ES2677619T3 - Análogos potentes de la compstatina - Google Patents

Abstract

Un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido que tiene una secuencia: Xaa1 - Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (ID DE SECUENCIA Nº: 26); en la que: Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu ó un dipéptido Gly-Ile; Xaa2 es Trp ó un análogo de Trp, en donde el análogo de Trp tiene carácter hidrófobo incrementado en comparación con Trp y se selecciona de (a) 5-fluoro-/-triptófano, o 6-fluoro-/-triptófano; o (b) 5-metoxitriptófano o 5-metiltriptófano; o (c) 1-metiltriptófano; con la condición de que si Xaa3 es Trp, Xaa2 es el análogo de Trp; Xaa3 es Trp o un análogo de Trp que tiene un hidrógeno de indol sustituido con un átomo de flúor, aumentando de este modo el potencial de enlace de hidrógeno del anillo de indol, opcionalmente en donde el análogo de Trp de Xaa3 es 5-fluoro-/-triptófano, o 6-fluoro-/-triptófano; Xaa4 es His, Ala, Phe o Trp, opcionalmente en donde Xaa4 es Ala; Xaa5 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipéptido Thr-Asn o Thr-Ala, o un tripéptido Thr-Ala-Asn, en donde un extremo terminal carboxi -OH de cualquiera de L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly o Asn está opcionalmente sustituido con -NH2; y los dos residuos Cys están unidos por un enlace de disulfuro.

Description

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Analogos potentes de la compstatina Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion hace referencia a la activacion de la cascada del complemento en el cuerpo. En particular, esta invencion proporciona peptidos y peptidomimeticos capaces de unirse a la protema C3 e inhibir la activacion del complemento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Varias publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artmulos tecnicos y artmulos academicos se citan a lo largo de la especificacion. Cada una de estas publicaciones citadas se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. Las citaciones completas para publicaciones no citadas completamente dentro de esta especificacion se exponen al final de la especificacion.

El sistema del complemento es la primera lmea de defensa inmunologica contra los patogenos externos. Su activacion a traves de la via clasica, alternativa o de las lectinas conduce a la generacion de los peptidos anafilatoxicos C3a y C5a y a la formacion del complejo de ataque a membrana C5b-9. El componente del complemento C3 desempena un papel fundamental en la activacion de las tres vfas. La activacion de C3 mediante convertasas de C3 de la via del complemento y su posterior acoplamiento a la superficie objetivo conduce a la formacion del complejo de ataque a membrana y a la larga a danos en o lisis en las celulas objetivo. C3 es unico en que posee una rica arquitectura que proporciona una gran diversidad de sitios de union a ligandos que son importantes en las vfas de la supervision inmunologica y de la respuesta inmunitaria.

La activacion inadecuada del complemento puede conducir a danos en la celula huesped. El complemento esta involucrado en varios estados de enfermedades, incluyendo diversas enfermedades autoinmunes, y se ha descubierto que contribuye a otras condiciones clmicas tales como el smdrome respiratorio del adulto, los ataques al corazon, el rechazo despues de un xenotransplante y las lesiones por quemaduras. Tambien se ha descubierto que las lesiones tisulares con mediacion del complemento son el resultado de situaciones de bioincompatibilidad tales como las que se encuentran en los pacientes que se someten a dialisis o bypass cardiopulmonar.

En las lesiones tisulares con mediacion del complemento actua de mediador directo el complejo de ataque a membrana, e indirecto la generacion de C3a y C5a. Estos peptidos inducen danos a traves de sus efectos en diferentes celulas, incluyendo los neutrofilos y los mastocitos. In vivo, la regulacion del complemento en los pasos de activacion de C3 y C5 la proporcionan tanto las protemas plasmaticas como las protemas de membrana. Los inhibidores de las protemas plasmaticas son el factor H y la protema de union a C4, y las protemas de membrana reguladoras ubicadas en las superficies celulares son los receptores del complemento 1 (CR1), el factor acelerador de la degradacion (DAF), y la protema cofactor de membrana (MCP). Estas protemas inhiben las convertasas de C3 y C5 (proteasas con multiples subunidades), estimulando la disociacion de los complejos con multiples subunidades y/o inactivando los complejos a traves de proteolisis (catalizados por el factor l). Se han identificado diferentes agentes farmacologicos que regulan o modulan la actividad del complemento mediante ensayo in vitro, pero in vivo la mayona han demostrado ser de baja actividad o toxicos.

Hasta la fecha, no se ha aprobado ningun inhibidor de activacion del complemento para su uso clmico, aunque existen algunos candidatos para el uso clmico, en concreto, una forma recombinante del receptor del complemento 1 conocida como receptor soluble del complemento 1 (sCR1) y un anticuerpo antiC5 monoclonal humanizado (5G1.1-scFv). Estas dos sustancias se ha demostrado que suprimen la activacion del complemento en modelos animales in vivo (Kalli KR et al., 1994; y, Wang et al., 1996). Sin embargo, cada sustancia posee la desventaja de ser una protema de gran peso molecular (240 kDa y 26 kDa, respectivamente) que es diffcil de fabricar y debe administrarse mediante infusion. De acuerdo con esto, investigaciones recientes han hecho hincapie en el desarrollo de agentes activos mas pequenos que sean mas faciles de administrar, mas estables y menos costosos de fabricar.

La patente estadounidense n° 6.319.897 de Lambris et al. describe el uso de una biblioteca aleatoria combinatoria de peptidos expresados en fago para identificar un peptido de 27 residuos que se une a C3 e inhibe la activacion del complemento. Este peptido se fragmento en un segmento dclico de 13 residuos que mantema una actividad completa, lo que se denomina en la tecnica compstatina. La compstatina inhibe la division de C3 en C3a y C3b mediante convertasas de C3. La compstatina ha sido sometida a ensayo en una serie de experimentos de interfaz in vitro, in vivo, ex vivo, y in vivo/ex vivo, y se ha demostrado que: (1) inhibe la activacion del complemento en el suero humano (Sahu A et al., 1996); (2) inhibe la activacion del complemento inducida por heparina/protamina en primates sin efectos secundarios significativos (Soulika AM et al., 2000); (3) prolonga la vida de un xenoinjerto porcino a ser humano perfundido con sangre humana (Fiane AE et al., 1999a; Fiane AE et al., 1999b; y, Fiane AE et al., 2000); (4) inhibe la activacion del complemento en modelos de bypass cardiopulmonar, plasmaferesis, y circuitos

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extracorporeos de dialisis (Nilsson B et al., 1998); y (5) posee una baja toxicidad (Furlong ST et al., 2000).

La compstatina es un peptido que comprende la secuencia ICVVQDWGHHRCT-NH2 (ID DE SECUENCIA N°: 1), en la que Cys2 y Cys12 forman un puente disulfuro. Se determino su estructura tridimensional utilizando espectroscopia NMR en 2D homonuclear en combinacion con dos metodologfas computacionales distintas restringidas experimentalmente. La primera metodologfa implicaba geometna de distancia, dinamica molecular e hibridacion simulada (Morikis D et al., 1998; WO99/13899) y la segunda metodologfa implicaba optimizacion global (Klepeis et al., J. Computational Chem., 20: 1344-1370, 1999). La estructura de la compstatina revelo una superficie molecular que comprende una zona polar y una zona no polar. La parte polar incluye un giro p de tipo I y la zona no polar incluye el puente disulfuro. Ademas, se sintetizaron una serie de analogos con sustituciones de alanina (un barrido de alanina) y se sometieron a ensayo buscando actividad, lo que revelo que los cuatro residuos del giro p y el puente disulfuro con el conjunto hidrofobo de alrededor juegan papeles importantes en la actividad inhibidora de la compstatina (Morikis et al., 1998; WO99/13899).

Utilizando un ensayo de la actividad del complemento que comprende medir la lisis eritrocitaria con mediacion de la via alternativa, se medido la IC50 de la compstatina en 12 pM. Algunos de los analogos sometidos a ensayo previamente han demostrado tener una actividad equivalente a o mayor que la de la compstatina. La solicitud de patente internacional publicada n° W02004/026328 revela analogos y mimeticos de la compstatina con variaciones en los extremos N y C, y en las posiciones 4 y 9, que impartfan una actividad mejorada en el antes mencionado ensayo. Se ha informado de mejoras de hasta 99 veces mas que la compstatina para ciertos analogos (vease tambien, Mallik et al., 2005). El desarrollo de analogos o mimeticos de la compstatina con incluso mayor actividad constituina un avance significativo en la tecnica.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona analogos y mimeticos del peptido inhibidor del complemento, la compstatina (HOOC-ICVVQDWGHHRCT-NH2; ID DE SECUENCIA N°: 1), que poseen una actividad inhibidora del complemento mejorada en comparacion con la compstatina.

En un aspecto, la invencion presenta un compuesto que inhibe la activacion del complemento, que comprende un peptido con la siguiente secuencia:

Xaa1 - Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (ID DE SECUENCIA

N°: 26); como se define en las reivindicaciones anadidas.

En ciertas realizaciones, Xaa2 participa en una interaccion no polar con C3. En otras realizaciones, Xaa3 participa en un enlace de hidrogeno con C3. En otras realizaciones, Xaa2 participa en una interaccion no polar con C3, y Xaa3 participa en un enlace de hidrogeno con C3.

En varias realizaciones, el analogo de Trp de Xaa2 es un triptofano halogenado, como 5-fluoro-1-triptofano o 6-fluoro-1-triptofano. En otras realizaciones el analogo de Tro en Xaa2 comprende un sustituyente de alcoxi inferior o alquilo inferior en la posicion 5, por ejemplo, 5-metoxitriptofano o 5-metiltriptofano. En otras realizaciones, el analogo de Trp en Xaa2 es 1-metiltriptofano o comprende un sustituyente de alquenoilo inferior en la posicion 1, con las realizaciones ejemplares comprendiendo 1-formiltriptofano. En otras realizaciones, el analogo de Trp de Xaa3 es un triptofano halogenado como 5-fluoro-1triptofano o 6-fluoro-triptofano.

En ciertas realizaciones, Xaa2 comprende un sustituyente de alquenoilo inferior en la posicion 1 de triptofano, Xaa3 comprende opcionalmente un triptofano halogenado y Xaa4 comprende Alanina. En realizaciones particulares, Xaa2 es 1-metiltriptofano o 1-formiltriptofano y Xaa3 comprende opcionalmente 5-fluoro-1-triptofano. Algunos compuestos ejemplares de la invencion comprenden cualquiera de las ID DE SECUENCIA N°: 15-25.

En algunas realizaciones, el compuesto comprende un peptido producido mediante la expresion de un polinucleotido que codifica el peptido. En otras realizaciones, el compuesto es producido al menos en parte mediante smtesis peptfdica. Tambien puede utilizarse una combinacion de metodos sinteticos.

En ciertas realizaciones, los analogos de la compstatina son, donde el compuesto este PEGilado, tal y como lo ilustra el compuesto que comprende la ID DE SECUENCIA N°: 36.

En otras realizaciones, el analogo de la compstatina ademas comprende un componente peptfdico adicional que extiende la retencion in vivo del compuesto. Por ejemplo, el componente peptfdico adicional puede ser un peptido de union a albumina. Un conjugado peptido-compstatina de union a albumina ejemplo comprende la ID DE SECUENCIA N°: 39.

Otro aspecto de la invencion presenta un compuesto que inhibe la activacion del complemento, que comprende un mimetico no peptfdico o peptfdico parcial de la ID De SECUENCIA N°:26 o cualquiera de las otras

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secuencias de analogos y conjugados descritos en la presente con anterioridad. Estos mimeticos no peptfdicos o peptfdicos parciales estan disenados para unirse con C3 e inhiben la activacion del complemento con al menos una actividad 100 veces mayor de lo que lo hace el peptido que comprende la ID DE SECUENCIA N° 1 bajo condiciones de ensayo equivalentes.

Los analogos, conjugados y mimeticos de la compstatina descritos en el presente documento son de uso practico para cualquier proposito para el que se utilice la compstatina misma, tal y como se conoce en la tecnica y se describe en mayor detalle aqm. Algunos de estos usos implican la formulacion de los compuestos en composiciones farmaceuticas para su administracion a un paciente. Dichas formulaciones pueden comprender sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos, asf como uno o mas diluyentes, portadores, excipientes farmaceuticamente aceptables y otros parecidos, tal y como estana dentro del ambito de los expertos en la tecnica.

Diferentes caractensticas y ventajas de la presente invencion se comprenderan al leer la descripcion detallada, los dibujos y ejemplos que siguen a continuacion.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Actividad de la compstatina expresada y sus analogos. Grafico con porcentaje de la inhibicion del complemento versus la concentracion peptfdica para Ac-V4W/H9A (ID DE SeCuENCIA N°: 5) (cuadrados) y la compstatina expresada con triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 15) (drculos), 5-fluoro- triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 16) (triangulos), 6-fluoro-triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 17) (estrellas), 5-hidroxi-triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 27) (hexagonos), 7-aza-triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 28) (diamantes).

Figura 2. Actividad de los analogos sinteticos de la compstatina. Grafico con porcentaje de la inhibicion del complemento versus la concentracion peptfdica para Ac-V4W/H9A (ID DE SeCuENCIA N°: 5) (cuadrados) y los analogos de la compstatina con incorporacion de 5-fluoro-l-triptofano en la posicion 4 (ID DE SECUENCIA N°: 18) (drculos), en la posicion 7 (ID DE SECUENCIA N°: 19) (triangulos), en ambas posiciones 4 y 7 (ID DE SECUENCIA N°: 20) (diamantes).

Figura 3. Actividad de los analogos sinteticos adicionales de la compstatina. Grafico con porcentaje de la inhibicion del complemento versus la concentracion peptfdica para (A) Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5) (triangulos) en comparacion con Ac-V4(5f-/-W)/H9A (ID dE SeCuENCIA N°: 18) (triangulo invertido), Ac-V4(5-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 22) (drculos), Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23) (diamantes), Ac-V4(2-Nal)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 7) (cuadrados); (B) Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5) (triangulos) en comparacion con Ac-V4W/W7(5f-/-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 19) (hexagonos); y, (C) compstatina de tipo salvaje (ID DE SECUENCIA N°: 1) (triangulos) en comparacion con Ac-V4(1-metil-W)/W7(5f-/-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 24) (triangulos apuntando hacia la izquierda).

Figura 4. Caracterizacion termodinamica de la interaccion de los analogos adicionales de la compstatina con C3. Datos ITC que representan la union de (A) Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5); (B) Ac-V4(5f-/-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 18); (C) Ac-V4(5-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 22); (D) Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23); (E) Ac-V4(2-Nal)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 7); y, (F) Ac-V4W/W7(5f-/-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 19) a C3. Las lmeas se obtuvieron ajustando los datos sin procesar corregidos a un modelo de “un conjunto de sitios” en Origin 7.0.

Figura 5. Grafico con lmeas que muestran la relacion entre hidrofobicidad de los analogos indicada mediante log P y la constante inhibidora (A), la entropfa indicada mediante -TAS (B) y la constante de union (C).

Figura 6. Actividad de un analogo sintetico adicional de la compstatina. Grafico con porcentaje de la inhibicion del complemento versus la concentracion peptfdica para Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23) (drculos) y Ac-V4(1-formil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 25) (cuadrados).

Figura 7. Actividad del analogo PEGilado de la compstatina. Grafico con porcentaje de la inhibicion del complemento versus la concentracion peptfdica para Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23) (drculos) y Ac-V4(1-metil-W)/H9A-K-PEG 5000 (ID DE SECUENCIA N°: 36) (cuadrados).

Figura 8. Actividad del analogo de la compstatina conjugada con protema de union albumina. Grafico con porcentaje de la inhibicion del complemento versus la concentracion peptfdica para Ac-V4(1-metil- W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23) (drculos) y el peptido de fusion (Ac-

ICV(1MeW)QDWGAHRCTRLIEDICLPRWGCLWEDD-NH2) (ID DE SECUENCIA N°: 39) (cuadrados). DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

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Se utilizan diferentes terminos referentes a los metodos y otros aspectos de la presente invencion a lo largo de la especificacion y reivindicaciones. Se debe dar el significado habitual en la tecnica a dichos terminos a menos que se indique lo contrario. Otros terminos definidos de forma espedfica deben interpretarse de manera que sean consecuentes con la definicion que se proporciona en el presente documento.

Definiciones:

Las abreviaturas siguientes pueden utilizarse en la especificacion y ejemplos: Ac, grupo acetilo; NH2, amida; MALDI, ionizacion por desorcion laser asistida por matriz; TOF, tiempo de vuelo; ITC, calorimetna de titulacion isotermica; CLAP, cromatograffa de Kquidos a alta presion; NA, no activo; dT, D-treonina; 2-Nal, 2-naftilalanina; 1- Nal, 1-naftilalanina; 2-Igl, 2-indanilglicina; Dht, dihidrotriptofano; Bpa, 4-benzoil-L-fenilalanina; 5f-/-W, 5-fluoro-/- triptofano; 6f-/-W, 6-fluoro-/-triptofano; 5-OH-W, 5-hidroxitriptofano; 5-metoxi-W, 5-metoxitriptofano; 5-metil-W, 5- metiltriptofano; 1-metil-W, 1-metiltriptofano; las abreviaturas de aminoacidos utilizan la nomenclatura estandar de una o tres letras, por ejemplo, Trp o W para triptofano.

El termino “aproximadamente”, tal y como se utiliza aqu cuando se hace referencia a un valor mensurable como es una cantidad, una duracion temporal y cosas asf, pretende englobar variaciones de ± 20% o ± 10%, en algunas realizaciones ± 5%, en algunas realizaciones ± 1%, y en algunas realizaciones ± 0,1% con respecto al valor especificado, segun dichas variaciones sean apropiadas para realizar y usar los compuestos y composiciones reveladas.

Los terminos “farmaceuticamente activo” y “biologicamente activo” hacen referencia a la capacidad de los compuestos de la invencion para unirse a C3 o a fragmentos de la misma e inhibir la activacion del complemento. Esta actividad biologica puede medirse mediante uno o mas de los diversos ensayos reconocidos en la tecnica, tal y como se describe en mayor detalle en el presente documento.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “alquilo” hace referencia a un hidrocarburo dclico, ramificado o lineal saturado sustituido de forma opcional que posee de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 atomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y numeros espedficos de atomos de carbono en el mismo), prefiriendose de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 atomos de carbono. Los grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclooctilo, adamantilo, 3-metilpentilo, 2,2- dimetilbutilo, y 2,3-dimetilbutilo. El termino “alquilo inferior” hace referencia a un hidrocarburo dclico, ramificado o lineal saturado sustituido de forma opcional que posee de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y numeros espedficos de atomos de carbono en el mismo). Los grupos alquilo inferior incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, ciclopentilo, isopentilo y neopentilo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “halo” hace referencia a F, Cl, Br o I.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “alcanoilo”, que puede utilizarse de manera intercambiable con “acilo”, hace referencia a un residuo adlico alifatico ramificado o lineal sustituido de forma opcional que posee de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 atomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y numeros espedficos de atomos de carbono en el mismo), prefiriendose de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 atomos de carbono. Los grupos alcanoilo incluyen, pero no se limitan a, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoilo, isopentanoilo, 2-metil-butirilo, 2,2-dimetilpropionilo, hexanoilo, heptanoilo, octanoilo, y parecidos. El termino “alcanoilo inferior” hace referencia a un residuo adlico alifatico ramificado o lineal sustituido de forma opcional que posee de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y numeros espedficos de atomos de carbono en el mismo). Los grupos alcanoilo inferior incluyen, pero no se limitan a, formilo, acetilo, n-propionilo, isopropionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoilo, iso-pentanoilo, y parecidos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “arilo” hace referencia a un sistema de anillo aromatico bidclico o monodclico sustituido de forma opcional que posee de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 atomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y numeros espedficos de atomos de carbono en el mismo), prefiriendose de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 atomos de carbono. Entre los ejemplos no restrictivos se incluyen, por ejemplo, el fenilo y el naftilo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “aralquilo” hace referencia a radicales alquilo portadores de un sustituyente arilo y tienen de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 atomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y numeros espedficos de atomos de carbono en el mismo), prefiriendose de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 atomos de carbono. Los grupos aralquilo pueden ser sustituidos de forma opcional. Entre los ejemplos no restrictivos se incluyen, por ejemplo, el bencilo, naftilmetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, feniletilo, y difeniletilo.

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Tal y como se utiliza en el presente documento, los terminos “alcoxi” y “alcoxilo” hacen referencia a un grupo-O-alquilo sustituido de forma opcional en el que el alquilo es como se ha definido anteriormente. Entre los grupos alcoxilo y alcoxi de ejemplo se incluyen el metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, y heptoxi, entre otros.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “carboxi” hace referencia a un grupo -C(=O)OH.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “alcoxicarbonilo” hace referencia a un grupo -C(=O)O alquilo, donde el alquilo es como se ha definido anteriormente.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “aroflo” hace referencia a un grupo -C(=O) arilo, en el que el arilo es como se ha definido anteriormente. Entre los grupos aroflo de ejemplo se incluyen el benzoflo y el naftoflo.

Tfpicamente, partes de moleculas qmmicas sustituidas incluyen uno o mas sustituyentes que sustituyen al hidrogeno en ubicaciones seleccionadas de una molecula. Entre los sustituyentes de ejemplo se incluyen, por ejemplo, halo, alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo, sulfhidrilo, hidroxilo (-OH), alcoxilo, ciano (-CN), carboxilo (- COOH), acilo (alcanoilo: -C(=O)R); -C(=O)O-alquilo, aminocarbonilo (-C(=O)NH2), aminocarbonilo N-sustituido (- C(=O)NHR”), CF3, CF2CF3, y similares. En relacion con los sustituyentes anteriormente mencionados, cada parte de molecula R” puede ser, por separado, cualquiera de entre H, alquilo, cicloalquilo, arilo, o aralquilo, por ejemplo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “L-aminoacido” hace referencia a cualesquiera alfa- aminoacidos levogiros presentes de forma natural que normalmente estan en las protemas o los esteres de alquilo de dichos alfa-aminoacidos. El termino "D-aminoacido" hace referencia a alfa-aminoacidos dextrogiros. Salvo que se especifique lo contrario, todos los aminoacidos a los que se hace referencia en el presente documento son L- aminoacidos.

“Hidrofobo” o “no polar” se utilizan en el presente documento como sinonimos, y hacen referencia a cualquier interaccion inter- o intramolecular no caracterizada por un dipolo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “caracter pi” hace referencia a la capacidad de la compstatina para participar en un enlace pi con C3. Los enlaces pi resultan de la superposicion lateral de dos orbitales p paralelos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “potencial de enlace de hidrogeno” hace referencia a la capacidad de la compstatina para participar en una atraccion electrostatica con C3 implicando a partes de moleculas electronegativas en los analogos de triptofano o residuos de triptofano modificados en los atomos de hidrogeno y compstatina de C3. Un ejemplo no restrictivo de dicha parte de molecula electronegativa es un atomo de fluor.

“PEGilacion” hace referencia a la reaccion en la que al menos una parte de molecula de polietilenglicol (PEG), independientemente del tamano, se une qmmicamente a una protema o peptido para formar un conjugado peptido-PEG. “PEGilado” significa que al menos una parte de molecula de PEG, independientemente del tamano, esta unida qmmicamente a un peptido o protema. El termino PEG va generalmente acompanado por un sufijo numerico que indica el peso molecular medio aproximado de los polfmeros de PEG; por ejemplo, PEG-8.000 hace referencia a un polietilenglicol que posee un peso molecular medio de aproximadamente 8.000.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “sales farmaceuticamente aceptables” hace referencia a derivados de los compuestos revelados en los que el compuesto precursor es modificado fabricando sales base o acidas del mismo. Entre los ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables se incluyen, pero no se limitan a, sales acidas organicas o minerales de residuos basicos tales como aminas; sales organicas o alcalinas de residuos addicos tales como acidos carboxflicos; y similares. Por consiguiente, el termino “sal de adicion acida” hace referencia al derivado de sal correspondiente de un compuesto precursor que ha sido elaborado mediante la adicion de un acido. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales convencionales o las sales cuaternarias de amonio del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de acidos organicos o inorganicos. Por ejemplo, dichas sales convencionales incluyen, pero no se limitan a, las derivadas de acidos inorganicos tales como los clorhndricos, bromhidricos, sulfuricos, sulfamicos, fosforicos, mtricos y similares; y las sales elaboradas a partir de acidos organicos tales como los aceticos, propionicos, succmicos, glicolicos, estearicos, lacticos, malicos, tartaricos, cftricos, ascorbicos, pamoicos, maleicos, hidroximaleicos, fenilaceticos, glutamicos, benzoicos, salicflicos, sulfamlicos, 2-acetoxibenzoicos, fumaricos, toluensulfonicos, metanosulfonicos, etanodisulfonicos, oxalicos, isetionicos, y similares. Ciertos compuestos basicos o acfdicos de la presente invencion pueden existir como zwitteriones. Todas las formas de los compuestos, incluyendo el acido libre, la base libre, y los zwitteriones, se considera que estan dentro del alcance de la presente invencion.

Descripcion:

De conformidad con la presente invencion, se ha empleado la informacion sobre las caractensticas biologicas y fisicoqmmicas de la compstatina para disenar analogos de la compstatina con una actividad

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considerablemente mejorada en comparacion con el peptido precursor de la compstatina. En algunas realizaciones, los analogos poseen una actividad al menos 50 veces mayor que la de la compstatina. En otras realizaciones, los analogos tienen 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, 100-, 105-, 110-, 115-, 120-, 125-, o 130-veces o mas actividad que la compstatina. En otras realizaciones mas, los analogos tienen 135-, 140-, 145-, 150-, 155-, 160-, 165-, 170-, 175-, 180-, 185-, 190-, 195-, 200-, 205-, 210-, 215-, 220-, 225-, 230-, 235-, 240-, 245-, 250-, 255-, 260-, 265veces o mas actividad que la compstatina, como se compara utilizando los ensayos descritos en los ejemplos.

Se ha demostrado que los analogos de la compstatina sintetizados de conformidad con otros enfoques poseen una actividad un tanto mejorada en comparacion con el peptido precursor, esto es, hasta aproximadamente 99 veces mas (Mallik, B. et al, 2005, supra; WO2004/026328). Los analogos elaborados de conformidad con la presente invencion poseen una actividad incluso mayor que el peptido precursor o los analogos del mismo elaborados hasta la fecha, tal y como se ha demostrado mediante ensayos in vitro como se muestra en las figuras y los Ejemplos del presente documento.

La Tabla 1B muestra la secuencia de aminoacidos y las actividades inhibidoras del complemento de la compstatina y analogos seleccionados con una actividad considerablemente mejorada. Se hace referencia a los analogos seleccionados mediante modificaciones espedficas de las posiciones designadas (1-13) en comparacion con el peptido precursor, la compstatina (ID DE SECUENCIA N°: 1) y con los peptidos de las SeCuENCIAS N°: 214, que se muestran en la Tabla 1A y que se han descrito en WO2004/026328. Los peptidos de ID DE SECUENCIA N°: 16-24 son representativos de modificaciones realizadas de conformidad con la presente invencion, dando por resultado analogos de la compstatina considerablemente mas potentes. Tal y como se describe en mayor detalle a continuacion, se entendera que ciertas modificaciones realizadas al triptofano en la posicion 4 como se expone en la ID DE SECUENCIA N°: 2-13 pueden combinarse con una sustitucion del analogo del triptofano en la posicion 7, para formar unos analogos de la compstatina aun mas potentes.

TABLA 1.

Peptido

Secuencia ID DE SECUENCIA N°: Actividad sobre la compstatina

A. Compstatina y analogos anteriormente descritos

Compstatina

H-ICWQDWGHHRCT-CONH2 1 *

Ac-compstatina

Ac-ICVVQDWGHHRCT-CONH2 2 3 veces mas

Ac-V4Y/H9A

Ac-ICVYQDWGAHRCT-CONH2 3 19 veces mas

Ac-V4W/H9A-OH

Ac-ICVWQDWGAHRCT-COOH 4 25 veces mas

Ac-V4W/H9A

Ac-ICVW3DWGAHRCT-CONH2 5 55 veces mas

Ac-V4W/H9A/T13dT-OH

Ac-ICVWQDWGAHRCdT-COON 6 55 veces mas

Ac-V4(2-Nal)/H9A

Ac-ICV(2-Nal)QDWGAHRCT-CONH2 7 99 veces mas

Ac V4(2-Nal)/H9A-OH

Ac-ICV(2-Nal)QDWGAHRCT-COOH 8 39 veces mas

Ac V4(1-Nal)/H9A-OH

Ac-ICV(1-Nal)QDWGAHRCT-COOH 9 30 veces mas

Ac-V4Igl/H9A

Ac-ICV(2-Igl)QDWGA-HRCT-CONH2 10 39 veces mas

Ac-V4Igl/H9A-OH

Ac-ICV(2-Igl)QDWGAHRCT-COOH 11 37 veces mas

Ac-V4Dht/H9A-OH

Ac-ICVDhtQDWGAHRCT-COOH 12 5 veces mas

Ac-V4(Bpa)/H9A-OH

Ac-ICV(Bpa)QDWGAHRCT-COOH 13 49 veces mas

+G/V4W/H9A +AN -OH

H-GICVWQDWGAHRCTAN-COOH 14 38 veces mas

B. Analogos ejemplo descritos en el presente documento

+G/V4W/H9A +N -OH

H-GICVWQDWGAHRCTN-COOH 15 45 veces mas

+G/V4(5f-/-W)/W7(5f-I- W),/H9A+N -OH

H-GICV(5f-/-W)QD(5f-/-W)GAHRCTN- COOH 16 112 veces mas

+G/V4(6f-/-W)/W7(6f-I- W)/H9A+N -OH

H-GICV(6f-/-W)QD(6f-/-W)GAHRCTN- COOH 17 126 veces mas

Ac-V4(5f-I-W)/H9A

Ac-ICV(5f-/-W)QDWGAHRCT-CONH2 18 31 veces mas

Ac-V4W/W7(5f-I-W)/H9A

Ac-ICVWQD(5f-/-W)GAHRCT-CONH2 19 121 veces mas

Ac-V4(5f-/-W)/W7(5f-/- W)/H9A

Ac-ICV(5f-/-W)QD(5f-/-W)GAHRCT- CONH2 20 161 veces mas

Ac-V4(5-metoxi-W)/H9A

Ac-ICV(5-metoxi-W)QDWGAHRCT- CONH2 21 76 veces mas

Ac-V4(5-metil-W)/H9A

Ac-ICV(5-metil-W)QDWGAHRCT- CONH2 22 67 veces mas

Ac-V4(1-metil-W)/H9A

Ac-ICV(1-metil-W)QDWGAHRCT- CONH2 23 264 veces mas

Ac-V4(1-metil-W)/W7(5f-I- W)/H9A

Ac-ICV(1-metil-W)QD(5f-/- W)GAHRCT-CONH2 24 264 veces mas

Ac-V4(1-formil-W)/H9A

Ac-ICV(1-formil-W)QDWGAHRCT- CONH2 25 264 veces mas

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(continua)

Las abreviaturas utilizadas en esta tabla son las siguientes: dT = D-treonina 2-Nal = 2-naftilalanina

1- Nal = 1-naftilalanina

2- Igl = 2-indanilglicina Dht = dihidrotriptofano

Bpa = 4-benzoil-L-fenilalanina 5f-/-W = 5-fluoro-/-triptofano 6f-/-W = 6-fluoro-/-triptofano 5-OH-W = 5-hidroxitriptofano 5-metoxi-W = 5-metoxitriptofano 5-metil-W = 5-metiltriptofano 1-metil-W = 1-metiltriptofano 1-formil-W = 1-formiltriptofano

Modificaciones en el extremo N terminal. La acetilacion del extremo N terminal normalmente incrementa la actividad inhibidora del complemento de la compstatina y sus analogos, como puede verse espedficamente comparando la ID DE SECUENCIA N°: 1 con la ID DE SEcUeNCIA N°: 2. De acuerdo con esto, la adicion de un grupo acilo en el extremo amino terminal del peptido, incluyendo pero sin limitarse a la N-acetilacion, es una realizacion preferente de la invencion, de particular utilidad cuando los peptidos se elaboran de forma sintetica. Sin embargo, a veces es ventajoso elaborar los peptidos mediante la expresion de una molecula de acido nucleico de codificacion peptfdica en un sistema de expresion procariotica o eucariotica, o mediante traduccion y transcripcion in vitro. Para estas realizaciones, puede utilizarse el extremo N terminal presente de forma natural. Un ejemplo de un analogo de la compstatina adecuado para la expresion in vitro o in vivo viene representado por la ID DE SECUENCIA N°: 15-17, en la que el grupo acetilo es sustituido por una glicina no modificada en el extremo N terminal. Las ID DE SECUENCIA N°: 15-17, que ademas comprenden modificaciones dentro de los peptidos y en los extremos C terminales como se dice a continuacion, son aproximadamente entre 45 y 125 veces mas activas que la compstatina en el ensayo de inhibicion del complemento que se describe en el presente documento.

Modificacion dentro del peptido. Utilizando metodos computacionales que clasifican las secuencias de baja energfa, se ha determinado previamente que Tyr y Val eran los candidatos mas probables en la posicion 4 para proporcionar estabilidad y actividad del peptido (Klepeis JL et al., 2003). Se revelo en WO2004/026328 que Trp en la posicion 4, en especial combinado con Ala en la posicion 9, produce una actividad muchas veces mayor que la del peptido precursor (por ejemplo, comparense las actividades de las ID DE SECUENCIA N°: 4, 5 y 6 con las de las Id DE SECUENCIA N°: 2 y 3). WO2004/026326 tambien revelo que se descubrio que todos los peptidos que comprendfan los analogos de triptofano 2-naftilalanina (ID DE SECUENCIA N°: 7, 8), 1-naftilalanina (ID DE SECUENCIA N°: 9), 2-indanilglicina (ID DE SECUENCIA N°: 10, 11) o dihidrotriptofano (ID DE SECUENCIA N°: 12) en la posicion 4, posefan una actividad inhibidora del complemento incrementada, que era entre 5 veces y 99 veces mayor que la compstatina. Ademas, un peptido que comprendfa el analogo de fenilalanina, 4-benzoil-L-alanina, en la posicion 4 (ID DE SECUENCIA N°: 13) posefa una actividad 49 veces mayor que la de la compstatina.

De conformidad con la presente invencion, los peptidos que comprenden 5-fluoro-/-triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 19) o 5-metoxi-, 5-metil- o 1-metil-triptofano, o 1-formil-triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 21, 22, 23 y 25, respectivamente) en la posicion 4 poseen una actividad 31-264 veces mayor que la de la compstatina. La incorporacion de 1-metil- o 1-formil-triptofano incremento sobre todo la actividad y la afinidad de union en comparacion con otros analogos. Se cree que un enlace de hidrogeno con mediacion de un 'N' de indol no es necesario en la posicion 4 para la union y actividad de la compstatina. La ausencia de este enlace de hidrogeno o la reduccion del caracter polar al sustituir el hidrogeno por metilo o alcanoilo inferior en el nitrogeno del indol en la posicion 4 aumenta la union y actividad de la compstatina. Sin pretender estar limitado por ninguna teona o mecanismo de accion concretos, se cree que una interaccion o efecto hidrofobos en la posicion 4 fortalece la interaccion de la compstatina con C3. De acuerdo con esto, en la presente invencion se contemplan las modificaciones del Trp en la posicion 4 (p. ej., alterar la estructura de la cadena lateral segun metodos bien conocidos en la tecnica), o sustituciones de analogos de Trp que mantienen o aumentan la anteriormente mencionada interaccion hidrofoba para producir analogos de la compstatina con una actividad incluso mayor. Dichos analogos son bien conocidos en la tecnica e incluyen, pero sin limitarse a ellos, los analogos ejemplificados en el presente documento, asf como derivados de los mismos no sustituidos o sustituidos de forma alternativa. Pueden encontrarse ejemplos de analogos adecuados consultando las siguientes publicaciones y muchas otras: Beene, et al. (2002) Biochemistry 41: 10262-10269 (que describe, entre otros, analogos de Trp halogenados individualmente o multitudinariamente); Babitzky y Yanofsky (1995) J. Biol. Chem. 270: 12452-12456 (que describen, entre otros, Trp metilado y halogenado y otros analogos de Trp y de indol); y las patentes estadounidenses 6.214.790, 6.169.057, 5.776.970, 4.870.097, 4.576.750 y 4.299.838. Los analogos de Trp pueden

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introducirse en el peptido compstatina mediante expresion in vitro o in vivo, o mediante smtesis peptidica, tal y como se conoce en la tecnica y se describe con mayor detalle en los ejemplos.

En ciertas realizaciones, Trp en la posicion 4 de la compstatina esta sustituido con un analogo que comprende un 1-alquilo sustituyente, mas particualrmente un sustituyente alquilo inferior (por ejemplo, C1-C5) como se define anteriormente. Estos incluyen, pero no estan limitados a, N(a)metiltriptofano y 5-metiltriptofano. En otras realizaciones, Trp en la posicion 4 de la compstatina esta sustituido con un analogo que comprende un sustituyente 1-alcanoilo, mas particularmente un sustituyente alcanoilo inferior (por ejemplo, C1-C5) como se ha definido anteriormente. Ademas de los analogos ejemplificados, estos incluyen, pero no se limitan 1-acetil-L-triptofano y L- p-homotriptofano.

Experimentos termodinamicos mostraron que la incorporacion de 5-fluoro-/-triptofano en la posicion 7 de la compstatina incrementaba la entalpia de la interaccion entre la compstatina y C3, refiriendose a la compstatina de tipo salvaje, mientras que la incorporacion de 5-fluoro-triptofano en la posicion 4 de la compstatina disminrna la entalpia de esta interaccion. Sin pretender estar vinculados a ningun mecanismo concreto, los resultados anteriores indican que la sustitucion de hidrogenos del indol por un atomo de fluor en un residuo de Trp en la posicion 7 de la compstatina puede fortalecer el potencial de enlace de hidrogeno del anillo de indol, crear un nuevo potencial de enlace de hidrogeno, o mediar en una interaccion con C3 a traves de una molecula de agua en la interfaz de union. (Katragadda M et al., 2004). Por lo tanto, se contemplan en la presente invencion las modificaciones de Trp en la posicion 7 (por ejemplo, alterar la estructura de la cadena lateral de conformidad con metodos bien conocidos en la tecnica), o las sustituciones de analogos de Trp que mantienen o aumentan el anteriormente mencionado potencial de enlace de hidrogeno, o median en una interaccion con C3 a traves de una molecula de agua en la interfaz de union, para producir analogos con una actividad incluso mayor. En ciertas realizaciones, los analogos de Trp cuyos anillos de indol poseen modificaciones que dan por resultado un potencial incrementado de enlace de hidrogeno o que median en una interaccion con C3 a traves de una molecula de agua en la interfaz de union pueden introducirse en la posicion 7 del peptido compstatina mediante expresion in vitro o in vivo, o mediante smtesis peptfdica. Se descubrio que un peptido que comprendfa el analogo de triptofano 5-fluoro-triptofano (ID DE SECUENClA N°: 19) en la posicion 7 posefa una actividad 121 veces mayor en comparacion con la de la compstatina.

En otra realizacion, se incorporan analogos de Trp tanto en la posicion 4 como en la 7 de la molecula de compstatina, e His en la posicion 9 de la compstatina es sustituido de forma opcional por Ala. Experimentos termodinamicos mostraron que la incorporacion de 5-fluoro-triptofano en las posiciones 4 y 7 de la compstatina incrementaba la entalpia de la interaccion entre la compstatina y C3, refiriendose a la compstatina de tipo salvaje. En consecuencia, se contemplan en la presente invencion las modificaciones de Trp en las posiciones 4 y 7 (por ejemplo, alterar la estructura de la cadena lateral de conformidad con metodos bien conocidos en la tecnica), o las sustituciones de analogos de Trp que mantienen o aumentan la anteriormente mencionada interaccion hidrofoba con C3 a traves de la posicion 4 y mantienen o aumentan el anteriormente mencionado potencial del enlace de hidrogeno con C3 a traves de la posicion 7, o la interaccion con C3 a traves de una molecula de agua en la interfaz de union a traves de la posicion 7, para producir analogos de la compstatina con una actividad incluso mayor. Dicho Trp modificado o analogos de Trp pueden introducirse en el peptido compstatina en las posiciones 4 y 7 mediante expresion in vitro o in vivo, o mediante smtesis peptfdica. Se descubrio que los peptidos que comprendfan los analogos de triptofano 5-fluoro-triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 16) y que comprendfan los analogos de triptofano 6-fluoro-triptofano (ID DE SECUENCIA N°: 17) en las posiciones 4 y 7 posefan una actividad significativamente mayor que la compstatina, una actividad de 112 a 264 veces mayor. Ademas, se descubrio que los peptidos que comprendfan el analogo de triptofano 1-metil-triptofano en la posicion 4 y 5-fluoro-triptofano en la posicion 7 (ID DE SECUENCIA N°: 24) posefan una actividad 264 veces mayor en comparacion con la compstatina.

Modificaciones en el extremo carboxi terminal. Los peptidos producidos mediante metodos sinteticos normalmente se modifican en el extremo carboxi terminal para comprender una amida en vez de un acido; esta modificacion frecuente se puede ver en la Tabla 1 en la compstatina (ID DE SECUENCIA N°: 1) y en varios analogos. De hecho, en algunos casos, se ha determinado que los peptidos que contienen amida terminal poseen mayor actividad que los peptidos que contienen acido terminal (comparese, por ejemplo, las ID DE SECUENCIA N°: 5 y 7 con las ID DE SECUENCIA N°: 4 y 8, respectivamente). En consecuencia, una realizacion preferente de la invencion utiliza la modificacion amida C-terminal. Sin embargo, algunas circunstancias favorecen el uso de un acido en el extremo C-terminal. Dichas circunstancias incluyen, pero no se limitan a ello, consideraciones de solubilidad y la expresion de los peptidos in vitro o in vivo a partir de moleculas de acido nucleico de codificacion peptfdica.

El residuo carboxi terminal de la compstatina es la treonina. En algunas realizaciones de la presente invencion, la treonina C-terminal es sustituida por uno o mas aminoacidos presentes de forma natural o analogos. Por ejemplo, el peptido que tiene la ID DE SECUENCIA N°: 6 comprende D-treonina en vez de L-treonina, y ademas posee un grupo COOH en el extremo C-terminal. Este peptido muestra una actividad igual a la del peptido de ID dE SECUENCIA N°: 5, que comprende L-treonina y C0NH2 en el extremo C-terminal. Mas aun, Ile ha sido sustituido por Thr en la posicion 13, para obtener un peptido con una actividad 21 veces mayor que la de la compstatina. Ademas, los peptidos de las ID DE SECUENCIA N°: 14-17, que comprenden una extension peptfdica

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C-terminal de Asn, o una extension dipeptfdica de Ala-Asn, junto con un COOH en el extremo C-terminal y un extremo N-terminal no acetilado, demuestra una actividad entre 38 y 126 veces mayor que la de la compstatina. Tambien son adecuados para la produccion mediante un sistema de expresion procariotica o eucariotica, tal y como se describe con mayor detalle a continuacion.

Los analogos de la compstatina de la presente invencion pueden elaborarse mediante varios metodos sinteticos de smtesis peptidica a traves de la condensacion de uno o mas residuos de aminoacidos, de conformidad con los metodos convencionales de smtesis peptidica. Por ejemplo, los peptidos se sintetizan de conformidad con metodologfas estandar de fase solida, tales como las que pueden realizarse en un sintetizador peptfdico Applied Biosystems Modelo 431A (Applied Biosystems, Foster City, California), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Otros metodos de sintetizar peptidos o peptidomimeticos, bien mediante metodologfas de fase solida o en fase lfquida, son bien conocidos para los expertos en la tecnica. Durante el curso de la smtesis peptfdica, pueden protegerse/desprotegerse los grupos carboxilo y amino de cadena ramificada segun sea necesario utilizando grupos protectores bien conocidos. Un ejemplo de un metodo de smtesis peptfdica adecuado se expone en el Ejemplo 3. La modificacion utilizando grupos protectores alternativos para peptidos y derivados peptfdicos sera evidente para los expertos en la tecnica.

De forma alternativa, ciertos peptidos de la invencion pueden elaborarse mediante expresion en un sistema procariotico o eucariotico adecuado. Por ejemplo, una construccion de ADN puede insertarse en un vector plasmfdico adaptado para la expresion en una celula bacteriana (tal como la E. coli) o una celula de la levadura (tal como la Saccharomyces cerevisiae), o en un vector baculovirus para la expresion en una celula de insecto o un vector viral para la expresion en una celula de mairnfero. Dichos vectores comprenden los elementos reguladores necesarios para la expresion del ADN en la celula huesped, colocados de tal manera que permitan la expresion del ADN en la celula huesped. Dichos elementos reguladores requeridos para la expresion incluyen secuencias promotoras, secuencias de inicio de transcripcion y, de forma opcional, secuencias potenciadoras.

Los peptidos de las ID DE SECUENCIA N°: 14-17, y otros disenados de modo similar, son adecuados para la produccion mediante la expresion de una molecula de acido nucleico in vitro o in vivo. Una construccion de ADN que codifica un concatemero de los peptidos, dependiendo el lfmite superior del concatemero en el sistema de expresion utilizado, puede introducirse en un sistema de expresion in vivo. Una vez que se ha producido el concatemero, se consigue la division entre el Asn C-terminal y la siguiente G N-terminal mediante la exposicion del polipeptido a la hidracina.

Los peptidos producidos mediante expresion genica en un sistema procariotico o eucariotico recombinante se pueden purificar de conformidad con metodos conocidos en la tecnica. Los ejemplos 1 y 2 exponen metodos adecuados para usar en la presente invencion. En una realizacion, puede utilizarse un sistema de expresion/secrecion disponible comercialmente, mediante el que se expresa el peptido recombinante y despues se secreta de la celula huesped, para ser purificado facilmente del medio que le rodea.

Tambien puede utilizarse una combinacion de expresion genica y metodos sinteticos para producir analogos de la compstatina. Por ejemplo, puede producirse un analogo mediante expresion genica y despues someterlo a uno o mas procesos sinteticos post-traslacionales, por ejemplo, para modificar el extremo N o C- terminal o para ciclizar la molecula.

La estructura de la compstatina es conocida en la tecnica y las estructuras de los analogos anteriores se determinan mediante medios similares. Una vez que se ha establecido una conformacion espedfica deseada de un peptido corto, hay metodos conocidos en la tecnica para disenar un peptido o peptidomimetico que se adapte a dicha conformacion. Veanse, por ejemplo, G.R. Marshall (1993), Tetrahedron, 49: 3547-3558; Hruby y Nikiforovich (1991), en Molecular Conformation and Biological Interactions, P. Balaram y S. Ramasehan, eds., Indian Acad. of Sci., Bangalore, pp. 429-455. De especial relevancia para la presente invencion, el diseno de analogos peptfdicos puede perfeccionarse aun mas considerando la contribucion de diversas cadenas laterales de residuos de aminoacidos, tal y como se habfa dicho anteriormente (esto es, para el efecto de los grupos funcionales o para consideraciones estericas).

Los expertos en la tecnica comprenderan que un mimetico peptfdico puede servir igual de bien que un peptido a efectos de proporcionar la conformacion estructural espedfica y las funcionalidades de la cadena lateral necesarias para unirse a C3 y para inhibir la activacion del complemento. En consecuencia, se contempla como dentro del alcance de la presente invencion el producir compuestos inhibidores del complemento y de union a C3 mediante el uso de o bien aminoacidos presentes de forma natural, derivados de aminoacidos, analogos o moleculas no aminoaddicas capaces de unirse para formar la conformacion estructural apropiada. Un analogo no peptfdico, o un analogo que comprende componentes peptfdicos y no peptfdicos, en ocasiones se denomina en el presente documento “peptidomimetico” o “mimetico isosterico”, para designar sustituciones o derivaciones de los peptidos de la invencion, que poseen las mismas caractensticas conformacionales estructurales y/u otras funcionalidades, de modo que sea suficientemente similar a los peptidos de ejemplo para inhibir la activacion del complemento.

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El uso de peptidomimeticos para el desarrollo de analogos peptidicos de alta afinidad es bien conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, Zhao B et al., 1995; Beeley, N. 1994; y, Hruby, VJ 1993). Suponiendo restricciones rotacionales similares a las de los residuos de aminoacidos dentro de un peptido, se pueden analizar los analogos que comprenden partes de moleculas no aminoaddicas y pueden verificarse sus motivos conformacionales, mediante, entre otras tecnicas conocidas, el grafico de Ramachandran (Hruby y Nikiforovich 1991).

Los analogos de la comsptatina de la presente invencion pueden modificarse mediante la adicion de componentes de polietilenglicol (PEG) al peptido. Tal y como se conoce bien en la tecnica, la PEGilacion puede incrementar la vida media de las protemas y peptidos terapeuticos in vivo. En una realizacion, el PEG posee un peso molecular medio de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 50.000. En otra realizacion, el PEG posee un peso molecular medio de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 20.000. En otra realizacion, el PEG posee un peso molecular medio de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000. En una realizacion ejemplo, el PEG posee un peso molecular medio de aproximadamente 5.000. El polietilenglicol puede ser una cadena ramificada o lineal, y preferentemente es una cadena lineal.

Los analogos de la compstatina de la presente invencion pueden unirse de forma covalente a PEG mediante un grupo de enlace. Dichos metodos son bien conocidos en la tecnica. (Revisados en Kozlowski A. et al. 2001; vease tambien, Harris JM y Zalipsky S, eds. Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680 (1997)). Entre los ejemplos no restrictivos de grupos de union aceptables se incluyen un grupo ester, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un carbohidrato, un grupo succinimida (incluyendo, sin limitarse a ello, succinato de succinimidilo (SS), propionato de succinimidilo (SPA), carboximetilato de succinimidilo (SCM), succinimida de succinimidilo (SSA) y N- hidroxisuccinimida (NHS)), un grupo epoxido, un grupo oxicarbonilimidazol (incluyendo, pero sin limitarse a ello, carbonilimidazol (CDI)), un grupo nitrofenilo (incluyendo, pero sin limitarse a ello, nitrofenil carbonato (NPC) o triclorofenil carbonato (TPC)), un grupo trisilato, un grupo aldelddo, un grupo isocianato, un grupo vinilsulfona, un grupo tirosina, un grupo cistema, un grupo histidina o una amina primaria. En ciertas realizaciones, el grupo de union es un grupo succinimida. En una realizacion, el grupo de union es NHS.

Los analogos de la comsptatina de la presente invencion pueden acoplarse de forma alternativa directamente al PEG (esto es, sin grupo de union) a traves de un grupo amino, un grupo sulfhidrilo o un grupo carboxilo. En una realizacion, el PEG se acopla a un residuo de lisina anadido al extremo C-terminal de la compstatina.

La PEGilacion es una manera de incrementar la retencion in vivo de las protemas y peptidos terapeuticos. La depuracion in vivo de peptidos puede tambien reducirse uniendo los peptidos a ciertos otros peptidos. Por ejemplo, ciertos peptidos de union a albumina muestran una vida media inusualmente larga de 2,3 horas cuando son inyectados mediante bolo intravenoso a conejos (Dennis et al., 2002). Un peptido de este tipo, fusionado con el factor antitisular Fab de D3H44, permitio que Fab se uniese a la albumina a la vez que retema la capacidad de Fab para unirse al factor tisular (Nguyen et al., 2006). Esta interaccion con la albumina dio por resultado una depuracion in vivo significativamente reducida y una vida media extendida en los ratones y conejos, en comparacion con el Fab de D3H44 de tipo salvaje, comparable con lo observado para las moleculas de Fab PEGiladas, las inmunoadhesinas y fusiones de albumina. Tal y como se describe en el Ejemplo 11 del presente documento, los inventores han sintetizado un analogo de la compstatina fusionado con un peptido de union a albumina y han demostrado que la protema de fusion esta activa a la hora de inhibir la activacion del complemento.

La actividad de inhibicion de la activacion del complemento de los analogos de la compstatina, los peptidomimeticos y conjugados puede analizarse mediante una diversidad de ensayos conocidos en la tecnica. En una realizacion preferente, se utiliza el ensayo descrito en el Ejemplo 4. Se expone un listado no exhaustivo de otros ensayos en la patente estadounidense 6.319.897, incluyendo, pero sin limitarse a ello, (1) la union del peptido a C3 y a fragmentos de C3; (2) diferentes ensayos hemolfticos; (3) medicion de la division de C3 mediada por la convertasa de C3; y (4) medicion de la division del Factor B mediante el Factor D.

Los peptidos y peptidomimeticos descritos en el presente documento son de utilidad practica para cualquier fin para el que se use la compstatina misma, tal y como se conoce en la tecnica. Entre tales usos estan incluidos, aunque no se limitan a ello: (1) inhibicion de la activacion del complemento en el suero, tejidos u organos de un paciente (humano o animal), lo que puede facilitar el tratamiento de ciertas enfermedades o condiciones, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la degeneracion macular asociada a la edad, la artritis reumatoide, la lesion de la medula espinal, la enfermedad de Parkinson, y la enfermedad de Alzheimer; (2) inhibicion de la activacion del complemento que se produce durante el uso de implantes u organos artificiales (por ejemplo, recubriendo o tratando de otro modo el implante u organo artificial con un peptido de la invencion); (3) inhibicion de la activacion del complemento que se produce durante la circulacion extracorporea de fluidos fisiologicos (sangre, orina) (por ejemplo, recubriendo los tubos a traves de los que se hacen circular los fluidos con un peptido de la invencion); y (4) en la criba de bibliotecas de moleculas pequenas para identificar a otros inhibidores de la activacion de la compstatina (por ejemplo, ensayos de alto rendimiento de fase lfquida o solida disenados para medir la capacidad

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de un compuesto de prueba para competir con un analogo de la compstatina para unirse con C3 o un fragmento de C3).

Los ejemplos siguientes se proporcionan para describir la invencion con mayor detalle. Tienen la intencion de ilustrar, pero no restringir, la invencion. Los materiales y metodos expuestos en los Ejemplos 1-5 fueron utilizados para generar los resultados descritos en los Ejemplos 6-11.

EJEMPLO 1

Expresion bacteriana de la compstatina

Se expreso un analogo de la compstatina con la secuencia siguiente, NH2-GICVWQDWGAHRCTN-OH ("G(-1)/V4W/H9A/N14”) (ID DE SECUENCIA N°: 15) en fusion con un dominio de union a quitina y la interna DnaB (New England Biolabs, Beverly, MA). Guiado por la secuencia peptfdica y el uso de codones para E. coli, se utilizo el siguiente codigo genetico para generar un gen sintetico para este peptido con la secuencia siguiente:

5'ATTTGCGTTTGGCAGGATTGGGGTGCGCACCGTTGCACCAATTAA3' (ID DE SECUENCIA N°: 29)

Para clonar el gen sintetico en el vector pGEM-T, se disenaron una region de flanqueo 5' que contema un sitio Sapl y una region de flanqueo 3' que contema un sitio Pstl. Para construir el gen sintetico, se disenaron los cuatro oligonucleotidos superpuestos que se muestran a continuacion utilizando el software DnaWorks y se sintetizaron en Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA):

5'GGTGGTGCTCTTCCAACGGTATTTGCGTTTGGCAGGA3' (ID DE SECUENCIA N°: 30)

5'TTGGGGTGCGCACCGTTGCACCAATTAACTGCAGG3' (ID DE SECUENCIA N°: 31)

3'CAACGTGGTTAATTGACGTCCGC5' (ID DE SECUENCIA N°: 32)

3'CATAAACGCAAACCGTCCTAACCCCACGCGTGG5' (ID DE SECUENCIA N°: 33)

Los fragmentos de ADN superpuestos fueron ensamblados mediante PCR tal y como lo describe Stemmer et al., 1995. El gen resultante fue amplificado utilizando los cebos siguientes:

5'CGCCTGCAGTTAATTGGT3' (ID DE SECUENCIA N°: 34)

5'GGTGGTGCTCTTCCAACG3' (ID DE SECUENCIA N°: 35)

Los fragmentos amplificados por PCR de la compstatina fueron entonces clonados en el vector pGEM-T, y el clon resultante fue digerido con Pstl y Sapl. El fragmento Pstl-Sapl que codificaba el analogo de la compstatina fue subclonado de forma adicional en el vector de expresion pTWIN1, que habfa sido predigerido con Pstl y Sapl; la secuencia del clon fue verificada secuenciando el ADN.

Para expresar el analogo de la compstatina, se cultivaron celulas ER2566 E. coli transformadas con el clon de compstatina en un medio SOB (20 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 0,5 g/L de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCh) a 37° C. Cuando se alcanzo OD600 de 0,7, se indujo la expresion mediante la adicion de IPTG a una concentracion final de 0,3 mM, seguido por una incubacion adicional a 37° C durante 4 horas. Se recogieron las celulas mediante centrifugacion y se sometieron a lisis mediante sonicacion en un tampon B1 (20 mM de tampon de fosfato, pH de 8,5, con 500 mM de NaCl y 1 mM de EDTA) suplementado con 0,2% de Tween-20. El extracto celular fue centrifugado, y la fraccion soluble fue aplicada a una columna de union a quitina (New England Biolabs, Beverly, MA) pre-equilibrada con un tampon B1. La columna se lavo con 100 ml de tampon B1, seguido por un lavado rapido con 3 volumenes de columna del tampon B2 (50 mM de acetato de amonio, pH de 7,0). La columna fue incubada a temperatura ambiente durante 20 horas, y el peptido fue elrndo con un tampon B2, liofilizado y purificado aun mas en una columna C18 de CLAP. El peptido purificado fue identificado utilizando espectrometna de masas MALDI-TOF.

EJEMPLO 2

Expresion de analogos del triptofano de la compstatina en E. coli

Para expresar los analogos de la compstatina que conteman derivados del triptofano, el clon de la compstatina pTWIN1 fue transformado en el auxotrofo ER2566 Trp 82. La expresion se llevo a cabo en un medio mmimo M9 suplementado con 1 mM de L-triptofano tal y como se ha descrito anteriormente. Las celulas fueron cultivadas en OD600 de 0,8-1,0, despues se recogieron mediante centrifugacion y se resuspendieron en un medio mmimo fresco que contema 2 mM del/de los analogo(s) del triptofano deseado(s): 5-fluoro-triptofano, 6-fluoro- triptofano, 7-aza-triptofano o 5-hidroxi-triptofano. Los analogos de la compstatina expresados fueron purificados de forma adicional tal y como se describe en el Ejemplo 1.

EJEMPLO 3

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Smtesis peptidica

La smtesis y la purificacion peptidicas se llevaron a cabo tal y como describen Sahu et al., 1996; Sahu et al., 2000; y Mallik et al., 2005. En resumen, los peptidos fueron sintetizados en un sintetizador peptidico de Applied Biosystem (modelo 431A) utilizando grupos protectores de cadena lateral estandar y una resina de Fmoc amida. Los peptidos se separaron de la resina mediante incubacion durante 3 horas a 22° C con una mezcla de solventes que contema fenol al 5%, tioanisol al 5%, agua al 5%, etanoditiol al 2,5% y acido trifluoroacetico (TFA) al 82,5%. La mezcla de la reaccion se filtro a traves de un embudo fritado, se precipito con eter frio, se disolvio en acetonitrilo al 50% que contema TFA al 0,1% y se liofilizo.

Los peptidos en bruto obtenidos tras la division se disolvieron en acetonitrilo al 10% que contema TFA al 0,1% y se purificaron utilizando una columna C-18 de fase inversa (Waters, Milford, MA). Se consiguio la oxidacion disulfurica mediante un metodo de ciclizacion sobre resina utilizando el reactivo trifluoroacetato de talio (III). Este metodo elimina los pasos de oxidacion en solucion dilrnda y la posterior concentracion que requiere mucho tiempo a traves de los pasos de liofilizacion antes de la CLAP de fase inversa. Utilizando este metodo, no se produjo la formacion de multimero y se obtuvo un nivel elevado (~ 90%) de material ciclizado, oxidado o completamente desprotegido. La identidad y la pureza de todos los peptidos fueron confirmadas mediante espectroscopia de masas por desorcion laser y CLAP.

Para la smtesis de los analogos 5-fluoro-triptofano, 1-metil-triptofano y 5-metil-triptofano, se utilizaron derivados de Fmoc-dl. La separacion de los peptidos enantiomericos se llevo a cabo tal y como lo describen Meyers et al., 1978. La mezcla de dl de cada peptido fue separada en peptidos isomericos l y d sobre una columna C18 de CLAP de fase inversa utilizando acetonitrilo al 10% en 0,01 M de acetato de amonio, pH de 4,1. La identidad isomerica de los peptidos elrndos fue determinada tratando los peptidos con proteasa V8, seguido de un analisis utilizando espectrometria de masas MALDI-TOF (MicroMass TOFspec2E).

EJEMPLO 4

Ensayos de inhibicion del complemento

La actividad inhibidora de la compstatina y sus analogos sobre el sistema del complemento fue determinada midiendo su efecto sobre la activacion del sistema del complemento mediante inmunocomplejos. La inhibicion de la activacion del complemento fue evaluada midiendo la inhibicion de la fijacion de C3 a los complejos de ovoalbumina-anti-ovoalbumina en plasma humano normal. Los pocillos de microtitulacion fueron recubiertos con 50 |jl de ovoalbumina (10 mg/ml) durante 2 horas a 25° C (durante la noche a 4° C). Los pocillos fueron saturados con 200 jl de BSA a 10 mg/ml durante 1 hora a 25° C y, despues, se anadio un anticuerpo anti-ovoalbumina de conejo para formar un inmunocomplejo mediante el que podfa activarse el complemento. A cada pocillo se anadieron directamente treinta microlitros de peptidos a diferentes concentraciones, seguido de 30 jl de una dilucion 1:80 de plasma humano. Tras 30 minutos de incubacion, se detecto el C3b/iC3b unido utilizando un anticuerpo conjugado con HRP anti-C3 humano de cabra. Se desarrollo el color anadiendo sustrato de ABTS peroxidada y se midio la densidad optica a 405 nm.

Los datos de absorbencia obtenidos a 405 nm fueron expresados en % de inhibicion basada en la absorbencia correspondiente al 100% de la activacion del complemento. El % de inhibicion fue determinado contra la concentracion peptidica, y el conjunto de datos resultante se ajusto a la funcion logfstica dosis-respuesta utilizando el software Origin 7.0. La concentracion del peptido que provoca una inhibicion del 50% de la deposicion de C3b/iC3b se tomo como la IC50 y se utilizo para comparar las actividades de diferentes peptidos. Los valores de IC50 fueron obtenidos a partir de los parametros fijados que habfan conseguido el valor mas bajo de chi-cuadrado.

EJEMPLO 5

Analisis de calorimetria de titulacion isotermica de la interaccion de C3 con la compstatina y sus analogos

Se llevaron a cabo experimentos de calorimetna de titulacion isotermica utilizando el calonmetro Microcal VP-ITC (Microcal Inc, Northampton, MA). Se utilizaron concentraciones protemicas de 3,5-5 jM y concentraciones peptidicas de 80-200 jM para estos experimentos. Todas las titulaciones se llevaron a cabo en PBS (10 mM de tampon de fosfato con 150 mM de NaCl, pH de 7,4). En cada experimento, la protema objetivo, C3, se cargo en la celula, y se cargo un peptido en la jeringa. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25° C y para cada experimento, se hicieron inyecciones de 2 jl de peptidos en la celula que contema la protema. En cada experimento, se corrigieron las isotermas en bruto con respecto a los calores de la dilucion sustrayendo las isotermas que representaban las inyecciones peptidicas en el tampon. Las isotermas resultantes se ajustaron a diferentes modelos dentro del software Origin 7.0, y el modelo que consiguio el valor mas bajo de chi-cuadrado se considero el adecuado para el conjunto de datos correspondiente. Los valores de la entropfa y afinidad de union fueron calculados contra los valores de log P.

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EJEMPLO 6

Papel del triptofano en la interaccion de C3-compstatina segun lo establecido por los analogos de la compstatina con expresion bacteriana

Se incorporaron a la compstatina cuatro analogos del triptofano diferentes que difieren en la naturaleza qmmica del anillo de indol utilizando un sistema de expresion de la protema con mediacion de la interna. Despues de la expresion, los peptidos fueron purificados en un unico paso con un rendimiento final de 2 mg/L de cultivo. Los analogos del triptofano 5-fluoro-triptofano, 6-fluoro-triptofano, 7-aza-triptofano y 5-hidroxi-triptofano tambien fueron expresados utilizando el auxotrofo ER2566/Trp 82 como lo indican los perfiles MALDI, y los peptidos resultantes fueron purificados para alcanzar la homogeneidad. La compstatina nativa y los analogos fueron ciclizados in vivo a traves de un enlace disulffdico, tal y como queda evidenciado por su incapacidad para reaccionar con PHMB. Todos los peptidos fueron purificados de forma adicional sobre una columna Cl8 de CLAP de fase inversa .

La actividad del analogo de la compstatina expresado G(-1)N4W/H9A/N14 (ID DE SECUENCIA N°: 15) mostro una IC50 de 1,2 jM, que es similar a la actividad observada para el analogo de Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5). Este resultado indica que la glicina ubicada en el extremo N-terminal del peptido expresado juega un papel similar al del grupo acetilo ubicado en el extremo N-terminal del analogo de Ac-V4W/H9A.

Todos los analogos expresados de la compstatina excepto el analogo 7-aza-triptofano se vio que estaban activos en las concentraciones analizadas. Sin embargo, el peptido mostraba diferentes niveles de actividad con respecto al analogo de Ac-V4W/H9A (Figura 1; Tabla 2). La compstatina que contema 6-fluoro-triptofano y 5-fluoro- triptofano asf como alanina en la posicion 9 mostro una actividad 2,8 y 2,5 veces mayor, respectivamente, que la del analogo de Ac-V4W/H9A.

Tabla 2. Actividad de inhibicion del complemento de los peptidos expresados

Peptido expresado

ID DE SECUENCIA N°: IC50 (JM) Actividad relativa*

Ac-V4W/H9Ab

5 1,2 45

G(-1)/V4W/H9A/N14

15 1,2 45

G(-1)/V4(5fW)/W7(5fW)/H9A/N14

16 0,48 112

G(-1)/V4(6fW)/W7(6fW)/H9A/N14

17 0,43 126

G(-1yV4(5-OHa-WyW7(5-OH-W)/H9A/N14

27 33 1,6

G(-1)/V4(7-aza-W)/W7(7-aza-W)/H9A/N14

28 122 0,44

*relativa a la actividad del peptido H-I(CVVQDWGHHRC)T-NH (compstatina, ID DE SECUENCIA N°: 1) c representa el hidroxi b peptido sintetico

Sin estar restringido a ningun mecanismo en concreto, se cree que anadir un atomo de fluor incrementa la actividad del peptido aumentando la hidrofobicidad del anillo de indol. Tambien se investigo la incorporacion de los analogos del triptofano menos hidrofobos 5-hidroxi-triptofano y 7-aza-triptofano. En contraste con los resultados con los analogos 5-fluoro y 6-fluoro, los analogos de la compstatina que conteman 5-hidroxi-triptofano mostraron una perdida 27,5 veces mayor en la actividad en comparacion con el analogo de Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5), y el peptido que contema 7-aza-triptofano no mostro ninguna actividad en las concentraciones analizadas. 7-aza- triptofano se parece al triptofano de la estructura molecular excepto en que posee un atomo de nitrogeno en la posicion 7 del anillo de indol en vez de un atomo de carbono. La perdida de actividad observada en la sustitucion de 7-aza-triptofano muestra la importancia relativa de este atomo de carbono.

EJEMPLO 7

Papel de los triptofanos individuales en la interaccion de C3-compstatina

Se utilizo la smtesis peptfdica en fase solida para generar analogos de la compstatina con 5-fluoro- triptofano incorporado de forma selectiva en la posicion 4, la posicion 7, o en ambas posiciones 4 y 7, con alanina en la posicion 9. La smtesis se llevo a cabo utilizando Fmoc-5-fluoro-d/-triptofano. Esta reaccion produjo una mezcla enantiomerica de los peptidos que portaban 5-fluoro-d-triptofano y 5-fluoro-/-triptofano. Se sintetizaron tres peptidos diferentes: dos peptidos con una unica sustitucion independientemente en la posicion 4 o 7 y un peptido con sustituciones en ambas posiciones 4 y 7. Mientras que una mezcla de analogos 5-fluoro-/-triptofano y 5-fluoro-d- triptofano podna producirse en el caso de la sustitucion unica, una mezcla de cuatro combinaciones enantiomericas era posible en el caso de la doble sustitucion. Cada una de las mezclas peptfdicas fue sometida ademas a CLAP de fase inversa para separar los enantiomeros peptfdicos. La identificacion de los enantiomeros se llevo a cabo digiriendo los peptidos con proteasa V8 y posteriormente analizando el producto digerido utilizando MALDI. La proteasa V8 se divide en el extremo C-terminal de los residuos de Asp solamente cuando le sigue un /-aminoacido.

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La identificacion de los productos de la division en los espectros de masa indico que el peptido /-enantiomerico se elma primero seguido por la forma d, donde no se detectaba ningun fragmento de la division.

Todos los peptidos, que conteman o bien 5-fluoro-/-triptefano o 5-fluoro-d-triptofano o ambos, fueron analizados para ver su actividad inhibidora del complemented El peptido sintetico sustituido por 5-fluoro-/-triptefano en ambas posiciones mostro una actividad 2,5 veces mayor que la de Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5) (Tabla 3).

Tabla 3. Actividad inhibidora del complemento de los analogos sinteticos de la compstatina que contienen 5-

fluoro-1-triptofano

Peptido

ID DE SECUENCIA N°: ICS0(uM) Actividad relativa*

Ac-V4W/H9A

5 1,20 45

Ac-V4(5f-/-W)/H9A

18 1,74 31

Ac-V4W/W7(5f-/-W)/H9A

19 0,446 121

Ac-V4(5f-/-W)/W7(5f-/- W)/H9A

20 0,482 112

*relativa a la actividad del peptido H-I(CVVQDWGHHRC)T-NH (compstatina, ID DE SECUENCIA N°: 1)

Los ensayos de inhibicion del complemento (Figura 2; Tabla 3) indicaron que (a) la sustitucion de 5-fluoro-/- triptofano solo en la posicion 4 hizo que el peptido fuera al menos 1,5 veces menos activo que Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5). La sustitucion de 5-fluoro-/-triptofano solo en la posicion 7 incremento la actividad 2,7 veces en comparacion con Ac-V4W/H9A. La sustitucion de 5-fluoro-/-triptefano a la vez en las posiciones 4 y 7 tambien produjo un incremento en la actividad de 2,5 veces con referencia a Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5). La sustitucion de 5-fluoro-d-triptofano en la posicion 4 o 7, o en ambas, hizo que el peptido estuviera inactivo.

EJEMPLO 8

Base termodinamica para el reconocimiento de la compstatina por parte de C3 con mediacion del triptofano

Se utilizo calorimetna de titulacion isotermica para examinar la union de los peptidos a C3 e investigar la base termodinamica de sus actividades. Los datos calorimetricos obtenidos para la interaccion de todos los peptidos con C3 se ajustan al modelo de un “conjunto de sitios” con una estequiometna de cerca de 1. Se cree que la union de estos peptidos a C3 se produce en una proporcion de 1:1. Los parametros termodinamicos resultantes de estos ajustes se muestran en la Tabla 4. Como resulta evidente a partir de los valores Kd, el peptido con una unica sustitucion de 5-fluoro-/-triptofano en la posicion 7 y una doble sustitucion en las posiciones 4 y 7 mostro una union mas estrecha que los analogos de Ac-V4W/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 5) y Ac-V4(5f-/-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 18). Este resultado esta conforme con las actividades relativas observadas en el ensayo de inhibicion del complemento (Tabla 3), indicando que existe una correlacion union-actividad.

Todos los peptidos se unieron a C3 con una entalpia negativa y una entropfa positiva. Dicha union es una caractenstica de la interaccion de la compstatina con C3. Entre todos los peptidos examinados, el analogo de Ac- V4W/W7(5f-/W)/H9A con sustitucion en la posicion 7 (ID DE SECUENCIA N°: 19) mostro una entalpia de union mayor (AH = -21,83, AAH = -3,69) que la de su homologo de tipo salvaje. El analogo de Ac-V4(5f-/-W)/H9A con sustitucion en la posicion 4 (ID dE SECUENCIA N°: 18) se unio a C3 con una entalpia de -16,69 kcal/mol, 1,45 kcal/mol menos que la mostrada por su homologo de tipo salvaje

La incorporacion de 5-fluoro-triptofano en la posicion 4 llevo a una perdida en la entalpia de 1,45 kcal/mol con respecto a la del triptofano en esa posicion (Tabla 4). Dado que la unica diferencia entre el triptofano y el 5- fluoro-triptofano es el atomo de fluor en C5 del indol, esta perdida en la entalpia puede atribuirse a la sustitucion del hidrogeno por fluor.

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Tabla 4. Parametros termodinamicos para la interaccion de los analogos sinteticos de la compstatina que

contienen 5-fluoro-1-triptofano y C3

Peptido

ID DE SECUENCIA N°: Kd (jM) (kcal/mol)

AH

AAH -TAS -TAAS AG AAG

Ac-V4W/H9A

5 0,14 -18,14 0 8,79 0 -9,4 0

Ac-V4(5f-/- W)/H9A

18 0,15 -16,69 1,45 7,39 -1,4 -9,4 0

Ac- V4W/W7(5f- /-W)/H9A

19 0,035 -21,83 -3,69 11,56 2,77 -10,25 -1

Ac-V4(5f-/- W)/W7(5f-/- W)/H9A

20 0,017 -17,33 0,81 6,73 -2,06 -10,6 -1,2

La incorporacion de 5-fluoro-triptofano en la posicion 7 incremento la entalpia en 3,69 kcal/mol con respecto al tipo salvaje (Tabla 4). Sin limitarse a ningun mecanismo en concreto, se cree que el triptofano en la posicion 7 esta participando en una interaccion entalpicamente favorable como por ejemplo un enlace de hidrogeno. Sustituir uno de los hidrogenos del indol por un atomo de fluor podna fortalecer el caracter de enlace de hidrogeno del indol NH debido al descenso en pKa. De forma alternativa, el fluor forma un enlace de hidrogeno como resultado de su caracter de donante de electrones, tal y como se ha demostrado en la estructura de la tetradeca(3- fluorotirosil)glutation transferasa.

Otra explicacion del incremento observado en la entalpia es que una molecula de agua esta haciendo puente en la interaccion entre el atomo de fluor y un aceptor de hidrogeno en C3, en cuyo caso, deben formarse dos enlaces de hidrogeno (equivalentes a una energfa de aproximadamente 4 kcal/mol). El respaldo a esta teona proviene de la disminucion en la entropfa observada para la interaccion del analogo de Ac-V4W/W7(5fW)/H9A con sustitucion en la posicion 7 (ID DE SECUENCIA N°: 19) con respecto al analogo de tipo salvaje (Tabla 4), una disminucion que podna producirse por la union de una molecula de agua adicional en la interfaz. En otros sistemas se han observado interacciones con mediacion de agua entre atomos de fluor y otros aceptores del enlace de hidrogeno.

La union del analogo con doble sustitucion a C3 produjo un cambio en la entalpia de -19,85 kcal/mol, un cambio en la entropfa de -9,35 kcal/mol y un cambio en la energfa libre de -10,5 kcal/mol. Se cree que la incorporacion de 5-fluoro-triptofano simultaneamente en ambas posiciones abroga los efectos de las sustituciones unicas.

EJEMPLO 9

Analogos adicionales de la compstatina

Incorporacion de analogos del triptofano en la posicion 4. Se ha mostrado en los Ejemplos 5 y 6 que la

sustitucion de valina por triptofano en la posicion 4 de la compstatina incrementaba su actividad 45 veces. Para investigar aun mas el caracter de la interaccion con mediacion del residuo en la posicion 4 durante el curso de la union de la compstatina a C3, se sustituyo el triptofano en la posicion 4 por analogos del triptofano y 2-naftilalanina.

Se utilizaron ensayos basados en ELISA para analizar la actividad de todos los analogos peptfdicos que portaban analogos del triptofano en la posicion 4 y alanina en la posicion 9. Mientras que la sustitucion por 1-metil- triptofano (Ac-V4(1-metil-W)/H9A) (ID DE SECUENCIA N°: 23) y 2-naftilalanina (Ac-V4(2Nal)/H9A) (ID DE SECUENCIA N°: 7) incremento la actividad sobre la compstatina 264 y 99 veces, respectivamente, la sustitucion por 5-fluoro-triptofano (Ac-V4(5f-/-W)/W7/H9A) (ID DE SECUENCIA N°: 18) y 5-metil-triptofano (Ac-V4(5-metil-W)/H9A) (ID DE SECUENCIA N°: 22) dio por resultado una actividad menor; 31 y 67 veces mayor que la actividad mostrada por el peptido de tipo salvaje (Tabla 5). La Figura 3 muestra las curvas inhibitorias que representan la actividad y la Tabla 5 muestra los valores de IC50 calculados a partir de las curvas y las actividades relativas de los peptidos en comparacion con la actividad de la compstatina original. La Figura 5 muestra las constantes inhibitorias (IC50) trazadas contra los valores del log P de los analogos del triptofano y 2-naftilalanina.

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Tabla 5. Actividad inhibidora del complemento de los analogos de la compstatina

Peptido

ID DE SECUENCIA N°: IC50 (MM) Actividad relativa*

Ac-V4W/H9A

5 1,20 45

Ac-V4(5f-/-W)/7W/H9A

18 1,74 31

Ac-V4W/W7(5f-/- W)/H9A

19 0,446 121

Ac-V4(5f-/-W)/W7(5f-/- W)/H9A

20 0,482 112

Ac-V4W/7(5-metoxi W)/H9A

29 0,46 0,5

AC-V4(5-metoxi W)/7W/H9A

21 0,71 76

AC-V4(5-metil W)/7W/H9A

22 0,81 67

AC-V4(1-metil W)/7W/H9A

23 0,205 264

AC-V4(2-Nal)/W7/H9A

7 0,545 99

AC-V4(1-metil W)/W7(5f-/-W)/H9A

24 0,205 264

* Relativa a la actividad de H-I(CVVQDWGHHRC)T-NH2 (compstatina, ID DE SECUENCIA N°: 1).

Tambien se investigo la union de peptidos de la compstatina utilizando calorimetna de titulacion isotermica. Los datos calorimetricos obtenidos para la interaccion de todos los peptidos con C3 se ajustan al modelo de “un conjunto de sitios” con una estequiometna de cerca de 1 (Figura 4). Este resultado sugiere que la union de estos peptidos a C3 se produce en una proporcion de 1:1. Los parametros termodinamicos resultado de estos ajustes se muestran en la Tabla 6. Como resulta evidente a partir de los valores Kd, Ac-V4(1-metil-W)/H9A mostro una afinidad de union mas elevada (Kd = 0,015 pM) en comparacion con todos los demas peptidos que posefan una unica sustitucion en la posicion 4. La determinacion de estos valores contra los valores del log P de los analogos indica que existe una correlacion entre la afinidad de union y el caracter hidrofobo de los analogos del triptofano y 2- naftilalanina. De conformidad con la correlacion, la afinidad de union aumenta con un incremento en la hidrofobicidad del analogo incorporado en la posicion 4. Esta observacion concuerda con la correlacion que se muestra entre log P y las constantes inhibitorias.

Tabla 6. Parametros termodinamicos para la interaccion de los analogos sinteticos de la compstatina que

contienen 5-fluoro-1-triptofano y C3

peptido

ID DE SECUENCIA N°: Kd (MM) (kcal/mol)

AH

AAH -TAS -TAAS AG AAG

Tipo salvaie

1 0,14 -18,14 0 8,79 0 -9,4 0

Ac-V4(5f-/- W)/H9A

18 0,15 -16,69 1,45 7,39 -1,4 -9,4 0

Ac-V4(5- metil-W)/H9A

22 0,12 -17,75 0,34 8,2 -0,54 -9,55 -0,15

AC-V4(1- metil-W)/H9A

23 0,015 -17,59 0,81 6,94 -1,85 -10,65 -1,1

AC-V4(2- Nal)/H9A

7 0,11 -14,27 3,87 4,8 -3,99 -9,5 -0,1

AC- V4W/W7(5f- I-W)/H9A

19 0,035 -21,83 -3,69 11,56 2,77 -10,25 -0,8

AC-V4(1- metil- W)/W7(5f-I- W)/H9A

24 0,017 -17,33 0,81 6,73 -2,06 -10,6 -1,2

Todos los peptidos se unieron a C3 con una entalpia negativa y una entropfa positiva, lo que sugiere que la union esta impulsada por la entalpia. Dicha union es una caractenstica de la interaccion de la compstatina con C3. Sin embargo, la union de estos peptidos esta caracterizada por un cambio en la entalpia menor que la del tipo salvaje, y el cambio en la entropfa vario hacia un lado favorable. La Figura 5B muestra un grafico de log P versus -

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TAS, que indica que con un incremento en la hidrofobicidad de los analogos incorporados en la posicion 4, se favorece mas la entropfa provocando por tanto un impacto positivo en el cambio de la energfa libre.

Incorporacion de analogos del triptofano en la posicion 7. Se propoma en el Ejemplo 7 que el triptofano en la posicion 7 produce un enlace de hidrogeno con un residuo en C3. Para examinar mas aun esta posibilidad, el triptofano en la posicion 7 fue sustituido por analogos de triptofano similares a las sustituciones de la posicion 4 para dilucidar el caracter de la interaccion realizada por el triptofano en esta posicion. La sustitucion por 5-fluoro-triptofano (Ac-V4W/W7(5f-/W)/H9A) (ID DE SECUENCIA N°: 19) produjo un peptido 121 veces mas activo. (Figura 3, Tabla 5). Las sustituciones del triptofano 7 por el analogo 5-metil trp o 1-metil trp hicieron que la compstatina estuviera inactiva (no se muestran los datos). Por consiguiente, no se observo ninguna correlacion entre la actividad y la hidrofobicidad de los analogos del triptofano.

Las propiedades termodinamicas de los diferentes analogos de Trp 7 fueron investigadas paralelamente mediante calorimetna. (Tabla 6). Dado que no se detecto ninguna union para los peptidos que conteman o bien 5- metil trp o 1-metil trp en la posicion 7, no existen los parametros de union. Solamente el peptido Ac-V4W/W7(5f-I- W)/H9A (ID DE SeCuENCIA N°: 19) se unio a C3. La afinidad de union era de 0,035 jM, lo que es mayor que la observada para todos los peptidos que tienen un analogo de Trp en la posicion 4, excepto el peptido Ac-V4(1-metil- W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23). En contraste con los peptidos que tienen un analogo de Trp en la posicion 4, Ac-V4W/W7(5f-1-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 19) se unio a C3 con un cambio en la entalpia de union altamente favorable (aH = -21,83, AAH = -3,69) y un cambio en la entropfa desfavorable (-TAS = 11,56, -TAAS = 2,77), lo que sugiere interacciones no covalentes favorables adicionales de caracter polar.

Los resultados muestran que la incorporacion de 5-fluoro-triptofano en la posicion 7 da por resultado un incremento en la actividad de la compstatina, mientras que la incorporacion de los analogos 5-metil-triptofano y 1- metil-triptofano hace que la compstatina este inactiva. La perdida de actividad de la compstatina con la incorporacion de 1-metil-triptofano respalda la conclusion de que el enlace de hidrogeno con mediacion de N-H de Trp 7 es importante para la interaccion de la compstatina con C3. Ademas, la perdida completa de actividad de la compstatina con la incorporacion de 5-metil-triptofano sugiere que no se tolera bien un aminoacido hidrofobo en la posicion 7.

Incorporacion de analogos del triptofano en las posiciones 4 y 7. Dado que la sustitucion de triptofanos en la posicion 4 por 1-metil-triptofano y en la posicion 7 por 5-fluoro-triptofano produda analogos de la compstatina que mostraban un espectacular incremento en la actividad, se genero un analogo de la compstatina que contema sustituciones en las posiciones 4 y 7. El peptido resultante (Ac-V4(1-metil-W)/W7(5f-I-W)/H9A) (ID DE SECUENCIA N°: 24) genero una curva de inhibicion similar a la de la sustitucion unica con 1-metil-triptofano (Ac-V4(1-metil- W)/H9A) (ID DE SECUENCIA N°: 23), (Figura 3, Tabla 5). La afinidad de union (Kd = 0,017) observada para este peptido en el calonmetro es tambien similar a la de Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23). Estas observaciones sugieren que 5-fluoro-triptofano no tiene ningun efecto en la posicion 7 en presencia de 1-metil- triptofano en la posicion 4 bajo estas condiciones experimentales.

Incorporacion de otro analogo del triptofano en la posicion 4. Para investigar mas aun el caracter de la interaccion con mediacion del residuo en la posicion 4 durante el curso de la union de la compstatina con C3, el triptofano en la posicion 4 fue sustituido por el analogo del triptofano 1-formil-triptofano.

La Figura 6 muestra una comparacion del porcentaje de la inhibicion del complemento versus la concentracion peptfdica para Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23) (drculos) y Ac-V4(1-formil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 25). Como puede verse, el analogo de 1-formil-W era fundamentalmente identico al analogo de 1-metil-W en su actividad de inhibicion del complemento.

EJEMPLO 10

PEGilacion del analogo de la compstatina

Una vida media prolongada de la compstatina resulta ventajosa para su uso en tratamientos cronicos. Se ha conseguido extender la vida media de los peptidos terapeuticos analizados en diferentes ejemplos a traves de la PEGilacion (vease Veronese et al., 2001), ya que PEG posee la capacidad de demorar la eliminacion de las biomoleculas de la circulacion a traves de una diversidad de mecanismos, incluyendo disminuir la depuracion renal, la proteolisis y la inmunogenicidad. La PEGilacion implica la union covalente de polfmeros de PEG a macromoleculas, preferentemente a la amina primaria de las lisinas.

Este ejemplo describe la elaboracion de un analogo de la compstatina PEGilado, Ac-V4(1-metil-W)/H9A-K- PEG 5000 (ID DE SECUENCIA N°: 36) y la evaluacion del compuesto para ver su capacidad para inhibir la activacion del complemento.

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Se adquirio Fmoc-NH-NHS-5000 PEG en Nektar transforming therapeutics, 490 discovery Dr, Huntsville, AL 35806.

El compuesto Ac-V4(1-metil-W)/H9A-K-PEG 5000 (ID DE SECUENCIA N°: 36) fue sintetizado qmmicamente mediante qmmica peptidica Fmoc en fase solida de conformidad con un protocolo estandar modificado. En resumen, se disolvio PEG en 3 ml de diclorometano, se anadio manualmente 1 ml de 2M DIEA, y se mezclo el PEG durante 5 minutos.

Despues, se paso el PEG a un recipiente y se dejo reposar durante toda la noche para que se uniera. El PEG fue entonces desprotegido con piperidina al 20% durante 20 minutos.

Despues, la smtesis prosiguio de conformidad con el protocolo estandar, incorporando una lisina en el extremo C-terminal de la molecula con el proposito de unir el PEG a su cadena lateral.

Las divisiones finales de los peptidos se consiguieron con el reactivo D (TFA:H2O:TIS:Fenol, 87,5:5:2,5:5) (4 mL) a 25° C durante 90 minutos, para proporcionar el producto deseado. El peptido fue entonces purificado en una columna C18 de CLAP de fase inversa, fue liofilizado y caracterizado mediante MALDI-TOF.

El analogo PEGilado de la compstatina se analizo en busca de la actividad inhibidora del complemento utilizando el ensayo in vitro que se ha descrito en el Ejemplo 4. Tal y como se muestra en la Figura 7, el analogo PEGilado estaba activo a la hora de inhibir la activacion del complemento, sin embargo, se necesito siete veces mas conjugado para conseguir la misma cantidad de inhibicion que la del analogo no PEGilado, Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23).

EJEMPLO 11

Conjugado proteinico de union a albumina del analogo de la compstatina

Dennis et al. (2002) identificaron una serie de peptidos que posefan la secuencia central DICLPRWGCLW (ID DE SECUENCIA N°: 37) que se uman de forma espedfica a la albumina del suero procedente de multiples especies con una elevada afinidad. Estos peptidos se uman a la albumina con una estequiometna 1:1 en un sitio diferente de los sitios de union de pequenas moleculas conocidos. El peptido SA21

(AcRLIEDICLPRWGCLWEDDNH2; ID DE SECUENCIA N°: 38) posee una vida media inusualmente larga de 2,3 horas cuando se inyecta mediante bolo intravenoso a conejos. Tal y como se menciona en la Descripcion Detallada, una secuencia relacionada, fusionada con el factor antitisular Fab de D3H44 permitio que Fab se uniese a la albumina con una afinidad similar a la de SA21 a la vez que retema la capacidad de Fab para unirse al factor tisular

1 (Nguyen et al., 2006). Esta interaccion con la albumina dio por resultado una depuracion in vivo reducida de 25 a

58 veces en ratones y conejos, respectivamente, en comparacion con el Fab de D3H44 de tipo salvaje. La vida media se extendio 37 veces hasta alcanzar las 32,4 horas en los conejos y 26 veces hasta alcanzar las 10,4 horas en los ratones, consiguiendo un 25-43% de la vida media de la albumina en estos animales. Estas vidas medias exceden las de Fab 2 y son comparables a las observadas en las moleculas de Fab PEGiladas, las

inmunoadhesinas y las fusiones de albumina.

Este ejemplo describe la smtesis de un analogo de la compstatina fusionado con un peptido de union a albumina y su actividad en ensayos in vitro para la inhibicion del complemento.

El compuesto 4(1MeW)-ABP fue sintetizado qmmicamente mediante qmmica peptfdica Fmoc en fase solida de conformidad con los protocolos estandar. Los extremos N y C terminales del peptido fueron protegidos con grupos acetilo y amida. El peptido fue purificado ademas en una columna C18 de CLAP de fase inversa, fue liofilizado y caracterizado mediante espectrometna de masas MALDI.

Para la ciclizacion, el peptido-resina (carga de 0,10 mmol/g basada en un analisis de aminoacidos) fue hinchado en diclorometano (DCM) (2 mL) durante 5 minutos, filtrado y tratado con 94:1:5 de DCM/TFA/TIS (5 mL) a 25° C, 3 veces x 2 minutos cada uno, para desproteger de forma selectiva los grupos protectores S-Mmt, eliminando la presion del solvente N2. Estos bis(tiol), bis(Acm)-peptido-resina intermedios fueron lavados con CH2O2, DMF y NMP (cada uno 5 veces x 2 minutos, 2 mL), hinchados adicionalmente en NMP (2 mL) durante 5 minutos y despues tratados con Et3N (2 eq.) en NMP a 25° C durante 4 horas. El peptido-resina fue despues lavado con DMF y CH2O2 (cada uno 5 veces x 2 minutos, 2 mL). Despues de las formaciones unidas a la resina del primer bucle, el peptido- resina fue lavado de nuevo con DMF (5 veces x 2 minutos, 2 mL) e hinchado en DMF (2 mL) durante 5 minutos, filtrado y tratado con T1 (tfa)3 (1,5 eq.) en DMF-anisol (4 mL) para ciclizar los segundos bucles disulfuro. Tras agitarlos suavemente a 25° C durante 4 horas, los reactivos de talio fueron extrafdos con DMF (8 veces x 2 minutos,

2 mL) y los peptidos-resinas fueron lavados de forma adicional con CH2O2 (5 veces x 2 minutos, 2 mL). Las divisiones finales del peptido bidclico se consiguieron con el Reactivo D (TFA:H2O:TIS:Fenol, 87,5:5:2,5:5) (4 mL) a 25° C durante 90 minutos, para proporcionar el producto deseado. El peptido conjugado resultante (ID DE SECUENCIA N°: 39) se muestra a continuacion.

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El peptido-compstatina de union a albumina fue analizado para observar la actividad inhibidora del complemento utilizando el ensayo in vitro que se ha descrito en el Ejemplo 4. Tal y como se muestra en la Figura 8, el conjugado estaba activo a la hora de inhibir la activacion del complemento, sin embargo, se necesito siete veces mas conjugado para conseguir la misma cantidad de inhibicion que el analogo no conjugado, Ac-V4(1-metil-W)/H9A (ID DE SECUENCIA N°: 23).

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Claims (16)

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   Reivindicaciones

   1. Un compuesto que inhibe la activacion del complemented que comprende un peptido que tiene una secuencia:

   Xaa1 - Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (ID DE SECUENCIA N°: 26);

   en la que:

   Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipeptido Gly-Ile;

   Xaa2 es Trp o un analogo de Trp, en donde el analogo de Trp tiene caracter hidrofobo incrementado en comparacion con Trp y se selecciona de

   (a) 5-fluoro-/-triptofano, o 6-fluoro-/-triptofano; o

   (b) 5-metoxitriptofano o 5-metiltriptofano; o

   (c) 1-metiltriptofano;

   con la condicion de que si Xaa3 es Trp, Xaa2 es el analogo de Trp;

   Xaa3 es Trp o un analogo de Trp que tiene un hidrogeno de indol sustituido con un atomo de fluor, aumentando de este modo el potencial de enlace de hidrogeno del anillo de indol, opcionalmente en donde el analogo de Trp de Xaa3 es 5-fluoro-/-triptofano, o 6-fluoro-/-triptofano;

   Xaa4 es His, Ala, Phe o Trp, opcionalmente en donde Xaa4 es Ala;

   Xaa5 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipeptido Thr-Asn o Thr-Ala, o un tripeptido Thr-Ala-Asn, en donde un extremo terminal carboxi -OH de cualquiera de L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly o Asn esta opcionalmente sustituido con -NH2; y

   los dos residuos Cys estan unidos por un enlace de disulfuro.
2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde Xaa2 es 1-metiltriptofano, Xaa3 es 5-fluoro/-triptofano o 6-fluoro-/- triptofano y Xaa4 es Ala.
3. 3. Un compuesto que inhibe la activacion del complemento, que comprende un peptido que tiene una secuencia:

   Xaa1 - Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (ID DE SECUENCIA N°: 26);

   en la que:

   Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipeptido Gly-Ile;

   Xaa2 es Trp o un analogo de Trp, en donde el analogo de Trp tiene caracter hidrofobo incrementado en comparacion con Trp y es un analogo que tiene:

   (a) un sustituyente alcoxi que tiene de 1 a 5 atomos de carbono en la posicion 5 del triptofano, opcionalmente 5-metoxitriptofano; o

   (b) un sustituyente alcanoilo que tiene de 1 a 5 atomos de carbono en la posicion 1 del triptofano, opcionalmente en donde el analogo de Trp de Xaa1 es 1-formiltriptofano,

   con la condicion de que si Xaa3 es Trp, Xaa2 es el analogo de Trp;

   Xaa3 es Trp o un analogo de Trp que tiene un hidrogeno de indol sustituido con un atomo de fluor, aumentando de este modo el potencial de enlace de hidrogeno del anillo de indol, opcionalmente en donde el analogo de Trp de Xaa3 es 5-fluoro-/-triptofano, o 6-fluoro-/-triptofano;

   Xaa4 es His, Ala, Phe o Trp, opcionalmente en donde Xaa4 es Ala;

   Xaa5 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipeptido Thr-Asn o Thr-Ala, o un tripeptido Thr-Ala-Asn, en donde un extremo terminal carboxi -OH de cualquiera de L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly o Asn esta opcionalmente sustituido con -NH2; y

   los dos residuos Cys estan unidos por un enlace de disulfuro; opcionalmente en donde el compuesto comprende la ID DE SECUENCIA N°: 25
4. 4. El compuesto de cualquier reivindicacion anterior, en donde el compuesto se produce al menos en parte por la expresion de un polinucleotido que codifica el peptido.
5. 5. El compuesto de cualquier reivindicacion anterior, en donde el compuesto se produce al menos en parte por smtesis de peptidos.
6. 6. el compuesto de cualquier reivindicacion anterior, en donde el compuesto esta PEGilado.

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7. 7. El compuesto de cualquier reivindicacion anterior, que comprende ademas un componente peptfdico adicional que extiende la retencion in vivo del compuesto; opcionalmente en donde el componente peptidico adicional es un peptido de union a albumina.
8. 8. Un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior para su uso en la inhibicion de la activacion del complemento en o sobre un medio en el que esta teniendo lugar la activacion del complemento, opcionalmente en donde la activacion del complemento se inhibe en uno o mas de : (a) sangre o suero; (b) organos artificiales o implantes; y (c) en fluidos fisiologicos durante la desviacion extracorporea de los fluidos.
9. 9. El uso ex-vivo de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para inhibir la activacion del complemento en o sobre un medio en el que esta teniendo lugar la activacion del complemento.
10. 10. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion en la que el complemento contribuye a dano celular o lesion de tejidos.
11. 11. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para disenar un analogo peptfdico o peptido mimetico o para examinar una biblioteca de moleculas pequenas para identificar un compuesto que inhibe la activacion del complemento o compite con el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para unirse a C3 o un fragmento de C3.
12. 12. Un metodo para elaborar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende sintetizar el compuesto por condensacion de residuos de aminoacidos o analogos de los mismos, o expresar un polinucleotido que codifica un peptido que comprende el compuesto.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, que comprende ademas ciclar el compuesto a traves de la formacion de un enlace de disulfuro entre una o mas parejas de residuos Cys.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 12 o 13, que comprende ademas la modificacion post-smtesis del compuesto, opcionalmente seleccionada de una o ambas de acetilacion de Xaa1 y reemplazo del -OH terminal de Xaa5 con - NH2.
15. 15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 12, 13 o 14, que comprende la PEGilacion del compuesto.

    imagen1

    Fig.l

    imagen2

    Concentration pepti'dica (pM)

    Fig. 2

    w

    *

    Oi

    % Inhibicion

    imagen3

    Concentration peptidica (pM)

    Fig. 3b

    w

    »

    OJ

    61

    % Inhibicion

    % Inhibicion

    * « e t

    J_________I____i,-----1------.------L_

    imagen4

    imagen5

    kcal/mol del inyectante

    imagen6

    Proporcion molar

    imagen7

    Fig. 4a

    Fig. 4b

    imagen8

    kcal/mol del inyectante

    imagen9

    Fig. 4d Fig. 4e

    imagen10

    Fig* 5a

    Fig. 5b

    Fig. 5c

    imagen11

    imagen12

    imagen13

    lo(jP

    imagen14

    FIG. 6

    imagen15

    FIG. 7

    imagen16

    rTT).................................................f—...............it] ------f—.....................
16. 0.01 0.1 1 10

    Concentration peptidica ^M

    FIG. 8