando PowderCell 2.3 [6] y las coordenadas atomicas, el grupo espacial y los parametros de celda unidad procedentes de los datos de monocristal.

(vi) Diagramas de empaquetamiento y ORTEP

Se preparo el diagrama ORTEP usando ORTEPIII [7][9. Se representan los atomos mediante elipsoides termicos

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anisotropicos de una probabilidad del 50%. Se prepararon los diagramas de empaquetamiento usando el software de modelado CAMERON [8]. Se generaron figuras y predicciones de morfologfa BFDH adicionales usando Mercury 1.4.1 [4].

c. Tecnicas instrumentales

i. Calorimetna diferencial de barrido (DSC)

Se llevaron a cabo analisis en un calonmetro diferencial de barrido 2920 o Q1000 de TA Instruments. Se calibro el instrumento usando indio como material de referencia. Se puso la muestra en una capsula de aluminio para DSC convencional con una configuracion de tapa de fijacion a presion, y se registro con precision el peso. Se eqiulibro la celda de muestra a 25°C y se calento bajo una purga de nitrogeno a una velocidad de 10°C/min, hasta una temperatura final de 250°C.

ii. Sorcion/desorcion dinamica de vapor (DVS)

Se recogieron datos sorcion/desorcion de humedad en un analizador de sorcion de vapor SGA-100 de VTI en un intervalo humedad relativa (HR) del 5% al 95% a intervalos del 10% de HR bajo una purga de nitrogeno. No se secaron las muestras antes del analisis. Los criterios de equilibrio usados para el analisis fueron un cambio de peso inferior al 0,010% en 5 minutos, con un tiempo de equilibracion maximo de 3 horas si no se cumplfa el criterio del peso. No se corrigieron los datos para el contenido de humedad inicial de las muestras. Se usaron cloruro de sodio y polivinilpirrolidina como patrones de calibracion.

iii. Karl Fischer (KF)

Se realizo el analisis culombimetrico de Karl Fischer (KF) para la determinacion de agua usando un valorador Karl Fischer DL39 de Mettler Toledo. Se pusieron aproximadamente 24-32 mg de muestra en el recipiente de valoracion KF que contema Hydranal - Coulomat EA. Entonces se valoro la muestra por medio de un electrodo generador que produce yodo mediante oxidacion electroqmmica: se obtuvieron tres duplicados para garantizar la reproducibilidad.

2 I- => h + 2e

Se obtuvieron tres duplicados para garantizar la reproducibilidad.

iv. Microscopfa de platina caliente

Se realizo microscopfa de platina caliente usando una platina caliente Linkam (modelo FTIR 600) montado en un microscopio Leica Dm LP. Se observaron las muestras usando un objetivo 20x (obj.) con polarizadores cruzados (CP, cross polarizers) y compensador lambda (□). Se pusieron las muestras sobre un cubreobjetos. Entonces se puso un segundo cubreobjetos sobre la muestra. Se observo visualmente cada muestra a medida que se calentaba la platina. Se captaron imagenes usando una camara digital en color SPOT Insight™ con Software SPOT v. 4.5.9. Se calibro la platina caliente usando patrones de punto de fusion segun la USP.

v. Calorimetna diferencial de barrido modulada (MDSC)

Se obtuvieron datos de calorimetna diferencial de barrido modulada en un calonmetro diferencial de barrido de TA Instruments equipado con un sistema de enfriamiento refrigerado (RCS, refrigerated cooling system). Se puso la muestra en una capsula de aluminio para DSC, y se registro con precision el peso. Se cubrio la capsula con una tapa y se fijo a presion. Se obtuvieron los datos de MDSC usando una amplitud de modulacion de +/- 0,8°C y un periodo de 60 segundos con una velocidad de calentamiento subyacente de 2°C/min de desde -25 hasta 250°C. Se calibraron la temperatura y la capacidad calonfica usando metal indio y zafiro como los patrones de calibracion, respectivamente. Se obtiene la temperatura de transicion vftrea notificada a partir de la inflexion del cambio sustancial en la curva de flujo de calor reversible frente a la temperatura.

vi. Resonancia magnetica nuclear (RMN)

Se recogieron los espectros de 1H-RMN en fase de disolucion por Spectra Data Services, Inc. Se imprimen los parametros de adquisicion en cada espectro. Los espectros se tomaron con referencia a tetrametilsilano interno a 0,0 ppm.

vii. Microscopfa optica

Se recogieron las observaciones realizadas mediante microscopfa optica en un microscopio optico de polarizacion Wolfe a un aumento de 4x. Se usaron polarizadores cruzados (CP) para observar birrefringencia en las muestras.

viii. Microscopfa electronica de barrido (SEM)

Se realizo la microscopfa electronica de barrido (SEM) usando un microscopio electronico de barrido Quanta 200 de FEI. En modo a alto vado, se uso un detector de retrodispersion de estado solido (Etd). La tension del haz era de

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5,0 kV. Se recubrieron por pulverizacion las muestras usando una recubridora por pulverizacion 108auto de Cressington a -20 mA y ~0,13 mbar (Ar) con Au/Pd durante 75 segundos. Se preparon muestras para el analisis poniendo una pequena cantidad sobre cinta adhesiva doble de carbono fijada a un portamuestras de aluminio. Se calibro el instrumento para el aumento usando patrones de NIST. Se recogieron datos usando xTm (v. 2,01), numero de montaje 1564 y se analizaron usando XT Docu (v. 3.2). Se calcularon los aumentos notificados en las imagenes de SEM tras la adquisicion inicial de datos. La barra de escala notificada en la parte inferior de cada imagen es exacta tras el redimensionamiento de las imagenes y debe utilizarse cuando se realizan determinaciones de tamano.

ix. Termogravimetna (TG)

Se llevaron a cabo analisis en un analizador termogravimetrico 2950 de TA Instruments. Los patrones de calibracion fueron mquel y Alumel™. Se puso cada muestra en una capsula para muestra de aluminio y se inserto en el horno para TG. En primer lugar se equilibraron las muestras a 25°C, luego se calentaron bajo una corriente de nitrogeno a una velocidad de calentamiento de 10°C/min, hasta una temperatura final de 350°C a menos que se especifique lo contrario.

x. Difraccion de rayos X de polvo (XRPD)

(i) XRG-3000 de Inel

Tambien se realizaron analisis de difraccion de rayos X de polvo en un difractometro XRG-3000 de Inel, equipado con un detector sensible a la posicion curvado con un intervalo de 20 de 120°. Se recogieron datos en tiempo real usando radiacion Ka de Cu a una resolucion de 0,03° de 2D. Se fijaron el amperaje y la tension del tubo en 40 kV y 30 mA, respectivamente. Se visualizan los espectros desde 2,5 hasta 40° de 20 para facilitar las comparaciones directas con espectros. Se prepararon muestras para el analisis mediante su empaquetamiento en capilares de vidrio de pared delgada. Se monto cada capilar sobre un cabezal de goniometro que esta motorizado para permitir el giro del capilar durante la adquisicion de datos. Se realizo la calibracion del instrumento diariamente usando un patron de referencia de silicio.

d. Tecnicas de calculo adicionales

i. PDF

Una tecnica usada en el analisis computacional de datos amorfos en rayos X es la funcion de distribucion de pares (PDF, pair distribution function). Tal como sugiere su nombre, la PDF se compone de una suma lineal de todas las interacciones atomo-atomo coherentes dentro del material. Los materiales defectuosos (desordenados) presentaran las mismas interacciones atomo-atomo que la fase cristalina, pero a lo largo de una escala de longitud reducida. Por tanto, tales materiales pueden compararse con materiales cristalinos originales examinando los picos en la PDF a lo largo de algunos de los primeros nanometros. Las comparaciones entre espectros en el intervalo de 0 A a aproximadamente 5 A son diffciles debido a los artefactos en esta region.

Con la formacion del material vftreo, los picos de PDF presentaran cierto movimiento desde las posiciones de los picos cristalinos ya que las moleculas se relajan en sus posiciones. Esto es similar a un acontecimiento de dilatacion/contraccion termica en el que, aunque los picos de PDF se mueven ligeramente, las intensidades relativas de los picos deben poder reconocerse todavfa como que estan relacionadas con el material cristalino original. A medida que el material entra en el estado amorfo termodinamico, algunas de las relaciones de simetna de grupos puntuales se perderan proporcionando una PDF de complejidad reducida. Tambien habra cierto movimiento de picos. Los materiales vftreos/amorfos presentaran PDF que rapidamente se reduciran a cero a lo largo de distancias de 2 a 3 vecinos mas proximos (NN, nearest neighbor).

Se usan condiciones de medicion para minimizar el fondo en los espectros de rayos X y se usan algoritmos para calcular la PDF a partir de los datos de rayos X medidos. Se calcularon las PDF usando PatternMatch v2.2.1, usando todo el intervalo de datos medidos para todas las muestras.

Ejemplo 1 - Estimaciones de solubilidad

Se determinaron solubilidades aproximadas en diversos disolventes a temperatura ambiente, con los resultados proporcionados en la tabla 2. El ester metflico de CDDO presenta alta solubilidad en la mayona de los disolventes organicos usados. La solubilidad en agua parece ser inferior a 0,1 mg/ml.

Ejemplo 2 - Resultados de la seleccion de polimorfos

Se realizaron aproximadamente 50 experimentos de seleccion de polimorfos. Se observo la forma A a partir de aproximadamente el 50% de las muestras. La formacion de la forma A no se limito a una condicion de cristalizacion particular y se preparo a partir de una variedad de diferentes experimentos y disolventes. Se preparo material de la forma B a partir de liofilizacion, fusion/enfriamiento rapido, y varios experimentos de evaporacion.

Se enumeran alfabeticamente las muestras de la seleccion de polimorfos en las tablas 3-5 por el disolvente usado.

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Se comparan espectros de XRPD representativos de materiales de la forma A y la forma B en la figura 2. Se resumen los datos de caracterizacion de las formas en los ejemplos a continuacion.

Ejemplo 3 - Caracterizacion de ester metilico de CDDO - forma A (no micronizada)

La forma A no esta solvatada (tabla 6). Se determino la estructura de monocristal de la forma A basandose en los metodos descritos anteriormente. Se hicieron crecer cristales de ester metilico de CDDO y se enviaron para el analisis de la estructura de monocristal. Se determino la estructura cristalina mediante difraccion de rayos X de monocristal. Se muestra la estructura propuesta del ester metilico de CDDO en la figura 1.

Los parametros de celda tetragonal y el volumen calculado son: a = 14,21620(10) A, b = 14,21620(10) A, c = 81,5875 (12) A, a = 90,00°, p = 90,00°, y = 90,00°, V = 16488,9(3) A3. El peso molecular del ester metflico de CDDO es de 505,70 g/mol siendo Z = 24, lo que da como resultado una densidad calculada de 1,222 g cm-3. Se determino que el grupo espacial era P432-|2 (n.° 96). Se proporciona un resumen de los datos cristalinos y parametros de recogida de los datos cristalograficos en la tabla 10.

La calidad de la estructura obtenida en alta, tal como se indica mediante el valor de R de 0,051 (5,1%). Habitualmente se citan valores de R en el intervalo de 0,02 a 0,06 para las estructuras determinadas de la manera mas fiable.

Se muestra un dibujo de ORTEP de una molecula individual de ester metflico de CDDO en la figura 12. La unidad asimetrica mostrada en la figura 13 contiene tres moleculas de ester metflico de CDDO. Las moleculas son las mismas que la estructura propuesta a partir de la figura 1.

Se muestran diagramas de empaquetamiento visualizados a lo largo de los ejes a, b y c cristalograficos en las figuras 14-16, respectivamente. Sin enlaces de hidrogeno, la estructura cristalina incluye numerosas interacciones de van der Waals. La vista a lo largo del eje b cristalografico (figura 15) destaca la naturaleza helicoidal de la disposicion de empaquetamiento del eje helicoidal tetragonal y la morfologfa BFDH predicha. La morfologfa predicha concuerda bien con el habito observado en el monocristal usado en la recogida de datos.

Se proporciona el espectro de XRPD calculado del ester metflico de CDDO, generado a partir de los datos de monocristal, en la figura 17. Se muestra el espectro de XRPD experimental del ester metflico de CDDO en la figura 18. Se proporcionan picos caractensticos para el espectro de XRPD de la forma A en la tabla 17. Una comparacion de los espectros de XRPD calculados y experimentales (figura 19) revela que todos los picos en los espectros experimentales estan representados en el espectro de XRPD calculado, lo que indica que el material a granel es probablemente una unica fase. El ligero desplazamiento sistematico observado en la ubicacion de los picos se debe probablemente al hecho de que el espectro de polvo experimental se recogio a temperatura ambiente, y los datos de monocristal se recogieron a 150°K. Se usan bajas temperaturas en el analisis de monocristal para mejorar la calidad de la estructura.

En resumen, se determino la estructura de monocristal de la forma A del ester metflico de CDDO A para confirmar la estructura molecular propuesta. Se determino que el grupo espacial era P432-|2 (n.° 96). La estructura del ester metflico de CDDO consiste en tres moleculas de una naturaleza helicoidal a lo largo del eje b cristalografico. Todos los picos en los espectros experimentales estan representados en el espectro de XRPD calculado, lo que indica que el material a granel es probablemente una unica fase.

Se muestran los datos termicos para la forma A en la figura 3. La curva de DSC muestra un desplazamiento con respecto a la lmea base a aproximadamente 157°C y una endoterma con una temperatura de inicio de aproximadamente 222°C (maximo de senal a ~224°C). Se confirmo el acontecimiento a ~224°C como la fusion mediante microscopfa de platina caliente (figura 4). La curva de termogravimetna (TG) presenta una perdida de peso insignificante del 0,34% hasta 150°C, seguido por una perdida de peso del 1,2% desde 150 hasta 210°C. Los datos de Karl Fischer muestran que el material contiene aproximadamente el 0,38% de agua residual, lo que concuerda con la perdida de peso inicial observada mediante TG.

Los datos de DVS indican que la forma A no es higroscopica (figura 5). El material muestra un cambio de peso insignificante a lo largo de todo el experimento. Se analizo el material resultante mediante XRPD y es la forma A.

Se muestran imagenes de SEM en la figura 6. Se observan varios habitos, incluyendo piramidal, pastilla y similar a una placa.

Se investigo la estabilidad ffsica de la forma A en diversas condiciones (tabla 7). Las muestras sometidas a estres o bien a 25°C/HR del 60% o bien a 40°C/HR del 75% durante 7 dfas mostraron ambas un cambio de peso insignificante (perdida del 0,6% y aumento del 0,2%, respectivamente) lo que sugiere que la forma A no es higroscopica. Se trituraron dos muestras en un molino de bolas durante aproximadamente 20 minutos, una seca y otra con una pequena cantidad de agua. Se volvieron a analizar todas las muestras mediante XRPD y segrnan siendo la forma A. Se sometio a estres una muestra a 195°C durante 15 minutos y mostro una perdida de peso del 2%. El XRPD del material resultante es similar al de la forma A; sin embargo, es evidente un aumento en el ruido de la lmea base (figura 7).

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Se muestra el espectro de RMN en disolucion en la figura 8. El espectro concuerda con la estructura de ester metilico de CDDO. Los picos a aproximadamente 1,6 y 7,3 ppm se asignan a agua y cloroformo (debido al intercambio), respectivamente.

La forma A no esta solvatada y no es higroscopica, por tanto, y funde a aproximadamente 228°C, basandose en observaciones del analista durante la microscopfa de platina caliente.

Ejemplo 4 - Caracterizacion de ester metilico de CDDO - forma A (micronizada)

Se determino que la forma A micronizada de ester metilico de CDDO era la forma A mediante XRPD (figura 2, tabla 1). Puede producirse material micronizado mediante la metodologfa convencional, ampliamente conocida en el campo, tal como molienda con chorro de aire. Estos hallazgos parecen indicar que la micronizacion no afecta a la forma A para alterar su espectro de XRPD.

Ejemplo 5 - Caracterizacion de ester metilico de CDDO - forma B

Puede prepararse material de la forma B a partir de liofilizacion, fusion/enfriamiento rapido, y otros varios experimentos de evaporacion, tal como se facilita en la tabla 3.

Se muestran los datos de DSC modulada (MDSC) en la figura 9. La curva reversible muestra una temperatura de transicion vftrea (Tg) a aproximadamente 125°C. La curva no reversible muestra una exoterma con maximo de senal a 195°C y una endoterma con maximo de senal a 223°C. Los acontecimientos no reversibles se deben de la manera mas probable a la cristalizacion de material de la forma B (exoterma) seguida por la fusion del material cristalizado (endoterma).

Se investigo la establidad ffsica de material de la forma B a diversas condiciones (tabla 9). Las muestras sometidas a estres a 22°C/HR del 97%, 40°C/HR del 75%, 80°C/HR del 0% y 195°C/HR ambiental segman siendo la forma B. El someter a estres el material a 200°C/HR ambiental durante 60 minutos produjo la forma A mas material minoritario de la forma B (figura 10).

Se muestra el espectro de RMN en disolucion en la figura 11. El espectro concuerda con la estructura de ester metilico de CDDO. Los picos a aproximadamente 1,6, 5,3, y 7,3 ppm se asignan a agua, diclorometano y cloroformo, respectivamente.

La forma B no es hidgroscopica, cristaliza en la forma A a aproximadamente 200°C, y tiene una temperatura de transicion vftrea (Tg) de aproximadamente 125°C - 130°C.

En resumen, la forma B no es higroscopica. Los datos de MDSC indican que la temperatura de transicion vftrea (Tg) de la forma B es de aproximadamente 125°C - 130°C. El material de la forma B cristaliza en la forma A cuando se somete a estres a aproximadamente 200°C.

Ejemplo 6 - Estudios de establidad para la forma B de ester metflico de CDDO y dispersiones de excipiente de poftmero de ester metflico de CDDO

(i) Estudios de la forma B purificada

La forma B de ester metflico de CDDO se sometio a condiciones de estres variables. La tabla 15 proporciona algunos de los resultados de estos estudios. La forma B de ester metflico de CDDO producida mediante una realizacion util pero menos preferida de esta invencion, que implica el uso de acetato de etilo como disolvente, muestra una establidad considerable. No obstante, las pruebas de muestras de la forma B producidas en presencia de acetato de etilo revelaron la formacion de la forma A despues de 28 dfas de almacenamiento a temperaturas de 60°C e inferiores. Por el contrario, todas las muestras producidas segun una realizacion preferida de esta invencion, siendo el ejemplo 11 a continuacion ilustrativo de la misma, conservaron las caractensticas amorfas despues de las pruebas de estres en condiciones particularmente rigorosas (vease la tabla 15). Estos estudios muestran la sorprendente establidad de material de la forma B, especialmente cuando se prepara segun la realizacion preferida, mencionada anteriormente.

Ademas, se analizaron muestras de la forma B preparadas en condiciones variables para determinar si teman propiedades qrnmicas similares. Tal como se describio anteriormente, es decir, se prepararon muestras de la forma B mediante metodos de criotrituracion, fusion-enfriamiento rapido, y secado por pulverizacion. Ademas, se micronizo forma B no micronizada para producir forma B micronizada. Se realizo el analisis de PDF en las muestras (figura 28), que se determino que eran de naturaleza vftrea.

(ii) Estudios con preparaciones de dispersion de CDDO-Me

Se realizaron estudios para comparar el rendimiento de diferentes dispersiones solidas de forma B:poftmero producidas mediante secado por pulverizacion. Los atributos del producto estudiados incluyeron establidad y perfil de disolucion del farmaco.

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Se usaron diferentes poKmeros a tres razones de principio activo farmaceutico (API) con respecto a poKmero (20:80; 40:60 y 60:40%p/p).

Se seleccionaron los siguientes tres polfmeros:

CopoKmero de acido metacnlico - acrilato de etilo (1:1)

Copovidona [copKmero de 1 -vinil-2-pirrolidona - acetato de vinilo (3:2)]

Ftalato de hipromelosa.

Se disolvieron disoluciones de CDDO-Me, o bien material cristalino de la forma A o bien material de la forma B, y el polfmero elegido para el estudio en un disolvente adecuado a las razones en peso apropiadas, normalmente para producir desde el 10-20% en peso de solidos en disolucion. El disolvente empleado normalmente era acetona. Se secaron por pulverizacion las disoluciones resultantes por medio de una secadora por pulverizacion a escala de laboratorio (BUCHI, modelo B-290), equipado con una boquilla de dos fluidos, usando nitrogeno como gas portador y de secado. Normalmente se emplearon temperaturas de entrada de gas portador de 65-85°C y temperaturas de salida de 50-60°C. Se recogieron los solidos y se secaron posteriormente a vado los polvos secados por pulverizacion, para reducir adicionalmente los niveles de los disolventes organicos.

Se analizaron los polvos secados por pulverizacion para determinar el nivel de disolventes organicos residuales, la temperatura de transicion vftrea (Tg) y la densidad aparente. Despues del secado posterior, tambien se analizaron los polvos para determinar la pureza, el contenido de agua, el tamano de partfcula promedio, la ausencia de material cristalino mediante difraccion de rayos X de polvo (XRPD) y perfil de disolucion.

Se evaluaron las caractensticas fisicoqmmicas de las dispersiones despues de someterlas a estres a corto plazo (despues de 5 dfas, 40°C / HR del 75%) mediante XRPD y calorimetna diferencial de barrido modulada (mDSC).

Estos estudios encontraron que la temperatura de transicion vftrea, Tg, disminuyo cuando se sometio a estres a corto plazo, probablemente debido a la captacion de humedad a lo largo del transcurso del estres. La disminucion fue mas pronunciada con las formulaciones que teman bajas razones de ester metflico de CCDO : polfmero. Para las muestras antes del estres a corto plazo, se observaron una o dos transiciones endotermicas a mayores temperaturas, aunque estas temperaturas son algo menores que las observada inicialmente. La entalpfa asociada con estas transiciones disminuyo a medida que disminuyo el contenido en polfmero. Esto es una indicacion de que esta transicion esta relacionada de la manera mas probable con el polfmero y no con la fusion de una forma cristalina. De hecho, para las dispersiones producidas con PVP/VA, la temperatura de esta transicion endotermica fue similar a la observada para el excipiente puro, tal como se recibio del fabricante. En cada caso, el perfil de XRPD despues del estres continuo siendo el espectro de halo caractenstico centrado aproximadamente en 13,5° de 20, y no se detectaron picos asociados con la forma cristalina.

Se llevaron a cabo estudios de secado por pulverizacion adicionales con dos formulaciones, usando equipo de secado por pulverizacion a mayor escala. En estos casos, se empleo una secadora a escala piloto modelo PSD-1 (mobile minor 2000) de Niro. Tambien se emplearon condiciones de boquilla y secado por pulverizacion equivalentes a las descritas anteriormente. Las tablas 20 y 21 resumen las disoluciones preparadas para secado por pulverizacion y sus caractensticas tras el secado por pulverizacion. Las formulaciones mostraron una menor Tg, con relacion a la forma B pura, debido a que la formulacion inclrna polfmeros con una menor Tg que la forma B.

Ejemplo 7 - Administracion de ester metilico de CDDO: forma B frente a forma A en monos macacos

En la fase 1 de este estudio, se preparo una cantidad de capsulas de gelatina dura, que conteman la forma A micronizada pura de CDDO-Me o la forma B micronizada pura de CDDO-Me, mediante (i) anadir una cantidad pesada de manera apropiada de la forma pura del principio activo a una capsula de gelatina dura de tamano 1 y luego (ii) cerrar la capsula. No se emplearon excipientes adicionales. Se administro o bien la forma B o bien la forma A de ester metilico de CDDO por via oral en una capsula de gelatina a monos macados (dosis = 4,1 mg/kg en todos los casos).

La administracion de la forma B de ester metflico de CDDO proporciono una mediana de exposicion que era aprox un 520% mayor que la dosis equivalente de la forma A de ester metflico de CDDO en monos. La tabla 11 compara las exposiciones al farmaco de los animales individuales. Se implemento un diseno cruzado en este estudio para aumentar el valor de 'n' y para mejorar la fiabilidad de los datos. Se implemento un periodo de lavado de 1 semana durante el cruce. La figura 20 demuestra las concentraciones en plasma logradas de ambas formas de ester metflico de CDDO con el tiempo en la poblacion de la que se tomaron muestras. La figura 21 representa concentraciones en plasma de ester metflico de CDDO comparativas de los animales n.° 505M y n.° 507F. La figura 22 representa concentraciones en plasma de ester metflico de CDDO comparativas de los animales n.° 508F y n.° 502M.

Para evaluar adicionalmente la biodisponibilidad comparativa de las formas de dosificacion oral de ester metflico de CDDO, incluyendo las que contienen dispersiones de excipiente de ester metflico de CDDO, se llevaron a cabo dos fases de estudio adicionales, 2 y 3, tal como se detalla a continuacion. Estos estudios incluyeron algunas de las

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dispersiones de poUmero de la forma B de CDDO-Me descritas en el ejemplo 6. Todas las formulaciones inclman aditivos de formulacion usados comunmente.

Fase 2:

Se produjo una suspension acuosa de CDDO-Me nanocristalino, partiendo de una muestra de material de la forma A micronizada. Se cargo un molino planetario de bolas Retsch® modelo PM 400, que contema bolas de zircona de 2 mm de tamano promedio, con 25 g de CDDO-Me micronizado (distribucion de tamano de partfcula promedio de 6,1 uM), 5 g de docusate sodio, 1 g de Tween 80 y 68,3 g de agua. Se inicio la trituracion a aproximadamente 400 RPM y se continuo durante 2 horas. Se obtuvo una determinacion de la distribucion de tamano de partfcula distribucion (PSD, particle size distribution) usando un granulometro de luz que indico una PSD promedio de 0,37 |iM. A esta suspension espesa se le anadieron 1 g de celulosa microcristalina y 0,2 g de goma xantana, con breve mezclado, y se almaceno refrigerada la suspension.

Se recubrio por pulverizacion la nanosuspension molida en molino de bolas sobre una combinacion de excipiente seca en un lecho fluido Strea 1a de Aeromatic a escala de laboratorio, teniendo el conjunto de pulverizacion superior un tamano de boquilla de pulverizacion de 0,4 mm. Se fijo la temperatura de entrada en 55°C. El intervalo de temperatura de salida durante la pulverizacion fue de 32 a 35°C. Se seco la granulacion resultante durante aproximadamente 5 minutos, hasta que la temperatura de salida alcanzo los 38°C (Anexo 3-5). Se facilita a continuacion la composicion de los materiales recubiertos.

Composicion teorica de la formulacion de 30 mg de CDDO-Me nanocristalino

Artfculo

Componente % mg/unidad

1

CDDO-Me 5,7 19

2

Tween 80 0,12 0,4

3

DOS 1,14 3,8

4

Celulosa microcristalina en suspension 0,21 0,7

5

Goma xantana 0,03 0,1

6

Celulosa microcristalina en granulacion 24,4 81,55

7

Almidon Pregel 58,5 195,3

8

Povidona K29/32 0,5 1,75

9

Crospovidona 8,4 28

10

Dioxido de silicio coloidal 0,5 1,75

11

Estearato de magnesio 0,5 1,75

Total:

100,0 334,1

Se envio la granulacion seca resultante para analisis de HPLC para determinar la valoracion del principio activo. Se determino que esa valoracion era del 14,4% (p/p), sustancialmente mayor que el valor teorico (5,7%). Basandose en el analisis de HPLC, se llenaron capsulas de modo que se proporcionara un contenido neto de CDDO-Me de 30 mg.

Se produjeron formulaciones de la forma A micronizada cristalina y la forma B micronizada, amorfa mediante un proceso de combinacion de polvos secos convencional, usando, como aditivos, celulosa microcristalina, almidon pregelatinizado, crospovidona (que funciona como disgregante), dioxido de silicio coloidal, y estearato de magnesio de calidad vegetal. Se uso forma A micronizada de CDDO-Me de PSD promedio de 6,1 pM para la formulacion de la forma A, mientras que se empleo forma B micronizada de CDDO-Me de PSD promedio de 10,8 pM para la formulacion correspondiente de forma B de CDDO-Me. La tabla a continuacion presenta la composicion cuantitativa de ambas formulaciones.

Composicion cuantitativa de capsula de 30 mg de la forma A y forma B

Identidad

% p/p mg por capsula

CDDO-Me (micronizada)

18,18 30,0

Celulosa microcristalina

18,55 30,6.

Almidon pregelatinizado

53,45 88,2.

Crospovidona

8,72 14,4

Dioxido de silicio coloidal

0,55 0,9

Estearato de magnesio (calidad vegetal)

0,55 0,9

Contenido total de la capsula

100,00 165 mg

Cada uno de 15 monos macacos, Macaca fascicularis, recibieron una administracion oral unica de ester metilico de CDDO (3 formulaciones diferentes, 5 monos por formulacion) a un nivel de dosis objetivo de 10 mg/kg. Los monos 5 oscilaban entre 1-3 anos de edad y 2,5-3,5 kg de tamano. Se extrajeron muestras de sangre hasta 72 horas tras la dosis.

Fase 3:

Se formularon adicionalmente dispersiones de excipiente de CDDO-Me descritas en el ejemplo 6 fueron mediante un proceso de combinacion de polvos secos convencional, usando celulosa microcristalina, lactosa monohidratada, 10 crospovidona (que funciona como disgregante), y laurilsulfato de sodio como aditivos. La composicion cuantitativa de cada formulacion aparece a continuacion.

Composicion de dispersiones de excipiente de CDDO-Me combinadas con aditivos en la formulacion de capsula

Componente

40% de CDDO-Me / 60% de copolfmero de acido metacnlico de tipo C 60% de CDDO-Me/ 40% de PVP/VA 60% de CDDO-Me/ 40% de HPMC-P

Dispersion de CDDO-Me

60,0% 50,0% 50,0%

Celulosa microcristalina

12,8% 16,0% 16,0%

Lactosa monohidratada

20,0% 25,0% 25,0%

Crospovidona

6,4% 8,0% 8,0%

Laurilsulfato de sodio

0,8% 1,0% 1,0%

Contenido total de la capsula

100% 100% 100%

Masa de llenado

125mg 100mg 100mg

15 Despues de un periodo de lavado adecuado (de 7 a 10 dfas), los mismos 15 monos macacos macho usados en la fase 2 recibieron cada uno una administracion oral unica de ester metflico de CDDO (3 formulaciones diferentes, 5 monos por formulacion) a un nivel de dosis objetivo de 10 mg/kg. Se extrajeron muestras de sangre hasta 72 horas tras la dosis.

El cuadro a continuacion resume cada fase del estudio.

Numero de V^a de

fase administracion

Formulacion de CDDO-Me

Nivel de dosis objetivo

Numero de animales (machos)

2

Forma A nanocristalina

Oral (capsula)

Forma B micronizada amorfa

Forma A micronizada cristalina

30 mg/por animal (10 mg/kg)

5

5

5

Forma B de PVP/VA

5

3

Oral (capsula)

Forma B de HPMC-P Forma B de copolfmero de acido metacnlico de tipo C

30 mg/por animal (10 mg/kg)

5

5

Se resumen a continuacion las dosis orales e intravenosas medias recibidas por los monos macacos macho y las concentraciones medias de ester metflico de CDDO:

Numero de fase

Formulacion Peso corporal medio (kg) Dosis media (mg/kg)

2

v.o. (forma A nanocristalina) 2,89 + 0,267 10,5 + 0,971

v.o. (forma B micronizada amorfa) 2,87 + 0,177 10,5 + 0,635

v.o. (forma A micronizada cristalina) 2,91 + 0,202 10,3 + 0,702

3

Forma B v.o. (PVP/VA) 2,98 + 0,311 10,2 + 1,06

Forma B v.o. (HPMC-P) 2,93 + 0,183 10,3 + 0,627

Forma B v.o. (Copolfmero de acido metacnlico de tipo C) 2,93 + 0,142 10,2 + 0,486

v.o. Administracion oral mediante capsula.

5

Se uso una capsula de gelatina de tamano 2 para suministrar las formulaciones en la fase 2 y se uso una capsula de gelatina de tamano 1 para el suministro en la fase 3. El contenido neto de farmaco en cada capsula era de 30 mg, correspondiente a una dosificacion de 10 mg/kg de farmaco, basandose en la suposicion de que cada mono pesaba 3 kg. Se unio la capsula a una sonda nasogastrica, se sondo el animal, y se libero la capsula desde el extremo de la 10 sonda nasogastrica mediante presion de aire procedente de una jeringa vada. Se administro una pequena cantidad de agua (aproximadamente 10 ml) por via oral despues de la administracion de la ultima capsula.

Se extrajeron muestras de sangre en serie (de aproximadamente 1 ml) de la arteria o la vena femoral de cada

animal y se transfirieron a tubos que conteman K2-EDTA en cada uno de los siguientes puntos de tiempo (se

registraron los tiempos reales):

Fase 2 Antes de la dosis, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 y 72 h tras la dosis

Fase 3 Antes de la dosis, 1,2, 4, 8, 16, 24, 48 y 72 h tras la dosis

15 Se mezclaron meticulosamente todas las muestras tras la extraccion y se pusieron en hielo humedo, antes de refrigerarse a aproximadamente 4°C. Se analizaron las concentraciones en sangre de ester metflico de CDDO mediante HPLC-EM/EM.

Se proporcionan los resultados en la tabla 22 y en la figura 30. Para la fase 2, la forma B mostro una biodisponibilidad significativamente mejor que las dos formulaciones de la forma A sometidas a prueba. Los 20 resultados de la fase 3 muestran que cada una de las formulaciones a base de dispersion de CDDO-Me : polfmero tema una biodisponibilidad mucho mayor que las formulaciones de o bien la forma A micronizada o bien la forma A

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nanocristalina. Las formulaciones de copoUmero de acido metacnlico tipo C y HPMC-P mostraron la mayor biodisponibilidad en los monos objeto.

Ejemplo 8 - Caracterizacion de la forma de hemibencenato de ester metflico de CDDO

Se realizaron diversos experimented, reproduciendo la ultima etapa de recuperacion a partir de la smtesis de ester metflico de CDDO. Honda et al., 2000. El objetivo era el aislamiento de material cristalino a partir de una mezcla en disolucion de benceno/acetona (10:1).

Se disolvieron aproximadamente 100 mg de ester metilico de CDDO en 300 pl de benceno/acetona (10:1) y se filtraron a traves de un filtro de nailon de 0,2 pm. Entonces se sonico la disolucion usando un procesador ultrasonico durante 10 minutos y se permitio que se evaporase a temperatura ambiente en un vial sin tapar durante la noche. Se formo un gel transparente y se anadieron 100 pl de benceno/acetona (10:1). Se sometio la disolucion a sonicacion en un procesador ultrasonico durante aproximadamente 30 minutos. Se formo un precipitado blanco. Se permitio que los solidos se secasen al aire.

En otros experimentos, se disolvieron aproximadamente 200 mg de ester metflico de CDDO en 0,8 ml de benceno/acetona (10:1) y se filtraron a traves de un filtro de nailon de 0,2 pm. Entonces se dividio uniformemente la disolucion en dos viales de 1 dragma. Se permitio que las muestras A y B se evaporaran rapidamente a temperatura ambiente durante unas cuantas horas. Se tapo la muestra A y se puso en un congelador. Despues de congelarse la muestra, se permitio que la muestra se descongelase a temperatura ambiente. Se introdujo un pequeno rayado usando una espatula y se permitio que la muestra se evaporase a temperatura ambiente. Se formaron solidos blancos y se permitio que se secasen al aire. Se tapo la muestra B, se dejo a temperatura ambiente y era una disolucion transparente despues de asentarse a temperatura ambiente durante la noche. Se introdujo un pequeno rayado usando una espatula y se permitio que la muestra se evaporase a temperatura ambiente. Se formaron solidos blancos y se permitio que se secasen al aire.

Se obtuvo material cristalino, que se determino que era un hemibencenato, a partir de varios de estos experimentos. Tal como se describio anteriormente, perturbaciones menores, tales como sonicacion o meramente introducir un pequeno rayado dentro del recipiente de recogida, facilitaran la cristalizacion del solvato de benceno (tabla 12).

Se resumen los datos de caracterizacion del hemibencenato en la tabla 13. Se proporcionan los picos caractensticos para el espectro de XRPD del hemibencenato en la tabla 19. La curva de DSC presenta una endoterma ancha cerca de 133°C, asociada con ~7,0% de perdida de peso en la figura 23 del termografo TG. La perdida de peso se debe probablemente a la volatilizacion de benceno (vease la discusion de RMN a continuacion), y corresponde a 0,5 moles de benceno por cada mol de ester metflico de CDDO. La endoterma de DSC observada cerca de 223°C resulta de la manera mas probable de la fusion de material desolvatado.

Estos datos distinguen formas aisladas previamente de ester metflico de CDDO de la presente invencion.

Ejemplo 9 - Caracterizacion de la forma novedosa de dimetanolato de ester metilico de CDDO

Se preparo un solvato de dimetanol de ester metflico de CDDO segun el procedimiento a continuacion. Se disolvieron aproximadamente 500 mg de ester metflico de CDDO en 20 ml de metanol a 60°C. Entonces se anadio lentamente la disolucion a 20 ml de metanol frte a -10°C con agitacion. Se recogieron solidos blancos mediante filtracion a vacte y entonces se almacenaron en un congelador.

Se resumen los datos de caracterizacion en la tabla 14. Se proporcionan los picos caractensticos para el espectro de XRPD del dimetanolato en la tabla 18.

La curva de DSC muestra una endoterma ancha cerca de 102°C, asociada con ~11% de perdida de peso en el termogeafo TG (figura 24). Los datos de TGIR confirman que la perdida de peso se debe a la volatilizacion de ~2,0 moles de metanol (figura 25). Se recupero el material resultante del experimento de TGIR y era amorfo mediante XRPD (figura 26). Tambien se observan un desplazamiento con respecto a la lmea base a aproximadamente 130°C, una exoterma ancha cerca de 203°C seguida por una endoterma aguda (inicio: 223°C) en la curva de DSC. Estos acontecimientos son indicativos de la manera mas probable de la Tg del material amorfo (forma B) obtenido a traves de la desolvatacion del solvato de dimetanol seguida por la cristalizacion del material amorfo en la forma A y la fusion de ese material cristalino.

Se obtuvo el espectro de RMN de proton en disolucion. No se realizaron las asignaciones qmmicas; sin embargo parecen concordar con la estructura qrnmica de ester metflico de CDDO. Los picos a ~3,51 ppm se asignan a metanol y corresponden a ~1,7 moles. Este resultado concuerda con los datos termicos anteriores.

Ejemplo 10 - Estudios clmicos con ester metilico de CDDO

Se selecciono CDDO-Me, formulado usando la forma A micronizada, para el desarrollo clmico y se sometio a prueba en primer lugar en un estudio orientado a la seguridad de fase I en pacientes con cancer avanzado que no habfan respondido adecuadamente a terapias previas. En este ensayo de aumento a escala de la dosis de fase I, se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

administro CDDO-Me a 21 pacientes adultos con diversas formas de cancer avanzado (metastasico). Se administro a los pacientes dosis diarias de capsulas de CDDO-Me a dosis que oscilaron entre 5 y 900 mg/dfa (espedficamente 5, 10, 20, 40, 80, 150, 300, 600 o 900 mg/dfa). Se administro CDDO-Me en “ciclos” que se repitieron hasta que el paciente experimento una toxicidad inaceptable o mostro evidencias de progresion de la enfermedad. En este estudio, un ciclo de CDDO-Me consistio en 21 dfas consecutivos de dosificacion seguidos por un periodo de descanso de 7 dfas despues de que el paciente fuera elegible para iniciar el siguiente ciclo.

Se revisaron tanto la seguridad como la actividad antitumoral de CDDO-Me. Ademas, se caracterizaron los efectos biologicos de CDDO-Me. CDDO-Me se tolero muy bien en estos pacientes, sin acontecimientos adversos relacionados con el farmaco significativos notificados. Se considero que varios pacientes (aproximadamente el 75% de los pacientes evaluables) teman una enfermedad estable (basandose en criterios radiologicos y clmicos convencionales) en el primer punto de evaluacion tras la finalizacion del segundo ciclo de tratamiento. No se evaluaron formalmente los pacientes que se encontro que teman evidencias de enfermedad progresiva antes de completar el segundo ciclo, y no se incluyeron en el grupo de pacientes evaluables. Cinco pacientes, incluyendo pacientes con melanoma y cancer de celulas renales, continuaron mostrando enfermedad estable, algunos con evidencias de regresion de lesiones tumorales individuales, despues de cuatro ciclos de tratamiento. Se considero que cuatro pacientes teman enfermedad estable despues de al menos seis ciclos de tratamiento. No se desarrollaron nuevas metastasis en ningun paciente que recibio una dosis de al menos 40 mg de CDDO-Me al dfa segun la pauta prescrita.

Basandose en las propiedades antiinflamatorias conocidas de CDDO-Me, se evaluaron las citocinas inflamatorias circulantes en los pacientes en el ensayo de fase I. A dosis de tan solo 5 mg/dfa, hubo una reduccion de varias quimiocinas y citocinas inflamatorias circulantes incluyendo MMP-9, TNFa, IL-8 y VEGF. En particular, TNFa, que se sabe que desempena un papel significativo en el proceso inflamatorio de enfermedades tales como artritis reumatoide, se redujo sustancialmente o hasta por debajo de lfmites detectables en 3 pacientes con niveles de TNF elevados en el nivel inicial (un paciente a cada una de las dosis de tratamiento de 10, 20, y 40 mg al dfa). A diferencia de los anticuerpos monoclonales anti-TNF, que se unen a y vuelven las dianas inactivas, CDDO-Me reduce la produccion de TNFa y los niveles circulantes resultantes de TNFu.

Adicionalmente, se han monitorizado los productos genicos de la fase 2, incluyendo enzimas de detoxificacion y antioxidantes, en celulas mononucleares de sangre periferica de pacientes en el estudio de fase I. Se ha observado una induccion significativa de NQO1 (NAD(P)H: quinona oxidorreductasa), un marcador de actividad transcripcional de fase 2, a dosis de 10 mg/dfa e inferiores.

Los datos de biopsias tumorales de varios pacientes, tomados despues de dos ciclos de tratamiento con CDDO-Me, indicaron reducciones pronunciadas en los niveles en tejido tumoral de ciclooxigenasa-2 (COX-2), oxido mtrico sintasa inducible (iNOS), y STAT3 fosforilado (pSTAT3). Se sabe que los altos niveles de expresion de cada una de estas protemas se correlacionan con la progresion tumoral y malos desenlaces clmicos. Los datos de biopsias tumorales en varios pacientes tambien indicaron un grado pronunciado de muerte de celulas tumorales despues de dos ciclos de tratamiento con CDDO-Me. Los niveles de creatinina en suero fueron significativamente menores en el dfa 21, en comparacion con el nivel inicial antes del tratamiento, en mas del 80% de los pacientes en este estudio. Varios pacientes que continuaron con el tratamiento durante multiples ciclos mostraron reducciones continuadas en la creatinina en suero. Puesto que la creatinina en suero es un indicador de la funcion renal usado ampliamente, estas observaciones indican que el tratamiento con CDDO-Me mejora la funcion renal.

Estos estudios proporcionan datos en pacientes humanos con cancer que muestran el efecto beneficioso del ester medico de CDDO en pacientes que tienen cancer. Los datos indican ademas que es probable que CDDO-Me tenga efectos clmicamente utiles en pacientes que tienen otras enfermedades relacionadas con la inflamacion, incluyendo la disfuncion renal.

Ejemplo 11 - Produccion a gran escala de la forma B usando un producto intermedio de solvato de dimetanol

Se disolvio un kilogramo de la forma A de CDDO-Me en metanol a 60 + 5°C para proporcionar una disolucion completa. Se anadio la disolucion de CDDO-Me caliente resultante a un recipiente que contema metanol frio a de -5°C a -15°C, mientras se mantema agitacion y una temperatura de -5°C a -15°C a lo largo de toda la adicion. Se filtro la suspension de solvato de dimetanol cristalino de CDDO-Me resultante. Se secaron los solidos resultantes, que presentaban un espectro de XRPD que concuerda con el presentado en la figura 26 (antes de analisis TGIR), en un horno a 70 + 5°C. Se continuo el secado hasta que el perfil de XRPD no presento reflexiones caractensticas de la sustancia cristalina. Se hicieron pasar los solidos de CDDO-Me amorfos en XRPD resultantes a traves de un tamiz y se envasaron. La recuperacion del producto oscila entre el 65-95%.

Ejemplo 12 - Forma A y forma B sometidas a criotrituracion

Se sometio a criotrituracion y se analizo la forma A. Los datos de rayos X medidos de la muestra obtenida a traves de criotrituracion (2 horas) mostraron cierto ensanchamiento en el pico a aproximadamente 13,5° de 20. El analisis de PDF de la forma A sometida a criotrituracion produjo resultados similares al analisis de la forma B. Estos resultados sugieren que la forma A sometida a criotrituracion es un material vftreo y que la criotrituracion puede

proporcionar un metodo alternativo para producir la forma B.

Se sometio a criotrituracion y se analizo la forma B. Los datos de rayos X medidos de la muestra obtenida a traves de criotrituracion (1 hora) fueron similares a los del material de partida de la forma B. Estos resultados indican que la forma B es estable y no cambia de forma debido a la criotrituracion.

5 Tabla 1 - Informacion de las muestras

INFORMACION DE LAS MUESTRAS

DESCRIPCION RESULTADO DE XRPD

No micronizada

Polvo blanco A

micronizada

- A

Tabla 2 - Solubilidades aproximadas de ester metflico de CDDO

DISOLVENTE

SOLUBILIDAD (mg/ml)a

Acetona

70

ACN (acetonitrilo)

66

DCM (diclorometano)

> 194

1,4-Dioxano

21

EtOH (etanol)

4

EtOAc (acetato de etilo)

36

Hexanos

< 1

(10:1) Isopropanol/agua

4

MeOH (metanol)

8

MTBE (terc-butil metil eter)

4

THF (tetrahidrofurano)

97

Tolueno

38

Agua

< 0,1

a Se calcularon las solubilidades basandose en el disolvente total usado para proporcionar una disolucion; las solubilidades reales pueden ser mayores por el volumen de las porciones de disolvente usadas o una lenta velocidad de disolucion. Se redondean las solubilidades al mg/ml mas cercano.

Tabla 3 - Experimentos de cristalizacion con ester metilico de CDDO

DISOLVENTE

CONDICIONESa HABITO/DESCRIPCION RESULTADO DE XRPD

Acetona

FE Fragmentos blancos A

SE

Vidrio roto blanco Forma B

Acetona/hexanos (3:10)

SC Ningun solido -

ACN

FE Vidrio roto blanco A + Forma B

SE Fragmentos blancos A

ACN/agua (7:5)

SC Pequenas hojas blancas A

DCM

Rotovap Vidrio roto blanco Forma B

FE Vidrio roto Forma B

SE Vidrio roto blanco Forma B

DCM/hexanos (1:5)

SC Ningun solido -

1,4-Dioxano

FD Solido blanco esponjoso Forma B

EtOH

FE Fragmentos blancos A

SE Trozos defectuosos blancos A

SC Pequenas pastillas blancas A

EtOAc

FE Vidrio roto blanco Forma B

SE Vidrio roto blanco Forma B

SC Ningun solido -

IPA/agua (10:1)

SC Pequenas pastillas blancas A

MeOH

FE Fragmentos blancos A

SE Pastillas blancas, trozos defectuosos A

SC Pastillas piramidales Ab

MTBE

FE Vidrio roto blanco Forma B

SE Vidrio roto blanco Forma B

SC Ningun solido

THF

FE Vidrio roto blanco Forma B

SE Vidrio roto blanco Forma B

THF/hexanos (1:2)

SC Ningun solido -

Tolueno

FE Fragmentos blancos Forma B

SE Vidrio roto blanco Forma B

SC Ningun solido -

-

Fusion/enfria-miento rapido Vidrio roto transparente Forma B

a FE = evaporacion rapida, SE = evaporacion lenta, SC = enfriamiento lento, las temperaturas son aproximadas, FD = liofilizacion. rotovap = evaporacion rotatoria b determinacion de la estructura de monocristal

Tabla 4 - Experimentos de suspension espesa de ester metilico de CDDO

DISOLVENTE

TIEMPO (DIAS) HABITO/DESCRIPCION RESULTADO DE XRPD

IPA/agua (10:1)

7 Pedazos blancos A

MTBE

10 Fragmentos blancos A

MeOH

10 Fragmentos blancos A

Tabla 5 - Experimentos de precipitacion en fno de ester metflico de CDDO

DISOLVENTE

ANTIDISOLVENTE HABITO/DESCRIPCION RESULTADO DE XRPD

Acetona

Hexanos Ningun solido -

Agua

Solido blanco A

DCM

Hexanos Ningun solido -

THF

Agua Solido blanco A

Tabla 6 - Datos de caracterizacion de la forma A

TECNICA ANALITICA

RESULTADOS3

XRPD

A

DSC

Desplazamiento con respecto a la lmea base a 157°C, endoterma a 224°C

TGA

perdida de peso del 0,3% hasta 150°C perdida de peso del 1,2% desde 150 hasta 210°C

KF

0,38%

Platina caliente

28,9: comienzo del calentamiento 150,1: - 176.4: - 200,2: sin cambios 225,9: fusion 227,9: punto de fusion

MB

Cambio de peso insignificante a lo largo de todo el experimento

XRPD tras MB

A

SEMb

Piramidales, pastillas y placas

RMN (CDCl3)

Concuerda con la estructura

a todas las temperaturas son en °C, endo = endoterma b resultados basados en las imagenes tomadas

Tabla 7 - Estudios de estres de la forma A

CONDICIONES3

HABITO/ descripcion RESULTADO DE XRPD

25°C/HR del 60% 3 dfas: perdida del 1,5% 7 dfas: perdida del 0,6%

Polvo blanco A

40°C/HR del 75% 3 dfas: perdida del 1,4% 7 dfas: aumento del 0,2%

Polvo blanco A

195°Cb 15 minutos: perdida del 2%

Polvo blanco A

molienda de 20 min., en seco

Polvo blanco A

molienda en humedo de 20 min., agua

Polvo blanco A

Tabla 8 - Datos de caracterizacion de la forma B de ester metflico de CDDO

TECNICA ANALITICA

RESULTADOSa

XRPD

Forma B

MDSC

Tg ~125°C

RMN (CDCh)

Concuerda con la estructura

Tabla 9 - Estudios de estres de la forma B de ester metilico de CDDO

CONDICIONESa

HABITO/DESCRIPCION RESULTADO DE XRPDc

22°C/HR del 97% 7 dfas

Vidrio roto Forma B

40°C/HR del 75% 8 dfas

Vidrio roto Forma B

80°C/HR del 0% -24 horas

Vidrio roto blanco, fragmentos redondeados transparentes Forma B

195°Cb 5 minutos

Finos blancos Forma B

200°Cb 60 minutos

Pedazos birrefringentes blancos A + Forma B (min)

a RH = humedad relativa, Tg = temperatura de transicion vftrea b humedad de lab ambiental se midio que era 74% RH

c min = minoritario

Tabla 10 - Datos cristalinos y parametros de recogida de datos de la forma A

formula

C32H43NO4

peso formula

505,70

grupo espacial

P 43 21 2 (n.° 96)

a, A

14,21620(10)

c, A

81,5875(12)

V, A3

16488,9(3)

Z

24

dcalc, g cm'3

1,222

dimensiones del cristal, mm

0,01 x 0,01 x 0,00b

temperatura, K

150.

radiacion (longitud de onda, A)

Mo Ka (0,71073)

nonocromador

grafito

coef. de abs. lineal, mm'1

0,074

correccion de absorcion aplicada

empiricala

factores de transmision: min, max

difractometro

intervalo h, k, l

intervalo de 2 0, grados

mosaicidad, grados

programas usados

F000

ponderacion 1/[ct2(Fo2)+(0,0176P)2+0,0000P] donde P=(Fo2+2Fc2)/3

datos recogidos

datos unicos

Pint

datos usados en el refinamiento

corte usado en los datos de los calculos del factor R

datos con I>2,0ct (I)

numero de variables

mayor desplazamiento/esd en el ciclo final P(Fo)

Pw(Fo2)

bondad del ajuste

a Otwinowski Z. & Minor, W. Methods Enzymol., 1997 276, 307.

b Las dimensiones del cristal son aproximadas

0,9995, 0,9999

Nonius KappaCCD

-15 a 15 -10 a 10 -86 a 72

4,08-44,43

0,32

SHELXTL

6576,0

46742

9168

0,093

9168

Fo 2>2,0o(Fo 2) 5421 1024 0,00 0,051 0,085 1,045

Tabla 11 - Resumen del area bajo la curva de concentracion en plasma (AUC) frente al tiempo en todos los animales estudiados (n=8)

ESTUDIO DE FORMULACIONES DE ESTER METWCO DE CDDO - COMPUESTO ORIGINAL

n.° de mono objeto

AUC de la forma A (ng/ml*h) AUC de la forma B (ng/ml*h) % de forma B con respecto a forma A

501M

37,5 203,4 542

502M

28,3 204,7 723

503F

21,3 107,3 504

504F

N/A 175 N/A

505M

60,4 158,3 262

506M

N/A N/A N/A

507F

57,3 164 286

508F

37,3 228 611

Media

40,4 177,2 439

Mediana

37,4 175,0 523

Intervalo (min-max)

21 -60,4 158 -228 262 - 723%

N/A - sin determinar.

Tabla 12 - Experimentos de cristalizacion de ester metilico de CDDO.

DISOLVENTE

CONDICIONESa DESCRIPCION RESULTADO DE XRPD

Benceno/acetona 10:1

RE, temperatura ambiente Solido blancos Amorfo en rayos X

Benceno/acetona 10:1

FE seguido por secado a 60°C Gel transparente -

Benceno/acetona 10:1

FE con capilares Pelfcula transparente -

Benceno/acetona 10:1

FE, se tapo y se puso en un congelador durante la noche, se rayo el vial usando una espatula de metal y se dejo evaporar a temperatura ambiente Solido blanco Solvato de benceno

Benceno/acetona 10:1

FE, se tapo y se dejo asentar a temperatura ambiente durante la noche, se rayo el vial usando una espatula de metal y se dejo evaporar a temperatura ambiente Solido blanco Solvato de benceno

Benceno/acetona 10:1

FE con sonicacion Solido blancos Solvato de benceno

a RE = evaporacion rotatoria, FE = evaporacion rapida

Tabla 13 - Caracterizacion de solvato de hemibenceno de ester metilico de CDDO

TECNICA ANAUTICA

RESULTADOS

XRPD

Solvato de hemibenceno

Endoterma 133°C

DSC, 10°C/min

Endoterma 223°C (inicio a 221°C) Perdida de peso del 7,0% hasta 160°C

TG, 10°C/min

Corresponde a 0,5 moles de benceno

'H-RMN (CDCl3)

Concuerda con la estructura ~0,5 moles de benceno evidentes

5

Tabla 14 - Characterizacion de Ester metilico de CDDO Solvato de dimetanol

TECNICA ANAUTICA

RESULTADOS

XRPD

Solvato de dimetanol

DSC, 10°C/min

Endoterma a 102°C Desplazamiento con respecto a la lmea base a 130°C Exoterma ancha a 203°C

Endoterma a 225°C (inicio: 223°C)

TG, 10°C/min

Perdida de peso del 11% hasta 110°C Corresponde a ~2,0 moles de metanol

TGIR, 20°C/min

Perdida de peso del 9,8% hasta 110°C Corresponde a ~1,7 moles de metanol Componente volatil identificado como metanol

XRPD tras TGIR

Amorfo en rayos X

IR

Concuerda con la estructura

1H-NMR (CDCl3)

Concuerda con la estructura ~1,7 moles de metanol evidentes

Tabla 15 - Estudios de estres de la forma B micronizada de ester metflico de CDDO

FORMA B PRODUCIDA MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO DEL EJEMPLO 11 FORMA B PRODUCIDA MEDIANTE AISLAMIENTO A PARTIR DE MEZCLAS DE ACETATO DE ETILO Y ETANOL

Condiciones de estres3

Resultado de XRPD Resultado de KF Resultado de XRPD Resultado de KF

80°C/P2O5, 14d

Forma B NP NP NP

80°C/ P2O5, 28 d

Forma B 1,10 100% de forma A 0,37

60°C/23% RH, 28d

Forma B 0,04 -50% de forma A + Forma B 0,02

40°C/48% RH, 28d

Forma B 0,00b Forma B 0,39

25°C/HR del 75%, 14d

Forma B NP NP NP

25°C/HR del 75%, 28d

Forma B 0,77 Forma B 0,58

a RH = humedad relativa b El valor actual fue negativo

Tabla 16 - Actividad anticancengena del agente individual CDDO-Me

MODELO

AGENTE/VIA ACTIVIDAD FARMACOLOGICA COMENTARIOS

Xenoinjerto de cancer de pulmon NCI-H460 (rata atfmica)

CDDO-Me, v.o. 78% de TGI1 Efectos dependientes de dosis. CDDO-Me tan eficaz como la

Xenoinjerto de cancer de mama MCF-7/Her-2 (raton atimico)

CDDO-Me, i.v. 15% de regresion radiacion

Modelo de metastasis de cancer de mama singenico 4T1 (raton) - tratamiento temprano

CDDO-Me, i.v. 100% de supresion Resultados superiores obtenidos en tumores que sobre expresaron Her- 2a

Modelo de metastasis de cancer de mama singenico 4T1 (raton) -

Todos los animales quedaron libres de tumores en el dfa de sacrificio el

tratamiento retrasado

CDDO-Me, i.v. 67% de supresion dfa 85b

Xenoinjerto de cancer de pancreas L3.6PL (raton atimico)

33% de los animales libres de tumores en el d^a de sacrificio el d^a

CDDO-Me,

i.v 51% de TGI 952

Xenoinjerto de cancer de prostata DU-145 (rata atfmica)

CDDO-Me, v.o. 77% de TGI CDDO-Me supera Gemcitabine

Multiples pautas sometidas a prueba - TGI 60-77%

1-----------------------------------------------------------------------------1----------------------------------------1--------------------------------------------------------1------------------------------------------------------------------------------

TGI = los datos de inhibicion del crecimiento tumoral son de dosis a o inferiores a la MTD (definida como <10% de

mortalidad y <20% de perdida de peso).

Tabla 20 - Disoluciones preparadas para secado por pulverizacion

RAZON DE SOLIDOS

40% de la forma B, 60% de polfmero 60% de la forma B, 40% de polfmero

POLIMERO

Copolfmero de acido metacnlico de tipo C HPMCP HP-55

DISOLVENTE

Acetona Acetona

CONC. % p/p

10 10

TEMPERATURA °C

-20 -20

OBSERVACIONES

La disolucion mostro cierta turbidez que tras la carga del polfmero. Se calento una muestra de la solucion hasta 35/40°C, pero la turbidez no desaparecio y se observo cierta floculacion. La disolucion era completamente transparente tras la carga del polfmero. Las dos ejecuciones realizadas usaron la disolucion en el mismo dfa que se preparo.

a Konopleva, et al., “Synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid induce growth arrest in HER2-overexpressing breast cancer cells, “Mol Cancer Ther. 2006, 5: 317-28. b Ling, et al., “The novei triterpenoid C-28 methyl ester of 2-cyano-3,12-dioxoolen-1, 9-dien-28-oic acid inhibits metastatic murine breast tumor growth through inactivation of STAT3 signaling,” Cancer Res. 2007, 67: 4210-8.

Tabla 21 - Caractensticas de las formulaciones sometidas a prueba

PoKmero

Copolimero de acido metacrilico, tipo C HPMCP HP-55

Pruebas

Descripcion

Solido blanco Solido blanco

Difraccion de rayos X de polvo

No se detectaron picos cristalinos No se detectaron picos cristalinos

Agua

1,50% p/p -

DSC - Tg (punto de inflexion)

106°C 118°C

Valoracion (mediante HPLC)

409% p/p (calculado con respecto a una base anhidra y libre de disolvente) 59,4% p/p (calculado con respecto a una base anhidra y libre de disolvente)

Total de impurezas (HPLC)ti

area del 1,14% area del 0,42%

Tamano de partfcula (D50)

21 pm

Densidad aparente

0,18g/cm3 (calculado con 4 g de producto) 0,19 g/cm3 (calculado con 4 g de producto)

Tabla 22 - Concentraciones medias de CDDO-Me en plasma de monos macacos en muestras de fase 2 y 3

Concentraciones medias de ester metftico de CDDO (ng/ ml)

Tiempo

Forma A v.o. (nanocristalina) Forma B v.o. (micronizada) Forma A v.o. (micronizada cristalina) Forma B v.o. (PVP/VA) Forma B v.o. (HPMCP) Forma B v.o. (Eudragit L100-55)

Antes de la dosis

BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ

5 min

NST NST NST NST NST NST

10 min

NST NST NST NST NST NST

15 min

NST NST NST NST NST NST

30 min 1 h

NST NST NST NST NST NST

1,53 ± 1,49

6,01 ± 5,67 0,619 ± 0,207 9,45 ± 3,64 9,94 ± 4,83 9,06 ± 4,38

2 h

3,00 ± 2,02 14,5 ± 9,63 0,505 ± 0,260 14,8 ± 3,04 24,1 ± 13,2 22,2 ± 11,7

4 h

3,52 ± 1,30 32,0 ± 11,6 1,15 ± 0,73 27,3 ± 3,79 50,7 ± 10,0 50,6 ± 19,3

8 h

8,56 ± 2,32 33,3 ± 8,44 4,31 ± 1,35 30,4 ± 10,8 40,0 ± 15,6 51,1 ± 8,72

16 h

CD CM CM +1 O o> N.’ 00 CD LO +1 CM 5,39 ± 1,12 13,3 ± 3,92 cn 1+ -m 4^ (J) CO +1 CD LO CM

24 h 36 h

4,40 ± 2,33 5,23 ± 1,86 3,05 ± 1,42 6,39 ± 2,02 5,79 ± 2,95 7,47 ± 4,10

48 h

NST NST NST NST NST NST

72 h

0,649 ± 0,342 0,576 ± 0,175 0,419 ± 0,291 1,78 ± 1,61 0,983 ± 0,34 1,37 ± 0,626

0,312 ± 0,390

0,408 ± 0,368 0,0169 ± 0,0252 0,395 ± 0,319 0,448 ± 0,283 0,344 ± 0,461

NST No se tomo muestra. i.v. administracion intravenosa.

BLQ Por debajo del Kmite de cuantificacion (1,00 ng/ml). v.o. Administracion oral mediante capsula.

Los valores en negrita y cursiva se calcularon usando todos los valores presentados en el Apendice 3, por consiguiente la media puede diferir de las medias calculadas cuando se supone que los valores que estan BLQ son cero.

Publicaciones citadas

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Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. 2-ciano-3,12-dioxoleana-1,9(11)-dien-28-oato de metilo (ester metflico de CDDO) anhidro, cristalino, caracterizado por que su difractograma de rayos X de polvo comprende picos a 8,78° 20, 12,94 20, 13,35° 20, 14,18° 20, y 17,4° 20 ± 0,2° 20 basado en los datos recogidos en un difractometro con radiacion Ka de Cu.
2. 2. El ester metflico de CDDO segun la reivindicacion 1, en donde el difractograma de rayos Xde polvo es sustancialmente como se muestra en la figura 18.
3. 3. El ester metflico de CDDO segun la reivindicacion 1, que ademas se caracteriza por qie su curva de calorimetna diferencial de barrido comprende un desplazamiento de la lmea de base a aproximadamente 157°C y un maximo de endoterma a aproximadamente 224°C.
4. 4. El ester metflico de CDDO segun la reivindicacion 3, en donde la curva de calorimetna diferencial de barrido es sustancialmente como se muestra en la Figura 3.
5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del ester metflico de CDDO segun la reivindicacion 1, y uno o mas vehuculos solidos farmaceuticamente aceptables.
6. 6. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5, en donde el ester metflico de CDDO esta micronizado y los vehfculos solidos farmaceuticamente aceptables son vehfculos comestibles.
7. 7. Ester metfclico de CDDO segun la reivindicacion 1 para uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria cronica en un sujeto que la sufre.
8. 8. Hemibencenato ester metflico de CDDO cristalino, caracterizado por que su difractograma de rayos X de

   polvo comprende picos a 9,25° 20, 14,17° 20, 14,62° 20, 16,32° 20, y 17,11° 20 ±0,2° 20 basado en los datos

   recogidos en un difractometro con radiacion Ka de cobre.
9. 9. El hemibencenato de ester metilico de CDDO cristalino segun la reivindicacion 8, que ademas se caracteriza por que tiene una curva de calorimena diferencial de barrido como se muestra sustancialmente en la figura 23.
10. 10. Una forma solida de ester metilico de CDDO preparada mediante un procedimiento que comprende la etapa de criotriturar el eter metilico de CDDO segun la reivindicacion 2.