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ES2682750T3 - Método de tinción reversible de una célula diana - Google Patents

Método de tinción reversible de una célula diana Download PDF

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ES2682750T3
ES2682750T3 ES12747985.5T ES12747985T ES2682750T3 ES 2682750 T3 ES2682750 T3 ES 2682750T3 ES 12747985 T ES12747985 T ES 12747985T ES 2682750 T3 ES2682750 T3 ES 2682750T3
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Christian STEMBERGER
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Lothar Germeroth
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Abstract

Un método in vitro de tinción reversible de una célula diana, comprendiendo dicha célula diana una molécula de receptor sobre la superficie de la misma, con una marca detectable, comprendiendo el método: poner en contacto una mezcla de células que comprende dicha célula diana con (i) un reactivo de unión a receptor, comprendiendo el reactivo de unión a receptor al menos un sitio de unión B, en el que el sitio de unión B se une específicamente a dicha molécula de receptor, en el que la constante de la velocidad de disociación (kdis) como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales para la unión entre dicho reactivo de unión a receptor mediante el sitio de unión B y dicha molécula de receptor tiene un valor de 0,5 x 10-4 s-1 o mayor, comprendiendo el reactivo de unión a receptor además al menos un componente de unión C, en el que el componente de unión C es capaz de ser reversiblemente unido a un sitio de unión Z de un reactivo de multimerización, (ii) un reactivo de multimerización, comprendiendo el reactivo de multimerización al menos dos sitios de unión Z para la unión reversible del componente de unión C del reactivo de unión a receptor, en el que el reactivo de unión a receptor (i) y el reactivo de multimerización (ii) forman complejos de unión multivalentes que se unen a dicha célula diana, comprendiendo cada complejo de unión multivalente al menos dos de dichos reactivos de unión a receptor unidos a uno de dicho reactivo de multimerización, proporcionando dicho complejo de unión multivalente elevada avidez, con respecto a dicho reactivo de unión a receptor; y (iii) dicha marca detectable unida o capaz de unirse a dicho complejo de unión multivalente, en el que dicha célula diana se tiñe uniendo dicho complejo de unión multivalente a dicha célula diana, y en el que la tinción de dicha célula diana es reversible tras la rotura de la unión entre dicho componente de unión C de dicho reactivo de unión a receptor y dichos sitios de unión Z de dicho reactivo de multimerización, en el que dicho reactivo de unión a receptor que se une específicamente a dicha molécula de receptor se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo divalente, un fragmento de anticuerpo monovalente, una molécula de unión proteinácea con propiedades de unión de tipo anticuerpo y una molécula de MHC, en el que dicha célula diana es una célula de mamífero.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de tincion reversible de una celula diana Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos de tincion reversible de una celula diana. La invencion tambien se refiere a metodos de aislamiento de una celula diana o una poblacion de celulas diana que se definen por la presencia de al menos una molecula de receptor espedfico comun. La invencion tambien proporciona kits que se pueden usar para llevar a cabo los metodos de la invencion.
Antecedentes de la invencion
La terapia celular ha demostrado ser altamente eficaz para el tratamiento de varias enfermedades. Por ejemplo, se pueden curar inmunodeficiencias primarias por trasplante de celulas madre hematopoyeticas (HSCT) y se puede llevar alguna leucemia a remision completa por HSCT alogeno e infusion de linfocitos de donante (DLI) combinado (Kolb, H.J. et al., Donor leukocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplant patients. Blood 76 (12), 2462-2465 (1990)). En alguna practica clmica, la transferencia adoptiva de linfocitos T espedficos de virus es muy eficaz para reconstituir pacientes inmunodeprimidos contra complicaciones potencialmente mortales producidas por la reactivacion de citomegalovirus (CMV) (Riddell, S.R. et al., Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science 257 (5067), 238-241 (1992)), o enfermedades linfoproliferativas mediadas por el virus de Epstein-Barr (VEB) (Rooney, C.M. et al., Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet 345 (8941), 9-13 (1995)). Similarmente, linfocitos T dirigidos a antigeno de tumor, ya sea derivados de linfocitos autologos infiltrantes de tumor o cultivados o manipulados in vitro, son candidatos prometedores para terapias mejoradas.
Independientemente de estas interesantes observaciones clmicas, se espera todavfa una transferencia mas ancha de la terapia celular a aplicaciones clmicas. Esto es principalmente debido al hecho de que la mayona de los procedimientos usados para generar preparaciones de celulas para inmunoterapia son muy laboriosos, requieren mucho tiempo y son caros. Ademas, normalmente se necesita enriquecer a altas purezas las poblaciones de celulas que se sabe que median en los efectos clmicos, puesto que celulas 'no deseadas' contaminantes pueden mediar en efectos secundarios peligrosos y algunas veces potencialmente mortales (como linfocitos T alorreactivos que median en enfermedad de injerto contra huesped (GvHD) tras el trasplante alogeno de celulas madre y/o tratamiento con DLI). Como se ha mostrado que numeros ya muy bajos de linfocitos T adoptivamente transferidos pueden contribuir a los beneficiosos efectos clmicos, tambien se aplicaran reglas similares para poblaciones de celulas que median en efectos secundarios negativos. Por tanto, el proporcionar altas purezas de preparaciones de celulas bien definidas aplicables para terapia llegara a ser clave para hacer estas prometedoras terapias mas eficaces y predecibles, ademas de para reducir el riesgo de posibles efectos secundarios.
Los actuales metodos para la purificacion de celulas clmicas mediada por marcador superficial normalmente se basan en parametros individuales (por ejemplo, CD34, multimeros de MHC). Sin embargo, para la mayona de las poblaciones de celulas - ya sea directamente derivadas ex vivo o despues de cultivo celular in vitro - es necesaria una combinacion de diferentes marcadores superficiales con el fin de segregar realmente estas celulas de otras. Por ejemplo, los linfocitos T reguladores (Tregs) que existen de forma natural representan un prometedor subconjunto de celulas, que podna ser capaz de prevenir GvHD aguda tras HSCT 4 alogeno o el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias (Riley, J.L., June, C.H., & Blazar, B.R., Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity 30 (5), 656-665 (2009), Randolph, D.A. & Fathman, C.G., Cd4+Cd25+ regulatory T cells and their therapeutic potential. Annu Rev Med 57, 381-402 (2006)).
Ademas de la expresion de CD4, que se comparte por un gran numero de celulas, se necesitan marcadores adicionales como su expresion constitutiva de la cadena a del receptor de IL-2 de alta afinidad (CD25) para reducir mas la heterogeneidad. Sin embargo, CD25 tambien se expresa en una gran fraccion de linfocitos no reguladores, que incluyen linfocitos T efectores y de memoria recientemente activados. Por tanto, se han sugerido patrones de tincion combinatoria, como combinaciones de CD4, CD25, CD127 y CD45RA (Miyara, M. et al., Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. Immunity 30 (6), 899-911 (2009), Hoffmann, P. et al., Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion . Blood 108 (13), 4260-4267 (2006)) para identificar con mas precision este subconjunto de linfocitos T clmicamente relevante.
Todas las tecnicas de separacion de celulas basadas en marcadores clmicos actualmente disponibles utilizan perlas paramagneticas, que retienen las poblaciones de celulas marcadas dentro de un campo magnetico. Asf, estrategias de enriquecimiento positivo que usan poblaciones diana directamente marcadas dan las purezas mas altas. Sin embargo, todavfa son diffciles de lograr combinaciones de purificaciones mediante varios marcadores diferentes, aunque son necesarias para aislar distintas poblaciones de celulas de la pureza mas alta. Ademas, despues de la seleccion positiva, tanto las marcas como las perlas normalmente quedan sobre el producto celular, manipulando
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posiblemente la poblacion de celulas aisladas o afectando negativamente su funcionalidad/viabilidad, por ejemplo, por el bloqueo de receptores. Especialmente con respecto a la clasificacion de celulas clmicas, las restantes marcas de celulas producen sustanciales cargas reguladoras para la aplicabilidad de los productos de celulas en pacientes. Con el fin de evitar los problemas de seleccion positiva, se han cambiado muchos procedimientos de procesamiento de celulas clmicas a contextos de agotamiento. Desafortunadamente, las purezas de las celulas diana son frecuentemente malas y los metodos de agotamiento frecuentemente requieren una mezcla complicada de diferentes anticuerpos, que hace que su produccion y aplicacion sea laboriosa y cara. Un enfoque para el aislamiento funcional de celulas tales como linfocitos T espedficos de antfgeno se describe en la solicitud de patente internacional WO 02/054065, la patente de EE.UU. 5.985.658 y por Knabel et al., Nature Medicine, 2002, 8(6):631- 637. En estas publicaciones se desvela un metodo para la tincion reversible y el aislamiento funcional o caracterizacion de tales celulas, tambien denominada tecnologfa "Streptamer®". La metodologfa descrita en el documento WO 02/054065, la patente de EE.UU. 5.985.658 y Knabel et al. se ha usado por Schmitt et al., Transfusion, 2010, 51(3):591-599 al nivel de buenas practicas de fabricacion (GMP) para la transferencia adoptiva de linfocitos T espedficos de CMV en pacientes con leucemia aguda con antigenemia de CMV recurrente alta despues del trasplante alogeno de celulas madre. Schroeder, Nach Zellen angeln, Faszination Forschung, 30 de junio de 2010, paginas 28-37, Odendahl et al., Vox Sanguinis, 2010, 99(Suppl.1):491-491, Casalegno-Garduno et al., Cancer Immunology immunotherapy, 2009, 59(2):195-202, Neudorfer et al., Journal of Immunological Methods, 2007, 320(1-2):119-131, Bouquie et al., Cancer Immunology immunotherapy, 2009, 58:553-566 describen aplicaciones practicas adicionales de esta metodologfa. Ademas, Matsui et al., PNAS, 1994, 91:12862-12866 D3 desvela las constantes de velocidad de disociacion del complejo de TCR con peptido de citocromo c soluble/I-Ek.
Asf, todavfa existe la necesidad de proporcionar un metodo para la purificacion o aislamiento de celulas que permita, por ejemplo despues de la clasificacion de las celulas, la liberacion y eliminacion completa de todos los componentes de los reactivos de union a receptor y de tincion de la poblacion de celulas purificadas.
Sumario de la invencion
En un aspecto la invencion proporciona un metodo in vitro de tincion reversible de una celula diana, comprendiendo dicha celula diana una molecula de receptor sobre la superficie de la misma, con una marca detectable, comprendiendo el metodo:
poner en contacto una mezcla de celulas que comprende dicha celula diana con
(i) un reactivo de union a receptor, comprendiendo el reactivo de union a receptor al menos un (cualquier) sitio de union B, en el que el sitio de union B se une espedficamente a dicha molecula de receptor, en el que la constante de la velocidad de disociacion (kdis) como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales para la union entre dicho reactivo de union a receptor mediante el sitio de union B y dicha molecula de receptor tiene un valor de 0,5 x 10-4 s'1 o mayor, comprendiendo el reactivo de union a receptor ademas al menos un componente de union C, en el que el componente de union C es capaz de ser unido (reversiblemente) a un sitio de union Z de un reactivo de multimerizacion,
(ii) un reactivo de multimerizacion, comprendiendo el reactivo de multimerizacion al menos dos sitios de union Z para la union reversible del componente de union C del reactivo de union a receptor, en el que el reactivo de union a receptor (i) y el reactivo de multimerizacion (ii) forman (una pluralidad de) complejos de union multivalentes que se unen a dicha celula diana, comprendiendo cada complejo de union multivalente al menos dos de dichos reactivos de union a receptor unidos a uno de dicho reactivo de multimerizacion, proporcionando dicho complejo de union multivalente elevada avidez, con respecto a dicho reactivo de union a receptor; y
(iii) dicha marca detectable unida a dicho complejo de union multivalente,
en el que dicha celula diana se tine uniendo dicho complejo de union multivalente a dicha celula diana, y en el que la tincion de dicha celula diana es reversible tras la rotura de la union entre dicho componente de union C de dicho reactivo de union a receptor y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion, en el que dicho reactivo de union a receptor que se une espedficamente a dicha molecula de receptor se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo divalente, un fragmento de anticuerpo monovalente, una molecula de union proteinacea con propiedades de union de tipo anticuerpo y una molecula de MHC, en el que dicha celula diana es una celula de mairnfero.
En el presente documento tambien se desvela el uso de tal metodo de tincion para el aislamiento de una poblacion de celulas diana que se define por la presencia de una molecula de receptor (al menos una espedfica comun).
En el presente documento tambien se desvela un kit para la tincion reversible de una celula diana (o aislamiento de una celula diana), comprendiendo dicha celula diana una molecula de receptor sobre su superficie, con una marca detectable. Un kit tal comprende:
(i) al menos un reactivo de union a receptor que comprende un (cualquier) sitio de union B que se une espedficamente a dicha molecula de receptor, en el que la constante de la velocidad de disociacion (kdis)
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para la union entre dicho reactivo de union a receptor mediante el sitio de union B y dicha molecula de receptor de union tiene un valor de aproximadamente 0,5 x 10-4 s-1 o mayor, y comprendiendo el reactivo de union a receptor ademas al menos un componente de union C, en el que el componente de union C es capaz de ser (reversiblemente) unido por un sitio de union Z de un agente de multimerizacion,
(ii) al menos un reactivo de multimerizacion que comprende al menos dos sitios de union Z para dicho componente de union C del reactivo de union a receptor, en el que el componente de union C y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion son capaces de formar un enlace reversible,
(iii) una marca detectable unida o capaz de unirse al reactivo de union a receptor (i) y/o el reactivo de multimerizacion (ii).
En el presente documento tambien se desvela el uso de un reactivo de union a receptor que se une espedficamente a una molecula de receptor, comprendiendo el reactivo de union a receptor al menos un sitio de union B, en el que el sitio de union B se une espedficamente a dicha molecula de receptor, en el que la constante de la velocidad de disociacion (kdis) para la union entre dicho reactivo de union a receptor mediante el sitio de union B y dicha molecula de receptor tiene un valor de aproximadamente 0,5 x 10-4 s-1 o mayor, para un metodo de tincion reversible de una celula diana.
En el presente documento tambien se desvela un metodo de tincion reversible de una celula diana, comprendiendo dicha celula diana una (al menos una) molecula de receptor sobre la superficie de la misma, con una marca detectable, comprendiendo el metodo:
poner en contacto una mezcla de celulas que comprende dicha celula diana con
(i) al menos dos tipos de un reactivo de union a receptor, comprendiendo cada tipo de reactivo de union a receptor al menos un sitio de union B, en el que el sitio de union B de cada tipo de reactivo de union a receptor se une espedficamente a dicha molecula de receptor, en el que la constante de la velocidad de disociacion (kdis) para la union entre cada tipo de dicho reactivo de union a receptor mediante el sitio de union B y dicha molecula de receptor tiene un valor de aproximadamente 0,5 x10-4 s-1 o mayor, comprendiendo cada tipo de reactivo de union a receptor ademas al menos un componente de union C, en el que el componente de union C de cada tipo de reactivo de union a receptor es capaz de ser reversiblemente unido a un sitio de union Z de un reactivo de multimerizacion,
(ii) un reactivo de multimerizacion, comprendiendo el reactivo de multimerizacion al menos un sitio de union Z para la union reversible del componente de union C de cada tipo del reactivo de union a receptor,
en el que los al menos dos tipos de reactivo de union a receptor (i) y el reactivo de multimerizacion (ii) forman (una pluralidad de) complejos de union multivalentes que se unen a dicha celula diana, comprendiendo cada complejo de union multivalente al menos uno de cada tipo de reactivo de union a receptor unido a uno de dicho reactivo de multimerizacion, proporcionando dicho complejo de union multivalente elevada avidez, con respecto a cada tipo de dicho reactivo de union a receptor; y
(iii) dicha marca detectable unida a dicho complejo de union multivalente,
en el que dicha celula diana se tine uniendo dicho complejo de union multivalente a dicha celula diana, y en el que la tincion de dicha celula diana es reversible tras la rotura de la union entre dicho componente de union C de cada tipo de dicho reactivo de union a receptor y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion.
En el presente documento tambien se desvela un kit de reactivos para la tincion reversible (o aislamiento) de una celula diana, comprendiendo dicha celula diana una molecula de receptor sobre la superficie de la misma, con una marca detectable, comprendiendo el kit: (i)
(i) al menos dos tipos de un reactivo de union a receptor que comprenden un sitio de union B que se une espedficamente a dicha molecula de receptor, en el que la constante de la velocidad de disociacion (kdis) para la union entre cada tipo de dicho reactivo de union a receptor mediante el sitio de union B y dicha molecula de receptor de union tiene un valor de aproximadamente 0,5 x 10-4 s-1 o mayor, y comprendiendo cada tipo de reactivo de union a receptor ademas al menos un componente de union C, en el que el componente de union C de cada tipo del reactivo de union a receptor es capaz de ser (reversiblemente) unido por un sitio de union Z de un reactivo de multimerizacion,
(ii) al menos un reactivo de multimerizacion que comprende al menos un sitio de union Z para dicho componente de union C de cada tipo del reactivo de union a receptor, en el que el componente de union C de cada tipo de reactivo de union y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion son capaces de formar un enlace reversible,
(iii) una marca detectable unida o capaz de unirse al reactivo de union a receptor (i) y/o el reactivo de multimerizacion (ii).
Breve descripcion de los dibujos
La invencion se entendera mejor con referencia a la descripcion detallada cuando se considera conjuntamente con los ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos, en los que:
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La Fig. 1 representa el principio del metodo de tincion reversible de la invencion usando un fragmento Fab como (al menos un) reactivo de union a receptor (en el caso de un fragmento Fab y tambien generalmente en una realizacion de la invencion, el reactivo de union a receptor puede tener un unico sitio de union para la molecula de receptor). La Fig. 1a muestra un ejemplo ilustrativo de un fragmento Fab que se usa como reactivo de union a receptor, en el que un peptido de union a estreptavidina, Strep-tag®, es el componente de union C del reactivo de union a receptor. En esta realizacion, el peptido de union a estreptavidina esta fusionado o conjugado con el fragmento Fab para formar el reactivo de union a receptor. En este ejemplo como se muestra en la Fig. 1a, el reactivo de multimerizacion que comprende al menos dos sitios de union Z para dicho al menos un componente de union C es una estreptavidina-mutema ("Strep-Tactin®"). En el ejemplo de la Fig.
la, el reactivo de multimerizacion lleva una marca fluorescente tal como ficoeritrina. En el ejemplo de la Fig.
lb, nuevamente un fragmento Fab se muestra junto con un reactivo de multimerizacion que esta conjugado con una perla magnetica que sirve de marca. El metodo de tincion reversible usando la formacion de complejos de union multivalentes entre la estreptavidina-mutema y un fragmento Fab mediante el peptido de union a estreptavidina tambien se denomina en el presente documento "tincion de multfmeros de Fab". La Fig. 1c representa una vision general esquematica de este metodo de tincion reversible de multfmeros de Fab. En este ejemplo, se tinen/afslan celulas diana de una mezcla de celulas presentes en una muestra de sangre. Se multimerizan reversiblemente fragmentos Fab con una velocidad kdis de aproximadamente 0,5 x 10"4 s"1 o mayor para la union a una molecula de receptor celular que esta presente sobre una celula diana por formacion de complejos Strep-tag®/Strep-Tactin®. Se tinen celulas diana con el complejo de union multivalente (poniendo en contacto las celulas con el reactivo de multimerizacion y el reactivo de union a receptor como se muestra en la etapa a) de la Fig. 1c) y se separan opcionalmente de otras celulas que carecen de la molecula de receptor de la superficie celular relacionada, por ejemplo, por citometna de flujo activada por fluorescencia (tambien conocida con la marca registrada "FACS™" en la etapa b) de la Fig. 1c). El posterior tratamiento de celulas diana tenidas aisladas con el ligando de Strep-Tactin® D-biotina que compite con el peptido Strep-tag® produce el desplazamiento de los fragmentos Fab del reactivo de multimerizacion, liberando asf el reactivo de multimerizacion (complejo de Strep-Tactin®) de la celula diana (como se muestra en la etapa c) de la Fig. 1c). Los restantes fragmentos Fab, sin complejar de Strep-Tactin®, se disocian (espontaneamente) en una ventana de tiempo razonable debido a su alta velocidad kdis y se pueden eliminar completamente de la superficie de la celula diana lavando (etapa d) de la Fig. 1c). El lavado se puede llevar a cabo en un volumen diluyendo los fragmentos Fab durante cada etapa de lavado hasta al menos una concentracion igual a la constante de disociacion de afinidad (Kd) para la union entre el fragmento Fab y la molecula de receptor de la superficie celular relacionada. La Fig. 1d muestra el procedimiento de tincion analogo al de la Fig. 1c en el que el reactivo de multimerizacion se conjuga con una perla magnetica y en el que la etapa de tincion/separacion incluye separacion de celulas tenidas de celulas no tenidas mediante una columna magnetica a la que se unen las celulas tenidas.
La Fig. 2 muestra las caractensticas de union requeridas para la tincion reversible de multfmeros de Fab. La Fig. 2 muestra un analisis de FACS de tincion de multfmeros de Fab anti-CD4 con diferentes mutantes de Fab anti-CD4 con velocidades kdis crecientes para la union de los fragmentos Fab a CD4 como molecula de receptor (se enumera un resumen de la union cinetica de los fragmentos Fab en la Tabla 1). Se tineron celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) con fragmentos Fab anti-CD4 (reactivo de union a receptor) fusionados a una disposicion secuencial de dos secuencias de Strep-tag® (comercialmente disponible con el nombre comercial "One-STrEP-tag"; componente de union C) y multimerizados sobre Strep-Tactin® marcada con ficoeritrina (Strep-Tactin PE; IBA GmbH, Gottingen, Alemania; reactivo de multimerizacion que comprende al menos 2 sitios de union Z para el componente de union C) y se analizaron ya fuera antes (segunda columna) o despues del tratamiento con D-biotina (tercera columna). Los restantes monomeros de Fab (es decir, fragmentos Fab usados como reactivo de union a receptor) sobre la superficie de la celula diana se detectaron entonces despues de posteriores etapas de lavado para eliminar los monomeros de Fab usando Strep-Tactin PE solo (sin fragmentos Fab unidos) (cuarta columna). Se realizo otra vez la tincion de multfmeros de Fab despues de la tincion reversible descrita anteriormente de las celulas (quinta columna) para controlar el final de la eliminacion de biotina que de otro modo habna impedido la tincion de los restantes monomeros de Fab con Strep-Tactin PE solo (sin fragmentos Fab unidos) como se muestra en la cuarta columna y que asf habna inducido una conclusion erronea del experimento. Alternativamente, se incubaron celulas con fragmentos Fab monomericos, se lavaron y posteriormente se analizaron despues de la tincion con Strep-Tactin® PE (primera columna, es decir, primera columna a la izquierda). Se muestran linfocitos T CD3+ vivos. Los numeros en los graficos de puntos indican el porcentaje de celulas dentro de las puertas.
La Fig. 3 muestra, alternativamente al analisis de FACS de la Figura 2, un analisis de transferencia Western de reversibilidad de la tincion de multfmeros de Fab. Se generaron multfmeros de Fab de CD4 con los diferentes mutantes de Fab anti-CD4 enumerados en la Tabla 1 y se especificaron ademas en la Figura 2 y Strep-Tactin® PE (IBA GmbH, Gottingen, Alemania). Se incubaron CMSP con los diferentes multfmeros de Fab de CD4 y se verifico tincion celular coherente en cada muestra por citometna de flujo (lmea continua en comparacion con el histograma tenido que representa celulas sin tenir). Entonces, las celulas se trataron con D-biotina y posteriormente se lavaron. Finalmente, se lisaron las celulas lavadas, y las fracciones solubles (S) e insolubles (I) se analizaron para los monomeros de Fab restantes usando anticuerpos anti-Strep-tag® altamente espedficos (conjugado StrepMAB-peroxidasa de rabano picante (HRP) clasica; IBA GmbH, Gottingen, Alemania). Para controlar la aplicacion de cantidades coherentes de material celular insoluble, se detecto simultaneamente p-actina con un anticuerpo primario contra p-actina de conejo (Santa Cruz Biotechnology Inc.,
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Santa Cruz, EE.UU.) y un anticuerpo secundario contra Ig de conejo (inmunoglobulina) conjugado con HRP (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para la tincion reversible de una celula diana o una poblacion de celulas diana que tiene una molecula de receptor sobre la superficie celular. La invencion se basa en el hallazgo de que, a diferencia de los metodos descritos en la patente de EE.UU. 7.776.562 o la solicitud de patente internacional WO02/054065, no es esencial para la reversibilidad de un metodo tal que se de una union de baja afinidad entre un reactivo de union a receptor y una molecula de receptor sobre la superficie de la celula diana. Mas bien, se ha encontrado en la actual invencion que independientemente de la intensidad de la union, que significa si la constante de disociacion (Kd) para la union entre el reactivo de union a receptor y la molecula de receptor es de baja afinidad, por ejemplo, en el intervalo de una Kd de aproximadamente 10-3 a aproximadamente 10-7 M, o de alta afinidad, por ejemplo, en el intervalo de una Kd de aproximadamente 10-7 a aproximadamente 1 x 10-10 M, una celula diana se puede tener reversiblemente en tanto que la disociacion de la union del reactivo de union a receptor mediante el sitio de union B y la molecula de receptor se produzca suficientemente rapido. Expresado en terminos de la velocidad kdis (tambien denominada constante de la velocidad de disociacion para la union entre el reactivo de union a receptor (mediante el sitio de union B) y la molecula de receptor, la velocidad kdis es aproximadamente 0,5 x 10-4 s-1 o mayor, aproximadamente 1x10-4 s-1 o mayor, aproximadamente 2x10-4 s-1 o mayor, aproximadamente 3x10-4 s-1 o mayor, aproximadamente 4 x 10-4 s-1 de mayor, aproximadamente 5 x 10-4 s-1 o mayor, aproximadamente 1 x 10-3 s-1 o mayor, aproximadamente 1,5 x 10-3sec-1 o mayor, aproximadamente 2 x 10-3 s-1 o mayor, aproximadamente 3 x 103 s-1 o mayor, aproximadamente 4 x 10-3 s-1, aproximadamente 5 x 10-3 s-1 o mayor, aproximadamente 1 x 10-2 s-1 o mayor, o aproximadamente 5x10-1 s-1 o mayor. El termino "aproximadamente", cuando se usa en el presente documento en relacion con la velocidad kdis, la velocidad kaso Kd pretende incluir un margen de error de ± 0,1 %, ± 0,2 %, ± 0,3 %, ± 0,4 %, ± 0,5 %, ± 0,7 ± 0,9, %± 1,0, %, ± 1,2 %, ± 1,4 %±1,6 %, ± 1,8, %± 2,0 %, ± 2,2 %, ± 2,4, %, ± 2,6 %, ± 2,8 %, ± 3,0 %, ± 3,5 %, ± 4,0. %, ± 4,5 %, ± 5,0 %, ± 6,0 %, ± 7,0 %, ± 8,0 %, ± 9,0 %, ± 10,0 %, ± 15,0 %o ± 20,0%.
En este contexto, se observa que la formacion del complejo (C) entre un reactivo de union a receptor L y su receptor P, por ejemplo, un molecula de receptor de la superficie celular se puede describir por un proceso de dos estados indicado
imagen1
La constante de disociacion Kd correspondiente se define
imagen2
en la que [P], [L] y [C] son las concentraciones molares en equilibrio del receptor, el reactivo de union a receptor (ligando) y el complejo respectivo a una temperatura y presion dadas. La constante de disociacion Kd tambien se puede expresar como la relacion de la constante de la velocidad de asociacion (kas) para la velocidad de asociacion/formacion (tambien denominada constante de la velocidad de asociacion) del complejo y la constante de la velocidad de disociacion (kdis) para la disociacion del complejo (tambien denominada constante de la velocidad de disociacion) con
Kd _ kdis/kas
En la presente solicitud, los valores de las constantes termodinamicas y cineticas Kd, Ka, kas y kdis se refieren a su determinacion en "condiciones normales", es decir, una temperatura de 25 °C y presion atmosferica de 1,013 bares.
En la presente invencion, se ha encontrado, como se ha mencionado anteriormente, que la velocidad kdis [s-1] para la union del reactivo de union a receptor a la molecula de receptor mediante su sitio de union espedfica B es el determinante para la reversibilidad de la tincion de una celula diana por un reactivo de union a receptor respetivo que tiene un componente de union C adicional, en la que el componente de union C es capaz de ser unido por un reactivo de multimerizacion como se define en el presente documento. El intervalo de kdis se puede elegir dentro de un intervalo, dependiendo, por ejemplo, de la celula diana a tenir y opcionalmente a purificar y la condicion experimental respectiva. Teniendo en cuenta que la semivida T1/2 del complejo (C) entre el reactivo de union a receptor L y la molecula de receptor P se puede expresar como ln2/kdis, = 0,693/kdis con una kdis de 0,5 x 10-4 s-1, se necesitan 13860 segundos o 231 minutos o 3,85 horas para reducir a la mitad la concentracion del complejo entre el reactivo de union a receptor y la molecula de receptor, suponiendo que la dilucion es suficiente para despreciar que se vuelva a unir el reactivo de union a receptor disociado a la molecula de receptor. Para una velocidad kdis de 1,0 x 10-4 s-1, entonces se necesitan 6390 segundos (o solo 106,5 minutos o 1,775 horas), para una kdis de 2,0 x 10-4 s-1 se necesitan 3465 segundos (o 57 minutos. es decir, menos de 1 hora) y para una kdis de 4,0 x10-4 s-1 se
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necesitan 1732 segundos (o aproximadamente 28 minutos) para lograr la misma reduccion en la concentracion del complejo. As^ para el lavado que se lleva a cabo despues de la separacion de las celulas diana tenidas de las otras celulas en la muestra y despues de la rotura del complejo multivalente formado entre el reactivo de multimerizacion y el reactivo de union a receptor, se puede elegir el reactivo de union a receptor de celulas dependiendo de la sensibilidad de la celula a tenir a las influencias externas. Por ejemplo, para una celula bastante sensible, se puede usar un reactivo de union a receptor con una velocidad kdis bastante alta de, por ejemplo, superior a 4,0 x 10-4 s-1 de manera que, despues de la rotura de los complejos de union multivalentes, se pueda eliminar la mayona del reactivo de union a receptor en el plazo de una hora (como se ilustra anteriormente, en el plazo de 56 minutos la concentracion de los complejos se reduce al 25 % de la concentracion original, suponiendo que se pueden despreciar los efectos de que vuelva a unir debido a dilucion suficiente). Para una celula mas robusta, se puede usar un reactivo de union a receptor con una velocidad kdis mas baja de, por ejemplo, 1,0 x 10-4 s-1, cuya disociacion necesita, por consiguiente, mucho mas tiempo, (en este caso, se necesitan 212 min o aproximadamente 3 horas y media para disociar y eliminar el 75 % del reactivo de union a molecula de receptor). Despues de disociacion del reactivo de multimerizacion (por ejemplo, por medio de un competidor que es capaz de romper el enlace reversible entre el componente de union C y el reactivo de multimerizacion), tambien se puede producir lavado con agitacion suave constante durante al menos 2 veces la semivida T1/2 en un volumen de tampon que diluye el reactivo de union a receptor empleado a una concentracion que es al menos un factor de 10 por debajo de la constante de disociacion (Kd). Entonces se elimina el reactivo de union a receptor disociado, por ejemplo, mediante sedimentacion de las celulas diana, y desechando el sobrenadante. En una realizacion alternativa, es posible repetir el lavado anteriormente descrito una vez o dos veces o varias veces para eliminar el reactivo de union a receptor hasta casi el final. En este contexto, se observa que el termino "lavado" como se usa en el presente documento con referencia a las celulas diana tenidas significa que las celulas diana tenidas se ponen en contacto (concomitantemente con la rotura de los complejos de union multivalentes o despues de la rotura de los complejos de union multivalentes) con una cantidad suficiente de tampon de lavado, se incuba con el tampon de lavado durante un periodo de tiempo adecuado para la disociacion del reactivo de union a receptor de la molecula de receptor y entonces se separa del tampon de lavado (que asf elimina el reactivo de union a receptor disociado) por un procedimiento adecuado, por ejemplo, sedimentacion de las celulas diana y eliminacion del sobrenadante o, por ejemplo, filtracion del tampon de lavado. El lavado se lleva a cabo normalmente en tampon que no tiene un efecto adverso sobre la viabilidad o el estado de las celulas a tenir o aislar, es decir, el lavado se realiza en condiciones fisiologicamente aceptables (tales como tampon fisiologicamente aceptable, temperatura adecuada, por ejemplo, a 4 °C, 15 °C o 25 °C (es decir, temperatura ambiente) etc.). El experto medio en la material puede determinar empmcamente facilmente condiciones de lavado experimentales adecuadas. Por ejemplo, si kdis tiene un valor relativamente alto proximo a 0,5 x 10-4 s-1, y las celulas tenidas son (relativamente) insensibles a temperatura mas alta, el lavado se puede llevar a cabo a temperatura ambiente, para permitir una disociacion mas rapida del reactivo de union a receptor de las celulas tenidas. Alternativamente, si las celulas tenidas son relativamente sensibles a temperatura mas alta, el lavado se podna llevar a cabo a 4 °C, de manera que la disociacion/eliminacion del reactivo de union a receptor necesita mas tiempo, sin embargo, no se afectara el estado o viabilidad funcional de las celulas. En algunas realizaciones se prefiere una temperatura de 4 °C o al menos inferior a 15 °C para prevenir cualquier cambio del estado fisiologico de las celulas diana.
En este contexto, se observa que el reactivo de union a receptor pueden o bien tener un (cualquier) single sitio de union B que se une espedficamente a la molecula de receptor o el reactivo de union a receptor tambien puede tener dos o mas de tales sitios de union B, en tanto que la union de la molecula de receptor mediante (cada uno de) el (los) sitios de union B tenga un valor agregado de la kdis de aproximadamente 0,5 x 10-4 s-1 o mayor. Asf, el reactivo de union a receptor puede ser monovalente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monovalente o una molecula de union artificial monovalente (proteinacea u otra) tal como una mutema basada en un polipeptido de la familia de lipocalina (tambien conocidos como "Anticalin®"), o una molecula bivalente tal como un anticuerpo o un fragmento en el que se retienen ambos sitios de union tal como un fragmento F(ab')2. El reactivo de union a receptor podna incluso ser una molecula IgM pentamerica, siempre que la velocidad kdis de la molecula de IgM completa sea 0,5 x 10-4 s-1 o mayor.
Se pueden determinar la velocidad kdis para la union del reactivo de union a receptor a la molecula de receptor y, por supuesto, tambien la velocidad kas mediante metodos convencionales, tales como resonancia de plasmones superficiales (SPR), por ejemplo, usando la tecnologfa BIAcore (SPR; Jonsson, U. et al. (1991) Biotechniques, 11, 620-627). Esta determinacion esta dentro del conocimiento promedio del experto en la materia. Normalmente, la determinacion se lleva a cabo a 25 °C por analisis de resonancia de plasmones superficiales, a una concentracion adecuada del reactivo de union a receptor) siendo la molecula de receptor inmovilizada sobre la superficie de un chip sensor respectivo. El ligando (es decir, el reactivo de union a receptor), por ejemplo, un fragmento Fab, se aplica sobre el chip en diferentes concentraciones (normalmente alrededor del valor de Kd estimado como se determina a partir de caracterizaciones preliminares), usando caudales en el intervalo de pl/min.
Como un ejemplo ilustrativo, se requiere en este contexto a la determinacion de la velocidad kdis de la union de CD4 (como una molecula de receptor) a fragmentos Fab derivados del anticuerpo monoclonal 13B8.2. Como se describe en la patente de EE.UU. 7.482.000 o en Bes, C., et al., J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003), la velocidad kdis y los otros parametros cineticos se pueden determinar a 25 °C por analisis de resonancia de plasmones superficiales usando un instrumento BIAcore 2000 (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). Puede inmovilizarse covalentemente CD4
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recombinante sobre una superficie de chip sensor CM5 usando el metodo de acoplamiento de amina segun las instrucciones del fabricante. Se puede preparar una superficie de referencia de control usando el mismo tratamiento qmmico del flujo superficie celular sin inyeccion de CD4. Entonces se pueden inyectar mutantes de Fab recombinantes en tampon que contiene Hepes 10 mM (pH 7,4), EDTA 3 mM, NaCl 150 mm y 0,005 % de tensioactivo no ionico P20 (BIAcore AB) a concentraciones de entre 5 y 20 pg/ml sobre la celda de flujo, y se seguira la fase de disociacion por una etapa de regeneracion con disolucion 5 mM de HCl. El caudal puede establecerse a 30 pl/min. Todos los sensogramas se pueden corregir restando la senal de la superficie de referencia de control. Entonces se pueden ajustar globalmente los datos a una isoterma de union de Langmuir 1:1 usando el software BIAevaluation Version 3.2.
Como otro ejemplo ilustrativo, se refiere a la determinacion de la velocidad kdis de fragmentos Fab anti-CD30 para el fragmento de antfgeno CD30A recombinante como se mide por resonancia de plasmones superficiales por Schlapschy, M., et al. "Functional humanization of an anti-CD30 Fab fragment for the immunotherapy of Hodgkin's lymphoma using an in vitro evolution approach" Protein Eng Des Sel 17, 847-860 (2004). Esta determinacion se llevo a cabo en un sistema BIAcore X (BIAcore, Uppsala, Suecia). Despues del intercambio de tampon a acetato sodico 10 mM a pH 3,85 por filtracion en gel, se diluyo CD30A purificado a 50 pg/ml y se inmovilizo sobre un chip sensor CM5 de 'calidad para investigacion' usando el kit de acoplamiento de amina (BIAcore), dando como resultado la inmovilizacion de 1700 unidades de respuesta (UR). Los fragmentos Fab recombinantes purificados se aplicaron en PBS/P (PBS que contiene 0,005 % de tensioactivo P-20; BIAcore) en una serie de concentraciones apropiadas. Se observo formacion de complejos bajo un flujo de tampon continuo de 5 pl/min. Los sensogramas se corrigieron restando las senales correspondientes medidas para el canal de blanco de control, que se uso en lmea. El chip se regenero aplicando un pulso de 2 ml de NaOH 1 mM a un caudal de 25 pl/ min, seguido por equilibrado con PBS/P. Se pueden determinar nuevamente los parametros cineticos con el software BIAevaluation V 3.0 (BIAcore) usando un modelo de union 1:1 (Langmuir) con la referencia de desviacion.
Volviendo al metodo de la invencion, como se ha mencionado anteriormente, la afinidad del reactivo de union a receptor por la molecula de receptor de la superficie celular no tiene que ser de baja afinidad. Mas bien (vease tambien la Seccion experimental), la constante de disociacion (Kd) para la union entre dicho reactivo de union a receptor y dicha molecula de receptor puede estar el intervalo de aproximadamente 10-2 M a aproximadamente 10' 8 M, o de aproximadamente 10'2 M a aproximadamente 10'9 M, o de aproximadamente 10'2 M a aproximadamente 0,8x10'9M, o de aproximadamente 10'2M a aproximadamente 0,6x10'9M, o de aproximadamente 10'2M a aproximadamente 0,4x10'9M, o de aproximadamente 10'2M a aproximadamente 0,3x10'9M, o de aproximadamente 10'2M a aproximadamente 0,2 x10'9, o de aproximadamente 10'2M a aproximadamente 0,15x10'9M, o de aproximadamente 10'2 a aproximadamente 10, en tanto que, despues de la rotura de los complejos de union multivalentes, la kdis permita la eliminacion del reactivo de union a receptor en un periodo de tiempo y en condiciones de lavado que son aceptables para la celula a tenir o aislar. En una realizacion, la constante de disociacion (Kd) para la union entre dicho reactivo de union a receptor y dicha molecula de receptor puede estar en el intervalo de aproximadamente 10'7M a aproximadamente 10'10M, o de aproximadamente 10'7M a aproximadamente 0,8x10'9M, o de aproximadamente 10'7M a aproximadamente 0,6x10'9M, de aproximadamente 10'7M a aproximadamente 0,3x10'9M, de 1,1x10'7M a aproximadamente 10'10M, o de aproximadamente 1,1x10'7M a aproximadamente 0,15x10'9M, o de aproximadamente 1,1x10'7M a aproximadamente 0,3 x 10-9 M, o de aproximadamente 1,1 x 10-7 M a aproximadamente 0,6 x 10-9 M, o de aproximadamente 1,1 x 10'7 M a aproximadamente 0,8 x 10'9 M. En este contexto se observa que las velocidades kas de hasta aproximadamente 5 x 106 M'1s'1 son conocidas por la union de inmunoglobulinas tales como anticuerpos o fragmentos Fab a su antfgeno respectivo (vease, por ejemplo, Lee et al., Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093, Fig. 4 en la que el fragmento Fab G6-23 tiene una velocidad kas de 5,6 x 106 M'1s'1 o, por ejemplo, Kwong et al J. Mol. Biol. 31 de diciembre de 2008; 384(5): 1143-1156 o solicitud de patente internacional WO 2010/017103 que informa de valores de kas de 1 x105M'1s'1 a 1,4 x 106 M-1s-1 para el fragmento Fab de anticuerpo monoclonal anti-NKG2D humano y anticuerpos como IgG1 (vease la Tabla 1 de Kwong et al., arriba). Por consiguiente, suponiendo un reactivo de union a receptor tal como un fragmento Fab tiene un valor de kas para la union de la molecula de receptor de 5 x 106 M-1s-1 y una Kd de 1 x 10-10, kdis es 5 x10-4 M, que convierte tales moleculas de anticuerpo (o reactivos de union a receptor en general) en muy adecuados para que se usen en el metodo de tincion reversible de la invencion (con una kdis de 5 x 10-4 s-1 se necesitan solo 1386 segundos o 23 minutos para reducir a la mitad la concentracion del complejo entre el reactivo de union a receptor y la molecula de receptor, a pesar de una afinidad con una Kd de 1 x 10-10 M). Asimismo, como un ejemplo ilustrativo adicional, si el reactivo de union a receptor tiene un valor de kas para la union de la molecula de receptor de 5 x 105 M-1s-1 y una Kd de 1 x 10-9, la kdis tambien es 5 x 10-4 M, que tambien da como resultado una disociacion bastante rapida del reactivo de union a receptor de la celula diana, despues de la rotura de los complejos de union multivalentes. En este contexto, es posible, por ejemplo, usar metodos evolutivos tales como presentacion en fagos para cribar deliberadamente reactivos de union a receptor tales como fragmentos de anticuerpos o, por ejemplo, mutemas de lipocalina (vease tambien Lee et al., arriba a este respecto). Asf, si se desean, se pueden obtener reactivos de union a receptor con propiedades cineticas deseadas por tales metodos evolutivos a partir de una molecula de partida de la que se conoce la secuencia de aminoacidos. Tambien es posible usar en el metodo descrito aqrn un reactivo de union a receptor que tiene una baja afinidad por la molecula de receptor, entonces la constante de disociacion (Kd) para la union entre el reactivo de union a receptor y la molecula de receptor puede estar en el intervalo de 10-2 a 10-7 M.
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El metodo de tincion comprende ademas separar la celula tenida de celulas no diana presentes en una muestra/mezcla de celulas. La separacion se puede llevar a cabo como se describe en la patente de EE.UU. 7.776.562 o la solicitud de patente internacional WO 02/054065 y puede comprender ademas eliminar dicha tincion de dicha celula rompiendo la union entre el componente de union C del reactivo de union a receptor y los sitios de union Z del reactivo de multimerizacion. Este enlace debe ser reversible, es decir, el enlace debe ser capaz de ser roto en condiciones adecuadas para llevar a cabo el metodo reivindicado. La constante de disociacion (Kd) para la union entre dicho componente de union C y dichos sitios de union Z puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 10-2 M a aproximadamente 10-13 M. Asf, este enlace reversible puede tener, por ejemplo, una Kd de entre aproximadamente 10-2M y aproximadamente 10-13M, o de entre aproximadamente 10-5M y
aproximadamente 10-3M, o de entre aproximadamente 10-6M y aproximadamente 10-10M, o de entre
aproximadamente 10-3M y aproximadamente 10-12M o entre aproximadamente 10-4M y 10-11 M, o entre aproximadamente 10-5M y aproximadamente 10-10M. La Kd de este enlace tambien se puede determinar por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por valoracion por fluorescencia, dialisis en equilibrio o resonancia de plasmones superficiales como se ha explicado anteriormente a proposito de la determinacion de la velocidad kdis para el enlace formado entre el reactivo de union a receptor y la molecula de receptor. La disociacion/eliminacion de la tincion del reactivo de multimerizacion de las celulas da como resultado la eliminacion del reactivo de union a receptor disociado, y asf del complejo completo de union multivalente que incluye la marca detectable de la celula previamente tenida. Con el fin de facilitar la eliminacion del reactivo de union a receptor, se podna usar un volumen de tampon de lavado respectivo que lleva la concentracion del reactivo de union a receptor anadido significativamente por debajo de Kd para su interaccion con la molecula de receptor relacionada. Alternativamente, se podna repetir el lavado varias veces a volumenes mas bajos y se podna desear agitacion suave para prevenir que se vuelvan a unir inmediatamente. En una realizacion, se usa un volumen del tampon de lavado que reduce la concentracion del reactivo de union a receptor por debajo de la Kd o incluso mas preferentemente a una concentracion inferior a 1/10 de la Kd de manera que mas del 90 % del reactivo de union a receptor este presente en la forma disociada (es decir, no unida a la molecula de receptor) o incluso mas preferentemente a una concentracion inferior a 1/100 de la Kd de manera que mas del 99 % del reactivo de union a receptor este presente en la forma disociada o incluso mas preferentemente a una concentracion inferior a 1/1000 de la Kd de manera que mas del 99,9 % del reactivo de union a receptor este presente en la forma disociada.
En algunas realizaciones de la invencion, el reactivo de union a receptor se selecciona de forma que comprenda al menos un componente de union C y el reactivo de multimerizacion comprenda al menos dos sitios de union Z, al menos tres o al menos cuatro sitios de union Z para el componente de union C. En realizaciones alternativas, es posible usar dos (tipos de) reactivos de union a receptor diferentes. Cada uno de estos dos reactivos de union a receptor se unen a la misma molecula de receptor por una mismo sitio de union B o uno diferente (para el ultimo caso, es posible que los dos reactivos de union a receptor reconozcan y asf se unan a diferentes epitopes sobre la misma molecula de receptor). Ademas, cada uno de los dos reactivos de union a receptor tiene al menos un componente de union C y el reactivo de multimerizacion tiene al menos un sitio de union Z para el componente de union C de cada uno de los dos reactivos de union a receptor diferentes. Por ejemplo, es posible usar dos reactivos de union a receptor diferentes, ambos de los cuales se unen a la misma molecula de receptor mediante el mismo sitio de union B, pero que tienen diferentes componentes de union C1 y C2. Por ejemplo, un reactivo de union a receptor puede tener un componente de union C1 tal como una marca de hexa-histidina y el otro reactivo de union a receptor tiene un componente de union C2 tal como una marca FLAG. En tal caso, el reactivo de multimerizacion puede comprender solo un sitio de union (Z1) para el componente de union C1 y solo un sitio de union para el componente de union C2. Puesto que en total estan presentes dos sitios de union en el reactivo de multimerizacion todavfa se logra el efecto de avidez. Un reactivo de multimerizacion tal podna ser, por ejemplo, un polfmero biocompatible (por ejemplo, dextrano u otro polisacarido) con el que se conjuga un fragmento Fab de un anticuerpo anti-FLAG y un fragmento Fab de un anticuerpo anti-marca de hexa-histidina (para una discusion detallada de reactivos de multimerizacion vease mas adelante). Independientemente de si se usan uno o los dos reactivos de union a receptor con solo uno o dos o mas componentes de union C en la invencion, se puede elegir la combinacion del componente de union C y el reactivo de multimerizacion, en tanto que el componente de union C y el (los) sitio(s) de union Z del reactivo de multimerizacion sean capaces de multimerizarse reversiblemente en un complejo (multivalente) para producir un efecto de avidez, como tambien se describe en la patente de EE.UU. 7.776.562 o solicitud de patente internacional WO02/054065.
En algunas realizaciones ilustrativas, los componentes se pueden elegir del siguiente grupo:
(a) el componente de union C comprende biotina y el reactivo de multimerizacion comprende un analogo de estreptavidina o un analogo de avidina que se une reversiblemente a biotina,
(b) el componente de union C comprende un analogo de biotina que se une reversiblemente a estreptavidina o avidina y el reactivo de multimerizacion comprende estreptavidina, avidina, un analogo de estreptavidina, o un analogo de avidina que se une reversiblemente a dicho analogo de biotina, o
(c) el componente de union C comprende un peptido de union a estreptavidina o avidina y el reactivo de multimerizacion comprende estreptavidina, avidina, un analogo de estreptavidina, o un analogo de avidina que se une reversiblemente a dicho peptido de union a estreptavidina o avidina. En algunas de estas realizaciones, el componente de union C puede comprender el peptido de union a estreptavidina Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys y dicho reactivo de multimerizacion comprende el analogo de estreptavidina Val44-
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Thr45-Ala46-Arg47 o el analogo de estreptavidina Ne44-Gly45-Ala46-Arg47, ambos de los cuales se describen en la patente de EE.UU. 6.103.493, por ejemplo, y estan comercialmente disponibles con la marca registrada Sfrep-Tactin®. Los peptidos de union a estreptavidina podnan ser, por ejemplo, peptidos individuales tales como "Strep-tag®" descrito en la patente de EE.UU. 5.506.121, por ejemplo, o los peptidos de union a estreptavidina que tienen una disposicion secuencial de dos o mas modulos de union individuales como se describe en la publicacion de patente internacional WO 02/077018.
En otras realizaciones, en las que solo se usa un componente de union C, la union entre el componente de union C y dichos al menos 2 sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion se produce en presencia de un cation divalente. En un ejemplo ilustrativo de una realizacion tal, el componente de union C comprende un peptido de union a calmodulina y el reactivo de multimerizacion comprende calmodulina multimerica como se describe en la patente de EE.UU. 5.985.658, por ejemplo. Alternativamente, el componente de union C puede comprender un peptido FLAG y dicho reactivo de multimerizacion puede comprender un anticuerpo que se une al peptido FLAG, por ejemplo el peptido FLAG, que se une al anticuerpo monoclonal 4E11 como se describe en la patente de EE.Uu. 4.851.341. En otro ejemplo ilustrativo mas, el componente de union C comprende una marca de oligohistidina y el reactivo de multimerizacion comprende un anticuerpo o un ion de metal de transicion que se une a la marca de oligohistidina. La rotura de todos estos complejos de union se puede llevar a cabo por quelacion de ion metalico, por ejemplo quelacion de calcio, por ejemplo mediante adicion de EDTA o EGTA. Se pueden multimerizar calmodulina, anticuerpos tales como 4E11 o iones metalicos quelados o quelantes libres por metodos convencionales, por ejemplo por biotinilacion y complejacion con estreptavidina o avidina o multimeros de los mismos o por la introduccion de residuos carboxilo en un polisacarido, por ejemplo dextrano, esencialmente como se describe en Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). "Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3, 132-137" en una primera etapa y acoplamiento de calmodulina o anticuerpos o iones metalicos quelados o quelantes libres mediante grupos amino primarios con los grupos carboxilo en el polisacarido, por ejemplo esqueleto de dextrano usando qmmica de carbodiimida convencional en una segunda etapa.
En tales realizaciones, se puede romper la union entre dicho componente de union C y dichos al menos dos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion por quelacion de ion metalico. La quelacion de ion metalico se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante adicion de EDTA.
En el metodo de la invencion tambien es posible que el reactivo de multimerizacion sea un oligomero o un polfmero de estreptavidina o avidina o de cualquier analogo de estreptavidina o avidina. Se puede reticular el oligomero o polfmero por un polisacarido. En una realizacion, se preparan oligomeros o polfmeros de estreptavidina o de avidina o de analogos de estreptavidina o de avidina por la introduccion de residuos de carboxilo en un polisacarido, por ejemplo dextrano, esencialmente como se describe en " Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3,132137" en una primera etapa. Entonces se acoplan estreptavidina o avidina o analogos de las mismas mediante grupos amino primarios del resto de lisina interno y/o el extremo N libre a los grupos carboxilo del esqueleto de dextrano usando qmmica de carbodiimida convencional en una segunda etapa. Sin embargo, tambien se pueden obtener oligomeros o polfmeros reticulados de estreptavidina o avidina o de cualquier analogo de estreptavidina o avidina reticulando mediante conectores bifuncionales tales como glutardialdehndo o por otros metodos descritos en la bibliograffa.
En otra realizacion del metodo de tincion de la invencion, el componente de union C comprende un antfgeno y el reactivo de multimerizacion comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra dicho antfgeno. El antfgeno puede ser, por ejemplo, una marca de epitope. Ejemplos de marcas de epitopes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, marca de Myc (secuencia: EQKLIsEeDL), la marca de HA (secuencia: YPYDVPDYA), la marca de VSV-G (secuencia: YTDIEmNrLGK), la marca de HsV (secuencia: QPELAPEDPED), la marca de V5 (secuencia: GKPIPNPLLGLDST) o glutation-S-transferasa (GST), por solo nombrar algunas. En otra realizacion, el componente de union C comprende protema de union a maltosa (MBP), protema de union a quitina (CBP) o tiorredoxina como antfgeno. En estos casos, se puede romper el complejo formado entre los al menos dos sitios de union Z del reactivo de multimerizacion (anticuerpo) y el antfgeno anadiendo el antfgeno libre, es decir, el peptido libre tal como una marca de Myc o la marca de HA (marca de epitope) o la protema libre (tal como MBP o cBp). En este contexto se observa que en el caso de que se use la marca de FLAG (secuencia: DYKDDDDK) como componente de union C y el reactivo de multimerizacion comprenda un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la marca FLAG, tambien es posible romper este enlace reversible mediante la adicion del peptido FLAG libre.
En el metodo de la invencion, el al menos un sitio de union B del reactivo de union a receptor que se une espedficamente a dicha molecula de receptor puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo divalente tal como un fragmento (Fab)2', fragmento Fv de una sola cadena divalente. Tambien podna ser una molecula de union artificial proteinacea bivalente tal como una mutema de lipocalina dimerica que tambien se conoce como "duocalina". En otras realizaciones, el reactivo de union a receptor puede tener un unico sitio de union B, es decir, puede ser monovalente. Ejemplos de reactivos de union a receptor monovalentes incluyen un fragmento
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de anticuerpo monovalente, una molecula de union proteinacea con propiedades de union de tipo anticuerpo o una molecula de MHC.
Ejemplos de fragmentos de anticuerpos monovalentes incluyen, pero no se limitan a, un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de una sola cadena (scFv).
Ejemplos de moleculas de union proteinaceas con propiedades de union de tipo anticuerpo que se pueden usar como reactivo de union a receptor que se une espedficamente a la molecula de receptor incluyen, pero no se limitan a, un aptamero, una mutema basada en un polipeptido de la familia de la lipocalina, un glucuerpo, una protema basada en el armazon de anquirina, una protema basada en el armazon de cristalina, una adnectina, un avfmero, un dominio de tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio de fibronectina de tipo I, un dominio de fibronectina de tipo II, un dominio de fibronectina de tipo III, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio de Kunitz/inhibidor de tripsina pancreatica bovina, tendamistat, un dominio de inhibidor de serina proteasa de tipo Kazal, un dominio Trefoil (tipo P), un dominio de factor de von Willebrand tipo C, un dominio de tipo anafilotoxina, un dominio CUB, una repeticion de tiroglobulina tipo I, un dominio de la clase A de receptor de LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio de trombospondina tipo I, un dominio de inmunoglobulina o un dominio de tipo inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpos de dominio o anticuerpos de la cadena pesada de camello), un dominio de lectina de tipo C, un dominio MAM, un dominio de factor de von Willebrand de tipo A, un dominio de somatomedina B, un dominio de cuatro nucleos de disulfuro de tipo WAP, un dominio de F5/8 tipo C, un dominio de hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio de tipo EGF de tipo laminina, un dominio C2, "Kappabodies" (Ill. et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et al. "The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6" EMBO J 13:5303-9 (1994)), "Janusinas" (Traunecker et al. "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells" EMBO J 10:36553659 (1991) y Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992), un nanocuerpo, una adnectina, una tetranectina, un microcuerpo, una afilina, un afficuerpo o una anquirina, una cristalina, una knotina, ubiquitina, una protema de dedo de cinc, una protema autofluorescente, una anquirina o protema de repeticion de anquirina o una protema de repeticion rica en leucina, un avfmero (Silverman, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba bM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP 2005, Nat Biotech, Dec;23(12):1556-61, publicacion electronica en Nat Biotech. 2005 Nov 20 edicion); ademas de protemas de avfmero multivalentes desarrolladas por barajado de exones de una familia de dominios de receptor humano como tambien se describe en Silverman J, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP, Nat Biotech, Dec;23(12):1556-61, publicacion electronica en Nat. Biotechnology. 2005 Nov 20 edicion).
En el metodo de la invencion, el poner en contacto la mezcla que contiene la(s) celula(s) diana con el reactivo de union a receptor y el reactivo de multimerizacion se puede llevar a cabo a cualquier temperatura adecuada, como se describe en la patente de EE.UU. 7.776.562 o la solicitud de patente internacional Wo 02/054065, por ejemplo. Normalmente, el poner en contacto la mezcla que contiene las celulas diana con el reactivo de union a receptor y el reactivo de multimerizacion y despues tambien la eliminacion de dichos reactivos se pueden llevar a cabo a tales temperaturas, a las que sustancialmente no ocurren eventos de activacion y/o senalizacion, que podnan dar como resultado una alteracion de la celula diana, por ejemplo el fenotipo de linfocitos T, en caso de que un linfocito T se vaya a tenir o aislar. En algunas realizaciones mas preferidas, el poner en contacto se lleva a cabo a una temperatura de < 15 °C o se lleva a cabo a una temperatura de < 4 °C.
En el metodo de la invencion, se puede usar practicamente cualquiera de dicha celula diana que tiene al menos una molecula de receptor comun que se usa para la tincion o aislamiento de la celula diana. Con el fin de lograr un efecto de avidez, la molecula de receptor normalmente esta presente en dos o mas copias sobre la superficie de la celula diana. En realizaciones tfpicas, la celula diana es una celula de mairnfero o una celula eucariota o procariota. Asimismo, el al menos un receptor comun (espedfico) que define la poblacion de celulas diana puede ser cualquier receptor contra el que se puede dirigir un reactivo de union a receptor como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el receptor puede ser un antfgeno que define una poblacion o subpoblacion de celulas, por ejemplo una poblacion o subpoblacion de globulos sangumeos, por ejemplo linfocitos (por ejemplo linfocitos T, linfocitos T colaboradores, por ejemplo, linfocitos T colaboradores CD4+, linfocitos B o linfocitos citolfticos espontaneos), monocitos, o celulas madre, por ejemplo celulas madre perifericas CD34-positivas o celulas madre que expresan Nanog u oct-4. Ejemplos de linfocitos T incluyen celulas tales como linfocitos T CD8+ espedficos de CMV, linfocitos T citotoxicos, linfocitos T de memoria y linfocitos T reguladores (Treg). Un ejemplo ilustrativo de Treg son celulas Treg CD4+CD25+CD45RA y un ejemplo ilustrativo de linfocitos T de memoria son linfocitos T de memoria central espedficos CD62L+CD8+. El receptor tambien puede ser un marcador para celulas tumorales. En este contexto, se observa que el termino "celulas diana" como se usa en el presente documento engloba todas las entidades/vesmulas biologicas en las que una membrana (que tambien puede ser un lfpido bicapa) separa el entorno interior del exterior y que comprenden moleculas de receptor espedfico sobre la superficie de la entidad biologica. Ejemplos de tales entidades incluyen, pero no se limitan a, virus, liposomas y organulos tales como mitocondrias, cloroplastos, el nucleo celular o lisosomas.
Una vez se ha aislado, la poblacion de celulas diana se caracteriza por que el reactivo de union a receptor se ha
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eliminado sustancialmente completamente (normalmente por debajo del Kmite de deteccion como se detecta, por ejemplo, por FACS) de dicho receptor. La eliminacion completa del reactivo de union a receptor se lleva a cabo usando el reactivo de union a receptor reversiblemente multimerizado que tiene una alta velocidad kdis como se ha descrito anteriormente. Haciendo esto, se puede proporcionar una poblacion de celulas diana (definida por el receptor espedfico comun) que tiene un estado funcional que no se ha alterado por el metodo de purificacion.
El hecho de que la poblacion de celulas diana o cualquier otra poblacion de una entidad biologica en la que una membrana (que tambien puede ser un lfpido bicapa) separa el entorno interior del exterior y que se caracteriza ademas por comprender una molecula de receptor espedfico comun sobre la superficie se pueda purificar por los metodos de la invencion con eliminacion posterior de cualquier reactivo de purificacion usado (reactivo de union a receptor; reactivo de multimerizacion, marca) ofrece - mas alla de la ventaja de que, si la diana es una celula o un organulo, no se altera el estado fisiologico - la ventaja reguladora de que los reactivos de purificacion no se administran al paciente durante el uso de tales entidades biologicas purificadas como medicamentos. En tales casos, autoridades sanitarias como la FDA (EE.UU.) o EAM (Europa) requieren limitaciones menos caras con respecto a los procesos de produccion para dichos reactivos de purificacion que en casos en los que el reactivo de purificacion se administra junto con el medicamento que es una celula o un liposoma. Por tanto, tambien existe una clara ventaja tecnica con respecto a los metodos de la invencion para la purificacion de entidades de las que no se puede manipular el estado fisiologico como para liposomas, por ejemplo, si tales liposomas se tienen que purificar y se usan como medicamentos.
La marca que se usa para la deteccion de celulas tenidas puede ser cualquier marca que se usa en metodos de diagnostico y analfticos. Preferentemente, la marca no afecta negativamente las caractensticas de las celulas a tenir o aislar. Ejemplos de marcas son marcas fluorescentes (por ejemplo, ficoeritrina, aloficocianina, cumarina o rodaminas, por solo nombrar algunas), marcas magneticas, marcas cromoforas, etiquetas de espm adecuadas para resonancia de espm electronico/resonancia paramagnetica electronica (EPR), o marcas radiactivas. La marca se puede unir al reactivo de union a receptor y/o el reactivo de multimerizacion. La marca puede ser una marca directa, es decir, una marca unida a uno de los miembros del complejo de union multivalente como se especifico anteriormente. En un caso tal, la marca se podna acoplar (conjugar) covalentemente, por ejemplo, a cualquiera del reactivo de union a receptor o el reactivo de multimerizacion (vease el reactivo de multimerizacion que lleva una marca fluorescente tal como la ficoeritrina mostrada en la Fig. 1). Alternativamente, la marca puede ser una marca indirecta, es decir, una marca que se une a un reactivo adicional que a su vez es capaz de unirse a uno de los miembros del complejo de union multivalente como se especifico anteriormente. Una marca tal se puede anadir antes, durante o despues de que se haya formado el complejo de union multivalente. Un ejemplo de una marca tal es un bis-, tris- o tetraquis-NTA que contiene colorante fluorescente como se describe por Lata et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 10205-10215 o Huang et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1592-1600. Dicha marca es capaz de unirse no covalentemente (mediante quelacion de metales) a una marca de oligohistidina. Asf, en este ejemplo, el reactivo de union a receptor y/o el reactivo de multimerizacion pueden llevar una marca de oligohistidina (por ejemplo, se puede usar un fragmento Fab como reactivo de union a receptor que tiene una marca de oligohistidina tal como una marca de hexa-histidina fusionada con el extremo C de CH1 o el dominio CL o una estreptavidina- mutema tal como Strep-Tactin® como reactivo de multimerizacion que tiene una marca de oligohistidina fusionada con el extremo No C de una de sus subunidades), siendo asf habilitado para unirse no covalentemente a un compuesto colorante fluorescente basado en NTA tal descrito por Lata et al, arriba, o Huang et al, arriba. Una marca que se une no covalentemente tal no necesita unirse necesariamente a su diana (reactivo de union a receptor y/o reactivo de multimerizacion) antes de que se forme el complejo de union multivalente, pero tambien se puede anadir a la muestra cuando se forma el complejo de union multivalente o despues de que se haya formado el complejo de union multivalente. Una marca que se une no covalentemente tal tambien se puede anadir despues de que se una el complejo de union multivalente a las celulas diana. En lugar del par de union de colorante fluorescente que comprende NTA:marca de oligohistidina descrito anteriormente, tambien se puede usar cualquier otro par de union espedfica tal como, por ejemplo, digoxigenina y un anticuerpo anti-digoxigenina o fragmento de anticuerpo que lleva la marca fluorescente u otra marca para el marcado indirecto. En tal caso, el reactivo de union a receptor y/o el reactivo de multimerizacion se conjugan con/acoplan con digoxigenina y un anticuerpo anti-digoxigenina o fragmento de anticuerpo que lleva la marca se une (mediante digoxigenina) al reactivo de multimerizacion o reactivo de union a receptor.
En realizaciones del metodo de la invencion, se tine una celula diana y opcionalmente se afsla por medio de un grupo de al menos dos moleculas de receptor diferentes (preseleccionadas). El aislamiento de celulas diana en nombre de mas de un receptor comun se puede hacer realizando un metodo de la invencion de una manera secuencial usando reactivos de union a receptor correspondientes en cada ciclo. En este caso, se puede usar la misma marca para cada ciclo. Alternativamente, es posible el marcado simultaneo de las celulas diana cuando se usan diferentes marcas para cada molecula de receptor. Un enriquecimiento celular secuencial tal y/o tincion multiparametrica (simultanea) usa al menos dos reactivos de union a receptor diferentes, comprendiendo cada reactivo de union a receptor al menos un sitio de union B que se une espedficamente a una molecula de receptor preseleccionada de un grupo de al menos dos moleculas de receptor diferentes. Hablando ilustrativamente, las al menos dos moleculas de receptor diferentes pueden ser marcadores CD diferentes tales como linfocitos T reguladores CD4+CD25+, o linfocitos T de memoria central espedficos CD62L+CD8+. Las celulas pueden ser, por ejemplo, linfocitos T espedficos de antfgeno tales como linfocitos T CD8+ espedficos de CMV que se pueden aislar
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seleccionando primero linfocitos T CD8+, seguido por una segunda tincion y aislamiento para la poblacion diana espedfica de CMV tal como linfocitos T CD8+ espedficos de HLA-B8/IEIK199-207.
En tales realizaciones, el reactivo de union a receptor que se une a la segunda molecula de receptor o cualquier molecula de receptor adicional del grupo de al menos dos moleculas de receptor diferentes puede comprender ademas al menos un componente de union C.
Para la tincion de esta segunda molecula de receptor, la constante de la velocidad de disociacion kdis para la union entre el reactivo de union a receptor que se une espedficamente mediante el sitio de union B y dicha segunda molecula de receptor o cualquier molecula de receptor adicional tambien puede tener (al igual que el reactivo de union a receptor que se une a la primera molecula de receptor) una velocidad kdis de 0,5 x10-4 s-1 o mayor. Alternativamente, en lmea con el metodo de la patente de EE.Uu. 7.776.562 o la solicitud de patente internacional WO 02/054065, la constante de disociacion (Kd) para la union entre dicha segunda molecula de receptor o cualquier molecula de receptor adicional y dicho reactivo de union a receptor que se une espedficamente a dicha segunda molecula de receptor o cualquier molecula de receptor adicional puede estar en el intervalo de 10-2 a 10-7 M.
Como se trata anteriormente, el metodo de tincion de la invencion se puede usar para el aislamiento de una poblacion de celulas que se define por la presencia de al menos una molecula de receptor espedfico comun. La poblacion de celulas que se define por la presencia de una molecula de receptor espedfico comun puede, por ejemplo, una poblacion de linfocitos T, que incluye, por ejemplo, una poblacion de linfocitos T espedfica de antigeno. Esta poblacion de celulas purificada se puede usar, por ejemplo, para transferencia adoptiva o inmunoterapia.
El metodo de la invencion tambien se puede usar para la determinacion del estado funcional de una poblacion de linfocitos T, o para la purificacion de una poblacion de linfocitos T para expansion in vitro.
Con mas detalle y segun la divulgacion de la patente de EE.UU. 7.776.562, el metodo de la presente invencion permite un aislamiento funcional de poblaciones de celulas diana, por ejemplo de poblaciones de linfocitos T basandose en un procedimiento de tincion reversible. El estado funcional original de celulas diana, por ejemplo linfocitos T, se puede mantener sustancialmente despues de la identificacion y purificacion. Asf, el metodo de la invencion es de amplio beneficio para investigacion basica y aplicaciones clfnicas.
Ejemplos de aplicaciones preferidas son del siguiente modo:
Investigacion basica:
Investigacion directa ex vivo del estado funcional de linfocitos tales como linfocitos T que incluyen, por ejemplo, poblaciones de linfocitos T espedficas de antfgeno. Se sugiere que el estado funcional de poblaciones de linfocitos T in vivo es altamente diverso y dependiente de condiciones in vivo espedficas, pero debido a la falta de herramientas de investigacion apropiadas, estos aspectos solo se entienden marginalmente. Con, por ejemplo, multimeros de Fab como se describen aqrn, se pueden identificar y purificar poblaciones de linfocitos T espedficas de epitope independientemente de su estado funcional. Sin embargo, la union de reactivos irreversibles interfiere con los posteriores ensayos funcionales. La tincion reversible de linfocitos T, por ejemplo usando fragmentos Fab equipados con un peptido de union a estreptavidina/reactivos Strep-Tactin®, es una tecnologfa que permite la investigacion ex vivo funcional directa de diversas poblaciones de linfocitos T sin alterar.
Purificacion de poblaciones de linfocitos T para expansion in vitro altamente eficiente. La caracterizacion de poblaciones de linfocitos T obtenidas ex vivo requiere frecuentemente ademas la expansion in vitro dando lmeas de linfocitos T o clones de linfocitos T.
Con las tecnicas de multfmeros de Fab, se pueden aislar celulas individuales o subpoblaciones fenotfpicas distintas dentro de una diversa poblacion de linfocitos T, pero la union de los reactivos a TCR interfiere con la eficiencia de la expansion in vitro. Este problema experimental se resuelve por tincion reversible de linfocitos T usando los reactivos de la invencion, por ejemplo reactivos Fab-Strep-tag®/Strep-Tactin®. Tales fragmentos Fab podnan llevar como componente de union C un peptido de union a estreptavidina que tiene una disposicion secuencial de dos o mas modulos de union individuales como se describe en la publicacion de patente internacional WO 02/077018.
Purificacion de poblaciones de linfocitos T para experimentos de transferencia adoptiva. Muchos experimentos in vivo en investigacion inmunologica requieren la transferencia adoptiva de linfocitos T purificados en animales receptores. Ambos, la pureza de las poblaciones de linfocitos T transferidas y los posibles cambios en las celulas que se producen durante el procedimiento de aislamiento, son problemas en estos sistemas experimentales. La pureza mas alta de las poblaciones de celulas se logra por metodos de seleccion positiva, pero los marcadores (normalmente anticuerpos) usados para la identificacion son diffciles de eliminar de la superficie de celulas aisladas y pueden interferir con el resultado de experimentos in vivo posteriores.
La tincion reversible de linfocitos T usando reactivos de la invencion, por ejemplo reactivos Fab Strep-tag®/Strep-
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Tactin® permite la combinacion de metodos de seleccion positiva con la posterior eliminacion del marcador de seleccion y podna mejorar enormemente los experimentos de transferencia adoptiva.
Aplicaciones clmicas:
Purificacion de poblaciones de linfocitos T para la expansion in vitro altamente eficiente. La generacion de lmeas o clones de linfocitos T humanos (por ejemplo, linfocitos T espedficos de patogeno/tumor o autorreactivos) es necesaria en muchas areas de la investigacion clmica, diagnosticos e inmunoterapia. El cultivo in vitro se limita frecuentemente por dificultades en las condiciones de normalizacion para la estimulacion espedfica de antigeno. Estrategias mejoradas para la purificacion de poblaciones de linfocitos T podnan potenciar enormemente la eficiencia de expansion in vitro, permitiendo el uso de estimulacion independiente de antigeno tal como mitogenos y anti-CD3. Con la invencion, por ejemplo con reactivos MHC-Strep-tag® o Fab-Strep-tag® (como reactivo de union a receptor) y un reactivo de multimerizacion Strep-Tactin®, se pueden aislar poblaciones de linfocitos T directamente ex vivo y expandirse in vitro despues de la disociacion de los reactivos. Se espera que este enfoque sea mucho mas eficiente que la purificacion usando, por ejemplo, reactivos de multfmeros de MHC irreversibles convencionales, ya que la union de los reactivos interfiere negativamente con la eficiencia de la expansion in vitro de linfocitos T.
Purificacion de poblaciones de linfocitos T a partir de lmeas o clones de celulas expandidos in vitro para analisis o terapia funcional adicional. La expansion in vitro de linfocitos T requiere la adicion de celulas presentadoras de antfgenos o celulas nodrizas al cultivo. Para analisis funcionales adicionales, y especialmente para aplicaciones terapeuticas (por ejemplo, transferencia adoptiva), sena util eliminar estas celulas contaminantes. Para procedimientos de seleccion positiva (que normalmente dan como resultado los grados de pureza mas altos), el marcador de seleccion debe ser extrafble de la superficie de linfocitos T, ya que podna interferir con ensayos funcionales o transferencia adoptiva. Si se usan linfocitos T para aplicaciones in vivo, el marcador de seleccion se debe eliminar ademas si contiene sustancias que podnan producir complicaciones clinicas tales como reacciones alergicas. La tincion reversible de linfocitos T, por ejemplo usando MHC-Strep-tag® o Fab-reactivos Strep- tag®/reactivos Strep-Tactin® cumple todos estos criterios.
Purificacion ex vivo de poblaciones de linfocitos T para "monoterapia adoptiva directa". Es de especial interes clmico el aislamiento de poblaciones de linfocitos T directamente ex vivo, seguido por la transferencia inmediata de las celulas en receptores (sin ninguna propagacion in vitro adicional). Se espera que las poblaciones de celulas directamente aisladas sean mucho mas eficientes que las celulas cultivadas para aplicaciones in vivo. Se requieren numeros extremadamente altos de linfocitos T expandidos in vitro para la transferencias adoptivas efectivas, un fenomeno lo mas probablemente debido a la adaptacion de los linfocitos T a condiciones de cultivo in vitro. Un ejemplo de una importante aplicacion clmica de este procedimiento es la purificacion y transferencia adoptiva en paralelo de poblaciones de linfocitos T espedficas de VEB y/o CMV durante trasplantes de celulas madre [por lo demas] agotadas en linfocitos T, cuyo protocolo es probable que reduzca espectacularmente la incidencia de tumores malignos relacionados con VEB y CCMV en pacientes trasplantados. La tincion reversible de linfocitos T y aislamiento, por ejemplo usando MHC-Strep-tag® o Fab-Strep-tag® como reactivos de union a receptor y Strep- Tactin® como reactivo de multimerizacion, es un metodo muy adecuado para estas aplicaciones clmicas. Por ejemplo, moleculas de MHC I (fusionadas con un peptido de union a estreptavidina) permiten el aislamiento de linfocitos T CD8+ espedficos de CMV con alta pureza de leucocitos de sangre de donante; posteriormente, tales celulas purificadas se transfieren directamente a pacientes inmunodeprimidos que padecen enfermedad por CMV potencialmente mortal (por ejemplo, tras el trasplante de celulas madre alogenas). Vease Schmitt et al., (2011) TRANSFUSION, Volumen 51, pag. 591-599 a este respecto. Otros ejemplos incluyen poblacion de linfocitos Treg purificados para su uso en transferencia adoptiva para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como enfermedad injerto contra huesped (GvHD) o rechazo del injerto, o diabetes de tipo 1, colitis o alergia. Para este fin, la poblacion de linfocitos diana Treg puede ser linfocitos Treg CD4+CD25+CD45RA+ que se tinen/afslan de una manera secuencial usando tres reactivos de union a receptor tales como fragmentos Fab que se unen espedficamente a la molecula de receptor de CD4, la molecula de receptor de CD25 o la molecula de receptor CD45RA. Otros ejemplos incluyen el aislamiento de linfocitos citolfticos espontaneos mediante la molecula de receptor de CD56 (tambien conocida como molecula de adhesion a celulas neurales (NCAM)) o de celulas madre hematopoyeticas tales como celulas madre hematopoyeticas CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/', CD133+ o Ckit/CD117+ mediante la molecula de receptor de la superficie celular respectiva.
Diagnosticos funcionales de linfocitos T.
Las tecnicas de multfmeros de MHC permiten la cuantificacion y caracterizacion fenotfpica de linfocitos T espedficos de antfgeno directamente ex vivo. Sin embargo, la union de reactivos multimeros a TCR complica el uso de celulas purificadas en ensayos funcionales (por ejemplo, infecciones cronicas por virus [VIH, CMV, VEB, VHB, VHC], poblaciones de linfocitos T espedficas de tumor).
La tincion reversible de linfocitos T y el aislamiento, por ejemplo usando reactivos Fab-Strep-tag®/Strep-Tactin®, no excluye la posibilidad de la poderosa evaluacion de tal estado de linfocitos T en muchas situaciones clmicas.
La invencion se ilustrara ademas por los siguientes ejemplos experimentales.
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Ejemplos
Materiales y metodos Muestras de sangre
Se generaron CMSP recientes de cualquiera de sangre periferica o capas leucocitarias por centrifugacion sobre solucion de separacion Biocoll. Se obtuvo sangre periferica de donantes adultos sanos en el Instituto de Microbiologfa Medica, Inmunolog^a e Higiene (Universidad Tecnica de Munich), y se obtuvieron capas leucocitarias de donantes autologos de sangre en el Instituto de Anestesiologfa, Centro Aleman del Corazon de Munich (Estado de Bavaria y Universidad Tecnica de Munich). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los donantes, y el uso de las muestras de sangre se autorizo segun la ley nacional por el Comite local de etica medica (Ethikkommission der Medizinischen Fakultat der Technischen Universitat Munchen).
Produccion de fragmentos Fab como reactivos de union a receptor (clonacion. expresion. purificacion)
Se generaron los dominios variables que se originan del anticuerpo monoclonal anti-CD4 13B8.2 por smtesis genica usando las secuencias descritas en la patente de EE.UU. 7.482.000 y Bes, C., et al., J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003). Las secuencias variables obtenidas se unieron posteriormente con secuencias que codificaban la region constante humana Ch1 tipo □I para la cadena pesada y kappa para la cadena ligera, y la cadena pesada se fusiono terminalmente en carboxi con una disposicion secuencial de dos modulos de union a estreptavidina (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK), comercialmente disponible como la marca de afinidad One-STrEP-tag de IBA GmbH, Gottingen, Alemania. Toda la clonacion se hizo usando el sistema de clonacion StarGate® (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) con vectores de fusion adaptados para la expresion de Fab descrita. Se aplico PCR de mutagenesis para introducir sustituciones de aminoacidos. Tras la clonacion, se expresaron las protemas de fusion Fab-One-STrEP-tag en la cepa JM83 de E. coli (Pluckthun, A. & Skerra, A. Expression of functional antibody Fv and Fab fragments in Escherichia coli. Methods Enzymol 178, 497-515 (1989)). Despues de la expresion periplasmatica, los fragmentos Fab se purificaron por cromatograffa de afinidad en One-STrEP-tag/Sfrep-Tactin® (Schmidt, T.G. & Skerra, A. The Strep-tag® system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat Protoc 2, 1528-1535 (2007)) mediante una columna Sfrep-Tactin® Superflow (IBA), liberada de destiobiotina usada para la elucion de Fab respectivo de la columna por dialisis y asf se transfirio a tampon PBS a pH 7,4 y se guardo en PBS pH 7,4 a 4 °C o se congelo (-20 °C) hasta uso.
Multimerizacion. tincion y analisis de FACS
Para la tincion de una poblacion de celulas diana espedfica de moleculas de receptor de CD4 en una mezcla de celulas, se uso Sfrep-Tactin® marcada con ficoeritrina como marca fluorescente (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) como el reactivo de multimerizacion junto con el fragmento Fab-One-STrEP de union a CD4 monomerico de las variantes del anticuerpo 13B8.2 (que sirvio de reactivo de union a receptor) como se describe a continuacion. Para el analisis de FACS se incubaron 5x 106 CMSP con multfmeros de Fab que consistfan en 0,2 pg del fragmento Fab (que comprende el sitio de union B) equipado con One-STrEP-tag (componente de union C) como reactivo de union a receptor y 0,75 pg de Sfrep-Tactin® PE (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) como reactivo de multimerizacion usando el protocolo de a continuacion. Ademas, despues de la separacion por FACS, se rompieron los complejos multivalentes en una porcion de cada una de las celulas tenidas mediante adicion de biotina como se describe a continuacion. Se realizaron tinciones de anticuerpo de control por aplicacion concomitante del anticuerpo respectivo: anti-CD4 (OKT4) (de eBiosciences, San Diego, CA, EE.UU.). Despues del procedimiento de tincion de la presente invencion, las celulas se tineron posteriormente con yoduro de propidio para la discriminacion vivas / muertas.
Protocolo para la tincion de 5x106 celulas con reactivo de union a receptor y reactivo de multimerizacion
1. Se incubaron 0,75 pg de Sfrep-Tactin PE con 0,2 pg de fragmento Fab-One-STrEP de union a CD4 monomerico durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad.
2. Se lavaron 5x106 celulas previamente enfriadas con 10 ml de tampon IS (0,5 % de BSA (p/v) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 con PBS = Na2HPO4 8,06 mM KH2PO4, 1,47 mM, NaCl 137 mM) en un tubo de reaccion de 15 ml para eliminar componentes posiblemente existentes como, por ejemplo, D-biotina, que interfieren con el posterior procedimiento.
3. Las celulas se resuspendieron en 50 pl de tampon IS y se transfirieron a un recipiente de reaccion adecuado para la tincion, por ejemplo una placa de microtitulacion de fondo redondo de 96 pocillos.
4. Se anadio a las celulas la preparacion Fab-Streptamer previamente incubada de la etapa 1 y se mezclo minuciosamente por pipeteado suave.
5. La mezcla se incubo durante 20 minutos a 4 °C en la oscuridad.
6. Las celulas se lavaron tres veces por centrifugacion (400 x g, 2 min) en 200 pl de tampon IS.
7. Las celulas estuvieron a continuacion listas para el analisis de FACS o clasificacion por FACS, se llevo a cabo analisis de FACS en un CyAn ADP Lx (Beckman Coulter) y se analizaron con el software FlowJo (TreeStar).
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Protocolo para la disociacion de complejos multivalentes y posterior eliminacion del reactivo de union a receptor de 5x10 celulas con D-biotina
1. Se recogieron 5x106 celulas tenidas (vease anteriormente) por centrifugacion (400 x g) y se resuspendieron en 3 ml de tampon IS que contema D-biotina 1 mM y se incubaron durante 10 minutos a 4 °C.
2. Se sedimentaron por centrifugacion las celulas y se desecho el sobrenadante.
3. Se repitieron las etapas 1 y 2.
4. Las celulas se resuspendieron en 10 ml de tampon IS y se incubaron durante 10 minutos a 25 °C (para la disociacion del fragmento Fab de union a CD4 usado como reactivo de union a receptor).
5. Se sedimentaron por centrifugacion las celulas y se desecho el sobrenadante.
6. Se repitieron tres veces las etapas 4 y 5.
Resultados
Principio de tincion reversible de multimeros de Fab
La base de la presente invencion fue el sorprendente descubrimiento de que los reactivos de union a receptor tales como moleculas de Fab monomericas que tienen altas afinidades por el receptor celular con una Kd < 10"7 de hasta 10"10 M necesitan ser multimerizados por un reactivo de multimerizacion para union estable a las celulas diana y se pueden eliminar completamente de la superficie celular tras la rotura dirigida de la interaccion entre el componente C y los sitios de union Z del reactivo de multimerizacion (Fig. 1). Se descubrio ademas que la base molecular clave para tal tincion reversible no es la constante de afinidad Kd para la interaccion entre la molecula de receptor de la superficie celular y el sitio de union B sobre el reactivo de union a receptor, sino la velocidad de disociacion para la disociacion del reactivo de union a receptor de la molecula de receptor. La velocidad de disociacion debena ser 0,5 x 10"4 s"1 o mas alta para que una molecula de receptor reactivo de union se pueda eliminar completamente de la celula diana en el plazo de una ventana de tiempo razonable.
Con el fin de demostrar el hallazgo clave de que esta velocidad de disociacion y no la afinidad es el parametro esencial para realizar la tincion reversible de multfmeros de Fab, se generaron los siguientes fragmentos Fab recombinantes (que sirven de reactivos de union a receptor) dirigidos contra la molecula de receptor de la superficie celular CD4:
1) Un fragmento Fab que consiste en el dominio variable del anticuerpo murino de union a CD4 13B8.2 y un dominio constante que consiste en el dominio CH1 humano constante de tipo gamma1 para la cadena pesada y el dominio de cadenas ligeras humanas constantes de tipo kappa, como se describe en la patente de EE.UU. 7.482.000. Este Fab se indica a continuacion el fragmento Fab de 13B8.2.
2) Un fragmento Fab de 13B8.2 mutante en el que el resto de Phe en la posicion 100 de la cadena pesada se muto a Ala (tambien denominado en el presente documento mutante 1 de CD4 (F100A) y se denomina F100K-H en la patente de EE.UU. 7.482.000, Tabla II)
3) Un fragmento Fab de 13B8.2 mutante en el que el resto de Tyr en la posicion 92 de la cadena ligera se muto a Ala (tambien denominado en el presente documento mutante 2 de CD4 (Y92A) y se denomina Y92- L en la patente de EE.UU. 7.482.000, Tabla III)
4) Un fragmento Fab de 13B8.2 mutante en que el resto de His en la posicion 35 de la cadena pesada se muto a Ala (tambien denominado en el presente documento mutante 3de CD4 (H35A) y se denomina H35- H en la patente de EE.UU. 7.482.000, Tabla II)
5) Un fragmento Fab de 13B8.2 mutante en que el resto de His en la posicion 91 de la cadena ligera se muto a Ala (tambien denominado en el presente documento mutante 4 de CD4 (H91A) y se denomina H91- L en la patente de EE.UU. 7.482.000, Tabla III)
Estos fragmentos Fab tienen un amplio espectro de afinidades (valores de Kd que oscilan de 12,5 nM a 16,9 pM) y velocidades de kdis crecientes; un resumen de la cinetica de union determinada por BIAcore se enumera en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1: Cinetica de union entre CD4 inmovilizado y el fragmento Fab del anticuerpo de union a CD4 13B8.2 y fragmentos Fab mutantes de la patente de EE.UU. 7.482.000 y Bes, C., et al., J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003)
Fragmento Fab
kas (104 s-1Mv kdis (10-4s-1) Kd (nM)
CD4 no mutante (13B8.2)
0,37 ± 0,09 1 1,11 ± 0,4 1 29,17 ± 3,271)
mutante 1 de CD4 (F100A)
0,562 ± 0,0032) 4,75 ± 0,052) 845,1 ± 47,52)
mutante 2 de CD4 (Y92A)
7,27 ± 0,23) 10,80 ± 1,913) 14,75 ± 2,253)
mutante 3 de CD4 (H35A)
0,0301 ± 0,2002) 18,90 ± 0,85 2) 6279,1 ±4240 2)
mutante 4 de CD4 (H91A)
0,0239 ± 0,0022) 40,40 ± 0,282 16903,7 ± 19002)
1) Este valor es la media aritmetica de las 3 mediciones dadas en Bes, et al. 2) Valor de una unica medicion como se da en Bes et al., 3) El valor es la media aritmetica de las 2 mediciones dadas en Bes et al.,
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Con el fin de introducir un componente de union C, las cadenas pesadas de fragmentos Fab de union a CD4 se fusionaron geneticamente con una disposicion en tandem de dos secuencias de Sfrep-tag®II (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK comercialmente disponible como la secuencia OneSTrEP-tag de IBA GmbH, Gottingen, Alemania), y ambas cadenas se expresaron simultaneamente en el periplasma de E. coli. Los fragmentos Fab funcionalmente ensamblados que sirvieron de reactivo de union a receptor se purificaron entonces por cromatograffa de afinidad sobre una resina Sfrep-Tactin® y, despues de eliminar la destiobiotina por dialisis, posteriormente se multimerizaron en presencia de Sfrep-Tactin® marcado con ficoeritrina soluble en agua (Sfrep- Tactin® PE, que sirve de reactivo de multimerizacion que proporciona al menos 2 (aproximadamente 12) sitios de union Z para la secuencia de One-STrEP-tag, sirviendo la ficoeritrina de marca (fluorescente)). La interaccion entre el peptido de union a estreptavidina y la estreptavidina-mutema "Sfrep-Tactin®" es reversible tras la adicion de D- biotina (o sus derivados tales como diaminobiotina o destiobiotina, por ejemplo) como ligando de competencia.
Para los experimentos de tincion y disociacion, se incubaron 5 x 106 CMSP con los complejos multimero de Fab anti- CD4-Sfrep-Tactin® PE respectivos o con los monomeros de Fab correspondientes (los ultimos no complejados con Sfrep-Tactin® PE). Mientras que el fragmento Fab no mutante (wt) de 13B8.2 y todos los mutantes mostraron senales de tincion buenas esencialmente iguales cuando se multimerizaron, solo el fragmento Fab wt 13B8.2 y el mutante 1, con velocidades kdis mas lentas (1,11 x 10-4 s'1 y 4,75x 10-4 s'1), fueron capaces de unirse a su antfgeno en un estado monomerico (Fig. 2, primera y segunda columnas). Despues de la rotura mediada por D-biotina de los complejos multimericos (Fig. 2, tercera columna) y posterior lavado, las celulas se sondaron para fragmentos Fab unidos a la superficie residuales mediante la adicion de Sfrep-Tactin® PE solo (sin Fab unido) (Fig. 2, cuarta columna). Como era de esperar de los experimentos de tincion de monomero, no se pudieron detectar monomeros de Fab restantes para los mutantes 2, 3 y 4, mientras que se observo Fab unido a la superficie celular residual sustancial de las variantes de no mutante y mutante 1. Para los mutantes 2, 3 y 4, las celulas se podnan volver a tenir eficientemente una segunda vez usando marcado de multfmeros de Fab una vez mas (Fig. 2, quinta columna) que demuestra la coherente eliminacion de biotina durante la deteccion de fragmentos Fab residuales sobre la superficie celular.
Ademas del analisis basado en citometna de flujo (Fig. 2), tambien se evaluo la eliminacion completa de multfmeros de Fab por otro metodo de analisis independiente, es decir, analisis de transferencia Western (Fig. 3). Confirmando los resultados de FACS altamente sensibles mostrados en la Fig. 2, no pudieron detectarse fragmentos Fab en ninguna de la fraccion celular soluble o la insoluble despues de la lisis celular para los mutantes 2, 3 y 4, mientras que el fragmento Fab no mutante pudo ser facilmente detectado en la fraccion soluble. Como este experimento tambien habna detectado fragmentos Fab internalizados, que no habnan sido detectados por FACS, podna descartarse cualquier internalizacion significativa de los reactivos de union a receptor unidos en superficie durante el procedimiento de tincion y liberacion, confirmando asf la correcta interpretacion de los resultados mostrados en la Fig. 2. A diferencia del experimento de FACS que demuestra la eliminacion incompleta del mutante 1 en las condiciones de lavado usadas, no se pudo detectar el mutante 1 restante en celulas similarmente tratadas por el experimento de transferencia Western, supuestamente debido a la sensibilidad inferior del metodo de transferencia Western.
El principal resultado sorprendente es el siguiente: Mientras que, debido a su baja afinidad (Kd de aproximadamente 6,2 pM y 16 pM), la eliminacion completa para mutantes 3 y 4 de Fab despues de la rotura del complejo multivalente del fragmento Fab respectivo y Sfrep-Tactin® PE como reactivo de multimerizacion estuvo en lmea con la ensenanza de la patente de EE.UU. 7.776.562 o la solicitud de patente internacional WO02/054065, fue completamente inesperada la eliminacion completa del fragmento Fab de mutante 2, a diferencia de las moleculas de Fab no mutantes monomericas (y similares a los fragmentos Fab de mutantes 3 y 4), puesto que se determino que la afinidad (Kd = 14,75 ± 2,25 nM) del mutante 2 era significativamente superior que aquella para el no mutante (Kd = 29,17 ± 3,27 nM) y que para todos los otros mutantes. Sin embargo, el mutante 2 se caracteriza por una velocidad de disociacion mucho mas rapida (kdis= 10,80 ± 1,91 x 10-4 s-1; vease tambien la Tabla 1) que el fragmento Fab no mutante y el mutante 1 de Fab, que muestran que la velocidad de disociacion tiene un efecto dominante sobre la estabilidad de union de fragmentos Fab monomericos unidos en la superficie, y no la constante de afinidad. En lmea con esta interpretacion, todos los fragmentos Fab completamente reversibles (mutantes 2-4) (que son los reactivos de union a receptor como se define en el presente documento) comparten una velocidad de disociacion rapida kdis que es mayor que 0,5 x 10-4 s-1. Sin embargo, se debe tambien observar aqrn que, durante la rotura de los complejos de union multivalentes, con lavado/incubacion mas largo con la disolucion que contiene D-biotina, es posible la inversion completa de la union del fragmento Fab no mutante y el mutante 1 de Fab - que ambos tambien tienen una velocidad kdis que es mayor que 0,5 x 10-4 s-1 - dentro de una ventana de tiempo razonable y asf se pueden usar como reactivos de union a receptor segun la invencion.
En resumen, estos datos demuestran que los reactivos de union a receptor multimerizados con una velocidad kdis para la union de una molecula de receptor mediante el sitio de union B que es mayor que 0,5 x 10-4 s-1 (por ejemplo, fragmentos Fab) se pueden usar para tenir celulas de una manera estable y que estos reactivos se pueden desprender y eliminar completamente de la superficie de celulas marcadas en condiciones fisiologicas.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo in vitro de tincion reversible de una celula diana, comprendiendo dicha celula diana una molecula de receptor sobre la superficie de la misma, con una marca detectable, comprendiendo el metodo:
    poner en contacto una mezcla de celulas que comprende dicha celula diana con
    (i) un reactivo de union a receptor, comprendiendo el reactivo de union a receptor al menos un sitio de union B, en el que el sitio de union B se une espedficamente a dicha molecula de receptor, en el que la constante de la velocidad de disociacion (kdis) como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales para la union entre dicho reactivo de union a receptor mediante el sitio de union B y dicha molecula de receptor tiene un valor de 0,5 x10-4 s-1 o mayor, comprendiendo el reactivo de union a receptor ademas al menos un componente de union C, en el que el componente de union C es capaz de ser reversiblemente unido a un sitio de union Z de un reactivo de multimerizacion,
    (ii) un reactivo de multimerizacion, comprendiendo el reactivo de multimerizacion al menos dos sitios de union Z para la union reversible del componente de union C del reactivo de union a receptor,
    en el que el reactivo de union a receptor (i) y el reactivo de multimerizacion (ii) forman complejos de union multivalentes que se unen a dicha celula diana, comprendiendo cada complejo de union multivalente al menos dos de dichos reactivos de union a receptor unidos a uno de dicho reactivo de multimerizacion, proporcionando dicho complejo de union multivalente elevada avidez, con respecto a dicho reactivo de union a receptor; y
    (iii) dicha marca detectable unida o capaz de unirse a dicho complejo de union multivalente,
    en el que dicha celula diana se tine uniendo dicho complejo de union multivalente a dicha celula diana, y en el que la tincion de dicha celula diana es reversible tras la rotura de la union entre dicho componente de union C de dicho reactivo de union a receptor y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion,
    en el que dicho reactivo de union a receptor que se une espedficamente a dicha molecula de receptor se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo divalente, un fragmento de anticuerpo monovalente, una molecula de union proteinacea con propiedades de union de tipo anticuerpo y una molecula de MHC,
    en el que dicha celula diana es una celula de mairnfero.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la constante de disociacion (Kd) para la union reversible entre dicho sitio de union Z y dicho componente C esta en el intervalo de 10-2 M a 10-13 M.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la constante de la velocidad de disociacion (kdis) para la union entre dicho reactivo de union a molecula de receptor y dicha molecula de receptor tiene un valor de 1 x 10-4 s-1 o mayor,
    -4 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 -3 -1
    de 2x10 s' o mayor, o 3x10 s' o mayor, de 4x10 s' o mayor, de 5x10 s' o mayor, de 1x10 s' o mayor,
    -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1
    de 1,5 x10- s- o mayor, de 2x10- s- o mayor, de 3x10- s- o mayor, de 4x10- s-, de 5x10- s- o mayor, o 1 x 10-2 s-1 o mayor.
  4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la constante de disociacion (Kd) para la union entre dicho reactivo de union a receptor y dicha molecula de receptor esta en el intervalo de 10-2 a 10-10 M.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que la constante de disociacion (Kd) para la union entre dicho reactivo de
    1 o' ' 1 in o q o
    union a receptor y dicha molecula de receptor esta en el intervalo de 10- M a 10- M, o 10- M a 10- M, o 10- M a 10-8 M, o 10-3 M a 10-7 M, o 10-7 M a 10-10 M, o 10-7 M a 10-9M.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende ademas separar dicha celula tenida de celulas no diana presentes en dicha mezcla de celulas.
  7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende ademas eliminar dicha tincion de dicha celula diana rompiendo la union entre dicho componente de union C del reactivo de union a receptor y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion.
  8. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que la eliminacion del reactivo de multimerizacion da como resultado una disociacion del reactivo de union a receptor de la celula tenida.
  9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que
    (a) dicho componente de union C comprende biotina y dicho reactivo de multimerizacion comprende un analogo de estreptavidina o un analogo de avidina que se une reversiblemente a biotina,
    (b) dicho componente de union C comprende un analogo de biotina que se une reversiblemente a estreptavidina o avidina y dicho reactivo de multimerizacion comprende estreptavidina, o avidina, o un analogo de estreptavidina, o un analogo de avidina que se une reversiblemente a dicho analogo de biotina, o
    5
    10
    15
    20
    25
    (c) dicho componente de union C comprende un peptido de union a estreptavidina o avidina y dicho reactivo de multimerizacion comprende estreptavidina, o avidina, o un analogo de estreptavidina, o un analogo de avidina que se une reversiblemente a dicho peptido de union a estreptavidina o avidina.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicho componente de union C comprende el peptido de union a estreptavidina Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys y dicho reactivo de multimerizacion comprende el analogo de estreptavidina Val44-Thr45-Ala46-Arg47 o el analogo de estreptavidina lle44-Gly45-Ala46-Arg47.
  11. 11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la union entre dicho componente de union C y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion se produce en presencia de un cation divalente.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que dicho componente de union C comprende un peptido de union a calmodulina y dicho reactivo de multimerizacion comprende calmodulina, o
    en el que dicho componente de union C comprende un peptido FLAG y dicho reactivo de multimerizacion comprende un anticuerpo que se une al peptido FLAG, o
    en el que dicha primera union C comprende una marca de oligohistidina y dicho reactivo de multimerizacion comprende un anticuerpo que se une a la marca de oligohistidina.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 11 o 12, en el que la union entre dicho componente de union C y dichos sitios de union Z de dicho reactivo de multimerizacion se rompe por quelacion de ion metalico.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que la quelacion de metales se lleva a cabo mediante adicion de EDTA o EGTA.
  15. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho reactivo de multimerizacion es un oligomero o un polfmero de estreptavidina o avidina o de cualquiera analogo de estreptavidina o avidina.
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