ES2676878T3

ES2676878T3 - Diseño de armazón de heteromultímero multivalente y constructos

Info

Publication number: ES2676878T3
Application number: ES12751893.4T
Authority: ES
Inventors: Surjit Bhimarao Dixit; Igor Edmondo Paolo D'angelo; David Kai Yuen Poon
Original assignee: ZYMEWORKS Inc; Zymeworks Inc Canada
Current assignee: ZYMEWORKS Inc; Zymeworks BC Inc
Priority date: 2011-03-03
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2018-07-25
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: WO2012116453A1; US20190127443A1; CA2828811A1; US9499605B2; JP2014512343A; CA2828811C; DK2681245T3; AU2012222833B2; CN103732628B; EP2681245A1; EP2681245B1; EP2681245A4; US20210009659A1; US10711051B2; CN103732628A; US20170174745A1; US10155803B2; AU2012222833A1; US20120244577A1; JP6101638B2

Abstract

Un heteromultímero que comprende: al menos una primera proteína monomérica que comprende (i) un primer polipéptido transportador que comprende un primer segmento de albúmina sérica y (ii) al menos un polipéptido de carga y al menos una segunda proteína monomérica que comprende (iii) un segundo polipéptido transportador que comprende un segundo segmento de albúmina sérica y (iv) al menos un polipéptido de carga; donde dicho primer polipéptido transportador es distinto del segundo polipéptido transportador mencionado, y donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasinatural de albúmina sérica.

Description

Diseño de armazón de heteromultímero multivalente y constructos DESCRIPCIÓN 5 Campo de la invención

El campo de la invención es el diseño racional de un armazón para el desarrollo personalizado de bioterapéutica. Descripción de la técnica relacionada

10

En el área de las proteínas terapéuticas, los anticuerpos con sus características de unión de diana multivalente suponen armazones excelentes para el diseño de fármacos potenciales. Yendo más allá en estas características, los anticuerpos ^específicamente diseñados y otras terapéuticas multiespecíficas fusionadas muestran especificidades diana múltiples o duales además de una oportunidad para crear fármacos con novedosas modalidades de acción. El 15 desarrollo de tales proteínas terapéuticas multiespecíficas y multivalentes con una actividad funcional y una famacocinética favorables ha sido todo un reto.

La albúmina sérica humana (ASH o AH), una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura es responsable de una proporción significativa de presión osmótica del suero y funciona también como vehículo de ligandos tanto 20 endógenos como exógenos. El papel de la albúmina como molécula vehículo, así como su naturaleza estable, resultan propiedades deseables para el uso como un vehículo y un transportador de polipéptidos in vivo.

La albúmina sérica humana posee muchas características deseables. La ASH se encuentra por todo el cuerpo, pero más concretamente en el espacio intersticial y en la sangre con concentraciones séricas de 40 g/l que equivalen a 25 0,7 mM (Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 89:1904-1908 (1992)). Se considera que la ASH es la proteína más abundante del suero, y es responsable de mantener la osmolaridad. La ASH posee propiedades farmacocinéticas favorables y se elimina muy lentamente gracias al hígado y riñones, lo que indica unas vidas medias in vivo de hasta varias semanas (Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 89:1904-1908 (1992); Waldmann, T. A., Albumin Structure, Function and Uses, pp. 255-273 (1977); Sarav et al., J Am Soc Nephrol 30 20:1941-1952(2009)). La ASH carece de actividad enzimática y de antigenicidad, por lo que se eliminan potencialmente los efectos secundarios indeseables. La ASH actúa como un vehículo tanto para ligandos exógenos como endógenos. En combinación, estas características pueden ampliarse, al menos parcialmente, para formar la proteína de fusión basada en albúmina. Se pueden eludir las malas propiedades farmacocinéticas mostradas por las proteínas terapéuticas.

35

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En el presente documento se proporcionan heteremultímeros multifuncionales y sus procedimientos de diseño. En ciertas realizaciones son heteromultímeros, cada heteromultímero que comprende al menos una primera proteína 40 monomérica que comprende (i) un primer polipéptido transportador que comprende un primer segmento de albúmina sérica y (ii) al menos un polipéptido de carga y al menos una segunda proteína monomérica que comprende (iii) un segundo polipéptido transportador que comprende un segundo segmento de albúmina sérica y (iv) al menos un polipéptido de carga; donde dicho primer polipéptido transportador es diferente de dicho segundo polipéptido transportador, y donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura 45 cuasinatural de albúmina sérica. En ciertas realizaciones, al menos una molécula de carga es un fármaco, o un agente terapéutico. En ciertas realizaciones, cada polipéptido transportador monomérico es inestable y preferencialmente forma un heteromultímero con al menos uno de los otros polipéptidos transportadores. En ciertas realizaciones, cada polipéptido transportador monomérico es estable y preferencialmente forma un heteromultímero con al menos uno de los otros polipéptidos transportadores. En ciertas realizaciones, la conexión comprende al 50 menos un enlace disulfido. En ciertas realizaciones, la conexión de heteromultimerización no comprende un enlace disulfido.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero es un heterodímero. En una realización, el heteromultímero es biespecífico. En una realización, el heteromultímero es multiespecífico. En ciertas realizaciones, el heteromultímero 55 es bivalente. En una realización, el heteromultímero es multivalente. En una realización, el heteromultímero es multifuncional. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido transportador no deriva de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores no derivan de un anticuerpo. En ciertas realizaciones del heteromultímero descrito en el presente documento, los polipéptidos transportadores derivan de albúmina sérica humana (ASH o AH) de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones del heteromultímero descritas en el presente 60 documento, los polipéptidos transportadores derivan de aloalbúminas (AAH). En ciertas realizaciones del heteromultímero descrito en el presente documento, los polipéptidos transportadores derivan de homólogos de secuencia con la albúmina sérica humana (ASH o AH) de la SEQ Id NO: 1.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de carga son proteínas terapéuticas o fragmentos o variantes de las mismas. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de carga son antígenos o fragmentos o variantes de los mismos. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de carga son receptores de antígenos o fragmentos o variantes de los 5 mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga es un anticuerpo, un dominio de anticuerpo, un ligando o un receptor que se une a un polipéptido diana. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se fusiona al polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se une al terminal-N del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se une al terminal-C del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga está químicamente unido al 10 polipéptido transportador. En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en el presente documento, al menos un polipéptido de carga comprende un GLP-1 o un fragmento o variante del mismo. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga comprende glucagón o un fragmento o variante del mismo. En una realización, al menos un polipéptido de carga comprende un dominio similar al EGF-A.

15 En ciertas realizaciones, son heteromultímeros de la invención, cada heteromultímero que comprende: al menos una primara proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador que comprende un primer segmento de albúmina sérica humana; y al menos una segunda proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga, fragmento y un segundo polipéptido transportador que comprende un segundo segmento de albúmina sérica humana; donde dichos polipéptidos transportadores se 20 autoensamblan para formar una estructura cuasinatural de albúmina o análogo de la misma. En ciertas realizaciones, el primer y segundo segmento de albúmina sérica humana son de las regiones no superpuestas de la proteína. En ciertas realizaciones, hay una superposición entre las secuencias del primer y segundo segmento de la albúmina sérica humana. En algunas realizaciones, la superposición es un 5 % de superposición. En una realización, la superposición es un 10 % de superposición. En ciertas realizaciones, el primer segmento de la 25 albúmina sérica humana comprende una secuencia de SEQ ID NO:2, y el segundo segmento de la albúmina sérica humana comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el primer segmento de la albúmina sérica humana comprende una secuencia de SEQ ID NO:8, y el segundo segmento de la albúmina sérica humana comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10.

30 En ciertas realizaciones, son heteromultímeros de la invención, cada heteromultímero que comprende: al menos una primera proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO:2; y al menos una segunda proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga, y un segundo polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, son heteromultímeros de la invención, cada heteromultímero que 35 comprende: al menos una primera proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO:8; y al menos una segunda proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones del heteromultímero descrito en el presente documento, al menos un polipéptido transportador deriva de aloalbúminas. En ciertas realizaciones, ambos 40 polipéptidos transportadores derivan de aloalbúminas. En ciertas realizaciones, todos los péptidos transportadores son derivados de la misma aloalbúmina. En algunas otras realizaciones, los polipéptidos transportadores son derivados de diferentes aloalbúminas. En algunas realizaciones, cada polipéptido transportador es un derivado de aloalbúmina basado en una aloalbúmina seleccionada de la tabla 2. En ciertas realizaciones, la primera proteína monomérica comprende dos polipéptidos de carga. En algunas realizaciones, la segunda proteína monomérica 45 comprende dos polipéptidos de carga. En algunas realizaciones, al menos una de las proteínas monoméricas está manipulada mediante la introducción de mutaciones. En ciertas realizaciones, las mutaciones introducidas mejoran la funcionalidad de la proteína monomérica en comparación con la forma natural no mutada del monómero. En ciertas realizaciones las mutaciones introducidas mejoran una o más de las formaciones de heteromultímeros, la vida media y estabilidad del polipéptido transportador.

50

En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se selecciona de entre las proteínas listadas en la tabla 2 o fragmentos, variantes o derivados de las mismas. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se selecciona de entre el ligando, receptor o anticuerpo para una o más proteínas de las listadas en la tabla 2, o fragmento, variante o derivado de dicho ligando, receptor o anticuerpo. En ciertas realizaciones, al menos un 55 polipéptido de carga se dirige a un antígeno de superficie celular del grupo que consiste de CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, Cd138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP, integrina, Mesotelina, EGFR, TAG- 72, GD2, CAIX, 5T4. En ciertas realizaciones, son heteromultímeros cada heteromultímero que comprende: al menos una primera proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido 60 transportador; y al menos una segunda proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga y un segundo polipéptido transportador, donde al menos un polipéptido de carga es un anticuerpo, o fragmento o variante del mismo. En ciertas realizaciones, todos los polipéptidos de carga son anticuerpos o fragmentos o variantes de los

mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga es un anticuerpo que se une a una proteína enumerada en la tabla 2. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo comprende una región Fc o Fab o Fv del anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga es una proteína no anticuerpo como nanocuerpos, aficuerpo, maxicuerpo, adnectinas, anticuerpo de dominio, evicuerpo, proteínas de repetición de anquirina, 5 anticalinas, camlidas o proteína de ligando o polipéptido que se une a una diana terapéuticamente relevante. En algunas realizaciones, el anticuerpo de su fragmento deriva de una inmunoglobulina que se selecciona de entre el grupo consistente en IgG, IgA, IgD, IgE, e IgM. En ciertas realizaciones, la IgG es un subtipo que se selecciona de entre IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es multiespecífico.

10 En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en el presente documento, al menos un polipéptido de carga es un anticuerpo terapéutico o un fragmento o variante del mismo, donde el anticuerpo se selecciona de entre abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, certuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, gemtuzumab ozagamicina, golimumab, ibritumomab tiuxetán, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, 15 mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, toclizumab, tositumomab, trastuzumab, Proxinium, Rencarex, ustekinumab, y zalutumumab. En ciertas realizaciones, el anticuerpo terapéutico une un antígeno diana relacionado con una enfermedad tal como un antígeno de cáncer, un antígeno de enfermedad inflamatoria o un antígeno de enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, el antígeno 20 diana podría ser una proteína sobre una superficie celular y la célula podría pertenecer al grupo de células-B, células-T, células estromales, células endoteliales, células vasculares, células mieloides, células hematopoyéticas o células de carcinoma.

En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en el presente documento, al menos un polipéptido de 25 carga es una enzima, un inhibidor de enzimas, hormona, polipéptido terapéutico, antígeno, radiotoxina y quimiotoxina con, pero no limitado a, neurotoxinas, interferones, toxinas de fusión de citoquinas y toxinas de fusión de quimiocina, citoquinas, proteína de fusión de anticuerpo o variantes o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en el presente documento, al menos un polipéptido de carga comprende un GLP-1 o un fragmento o variante del mismo. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de 30 carga comprende glucagón o un fragmento o variante del mismo. En una realización, al menos un polipéptido de carga comprende un dominio similar al EGF-A. En ciertas realizaciones, la toxina es una inmunotoxina tal como Denileucina diftitox y la inmunotoxina Anti-CD22 tal como CAT-3888 y CAT-8015. En ciertas realizaciones, la toxina es saporina. En algunas realizaciones, la toxina es una mitotoxina. En algunas realizaciones, la toxina es una toxina de difteria. En algunas realizaciones, la toxina es una toxina botulínica tipo A. En algunas realizaciones, la toxina es 35 ricino o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, la toxina es una toxina de la familia RTX de las toxinas.

En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en el presente documento, el polipéptido de carga está unido al polipéptido transportador mediante conjugación química, ligadura natural, ligadura química, un enlace disulfido o fusión directa o fusión a través de un conector. En ciertas realizaciones, los conectores para unir las 40 moléculas de carga tales como polipéptidos de carga a polipéptidos transportadores se seleccionan de entre los conectores descritos en US5482858, US5258498 y US5856456, US2009060721, US6492123, US4946778, US5869620, US7385032, US5073627, US5108910, US7977457, US5856456, US7138497, US5837846,

US5990275, EP1088888.

45 En el presente documento se proporcionan células huésped que comprenden ácidos nucleicos que codifican un heteromultímero descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la primera proteína monomérica y el ácido nucleico que codifica la segunda proteína monomérica están presentes en un único vector. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la primera proteína monomérica y el ácido nucleico que codifica la segunda proteína monomérica están presentes en vectores separados.

50

En el presente documento se proporciona un procedimiento para producir un heteromultímero, donde dicho procedimiento comprende: cultivar una célula huésped descrita en el presente documento tal que el ácido nucleico que codifica un heteromultímero descrito en el presente documento es expresado; y recuperar el heteromultímero a partir del cultivo celular. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota. 55 En algunas realizaciones, la célula huésped es E. coli. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la levadura es S. cerevisiae. En algunas realizaciones, la levadura es Pichia. En algunas realizaciones, la levadura es Pichia pastoris. En algunas realizaciones, la levadura es deficiente en glicosilación, y/o deficiente en proteasa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, la célula huésped que expresa un heteromultímero es descrita en el presente documento 60 como una célula de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula de mamífero es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula COS o una célula humana.

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende un heteromultímero descrito en el presente documento y un adyuvante aceptable farmacéuticamente. También se proporcionan procedimientos para tratar a un individuo que padezca una enfermedad o trastorno, dicho procedimiento comprende la administración a este individuo de una cantidad efectiva de una formulación o composición farmacéutica descrita en el presente 5 documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En algunas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno inmunológico en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. También se proporciona un procedimiento para 10 tratar una enfermedad infecciosa en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno respiratorio en un 15 paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno metabólico en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar una o más hiperplasias adrenales congénitas, enfermedad de 20 Gaucher, síndrome de Hunter, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Niemann-Pick, fenilcetonuria (FCU), porfiria, enfermedad de Tay-Sachs, y enfermedad de Wilson en un paciente, dicho procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento.

25 En el presente documento, se describe un kit para detectar la presencia de un biomarcador de interés en un individuo, dicho kit comprende (a) una cantidad de heteromultímero descrita en el presente documento, donde dicho heteromultímero comprende al menos un polipéptido de carga tal que dicho polipéptido de carga es capaz de unirse al biomarcador de interés; y (b) instrucciones de uso.

30 En ciertas realizaciones, el polipéptido de carga se fusiona al polipéptido transportador basado en albúmina o aloalbúmina. En algunas realizaciones, la fusión es en el terminal-N del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, la fusión es en el terminal-C del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, la fusión implica un conector puente o una molécula espaciadora. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga está químicamente conjugado con el polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, el polipéptido de carga está 35 unido al polipéptido transportador por medio de una ligadura química o enlace disulfido.

En el presente documento se proporcionan proteínas de heteromultímero que comprenden al menos dos proteínas monoméricas, donde cada proteína monomérica comprende al menos un polipéptido de carga, y un polipéptido transportador, tal que dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan a la forma del heteromultímero. En 40 algunas realizaciones, cada polipéptido transportador es un polipéptido basado en aloalbúmina, tal que dichos polipéptidos basados en aloalbúmina se autoensamblan para formar el heteromultímero. En ciertas realizaciones, cada polipéptido transportador monomérico es inestable y preferencialmente forma un heteromultímero con al menos uno de los otros polipéptidos transportadores.

45 En algunas realizaciones, un heteromultímero descrito en el presente documento es un heterodímero. En algunas realizaciones el polipéptido de carga es un anticuerpo, enzima, hormona, polipéptido terapéutico, antígeno, quimiotoxina, radiotoxina, o variante o fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga de una proteína monomérica funciona en sinergia con el polipéptido de carga de otra proteína monomérica.

50 En ciertas realizaciones, el, al menos, único polipéptido de carga del primer monómero es diferente del, al menos, único polipéptido de carga del segundo monómero. En ciertas realizaciones, el, al menos, único polipéptido de carga del primer monómero es igual al, al menos, único polipéptido de carga del segundo monómero.

En ciertas realizaciones de la invención, hay proteínas de heteromultímero que comprenden al menos dos proteínas 55 monoméricas de fusión, donde cada proteína monomérica de fusión comprende al menos un polipéptido de carga fusionado con un polipéptido derivado de la aloalbúmina, tal que dichos polipéptidos derivados de la aloalbúmina se autoensamblan para formar el heteromultímero multifuncional.

En el presente documento se proporciona un heteromultímero de la invención, donde cada polipéptido transportador 60 se obtiene mediante segmentación de una proteína entera tal que dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar la proteína entera cuasinatural. En ciertas realizaciones, el heteromultímero es multiespecífico. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores no derivan de un anticuerpo. En algunas

realizaciones, cada monómero forma preferencialmente el heteromultímero en comparación con un monómero o un homomultímero. En una realización del heteromultímero, al menos una molécula de carga es un agente terapéutico, o una biomolécula. En algunas realizaciones, al menos una molécula de carga es una biomolécula que se selecciona de entre un polipéptido, ADN, APN, o ARN. Cada polipéptido transportador es un derivado de albúmina o 5 aloalbúmina.

En ciertas realizaciones, son formulaciones farmacéuticas las que comprenden una proteína heteromultimérica basada en aloalbúmina y/o basada en albúmina y descrita en el presente documento y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, son formulaciones farmacéuticas las que comprenden una 10 proteína heteromultimérica basada en transferrina y descrita en el presente documento y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, se proporciona una formulación descrita en el presente documento como parte de un kit o contenedor. En ciertas realizaciones, el kit o contenedor está envasado con las instrucciones relativas al periodo de conservación extendido de la proteína terapéutica. En algunas realizaciones, un heteromultímero descrito en el presente documento se usa en un procedimiento para tratar (p. ej. mejorar), prevenir, 15 o diagnosticar una enfermedad o síntoma de enfermedad en un individuo, que comprende la etapa de administrar dicha formulación al individuo.

En el presente documento, se proporciona un procedimiento para obtener armazones de proteínas de fusión con un número conocido de sitios de conjugación basados en cualquier proteína de transporte de interés.

20

También se proporcionan organismos transgénicos modificados para contener moléculas de ácido nucleico descritos en el presente documento para codificar y expresar las proteínas monoméricas de fusión descritas en este documento.

25 Otros aspectos y características de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de la descripción siguiente sobre realizaciones específicas de la invención en conjunción con las figuras que la acompañan.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

30

En los dibujos que ilustran las realizaciones de la invención,

la figura 1 muestra la estructura de la molécula de albúmina sérica humana (ASH). Las secciones alfa-helicoidales de la estructura secundaria se muestran esquemáticamente junto con los enlaces representados como ramas.

35 La figura 2 es una gráfica del área superficial accesible de un disolvente enterrado en conexión con dos polipéptidos basados en albúmina.

La figura 3 describe dos polipéptidos basados en albúmina expresados de forma separada. Los dos polipéptidos se muestran en gris claro y oscuro respectivamente. Cada polipéptido comprende dos sitios de fusión para proteínas funcionales de carga y estos sitios se representan como esferas. Los residuos de disulfido en la estructura se 40 muestran como ramas.

La figura 4 es una representación esquemática de terapéuticas bioespecíficas y otras de tipo multifuncional basadas en el heteromultímero descrito en el presente documento. Los polipéptidos basados en aloalbúmina y basados en albúmina se indican como A1 y A2. Los heteromultímeros se obtienen con la conjugación de motivos de unión de antígeno, citoquinas y otras formas de moléculas de señalización, quimiotoxinas, radiotoxinas u otros 45 inmunoconjugados funcionalmente relevantes con los sitios terminales N y/o C en A1 y A2, siendo esto representado con el símbolo +.

La figura 5 es un esquema de un anticuerpo biespecífico derivado a partir de un dominio Fc heterodimérico. Los polipéptidos basados en albúmina o aloalbúmina se conectan al terminal-C del Fc para conducir selectivamente a la formación de heterodímeros.

50 Las figuras 6A-6C muestran perfiles de electrofóresis de gel natural de heteromultímero-1 basado en albúmina (ABH1) de armazones de heterodímero y ASH de longitud completa y heteromultidímero-2 basado en albúmina (ABH2) de polipéptidos transportadores basados en ASH.

La figura 7 muestra la estabilidad de la ASH de tipo silvestre y los armazones de heterodímero ABH1 y ABH2 estudiados y usando calorimetría de barrido diferencial.

55 Las figuras 8A-8B muestran las isotermas de unión en equilibrio de 3000 nM FcRN x3 series de dilución en 3000 RU (unidades de refrigeración). La figura 8A muestra albúmina y la figura 8B muestra un armazón de heteromultímero ABH1.

La figura 9 muestra un esquema para heteromultímeros multivalentes basados en albúmina que comprende las fusiones bioactivas de anti-Her2/neu y anti-CD 16 scFv.

60 Las figuras 10A-10B contienen un análisis SDS-PAGE no reductor de las fusiones de heteromultímero ABH2 descritas en la tabla 8. El gel indica que todos los constructos forman el complejo correcto con el PM esperado.

La figura 11 muestra la estructura de la molécula de anexina basada en una estructura 1MCX del PDB. Los dos

monómeros que serán derivados mediante la división de la molécula de anexina están codificados por color como unidades en gris claro y gris oscuro. Los sitios de fusión de la proteína de carga se representan como esferas.

La figura 12 muestra una gráfica del área superficial accesible del disolvente enterrado en la conexión del polipéptido-1 transportador basado en anexina, y el polipéptido-2 transportador basado en anexina.

5 La figura 13 muestra la estructura de la molécula de transferrina basada en una estructura 1H76 del PDB. Los dos monómeros derivados mediante la división de la molécula de transferrina están codificados por color como unidades en gris claro y gris oscuro. Los sitios de fusión de la proteína de carga se representan como esferas.

La figura 14 muestra una gráfica del área superficial accesible de un disolvente enterrado en conexión con dos polipéptidos transportadores basados en transferrina descritos en el presente documento. Una transferrina dividida 10 junto a la posición de residuo 330 tal como se indica en el presente documento, forma un heterodímero con aproximadamente 1800 A2 de área superficial enterrada.

La figura 15 muestra secuencias de multímeros que comprenden polipéptidos transportadores basados en albúmina sérica humana.

15 DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el área de las proteínas terapéuticas, las moléculas biespecíficas muestran especifidades diana duales o son capaces de realizar simultáneamente papeles funcionales múltiples al proporcionar la organización necesaria espaciotemporal para la necesaria acción del fármaco. En un aspecto, las moléculas biespecíficas resultan 20 particularmente interesantes cuando el modo de acción terapéutica implica la reorientación de las células o moléculas efectoras a una diana tal como una célula tumoral [Muller D. y Kontermann R.E. (2010) Biodrugs 24, 8998]. El desarrollo de las proteínas terapéuticas biespecíficas con una farmacocinética favorable y una actividad funcional en condiciones homogéneas y estables ha supuesto un reto. Se han hecho intentos para ensamblar unidades biespecíficas desde dominios de unión a antígeno múltiples mediante el uso de varios enfoques. Estas 25 técnicas han implicado el uso de una molécula de IgG de anticuerpo heterodimérica, mediante el uso de proteínas de cremallera de leucina tal como el par Fos/Jun u otros armazones ensamblados a partir de organizaciones alternantes de cadenas pesadas y ligeras de los dominios variables en un anticuerpo. Kipriyanov y Le Gall han revisado el diseño en varios constructos biespecíficos [Kipriyanov S.M. & Le Gall F. (2004) Curr Opin Drug Discov Dev 7, 233-242]. El uso de una molécula de IgG de anticuerpo heterodimérica donde las mutaciones se introducen 30 en el dominio CH3 del anticuerpo para alcanzar el heterodímero y, de esta forma, introducir los dos sitios únicos de unión al antígeno en una molécula resulta muy atractivo debido a la estructura natural semejante a la inmunoglobulina de este constructo. Además, la porción Fc del anticuerpo está implicada en interacciones con el receptor Fc neonatal (FcRn) que media una ruta de rescate endocítica, siendo esto atribuido a la vida media del suero mejorada de la molécula del anticuerpo [Roopenian D. & Akilesh S. (2007) Nature Rev Immunol 7, 715-725]. 35 Por otra parte, las moléculas biespecíficas basadas en anticuerpos han sido problemáticas en ensayos clínicos debido a las fuertes respuestas de citoquinas como resultado de la actividad del efector concurrente a través de la porción Fc del anticuerpo biespecífico [Weiner L.M.; Alpaugh R.K. et al. (1996) Cancer Immunol Immunother 42, 141-150]. Esto subraya las necesidades de armazones novedosos que puedan ayudar al diseño de moléculas inmunoconjugadas y biespecíficas.

40

La proteína de albúmina sérica humana (ASH) supone el componente más abundante de la sangre, llegando a casi el 60 % de las proteínas totales en suero sanguíneo con una concentración de aproximadamente 40 mg/ml. La albúmina también es una de las proteínas más duraderas en el sistema circulatorio con una vida media de aproximadamente 19 días. Curiosamente, la misma ruta de rescate endocítica dependiente de las moléculas FcRn 45 que evita la degradación del anticuerpo también es conocida por su interacción con la molécula ASH [Chaudhary C.; Mehnaz S.et al. (2003) J Exp Med 197, 315-322].

La ASH (mostrada en la figura 1) es una proteína de un solo polipéptido de residuo-585 no glicosilada y la estructura en 3 dimensiones de la proteína fue observada por vez primera usando una cristalografía de rayos X gracias a 50 Carter y colegas [revisado en Carter, D.C. & Ho, J.X. (1994) Adv Prot Chem 45, 153-203]. La proteína ASH consiste en tres dominios homólogos: DI, DII, DIII, atribuidos a la duplicación génica, una característica común a la albúmina sérica también en otras especies [Gray J.E. & Doolittle R.F. (1992) Protein Sci 1, 289-302]. Cada uno de los tres dominios ha sido expresado y caracterizado de forma separada y ha demostrado ser independientemente estable [Dockal M., Carter D.C. & Ruker F. (1999) J Biol Chem 274, 29303-29310]. Cada dominio está formado de 10 55 segmentos helicoidales y se basa en la organización interhelicoidal en la que cada dominio puede además clasificarse dentro de 2 subdominios comprendidos por 1 a 6 y 7 a 10 hélices respectivamente. La ASH posee 17 enlaces disulfido en total y todos estos pares de cisteína que forman los enlaces se encuentran dentro de los dominios individuales. En general, la ASH resulta muy estable debido al gran número de enlaces disulfido además del pliegue predominantemente helicoidal. Las identidades de la secuencia de las moléculas de albúmina resultan 60 bastante extensas a través de un número de especies, mayor del 70 % dentro del ADNc de la albúmina derivado de humanos, équidos, bóvidos, ratas, etc. [Carter, D.C. & Ho, J.X. (1994) Adv Prot Chem 45, 153-203].

Los pares de proteína dividida han sido utilizados como sensores para comprender las interacciones proteína- proteína dentro del área de la proteómica funcional. El enfoque implica la identificación de segmentos apropiados a partir de una proteína que puede reconstituirse para formar una proteína activa similar a la natural. La generación de nuevas proteínas divididas es demandada técnicamente. Para que una proteína sea dividida de forma 5 funcionalmente útil, el sitio de segmentación tiene que producir dos segmentos que se reconstituyan eficientemente en la proteína cuasinatural cuando se asocien entre sí. Además, los segmentos de la proteína del componente deben ser lo suficientemente solubles para permanecer en la solución y asociarse selectivamente con los segmentos pareja de modo que los rendimientos y la purificación de la fabricación resulten rentables. La derivación de segmentos de proteína dividida que se recombinaran para formar la estructura cuasinatural representa todo un 10 reto [Tafelmeyer P., Johnsson N. & Johnsson K. Chem & Biol 11, 681-689]. Dichas proteínas divididas no se han usado en el diseño de la terapéutica de proteínas, ni como vehículos de administración de carga en el pasado.

Definiciones

15 Debe entenderse que esta invención no se limita a los protocolos particulares; líneas celulares, constructos y reactivos descritos en el presente documento y como tal puede variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento solo tiene la finalidad de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención que solo se verá limitada por las reivindicaciones adjuntas.

20 Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen su referencia en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "ASH", "AH", "albúmina", "albúmina sérica humana", así como varias formas en mayúsculas, con guion o sin él indican una referencia a una o más de dichas proteínas e incluye variantes, derivados, fragmentos, equivalentes de los mismos conocidos por aquellos expertos en la técnica, y demás.

25

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente cualquier experto en la materia al que se dirige la presente invención. Aunque cualquier método, dispositivos, y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o ensayo de la invención, se describen ahora los métodos, 30 dispositivos y materiales preferidos.

Las publicaciones comentadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su descripción previa a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento ha de considerarse como una admisión según la cual los inventores no tengan derecho a prefechar dicha descripción en virtud de anteriores 35 invenciones o debido a cualquier otra razón.

Un "heteromultímero" o "polipéptido heteromultimérico" consiste en una molécula que comprende al menos un primer monómero que comprende un primer polipéptido transportador y un segundo monómero que comprende un segundo polipéptido transportador, donde el segundo polipéptido difiere en la secuencia aminoácida del primer 40 polipéptido por al menos un residuo de aminoácido. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero" formado por el primer y el segundo polipéptidos transportadores. En ciertas realizaciones, el heteromultímero puede formar estructuras terciarias de orden superior tales como, pero no limitado a, trímeros y tetrámeros. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores están presentes junto con el primer y segundo polipéptidos transportadores. En ciertas realizaciones, el ensamblaje de los polipéptidos transportadores para formar el 45 heteromultímero está condicionado por el entierro del área superficial. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí mediante interacciones electroestáticas y/o interacciones de puente salino que condicionan la formación del heteromultímero al favorecer la formación del heteromultímero y/o desfavorecer la formación del homomultímero. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí mediante interacciones hidrofóbicas que condicionan la formación del heteromultímero al favorecer la formación del 50 heteromultímero y/o desfavorecer la formación del homomultímero. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí mediante la formación de un enlace covalente. En ciertas realizaciones, los enlaces covalentes están formados entre cisteínas naturalmente presentes o introducidas que conducen a la formación del heteromultímero. En ciertas realizaciones de los heteromultímeros descritas en el presente documento, no se forman enlaces covalentes entre los monómeros. En algunas realizaciones, los polipéptidos 55 transportadores interactúan entre sí mediante interacciones del tipo empaquetado/tamaño- complementariedad/protuberancias en orificios/protuberancia-cavidad que condicionan la formación del heteromultímero al favorecer la formación del heteromultímero y/o desfavorecer la formación del homomultímero. En algunas realizaciones, los polipéptidos transportadores interactúan entre sí mediante interacciones catión-pi que condicionan la formación del heteromultímero al favorecer la formación del heteromultímero y/o desfavorecer la 60 formación del homomultímero. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores individuales no pueden existir como monómeros aislados en la solución. En ciertas realizaciones, el heteromultímero supone el estado preferido de los polipéptidos transportadores individuales en comparación al monómero.

El término "biespecífico" pretende incluir cualquier agente, p. ej., heteromultímero, monómero, proteína, péptido, o complejo de péptido o proteína, que posea dos especificidades diferentes de unión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula puede unirse a, o interactuar con, (a) una molécula diana de la superficie celular y (b) un 5 receptor Fc sobre la superficie de una célula efectora. En ciertas realizaciones de un heteromultímero descrito en el presente documento, al menos un monómero está formado de manera biespecífica mediante la unión al mismo polipéptido transportador, de dos moléculas de carga con diferentes especifidades de unión. En ciertas realizaciones de un heteromultímero descrito en el presente documento, el heteromultímero en sí mismo está formado de manera biespecífica mediante la unión a los polipéptidos transportadores, de al menos dos moléculas de carga con 10 diferentes especifidades. El término "molécula multiespecífica" o "molécula heteroespecífica" pretende incluir cualquier agente, p. ej., una proteína, péptido, o complejo de péptido o proteína, que posea más de dos especificidades diferentes de unión. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interactuar con, (a) una molécula diana de la superficie celular tal como, pero no limitado a, los antígenos de la superficie celular, (b) un receptor Fc sobre la superficie de una célula efectora, y (c) al menos uno cualquiera de otro componente. Por consiguiente, las 15 realizaciones de los heteromultímeros descritas en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras moléculas multiespecíficas. En ciertas realizaciones, estas moléculas se dirigen a los antígenos de la superficie celular, tales como CD30 y a otras dianas, tales como los receptores Fc sobre las células efectoras.

20 A menos que se indique lo contrario, la expresión "multivalente" es usada en esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende al menos dos sitios de unión para las moléculas diana. El heteromultímero multivalente está diseñado para contar con múltiples sitios de unión para las dianas deseadas. En ciertas realizaciones, los sitios de unión están, al menos, en una de las moléculas de carga unidas al polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, al menos un sitio de unión está en el polipéptido transportador. La expresión 25 "bivalente" es usada en esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende dos sitios de unión diana. En ciertas realizaciones de un heteromultímero bivalente, ambos sitios de unión están en el mismo monómero. La expresión "trivalente" es usada en esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende tres sitios de unión diana. La expresión "tetravalente" es usada en esta memoria descriptiva para denotar un heteromultímero que comprende cuatro sitios de unión diana.

30

Las "proteínas de fusión" y los polipéptidos son creados al unir dos o más genes que originalmente codificaban para polipéptidos separados. La traducción de este gen de fusión origina un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada uno de los polipéptidos originales. En realizaciones de los heteromultímeros descritos en el presente documento, al menos un monómero puede comprender una proteína de fusión formada mediante la 35 fusión de al menos un polipéptido de carga con el terminal N o C de un polipéptido transportador.

El término "sustancialmente purificado" se refiere a un heteromultímero descrito en el presente documento, o variante del mismo, que puede ser sustancialmente o estar esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína, tal y como se observa en su entorno de origen natural, es decir, una célula 40 natural, o célula huésped en el caso de heteromultímero producido por vía recombinante que en ciertos entornos, está sustancialmente libre de material celular e incluye preparaciones de proteínas que poseen menos de aproximadamente el 30 %, menos de aproximadamente el 25 %, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 15 %, menos de aproximadamente el 10 %, menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 4 %, menos de aproximadamente el 3 %, menos de aproximadamente el 2 %, o menos de 45 aproximadamente el 1 % (por peso seco) de la proteína contaminante. Cuando las células huésped producen por vía recombinante el heteromultímero o variante del mismo, en ciertas realizaciones la proteína se presenta en aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 2 %, o en aproximadamente el 1 % o menos del peso seco de las células. Cuando las células 50 huésped producen por vía recombinante el heteromultímero o variante del mismo, en ciertas realizaciones la proteína se presenta en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/l, aproximadamente 4 g/l, aproximadamente 3 g/l, aproximadamente 2 g/l, aproximadamente 1 g/l, aproximadamente 750 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 250 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, aproximadamente 50 mg/l, aproximadamente 10 mg/l, o a aproximadamente 1 mg/l o menos del peso seco de las células. En ciertas realizaciones, el heteromultímero 55 "sustancialmente purificado" y producido por los procedimientos descritos en el presente documento, tiene un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, y más específicamente, un 60 nivel de pureza de al menos aproximadamente el 90 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 95 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 99 % o mayor, como determinan procedimientos de análisis tales como el SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, y la electrofóresis capilar.

Una "célula huésped recombinante" o "célula huésped" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido, sin importar el procedimiento usado en la inserción, por ejemplo, la captación directa, transducción, apareamiento f, u otros procedimientos conocidos en la técnica para crear células huésped recombinantes. El polinucleótido exógeno 5 puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o de forma alternativa, puede integrarse en el genoma huésped.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "medio" o "medios" incluye cualquier medio de cultivo, solución, sólido, semisólido, o soporte rígido que pueda soportar o contener cualquier célula huésped, incluyendo 10 células huésped bacterianas, células huésped de levadura, células huésped de insectos, células huésped de plantas, células huésped eucariotas, células huésped de mamíferos, células CHO, células huésped procariotas, E. coli, o células huésped de Pseudomonas, y contenidos de células. Así, el término puede abarcar un medio en el que la célula huésped haya crecido, p. ej., un medio dentro del cual la proteína se haya secretado, incluyendo un medio tanto anterior como posterior a la etapa de proliferación. El término también puede abarcar tampones o reactivos 15 que contengan lisados de célula huésped, tal como en el caso donde un heteromultímero descrito en el presente documento sea producido intracelularmente y las células huésped sean lisadas o alteradas para liberar el heteromultímero.

"Replegar", tal y como se usa en el presente documento, describe cualquier proceso, reacción o procedimiento que 20 transforme el enlace disulfido que contiene polipéptidos de un estado no plegado o plegado de forma inadecuada a una conformación plegada adecuadamente con respecto a los enlaces disulfidos.

"Coplegar", tal y como se usa en el presente documento, se refiere específicamente a procesos, reacciones o procedimientos de replegado que emplean al menos dos polipéptidos monoméricos que interactúan entre sí y 25 resultan en la transformación de polipéptidos plegados o no plegados inadecuadamente en polipéptidos naturales y plegados adecuadamente.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "vida media en suero modulado" significa el cambio positivo o negativo en la vida media circulante de un polipéptido de carga comprendido por un heteromultímero 30 descrito en este documento en relación con su forma natural. La vida media en suero se mide mediante la extracción de muestras de sangre en varios puntos temporales después de la administración de heteromultímero, y la determinación de la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración de suero con el tiempo permite un cálculo de la vida media en suero. La vida media en suero aumentada es deseablemente de aproximadamente el doble, aunque un aumento menor podría ser útil, por ejemplo, cuando permita un régimen 35 de dosificación satisfactoria o evite un efecto tóxico. En algunas realizaciones, el aumento es al menos triple, al menos aproximadamente el cuádruple, al menos aproximadamente el quíntuple, o al menos aproximadamente diez veces más.

La expresión "vida media terapéutica modulada", tal como se usa en el presente documento, significa el cambio 40 positivo o negativo en la vida media de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de carga comprendido por un heteromultímero descrito en este documento en relación con su forma no modificada. La vida media terapéutica se cuantifica mediante la medición de las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en varios puntos temporales tras la administración. La vida media terapéutica aumentada permite deseablemente un régimen de dosificación particularmente beneficioso, una dosis total particularmente beneficiosa, 45 o bien evita un efecto indeseado. En algunas realizaciones, la vida media terapéutica aumentada resulta a partir de potencia aumentada, una unión aumentada o disminuida de la molécula modificada a su diana, la descomposición aumentada o disminuida de la molécula a través de enzimas tales como proteasas, o un aumento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada o bien un aumento o disminución en la eliminación de la molécula mediada por receptor.

50

El término "aislado", cuando se aplica a una proteína o ácido nucleico, denota que la proteína o ácido nucleico está libre de al menos alguno de los componentes celulares con los que este se asocia en su estado natural, o que la proteína o ácido nucleico se ha concentrado hasta un nivel mayor que el de la concentración de su producción in vivo o in vitro. Puede estar en un estado homogéneo. Las sustancias aisladas pueden estar o bien en un estado 55 seco o semiseco o bien en una solución, que incluye, pero no se limita a, una solución acuosa. Puede ser un componente de una composición farmacéutica que comprenda vehículos y/o excipientes adicionales farmacéuticamente aceptables. La pureza y la homogeneidad se determinan normalmente mediante técnicas de análisis químico tales como electrofóresis de gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Una proteína que sea la especie predominante presente en una preparación resulta sustancialmente purificada. En 60 particular, un gen aislado se separa de los marcos de lectura abiertos que flanquean al mismo y codifican una proteína diferente a la del gen de interés. El término "purificado" denota que una proteína o ácido nucleico origina sustancialmente una banda en un gel electroforético. En particular, puede significar que la proteína o el ácido

nucleico es al menos un 85 % puro, al menos un 90 % puro, al menos un 95 % puro, al menos un 99 % o tener una mayor pureza.

El término "ácido nucleico" hace referencia a desoxirribonudeótidos, desoxirribonudeósidos, ribonudeósidos, o 5 ribonucleótidos y polímeros de los mismos ya sean en forma mono o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen nucleótidos naturales o análogos conocidos que tienen propiedades de unión semejantes a las del ácido nucleico de referencia y que son metabolizados de forma similar a los nucleótidos de origen natural. Salvo que se limite específicamente lo contrario, el término también se refiere a análogos de oligonucleótidos que incluyen APN (ácido peptidonucleico), y análogos de ADN usados en 10 tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos, y demás). Salvo que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas conservadoramente de los mismos (que incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias, además de la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codón degenerado pueden lograrse al generar secuencias en las que la tercera posición de uno o más (de todos) los codones seleccionados sea sustituida 15 por residuos de deoxinosina y/o base mezclada (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácido. Esto es, una descripción dirigida a un polipéptido se aplica 20 igual a una descripción de un péptido y a una descripción de una proteína, y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural además de a polímeros de aminoácido en los que uno o más residuos de aminoácido representan un aminoácido codificado de forma no natural. Tal y como se usa en este documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, que incluyen proteínas de longitud completa, donde los residuos de aminoácidos se unen mediante enlaces de péptido covalentes.

25

El término "aminoácido" se refiere tanto a aminoácidos de origen natural como de origen no natural, además de análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan de forma parecida a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos codificados de forma natural son los 20 aminoácidos habituales (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, 30 metionina, fenilalanina, pralina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina) y pirrolisina y selenocisteína. Los análogos de aminoácido hacen referencia a compuestos que poseen la misma estructura química base como un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, tal como, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido o metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (tales como, norleucina) o esqueletos de péptido modificado, pero retienen las mismas 35 estructuras básicas como un aminoácido de origen natural. Una referencia a un aminoácido incluye, por ejemplo, ácidos L-amino proteogénicos de origen natural; aminoácidos-D, aminoácidos químicamente modificados, tales como variantes y derivados de aminoácido; aminoácidos no proteogénicos de origen natural tal como p-alanina, ornitina, etc.; y compuestos sintetizados químicamente que poseen propiedades conocidas en la técnica por ser características de los aminoácidos. Algunos ejemplos de aminoácidos de origen no natural incluyen, pero no se 40 limitan a, aminoácidos a-metilo (p. ej., a-metilo alanina), aminoácidos-D, aminoácidos parecidos a la histidina (p. ej., 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homo histidina), aminoácidos que tienen un metileno extra en la cadena lateral (aminoácidos "homo"), y aminoácidos en los que un grupo funcional ácido carboxílico en la cadena lateral es sustituido por un grupo ácido sulfónico (p. ej., ácido cisteíco). La incorporación de aminoácidos no naturales, que incluyen aminoácidos no naturales sintéticos, aminoácidos sustituidos, o uno o más aminoácidos-D en las proteínas 45 de la invención presente, puede resultar ventajosa en un número de formas diversas. Los péptidos que contienen aminoácidos-D, etc., exhiben una estabilidad aumentada in vitro o in vivo comparable a la de sus homólogos que contienen aminoácidos-L. Así, la construcción de péptidos, etc., que incorpora aminoácidos-D puede ser particularmente útil cuando se desea o necesita una estabilidad intracelular mayor. Más específicamente, los péptidos-D, etc., se muestran resistentes a peptidasas y proteasas endógenas, proporcionando, así, una 50 biodisponibilidad mejorada de la molécula, además de vidas prolongadas in vivo cuando dichas propiedades son deseables. Adicionalmente, los péptidos-D, etc., no pueden procesarse eficientemente para una presentación restringida a clase II del complejo mayor de histocompatibilidad para células-T colaboradoras, y son, por consiguiente, menos propensos a inducir respuestas inmunohumorales en todo el organismo.

55 En el presente documento puede hacerse referencia a los aminoácidos bien mediante sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica (IUPAC-IUB). De igual forma, puede hacerse referencia a los nucleótidos mediante los códigos de una única letra aceptados comúnmente.

60 "Variantes modificadas conservadoramente" se aplica tanto a aminoácidos como a secuencias de ácido nucleico. Con respecto a secuencias particulares de ácido nucleico, las "variantes modificadas conservadoramente" se refieren a esos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o

cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, en secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU, todos ellos codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición donde un codón especifica una alanina, el codón puede alterarse en cualquiera de los 5 codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que constituyen una especie de variaciones modificadas conservadoramente. Toda secuencia de ácido nucleico, en el presente documento, que codifica un polipéptido también describe toda variación silenciosa posible del ácido nucleico. Cualquier experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (a excepción de AUG, que es normalmente el único codón para metionina, y TGG, que es normalmente el 10 único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Como para las secuencias de aminoácidos, cualquier experto en la materia reconocería que las sustituciones 15 individuales, deleciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o secuencia de proteínas que altera, añade, o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservadoramente" donde la alteración resulta en la deleción de un aminoácido, adición de un aminoácido, o sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente semejante. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente semejantes son conocidas por aquellos expertos en la 20 materia. Dichas variantes modificadas conservadoramente se añaden a y no excluyen las variantes polimórficas, homólogos interespecies, y los alelos de la invención.

Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente semejantes son conocidas por aquellos expertos en la materia. En los siguientes ocho grupos cada uno contiene aminoácidos que son 25 sustituciones conservadoras para uno y otro:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

30 4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y [0139] 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, p. ej., Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)

35

Los términos "idéntico" o "identidad" de porcentaje, dentro del contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. Las secuencias son "sustancialmente idénticas", si tienen un porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos que son el mismo (es decir, aproximadamente una identidad del 60 %, aproximadamente una 65 %, aproximadamente un 70 %, 40 aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, o aproximadamente un 95 % de identidad sobre una región especificada), cuando se compara y alinea para la máxima correspondencia sobre un intervalo de comparación, o una región designada como medida usando uno de los algoritmos siguientes de comparación de secuencia (u otros algoritmos disponibles para personas expertas en la materia) o mediante alineamiento manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de 45 una secuencia de prueba. La identidad puede existir sobre una región que sea, al menos, aproximadamente de 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o sobre una región que sea de 75 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o, cuando no se especifique, a través de la secuencia completa de un polinucleótido o polipéptido. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, que incluye homólogos de especies diferentes a la humana, puede obtenerse mediante un proceso que comprende las etapas de cribado de una biblioteca bajo 50 condiciones de hibridación astringentes con una sonda marcada que tiene una secuencia de polinucleótido de la invención o un fragmento de la misma, y aislamiento del ADNc de longitud completa y los clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótido. Dichas técnicas de hibridación son bien conocidas para el experto en la materia.

55 Para la comparación de secuencia, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que son comparadas las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación, las secuencias de referencia y prueba se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, de ser necesario, así como los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Pueden usarse los parámetros predeterminados del programa, o bien pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de 60 secuencia calcula entonces las identidades de secuencia de porcentaje para las secuencias de prueba relativas a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.

Tal y como se usa en el presente documento, un "intervalo de comparación" incluye la referencia a un segmento de uno cualquiera de los números de posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo que consiste de 20 a 600, normalmente aproximadamente de 50 a aproximadamente 200, más normalmente aproximadamente de 100 a aproximadamente 150 en el cual se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo 5 número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias. Los procedimientos de alineamiento de secuencias para la comparación son conocidos por aquellos expertos en la materia. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse, incluyendo, pero sin limitarse a, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, el algoritmo de homología local de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, y la búsqueda para el procedimiento de similitud de Pearson y 10 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, y por implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por alineamiento manual o inspección visual (véase, p. ej., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).

15 Un ejemplo de un algoritmo apropiado para determinar la identidad de secuencia de porcentaje, así como la similitud de secuencia, son los algoritmos BLASt y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar los análisis BLAST está disponible al público gracias al National Center for Biotechnology Information a través de la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov. Los parámetros del algoritmo BLAST, siendo W, T y X, determinan la 20 sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza de forma predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, y una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza de forma predeterminada una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y 25 una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST se ejecuta normalmente con el filtro de "complejidad baja" desactivado.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo 30 BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad según la cual podría darse una coincidencia por casualidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos que aproximadamente 0,2, o menos que aproximadamente 0,01, o menos que aproximadamente 0,001.

35

La expresión "selectivamente (o específicamente) hibridiza en" se refiere a la unión, duplexación o hibridación de una molécula solo con una secuencia particular de nucleótidos bajo condiciones de hibridación astringentes cuando la secuencia se presenta en una mezcla compleja (incluyendo, pero sin limitarse a, ADN o ARN de biblioteca o celular total).

40

La expresión "condiciones de hibridación astringentes" se refiere a la hibridación de secuencias de ADN, ARN u otros ácidos nucleicos, o combinaciones de los mismo bajo condiciones de baja intensidad iónica y alta temperatura como es conocido en la técnica. Normalmente, bajo condiciones astringentes una sonda hibridará con su subsecuencia diana en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo, pero sin limitarse a, ADN o ARN de 45 biblioteca o celular total) pero no hibridiza con otras secuencias en la mezcla compleja. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Se puede encontrar una extensa guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- -Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993).

50

Tal como se usa en el presente documento, el término "eucariota" hace referencia a organismos que pertenecen a la familia filogenética Eucarya tales como animales (incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidia, protistas, etc.

55

Como se usa en el presente documento, el término "procariota" hace referencia a organismos procariotas. Por ejemplo, un organismo no eucariota puede pertenecer a la familia filogenética Eubacteria (incluyendo, pero sin limitarse a, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), o a la familia filogenética Archaea (incluyendo, pero sin 60 limitarse a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como Haloferax volcanii y especies de Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.).

El término "sujeto", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, en algunas realizaciones un mamífero, y en otras realizaciones un humano, quien puede ser objeto de tratamiento, observación o experimentación. Un animal puede ser un animal de compañía (p. ej., perros, gatos y otros), animales de granja (p.

5 ej., vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) o un animal de laboratorio (p. ej., ratas, ratones, conejillos de Indias y similares).

El término "cantidad efectiva", tal como se usa en el presente documento, se refiere a esa cantidad de heteromultímero que es administrada, que paliará hasta cierto punto uno o más de los síntomas de la enfermedad, 10 afección o trastorno que se trata. Las composiciones que contiene el heteromultímero descrito en este documento pueden administrarse con objeto de tratamientos profilácticos, potenciadores y/o terapéuticos.

Los términos "potenciar" o "potenciando" significan aumentar o prolongar ya sea en potencia o duración un efecto deseado. Así, en relación con potenciar el efecto de agentes terapéuticos, el término "potenciar" hace referencia a la 15 capacidad de aumentar o prolongar, ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad efectivo-potenciadora", tal y como se usa en el presente documento, hace referencia a una cantidad adecuada para potenciar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Al usarlo en un paciente, las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad y curso de la enfermedad, trastorno o afección, tratamiento anterior, el estado de salud del paciente y su respuesta a los fármacos, además del juicio 20 clínico del médico que trate.

El término "modificado/a", tal y como se usa en el presente documento, hace referencia a cualquier cambio realizado en un polipéptido dado, tales como cambios en la longitud del polipéptido, la secuencia de aminoácidos, la estructura química, la modificación cotranslacional, o la modificación postranslacional de un polipéptido. El término 25 "(modificado/a)" en forma significa que los polipéptidos tratados son modificados opcionalmente, es decir, los polipéptidos objeto de análisis pueden modificarse o no modificarse.

El término "modificado postranslacionalmente" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que a dicho aminoácido después de haber sido incorporado en una cadena de polipéptidos. El término 30 abarca, a modo de ejemplo solamente, modificaciones translacionales in vivo, modificaciones cotranslacionales in vitro (tales como en un sistema de traducción de célula libre), modificaciones postranslacionales in vivo, y modificaciones postranslacionales in vitro.

El término "segmentación" se refiere una ensambladura interna y precisa de la secuencia de proteínas original que 35 resulta en "segmentos" de la secuencia de proteínas que se asocian preferencialmente como heteromultímeros para formar una cuasiproteína.

Estructura cuasinatural:

40 Con referencia a la proteína natural o su estructura, las proteínas cuasinaturales y/o las 'estructuras cuasinaturales' presentan características funcionales y estructurales semejantes a las de la proteína natural. Las proteínas son naturalmente moléculas de dinámica y muestran un conjunto de configuraciones estructurales, aunque se le atribuye una estructura natural, tal como la obtenida mediante cristalografía de rayos X. Las configuraciones estructurales alternas observadas en el conjunto de geometrías de esa proteína pueden considerarse como estructuras 45 cuasinaturales en su mutua relación o en relación con la estructura observada en el cristal. Por otro lado, las secuencias de proteínas homólogas o proteínas que pertenecen a familias estructurales comunes tienden a plegarse en geometrías estructurales semejantes. Puede considerarse que las proteínas miembro que pertenecen a esta familia han alcanzado una estructura cuasinatural en su mutua relación. Algunas de las secuencias únicas en la familia de proteínas podrían también exhibir atributos similares y, de esta forma, podrían ser referidas como 50 proteínas cuasinaturales en su mutua relación. En el caso de heteromultímeros descritos aquí que comprendan dos o más proteínas monoméricas, cada una teniendo un componente de polipéptido transportador, los polipéptidos transportadores se ensamblan para formar una estructura cuasinatural. La proteína natural de referencia en este caso es la proteína a partir de la que deriva el polipéptido transportador y la estructura natural de referencia es la estructura de la proteína a partir de la que deriva el polipéptido transportador. Se describe un caso donde dos o más 55 polipéptidos diferentes se autoensamblan para formar una estructura heteromultimérica y exhibir características funcionales semejantes a las de una proteína natural que en sí misma es una entidad monomérica. En ciertas realizaciones, se presentan segmentos de polipéptidos derivados de albúmina que se autoensamblan para formar un heteromultímero que exhibe características funcionales semejantes a las de la albúmina natural, tales como unión de FcRn y características estructurales. En ciertas realizaciones, se presentan segmentos de polipéptidos 60 derivados de transferrina que se autoensamblan para formar un heteromultímero que exhibe características funcionales y estructurales semejantes a las de la transferrina natural. En ciertas realizaciones, se presentan segmentos de polipéptidos derivados de anexina que se autoensamblan para formar un heteromultímero que exhibe

características funcionales y estructurales semejantes a las de la anexina natural. Estos heteromultímeros tienen la consideración de cuasinaturales.

Polipéptido transportador

5

Tal como se usa en el presente documento, el término "polipéptido transportador" o "péptido transportador" o "transportador" hace referencia a un polipéptido, tal que dicho polipéptido transportador es capaz de formar proteínas heteromultiméricas con otros tales polipéptidos transportadores en una solución, y donde dichas proteínas heteromultiméricas tienen una estructura cuasinatural de una proteína monomérica a partir de la que deriva al 10 menos un polipéptido transportador. En ciertas realizaciones de los heteromultímeros descritas en el presente documento, todos los polipéptidos transportadores derivan de la misma proteína de aloalbúmina o albúmina. En otras realizaciones, los heteromultímeros están formados por polipéptidos transportadores derivados de varias proteínas de aloalbúmina y albúmina.

15 En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores son segmentos de una proteína entera donde dichos segmentos son capaces de ensamblarse para formar un heteromultímero.

Albúmina

20 Tal como se usa en el presente documento, "albúmina" se refiere colectivamente a proteínas de albúmina o a una secuencia de aminoácidos, o a un segmento de albúmina o variante, que posee una o más actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas) de albúmina. En particular "albúmina" se refiere a la albúmina humana o segmentos de la misma (véase, por ejemplo, EP 201 239, EP 322 094, WO97/24445, WO95/23857) especialmente la forma madura de la albúmina humana tal como se muestra en la FIG. 1, o la albúmina de otros vertebrados, o segmentos 25 de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de los mismos. En ciertas realizaciones, la albúmina se refiere a una versión truncada de albúmina.

El término "cuasialbúmina" se refiere a una molécula de heteromultímero que tiene una estructura y/o función similar a la de la albúmina entera, y donde dicha molécula de heteromultímero está formada por el ensamblaje de dos o 30 más polipéptidos monoméricos diseñados en base a la secuencia de la albúmina entera. En ciertas realizaciones, los polipéptidos monoméricos son "segmentos" que preferencialmente se asocian como pares heteromultiméricos para formar una cuasiproteína. En algunas realizaciones, la cuasialbúmina tiene el 90 % de la actividad de la albúmina entera. En algunas realizaciones, la cuasialbúmina tiene el 75 % de la actividad de la albúmina entera. En una realización, la cuasialbúmina tiene el 50 % de la actividad de la albúmina entera. En algunas realizaciones, la 35 cuasialbúmina tiene entre el 50 y el 75 % de la actividad de la albúmina entera. En una realización, la cuasialbúmina tiene el 80 % de la actividad de la albúmina entera. En algunas realizaciones, la cuasialbúmina tiene el 90 % de la estructura de la albúmina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasialbúmina tiene el 80 % de la estructura de la albúmina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasialbúmina tiene el 70 % de la estructura de la albúmina entera tal como se 40 determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasialbúmina tiene el 50 % de la estructura de la albúmina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasialbúmina tiene entre el 50% y el 75 % de la estructura de la albúmina entera tal como se determina por modelado molecular.

Los términos albúmina sérica humana (ASH) albúmina humana (AH) se usan indistintamente en el presente 45 documento. Los términos "albúmina y albúmina sérica" son más amplios, y abarcan albúmina sérica humana (y fragmentos y variantes de la misma), además de albúmina de otras especies (y fragmentos y variantes de la misma).

En ciertas realizaciones, cada monómero basado en albúmina de las proteínas heteromultiméricas descritas en el presente documento se basa en una variante de AH normal. Cada porción de polipéptido de carga de las proteínas 50 heteromultiméricas de la invención pueden ser también variantes de las proteínas terapéuticas tal como se describe en este documento. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, donde dichos cambios no alteran sustancialmente una o más de las propiedades no inmunogénicas y de unión a ligando útiles y oncóticas de la albúmina, o el sitio activo, o el dominio activo que concede las actividades terapéuticas de las proteínas terapéuticas.

55

En ciertas realizaciones, las proteínas heteromultiméricas, descritas en el presente documento, incluyen las variantes polimórficas de origen natural de la albúmina humana, así como los fragmentos de albúmina humana, por ejemplo, aquellos fragmentos descritos en EP 322 094 (en concreto AH (Pn), donde n es de 369 a 419).

60 En ciertas realizaciones, la albúmina deriva de algunos vertebrados, especialmente de cualquier mamífero que incluye, aunque sin limitación, al humano, vaca, oveja, rata, ratón, conejo, caballo, perro o cerdo. En ciertas realizaciones, la albúmina deriva de albúminas no mamíferas que incluyen, aunque no se limitan a, la gallina y el

salmón.

La secuencia de albúmina humana es como se muestra en:

5 SEQ ID NO: 1

MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF AQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLR ETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFL KKYLYETARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEG KASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHT ECCHGDLLECADDRADLAKY1CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCTAEVENDEM PADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKT YETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNAL LVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDR VTKCCTESL VNRRPCFS ALEVDET YVPKEFN AETFTFH AD1CTLS EKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAE EGKKLVAASQAALGL

Aloalbúmina

10

La aloalbúmina es una variante genética de la albúmina. En ciertas realizaciones, la aloalbúmina es aloalbúmina humana (AAH). Las aloalbúminas que difieren en movilidad electroforética de la albúmina han sido identificadas a través de encuestas en genética de población durante el curso de electroforesis clínica, o en encuestas a donantes de sangre. Como marcadores de mutación y migración, las aloalbúminas resultan de interés para genetistas, 15 bioquímicos, y antropólogos, aunque la mayor parte de estas aloalbúminas no se asocian a ninguna enfermedad (Minchioti et al. Human Mutations 29(8), 1007-1016(2008)).

Tabla 1: Lista de sustituciones comprendidas por varias aloalbúminas en comparación con la AH de la SEQ ID NO: 1. Tanto la termoestabilidad, como la información sobre la vida media y otras aAh se proporcionan en Krogh-hansen 20 et al. Biochim Biophys Acta 1747, 81-88(2005); y WO2011051489.________________________________

Mutación: Termoestabilidad (C) (positiva=estabilizante, negativa=desestabilizante) Efecto sobre la vida media (% de cambio)

H3Y: N/A N/A

H3Q: N/A N/A

Q32Stop: N/A N/A

E60K: N/A N/A

D63N: 6,07 N/A

L66P: N/A N/A

E82K: 2,03 N/A

R114G: N/A N/A

R114Stop: N/A N/A

E119K: N/A N/A

V122E: 0,57 N/A

H128R: N/A N/A

Y140C: N/A N/A

A175Stop: N/A N/A

C177F: -1,59 N/A

R218H: N/A N/A

R218P: N/A N/A

K225Q*: -4,86 N/A

K240E: N/A N/A

E244Stop: N/A N/A

Q268R: N/A N/A

D269G: 3,67 N/A

K276N: 4,87 N/A

K313N: -7,16 N/A

D314G: -0,38 N/A

D314V: N/A N/A

N318K: N/A N/A

A320T y -1R: N/A 6,16

E321K: 1,42 N/A

E333K: -2,56 N/A

E354K: N/A N/A

E358K: N/A N/A

K359K: -6,56 N/A

D365H: 0,89 N/A

D365V: N/A N/A

E368G: N/A N/A

K372E: N/A N/A

D375N: N/A N/A

D375H: -0,09 N/A

E376K: N/A N/A

E376Q: N/A N/A

E382K: N/A N/A

Q385Stop: N/A N/A

Y401Stop: N/A N/A

R410C: N/A N/A

E479K: N/A N/A

D494N: N/A 0,84

E501K: 0,13 N/A

E505K: 1,87 N/A

I513N: N/A N/A

V533M: N/A N/A

K536E: N/A N/A

K541E: 6,12 N/A

D550G: N/A N/A

D550A: N/A N/A

K560E: 0,70 N/A

D563N: 4,17 N/A

E565K: N/A N/A

E570K: -6,53 N/A

K573E: 2,08 2,7

K574N: N/A N/A

InserciónL575(TCCCKSSCLR LITSHLKASQPTMRIRERK): -5,30 N/A

Marco de lectura desplazado después de 567; Detención en 582: N/A -5,7 %

Marco de lectura desplazado después de 572; Detención en 578: N/A -8,9 %

Anexina:

Tal como se usa en el presente documento, "anexina" se refiere a un grupo de proteínas celulares halladas en los 5 organismos eucariotas. La anexina también es conocida como lipocortina. Tal como se usa en el presente documento, "anexina" puede referirse a proteínas específicas de anexina tales como "anexina A1," "anexina A2," y "anexina A5." Las anexinas se caracterizan por su capacidad dependiente de calcio para unir fosfolípidos cargados negativamente (es decir, paredes de membrana). Las anexinas se caracterizan por un armazón de proteína de repetición limitado a entre 30 y 50 kDa en tamaño con una distribución del tejido bastante ubicua. La estructura 10 básica de una anexina se compone de dos dominios: una región “central" de terminal C estructuralmente conservada y un dominio de terminal N divergente. La región central se une a la membrana celular fosfolípida en

una forma dependiente de Ca2+. La región de terminal N se une a las proteínas citoplasmáticas. Las anexinas son importantes en varios procesos fisiológicos y celulares y, además, proporcionan un armazón membranoso. El centro del terminal C está compuesto de cuatro repeticiones de anexina. La anexina se caracteriza por su naturaleza flexible semejante a la repetición que influye en sus capacidades intrínsecas de detección de membrana. Por 5 ejemplo, la afinidad hacia biomembranas específicas puede controlarse mediante el número de repeticiones. Con su característica de detección fosfolípida, la anexina puede ser útil para detectar/dirigirse a las uniones intestinales durante la administración de un fármaco. Otra aplicación potencial de una anexina reside en su orientación a uniones estrechas y a la región Zonula occludens (ZO-1), que es conocida por ser particularmente difícil de atravesar en tratamientos con proteínas mayores, impidiendo significativamente la absorción del fármaco.

10

El término "cuasianexina" se refiere a una molécula de heteromultímero que tiene una estructura y/o función similar a la de la anexina entera, y donde dicha molécula de heteromultímero está formada por el ensamblaje de dos o más polipéptidos monoméricos diseñados en base a la secuencia de la anexina entera. En ciertas realizaciones, los polipéptidos monoméricos son "segmentos" que preferencialmente se asocian como pares heteromultiméricos para 15 formar una cuasiproteína. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 90 % de la actividad de la anexina entera. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 75 % de la actividad de la anexina entera. En una realización, la cuasianexina tiene el 50 % de la actividad de la anexina entera. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 50 y el 75 % de la actividad de la anexina entera. En una realización, la cuasianexina tiene el 80 % de la actividad de la anexina entera. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 90 % de la estructura 20 de la anexina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 80 % de la estructura de la anexina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 70 % de la estructura de la anexina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 50 % de la estructura de la anexina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasianexina tiene el 50% y el 75 % de 25 la estructura de la anexina entera tal como se determina por modelado molecular.

La secuencia de anexina A2 de tipo silvestre humana es como se muestra en:

SEQ ID NO: 14 30

| GSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDTLTKRNNAQRQQIKAAYLQE

TGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILA

SRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNED

LADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNK

VLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEI

DMNDIKAFYQRMYGISLCQAILDETKGDYEK1LVALCGGN

Transferrina:

35 Las transferrinas son proteínas monoméricas de aproximadamente 76 kDa de peso molecular presentes en todos los vertebrados y funcionan como una proteína transportadora y de unión al hierro. La transferrina humana recombinante y sus fusiones se tienen en cuenta para el tratamiento de diversas enfermedades que incluyen talasemia, atransferrinemia, degeneración macular asociada a la edad, diabetes de tipo 2, durante el trasplante de células madre y en el tratamiento de enfermedades infecciosas agudas causadas por la bacteria del ántrax. La 40 transferrina resulta estable en un entorno gastrointestinal y, además, un número de estudios han demostrado que los conjugados intactos de proteína-transferrina pueden administrarse por vía oral y permanecer bioactivos.

El término "cuasitransferrina" se refiere a una molécula de heteromultímero que tiene una estructura y/o función similar a la de la transferrina entera, y donde dicha molécula de heteromultímero está formada por el ensamblaje de 45 dos o más polipéptidos monoméricos diseñados en base a la secuencia de la transferrina entera. En ciertas realizaciones, los polipéptidos monoméricos son "segmentos" que preferencialmente se asocian como pares heteromultiméricos para formar una cuasiproteína. En algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene el 90 % de la actividad de la transferrina entera. En algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene el 75 % de la actividad de la transferrina entera. En una realización, la cuasitransferrina tiene el 50 % de la actividad de la transferrina entera. En 50 algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene entre el 50 y el 75 % de la actividad de la transferrina entera. En una realización, la cuasitransferrina tiene el 80 % de la actividad de la transferrina entera. En algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene el 90 % de la estructura de la transferrina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene el 80% de la estructura de la transferrina entera tal

como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene el 70 % de la estructura de la transferrina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene el 50 % de la estructura de la transferrina entera tal como se determina por modelado molecular. En algunas realizaciones, la cuasitransferrina tiene entre el 50% y el 75 % de la estructura de la 5 transferrina entera tal como se determina por modelado molecular.

La secuencia de transferrina humana de tipo silvestre es como se muestra en:

SEQ ID NO: 19

10

MRLAVGALLV CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEF FéATKCQS FRDHMfííjVJP SlXíL'SVAt’VK. KASYLDCJRA IAANEADAVT LDAGLVYÜAY LAPNNLKPVV AEFYGSKEDPQTFYYAVAW KKDSGFQ^Q Í.RGKKSOITC LGRSAGWN1P IGLLYt’Dl.PE FRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST r.MQYFGYSÜA FKCLKDGAGD VAFVKHSTTFENLANEADRD QYELLCLDNT RKPVD6YKDC HLAQVPSHTV VARSMGGKBO LIWELLNQAQ EHFGKOKSKE FQLFSSPHGK DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMY1GYEYVT AIRTnLREGTC PEAPTDECKP VKWCALSHHE KLKCDEWSVN SVÜKIECVSA ETTEDClAKi MNGEADAMSL DGGPVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV VKKSASDLTW DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKI NHCRFDEFF& EGCAPGSKKD SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVElíGDVA FVKHQTVPQN TGGKNPDPWA KISLNEKDYEL LC LDGTRKPV EEYANGHLAR APNHAWTRK DKEACVHKIL RQQQHLFGSM VTDCSGNFCL FRSETKDLLF RJJDTVCLAKL HDRNTYEKYL GEEYVRAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP

Molécula de carga:

15 Un heteromultímero descrito en el presente documento comprende monómeros que comprenden al menos una molécula de carga, y al menos un polipéptido transportador, dichos molécula de carga y polipéptido transportador se asocian mutuamente, por medio de, pero no limitándose a, fusión genética o conjugación química. Tal como se describe en el presente documento, al menos una molécula de carga puede ser un agente terapéutico. Tal como se describe en el presente documento, la molécula de carga puede ser una toxina. Tal como se describe en el presente 20 documento, la molécula de carga puede ser un antígeno, o análogos del mismo. Tal como se describe en el presente documento, la molécula de carga puede ser un producto natural, análogo, o profármaco del mismo. Tal como se describe en el presente documento, la molécula de carga puede ser un agente terapéutico tal como una citotoxina, p. ej., un agente citostático o citocidal, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, p. ej., emisores alfa tales como, por ejemplo, 213Bi. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es 25 perjudicial para las células. Algunos ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetino, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homológos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 30 citarabina, 5-fluorouracilo decarbacina), agentes alquilantes [p. ej., mecloretamina, tioepa cloranbucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamino platino (II) (DDP) cisplatino], antraciclinas [p. ej., daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina], antibióticos [p. ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)], y agentes antimióticos (p. ej., vincristina y vinblastina).

35

En ciertas realizaciones, un heteromultímero descrito en el presente documento comprende proteínas monoméricas que comprenden al menos un polipéptido de carga, o fragmentos o variantes del mismo, y al menos un polipéptido transportador, dichos polipéptido de carga y polipéptido transportador se asocian mutuamente, por medio de, pero no limitándose a, fusión genética o conjugación química.

Tal y como se usa en el presente documento, "polipéptido de carga" se refiere a proteínas, polipéptidos, anticuerpos, péptidos o fragmentos o variantes de los mismos, que tienen una o más actividades biológicas y/o terapéuticas. Los polipéptidos de carga abarcados por la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas, polipéptidos, péptidos, 5 anticuerpos, sustratos o ligandos a biológicos y proteínas diana relevantes terapéuticamente. (En este documento, los términos péptidos, proteínas y polipéptidos se utilizan de forma intercambiable) Específicamente, el término "polipéptido de carga" abarca anticuerpos y fragmentos y variantes de los mismos. Así, un heteromultímero descrito en el presente documento puede contener al menos un fragmento o variante de un polipéptido de carga, y/o al menos un fragmento o variante de un anticuerpo. Adicionalmente, en ciertas realizaciones, el término "polipéptido de 10 carga" se refiere al correlato de origen natural o endógeno de un polipéptido de carga.

Como ejemplo no limitante, una "biomolécula de carga" es una biomolécula tal como, pero sin limitación a, una proteína, ADN o ARN que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, afección o trastorno. Como ejemplo de "polipéptido de carga" existe uno que se une específicamente a tipo celular específico [normal (p. ej., linfocitos) o 15 anormal (p. ej., células cancerígenas)] y por consiguiente puede usarse para dirigir un compuesto (fármaco o agente citotóxico) a ese tipo celular específicamente.

En otro ejemplo no limitante descrito en este documento, una "molécula de carga" es una molécula que posee una actividad biológica y, en particular, siendo esta actividad biológica útil para tratar, prevenir o mejorar una 20 enfermedad. Una lista no exhaustiva de las actividades biológicas que puede poseer una molécula de carga, por ejemplo un polipéptido de carga, incluye, la potenciación de la respuesta inmunitaria, el fomento de angiogénesis, la inhibición de angiogénesis, la regulación de las funciones hematopoyéticas, la estimulación del crecimiento de nervios, la potenciación de una respuesta inmunitaria, la inhibición de una respuesta inmunitaria, o una cualquiera o más de las actividades biológicas descritas en el presente documento.

25

Los polipéptidos de carga que corresponden a una porción de polipéptido de carga de una proteína de heteromultímero descrita en el presente documento, tal como superficie celular y proteínas de secreción, son a menudo modificados, por la unión de uno o más grupos oligosacáridos. La modificación, referida como glicosilación, puede afectar seriamente a las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante para la estabilidad, 30 secreción y localización de la proteína. La glicosilación se da en ubicaciones específicas por todo el esqueleto del polipéptido. Existen normalmente dos tipos principales de glicosilación: la glicosilación caracterizada por los oligosacáridos unidos a O, que están unidos a residuos de treonina o serina; y la glucosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a K, que están unidos a residuos de asparagina en una secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido, a excepción de prolina. El ácido n-acetilneuramínico (también conocido como ácido 35 siálico) es normalmente el residuo del terminal en ambos oligosacáridos unidos a B y unidos a O. Variables tales como la estructura de la proteína y el tipo celular influyen en el número y naturaleza de las unidades de carbohidratos dentro de las cadenas en diferentes sitios de glicosilación. Los isómeros de glicosilación también son comunes en el mismo sitio dentro de un tipo celular dado.

40 La tabla 2 proporciona una lista no exhaustiva de polipéptidos de carga que corresponden a la porción de polipéptido de carga de un heteromultímero descrito en el presente documento. La columna "polipéptido de carga" describe las moléculas de polipéptido de carga seguidas por un paréntesis que contiene la denominación de marca y científica que comprenden, o alternativamente consiste en, esa molécula de polipéptido de carga o un fragmento o variante del mismo. En una realización, la molécula de carga es una molécula que se une a una proteína descrita en la 45 columna "polipéptido de carga", o en Zhu et al. (Nucleic Acids Res. 38(1), D787-D791 (2009)); Wishart et al. (Nucleic Acids Res 36, D901-D906 (2008)); Ahmed et al. (Nucleic Acids Res 39, D960-D967 (2011)), o una proteína que pertenece a la clase de moléculas diana terapéuticas.

El "polipéptido de carga" tal y como se usa en el presente documento puede referirse o bien a una molécula 50 individual de polipéptido de carga (tal como se define por la secuencia de aminoácidos obtenible de los números CAS y de acceso a Genbank), o bien al grupo completo de polipéptidos de carga asociado con una molécula dada de polipéptidos de carga descrita en esta columna, o, también, a un polipéptido de carga que se une a una molécula de polipéptido descrita en esta columna.

55 Tabla 2: Lista no exhaustiva de polipéptidos de carga que corresponden a la porción de polipéptido de carga de un heteromultímero

Polipéptido de carga: Actividad biológica Ensayo de actividad ilustrativo Indicación

EPO (Eritropoyetina; Epoetina alfa; Epoetina beta; Eritropoyetina activada por genes; Darbepoetina-alfa; NESP; Epogen; Procrit; Eprex; Erypo; Espo; Epoimmun; EPOGIN; NEORECORMON; HEMOLINK; Dynepo; ARANESP).: Estimula la diferenciación celular de las células madre de la médula ósea en una etapa inicial de la eritropoyesis; acelera la proliferación y maduración de las células diferenciadoras terminales en eritrocitos; y modula el nivel de eritrocitos circulantes. Ensayo de proliferación celular usando una línea celular TF-1 eritroleucémica (Cell proliferation assay using a erythroleukemic cell line TF-1). (Kitamura et al. 1989 J. Cell. Physiol. 140: 323). Anemia; anemia en enfermedad renal; anemia en pacientes oncológicos, trastornos hemorrágicos; insuficiencia renal crónica; insuficiencia renal crónica en pacientes con prediálisis; enfermedad renal; enfermedad renal en etapa terminal; enfermedad renal en etapa terminal en pacientes con diálisis; quimioterapia; quimioterapia en pacientes con cáncer; anemia en pacientes con el VIH tratados con Zidovudina; anemia en pacientes con el VIH; anemia en bebés prematuros; pacientes quirúrgicos (pre- y/o postoperatorios); pacientes quirúrgicos (pre- y/o postoperatorios) que padecen anemia; pacientes quirúrgicos (pre- y/o postoperatorios) que se someten a cirugía opcional; pacientes quirúrgicos (pre- y/o postoperatorios) que se someten a cirugía no cardíaca opcional; pacientes quirúrgicos (pre- y/o postoperatorios) que se someten a cirugía no cardíaca, no vascular y opcional; pacientes quirúrgicos (pre- y/o postoperatorios) que se someten a cirugía cardíaca y/o vascular; anemia aplásica; anemia refractaria; anemia en enfermedad inflamatoria intestinal; anemia refractaria en enfermedad inflamatoria intestinal; elusión de transfusión; elusión de transfusión para pacientes quirúrgicos; elusión de transfusión para pacientes quirúrgicos con opción; elusión de transfusión para pacientes quirúrgicos ortopédicos con opción; pacientes que quieren aumentar la cantidad de eritrocitos.

G-CSF (Factor estimulante de colonias de granulocitos; Granulokine; KRN 8601; Filgrastim; Lenograstim; Meograstim; Nartograstim; Neupogen; NOPIA; Gran; GRANOCYTE; Granulokine; Neutrogin; Neu-up; Neutromax): Estimula la proliferación y la diferenciación de las células progenitoras para granulocitos y monocitos- macrófagos. Proliferación de células NFS-60 murinas (Proliferation of murine NFS-60 cells) (Weinstein et al., Proc Natl Acad Sei USA 1986; 83, pp 5010-4). Quimioprotección; complemento a la quimioterapia; trastornos inflamatorios; cáncer; leucemia; leucemia mielocítica; neutropenia; neutropenias primarias (p. ej., síndrome de Kostmann); neutropenia secundaria; prevención de neutropenia; prevención y tratamiento de la neutropenia en pacientes infectados con el VIH; prevención y tratamiento de la neutropenia asociada a la quimioterapia; infecciones asociadas con neutropenias; mielodisplasia; trastornos autoinmunitarios; psoriasis; movilización de células progenitoras hematopoyéticas; cicatrización de heridas; enfermedad autoinmunitaria; trasplantes; trasplantes de médula ósea; leucemia mielógena aguda; linfoma; linfoma no hodgkiniano; leucemia linfoblástica aguda; enfermedad de Hodgkin; recuperación mieloide acelerada; glucogenosis.

GM-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos; rhuGM- CSF; BI 61012; Prokine; Molgramostim; Sargramostim; fusión de GM- CSF/IL 3; Milodistim; Leucotropin; PROKINE; LEUKOMAX; Interberin; Leukine; Leukine Líquido; Pixykine): Regula la diferenciación de células hematopoyéticas, la expresión génica, su crecimiento y función. Ensayo: Testa, N. G., et al., Ensayos para factores de crecimiento hematopoyético ("Assays for hematopoietic growth factors.") Balkwill FR (edt) Cytokines, A practical Approach, pp 229-44; IRL Press Oxford 1991. Trastornos de la médula ósea; trasplante de médula ósea; quimioprotección; hepatitis C; infecciones de VIH; cáncer; cáncer de pulmón; melanoma; melanoma maligno; complejo micobacterium avium; micosis; leucemia; leucemia mieloide; infecciones; infecciones neonatales; neutropenia; mucositis; mucositis oral; cáncer de próstata; movilización de células madre; complemento a vacuna; úlceras (tales como diabéticas, de estasis venosa o úlceras por presión): prevención de neutropenia; leucemia mielógena aguda; movilización de células progenitoras hematopoyéticas; linfoma; linfoma no hodgkiniano; leucemia linfoblástica aguda; enfermedad de Hodgkin; recuperación mieloide acelerada; rechazo de trasplante; rechazo de xenotrasplante.

Hormona de crecimiento humana (Pegvisamont; Somatrem; Somatropin; TROVERT; PROTROPIN; BIO- TROPIN; HUMATROPE; NUTROPIN; NUTROPIN AQ; NUTROPHIN; NORDITROPIN; GENOTROPIN; SAIZEN; SEROSTIM): Se une a dos moléculas de la GHR e induce la transducción de la señal a través de la dimerización del receptor Ensayo de proliferación Ba/F3-hGHR, bioensayo novedoso y específico para la hormona de crecimiento humana en suero. J Clin Endocrinol Metab 2000 Nov; 85(11): 4274-9 Bioensayo en tibia e inmunoensayo de hormona de crecimiento (GH) en plasma, Appl Physiol 2000 Dec; 89(6): 21748 Proliferación mediada por células mediadas del receptor de la hormona de crecimiento (hGH), Growth Horm IGF Res 2000 Oct; 10 (5): 24855 International standard for growth hormone, Horm Res 1999; 51 Suppl 1: 712 Acromegalia; retraso del crecimiento; reemplazo de la hormona de crecimiento; deficiencia de hormona de crecimiento; deficiencia de la hormona de crecimiento pediátrica; deficiencia de la hormona de crecimiento en adultos; deficiencia de la hormona de crecimiento idiopática; retardo del crecimiento; síndrome de Prader-Willi; síndrome de Prader-Willi en niños de 2 años o mayores; deficiencias de crecimiento; retraso del crecimiento asociado con insuficiencia renal crónica; osteoporosis; osteoporosis postmenopáusica; osteopenia, osteoclastogénesis; quemaduras; Caquexia; caquexia por cáncer; enanismo; trastornos metabólicos; obesidad; insuficiencia renal; síndrome de Turner; fibromialgia; tratamiento por fractura; debilidad; emaciación



: por SIDA; emaciación muscular; baja estatura; agentes de diagnóstico; infertilidad femenina; lipodistrofia.

Insulina (Insulina humana; Insulina aspart; Insulina Glargine; Insulina lispro; Lys-B28 Pro- B29; lyspro; LY 275585; diarginilinsulina; Des- B26- B30-insulina- B25- amida; Insulina detemir; LABI; NOVOLIN; NOVORAPID; HUMULIN; NOVOMIX30; VELOSULIN; NOVOLOG; LANTUS; ILETIN; HUMALOG; MACRULIN; EXUBRA; INSUMAN; ORALIN; ORALGEN; HUMAHALE; HUMAHALIN): Estimula la captación de glucosa y favorece la glicogénesis y la lipogénesis. La actividad de la insulina puede analizarse mediante un ensayo in vitro de captación de [3-H]- glucosa. (J Biol Chem 1999 Oct 22; 274(43): 30864-30873). Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

Interferón alfa (Interferón alfa-2b; recombinante; Interferón alfa- n1; Interferón alfa- n3; Peginterferón alfa- 2b; Ribavirin e interferón alfa- 2b; Interferón alfacon-1; interferón consenso; YM 643; CIFN; interferón-alfa consenso; interferón alfa metionilo consenso; interferón consenso recombinante; CGP 35269; RO 253036; RO 258310; INTRON A; PEG- INTRON; OIF; OMNIFERON; PEG- OMNIFERON; VELDONA; PEG- REBETRON; ROFERONA; WELLFERON; ALFERON N/LDO; REBETRON; ALTEMOL; VIRAFERON PEG; PEGASYS; VIRAFERON; VIRAFON; AMPLIGEN; INFERGEN; INFAREX; ORAGEN): Confiere una gama de respuestas celulares que incluyen actividades inmunomoduladoras, antitumorales, antiproliferativas y antivirales; estimula la producción de dos enzimas: una proteína quinasa y una sintetasa oligoadenilata. Ensayo antiviral: Rubinstein S, Familletti PC, Pestka S. (1981) Ensayo conveniente para interferones. J. Virol. 37(2): 755-8; Ensayo de antiproliferación: Gao Y, et al.(1999) Sensibilidad de una línea de tumor positivo del virus epstein-barr, Daudi, a interferón alfa correlaciona con la expresión de un transcrito viral GC-Rich. Mol Cell Biol. 19(11): 7305-13. Infecciones virales; infecciones por VIH; hepatitis; hepatitis crónica; hepatitis B; Hepatitis B crónica; hepatitis C; hepatitis C crónica; Hepatitis D; hepatitis D crónica; virus del papiloma humano; herpes Infección de virus simplex; condiloma acuminado externo; VIH; infección por VIH; oncología; cáncer; tumores sólidos; melanoma; melanoma maligno; cáncer renal (p. ej., carcinoma celular renal); cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas o cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de colon; cáncer de mama; cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga; cáncer gástrico; sarcoma; sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA; linfoma; linfoma de células-T; linfoma cutáneo de células-T; linfoma no hodgkiniano; cáncer cerebral; glioma; glioblastoma multiforme; displasia cervical; leucemia; preleucemia; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; neoplasias hematológicas;



: trastornos hematológicos; mieloma múltiple; infecciones bacterianas; quimioprotección; trombocitopenia; esclerosis múltiple; fibrosis pulmonar; degeneración macular asociada a la edad; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; artritis reumatoide; colitis ulcerosa; osteoporosis; osteopenia; osteoclastogénesis; fibromialgia; síndrome de Sjogren; síndrome de fatiga crónica; fiebre; fiebre hemorrágica; fiebres hemorrágicas virales; hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

Calcitonina [calcitonina de salmón (salcatonina); híbrido de calcitonina de salmón y humana; Forcaltonina; Fortical; calcitonina; Calcitonina Almirall; Calcitonina Hubber; Calcimar; Calsynar; Calogen; Miacalcic; Miacalcin; SB205614; Macritonin; Cibacalcin; Cibacalcina; Cibacalcine; Salmocalcin; PowderJect Calcitonin] (CAS-21215-62-3): Regula los niveles de calcio y fosfato en suero; provoca una reducción del calcio en suero -un efecto opuesto al de la hormona paratiroide humana. Bioensayo en ratas hipocalcémicas, ensayo de reabsorción de fosita y ensayo de reabsorción de hueso, ensayo de unión a receptor CT (Hypocalcemic Rat Bioassay, bone resorbing assay and the pit assay, CT receptor binding assay, CAMP stimulation assay): J Bone Miner Res 1999 Aug; 14(8): 1425-31 Trastornos óseos; prevención de fracturas; hipercalcemia; hipercalcemia maligna; osteoporosis; enfermedad de Paget; osteopenia; osteoclastogénesis; osteólisis; osteomielitis; osteonecrosis; pérdida ósea periodontal; osteoartritis; artritis reumatoide; osteoporosis; enfermedad ósea metastásica, lítica o periodontal; inhibición de la diferenciación osteoclástica; trastornos óseos; regeneración y curación ósea.

Interferón beta (Interferón beta-1a; Interferón beta 1b; Interferón- beta-serina; SH 579; ZK 157046; BCDF; beta-2 IF; Interferón- beta-2; rhIL- 6; SJ0031; DL 8234; FERON; IFNbeta; BETASERON; AVONEX; REBIF; BETAFERON; SIGOSIX): Modula la expresión del antígeno MHC, la actividad de las células NK y la producción del IFNg, además de la producción de IL12 en monocitos. Ensayo antiviral: Rubinstein S, Familletti PC, Pestka S. (1981) Ensayo conveniente para interferones. J. Virol. 37(2): 755-8; ensayo de antiproliferación: Gao Y, et al. (1999) La sensibilidad a la línea de tumor positivo del virus epstein-barr, Daudi, al interferón alfa correlaciona con la expresión del transcrito viral GC-Rich. Mol Cell Biol. 19(11): 7305-13. Esclerosis múltiple; oncología; cáncer, tumores sólidos; melanoma; melanoma maligno; cáncer renal (p. ej., carcinoma celular renal); cáncer de pulmón (p. ej., carcinoma pulmonar de células no pequeñas o cáncer pulmonar de células pequeñas); cáncer de colon; cáncer de mama; cáncer dehígado; cáncer de próstata; cáncer de vejiga; cáncer gástrico; sarcoma; sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA; linfoma; linfoma de células-T; linfoma cutáneo de células-T; linfoma no hodgkiniano; cáncer cerebral; glioma; glioblastoma multiforme; displasia cervical; leucemia; preleucemia; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; neoplasias hematológicas; trastornos hematológicos; mieloma múltiple; infecciones bacterianas; quimioprotección; trombocitopenia; infecciones virales; infecciones por VIH; hepatitis; hepatitis crónica; hepatitis B; hepatitis B crónica; hepatitis C; hepatitis C crónica; Hepatitis D; hepatitis D crónica; virus del papiloma humano; herpes; infección de virus simplex; condiloma acuminado externo; VIH; infección por VIH; fibrosis pulmonar; degeneración macular asociada a la edad; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; artritis reumatoide; colitis ulcerosa; osteoporosis; osteopenia; osteoclastogénesis; fibromialgia; síndrome de Sjogren; síndrome de fatiga crónica; fiebre; fiebre hemorrágica; fiebres hemorrágicas virales; hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina



: (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

Factor liberador de hormona de crecimiento humana; hormona liberadora de la hormona de crecimiento (Sermorelin acetate; Pralmorelin; Somatorelin; Somatoliberin; Geref; Gerel; Groliberin): Actúa en la adenohipófisis para estimular la producción y secreción de la hormona de crecimiento y ejerce un efecto trófico en la glándula. Los péptidos liberadores de hormona de crecimiento (GHRP) son conocidos por liberar hormona de crecimiento (GH) in vivo e in vitro mediante la acción directa en los receptores de las células adenohipofisarias. La actividad biológica puede medirse en las líneas celulares que expresan el receptor del factor de liberación de hormona de crecimiento (Mol Endocrinol 1992 Oct; 6(10): 1734-44 Molecular Endocrinology, Vol 7, 77-84). Acromegalia; retraso del crecimiento; reemplazo de la hormona de crecimiento; deficiencia de hormona de crecimiento; deficiencia de la hormona de crecimiento pediátrica; deficiencia de la hormona de crecimiento en adultos; deficiencia de la hormona de crecimiento idiopática; retardo del crecimiento; síndrome de Prader-Willi; síndrome de Prader-Willi en niños de 2 años o mayores; deficiencias de crecimiento; retraso del crecimiento asociado con insuficiencia renal crónica; osteoporosis; osteoporosis postmenopáusica; osteopenia, osteoclastogénesis; osteoporosis postmenopáusica; quemaduras; caquexia; caquexia por cáncer; enanismo; trastornos metabólicos; obesidad; insuficiencia renal; síndrome de Turner; fibromialgia; tratamiento por fractura; debilidad; emaciación por SIDA; emaciación muscular; baja estatura; agentes de diagnóstico; infertilidad femenina; lipodistrofia.

IL-2 (Aldesleucina; toxina de fusión de interleucina- 2; factor de crecimiento de células-T; PROLEUKIN; IMMUNACE; CELEUK; ONCOLIPIN 2; MACROLIN): Fomenta el crecimiento de las células B y T y aumenta la actividad asesina de las células NK y CTL. Ensayo de proliferación de células-T: "Actividad biológica de la interleucina-2 recombinante humana producida en Escherichia coli." Science 223: 14121415, 1984. Ensayo de citotoxicidad de linfocito citolítico natural (NK) y CTL "Control de homeostasis de las células-T de memoria CD8+ mediante su oposición a citoquinas. Science 288: 675-678, 2000; CTLL-2 Proliferation: Gillis et al. (1978) J. Immunol. 120, 2027 Cáncer; tumores sólidos; carcinoma de células renales metastásico; melanoma metastásico; melanoma maligno; melanoma; carcinoma de células renales; cáncer renal; cáncer de pulmón (p. ej., cáncer pulmonar de células no pequeñas o cáncer pulmonar de células pequeñas), cáncer de colon; cáncer de mama; cáncer de hígado, leucemia; preleucemia; neoplasias hematológicas; trastornos hematológicos; leucemia mieloide aguda; melanoma; melanoma maligno; linfoma no hodgkiniano; cáncer de ovarios; cáncer de próstata; cáncer cerebral; glioma; glioblastoma multiforme; hepatitis hepatitis C; linfoma; infección por VIH (SIDA); trastornos inflamatorios intestinales; sarcoma de Kaposi; esclerosis múltiple; artritis; artritis reumatoide; rechazo de trasplante; diabetes; diabetes mellitus tipo 1; diabetes tipo 2.

Hormona paratiroide; parathyrin (PTH; Ostabolin; ALXl-11; hPTH 1-34; LY 333334; MN 10T; hormona paratiroide (1- 31); FORTEO;PARATHAR): Actúa en conjunción con la calcitonina para controlar el metabolismo del fosfato y calcio; eleva el nivel de calcio en sangre; estimula la actividad de los osteocitos; mejora la absorción Ca+/Pi del intestino delgado en la sangre; fomenta la reabsorción de Ca+ e inhibe la de Pi por los túbulos renales. Estimulación de adenilil ciclasa en células de osteosarcoma en ratas, modelo de ratas ovariectomizadas de osteoporosis (Adenylyl cyclase stimulation in rat osteosarcoma cells, ovariectomized rat model of osteoporosis): IUBMB Life 2000 Feb; 49(2): 131-5 Trastornos óseos; prevención de fracturas; hipercalcemia; hipercalcemia maligna; osteoporosis; enfermedad de Paget; osteopenia; osteoclastogénesis; osteólisis; osteomielitis; osteonecrosis; pérdida ósea periodontal; osteoartritis; artritis reumatoide; osteoporosis; enfermedad ósea metastásica, lítica o periodontal; inhibición de la diferenciación osteoclástica; trastornos óseos; regeneración y curación ósea.

Resistin: Media en la resistencia a insulina en la diabetes tipo 2; inhibe la captación de glucosa estimulada por insulina. La capacidad de resistin para influir en la diabetes tipo 2, puede determinarse con ensayos conocidos en la técnica: Pontoglio et al., J Clin Invest 1998 May 15; 101(10): 221522. Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

TR6 (DcR3; receptor 3 de señuelo; FAStR): Inhibe la apoptosis mediada por el ligando Fas y AIM-2 (TL5, LIGHT). La apoptosis celular puede medirse mediante tinción de anexina, tinción TUNEL, y con la medición de los niveles de caspasas. La inhibición del crecimiento celular también puede medirse directamente, por ejemplo, con tinción ALOMAR Blue. Referencias del ensayo: cytotoxicity assay on human fibrosarcoma (Epsevik y Nissen- Meyer, 1986, J. Immunol. methods). Trastornos inducidos por LIGHT o ligando Fas: hepatitis; insuficiencia renal (incluyendo insuficiencia hepática fulminante); enfermedad de injerto contra huésped; rechazo de injerto; síndrome mielodisplásico; insuficiencia renal; diabetes mellitus dependiente de insulina; artritis reumatoide; enfermedad intestinal inflamatoria; enfermedad autoinmunitaria; necrólisis epidérmica tóxica; esclerosis múltiple.

DeCAF [D- SLAM; proteína de membrana semejante a BCM; BLAME (activador de linfocito B expresado por macrófagos)]x: Inhibe la proliferación y diferenciación de las células-B; antagonizan la actividad de BLyS. La actividad de DeCAF puede determinarse mediante ensayos usados en la técnica, tales como, por ejemplo, aquellos descritos en los ejemplos 32-33 de la publicación internacional n.° WO0111046. Trastornos mediados por células B y/o T; inmunodeficiencia (p. ej., inmunodeficiencia variable común, deficiencia de IgA selectiva)

BLyS (estimulador de linfocitos B Neutrokine alfa; TL7; BAFF; TALL-1; THANK; BLyS radiomarcado): Promueve la proliferación, diferenciación y supervivencia de las células-B; promueve la producción de inmunoglobulina por las células-B. La actividad de BLyS puede determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el ensayo de proliferación coestimuladora y otros ensayos descritos por Moore et al., 1999, Science, 285(5425): 260- 3. Trastornos inmunológicos mediados por células-T y/o células-B, en particular trastornos del sistema inmunológico asociados con bajo recuento de células-B o baja inmunoglobulina sérica; inmunodeficiencia (p. ej., inmunodeficiencia variable común, deficiencia de IgA selectiva). Formas radiomarcadas: linfoma, linfoma no hodgkiniano, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple.

Anticuerpo de cadena única Anti-BLyS (scFvl116A01, scFvl050B11, scFvl006D08) y otros.: Agoniza o antagoniza la actividad de BLyS. La actividad de antagonista o agonista de BLyS puede determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, una versión modificada del ensayo de proliferación coestimulatorio descrito por Moore et al., 1999, Science, 285(5425): 260-3, en el cual el BLyS es mezclado o preincubado con el anticuerpo anti-BlyS antes de aplicarlo a los linfocitos B respondedores. Trastornos inmunológicos mediados por células-T y/o células-B; trastornos autoinmunitarios; en particular, enfermedades autoinmunitarias asociadas con la producción de autoanticuerpos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico; síndrome de Sjogren, cánceres que expresan BLyS como un factor de crecimiento autocrino, p. ej., ciertas leucemias linfocíticas crónicas.

MPIF-1 (Factor inhibidor del progenitor mieloide; CK beta-8; Mirostipen): Inhibe las células del progenitor mieloide; y activa a los monocitos. La actividad del MPIF-1 puede medirse mediante el ensayo de mieloprotección y el ensayo de quimiotaxis descritos en la patente de EE. UU. con n°. 6.001.606. Qumioprotección; complemento a la quimioterapia; trastornos inflamatorios; cáncer; leucemia; leucemia mielocítica; neutropenia; neutropenias primarias (p. ej., síndrome de Kostmann); neutropenia secundaria; prevención de neutropenia; prevención y tratamiento de la neutropenia en pacientes infectados con el VIH; prevención y tratamiento de la neutropenia asociada a la quimioterapia; infecciones asociadas con neutropenias; mielodisplasia; trastornos autoinmunitarios; psoriasis; movilización de células progenitoras hematopoyéticas; cicatrización de heridas; enfermedad autoinmunitaria; trasplantes; trasplantes de médula ósea; leucemia mielógena aguda; linfoma; linfoma no hodgkiniano; leucemia linfoblástica aguda;



: enfermedad de Hodgkin; recuperación mieloide acelerada; glucogenosis.

KDI (Interferón derivado del queratinocito; precursor del interferón Kappa): Inhibe la proliferación de la médula ósea; y muestra actividad antiviral. KDI, su actividad puede medirse mediante los ensayos de proliferación celular y antiviral descritos en los ejemplos 57-63 de la publicación internacional con n°. WO0107608. Esclerosis múltiple; hepatitis; cáncer; infecciones virales, infecciones por VIH, leucemia.

TNFR2 (p75) (ENBREL): Une ambos TNFa y TNFI3; media en la proliferación de células-T mediante el TNF; reduce los signos y el daño estructural en pacientes con artritis reumatoide (AR) activa de grave a moderada. La proliferación de células-T puede medirse mediante ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, “Linfocitos, un enfoque práctico” ("Lymphocytes: a practical approach") editado por: SL Rowland, AJ McMichael - chapter 6, pages 138-160 Oxford University Press (2000); y "Current Protocols on CD-ROM" section 3.12 Ensayos de proliferación para la función de células-T (Proliferation Assays for T-cell Function) John Wiley & Soncs, Inc. (1999). Enfermedad autoinmunitaria; artritis reumatoide; artritis psoriásica; enfermedad de Still; espondilitis anquilosante; enfermedades cardiovasculares; vasculitis; granulomatosis de Wegener; amiloidosis; lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependiente de insulina; trastornos por inmunodeficiencia; infección; inflamación; enfermedad intestinal inflamatoria; enfermedad de Chron; psoriasis; SIDA; rechazo de injerto; enfermedad de injerto contra huésped.

Factor 2 de crecimiento de queratinocitos (Repifermin; KGF-2; Factor-10 de crecimiento de fibroblastos; FGF-10): Estimula el crecimiento de células epiteliales. La actividad del KGF-2 puede medirse mediante los ensayos de cicatrización de heridas y los ensayos de proliferación de células epiteliales descritos en la patente de EE. UU. con n°. 6.077.692. Estimulan la proliferación de células epiteliales; estimulan los queratinocitos basales; cicatrización de heridas; estimulan la producción de folículos capilares; cicatrización de heridas cutáneas, cicatrización de heridas; heridas en tejido ocular, heridas en tejido dental, heridas en la cavidad bucal, úlceras diabéticas, úlceras cutáneas, úlceras de cúbito, úlceras arteriales, úlceras de estasis venosa, quemaduras resultantes de exposición al calor o a sustancias químicas, u otras condiciones de cicatrización de heridas no habituales como uremia, malnutrición, deficiencias en vitaminas o complicaciones asociadas con tratamiento sistémico con esteroides, radioterapia o antimetabolitos o fármacos antineoplásicos; promueven el restablecimiento cutáneo posterior a pérdida cutánea; incrementan la adherencia de injertos cutáneos al lecho de una herida, estimulan la reepitalización del lecho de una herida; promueven la resistencia cutánea; mejoran el aspecto de la piel envejecida; proliferan los hepatocitos contenidos en pulmón, mamas, páncreas, estómago, vejiga, intestino delgado, intestino grueso; sebocitos, folículos capilares, pneumocitos de tipo 2, células caliciformes productoras de mucina, u otras células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, o queratinocitos basales (y sus progenitores) contenidos en la piel, pulmón, hígado, vejiga, ojo, glándulas salivares, o tracto gastrointestinal; reducen los efectos secundarios de la toxicidad intestinal producidos por radiación, tratamientos de quimioterapia o infecciones virales; citoprotector, especialmente de la mucosa del intestino delgado o vejiga; mucositis (úlceras bucales); regeneración de piel; defectos



: cutáneos en su grosor total y/o parcial, incluyendo quemaduras, (p. ej., repoblación de folículos capilares, glándulas sebáceas y sudoríparas); psoriasis; epidermólisis bullosa, ampollas; úlceras duodenales y/o gástricas; reducen las cicatrizaciones; enfermedades intestinales inflamatorias; enfermedad de Crohn; colitis ulcerosa; toxicidad intestinal; daño pulmonar; reparación del epitelio bronquiolar y/o alveolar; daño pulmonar crónico o agudo; enfisema, SDRA; daños por inhalación; enfermedades de la membrana hialina; síndrome de dificultad respiratoria en bebés; displasia broncopulmonar en bebés prematuros; insuficiencia hepática fulminante; cirrosis; daño hepático causado por hepatitis viral y/o sustancias tóxicas; diabetes mellitus; inflamación.

TR2 (y TR2sv1, TR2SV2; TNFRSF14; HVEM; mediador de entrada del virus herpes; ATAR): Inhibe la proliferación de las células-B, y media e inhibe la infección por virus herpes simplex (HSV). Ensayo de producción de Ig y ensayo de proliferación de células- B de coestimulación (Moore et al., 1999, Science, 285(5425): 260-3.). Ensayo de infectividad de HSV-1 y HSV-2: N.° de publicación internacional WO97/ Herpes; trastornos inmunitarios; enfermedad autoinmunitaria; enfermedad de injerto contra huésped; rechazo de injerto; inmunodeficiencia variable; síndromes de inmunodeficiencia; cáncer.

Quimioquinas derivadas de macrófagos, MDC (Ckbeta-13): Quimiotáctica para células dendríticas derivadas de monocitos y linfocitos citolíticos naturales activados por IL-2. 04658; las actividades de la quimiocina pueden determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica: Methods in Molecular Biology, 2000, vol. 138: Chemokine Protocols. Editado por: A. E. I. Proudfoot, T. N. C. Wells, y C. A. Power. © Humana Press Inc., Totowa, NJ Enfermedades inflamatorias; cicatrización de heridas; angiogénesis; infección por SIDA.

HAGDG59 (Dehidrogenasa de cadena corta retinal): Activa la liberación de MIP1a en las células dendríticas. Los ensayos con células dendríticas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, J. Immunol. 158: 29192925 (1997); J. Leukoc. Biol. 65: 822-828 (1999). Trastornos inmunitarios; cáncer; infección viral; inflamación; sepsis; artritis; asma.

GnRH (Hormona liberadora de gonadotropina): Promueve la liberación de la hormona estimulante de folículos y la hormona luteinizante de la adenohipófisis. Se sabe que la GnRH causa la liberación de la hormona estimulante de folículos (FSH) y/o la hormona luteinizante (LH) in vivo y mediante acción directa en los receptores de los gonadotropos de la adenohipófisis. La actividad de la GnRH puede determinarse con la medición de los niveles de FSH en el medio de gonadotropos cultivados antes y después del complemento de GnRH. Por ejemplo, Baker et al. Biol Reprod 2000 Sep; 63(3): 865-71. Infertilidad; síndrome de Kallmann y otras formas de hipergonadismo hipergonadotrópico (deficiencias para atravesar la pubertad de forma natural).

Teprotide: Inhibe la enzima que convierte la angiotensina (ACE). La inhibición de ACE puede determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Anzenbacherova et al., J. Pharma Biomed Anal 2001 Mar; 24(5-6): 11516. Hipertensión; insuficiencia cardíaca congestiva.

Quimioquina humana HCC-1 (ckBeta-1; HWFBD): Implicada en la inflamación, alergia, rechazo de tejidos, infección viral, y biología tumoral; potencia la proliferación de las células progenitoras mieloides CD34+. Las actividades de las quimiocinas pueden determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica: Methods in Molecular Biology, 2000, vol. 138: Chemokine Protocols. Editado por: A. E. I. Proudfoot, T. N. C. Wells, y C. A. Power. © Humana Press Inc., Totowa, NJ Trastornos autoinmunitarios; inmunidad; trastornos inflamatorios y vasculares; VIH; SIDA; enfermedades infecciosas.

Inhibidor ACE2 (DX512): Inhibe la producción de angiotensina II que induce la producción de aldosterona, la vasoconstricción de musculatura lisa, y la proliferación de fibroblastos cardíacos; induce angiogénesis; una enzima que convierte la angiotensina I en angiotensina I-9; también fragmenta la des-Arg-bradiquina y la neurotensina. La inhibición de angiotensina puede determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, mediante un ensayo in vitro de proliferación con fibroblastos cardíacos de rata como se describe en: Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1999 May; 359(5): 394-9. Tratamiento para niveles elevados de aldosterona y/o angiotensina II, que puede llevar a vasoconstricción, hipertensión y/o alteración del gasto cardíaco; enfermedad cardiovascular; insuficiencia cardíaca; diabetes; diabetes tipo 2; proteinuria; trastornos renales, insuficiencia cardíaca congestiva.

TRl (OCIF; factor inhibidor de la osteoclastogénesis; osteoprotegerina, OPG; precursor del miembro 11B, superfamilia de receptor de factor de necrosis tumoral): Inhibe la osteoclastogénesis y la resorción ósea, e induce a la proliferación de fibroblastos. Un ensayo de cocultivo para osteoclastogénesis, un ensayo de resorción ósea mediante un sistema de cultivo de órgano de hueso largo fetal, un ensayo de resorción de dentina, y ensayos de proliferación de fibroblastos, son todos descritos en Kwon et al., FASEB J. 12: 845854 (1998). Osteoporosis; enfermedad de Paget; osteopenia; osteólisis; osteomielitis; osteonecrosis; pérdida ósea periodontal; osteoartritis; artritis reumatoide; osteoporosis; enfermedad ósea metastásica, lítica o periodontal; inhibición de la diferenciación osteoclástica; trastornos óseos; regeneración y curación ósea; calcificación de órganos; calcificación vascular.

Quimioquina humana Ckbeta-7: Quimiotáctica tanto para células-T (CD3+) activadas como linfocitos (CD14-) y linfocitos T (CD8+) y (CD4+) y células-T (CD45RA+) no activados. Las actividades de las quimiocinas pueden determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica: Methods in Molecular Biology, 2000, vol. 138: Chemokine Protocols. Editado por: A. E. I. Proudfoot, T. N. C. Wells, y C. A. Power. © Humana Press Inc., Totowa, NJ Cáncer; cicatrización de heridas; trastornos inflamatorios; trastornos inmunorreguladores; aterosclerosis; infección parasitaria; artritis reumatoide; asma; trastornos autoinmunitarios.

CKbeta4 (HGBAN46; HE9DR66): Atrae y activa los leucocitos microbicidas; atrae células-T efectoras/de memoria y células dendríticas inmaduras que expresan CCR6; quimiotaxis; inhibe la proliferación de las progenitoras mieloides; quimiotaxis de las PBMC. Las actividades de las quimiocinas pueden determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica: Methods in Molecular Biology, 2000, vol. 138: Chemokine Protocols. Editado por: A. E. I. Proudfoot, T. N. C. Wells, y C. A. Power. © Humana Press Inc., Totowa, NJ Cáncer; tumores sólidos; infección crónica; trastornos autoinmunitarios; psoriasis; asma; alergia; hematopoyesis; cicatrización de heridas; insuficiencia de médula ósea; silicosis; sarcoidosis; síndrome hipereosinofílico; inflamación pulmonar; trastornos fibróticos; ateroesclerosis; enfermedades periodontales; enfermedades virales; hepatitis.

Leptina: Controla la obesidad mediante la regulación del apetito, la reducción del peso corporal y la disminución de insulina y del nivel de glucosa. Modulación in vivo de la ingesta alimentaria, reducción del peso corporal, y disminución de los niveles de glucosa e insulina en ratones ob/ob; radioinmunoensayo (RIA) y activación del receptor de leptina en un ensayo celular. Protein Expr Purif 1998 Dec; 14(3): 335-42 Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X, trastornos inmunológicos; inmunosupresión.

Antagonista del receptor de IL-1(Anakinra; receptor de la interleucina-1 soluble; IRAP; KINERET; ANTRIL): Se une al receptor de IL1 sin activar las células diana; inhibe la unión de IL1-alfa y IL1-beta; y neutraliza la actividad biológica de IL1 -alfa e IL1- beta. 1) Competencia para la unión de IL-1 a receptores IL-1 en células YT-NCI o C3H/HeJ (Carter et al., Nature 344: 633-638, 1990); 2) Inhibición de la adhesión de leucocito-célula endotelial inducido por IL-1 (Carter et al., Nature 344: 633-638, 1990); 3) Ensayos de proliferación en células A375-C6, una línea celular de melanoma humano altamente susceptible a la acción antiproliferativa de la IL-1 (Murai T et al., J. Biol. Chem. 276: 6797- Enfermedad autoinmunitaria; artritis; artritis reumatoide; asma; diabetes; diabetes mellitus; GVHD; trastornos intestinales inflamatorios; enfermedad de Crohn; inflamación ocular; psoriasis; shock séptico; rechazo de trasplante; trastornos inflamatorios; trastornos reumáticos; osteoporosis; osteoporosis postmenopáusica; ictus.


: 6806, 2001).

TREM-1 (Receptor desencadenante expresado en monocitos 1): Media la activación de monocitos y neutrófilos; estimula la respuesta Inflamatoria mediada por neutrófilos y monocitos; promueve la secreción de TNF, IL-8, y MCP-1; Induce la degranulación de neutrófilos; la movilización de Ca2+ y la fosforilación de la tirosina quinasa 1 relacionada con señal extracelular (ERKI), ERK2 y la fosfolipasa C- gamma. La secreción de citoquinas, quimioquinas, degranulación, y los marcadores de activación de superficie celular pueden determinarse mediante ensayos descritos en Bouchon et al, J Immunol 2000 May 15; 164(10): 4991-5. Inflamación; sepsis; infección bacteriana; enfermedades autoinmunitarias; GVHD.

HCNCA73: Induce la activación- expresión de células- T del marcador CD152; estimula la liberación de TNF-a y MIP-1a a partir de células dendríticas derivadas de monocitos inmaduras; promueve la maduración de células dendríticas. La FMAT puede usarse para medir los marcadores superficiales de células-T (CD69, CD152, CD71, HLA- DR), así como la producción de citoquinas de células-T (p. ej., producción de IFNg). J. of Biomol. Screen. 4: 193-204 (1999). Otros ensayos de proliferación de células-T: Linfocitos: un enfoque práctico ("Lymphocytes: a practical approach") editado por: SL Rowland, AJ Trastornos autoinmunitarios; inflamación del tracto gastrointestinal; cáncer; cáncer de colon; alergia; enfermedad de Crohn.


: McMichael - Chapter 6, pages 138-160 Oxford University Press (2000); WO 01/21658 ejemplos 11 -14, 16 -17 y 33.

VEGF-2 (Factor-2 de crecimiento endotelial vascular; VEGF-C): Promueve la proliferación de células endoteliales. La actividad del VEGF puede determinarse mediante los ensayos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en la publicación internacional WO0045835, por ejemplo. Enfermedad de arteria coronaria; isquemia grave de extremidades; enfermedad vascular; proliferación de células endoteliales, tanto vasculares como linfáticas. Los antagonistas pueden ser útiles como agentes anti- angiogénicos; cáncer.

HCHNF25 (valor crítico de translocación en salto): Activa la liberación de MIP1a en las células dendríticas. Los ensayos con células dendríticas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, J. Immunol. 158: 29192925 (1997); J. Leukoc. Biol. 65: 822- 828 (1999). Trastornos inmunitarios; cáncer.

HLDOU1 8 [Proteína 9 morfogenética ósea (BMP9); Precursor del factor-2 de diferenciación de crecimiento (Precursor GDF-2 )]: Activa el ensayo de quinasa L6/GSK3. Los ensayos para la activación de la actividad de quinasa GSK3 son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, Biol. Chem. 379(8-9): (1998) 1101- 1110.; Biochem J. 1993 Nov 15; 296 (Pt 1): 15-9. Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito;



: síndrome X.

Péptidol semejante al glucagón (GLP1; Insulinotropina): Estimula la síntesis y liberación de insulina; potencia la sensibilidad de los tejidos hepáticos, musculares y adiposos hacia la insulina; estimula la captación de glucosa; ralentiza el proceso digestivo; suprime el apetito; bloquea la secreción de glucagón. La actividad del GLP1 puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]-glucosa. (J Biol Chem 1999 Oct 22; 274(43): 3086430873). Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (nIdDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

Exendin-4 (AC-2993): Estimula la síntesis y liberación de insulina; potencia la sensibilidad de los tejidos hepáticos, musculares y adiposos hacia la insulina; estimula la captación de glucosa; ralentiza el proceso digestivo; suprime el apetito; bloquea la secreción de glucagón. La actividad de Exendin-4 puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]- glucosa. (J Biol Chem 1999 Oet 22; 274(43): 30864-30873). Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

T20 (T20, péptido inhibidor de VIH, DP178; DP178, péptido Inhibidor de VIH): Un péptido de residuos 643-678 del ectodominio de la proteína de la transmembrana gp41 del VIH que se une al gp41 en su estado de reposo y evita la transformación al estado fusogénico. Se describen ensayos de inhibición del virus en Zhang et al., Sep. 26 2002, Sciencexpress (
www.sciencexpress.or g). VIH; SIDA; infección del VIS (virus de la inmunodeficiencia en simios).

T1249 (T1249, péptido inhibidor del VIH; T1249, péptido anti-VIH): Una segunda generación del inhibidor de fusión del VIH Se describen ensayos de inhibición del virus en Zhang et al., Sep. 26 2002, Sciencexpress (
www.sciencexpress.or g) VIH; SIDA; infección del VIS (virus de la inmunodeficiencia en simios).

Híbridos de interferón, preferidos específicamente: IFNalfa híbrido de A/D (versión BgIII) IFNalfa híbrido de A/D (versión Pvull) IFNalfa híbrido de A/F IFNalfa híbrido de A/B híbrido de IFNbeta 1/alfa D (híbrido de IFNbeta- 1/alfa- 1) híbrido de IFNalfa/beta: Aporta una gama de respuestas celulares que Incluyen actividades inmunomoduladoras, antitumorales, antiproliferativas y antivirales; estimulan la producción de dos enzimas: una proteína quinasa y una sintetasa oligoadenilata. También, modulan la expresión del antígeno MHC, la actividad de las células NK y la producción del IFNg, además de la Ensayo antiviral: Rubinstein S, Familletti PC, Pestka S. (1981) Ensayo conveniente para interferones (Convenient assay for interferons). J. Virol. 37(2): 755-8; Ensayo de antiproliferación: Gao Y, et al (1999) La sensibilidad de una línea de tumor positivo del virus epstein-barr, Daudi, a interferón alfa correlaciona con la expresión de un transcrito viral GC-Rich. Mol Cell Biol. 19(11): 7305-13. Infecciones virales; infecciones por VIH; hepatitis; hepatitis crónica; hepatitis B; hepatitis B crónica; hepatitis C; hepatitis C crónica; Hepatitis D; hepatitis D crónica; virus del papiloma humano; infección de virus herpes simplex; condiloma acuminado externo; VIH; infección por VIH; oncología; cáncer; tumores sólidos; melanoma; melanoma maligno; cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales); cáncer de pulmón (p. ej. cáncer pulmonar de células no pequeñas o cáncer pulmonar de células pequeñas); cáncer de colon; cáncer de mama; cáncer de hígado; cáncer de próstata,

: producción de IL12 en monocitos. cáncer de vejiga; cáncer gástrico; sarcoma; sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA; linterna; linterna de células-T; linterna cutáneo de células-T; linterna no hodgkiniano; cáncer cerebral; glioma; glioblastoma multiforme; displasia cervical; leucemia; preleucemia; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; neoplasias hematológicas; trastornos hematológicos; mieloma múltiple; infecciones bacterianas; quimioprotección; trombocitopenia; esclerosis múltiple; fibrosis pulmonar; degeneración macular asociada a la edad; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; artritis reumatoide; colitis ulcerosa; osteoporosis; osteopenia, osteoclastogénesis; fibromialgia; síndrome de Sjogren; síndrome de fatiga crónica; fiebre; fiebre hemorrágica; fiebres hemorrágicas virales; hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (nIdDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

Péptido natriurético de tipo B (BNP, péptido natriurético cerebral): Estimula la relajación, vasodilatación y natriuresis del músculo liso, y la supresión de la renina-angiotensina y endotelina. La inhibición de angiotensina puede determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica; por ejemplo, usando un ensayo in vitro de proliferación con fibroblastos cardíacos de rata como se describe en: Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1999 May; 359(5): 394-9. La vasodilatación puede cuantificarse en animales mediante la medición de las respuestas miogénicas en las arterias pequeñas renales en un sistema de arteriógrafo isobárico (véase Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2002 Aug; 283(2): R349- R355). La natriuresis es determinada con la medición de la cantidad de sodio en orina. Insuficiencia cardíaca congestiva; sobrecarga de volumen cardíaco, descompensación cardíaca; insuficiencia cardíaca; disfunción del ventrículo izquierdo; disnea

a-defensin, que incluye alfa 1 defensin, alfa 2 defensin, alfa 3 defensin (defensin de tipo mieloide; DEfA1; defensin específico de neutrófilos; CAF): Supresión de la replicación del VIH; activo contra bacterias, hongos, y virus desarrollados. Se describen ensayos de inhibición de virus en Zhang et al., Sep. 26 2002, Sciencexpress (
www.sciencexpress.or g). VIH, SIDA; CRS.

Fosfatonina (fosfoglicoproteína extracelular de matriz; MEPE): Regulación del metabolismo del fosfato. Los niveles de fosfato en sangre pueden medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como el Bioensayo en ratas hipofosfatémicas. Zoolog Sei 1995 Oct; 12(5): 607-10. Hiperfosfatemia; hipofosfatemia en insuficiencia renal crónica; hipofosfatemia; osteomalacia; raquitismo; raquitismo/osteomalacia hipofosfatémica dominante ligada al cromosoma X (XLH); raquitismo/osteomalacia hipofosfatémica autosómica dominante (ADHR); raquitismo/osteomalacia inducida por tumor (TIO).

P1pal-12 (pepducin, pepducin basado en PARI): Regulación de la transducción de señal del receptor activado por proteasa (PAR) y agregabilidad plaquetaria humana mediada por trombina. La agregabilidad plaquetaria puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en: Nature Medicine 2002 Oct; 8(10): 1161-1165. Protección contra activación plaquetaria sistémica, trombo, ataque cardíaco, ictus, y/o trastornos de coagulación.

P4pa1-10 (pepducin, pepducin basado en PAR4): Regulación de la transducción de señal del receptor activado por proteasa (PAR) y agregabilidad plaquetaria humana mediada por trombina. La agrebabilidad plaquetaria puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en Nature Medicine 2002 Oct; 8(10): 1161-1165. Protección contra activación plaquetaria sistémica, trombo, ataque cardíaco, ictus, y/o trastornos de coagulación.

HRDFD27: Implicado en la proliferación de células-T; producción de TNF-gamma. La proliferación de células-T puede medirse mediante ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Linfocitos: un enfoque práctico ("Lymphocytes: a practical approach") editado por: SL Rowland, AJ McMichael - chapter 6, pages 138-160 Oxford University Press (2000); and "Current Protocols on CD-ROM" section 3.12 Ensayos de proliferación para la función de células-T (Proliferation Assays for T-cell Function) John Wiley & Soncs, Inc. (1999). Quimioprotección; complemento a la quimioterapia; trastornos inflamatorios; cáncer; leucemia; leucemia mielocítica; neutropenia; neutropenias primarias (p. ej., síndrome de Kostmann); neutropenia secundaria; prevención de neutropenia; prevención y tratamiento de la neutropenia en pacientes infectados con el VIH; prevención y tratamiento de la neutropenia asociada a la quimioterapia; infecciones asociadas con neutropenias; mielodisplasia; trastornos autoinmunitarios; psoriasis; movilización de células progenitoras hematopoyéticas; cicatrización de heridas; enfermedad autoinmunitaria; trasplantes; trasplantes de médula ósea; leucemia mielógena aguda; linfoma; linfoma no hodgkiniano; leucemia linfoblástica aguda; enfermedad de Hodgkin; recuperación mieloide acelerada; glucogenosis.

HWHGZ51 (CD59; homólogo de proteína adherida a GPI y asociada con metástasis): Estimula una respuesta inmunitaria e induce a la inflamación mediante la inducción de infiltración de PMN, eosinófilos y células mononucleares; inhibe la expansión del cáncer de mama, el cáncer de ovarios, leucemia, y melanoma; sobreexpresado en tumores de colon, pulmón, mama y rectales; regula la glucosa y/o la captación de FFA por los adipocitos y la musculatura La capacidad de afectar a la diferenciación de condrocitos puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en Bone (1995) Sep; 17(3): 27986. Enfermedades y trastornos óseos; enfermedades y trastornos osteomusculares; fracturas y/o roturas de huesos; osteoporosis (de tipo postmenopáusica, senil o idiopática infantojuvenil); gota y/o pseudogota; enfermedad de Paget; osteoartritis; tumores y/o cánceres de huesos (osteocondromas, condromas benignos, condroblastomas, fibromas condromixoides, osteomas osteoides, tumores de células gigantes, mielomas múltiples, osteosarcomas, fibrosarcomas, histicitomas fibrosos malignos, condrosarcomas, tumores de Ewing, y/o linfomas malignos); infecciones óseas y articulares

: esquelética; induce la rediferenciación de condrocitos. (osteomielitis y/o artritis infecciosa); articulaciones de Charcot; espolón calcáneo, enfermedad de Sever; lesiones deportivas; cáncer; tumores sólidos; melanoma; melanoma maligno; cáncer renal (p. ej., carcinoma celular renal); cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas o cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de colon; cáncer de mama; cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga; cáncer gástrico; sarcoma; sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA; linfoma; linfoma de células-T; linfoma cutáneo de células-T; linfoma no hodgkiniano; cáncer cerebral; glioma; glioblastoma multiforme; displasia cervical; leucemia; preleucemia; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; neoplasias hematológicas; trastornos hematológicos; mieloma múltiple; enfermedades y trastornos renales; púrpura de Shonlein- Henoch, enfermedad de Berger; enfermedad celiaca, dermatitis herpetiforme, enfermedad de Crohn; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1, diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X; trastornos renales; hiperinsulinemia; hipoinsulinemia; trastornos



: inmunológicos (p. ej., artriris, asma, enfermedades de inmunodeficiencia, SIDA, artriris reumatoide, enfermedad granulomatosa, enfermedad intestinal inflamatoria, sepsis, acné, neutropenia, neutrofilia, psoriasis, hipersensibilidades, citotoxicidad mediada por células-T, enfemedad de injerto contra huésped, trastornos autoinmunitarios, desmielinización, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica inducida por fármacos, artritis reumatoide, enfermedad de Sjorgren, esclerodermia)

C17 (proteína C17 semejante a la citoquina): Inhibe la glucosa y/o la captación de FFA por los adipocitos; induce la proliferación de células mesangiales renales; regulación de la producción de citoquinas y presentación de antígenos La proliferación de células mesangiales renales puede estudiarse mediante técnicas descritas en J. Investig. Med. (1998) Aug; 46(6): 297-302. Trastornos y enfermedades renales; púrpura de Shonlein- Henoch, enfermedad de Berger, enfermedad celiaca, dermatitis herpetiforme, enfermedad de Crohn; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1, diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X; trastornos renales; hiperinsulinemia; hipoinsulinemia; trastornos hematopoyéticos; enfermedades y trastornos inmunológicos; enfermedades y trastornos del desarrollo; enfermedades y trastornos hepáticos; cáncer (en particular leucemia); trastornos inmunológicos (p. ej., artriris, asma, enfermedades de inmunodeficiencia, SIDA, artriris reumatoide, enfermedad granulomatosa, enfermedad intestinal inflamatoria, sepsis, acné, neutropenia, neutrofilia, psoriasis, hipersensibilidades, citotoxicidad mediada por células-T, enfermedad de injerto contra huésped, trastornos autoinmunitarios, desmielinización, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica inducida por fármacos, artritis reumatoide, enfermedad de Sjorgren, esclerodermia)

HDPBQ71: Regula la producción y secreción del IFN- gamma; activación Dichos ensayos que pueden usarse o modificarse Trastornos e infecciones sanguíneas (p. ej., infecciones virales, tuberculosis,

: de células mieloides y/o células hematopoyéticas habitualmente para probar la actividad inmunomoduladora de los polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos y agonistas o antagonistas de la invención) incluyen los ensayos descritos en Miraglia et al., J Biomolecular Screening 4: 193-204 (1999); Rowland et al., Linfocitos: un enfoque práctico ("Lymphocytes: a practical approach") Chapter 6: 138-160 (2000); Gonzalez et al., J Clin Lab Anal 8(5): 225-233 (1995); Billiau et al., Ann NY Acad Sei 856: 22-32 (1998); Boehm et al., Annu Rev Immunol 15: 749-795 (1997), y Rheumatology (Oxford) 38(3): 214-20 (1999) infecciones asociadas con la enfermedad granulomatosa crónica y la osteoporosis maligna); enfermedad autoinmunitaria (p. ej., artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple); inmunodeficiencia, potenciación de una respuesta inmunitaria mediada por células-T, y supresión de una respuesta inmunitaria mediada por células-T; trastornos inflamatorios y de inflamaciones; fibrosis pulmonar idiopática; enfermedades neoplásicas (p. ej., leucemia, linfoma, melanoma); cánceres y neoplasias, tales como, por ejemplo, leucemia, linfoma, melanoma, y cánceres de próstata, mama, pulmón, colon, pancreático, esofágico, estomacal, cerebral, hepático y urinario; Trastornos disproliferativos benignos y afecciones preneoplásicas, tales como, por ejemplo, hiperplasia, metaplasia, y/o displasia; anemia, pancitopenia, leucopenia; trombocitopenia; enfermedad de Hodgkin; anemia linfocítica aguda (ALL); plasmacitomas; mieloma múltiple; linfoma de Burkitt; artritis; SIDA; enfermedad granulomatosa; enfermedad intestinal inflamatoria; sepsis; neutropenia; neutrofilia; psoriasis; supresión de las reacciones inmunológicas a órganos y tejidos trasplantados; hemofilia; hipercoagulación; diabetes mellitus; endocarditis; meningitis; enfermedad de Lyme; asma; alergia

Oscar (isoforma-3 del receptor asociado a osteoclastos): Regulador de la diferenciación de osteoclastos; regulador de las respuestas inmunológicas adaptativas e innatas El ensayo para detectar la diferenciación de osteoclastos se describe en J. Exp. Med. (2002) Jan 21; 195(2): 201-9. Enfermedades y trastornos óseos; enfermedades y trastornos osteomusculares; fracturas y/o roturas de huesos; osteoporosis (de tipo postmenopáusica, senil o idiopática infantojuvenil); gota y/o pseudogota; enfermedad de Paget; osteoartritis; tumores y/o cánceres de huesos (osteocondromas, condromas benignos, condroblastomas, fibromas condromixoides, osteomas, tumores de células gigantes, mielomas múltiples, osteosarcomas, fibrosarcomas, histiocitomas fibrosos malignos, condrosarcomas, tumores de Ewing, y/o linfomas malignos); infecciones óseas y articulares (osteomielitis y/o artritis infecciosa); articulaciones de Charcot; espolón calcáneo, enfermedad de Sever; lesiones deportivas

Tumstatina (péptido T5, T7 o T8; a3(IV)NC1): Inhibe la angiogénesis; inhibe el crecimiento tumoral; inhibe la síntesis de proteínas. Un ensayo de proliferación celular tumoral se describe en J. Biol. Chem. (1997) 272: 20395-20401. La síntesis de proteínas puede medirse tal como se describe en Science (2002) Jan 4; 295(5552): 140-3. Cáncer, tumores sólidos; melanoma; melanoma maligno; cáncer renal (p. ej., carcinoma celular renal); cáncer de pulmón (p. ej., cáncer pulmonar de células no pequeñas o cáncer pulmonar de células pequeñas); cáncer de colon; cáncer de mama; cáncer de hígado; cáncer de próstata; cáncer de vejiga; cáncer gástrico; sarcoma; sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA; linfoma; linforma de células-T; Linfoma cutáneo de células-T; linfoma no hodgkiniano; cáncer cerebral; glioma; glioblastoma multiforme; displasia cervical; leucemia; preleucemia; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; neoplasias hematológicas; trastornos hematológicos; mieloma múltiple; angiogénesis

CNTF (Factor neurotrófico ciliar): Potencia la formación de mielina; reduce la degradación de fotorreceptores; regula las corrientes de calcio Pueden realizarse ensayos sobre la regulación en la formación de mielina como se describe en J. Neurosci. (2002) Nov. 1; 22(21): 9221-7. Enfermedades y trastornos neuronales y neurológicos, en particular enfermedades y trastornos asociados con la mielina y la desmielinización, tales como, por ejemplo, ELA, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington; lesiones neuronales y en la médula espinal; trastornos oculares, tales como, por ejemplo, retinitis pigmentaria, ceguera, daltonismo, degeneración macular.

Somatostatina (Octreotida; octreotida acetato; Sandostating LAR®): Inhibe la hormona de crecimiento, los glucagones y la insulina; suprime la respuesta de LF a la GnRH; disminuye el flujo sanguíneo esplácnico; inhibe la liberación de serotonina, gastrina, péptido intestinal vasoactivo, secretina, motilina, y polipéptidos pancreáticos. La inhibición en la liberación de la hormona de crecimiento en humanos por somatostatina puede medirse como se describe en J. Clin. Endocrinol. Metab. (1973) Oct; 37(4): 6324. La inhibición de la secreción de insulina por somastatina puede medirse como se describe en The Lancet (1973) Dec. 8; 2(7841): 1299-1301. Cáncer, tumores carcinoides metastásicos; adenomas que segregan péptidos vasoactivos intestinales; diarrea y sofocos; cánceres y trastornos prostáticos; cáncer de mama; cánceres y trastornos gastrointestinales; cánceres del sistema endocrino; paragangliomas de cabeza y cuello; cánceres y trastornos hepáticos; cánceres nasofaríngeos; cánceres y trastornos tiroideos; acromegalia; síndrome carcinoide; trastornos de la vesícula, tales como enfermedades de contractilidad y secreción de bilis anormal; psoriasis; diabetes; diabetes insípida, diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X, trastornos renales; enfermedades y trastornos neurológicos, que incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y demencia; trastornos



: neuropsicóticos, que incluyen trastorno afectivo bipolar, artritis reumatoide; hipertensión, hipertensión intracraneal; varices esofágicas; enfermedad de Graves; convulsiones; epilepsia; gastritis; angiogénesis;

IL-22 (IL22, interleucina- 22; IL1 7D, IL27): Estimula la captación de glucosa en las células musculoesqueléticas; aumenta a sensibilidad a la insulina del músculo esquelético. La actividad de la IL-22 puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]-glucosa. (J Biol Chem 1999 Oct 22; 274(43): 30864-30873). Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (nIdDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.

HCE1P80: Estimula la captación de glucosa; aumenta la sensibilidad a la insulina. La actividad del HCE1P80 puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]- glucosa. (J Biol Chem 1999 Oct 22; 274(43): 30864- 30873). Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

HDRMI82: Estimula la captación de glucosa; aumenta la sensibilidad a la insulina. La actividad del HDRMI82 puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]- glucosa. (J Biol Chem Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia;


: 1999 Oet 22; 274(43): 30864- 30873). diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.

HDALV07 (adiponectina; precursor de la proteína 28k unida a gelatina; transcrito génico adiposo más abundante; APM-1; GBP28; ACRP30; ADIPOQ): Modula la acción de la insulina La actividad de la insulina puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]- glucosa. (J Biol Chem 1999 Oct 22; 274(43): 30864- 30873). Diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X; hiperglicemia; hiperlipidemia combinada familiar; síndrome metabólico; trastornos inflamatorios; trastornos aterogénicos.

Péptido C: Un precursor de la insulina implicado en la regulación de insulina Las concentraciones de péptido C pueden medirse mediante ensayos bien conocidos en la técnica, tal como el descrito en PNAS (1970) Sep; 67(1): 148 - 55 Diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, pero no se limita a, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos



: vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X; hiperglicemia; hiperlipidemia combinada familiar; síndrome metabólico.

HCBOG68 (adipocina entérica; Fat SID; proteína acídica rica en prolina): Controla la proliferación/diferenci ación o el metabolismo/fisiologí a/patología de los adipocitos y el tejido adiposo en respuesta a condiciones dietéticas. Pueden hacerse ensayos sobre la activación de la transcripción mediada por cAMP en adipocitos mediante procedimientos conocidos en la técnica (Berger et al., Gene 66: 1-10 (1998); Cullen y Malm, Methods in Enzymol 216: 362-368 (1992); Henthom et al., Proe Natl Aead Sei USA 85: 6342-6346 (1988); Reuseh et al., Mol Cell Biol 20(3): 1008-1020 (2000); y Klemm et al., J Biol Chem 273: 917-923 (1998)). Tratamiento de obesidad; tratamiento para la diabetes; supresión de ganancia de peso corporal; supresión de apetito. hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X. Otras indicaciones para anticuerpos y/o antagonistas incluyen tratamiento de pérdida de peso; tratamiento de emaciación por SIDA; estimulación del apetito; tratamiento de caquexia.

PYY (Péptido YY), que incluye PYY 3-36 (residuos 31-64 de aminoácidos de longitud completa PYY, residuos 3-36 de aminoácidos de PYYmaduro): Disminuye el apetito; aumenta la saciedad; disminuye la ingesta de alimentos. El apetito y la ingesta de alimentos pueden medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Batterham et al. Nature 2002; 418: 650654). Las más preferidas: tratamiento de la obesidad; tratamiento para la diabetes; supresión de ganancia de peso corporal; supresión de apetito. Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque



: no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X. Otras indicaciones para anticuerpos y/o antagonistas: tratamiento de pérdida de peso; tratamiento de emaciación por SIDA; estimulación del apetito; tratamiento de caquexia.

WNT10b: Inhibe la adipogénesis. La actividad del WNT10b puede medirse mediante ensayos de inhibición de la adipogénesis (Ross et al., Science 2000; 289(5481): 950953 Las más preferidas: tratamiento de obesidad; supresión de ganancia de peso corporal; supresión de apetito. Otras indicaciones: hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM).

WNT11: Promueve la cardiogénesis. La actividad del WNT11 puede medirse mediante ensayos conocidos en la técnica, que incluyen ensayos de cardiogénesis (Eisenberg et al., Dev Dyn 1999 Sep; 216(1): 45-58). Tratamiento de trastornos cardiovasculares; insuficiencia cardíaca congestiva; infarto de miocardio.

Herstatin: Inhibe la proliferación del cáncer. La actividad de Herstatin puede medirse mediante ensayos de proliferación celular conocidos en la técnica (Doherty et al., PNAS 1999; 96(19): 1086910874. Oncología; cáncer, tumores sólidos; melanoma; melanoma maligno; cáncer renal (p. ej., carcinoma celular renal); cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas o cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de colon; cáncer de mama; cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga; cáncer gástrico; sarcoma; sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA; linfoma; linfoma de células-T; linfoma cutáneo de células-T; linfoma no hodgkiniano; cáncer cerebral; glioma; glioblastoma multiforme; displasia cervical; leucemia; preleucemia; tricoleucemia; leucemia mielógena crónica; neoplasias hematológicas; trastornos hematológicos; mieloma múltiple;

Adrenomedulina: Estimula la vasodilatación; promueve el crecimiento óseo. La vasodilatación puede medirse mediante ensayos conocidos en la técnica (Ashton et al. Pharmacology 2000; 61(2): 101-105. El estímulo del crecimiento óseo puede medirse mediante ensayos conocidos en la técnica, tales como el ensayo de proliferación de osteoblastos (Comish et al. Am J Physiol 1997 Dec; 273(6 Pt 1): E1113- 20). Tratamiento de insuficiencia cardíaca congestiva; hipertensión; infarto de miocardio; shock séptico; osteoporosis; osteoporosis postmenopáusica; osteopenia.

Receptor Nogo: Receptor para el inhibidor del crecimiento de axones, Nogo. El estímulo de regeneración y crecimiento de axones puede medirse mediante ensayos conocidos en la técnica (Foumier et al. Nature 2001;409(6818): 341346). Tratamiento de daño en el sistema nervioso central; lesión de la médula espinal; daño de nervios periféricos; enfermedades neurodegenerativas; enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; parálisis supranuclear progresiva; enfermedad de Creutzfeld-Jacob; enfermedad de las motoneuronas.

CART (Transcrito regulado por cocaína y anfetamina): Inhibe la ingesta de alimentos y el almacenamiento de grasas; promueve la oxidación de lípidos. El apetito y la ingesta de alimentos pueden medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Batterham et al. Nature 2002; 418: 650654). Las más preferidas: Tratamiento de obesidad; supresión de ganancia de peso corporal; supresión de apetito. Otras indicaciones: Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (nIdDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM).

RegIV (Gen específico de colon; proteína específica de colon): Estimula la captación de glucosa; aumenta la sensibilidad a la insulina. La actividad del RegIV puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]-glucosa. (J Biol Chem 1999 Oct 22; 274(43): 3086430873). Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

Cosintropina (Cortrosyn) (CAS-16960-16-0): Corticotropina sintética; estimula la liberación de cortisol. La actividad de la cosintropina puede evaluarse in vivo mediante la medición de los niveles de cortisol en suero. (Frank et al. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998 212(10): 1569-71). Sistema endocrino; enfermedad de Addison; síndrome de Cushing; disfunción de la hipófisis; insuficiencia suprarrenal aguda.

Pexiganan Acetato (CAS-172820-23-4): Altera las membranas bacterianas. La actividad de Pexiganan acetato puede evaluarse mediante ensayos antibacterianos in vitro conocidos en la técnica. (Zasloff et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1999, 43: 782-788). Tratamiento de enfermedades infecciosas; tratamiento de enfermedades bacterianas.

Pramlintida (Amylin) (CAS-151126-32-8): Ralentiza el vaciado gástrico; disminuye la ingesta de alimentos. El apetito y la ingesta de alimentos pueden medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Batterham et al. Nature 2002; 418: 650654) Tratamiento de obesidad; tratamiento para la diabetes; supresión de ganancia de peso corporal; supresión de apetito; tratamiento de trastornos endocrinos, hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X. Otras indicaciones para anticuerpos y/o antagonistas: tratamiento de pérdida de peso; tratamiento de emaciación por SIDA; estimulación del apetito; tratamiento de caquexia.

Teriparatida (CAS- 52232-67-4): Actúa en conjunción con la calcitonina para controlar el metabolismo del fosfato y calcio; eleva el nivel de calcio en sangre; estimula la actividad de los osteocitos; mejora la absorción Ca+/Pi del intestino delgado en la sangre; fomenta la reabsorción de Ca+ e inhibe la de Pi por los túbulos renales. Estimulación de la adenilil ciclasa en células de osteosarcoma de ratas, modelo de osteoporosis en ratas ovariectomizadas (Adenylyl cyclase stimulation in rat osteosarcoma cells, ovariectomized rat model of osteoporosis): IUBMB Life 2000 Feb; 49(2): 131-5 Trastornos óseos; prevención de fracturas; hipercalcemia; hipercalcemia maligna; osteoporosis; enfermedad de Paget; osteopenia; osteoclastogénesis; osteólisis; osteomielitis; osteonecrosis; pérdida ósea periodontal; osteoartritis; artritis reumatoide; osteoporosis; enfermedad ósea metastásica, lítica o periodontal; inhibición de la diferenciación osteoclástica; trastornos óseos; regeneración y curación ósea.

Terlipresina (triglicina lisina vasopresina) (CAS- 14636-12-5): Análogo de la vasopresina; induce vasoconstricción. La actividad de Terlipresina puede medirse mediante ensayos de vasoconstricción, tal como la preparación de anillo arterial aislado. (Landstrom et al., Hum Reprod 1999 Jan; 14(1): 151-5). Hemorragia varicosa; cirrosis; hipertensión portal; síndrome hepatorrenal; trastornos de tipo sanguíneo.

Ularitida (CAS-118812- 69-4): Estimula la natriuresis, la diuresis y la vasodilatación. La actividad de la Ularitida puede evaluarse con la medición de la acumulación de cGMP en las células renales de ratas. (Valentin et al., Hypertension 1993 Apr; 21(4): 432-8). Trastornos excretores; insuficiencia renal aguda; asma; insuficiencia cardíaca congestiva; hipertensión; hipertensión pulmonar; trastornos cardiovasculares.

Aprotinina (Trasylol) (CAS-9087- 70-1; CAS- 11061-94-2; CAS- 12407- 79-3): Inhibidor de proteasas de serina; atenúa la respuesta inflamatoria sistémica, la fibrinólisis y la agregabilidad plaquetaria inducida por trombina. La agregabilidad plaquetaria inducida por trombina puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica. (Poullis et al., J Thorac Cardiovasc Surg 2000 Aug; 120(2): 370-8). Inhibición de fibrinólisis; reducción de pérdida de sangre durante la cirugía; tratamiento de trastornos inmunitarios e inflamatorios.

Aspartocina (CAS-4117- 65-1; CAS- 1402-89-7): Antibacterial La actividad de la Aspartocina puede evaluarse mediante ensayos antibacterianos in vitro conocidos en la técnica. (Zasloff et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1999, 43: 782-788). Tratamiento de enfermedades infecciosas; tratamiento de infecciones bacterianas.

Calcitonina (Calcimar) (CAS-21215- 62-3): Regula los niveles de calcio y fosfato en suero; provoca una reducción del calcio en suero -un efecto opuesto al de la hormona paratiroide humana-. Hypocalcemic Rat Bioassay, bone resorbing assay and the pit assay, CT receptor binding assay, CAMP stimulation assay: J Bone Miner Res 1999 Aug; 14(8): 1425 -31 Osteomuscular; osteoporosis; enfermedad de Paget; hipercalcemia; trastornos óseos; prevención de fracturas; hipercalcemia maligna; osteopenia, osteocalciogénesis; osteólisis; osteomielitis; osteonecrosis; pérdida ósea periodontal; osteoartritis; artritis reumatoide; osteoporosis; enfermedad ósea metastásica, lítica y periodontal; inhibición de la diferenciación de osteoclastos; trastornos óseos; regeneración y curación ósea.

Carperitida (HANP; péptido atrial natriurético recombinante humano) (CAS-89213- 87-6): Estimula la natriuresis, la diuresis y la vasodilatación. La actividad de la Carperitida puede evaluarse in vitro con la medición de la acumulación de cGMP en un número de líneas celulares, que incluyen células PC12 y células glomerulares humanas en cultivo. (Medvede et al., Life Sei 2001 Aug 31; 69(15): 1783-90; Green et al., J Am Soc Nephrol 1994 Oct; 5(4): 1091-8). Tratamiento de insuficiencia cardíaca, trastornos cardiovasculares; trastornos respiratorios; síndrome de dificultad respiratoria.

Desirudina (hirudina recombinante; Revasc) (CAS- 120993- 53-5): Inhibe la trombina; inhibe los coágulos de sangre. La actividad de la Desirudina puede evaluarse mediante ensayos de coágulos sanguíneos conocidos en la técnica, tales como ensayos in vitro de agregabilidad plaquetaria. (Glusa, Haemostasis 1991; 21 Suppl 1: 116-20). Trastornos de tipo sanguíneo; trombosis; trombocitopenia; hemorragias.

Emoctaquina (interleucina 8) (CAS- 142298- 00-8): Citoquina proinflamatoria Tratamiento de inflamaciones, trastornos inmunológicos, infección del VSR.

Felipresina (CAS-56- 597): Derivado de vasopresina; estimula la vasoconstricción; induce anestesia local. La actividad vasoconstrictora de la Felipresina puede medirse con ensayos de vasoconstricción, tal como la preparación de anillo arterial aislado. (Landstrom et al., Hum Reprod 1999 Jan; 14(1): 151-5). Tratamiento del dolor; inductor de anestesia local.

Glucagón (CAS-16941- 32-5): Induce hiperglicemia. La actividad del Glucagón puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]- glucosa. (J Biol Chem 1999 Oet 22; 274(43): 30864- 30873). Hipoglucemia; diabetes mellitus; diabetes; diabetes insípida; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (nIdDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios;



: obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X, trastornos endocrinos.

Nagrestipen (CAS- 166089- 33-4): Inflamaciones; sistema inmunológico.

Pentigetida (Pentyde) (CAS-62087- 72-3): Sistema respiratorio; alergias; sistema inmunológico.

Proinsulina (CAS-67422- 14-4): Estimula la captación de glucosa y favorece la glicogénesis y la lipogénesis. La actividad de la insulina puede estudiarse in vitro mediante un ensayo de captación de [3-H]- glucosa. (J Biol Chem 1999 Oet 22; 274(43): 30864- 30873). Hiperglicemia; diabetes; diabetes insípida; diabetes mellitus; diabetes tipo 1; diabetes tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; diabetes mellitus no dependiente de insulina (nIdDM); diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM); afección asociada con la diabetes que incluye, aunque no exclusivamente, obesidad, enfermedad cardíaca, hiperglicemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión de apetito; síndrome X.

Becaplermina (Regranex; PDGF-BB recombinante) (CAS-165101- 51-9): Favorece la cicatrización de heridas. La actividad de la Becaplermina puede evaluarse mediante modelos in vitro de cicatrización de heridas en animales conocidos en la técnica. (Saba et al., Ann Plast Surg 2002 Jul; 49(1): 62-6). Estimula la proliferación de células epiteliales; estimula los queratinocitos basales; estimula la cicatrización de heridas; estimula la producción de folículos capilares; cicatrización de heridas cutáneas. Cicatrización de heridas; heridas en tejido ocular, heridas en tejido dental, heridas en la cavidad bucal, úlceras diabéticas, úlceras cutáneas, úlceras de cúbito, úlceras arteriales, úlceras de estasis venosa, quemaduras resultantes de exposición al calor o a sustancias químicas, u otras condiciones de cicatrización de heridas no habituales como uremia, malnutrición, deficiencias en vitaminas o complicaciones asociadas con tratamiento sistémico con esteroides, radioterapia o antimetabolitos o fármacos antineoplásicos;



: promueven el restablecimiento dérmico posterior a pérdida cutánea; incrementan la adherencia de injertos cutáneos al lecho de una herida; estimulan la reepitalización del lecho de una herida; promueven la resistencia cutánea; mejoran el aspecto de la piel envejecida; proliferan los hepatocitos en pulmón, mamas, páncreas, estómago, vejiga, intestino delgado, intestino grueso; sebocitos, folículos capilares, pneumocitos de tipo 2, células caliciformes productoras de mucina, u otras células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, o queratinocitos basales (y sus progenitores) contenidos en la piel, pulmón, hígado, vejiga, ojo, glándulas salivares, o tracto gastrointestinal; reducen los efectos secundarios de la toxicidad intestinal producidos por radiación, tratamientos de quimioterapia o infecciones virales; citoprotector, especialmente de la mucosa del intestino delgado o vejiga; mucositis (úlceras bucales); regeneración de piel; defectos cutáneos en su grosor total y/o parcial, incluyendo quemaduras, (p. ej., repoblación de folículos capilares, glándulas sebáceas y sudoríparas); psoriasis; epidermólisis bullosa, ampollas; úlceras duodenales y/o gástricas; reducen las cicatrizaciones; enfermedades intestinales inflamatorias; enfermedad de Crohn; colitis ulcerosa; toxicidad intestinal; daño pulmonar; reparación del epitelio bronquiolar y/o alveolar; daño pulmonar crónico o agudo; enfisema, SDRA; daños por inhalación; enfermedades de la membrana hialina; síndrome de dificultad respiratoria en bebés; displasia broncopulmonar en bebés prematuros; insuficiencia hepática fulminante; cirrosis; daño hepático causado por hepatitis viral y/o sustancias tóxicas; diabetes mellitus;



: inflamaciones; cáncer; trastornos digestivos.

Ghrelina (N.° de acceso en Genbank AB029434): Estimula la liberación de la hormona de crecimiento de la adenohipófisis. Estimula el apetito y reduce la quema de grasas. El apetito y la ingesta de alimentos pueden medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Batterham et al. Nature 2002; 418: 650654). Sistema endocrino; pérdida de peso corporal; pérdida de peso corporal asociada a cáncer o anorexia nerviosa; falta de apetito; apetito excesivo; ganancia de peso corporal; Obesidad; diabetes; acromegalia; deficiencia en el crecimiento; deficiencia en la hormona de crecimiento; retraso en el crecimiento y deficiencia de crecimiento para el síndrome de Prader-Willi en niños de 2 años o más; deficiencias en crecimiento; deficiencia de crecimiento asociado con insuficiencia renal crónica; osteoporosis postmenopáusica; quemaduras; caquexia; cáncer; enanismo; trastornos metabólicos; obesidad; insuficiencia renal; síndrome de Turner; de tipo pediátrico y en adultos; fibromialgia; tratamiento de fracturas; debilidad, emaciación por SIDA.

Anticuerpo unido a Ghrelina que incluye fragmento de anticuerpo, o forma negativa dominante de Ghrelina.: Inhibe la liberación de la hormona de crecimiento en respuesta a la Ghrelina; inhibe el aumento de apetito. El apetito y la ingesta de alimentos pueden medirse con procedimientos conocidos en la técnica (Batterham et al. Nature 2002; 418: 650654). Sistema endocrino; obesidad; diabetes; ganancia de peso corporal; apetito excesivo; pérdida de apetito; pérdida de peso corporal.

Fragmento de péptido de receptor NOGO-66 [N.° de acceso de Genbank NP_008939 (aminoácidos 62-101)]: Trastornos neurodegenerativos; lesión de la médula espinal; lesión neuronal; traumatismo cerebral; ictus; esclerosis múltiple (EM); trastornos de desmielinización; enfermedades neurológicas y de la actividad neuronal, regeneración y/o crecimiento de células neuronales (p. ej., neuronas, células gliales, y células de Schwann)

Polipéptido inhibidor gástrico (GIP), que incluye fragmentos de GIP (N.° de acceso de Genbank NM_004123): Aumenta la captación de nutrientes y la acumulación de triglicéridos en los adipocitos, originando obesidad y resistencia a la insulina. Tanto la captación de nutrientes como la acumulación de triglicéridos puede medirse con procedimientos descritos en Miyawaki et al., Nat. Medicine, 2002, Vol 8(7): 738742. Las más preferidas: pérdida de peso corporal; emaciación por SIDA, caquexia, y pérdida de apetito. Otras: obesidad; resistencia a la insulina; ganancia de peso corporal; apetito excesivo.

Anticuerpo de polipéptido inhibidor gástrico, o fragmentos de anticuerpo: Uso incrementado de grasas como fuente predominante de energía; disminución de la acumulación de grasas en adipocitos. La utilización de las grasas como fuente de energía puede medirse tal como se describe en Miyawaki et al., Nat. Medicine, 2002, Vol 8(7): 738-742. Obesidad; diabetes; resistencia a la insulina; ganancia de peso corporal.

Receptor de péptido inhibidor gástrico o variantes o fragmentos de receptor que incluyen fragmentos o variantes solubles (Número de acceso de Genbank NM_000164): Uso incrementado de grasas como fuente predominante de energía; disminución de la acumulación de grasas en adipocitos. La utilización de las grasas como fuente de energía puede medirse tal como se describe en Miyawaki et al., Nat. Medicine, 2002, Vol 8(7): 738-742. Las más preferidas: Obesidad; diabetes; ganancia de peso corporal; apetito excesivo; resistencia a la insulina. Otras: pérdida de peso corporal; emaciación por SIDA, pérdida de apetito.

POMC (proopiomelanocortina), que incluye fragmentos o variantes (tales como, por ejemplo, hormona estimulante de melanocitos-alfa, aMSH, hormona estimulante de melanocitos gamma, yMSH, hormona estimulante de melanocitos beta, pMSH, adrenocorticotropina, ACTH, beta-endorfina, met-encefalina) (Número de acceso de Genbank NM 000930): La actividad de fragmentos derivados de la POMC es diversa y bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Hadley et al., Ann N Y Acad Sei 1999 Oct 20; 885: 121; Dores, Prog Clin Biol Res 1990; 342: 22-7; Blalock, Ann N Y Acad Sei. 1999 Oct 20; 885: 161-72). Preferidas: resistencia al estrés; actividad antiinflamatoria; actividad analgésica; aumento de la pigmentación cutánea; aumento del catabolismo proteico; aumento de gluconeogénesis; obesidad, diabetes. Otras: disminución del catabolismo proteico, disminución de la pigmentación cutánea, enfermedad de Addison, síndrome de Cushing

HP 467, HP228 (Pat. de EE. UU. n.° 6.350.430.: Véase la Pat. de EE. UU. n.° 6.350.430. Véase la Pat. de EE. UU. n.° 6.350.430. Resistencia al estrés; actividad antiinflamatoria; actividad analgésica; aumento de la pigmentación cutánea; aumento del catabolismo proteico; aumento de gluconeogénesis.

NDP (Pat. de EE. UU. n.° 6.350.430.: Véase la Pat. de EE. UU. n.° 6.350.430. Véase la Pat. de EE. UU. n.° 6.350.430. Resistencia al estrés; actividad antiinflamatoria; actividad analgésica; aumento de la pigmentación cutánea; aumento del catabolismo proteico; aumento de gluconeogénesis.

Interleucina-21 (IL-21): Inmunomodulador; inhibe la producción de interferón gamma por las células-Th1. Se pueden realizar ensayos sobre la actividad de la IL-21 con la medición de la producción de interferón gamma en las células-Th1. (Wurster et al., J Exp Med 2002 Oct 7; 196(7): 969-77) Trastornos autoinmunitarios; trastornos inflamatorios; tratamiento de psoriasis; artritis reumatoide; enfermedad intestinal inflamatoria.

Interleucina-4 (IL-4): Inmunomodulador; favorece la diferenciación de las células-T dentro del fenotipo Th2. La actividad de la IL-4 puede evaluarse con la medición in vitro de las respuestas de citocinas Th1/Th2 en las células aisladas del bazo. (Waltz et al., Horm Metab Res 2002 Oct; 34(10): 561-9). Tratamiento de psoriasis; trastornos autoinmunitarios; artritis reumatoide; enfermedad intestinal inflamatoria; trastornos inflamatorios.

Lectina inhibidora de osteoclastos (OCIL): Inhibe la formación de osteoclastos. La actividad inhibitoria de la lectina puede evaluarse mediante ensayos sobre la formación de osteoclastos conocidos en la técnica. (Zhou et al., J Biol Chem 2002 Dec 13; 277(50): 48808-15) Tratamiento de trastornos óseos; osteoporosis; prevención de fracturas; hipercalcemia; hipercalcemia maligna; enfermedad de Paget; osteopenia; osteoclastogénesis; osteólisis; osteomielitis; osteonecrosis; pérdida ósea periodontal; osteoartritis; artritis reumatoide; osteoporosis; enfermedad ósea metastásica, lítica o periodontal; inhibición de la diferenciación osteoclástica; regeneración y cicatrización ósea.

Inhibidor PCSK9: Inhibe la interacción de PCSK9 con el receptor LDL. Mayor disminución de LDL actuando sobre PCSK9 en la enfermedad arterial coronaria (Further LDL lowering through targeting PCSK9 for coronary artery disease). (Cao et al. Endocrine, Metabolie & Tratamiento de la enfermedad cardíaca coronaria.


: Immune Disorders- Drug Targets 2008, 8, 238-243)

Actividad funcional:

5 "Un polipéptido que tiene actividad funcional" se refiere a un polipéptido capaz de mostrar una o más actividades funcionales conocidas y asociadas con la forma madura, proproteína y longitud completa de un polipéptido de carga. Dichas actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, antigenicidad [capacidad para unirse (o competir con un polipéptido en la unión) a un anticuerpo antipolipéptido], inmunogenicidad (capacidad para generar anticuerpos que se unen a un polipéptido específico descrito en el presente documento), capacidad para 10 forma multímeros con los polipéptidos descritos en el presente documento, y la capacidad para unirse a un receptor o ligando para un polipéptido. En ciertas realizaciones, la actividad funcional incluye la capacidad para mejorar la expresión y estabilidad de una proteína pareja.

"Un polipéptido que tiene actividad biológica" se refiere a un polipéptido que exhibe una actividad semejante a, 15 aunque no necesariamente idéntica a, una actividad de una proteína terapéutica descrita en el presente documento, que incluye formas maduras, tal y como se mide en un ensayo biológico específico, con o sin dependencia de dosis. En el caso de existir una dependencia de dosis, no necesita ser idéntica a la del polipéptido, sino más bien sustancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad dada en comparación al polipéptido descrito en el presente documento (es decir, el polipéptido candidato mostrará mayor actividad o no superior de 20 aproximadamente 25 veces menos, o no superior de aproximadamente tres veces menos de actividad relacionada con un polipéptido descrito en este documento, o presentado en la tabla 2).

En ciertas realizaciones, un heteromultímero descrito en el presente documento tiene al menos una actividad terapéutica y/o biológica asociada con la molécula de carga, cuando dicha molécula de carga no está unida al 25 polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, un heteromultímero descrito en el presente documento tiene al menos una actividad terapéutica y/o biológica asociada con el polipéptido de carga, cuando dicho polipéptido de carga no está unido al polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, una proteína heteromultimérica descrita en el presente documento tiene al menos una actividad terapéutica y/o biológica asociada con la porción de polipéptido de carga (o fragmento o variante del mismo), cuando dicho polipéptido de carga no está unido al polipéptido basado 30 en albúmina o aloalbúmina.

Las proteínas heteromultiméricas descritas en el presente documento pueden analizarse con respecto a su actividad funcional (p. ej., actividad biológica) con el uso o modificación rutinaria de ensayos conocidos en la técnica, además de con ensayos descritos en este documento. Adicionalmente, un experto en la materia puede realizar 35 rutinariamente ensayos de los fragmentos de una proteína que correspondan a la porción de proteína de carga de un polipéptido basado en albúmina o aloalbúmina, respecto a su actividad y con ensayos indicados en su correspondiente fila dentro de la tabla 2 (p. ej., en la columna 3 de la tabla 2). En ciertas realizaciones, se realizan ensayos de fragmentos de una proteína de albúmina que corresponden a una porción de proteína de albúmina de un heteromultímero, respecto a su actividad y mediante ensayos conocidos en la técnica y/o como se describe en 40 los ejemplos de la sección siguiente.

Por ejemplo, en una realización donde alguien realiza ensayos respecto a la capacidad de una proteína heteromulimérica descrita en el presente documento para unir o competir con un polipéptido de carga para la unión a un anticuerpo de polipéptido anti-carga y/o anticuerpo anti-albúmina, pueden usarse varios inmunoensayos 45 conocidos en la técnica, que incluyen, aunque no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción enzimática), inmunoensayos tipo "sandwich", ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando marcados de radioisótopo, enzima, u oro coloidal, por ejemplo), western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (p. ej., ensayos de aglutinación de gel, 50 ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de

proteína A, así como ensayos de inmunoelectrofóresis, etc. En una realización, la unión de anticuerpo es detectada mediante la detección de un marcado en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario es detectado con la detección de la unión de un anticuerpo secundario reactivo al anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario es marcado. Existen muchos medios conocidos en la técnica para 5 detectar la unión en un inmunoensayo y que se encuentran en el ámbito de la presente invención.

En ciertas realizaciones, donde un colaborador de unión (p. ej., un receptor o un ligando) es identificado por una molécula de carga comprendida por un heteromultímero descrito en el presente documento, uniéndose a ese colaborador de unión por un heteromultímero descrito en este documento es analizado, p. ej., por medios bien 10 conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía de gel reductor y no reductor, cromatografía de afinidad a proteína, y absorción de afinidad. Véase grosso modo, Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995). En otra realización, la capacidad de los correlatos fisiológicos de una proteína heteromultimérica para unirse a un sustrato(s) de polipéptidos que correspondan a la porción de proteína de carga del heteromultímero puede analizarse rutinariamente mediante técnicas conocidas en la técnica.

15

Actividades biológicas

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros, descritos en el presente documento, se utilizan en ensayos para probar una o más actividades biológicas. Si un heteromultímero muestra una actividad en un ensayo particular, es 20 probable que al menos una proteína de carga comprendida por uno o más monómeros del heteromultímero esté implicada en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. De este modo, el heteromultímero es para uso en un tratamiento de la enfermedad asociada.

En ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno que comprende la 25 administración a un paciente para el que se desea tal tratamiento, prevención o mejora, de un heteromultímero descrito en este documento, en una cantidad efectiva para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.

En el presente documento se proporcionan proteínas de fusión basadas en aloalbúmina o albúmina monoméricas producidas por una célula, donde dichas proteínas son codificadas por polinucleótidos, donde dichas proteínas 30 monoméricas comprenden al menos una proteína de carga, y un polipéptido derivado de albúmina o aloalbúmina, tal que dichos monómeros forman heteromultímeros en una solución. En ciertas realizaciones, cuando los polinucleótidos son usados para expresar la proteína codificada de una célula, las etapas de procesamiento y secreción natural de la célula producen una proteína que carece al menos de una secuencia de señal. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia de señal es bien conocida en la técnica.

35

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema endocrino. En algunas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema nervioso.

40

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema inmunológico. En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del aparato respiratorio.

45

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del sistema cardiovascular. En algunas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del aparato reproductor.

50

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos del aparato digestivo. En ciertas realizaciones, las proteínas de heteromultímeros descritas en este documento se usan en el diagnóstico, prognosis, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos en la sangre.

55

En ciertas realizaciones, los heteromultímeros descritos en este documento se usan en el diagnóstico, y/o prognosis de enfermedades y/o trastornos asociados con al menos un tejido(s) en el que al menos se expresa un gen de interés, donde un heteromultímero descrito en el presente documento comprende una molécula de carga que se une a dicho y, al menos, único gen de interés.

60

En algunas realizaciones, los heteromultímeros descritos en el presente documento y/o los polinucleótidos que codifican los monómeros basados en albúmina/aloalbúmina que se asocian para formar heteromultímeros descritos

en este documento, se utilizan en el diagnóstico, detección y/o tratamiento de las enfermedades y/o trastornos asociados con las actividades que incluyen, aunque no se limitan a, activación de prohormona, proliferación celular, diferenciación celular, y migración de células.

5 Usos terapéuticos:

En un aspecto, los heteromultímeros descritos en el presente documento se orientan a terapias basadas en anticuerpos que implican la administración de los heteromultímeros descritos que comprenden polipéptido(s) de carga que es un anticuerpo, o fragmento o variante de un anticuerpo, a un paciente para tratar una o más 10 afecciones, trastornos o enfermedades descritas. Los compuestos terapéuticos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, heteromultímeros descritos en este documento, y ácidos nucleicos que codifican los heteromultímeros descritos en este documento.

En una realización específica, hay terapias basadas en anticuerpos que implican la administración de 15 heteromultímeros descritos en este documento que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo, a un paciente para tratar una o más enfermedades, trastornos o afecciones, que incluyen, pero no se limitan a, trastornos neuronales, trastornos del aparato reproductor, trastornos gastrointestinales, trastornos pulmonares, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos proliferativos, y/o enfermedades y afecciones cancerosas, y/o tal como se describe en otras partes del presente.

20

Un resumen de las formas en las cuales las proteínas de heteromultímeros de la invención que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo son usadas terapéuticamente, incluye la unión local o sistemática en el cuerpo o mediante citotoxicidad directa del anticuerpo, p. ej., como es mediado por un complemento (CDC) o mediante células efectoras (ADCC). Algunos de estos enfoques se describen a continuación con más detalle. 25 Provisto con las enseñanzas proporcionadas en este documento, un experto en la materia sabrá cómo dar uso a los heteromultímeros descritos en el presente documento con respecto al diagnóstico, supervisión o propósitos terapéuticos, sin excesiva experimentación.

Los heteromultímeros descritos en el presente documento que comprenden al menos un fragmento o variante de un 30 anticuerpo pueden ser administrados solos o en combinación con otros tipos de tratamiento (p. ej., radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y agentes anti-tumorales). En general, se prefiere la administración de productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que sea la misma especie del paciente. Así, en una realización, los anticuerpos, fragmentos, derivados, análogos, o ácidos nucleicos humanos son administrados a un paciente humano para su tratamiento o profilaxis.

35

Terapia génica:

En una realización específica, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican las proteínas de los heteromultímeros descritos en este documento son administrados para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o 40 trastorno asociado con la expresión aberrante y/o actividad de la proteína, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresable o expresado. En esta realización de la invención, los ácidos nucleicos producen sus proteínas codificadas que median un efecto terapéutico. Puede usarse cualquiera de los procedimientos disponibles en la técnica para la terapia génica.

45

Demostración de la actividad profiláctica o terapéutica:

Los heteromultímeros o composiciones farmacéuticas descritas en este documento se han probado in vitro, y posteriormente in vivo con respecto a la actividad profiláctica o terapéutica deseada, y antes de su uso en humanos. 50 Por ejemplo, los ensayos in vitro han demostrado la utilidad profiláctica o terapéutica que una composición farmacéutica incluye, en el efecto de un compuesto sobre una línea celular o una muestra de tejido de paciente. El efecto del compuesto o composición sobre la línea celular y/o muestra de tejido puede determinarse con el uso de técnicas conocidos por los expertos en la materia que incluyen, aunque no se limitan a, los ensayos de formación de roseta y los ensayos de lisis celular. De acuerdo con la invención, los ensayos in vitro pueden usarse para 55 determinar si está indicada la administración de un compuesto específico, incluidos los ensayos de cultivo celular in vitro en los que una muestra de tejido de un paciente ha crecido cultivada, y a la que está expuesto de otra forma un heteromultímero, y qué efecto se observa de dicho heteromultímero sobre esta muestra de tejido.

Composición y administración terapéutica/profiláctica

60

Se proporcionan procedimientos de tratamiento, inhibición y profilaxis para la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un heteromultímero o composición farmacéutica descritos en este documento. En una

realización, el heteromultímero es purificado sustancialmente (p. ej., sustancialmente libre de sustancias que limiten su efecto o provoquen efectos secundarios no deseados). En ciertas realizaciones, el sujeto es un animal, que incluye, aunque no se limita a, animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y en ciertas realizaciones, un mamífero, y con la máxima preferencia un humano.

5

Se conocen varios sistemas de aplicación y pueden usarse para administrar una formulación de un heteromultímero descrito en el presente documento, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor [véase, p. ej., Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)], construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Las 10 formas de introducción incluyen, pero no se limitan a, la intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, así como vías orales. Los compuestos o composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de las capas mucocutánea o epitelial (p. ej., mucosa bucal, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes activos biológicamente. La administración puede ser sistémica o local. Además, en ciertas realizaciones, es 15 deseable introducir las composiciones de heteromultímero descritas en este documento en el sistema nervioso central mediante cualquier vía disponible, que incluye inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. También puede emplearse una administración pulmonar, p. ej., con el uso de un inhalador o nebulizador, o bien una formulación con un agente en aerosol.

20

En una realización específica, es deseable administrar los heteromultímeros, o las composiciones descritas en este documento de forma local en el área donde el tratamiento sea necesario; esto puede lograrse, por ejemplo, y sin intención de limitar, mediante infusión local durante cirugía, aplicación tópica, p. ej., junto con un apósito para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por 25 medio de un implante, dicho implante que sea de un material poroso, o no poroso o bien gelatinoso, y que incluya membranas, tales como membranas de Silastic, o fibras. Preferentemente, al administrar una proteína, que incluya un anticuerpo, de la invención, debe procurarse usar materiales que no absorban la proteína.

En otra realización, los heteromultímeros o la composición pueden administrarse a través de una vesícula, en 30 particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez- Berestein, ibid., pp. 317-327; véase grosso modo ibid.)

En todavía otra realización, los heteromultímeros o la composición pueden administrarse con un sistema de 35 liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. 40 Macromol. Chem. 23:61 (1983); see also Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). En todavía otra realización, puede colocarse un sistema de liberación controlada proximal a la diana terapéutica, p. ej., el cerebro, de este modo, se necesita únicamente una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

45

Otros sistemas de liberación controlada se tratan en una revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

En una realización específica que comprende un ácido nucleico que codifica un heteromultímero descrito en el presente documento, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para favorecer la expresión de la proteína 50 codificada, mediante su construcción como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrarlo de tal forma que se vuelva intracelular, p. ej., con el uso de un vector retroviral (véase la Pat. de EE.

UU. con n.° 4.980.286), o mediante inyección directa, o gracias al uso de bombardeo de micropartículas (p. ej., con

una pistola génica o biolística, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o mediante su administración en unión con un péptido semejante al homeobox, conocido por su 55 introducción en el núcleo (véase p. ej., Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para su expresión, mediante recombinación homóloga.

En este documento, también se proporcionan composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una 60 cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto, y un vehículo aceptable farmacéuticamente. En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia

reguladora del gobierno federal o estatal, o bien se enumera en la Farmacopea de Estados Unidos u otra

farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo transportador con el que se administra la terapéutica. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluidos los provenientes del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, 5 aceite mineral, aceite de sésamo y otros. El agua es el vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra vía intravenosa. Las soluciones salinas y la dextrosa acuosa, junto con las soluciones de glicerol, también pueden emplearse como vehículos de líquidos, en particular en las soluciones inyectables. Algunos excipientes farmacéuticos incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, cal, gel de sílice, estearato sódico, monostearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada y deshidratada, glicerol, propileno, glicol, 10 agua, etanol y otros. La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes de pH. Estas composiciones pueden adquirir la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, pastillas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y otros. La composición puede formularse como un supositorio, con los tradicionales aglutinantes y vehículos tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar tal como calidades farmacéuticas de manitol, 15 lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos apropiados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, preferentemente en su forma purificada, junto con una cantidad apropiada de vehículo que proporciona la forma con la que se administrará adecuadamente al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

20

En ciertas realizaciones, la composición que comprende el heteromultímero se formula de acuerdo con los procedimientos habituales como una composición farmacéutica adaptada a la administración intravenosa en seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un tampón acuoso, isotónico y estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un

25 anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Generalmente, los ingredientes se

suministran ya sea de forma separada o mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como polvos liofilizados secos o concentrado sin agua en un envase sellado herméticamente tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad del agente activo. Cuando la composición deba administrarse mediante infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contenga suero o agua de calidad farmacéutica y estéril. Cuando la composición es

30 administrada por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyectar o suero con objeto de

que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en este documento se formulan en formas salinas o neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas por aniones tales como las derivadas de ácidos 35 tartáricos, oxálicos, acéticos, fosfóricos, hidroclóricos, etc., y aquellas formadas por cationes tales como las derivadas del sodio, potasio, amonio, calcio, isopropalamina de hidróxido de hierro, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc.

La cantidad de la composición descrita en el presente documento que será efectiva en el tratamiento, inhibición y 40 prevención de una enfermedad o trastorno asociado con expresión aberrante y/o actividad de una proteína terapéutica puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptima. La dosis precisa emplearse en la formulación dependerá también de la vía de administración, y la gravedad del trastornos o enfermedad, y deberá decidirse de acuerdo con el juicio clínico del especialista y según las circunstancias del paciente. Las dosis efectivas 45 son extrapoladas a partir de las curvas dosis-respuesta derivadas de los sistemas de pruebas de modelos animales o in vitro.

Procedimientos de producción sintética y recombinante de proteínas de heteromultímero:

50 En ciertas realizaciones, los heteromultímeros son producidos como moléculas recombinantes mediante secreción de levadura, un microorganismo tal como una bacteria, o una línea celular animal o humana. En realizaciones, los polipéptidos son secretados a partir de las células huésped.

Las realizaciones incluyen una célula, tal como una célula de levadura transformada para expresar una proteína de 55 heteromultímero descrito en el presente documento. Aparte de las células de huésped transformadas en sí mismas, se proporcionan cultivos de esas células, preferentemente un cultivo (clonalmente homogéneo) monoclonal, o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio de nutriente. Si el polipéptido es secretado, el medio contendrá el polipéptido, con las células, o sin ellas, en caso de ser filtradas o centrifugadas. Se conocen muchos sistemas de expresión y pueden usarse, incluyendo bacterias (por ejemplo, E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por 60 ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris, hongos filamentosos (por ejemplo, Aspergillus), células de vegetales, células animales y células de insectos.

Un heteromultímero descrito en este documento es producido de formas convencionales, por ejemplo, a partir de una secuencia codificante insertada en el cromosoma huésped o en un plásmido libre. La levadura se transforma con una secuencia codificante para la proteína deseada en cualquiera de las formas habituales, por ejemplo, electroporación. Los procedimientos para la transformación de levadura se describen en Becker & Guarente (1990) 5 Methods Enzymol. 194, 182.

Las células-T transformadas con éxito, es decir, células que contienen un constructo de ADN de la presente invención, pueden identificarse mediante bien conocidas técnicas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un constructo de expresión pueden desarrollarse para producir el polipéptido deseado. Las células

10 pueden recogerse y lisarse, y su contenido en ADN examinarse para la presencia de ADN mediante un

procedimiento tal como el descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Alternativamente, la presencia de la proteína en el sobrenadante puede detectarse mediante anticuerpos.

Algunos vectores de plásmido de levadura útiles incluyen pRS403-406 y pRS413-416 y están disponibles

15 generalmente gracias a Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif. 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403,

pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integradores de levadura (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, 7RP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de levadura (Ycps).

20 Se han desarrollado una variedad de procedimientos para unir operativamente ADN a vectores a través de terminales cohesivos complementarios. Por ejemplo, pueden añadirse tramos de homopolímero complementario al segmento de ADN para insertarlo en el ADN del vector. El vector y el segmento de ADN están entonces unidos por un enlace de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.

25

Los conectores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción proporcionan un procedimiento alternativo de unión del segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por digestión restrictiva de endonucleasa, es tratado con polimerasa de ADN de bacteriófagos T4 o polimerasa 1 de ADN de E. coli, enzimas que eliminan los terminales monocatenarios sobresalientes con sus actividades 3' 5'-exonucleóticas, y rellenan los 30 3'-extremos encastrados con sus actividades polimerizantes.

La combinación de estas actividades por consiguiente genera segmentos de ADN de extremo romo. Los segmentos de extremo romo son incubados con un gran exceso molar de moléculas de conectores en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la ligadura de las moléculas de ADN con extremo romo, tal como la ligasa de ADN de 35 bacteriófago T4. Por lo tanto, los productos de la reacción son segmentos de ADN que portan secuencias de conectores poliméricos en sus extremos. Estos segmentos de ADN son escindidos con la apropiada enzima de restricción y ligados a un vector de expresión que ha sido escindido con una enzima que produce terminales compatibles con aquellos del segmento de ADN.

40 Los conectores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa restrictiva están comercialmente disponibles por varias fuentes que incluyen International Biotechnologies Inc, New Haven, Conn., EE. UU.

Algunos géneros ilustrativos de levadura contemplados por su utilidad en la práctica de la presente invención como huéspedes para expresar proteínas de fusión y albúmina son: Pichua (anteriormente clasificado como Hansenula), 45 Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor, Neurospora, Yarrowia, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y otros. Los géneros preferidos son aquellos seleccionados de entre el grupo consistente en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Torulaspora. Algunos ejemplos de Saccharomyces 50 spp. son S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii.

Algunos ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie adecuada de Torulaspora es T. delbrueckii. Algunos ejemplos de Pichia (Hansenula) spp. son P. angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anomala (anteriormente H. anomala) y P. pastoris. Algunos procedimientos de transformación de S. 55 cerevisiae son enseñados grosso modo en EP 251 744, eP 258 067 y WO 90/01063.

Las especies preferidas ilustrativas de Saccharomyces incluyen S. cerevisiae, S. italicus, S. diastaticus, y Zygosaccharomyces rouxii. Las especies preferidas ilustrativas de Kluyveromyces incluyen K. fragilis y K. lactis. Las especies preferidas ilustrativas de Hansenula incluyen H. polymorpha (ahora Pichia angusta), H. anomala (ahora 60 Pichia anomala), y Pichia capsulata. Una especie preferida ilustrativa y adicional de Pichia incluye P. pastoris. Las especies preferidas ilustrativas de Aspergillus incluyen A. niger y A. nidulans. Las especies preferidas ilustrativas de Yarrowia incluyen Y. lipolytica. Existen muchas especies preferidas de levadura disponibles en la ATCC. Por

ejemplo, las siguientes especies de levadura preferidas están disponibles en la ATCC y son útiles en la expresión de proteínas de fusión de albúmina: Saccharomyces cerevisiae, Hansen, cepa teleomorfa BY4743, mutante yap3 (N.° de acceso en ATCC 4022731); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorfa BY4743, mutante hsp150 (N.° de acceso en ATCC 4021266); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorfa BY4743, mutante pmtl (N.° de 5 acceso en ATCC 4023792); Saccharomyces cerevisiae Hansen, teleomorfa (N.os de acceso en ATCC 20626; 44773; 44774; y 62995); Saccharomyces diastaticus Andrews et Gilliland ex van der Walt, teleomorfa (N.° de acceso en ATCC 62987); Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt, teleomorfa (N.° de acceso en ATCC 76492); Pichia angusta (Teunisson et al.) Kurtzman, teleomorfa depositada como Hansenula polymorpha de Morais et Maia, teleomorfa (N.° de acceso en ATCC 26012); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (N.° de acceso en ATCC 10 9029); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (N.° de acceso en ATCC 16404); Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, anamorfa (N.° de acceso en ATCC 48756); y Yarrowia lipolytica (Wickerham et al.) van der Walt et von Arx, teleomorfa (N.° de acceso en ATCC 201847).

Los promotores adecuados para S. cerevisiae incluyen aquellos asociados con el gen PGKI, o los genes GAL1 o 15 GAL10, CYCI, PH05, TRP1, ADH1, ADH2, los genes para gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, triosa fosfata isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, glucoquinasa, feromona de factor alfa-apareamiento, [feromona de factor a-apareamiento], el promotor de PRBI, el promotor de GUT2, el promotor de GPDI, y los promotores híbridos que incluyen híbridos de partes de regiones regulatorias 5' con partes de regiones regulatorias 5' de otros promotores o con sitios de activación ascendentes (p. ej. el promotor 20 de EP-A-258 067).

Promotores regulables convenientes para uso en Schizosaccharomyces pombe son el promotor tiamina-represible del gen nmt como se describe por Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864 y el promotor del gen jbpl glucosa-represible como se describe porHoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816.

25

Algunos procedimientos de transformación de Pichia para la expresión de genes extraños, se enseñan en, por ejemplo, Cregg et al. (1993), y varias patentes de Phillips (p. ej., la de EE. UU. con n.° 4.857.467,), y los kits de expresión de Pichia están disponibles comercialmente gracias a Invitrogen BV, Leek, Países Bajos, y Invitrogen Corp., San Diego, Calif. Algunos promotores adecuados incluyen AOX1 y AOX2.Gleeson et al. (1986) J. Gen. 30 Microbiol. 132, 3459-3465 incluyen información sobre la transformación y los vectores Hansenula, siendo algunos promotores adecuados MOX1 y FMD1; mientras la EP 361 991, Fleer et al. (1991) y otras publicaciones de Rhone- Poulenc Rorer enseñan como expresar proteínas extrañas en Kluyveromyces spp., siendo PGKI un promotor adecuado.

35 La señal de finalización de transcripción es preferentemente una secuencia flanqueante 3' de un gen eucariótico que contiene señales adecuadas para la finalización y poliadenilación de la transcripción. Las secuencias flanqueantes 3' pueden, por ejemplo, ser aquellas del gen naturalmente unidas a la secuencia de control de la expresión usada, es decir, pueden corresponder al promotor. Alternativamente, pueden ser diferentes, en cuyo caso se prefiere la señal de finalización del gen ADHI de S. cerevisae.

40

En ciertas realizaciones, la proteína del heteromultímero deseada es expresada inicialmente con una secuencia del líder de secreción, que puede ser cualquier líder efectivo en la levadura elegida. Algunos líderes útiles en S. cerevisiae incluyen las provenientes del polipéptido del factor alfa de apareamiento (MFa-1) y los líderes híbridos de EP-A-387 319. Dichos líderes (o señales) son escindidos por la levadura antes de que la albúmina madura sea 45 liberada en el medio circundante. Dichos líderes adicionales incluyen aquellos de la invertasa de S. cerevisiae (SUC2) descritos en JP 62-096086 (concedida como911036516), fosfatasa ácida (PH05), la presecuencia de MFa-1, 0 glucanasa (BGL2) y la toxina asesina; la glucoamilasa Il de S. diastaticus; la a-galactosidasa (MEL1) de S. carlsbergensis; la toxina asesina de K. lactis; y la glucoamilasa de Cándida.

50 Se proporcionan vectores que contienen un polinucleótido que codifica una proteína de heteromultímero descrito en el presente documento, las células huésped, y la producción de proteínas de heteromultímero mediante técnicas recombinantes y sintéticas. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, de tipo viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser aptos o no aptos para la replicación. En el segundo caso, la propagación viral se dará generalmente solo al complementar células huésped.

55

En ciertas realizaciones, los polinucleótidos que codifican proteínas de heteromultímero descritas en el presente documento están unidas a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un huésped. En general, un vector de plásmido es introducido en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede ser empaquetado in vitro con el uso de una 60 línea celular empaquetadora apropiada y después transducido dentro de las células huésped.

En ciertas realizaciones, el inserto de polinucleótido está unido operativamente a un promotor apropiado, tal como el

promotor PL lambda de fago, los promotores E. coli, lac, trp, phoA y rac; los promotores tardíos y tempranos SV40 y los promotores de LTR retrovirales, por nombrar algunos. Habrá otros promotores adecuados conocidos por el experto en la materia. Los constructos de expresión contendrán además sitios para la iniciación de la transcripción y la finalización, y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante de los 5 transcritos expresados por los constructos incluirá preferentemente un codón de iniciación de traducción al inicio y un codón de finalización (UAA, UGA o UAG) apropiadamente posicionado al final del polipéptido a traducirse.

Tal como se indicó, los vectores de expresión incluirán preferentemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, G418, glutamina sintasa, o neomicina resistencia para el cultivo celular 10 eucariótico, y genes de tetraclina, kanamicina o amicilina resistencia para el cultivo en E. coli y otras bacterias. Algunos ejemplo representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como la células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas como las células de levadura [p. ej., Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (N.° de acceso en ATCC 201178)]; células de insectos como las células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como las células de CHO, COS, NSO, 293, y las 15 células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Algunos medios y condiciones de cultivo apropiados para las células de huésped anteriormente descritas se conocen en la técnica.

Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles con QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A; pNH46A, disponibles con 20 Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles con Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles con Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles con Pharmacia. Los vectores de expresión preferidos para uso en sistemas de levadura se incluyen, aunque no exclusivamente, pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, y PAO815 (todos disponibles 25 gracias a Invitrogen, Carlbad, CA). Habrá otros vectores adecuados evidentes para el experto en la materia.

En una realización, los polinucleótidos que codifican una proteína de heteromultímero descrito en el presente documento están fusionados con las secuencias de señal que dirigirán la localización de una proteína de la invención a compartimentos particulares de una célula eucariótica o procariótica y/o dirigirán la secreción de una 30 proteína de la invención desde una célula eucariótica o procariótica. Por ejemplo, en E. coli, uno puede desear dirigir la expresión de la proteína al espacio periplásmico. Ejemplos de proteínas o secuencias de señal (o fragmentos de los mismos) en los cuales las proteínas de heteromultímero se fusionan para dirigir la expresión del polipéptido hacia el espacio periplásmico de la bacteria incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de señal pelB, la secuencia de señal de proteína unida a maltosa (MBP), MBP, la secuencia de señal ompA, la secuencia de señal de la subunidad 35 B de enterotoxina termolábil de E. coli periplásmico, y la secuencia de señal de alcalina fosfotasa. Algunos vectores están disponibles comercialmente para la construcción de proteínas de fusión que dirigirán la localización de una proteína, tales como la serie de vectores pMAL (en particular la serie pMAL-.rho.) disponibles gracias a New England Biolabs. En una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de polinucleótidos de la invención pueden fusionarse con la secuencia de señal pelB pectato liasa para aumentar la eficiencia de la 40 expresión y purificación de tales polipéptidos en las bacterias gram-negativas. Véanse las patentes de EE. UU. con n.° 5.576.195 y n.° 5.846.818).

Ejemplos de péptidos de señal que se fusionan a una proteína de heteromultímero con objeto de dirigir su secreción en células de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de señal MPIF-1 (p. ej., aminoácidos 1-21 con 45 el número de acceso de Genbank AAB51134), la secuencia de señal de estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA), y una secuencia de señal de consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG). Una secuencia de señal adecuada que puede usarse junto con sistemas de expresión baculovirales es la señal de secuencia gp67 (p. ej., aminoácidos 1-19 del número de acceso de Genbank AAA72759).

50 Los vectores que usan glutamina sintasa (GS) o DHFR como marcadores seleccionables pueden amplificarse en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de las líneas celulares (p. ej., la línea célula de mieloma murino, NSO) que son glutamina sintasa negativas. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en células que expresen glutamina sintasa [p. ej., las células del ovario de los hámsteres chinos (CHO)] 55 mediante la aportación de un inhibidor adicional para evitar el funcionamiento del gen endógeno. Un sistema de expresión de glutamina sintasa y componentes del mismo se detallan en publicaciones PCT: WO87/04462; WO86/05807; WO89/10036; WO89/10404; y WO91/06657. Adicionalmente, los vectores de expresión de glutamina sintasa pueden obtenerse gracias a Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, N.H.). La expresión y producción de anticuerpos monoclonales usando un sistema de expresión de GS en células de mieloma murino se describe en 60 Bebbington et al., Bio/technology 10:169 (1992) y en Biblia and Robinson Biotechnol. Prog. 11:1(1995).

También se proporcionan células huésped que contienen constructos de vector descritos en este documento, y

adicionalmente células huésped que contienen secuencias de nucleótidos que se asocian operativamente con una o más regiones de control heterólogo (p. ej., un promotor y/o potenciador) mediante métodos conocidos en la técnica. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior como la célula de un mamífero (p. ej., una célula derivada de humano), o una célula huésped puede ser una célula procariótica, como la célula de una bacteria. 5 Puede elegirse una cepa huésped que module la expresión de las secuencias de gen insertadas, o modifique y procese el producto génico de una forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores, así, puede controlarse la expresión del polipéptido genéticamente diseñado. Además, las diferentes células huésped tienen mecanismos específicos y características para el procesamiento translacional y postranslacional y la modificación (p. ej., fosforilación, escisión) de las proteínas. Pueden elegirse las 10 líneas celulares apropiadas para garantizar las modificaciones deseadas y el procesamiento de la proteína extraña expresada.

La introducción de los ácidos nucleicos y los constructos de ácido nucleico de la invención dentro de la célula huésped pude efectuarse mediante transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, 15 transfección mediada por lípidos catiónicos, electrovaporación, transducción, infección u otros procedimientos. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Se contempla específicamente que los polipéptidos de la presente invención pueden, de hecho, expresarse mediante una célula huésped que carezca de un vector recombinante.

20 Además de abarcar las células huésped que contienen los constructos de vector indicados en este documento, la invención también abarca las células huésped inmortalizadas, primarias y secundarias de origen vertebrado, en particular de origen mamífero, que se han diseñado para borrar o reemplazar el material genético endógeno (p. ej., la secuencia codificante que corresponde a un polipéptido de carga es reemplazada por una proteína de heteromultímero que corresponde al polipéptido de carga), y/o para incluir material genético. El material genético 25 operativamente asociado con el polinucleótido endógeno puede activar, alterar, y/o amplificar los polinucleótidos endógenos.

Además, los métodos conocidos en la técnica pueden usarse para asociar operativamente polinucleótidos heterólogos (p. ej., polinucleótidos que codifiquen una proteína de albúmina, o un fragmento o variante de los 30 mismos) y/o regiones de control heterólogo (p. ej., un promotor y/o potenciador) con secuencias de polinucleótidos endógenos que codifiquen una proteína terapéutica a través de recombinación homóloga (véase, p. ej. la patente de EE. UU. con n.° 5.641.670, emitida el 24 de junio de 1997; número de publicación internacional WO 96/29411; número de publicación internacional WO 94/12650; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

35

Las proteínas de heteromultímero descritas en el presente documento pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía hidroxilapatita, 40 cromatografía de interacción de carga hidrofóbica y cromatografía de lectina. Con la mayor preferencia, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) se emplea en la purificación.

En ciertas realizaciones, las proteínas de heteromultímero de la invención se purifican usando cromatografía de intercambio de aniones que incluye, aunque no se limita a, Q-sefarosa, DEAE sefarosa, poros HQ, poros DEAF, 45 Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Resource/Source Q y DEAE, y columnas Fractogel Q y DEAE.

En realizaciones específicas las proteínas descritas en este documento son purificadas mediante la cromatografía de intercambio de cationes que incluye, aunque no se limita a, SP-sefarosa, CM sefarosa, poros HS, poros CM, Toyopearl SP, Toyopearl CM, Resource/Source S y CM, y las columnas Fractogel S y CM.

50

Además, las proteínas de heteromultímero descritas en este documento pueden sintetizarse químicamente mediante métodos conocidos en la técnica (p. ej., véase Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N. Yand Hunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984)). Por ejemplo, un polipéptido que corresponde a un fragmento o un polipéptido pueden sintetizarse mediante un sintetizador de péptidos. Es más, si 55 se desea, los análogos de aminoácidos químicos o aminoácidos no clásicos pueden introducirse como sustitución o adición en la secuencia de polipéptidos. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2,4diaminobutírico, ácido alfa-amino isobutírico, ácido 4aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t- 60 butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, aminoácidos fluoro, aminoácidos de diseñador como aminoácidos p-metil, aminoácidos Ca-metil, aminoácidos Na-metil, y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorrotatorio) o L (levorrotatorio).

Se proporcionan heteromultímeros que son modificados diferencialmente durante o después de la traducción, p. ej., por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas 5 modificaciones químicas puede realizarse mediante técnicas conocidas que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, chimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc.

Las modificaciones postranslacionales adicionales abarcadas en este documento incluyen, por ejemplo, cadenas de 10 carbohidrato unidas a O o unidas a N, procesamiento de extremos de terminal C o terminal N), unión de restos químicos al esqueleto del aminoácido, modificaciones químicas de las cadenas de carbohidrato unidas a O o unidas a N, y adición o deleción de un residuo de metionina de terminal N como un resultado de la expresión de la célula huésped procariótica. Las proteínas de heteromultímero son modificadas con marcado detectable, tal como un marcado de afinidad, isotópico, fluorescente o enzimático para permitir la detección y aislamiento de la proteína.

15

Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos incluyen estreptavidina biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriacinilamina, clorudo dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente 20 incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen iodina, carbono, sulfuro, tritio, indio, tecnecio, talio, galio, paladio, molibdeno, xénon, fluorina.

En realizaciones específicas, las proteínas de heteromultímero o fragmentos o variantes de las mismas son unidas a 25 quelantes macrocíclicos que se asocian a iones de metales radioactivos.

Como se mencionó, el heteromultímero descrito en este documento es modificado ya sea con procesos naturales, tales como el procesamiento postranslacional, o con técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación pueda estar presente en el mismo o en diferentes grados en 30 varios sitios de un polipéptido dado. Los polipéptidos de la invención pueden ramificarse, por ejemplo, como resultado de ubuquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados pueden resultar de los procesos naturales de postraducción o pueden formarse mediante procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, 35 unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por transferencia de ARN para proteínas 40 tales como arginilación y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, págs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).

45 En ciertas realizaciones, las proteínas heteromultiméricas pueden también unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación de polipéptidos que están unidos por, se unen a, o asocian con proteínas de fusión de albúmina de la invención. Dichos soportes sólidos incluyen, aunque no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, clorudo de polivinilo o polipropileno.

50 En realizaciones donde la proteína heteromultimérica comprende solo el dominio VH de un anticuerpo, puede ser necesario y/o deseable coexpresar la proteína con el dominio VL del mismo anticuerpo, tal que la proteína de fusión de albúmina-VH y la proteína VL se asociarán (ya sea covalentemente o no covalentemente) postranslacionalmente.

En realizaciones donde la proteína heteromultimérica comprende solo el dominio VL de un anticuerpo, puede ser 55 necesario y/o deseable coexpresar la proteína con el dominio VH del mismo anticuerpo, tal que la proteína de fusión de albúmina-VL y la proteína VH se asociarán (ya sea covalentemente o no covalentemente) postranslacionalmente.

También se proporcionan en el presente documento derivados químicamente modificados de las proteínas heteromultiméricas que puedan proporcionar ventajas adicionales tal como aumento de solubilidad, estabilidad y 60 tiempo de circulación del polipéptido, o disminución de la inmunogenicidad (véase la patente deEE. UU. con n.° 4.179.337). Los restos químicos para derivatización pueden seleccionarse de entre polímeros solubles en agua tales como copolímeros de polietilenglicol, etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol de polivinilo y

otros. Las proteínas pueden modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones determinadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.

El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, 5 el peso molecular preferido está entre 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que, en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado) para una facilidad en el manejo y fabricación. Pueden usarse otros tamaños dependiendo del perfil terapéutico deseado (p. ej., la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si hay alguno en la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos del polietilenglicol en una proteína 10 terapéutica o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 105.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, o 100.000 kDa.

15

La presencia y cantidad de las proteínas de heteromultímero descritas en este documento pueden determinarse mediante ELISA, un inmunoensayo bien conocido en la técnica. En un protocolo ELISA que fuera útil para detectar/cuantificar los heteromultímeros descritos en este documento, comprendería las etapas de recubrir una placa ELISA con un anticuerpo de albúmina sérica antihumano, bloquear la placa para evitar la unión no específica, 20 lavar la placa ELISA, añadir una solución que contenga la proteína descrita en este documento (a una o a más concentraciones diferentes), añadir un anticuerpo especifico de polipéptido de anticarga secundario emparejado con el marcado detectable (tal como se describe en este documento o ya sea conocido en la técnica), y detectar la presencia del anticuerpo secundario. En una versión alternativa de este protocolo, la placa ELISA podría estar cubierta con el anticuerpo específico de polipéptido de anticarga y el reactivo secundario marcado podría ser el 25 anticuerpo específico de albúmina antihumana.

En este documento, se proporcionan heteromultímeros multifuncionales que comprenden: al menos una primera proteína monomérica que comprende (i) un primer polipéptido transportador que comprende un primer segmento de albúmina sérica y (ii) al menos un polipéptido de carga y al menos una segunda proteína monomérica que 30 comprende (iii) un segundo polipéptido transportador que comprende un segundo segmento de albúmina sérica y (iv) al menos un polipéptido de carga; donde dicho primer polipéptido transportador es diferente de dicho segundo polipéptido transportador, y donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasinatural de albúmina sérica. En ciertas realizaciones, el heteromultímero es un heterodímero. En una realización, el heteromultímero es biespecífico. En una realización, el heteromultímero es multiespecífico. En ciertas 35 realizaciones, al menos un polipéptido transportador no deriva de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores no derivan de un anticuerpo. En una realización, el heteromultímero es multifuncional. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores son derivados de albúmina. En ciertas realizaciones del heteromultímero descrito en el presente documento, los polipéptidos transportadores derivan de albúmina sérica humana de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones del heteromultímero descritas en el presente documento, los 40 polipéptidos transportadores derivan de aloalbúminas. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de carga son proteínas terapéuticas, descritas en este documento, o fragmentos o variantes de las mismas. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se fusiona al polipéptido transportador. En ciertas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se une al terminal-N del polipéptido transportador. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de carga se une al terminal-C del polipéptido transportador.

45

En ciertas realizaciones, el heteromultímero es multivalente. En una realización, el heteromultímero es bivalente. En algunas realizaciones, el heteromultímero es multiespecífico. En una realización, el heteromultímero es biespecífico. En ciertas realizaciones, los polipéptidos transportadores son derivados de albúmina. En ciertas realizaciones del heteromultímero descrito en el presente documento, los polipéptidos transportadores derivan de albúmina sérica 50 humana de la SEQ ID NO: 1.

En ciertas realizaciones, son heteromultímeros de acuerdo con la invención reivindicada, cada heteromultímero que comprende: al menos una primera proteína monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga y un primer polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO:2; y al menos una segunda proteína 55 monomérica que comprende al menos un polipéptido de carga, y un segundo polipéptido transportador que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones del heteromultímero descrito en el presente documento, al menos un polipéptido transportador deriva de aloalbúminas. En ciertas realizaciones, ambos polipéptidos transportadores derivan de aloalbúminas. En ciertas realizaciones, todos los péptidos transportadores son derivados de la misma aloalbúmina. En algunas otras realizaciones, los polipéptidos transportadores son 60 derivados de diferentes aloalbúminas. En algunas realizaciones, cada polipéptido transportador es un derivado de aloalbúmina basado en una aloalbúmina seleccionada de la tabla 2. En ciertas realizaciones, la primera proteína monomérica comprende dos polipéptidos de carga. En algunas realizaciones, la segunda proteína monomérica

comprende dos polipéptidos de carga.

En algunas realizaciones de los heteromultímeros descritos en el presente documento, al menos un polipéptido de carga es un anticuerpo terapéutico o un fragmento o variante del mismo, donde el anticuerpo se selecciona de entre 5 abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, certuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, gemtuzumab ozagamicina, golimumab, ibritumomab tiuxetán, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, toclizumab, 10 tositumomab, trastuzumab, Proxinium, Rencarex, ustekinumab, y zalutumumab. En ciertas realizaciones, el anticuerpo terapéutico se une a un antígeno de cáncer.

Se proporciona, en el presente documento, que de acuerdo con la invención reivindicada son heteromultímeros, donde al menos un polipéptido de carga es una enzima, antígeno, quimiotoxina, radiotoxina, citoquina o variantes o 15 fragmentos de los mismos.

Se proporciona, en el presente documento, que de acuerdo con la invención reivindicada son heteromultímeros, donde el polipéptido de carga está unido al polipéptido transportador mediante conjugación química, ligadura natural, ligadura química, un enlace disulfido o fusión.

20

En el presente documento se proporcionan células huésped que comprenden ácidos nucleicos que codifican un heteromultímero descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la primera proteína monomérica y el ácido nucleico que codifica la segunda proteína monomérica están presentes en un único vector. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la primera proteína monomérica y el ácido 25 nucleico que codifica la segunda proteína monomérica están presentes en vectores separados.

En el presente documento se proporciona un procedimiento para producir un heteromultímero, donde dicho procedimiento comprende: cultivar una célula huésped descrita en el presente documento tal que el ácido nucleico que codifica un heteromultímero descrito en el presente documento es expresado; y recuperar el heteromultímero a 30 partir del cultivo celular. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota. En ciertas realizaciones, la célula huésped es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la levadura es S. cerevisiae. En algunas realizaciones, la levadura es deficiente en glicosilación, y/o deficiente en proteasa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, la célula huésped que expresa un heteromultímero es descrita en el presente documento como una célula de mamífero. En ciertas 35 realizaciones, la célula de mamífero es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula COS o una célula humana.

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende un heteromultímero descrito en el presente documento y un adyuvante aceptable farmacéuticamente. También se proporcionan procedimientos para tratar a un 40 individuo que padezca una enfermedad o trastorno, dicho procedimiento comprende la administración a este individuo de una cantidad efectiva de una formulación o composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En algunas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno inmunológico en 45 un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. También se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad infecciosa en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular en un paciente, dicho procedimiento 50 comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones es un procedimiento para tratar un trastorno respiratorio en un paciente, dicho procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero descrita en el presente documento.

55 Se proporciona un kit para detectar la presencia de un biomarcador de interés en un individuo, dicho kit comprende (a) una cantidad de heteromultímero descrita en el presente documento, donde dicho heteromultímero comprende al menos un polipéptido de carga tal que dicho polipéptido de carga es capaz de unirse al biomarcador de interés; y (b) instrucciones de uso.

60 En ciertas realizaciones, el polipéptido de carga se fusiona al polipéptido basado en albúmina o aloalbúmina. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga está químicamente conjugado con el polipéptido basado en albúmina o aloalbúmina. En ciertas realizaciones, el polipéptido de carga está unido al polipéptido basado en albúmina o

aloalbúmina por medio de una ligadura química o un enlace disulfido.

En algunas realizaciones, un heteromultímero descrito en el presente documento es un heterodímero. En algunas realizaciones el polipéptido de carga es un anticuerpo, enzima, hormona, polipéptido terapéutico, antígeno, 5 quimiotoxina, radiotoxina, o variante o fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de carga de una proteína monomérica funciona en sinergia con el polipéptido de carga de otra proteína monomérica.

En un aspecto descrito en el presente documento, hay un procedimiento para derivar segmentos de proteína de una proteína de interés que pueden plegarse eficientemente y asociarse selectivamente para formar una estructura 10 parecida a una proteína cuasinatural activa.

En el presente documento, se proporciona una estrategia para crear polipéptidos basados en una proteína monomérica tal como, aunque no restringida a, albúmina sérica humana (ASH) que produce una estructura parecida a una proteína monomérica cuasinatural y funcionan al asociarse entre sí. En realizaciones descritas en este 15 documento, esta estrategia también se usa para diseñar heteromultímeros que comprenden polipéptidos monoméricos que comprenden polipéptidos transportadores que son derivados de variantes de ASH, aloalbúminas o de otras moléculas de albúmina homólogas de otras especies. Los monómeros descritos en este documento pueden diseñarse mediante una variedad de estrategias para mejorar las características biofísicas tales como la estabilidad de los polipéptidos transportadores individuales o su complejo asociado.

20

En una realización hay un armazón para el desarrollo de moléculas bioespecíficas u otras moléculas de proteínas multifuncionales o multiespecíficas basado en fragmentos derivados de ASH.

Se proporciona un polipéptido de carga que es un armazón derivado de ASH o AAH que puede conjugarse o 25 fusionarse con polipéptidos de carga tales como otros dominios funcionales tales como unidades de proteínas unidas a antígenos, sustratos diana o inhibidores o cargas tales como quimiotoxinas, radiotoxinas, citoquinas, etc., para lograr una proteína terapéutica multifuncional o multiespecífica.

En este documento se describen fusiones de Fc heterodiméricos con polipéptidos basados en ASH para producir 30 una terapéutica basada en anticuerpo biespecífico con suficiente pureza y estabilidad para servir a aplicaciones farmacéuticas.

En un aspecto, descrito en este documento hay un procedimiento de derivación de una proteína multifuncional o multiespecífica que comprende monómeros autoensamblados que comprenden polipéptidos transportadores 35 basados en ASH, tales que, la proteína tiene un número de propiedades farmacocinéticas favorables que incluyen una vida media mejorada, una mejor estabilidad, baja inmunogenicidad, etc.

En este documento, se proporcionan proteínas de heterodímero que comprenden al menos dos proteínas monoméricas de fusión, donde cada proteína monomérica de fusión comprende al menos un polipéptido de carga 40 fusionado con un polipéptido derivado de la albúmina, tal que dichos polipéptidos derivados de la albúmina se autoensamblan para formar el heteromultímero multifuncional con una estructura cuasinatural de albúmina o análogo de la misma.

En ciertas realizaciones hay proteínas de heterodímero que comprenden al menos dos proteínas monoméricas de 45 fusión, donde cada proteína monomérica de fusión comprende al menos un polipéptido de carga fusionado con un polipéptido derivado de la aloalbúmina, tal que dichos polipéptidos derivados de la aloalbúmina se autoensamblan para formar el heterodímero multifuncional.

En ciertas realizaciones descritas en este documento hay proteínas de heteromultímero que comprenden al menos 50 dos proteínas monoméricas de fusión, donde cada proteína monomérica de fusión comprende al menos un polipéptido de carga fusionado con un polipéptido derivado de la aloalbúmina, tal que dichos polipéptidos derivados de la aloalbúmina se autoensamblan para formar el heterodímero multifuncional. En ciertas realizaciones hay proteínas heterodiméricas que comprenden un primer monómero que comprende al menos un polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de aloalbúmina, y un segundo monómero que comprende al menos un 55 polipéptido de carga fusionado a un polipéptido derivado de aloalbúmina. En ciertas realizaciones, el, al menos, único polipéptido de carga del primer monómero es diferente del, al menos, único polipéptido de carga del segundo monómero.

En ciertas realizaciones, son formulaciones farmacéuticas las que comprenden una proteína heteromultimérica 60 basada en aloalbúmina y/o basada en albúmina y descrita en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, se proporciona una formulación descrita en el presente documento como parte de un kit o contenedor. En ciertas realizaciones, el kit o contenedor está envasado con las

instrucciones relativas al periodo de conservación extendido de la proteína terapéutica. En algunas realizaciones, un heteromultímero descrito en el presente documento se usa en un procedimiento para tratar (p. ej. mejorar), prevenir, o diagnosticar una enfermedad o síntoma de enfermedad en un individuo, que comprende la etapa de administrar dicha formulación al individuo.

5

10 EJEMPLOS

Ejemplo 1: Procedimiento de división de proteínas

La asociación específica proteína-proteína está impulsada por una fuerte complementariedad superficial entre los 15 colaboradores que interactúan y los cambios termodinámicos y estructurales que acompañan. La complementariedad superficial proporciona una oportunidad para formar contactos que apoyen la creación de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas favorables. Las interacciones electrostáticas implican la formación de puentes salinos, enlaces de hidrógeno, así como las interacciones de dispersión generalizadas. La exclusión del disolvente y la reorganización alrededor de los grupos atómicos no polares en la conexión y sus efectos entrópicos 20 asociados juegan un papel en el componente hidrofóbico de la termodinámica de unión. Los residuos con geometrías que son optimizadas para la interacción hidrofóbica entre ellos formarán contactos (p. ej., contactos de apilamiento, pi-pi, catión-pi favorables para la estabilización de la conexión proteína-proteína. Efectos similares termodinámicos controlan procesos de plegamiento de proteínas multietapa que implican la preorganización de unidades estructurales secundarias y dominios terciarios, a lo que sigue su asociación para formar el estado 25 cuaternario y plegado de la proteína. Un mecanismo alternativo en el plegamiento y unión de proteínas implica un proceso de plegamiento y unión de proteínas acoplado que finalmente originará el estado cuaternario de la proteína. En el contexto de la asociación de proteínas, los componentes proteicos individuales necesitan ser coexpresados o estar presentes en el mismo medio y cada uno de los componentes o monómeros se plegará de forma estable en su estado estructural final solo en asociación con su colaborador obligado. (Fig. 6)

30

La generación de una proteína dividida implica el reconocimiento de un sitio de segmentación en la proteína natural, con el uso de información de la secuencia, el pliegue y la estructura secundaria que producirá al menos dos polipéptidos transportadores que formarán eficientemente la estructura proteica cuasinatural mediante autoensamblaje para componer juntas un heteromultímero. Por ejemplo, estos polipéptidos de proteínas divididas se 35 autoensamblan selectivamente y forman el estado cuasinatural al coexpresarse. Mientras se genera un par complementario de proteínas divididas de los polipéptidos transportadores, de alguna forma, el intento significa emular un número de complejos proteína-proteína obligados de origen natural que exhiben su funcionalidad como un complejo mientras carecen de funcionalidad en su estado no complejo. Una implementación con éxito de la estrategia origina polipéptidos que se autoensamblan selectivamente para formar heteromultímeros entre sí, son 40 solubles como entidades individuales y en cuanto a la relevancia funcional, no impiden el plegamiento, la unión y la actividad de otros componentes en el entorno. La naturaleza intrínseca de los polipéptidos para reconstituirse entre sí posee aplicaciones en el área de creación de entidades de fusión heteromultiméricas fuera de las moléculas de carga que no son eficientes en la formación de multímeros por ellas mismas. El papel funcional de los segmentos de proteínas divididas consiste en actuar como polipéptidos transportadores que conduzcan a la heteromultimerización. 45

Ejemplo 2: Preparación de proteínas de heteromultímero basado en AH/Aloalbúmina

Se muestra un procedimiento para determinar el sitio de segmentación a lo largo de la estructura y secuencia de ASH que producirá cadenas de polipéptido monomérico que se pliegan y fusionan de forma estable para formar una 50 estructura cuaternaria cuasinatural de la proteína original. Uno de los requisitos importantes para tal estable asociación es la formación de una gran área enterrada de complementariedad superficial en la conexión entre las cadenas de polipéptido. El pliegue natural de la proteína original conlleva indicación de la complementariedad natural de regiones dentro de la proteína.

55 La figura 2 muestra el área de la superficie accesible del disolvente enterrada en la conexión de dos polipéptidos basados en albúmina que se plegarían idealmente dentro de la estructura cuasinatural de la ASH, cuando el punto de segmentación se mueve a lo largo de la secuencia de la proteína. El análisis indica que una gran área superficial, del orden de aproximadamente 5000 A2 es enterrada cuando se introduce la segmentación dividida en algún sitio entre los residuos 30 y 520 con unas pocas excepciones. La albúmina posee un número excepcionalmente grande 60 de puentes de disulfidos que contribuyen a la estabilidad de la estructura de la proteína natural. La sección de la proteína cerca de los residuos 110, 190, 300, 390 y 500 proporciona sitios para la segmentación que no dividen los residuos implicados en un vínculo disulfido a través de los dos polipéptidos transportadores. La segmentación en

otras regiones resultaría en heterodímeros con un enlace disulfido de unión cruzada entre los dos pares de polipéptidos transportadores. La figura 3 presenta una representación modélica de una tal estructura de albúmina cuasinatural derivada mediante eliminación de un bucle de los residuos 294 a 303 en la secuencia de ASH. El área superficial total enterrada para los dos polipéptidos basados en albúmina de la SEQ ID NO: 2, y la SEQ ID NO: 3 5 mostrada en este documento es de aproximadamente 5500 A2. Esta es considerablemente más grande que la media de 1910 - 3880 A2observada en un número de estructuras co-complejas heterodiméricas y heterodiméricas proteína-proteína [Bahadhur R.P. & Zacharias M. (2008) Cell Mol Life Sci 65, 1059-1072]. Esto sugiere que existe una fuerte semejanza para los dos polipéptidos en términos de asociarse selectivamente entre sí, si la ruta de plegamiento de los dos polipéptidos es bastante independiente entre ambas.

10

En un aspecto de esta invención, la formación selectiva de una estructura cuasinatural estable con los dos polipéptidos (el par formado por las SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 o el par de transportador formado por la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 10) nos ofrece la oportunidad de emplear estos polipéptidos para dirigir la formación de moléculas biespecíficas u otras moléculas multifuncionales después de fusionar las proteínas de interés de carga 15 apropiadas al terminal N o C de los polipéptidos basados en albúmina empleados como polipéptidos transportadores. Puede diseñarse un número de otros patrones de segmentación alternos que resulten en el heterodímero del par de polipéptidos de transporte. Las proteínas de carga fusionadas pueden ser dominios de unión a antígeno u otras cargas tales como quimiotoxinas, radiotoxinas o citoquinas (como se representa en la figura 4). Los heterodímeros resultantes poseen muchas de las propiedades favorables intrínsecas a la ASH que incluyen 20 propiedades como vida media mejorada, estabilidad y baja inmunogenicidad. Los conectores tradicionales tales como (Gly4Ser)x pueden usarse para la asociación de la proteína de carga con el polipéptido transportador.

En otro aspecto de esta invención, cada uno de los polipéptidos transportadores basados en ASH está fusionado independientemente al terminal C de dos cadenas pesadas en una molécula Fc biespecífica (como se representa en 25 la figura 5). El fuerte y selectivo emparejamiento de los dos polipéptidos transportadores (tal como SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3) dirige la heterodimerización del Fc y contribuye también a su estabilidad y a otras propiedades farmacocinéticas valiosas.

Preproteína de albúmina sérica NP_000468.1 GI 4502027 secuencia de ARNm de NM_000477.5, Consenso CDS 30 (CCDS) ID 3555.1

SEQ ID NO: 4: El residuo 1-24 (EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG)es la región de la secuencia de señal de exportación del terminal N que resulta escindida. Esta secuencia cumple con el mismo papel que la secuencia de señal natural, pero está optimizada para mamíferos y líneas celulares de CHO (ovarios de hámsteres chinos).

35

SEQ ID NO: 1: gi|4502027|ref|NP_000468.1| preproteína de albúmina sérica [Homo sapiens]

EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDK LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKA ACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKA EFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKE CCEKPLLEKSHCIAEVENDEMEADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP LVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESL VNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL

SEQ ID NO: 5: Secuencia CCDS de nucleótidos de albúmina sérica humana (1852 nt)

GAATTCGCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCT

GCTGTCCGGAGCTCTGGCTCTGACTCAGACCTGGGCTGGAGATGCACACAA

GAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGC

CTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGA

TCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGC

TGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGA

CAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGA

CTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAA

AGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGAT

5

GTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATA

TGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTT

TGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAA

AGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGC

TTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGA

AAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAA

AGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCA

CACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGA

CCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAA

GGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGT

GGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGT

TGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCT

GGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGT

GCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTG

TGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAA

ACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTT

TGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACAC

CAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAA

CCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAAT

GCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTT

GCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATC

CTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATA

CGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATG

CACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGA

GCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTAT

GGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGA

GACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGC

CTTAGGCTTATGA

La secuencia de nucleótidos y proteínas de los polipéptidos basados en albúmina y útiles como polipéptidos

transportadores es la siguiente:

5

Heteromultímero 1 basado en albúmina:

Polipéptido 1-Vers 1 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 2:

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVT EFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPER NECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF YAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLL ECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEV

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido 1-Vers 1 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 6: 5

GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGA AGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCA GTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGC AAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCA TACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTA TGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATG CTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACC AGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTT GAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCC GGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTG CCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCG GGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCT CCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAG CCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGA TCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGC TGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGAT C T C CAGTAAAC T GAAGGAATGCTGTGAAAAAC C T C TGT T GGAAAAATC C CA C T GCATTGC C GAAGT GT GA

Polipéptido 2-Vers 1 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 3:

SLAADFVF.SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA

KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEY

KFQNALLVRYTKKVPQVñTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPGAEDY LSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFISi AE T FT FHADIC T L S E KE RQIKKQ T AL VE L VK H KP KATKE Q LKAVMD D F AAF VE KC C KADDKETCFAEE G KKLVAAS QAALG L

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido 2-Vers 1 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 7:

TCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTA T GC T GAGGCAAAGGAT GT C T T C C TGGGCAT GT T T T T GTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATA T G A A A CCACTCTAGA G A A G T G C T’ G T G C C G C T G C A G A T C C T C A T G A A T G C T A TGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTT AATCAAACAAAAT'TGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCA GAATGGGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCC AACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTG TAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGT GGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGGATGAGAAAACGCCAGTAAG'I'GACÁG AGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTC AGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAAC ATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAG'AAGGA GAGACAAAT C A A G A A A C A ZEA C T G C A C T T G T T G A G C T C G T G A A A C A C A A G C C C A A G G C A A C AAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAA GTGCTGCAAGGCTGACGATAAGCAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAA 5 ACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGA

Heteromultímero 2 basado en albúmina:

Polipéptido 1-Vers 2 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 8:

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVT EFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPER NECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF

YAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPK.LDELRDEGKAS3AKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLL E C AD DRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDEH fJ AD L FSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARA Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido 1-Vers 2 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 9: GATGCACACAAGAGTGAGGT'TGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGA AGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGT’TGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCA GTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGC AAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCA TACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTA T GG T G A A A T G G C T G AC T G C T GT G C A AAAC AAG AAC C T G AG AGAAA T G AAT G C TTc T tGCAACACAAAGAT GAC AACCCAAACC T CC C C C GAT T G GT GAGACC AGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTT GAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCC GGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTG C C AAG C T G C T G A T A AAG C T GC C T G C C T G T T G C CAAAG CTCGATGAACT T C G GGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCT CCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAG CCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGA TCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGC TGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGAT C TC CA G TAAACTGAAG GAAT G C T GT G AAAAAC C T CTGT TC GAAAAAT C C CA CTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATT AGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGC 5 AAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAGCATGA

Polipéptido 2-Vers 2 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 10:

SVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLI K QN C E L F E! QI, G E YK FQNAL L VR Y TK.K V P Q V 3 T P T L VE V S .RE L GKV GS K C C K HPEAKRMPCAEDYLSVVLRQLCVLEEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSA

LEVDETYVPKEFNAETFTFHADI CTLSEKEiRQIKKQTALVELVKHKPKATK EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido 2-Vers 2 tipo transportador basado en albúmina: SEQ ID NO: 11:

TCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCT

AGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTT

CGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAA

T T G T G A GC T T T T T G A G C A G G T T G G A G A G T A C A A A T T C C A G A A T G C G C T ATT

AGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGA

GGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAAT6TTGTAAACATCCTGA

AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCA

GTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATG

CTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGT

CGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCA

TGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGAGAAATCAAGAAACAAAC

TGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACT

GAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGC

T G A C G A T A A G G A G A C C T G C T T T G C C G A G G A G G G T A A A A A AC T T G T T G C T G C

AA G T C A A G C1 l G C C T T A G G C T T A T G A 5

Generación y expresión de los heteromultímeros basados en AH o ASH

Los genes que codifican los monómeros de polipéptidos transportadores basados en la AH y la AH de tipo silvestre de longitud completa fueron construidos a través de síntesis génica mediante codones optimizados para la expresión 10 mamífera/humana. Los constructos se diseñaron a partir de preproteína de albúmina sérica humana de longitud completa conocida (GENEBANK: NP_000468.1), después de la exclusión de la secuencia de señal EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG. Los productos génicos finales se subclonaron dentro del vector pTT5 de expresión mamífera (NRC-BRI, Canadá) (Durocher et al). Se realizó la producción de proteína recombinante de alto rendimiento y nivel superior mediante transfección transitoria de CHO-3E7 humano con suspensión de 15 crecimiento. Véase la tabla 3 para los límites del constructo de los dos armazones descritos aquí: Heteromultímero 1 basado en albúmina (ABH1) y heteromultímero 2 basado en albúmina (ABH2). El heteromultímero 2 basado en albúmina comprende un enlace disulfido entre los dos polipéptidos transportadores, mientras que el heteromultímero 1 basado en albúmina está formado íntegramente por interacciones no covalentes. La figura 6A proporciona el análisis del gel (no reductor) SDS-PAGE de los dos constructos de heteromultímero (ABH1 y ABH2), después de la 20 coexpresión (se muestran diferentes relaciones de transfección de ADN). La ASH de longitud completa y tipo silvestre se muestra como control. Tal como se esperó, el ABH2 retiene la unión disulfido en el SDS-PAGe no reductor, con un peso molecular prácticamente del doble que el del ABH1 unido a ningún disulfido. La figura 6B proporciona un análisis de gel natural de los dos constructos de heteromultímero basado en albúmina (ABH1 y ABH2), después de la coexpresión (nivel de ADN 1:1). La ASH de longitud completa y tipo silvestre se muestra 25 como control. ABH1 y ABH2 ambos forman un complejo de masa esperada, comparable con la ASH de peso y longitud completa. Además, por la expresión, ninguno de los polipéptidos transportadores que formaron el aBH1, ni tampoco los que formaron el ABH2 homodimerizan; más bien éstos forman preferiblemente un heterocomplejo estable. Véase la tabla 3 siguiente para más detalles.

30 Tabla 3: Constructos de heteromultímero basado en albúmina

Constructo: Límites de segmento* PM (kDa)

AH de tipo silvestre: 1:585 (SEQ ID NO: 1) 64,3

ABH1: 1:293 (SEQ ID NO: 2) 32,2

304:585 (SEQ ID NO: 3): 30,9

ABH2: 1:337 (SEQ ID NO: 8) 37

342:585 (SEQ ID NO: 10): 26,7

La ASH de tipo silvestre y los dos heteromultímeros basados en albúmina (ABH1 y ABH2) se expresaron en la línea celular (CHO-3E7) desarrollada en suspensión en medio FreeStyle F17 (Invitrogen) suplementado con un 0,1 % de peso por volumen plurónico y 4 mM glutamina. El día de la transfección la densidad celular sería de alrededor de 1,5-2 millones de células/ml y la viabilidad debe ser mayor del 97 %. La transfección se realiza de acuerdo con la 5 solicitud de patente WO 2009/137911usando una mezcla del ADN de plásmido hecho del 5 % de plásmido pTTo- GFP (proteína verde fluorescente para determinar la eficiencia de la transfección, tabla 4), 15 % de plásmido pTT22- AKT, 21 % de plásmidos de ASH (10,63 % de cada uno), 68,37 % de Salmon Sperm ADN. Después de la transfección, el frasco de agitación que contenía células se coloca entonces en un agitador orbital configurado a 120 rpm en un incubador humidificado con 5 % de CO2 a 37 °C. Veinticuatro horas después de la transfección, un 1 % 10 p/v de TN1 y 0,5 mM de VPA (ácido valproico) fueron añadidos a los cultivos. Los cultivos son transferidos después a un agitador orbital (120 rpm) colocado en un incubador humidificado con 5 % de CO2 configurado a 32 °C. Entre 24 y 48 horas después, las células positivas a GFP deben estar entre el 30-60 % como determinó la citometría de flujo. Las células se recogieron 7 días después de la transfección y se centrifugaron a 4.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se esterilizó mediante filtro (clarificó) usando un filtro de 0,45 pm (Millipore). El sobrenadante se 15 mantuvo a 4 °C durante un corto periodo de almacenamiento y a -80 °C durante un largo periodo de almacenamiento. Antes de la purificación, el sobrenadante congelado se descongeló a 37 °C refiltrándolo y desgasificándolo a 0. Se uso una membrana de filtro de 45 pm bajo vacío durante 5 a 10 minutos.

tabla 4: Viabilidad celular en diferentes etapas de la expresión del constructo ABH1 y de tipo silvestre.

Armazón de ASH: % de GFP 48 horas después de la transfección % de viabilidad 48 horas después de la transfección % de viabilidad 48 horas después de la transfección

ASH de tipo silvestre: 67 94,6 72,3

ABH2: 66,3 93,6 77,1

20

Purificación de ASH y heteromultímeros ABH1 y ABH2

La purificación se realizó mediante flujo de gravedad usando una columna QIAGEN-tip 500 de laboratorio apilada con una matriz Blue Sepharose (GE Healthcare). La matriz Blue Sepharose se equilibró con 20 ml de PBS y pH 7,2. 25 La muestra se cargó a una tasa de flujo de 5 ml/min y, a continuación, se lavó con 20 ml de PBS. La proteína se eluyó con 0,1 M Na2HPO4, pH 7,2, suplementado con 1 M NaCl y se recogió en fracciones de 1 ml (20 ml totales). Las fracciones que contenían ASH (según el ensayo de proteínas Bradford) fueron mezcladas, concentradas y aplicadas a una columna de filtración de gel de nivel de preparación HiLoad 16/60 Superdex 200 emparejada a un sistema AKTA Express (GE Healthcare) usando una tasa de flujo de 1 ml/min. Se recogieron las proteínas con una 30 pureza mayor al 85 %; las fracciones que contenían la muestra pura fueron mezcladas y concentradas mediante centrifugación, usando una membrana Amicon Ultra con un peso de corte de 10.000 MWCo. La figura 6C muestra un análisis SDS-PAGE (no reductor) del heteromultímero ABH2 y la ASH de tipo silvestre, ambos después de la etapa final de purificación. Ambos constructos mostraron el esperado PM.

35 Determinación de la estabilidad de los heteromultímeros basados en albúmina usando calorimetría de barrido diferencial (DSC)

Todos los experimentos de DSC se llevaron a cabo con un GE o instrumento MicroCal VP-Capillary. Las proteínas fueron intercambiadas en tampón dentro de PBS (pH 7,4) y se diluyeron entre 0,3 a 0,7 mg/ml con 0,137 ml 40 cargados en la célula de muestra y medido con una tasa de barrido de 1 °C/min desde 20 a 100 °C. Los datos se analizaron usando el software Origin (GE Healthcare) con el fondo del tampón de PBS eliminado. Véase la tabla 5 y la figura 7 en referencia a la temperatura de fusión determinada.

Tabla 5: Temperatura de fusión para heteromultímeros basados en albúmina

Molécula: Masa molecular (Da) PM teorético (Da) Ta °C

Tipo silvestre de ASH: 66620 66470 75

ABH2: 66100 65880 63

Evaluación de la unión FcRn de la ASH y ABH2 usando resonancia plasmónica de superficie

5 Como se observa en las figuras 8A-B, cuando la ASH y el heteromultímero basado en ASH son inmovilizados en las superficies del SPR, parece que la afinidad hacia FcRn es comparable con la ABH2 y la ASH de tipo salvaje de longitud total, lo que indica que la funcionalidad de unión FcRn de la albúmina es retenida por el heteromultímero formado por el autoensamblaje de los polipéptidos transportadores basados en albúmina. La tabla 6 siguiente ilustra los datos de la unión FcRn Los valores entre paréntesis indican la desviación estándar.

10

Tabla 6: Ajuste cinético y de equilibrio de la unión FcRn de la ASH y ABH2 usando una resonancia plasmónica de superficie__________________________________________________________________________

: Ka (1/Ms) agrupado y ajustado Kd (1/s) agrupado y ajustado KD (M) agrupado y ajustado

ASH: 5,3E+04 (7E+03) 7,0E-02 (2,0E-02) 1,4E-06 (6,0E-07) Ajuste cinético

ABH2: 5,0E+04 (4E+03) 4,2E-02 (8,0E-03) 8,0E-07 (2,0E-07) Ajuste cinético

ASH: 9,0E-07 (1,0E-07) Ajuste de equilibrio

ABH2: 9,0E-07 (1,0E-07) Ajuste de equilibrio

Ejemplo 3: Generación y expresión de heteromultímeros basados en albúmina con tetravalencia que 15 comprende las fusiones bioactivas de la scFv anti-Her2/neu y anti-CD16

El heteromultímero multivalente ABH2 se generó mediante la expresión de sus únicos polipéptidos transportadores monoméricos, la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 10, fusionados en uno o dos terminales a los polipéptidos de carga que son o la scFv de antiHer2scFv (4D5) y/o bien la scFv de anti-CD 16 (NM3E). Estos forman un conjunto de 8 20 monómeros de constructo de base basados en el polipéptido 1 y 8 monómeros de constructo de base basados en el polipéptido 2 transportador. Se combinaron diferentes combinaciones de estos constructos de base según la coexpresión para formar heteromultímeros que mostraban toda la combinación de los dos polipéptidos de carga en cualquiera de las cuatro posiciones terminales de los dos polipéptidos transportadores, variando de monovalente a tetravalente.

25

Como se muestra en la figura 9, los polipéptidos de carga bioactivos se fusionaron con los polipéptidos transportadores del heteromultímero a través del conector GGSG, para el terminal N de un monómero y un conector (GGS) 4GG más largo para el resto de terminales en el otro monómero.

30 La Tabla 7ilustra los16 constructos de base (Constructo de base n.° 1-Constructo de base n.° 16) que se generaron mediante la fusión de los polipéptidos de carga 4D5 y NM3 con cada terminal N o C del polipéptido 1 transportador (F1) o el polipéptido 2 transportador (F2). F1 corresponde a la SEQ ID 8 y F2 corresponde a la SEQ ID 10.

Fusiones únicas

35

n.°: Fusión 1 Fusión 2

1: NM3E2 F1

2: F1 NM3E2

3: NM3E2 F2

4: F2 NM3E2

5: 4D5 F1

6: F1 4D5

7: 4D5 F2

8: F2 4D5

Fusiones dobles

n.°: Fusión 1 Fusión 2 Fusión 3

9: NM3E2 F1 NM3E2

10: NM3E2 F2 NM3E2

11: 4D5 F1 4D5

12: 4D5 F2 4D5

13: NM3E2 F1 4D5

14: 4D5 F1 NM3E2

15: NM3E2 F2 4D5

16: 4D5 F2 NM3E2

Los constructos multivalentes se generaron como describen en el ejemplo 2, usando un heteromultímero ABH2. Los productos génicos finales se subclonaron dentro del vector pTT5 de expresión mamífera (NRC-BRI, Canadá) 5 (Durocher et al). Se realizó la producción de proteína recombinante de alto rendimiento y nivel superior mediante transfección transitoria de CHO-3E7 humano con suspensión de crecimiento.

La purificación se realizó con la aplicación del sobrenadante celular con la proteína expresada en la columna QIAGEN-tip 500 apilada con matriz Blue Sepharose (GE Healthcare) emparejada a un sistema AKTA Express (GE 10 Healthcare) usando una tasa de flujo de 1 ml/min. La columna fue equilibrada con un tampón de muestra equilibrado compuesto de 20 ml de PBS pH 7,2, 300 mM NaCl. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 5 ml/min y, a continuación, se lavó con el tampón de muestra. La proteína fue eluida con la aplicación de un gradiente de NaCl que varió entre 300 mM a 2000 mM. Las fracciones eluidas con mayor concentración de sal fueron las más puras y fueron mezcladas, concentradas y después aplicadas a una columna de filtración de gel de nivel de preparación 15 HiLoad 16/60 Superdex 200 emparejada a un sistema AKTA Express (GE Healthcare) usando una tasa de flujo de 1 ml/min. Se recogieron las proteínas con una pureza mayor al 85 %; las fracciones que contenían la muestra pura fueron mezcladas y concentradas mediante centrifugación, usando una membrana Amicon Ultra con un peso de corte de 10.000 MWCO. Las figuras 10A-10B muestran un análisis SDS-PAGE (no reductor) del heteromultímero ABH2 fusionado con diferentes polipéptidos de carga. La posición de estos polipéptidos en el heteromultímero en 20 relación con los polipéptidos transportadores se describe a continuación en la tabla 8. Todos los constructos mostraron el peso molecular esperado.

Tabla 8: constructos multiespecíficos, monovalentes y multivalentes que se generaron mediante la fusión de los polipéptidos de carga 4D5 y NM3 con cada terminal N o C del polipéptido 1 transportador o el polipéptido 2 25 transportadpr de ABH2._________________________________________________________________________

Variante: Polipéptido 1 transportador de terminal N (SEQ ID NO: 8). Polipéptido 1 transportador de terminal C (SEQ ID NO: 8). Polipéptido 2 transportador de terminal N (SEQ ID NO: 10). Polipéptido 2 transportador de terminal C (SEQ ID NO: 10). Valencia

513: NM3E monovalente

514: NM3E monovalente

515: NM3E monovalente

516: NM3E monovalente

517: 4D5 monovalente

518: 4D5 monovalente

519: 4D5 monovalente

520: 4D5 monovalente

521: NM3E NM3E bivalente

522: NM3E NM3E bivalente

523: NM3E NM3E bivalente

524: NM3E NM3E bivalente

525: 4D5 4D5 bivalente

526: 4D5 4D5 bivalente

527: 4D5 4D5 bivalente

528: 4D5 4D5 bivalente

529: NM3E NM3E bivalente

530: NM3E NM3E bivalente

531: 4D5 4D5 bivalente

532: 4D5 4D5 bivalente

543: NM3E 4D5 biespecífica

544: NM3E 4D5 biespecífica

545: NM3E 4D5 biespecífica

546: NM3E 4D5 biespecífica

547: 4D5 NM3E biespecífica

548: 4D5 NM3E biespecífica

549: 4D5 NM3E biespecífica

550: 4D5 NM3E biespecífica

551: NM3E 4D5 biespecífica

552: 4D5 NM3E biespecífica

553: NM3E 4D5 biespecífica

554: 4D5 NM3E biespecífica

593: 4D5 NM3E biespecífica

594: NM3E 4D5 biespecífica

Unión con SPR del ABH2 monovalente fusionado a una única antiCD16scFv

El heteromultímero purificado ABH2 unido a una única antiCD16scFv con el terminal N del polipéptido transportador 5 SEQ ID 2 (constructo v515) se utilizó usando resonancia plasmónica de superficie (SPR). La CD16 soluble se inmovilizó covalentemente sobre la superficie CM5 y el ABH2 fusionado a la antiCD16scFv fue capturado, determinándose la cinética de unión.

Suministros del SPR. Chips sensores GLM, el kit de acoplamiento amina Biorad ProteOn (EDC, sNHS y 10 etanolamina), así como tampones de acetato de sodio de 10 mM fueron comprados a través de Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON). La proteína Her-2 recombinante se compró a través de eBioscience (San Diego, CA). El tampón HEPES, EDTA, y el NaCl fueron comprados a través de Sigma-Aldrich (Oakville, ON). La solución al 10 % de Tween 20 se compró a través de Teknova (Hollister, CA).

15 Ensayos de biosensor de SPR. Todos los ensayos de resonancia plasmónica de superficie se realizaron usando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)) con tampón de migración HBST (10mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, y 0,05 % de Tween 20, pH 7,4) a una temperatura de 25 °C. La superficie de captura de la CD16 se generó usando un chip sensor GLM activado por una dilución 1:5 de las soluciones estándar BioRad sNHS/EDC inyectadas durante 300 s a 30 pL/min en la dirección (horizontal) del 20 analito. Inmediatamente después de la activación, una solución de 4,0 pg/m del CD16 en 10 mM NaOAc pH 4,5 fue inyectada en la dirección (vertical) del ligando con una tasa de flujo de 25 pl/min hasta que aproximadamente 3000 unidades de resonancia (RU) fueron inmovilizadas. Los grupos activos restantes fueron aplacados con una inyección de 300 s de 1 M de etanolamina a 30 pl/min en la dirección del analito, y esto también asegura que las manchas internas activadas por simulación se creen para referencias en blanco.

25

Se inyectó una serie de V515 de dilución 3 veces con 500 nM sobre CD16aWT (L6) de 3000 RU en comparación a la referencia blanca (L5). Tasa de flujo de 50 ul/min durante 120 s, con una fase de disociación de 240 s. Las inyecciones se repitieron en el tampón de migración estándar (DPBS/3,4 mM EDTA/0,05 % Tween20) y un tampón de migración con 350 mM de NaCl. Se alinearon y referenciaron doblemente los sensogramas usando manchas 30 internas e inyección blanco de tampón, y se analizaron los sensogramas resultantes usando el software ProteOn Manager v3.0. Normalmente, los valores Kd fueron determinados a partir de isotermas de unión usando el modelo Equilibrium Fit (ajuste de equilibrio). Para interacciones de alta afinidad con constantes de disociación bajas, los valores de afinidad y cinéticos fueron adicionalmente determinados con el ajuste de los sensogramas referenciados al modelo de unión Langmuir 1:1 usando la Rmax local, y las constantes de afinidad (KdM) fueron derivadas de las 35 constantes de la tasa resultante (kds'VkaM'V). Todos los valores Kd son registrados como la media y la desviación estándar a partir de tres series independientes.

Como se muestra en la tabla 9, el heteromultímero ABH2 fusionado a una antiCD16scFv única posee total actividad y une su diana con buena reproducibilidad y semejante KD para la scFv de antiCD16 libre (NM3E).

Tabla 9: Datos de SPR para ABH2 monovalente fusionado a una antiCD16scFv única.

: Inyección n.° 1 Inyección n.° 2

: ka kd KD ka kd KD KD (M) Media KD SD

: 1/Ms 1/s M 1/Ms 1/s M

NM3E: 5,37E+04 o en O) m 1,07E- 07 5,89E+04 6,03E- 03 1,02E- 07 1,05E- 07 4,E- 09

V515 Dec: 6,11E+04 O O) wVi m 1,10E- 07

V515 Jan: 5,56E+04 7,30E- 03 1,31E- 07

Ejemplo 4: preparación de proteínas de heteromultímero basadas en AH o AAH donde la(s) proteína(s) de carga comprenden uno o más dominios semejantes a EGF-A.

5

La secuencia de péptidos del dominio EFG-A en la proteína PCSK9 u otra secuencia de polipéptidos homóloga al dominio EFG-A, capaz de unirse específicamente al receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL-R) es derivado mediante secuenciación o a partir de una base de datos tal como GenBank. El ADNc para el polipéptido de carga que comprende un dominio semejante a EGF-A es aislado por una variedad de medios que incluyen, aunque no 10 exclusivamente, a partir de bibliotecas ADNc, mediante RT-PCR y PCR, usando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos y solapantes, todos procedimientos estándar. En ciertos ejemplos, la proteína de carga es diseñada para mejorar la estabilidad, las características de unión a diana u otras propiedades biofísicas o relevantes terapéuticamente El polipéptido se emplea como proteína de carga en la creación de un heteromultímero con aplicación en el tratamiento de la hipercolesterolemia. La primera y segunda secuencia de polipéptidos de fusión es 15 derivada mediante fusión de la secuencia de proteínas de carga directamente o con un péptido de conector intermediario en el terminal N y/o terminal C del polipéptido transportador basado en AH o AAH tal como en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SeQ ID NO: 8 o SEQ ID nO: 10. Esta secuencia de proteínas de fusión monomérica es sometida a traducción inversa en su secuencia de ADN correspondiente para introducirse en un vector de expresión, con la secuencia optimizada para expresión en una particular línea celular de interés. La primera y segunda 20 proteínas de fusión monoméricas son transfectadas y coexpresadas en la línea celular de interés. En ciertos casos, la transfección tiene una relación 1:1 para los dos vectores. En algunos ejemplos, la relación se selecciona de entre 1,5:1, 2:1, 1:1,5, 1:2 etc.

Ejemplo 5: preparación de proteínas heteromultiméricas basadas en AH o AAH donde la(s) proteína(s) de 25 carga son el GLP-1 y/o Glucagón.

La secuencia de péptidos de GLP-1 u otra secuencia de polipéptidos homologa a este péptido, capaz de unirse específicamente al receptor GLP-1 o de actuar como un agonista de GLP-1 es derivada mediante secuenciación o a partir de una base de datos tal como GenBank. Alternativamente, la secuencia de péptidos de Glucagón u otra 30 secuencia de polipéptidos homologa a este péptido, capaz de unirse específicamente al receptor Glucagón o de actuar como un agonista receptor de Glucagón es derivada mediante secuenciación o a partir de una base de datos tal como GenBank. El ADNc para cada polipéptido de carga que comprende GLP-1 o glucagón es aislado por una variedad de medios que incluyen, aunque no exclusivamente, a partir de bibliotecas ADNc, mediante RT-PCR y PCR, usando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos y solapantes, todos procedimientos estándar. En 35 ciertos ejemplos, estos polipéptidos de carga basados en GLP-1 o Glucagón son diseñados para mejorar la estabilidad, las características de unión a diana u otras propiedades biofísicas o relevantes terapéuticamente. Estos polipéptidos basados en GLP-1 y Glucagón son empleados como una o más moléculas de carga en la creación de un heteromultímero con aplicación en el tratamiento de la diabetes tipo 2 u otra enfermedad relacionada con el metabolismo de la glucosa. La primera y segunda secuencia de polipéptidos de fusión es derivada mediante fusión 40 de la secuencia de proteínas de carga directamente o con un péptido de conector intermediario en el terminal N y/o terminal C del polipéptido transportador basado en AH o AAH tal como en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10. Las proteínas de fusión pueden ser monoespecíficas con polipéptidos semejantes a GLP-1 o bien a Glucagón, o ser biespecíficas (coagonistas) con ambos polipéptidos semejantes a GLP-1 y Glucagón. Cada secuencia de proteínas de fusión monomérica es sometida a traducción inversa en su secuencia de ADN 45 correspondiente para introducirse en un vector de expresión, con la secuencia optimizada para expresión en una particular línea celular de interés. La primera y segunda proteínas de fusión monoméricas son transfectadas y coexpresadas en la línea celular de interés. En ciertos casos, la transfección tiene una relación 1:1 para los dos vectores. En algunos ejemplos, la relación se selecciona de entre 1,5:1,2:1, 1:1,5, 1:2, etc.

50 Secuencia de molécula de carga GLP-1; SEQ ID NO: 12: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG Secuencia de molécula de carga glucagón; SEQ ID NO: 13: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 6: Repetición de la proteína Anexina como armazón multivalente de detección de membrana

La anexina es dividida con una conexión extensiva para generar un armazón de heteromultímero multivalente que comprende dos polipéptidos transportadores. La anexina es una proteína de residuo 346 (PDB ID 1MCX). El heteromultímero que comprende dos polipéptidos transportadores basados en la división de anexina en la región entre el residuo 186 y 194 se muestra en la figura 11. Cuando se coexpresan en una solución, la gran área de conexión entre ambos polipéptidos transportadores lleva a un autoensamblaje del heterodímero. El autoensamblaje de las dos unidades permite un diseño de constructo multivalente con polipéptidos transportadores basados en el núcleo de anexina. Hay dos estructuras disponibles, en cerdos y humanos. Las dos estructuras son superimponibles con una desviación de media cuadrática de 0,6 A. El siguiente tramo de la secuencia puede eliminarse de la secuencia de anexina humana DRSEDF (residuos 160 hasta 165). El truncamiento no rompe ningún elemento de estructura secundaria ni tampoco implica introducir o eliminar algún residuo de prolina.

Secuencia de tipo silvestre de anexina humana

SEQ ID NO: 14:

GSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATITDTLTKRNNAQRQQIKAAYLQE T GKPLDETLKKALT GHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILA SRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNED LADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNK VLDLELKG DIEKCT .T AIVKCATSKP AFFAEKI .1TQ AMKGVGTR T TK ALTRTMV SRSEI DMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN

Secuencia del polipéptido-1 transportador basada en anexina:

SEQ ID NO: 15:

SAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQET GKPLDET LKKALT GHLEE V VLALLKT PAQFDADELRAAMRGLGTDED TL1EIL AS RTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKG Secuencia del polipéptido-2 transportador basada en anexina:

SEQ ID NO: 16:

G VNEDL AD SD ARALYE AGE RRKGTDVN VFNTILTTRS YPQLRRVF QKYTKY SKH DMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIM VSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN

La figura 10 muestra una gráfica del área superficial accesible del disolvente enterrado en la conexión del polipéptido-1 transportador basado en anexina (ABT-1), y el polipéptido-2 transportador basado en anexina (ABT-2). Una anexina dividida junto a la posición de residuo 186 forma un heterodímero con aproximadamente 3200 Á2 de área superficial enterrada. Los polipéptidos transportadores, tales como ABT-1 y ABT-2 basados en anexina, pueden usarse para unir biomoléculas de carga usando los mismos procedimientos descritos anteriormente para polipéptidos transportadores basados en albúmina.

Ejemplo 7: Transferrina como un armazón multivalente

En base a un gran número de propiedades terapéuticamente relevantes en la transferrina, esta proteína se presenta a sí misma como una molécula de armazón interesante para el diseño de fármacos de fusión de proteínas multivalentes después de la creación de una proteína autoensamblable y sus partes de componente dividido. La estructura de la transferrina se muestra en la figura 13, basada en una estructura cristalina (1H76) disponible en el banco de datos de proteínas [Hall DR et al. Acta Crystallogr D 2002, 58, 70-80]. La molécula de transferrina está

compuesta de dos lóbulos estructuralmente similares, los lóbulos de terminal N y C, conectados mediante un conector de péptido corto entre los residuos 333 y 342.

Se diseña un heterodímero basado en la proteína de transferrina, dicho heterodímero comprende un primer 5 polipéptido transportador que incluye los residuos 1 a 333 de la transferrina, y un segundo polipéptido transportador compuesto de los residuos 342 hasta el terminal C de la secuencia original de transferrina. Al coexpresarse, los dos polipéptidos transportadores se pliegan independientemente y se parean para formar un armazón de cuasitransferrina capaz de mantener sus propiedades terapéuticamente relevantes. Además, tal armazón de transferrina permite la producción de moléculas de fusión multivalentes, p. ej., una fusión de GLP-1 multivalente con 10 polipéptidos transportadores basados en transferrina. Estas fusiones pueden ser similares a los polipéptidos de fusión de GLP-1 con polipéptidos transportadores basados en albúmina.

La figura 13 proporciona la estructura de la molécula de transferrina basada en una estructura 1H76 del PDB. Los dos polipéptidos transportadores monoméricos derivados mediante la división de la molécula de transferrina están 15 codificados por color como unidades en gris claro y gris oscuro. Los sitios de fusión de las moléculas de carga se representan como esferas. La figura 12 muestra una gráfica del área superficial accesible de un disolvente enterrado en conexión con dos polipéptidos basados en transferrina. Una transferrina dividida junto a la posición de residuo 330, tal como los dos polipéptidos transportadores mostrados abajo, forma un heterodímero con aproximadamente 1800 Á2 de área superficial enterrada.

20

Secuencia del polipéptido-1 transportador basado en transferrina:

SEQ ID NO: 17:

MRLAVGALLV CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP SDGPSVACVK KASYLDCIRAIAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVV AEFYGSKEDP QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWN1P IGLLYCDLPE PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST LNQYFGYSGA FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT RKPVDEYKDC HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ FHFGKDKSKF,

25 FQLFSSPHGK DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRJMLREG.

Secuencia del polipéptido-2 transportador basado en transferrina:

SEQ ID NO: 18:

30

ECKPVKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKTECVSA ETTEDCTAKI MNGEADAMSL DGGFVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV VKKSASDLTW DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKINHCRFDEFFS EGCAPGSKKD SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA FVKHQTVPQN TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LC'LDGTRKPV EEYANCHLAR APNHAVVTRK DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF RDDTVCLAKL HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP.

Ejemplo 9: Proteínas de carga múltiples

35 Las proteínas de heteromultímero descritas en este documento [p. ej., que contienen un polipéptido de carga (o fragmento o variante del mismo) fusionadas al segmento de albúmina transportadora o variante del mismo] pueden adicionalmente fusionarse a otras proteínas para generar "proteínas de multifusión". Estas proteínas de multifusión pueden usarse en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la fusión de las proteínas descrita en este documento en los dominios de IgG (His-tag) y de la proteína de unión a maltosa, facilita la purificación. (Véase p. ej., EP A 40 394.827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Las señales de localización nucleares fusionadas en los polipéptidos pueden orientar a la proteína a una localización subcelular específica. Además, la fusión de las

secuencias de proteínas adicionales a las proteínas descritas en este documento puede incrementar en mayor medida la solubilidad y/o estabilidad del heteromultímero. Las proteínas de heteromultímero descritas anteriormente pueden generarse usando o modificando rutinariamente métodos conocidos en la técnica y/o con la modificación del siguiente protocolo, que describe la fusión de un polipéptido a una molécula de IgG.

5

En resumen, la porción Fc humana de la molécula de IgG puede amplificarse por PCR, usando cebadores que abarcan los extremos 5' y 3' de la secuencia descrita a continuación. Estos cebadores deben tener también sitios de enzimas de restricción convenientes que facilitan la clonación en un vector de expresión, preferentemente un vector de expresión de levadura o mamífero.

10

Por ejemplo, si pC4 (con n° de acceso de ATCC 209646) es usado, la porción Fc humana puede ligarse al sitio de clonación de BamHl. Tenga en cuenta que el sitio 3' BamHI debe destruirse. Después, el vector que contiene la porción Fc humana se vuelve a restringir con BamHl, linealizando el vector, y un polinucleótido que codifica una proteína heteromultimérica descrita en este documento (generada y aislada usando métodos conocidos en la 15 técnica) se liga al sitio de esta BamHl. Tenga en cuenta que el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención es clonada sin un codón de terminación; en caso contrario, no se producirá una proteína de fusión que contenga Fc.

Si la secuencia de señal original se usa para producir la proteína heteromultimérica descrita en este documento, la 20 pC4 no necesita un segundo péptido de señal. Alternativamente, si la secuencia de origen natural no se usa, el vector puede modificarse para incluir una secuencia de señal heteróloga. (Véase, p. ej., la publicación internacional con n.° WO 96/34891.)

25

30

35

40

45

50

55

Claims

I. Un heteromultímero que comprende:

5

al menos una primera proteína monomérica que comprende (i) un primer polipéptido transportador que comprende un primer segmento de albúmina sérica y (ii) al menos un polipéptido de carga y

al menos una segunda proteína monomérica que comprende (iii) un segundo polipéptido transportador que 10 comprende un segundo segmento de albúmina sérica y (iv) al menos un polipéptido de carga;

donde dicho primer polipéptido transportador es distinto del segundo polipéptido transportador mencionado, y donde dichos polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar una estructura cuasinatural de albúmina sérica.

15 2. El heteromultímero de la reivindicación 1, donde dicho heteromultímero es un heterodímero.

3 El heteromultímero de la reivindicación 1 o 2, donde

dichos polipéptidos transportadores son derivados de albúmina sérica humana con una secuencia con SEQ ID NO: 20 1,

y más preferentemente donde dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 2 y dicho segundo polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ iD NO: 3, o donde dicho primer polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 8 y dicho segundo 25 polipéptido transportador tiene una secuencia que comprende la SEQ iD NO: 10.
4. El heteromultímero de la reivindicación 1 o 2, donde a) al menos un polipéptido transportador se obtiene mediante segmentación de una aloalbúmina, b) al menos un polipéptido transportador se obtiene mediante segmentación de una aloalbúmina y al menos un polipéptido transportador se obtiene mediante segmentación de

30 una albúmina, o c) cada polipéptido transportador se obtiene mediante segmentación de una aloalbúmina diferente.
5. El heteromultímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 donde al menos un polipéptido de carga es un anticuerpo, o fragmento del mismo.

35 6. El heteromultímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde al menos un polipéptido de carga de dicha primera proteína monomérica se une a un antígeno diana, y el, al menos, único polipéptido de carga de dicha segunda proteína monomérica comprende un resto de toxina.
7. El heteromultímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde, al menos, dicho único polipéptido de 40 carga se une a un antígeno diana, y donde dicho antígeno diana es al menos uno de la cadena-a (CD25) de IL-2R,

Beta amiloide, anti-EpCAM, anti-CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD23, CD3, CD4, CD52, CD80, CTLA-4, EGFR, EpCAM, proteína F de RSV, G250, glicoproteína IIB/IIIa R, HER2, HSP90, anticuerpo de IgE, IL-12, IL-23, IL-1p, IL- 5, IL-6, RANKL, TNF alfa, TNFR, VEGF-A, receptor de glucagón, receptor de GLP-1, y receptor de LDL, o donde al menos un polipéptido de carga es una enzima, hormona, polipéptido terapéutico, antígeno, quimiotoxina, 45 radiotoxina, citoquina o fragmento de los mismos.
8. El heteromultímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 donde dicha primera proteína monomérica y dicha segunda proteína monomérica comprenden el mismo polipéptido de carga, o donde dicha primera proteína monomérica y dicha segunda proteína monomérica comprenden polipéptidos de carga diferentes.

50
9. Una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el heteromultímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. La célula huésped de la reivindicación 9, donde el ácido nucleico que codifica la primera proteína monomérica y 55 el ácido nucleico que codifica la segunda proteína monomérica están presentes en un único vector, o donde el ácido

nucleico que codifica la primera proteína monomérica y el ácido nucleico que codifica la segunda proteína monomérica están presentes en vectores separados.

II. Un procedimiento para generar heteromultímeros de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 a 60 partir de albúmina sérica mediante segmentación de una albúmina sérica para obtener segmentos de albúmina

sérica tales que dichos segmentos de albúmina sérica se autoensamblan para formar dicho heteromultímero.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, donde la segmentación se realiza de forma que el heteromultímero no comprende ningún enlace covalente entre los segmentos de albúmina sérica, o donde la segmentación se realiza de forma que el heteromultímero comprende al menos un enlace covalente entre los segmentos de albúmina sérica.

5 13. Un armazón terapéutico que comprende un heteromultímero generado por el procedimiento de la reivindicación 11 o 12.
14. Un ácido nucleico que codifica el heteromultímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8

10 15. Un procedimiento para generar el heteromultímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 y recuperar el heteromultímero a partir del cultivo de células huésped.

15

20

25

30

35

40

45

50

55