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ES2668630T3 - Regulación por disminución de la expresión génica en plagas de insectos - Google Patents

Regulación por disminución de la expresión génica en plagas de insectos Download PDF

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ES2668630T3
ES2668630T3 ES12722308.9T ES12722308T ES2668630T3 ES 2668630 T3 ES2668630 T3 ES 2668630T3 ES 12722308 T ES12722308 T ES 12722308T ES 2668630 T3 ES2668630 T3 ES 2668630T3
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Myriam Beghyn
Thierry Bogaert
Pascale Feldmann
Romaan Raemaekers
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Devgen NV
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Abstract

Un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona, tras la captación por una especie de plaga de insectos, regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en el que el ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador en el que dicho elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.

Description

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DESCRIPCION
Regulación por disminución de la expresión génica en plagas de insectos Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, al control genético de infestación por parte de especies de plagas de insectos, particularmente a la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas de plantas. Más específicamente, la invención se refiere a la regulación por disminución de la expresión de genes diana en especies de plagas de insectos por parte de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) interferente. También se proporcionan composiciones y combinaciones que contienen moléculas de ARN interferente de la invención para su uso en aplicaciones tópicas, por ejemplo, en forma de insecticidas.
Antecedentes de la invención
Existe abundancia de especies de plagas de insectos que pueden infectar o infestar una amplia variedad de ambientes y organismos hospedadores. Las plagas de insectos incluyen una variedad de especies de los órdenes de insectos Hemiptera (chinches de campo), Coleóptera (escarabajos), Siphonaptera (pulgas), Dichyoptera (cucarachas y mantis), Lepidoptera (polillas y mariposas), Orthoptera (por ejemplo, langostas) y Diptera (moscas). La infestación por parte de plagas puede dar lugar a daños significativos. Las plagas de insectos que infestan especies de plantas son particularmente problemáticas en la agricultura, ya que pueden causar daños serios a cultivos y reducir significativamente los rendimientos de las plantas. Una amplia gama de diferentes tipos de plantas son susceptibles a la infestación por parte de plagas, incluyendo cultivos comerciales tales como arroz, algodón, soja, patata y maíz.
Tradicionalmente, la infestación con plagas de insectos se ha prevenido o controlado mediante el uso de plaguicidas químicos. Sin embargo, estos químicos no siempre son adecuados para su uso en el tratamiento de cultivos, ya que pueden ser tóxicos para otras especies y pueden provocar daño significativo al medio ambiente. En las décadas más recientes, los investigadores han desarrollado métodos más ecológicos para controlar la infestación por parte de plagas. Por ejemplo, se han utilizado microorganismos tales como las bacterias Bacillus thuringiensis que expresan de forma natural proteínas tóxicas para plagas de insectos. Los científicos han aislado los genes que codifican estas proteínas insecticidas y las han utilizado para generar cultivos transgénicos resistentes a plagas de insectos, por ejemplo, plantas de maíz y algodón manipuladas genéticamente para producir proteínas de la familia Cry.
Si bien las toxinas bacterianas han sido sumamente exitosas para controlar ciertos tipos de plagas, no son eficaces contra todas las especies de plagas. Por lo tanto, los investigadores han buscado otras estrategias dirigidas para controlar las plagas y en particular para lograr una interferencia de ARN o "silenciamiento génico" como medio para controlar plagas a nivel genético.
La interferencia de ARN "iARN" es un proceso mediante el cual la expresión de genes en el contexto de una célula o todo un organismo se regula por disminución con especificidad de secuencia. La iARN actualmente es una técnica bien establecida en la técnica de inhibición o regulación por disminución de la expresión de genes en una amplia gama de organismos, incluyendo organismos de plagas tales como hongos, nematodos e insectos. Además, estudios previos han demostrado que la regulación por disminución de genes diana en especies de plagas de insectos puede utilizarse como medio para controlar la infestación por parte de plagas.
El documento WO2007/074405 describe métodos para inhibir la expresión de genes diana en plagas de invertebrados, incluyendo el escarabajo de la patata de Colorado. Además, el documento WO2009/091864 describe composiciones y métodos para la supresión de genes diana de especies de plagas de insectos, incluyendo plagas del género Lygus.
Si bien el uso de la iARN para regular por disminución la expresión de genes en especies de plagas es bien conocido en la técnica, el éxito de esta técnica como medida para controlar las plagas depende de la selección de los genes diana más apropiados, concretamente aquellos en los que la pérdida de función provoca una alteración significativa en un proceso biológico esencial y/o la muerte del organismo. La presente invención, por tanto, está dirigida a la regulación por disminución de genes diana particulares en plagas de insectos como medio para alcanzar una prevención y/o control más eficaces de la infestación por parte de plagas de insectos, particularmente de plantas.
Sumario de la invención
Los autores de la presente invención buscaron identificar medios mejorados para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos utilizando estrategias genéticas. En particular, investigaron el uso de la iARN para regular por disminución genes de tal forma que se altere la capacidad de la plaga de insectos de sobrevivir, crecer, colonizar ambientes específicos y/o infestar organismos hospedadores y así limitar el daño causado por la plaga.
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Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un ácido ribonucleico (ARN o ARN bicatenario) interferente que funciona, tras la captación por una especie de plaga de insectos, regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos,
donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador en el que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
En un aspecto particular de la invención, las moléculas de ARN interferente de la presente invención comprenden al menos una región bicatenaria, típicamente el elemento silenciador del ARN interferente, que comprende una hebra de ARN codificante hibridada mediante formación de pares de bases complementarias a una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana.
En una realización, la presente invención se refiere a un ácido ribonucleico (ARN o ARN bicatenario) interferente que funciona, tras la captación por una especie de plaga de insectos, regulando por disminución un gen diana en dicha plaga de insectos, donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador donde el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos que es un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
Estos genes diana codifican proteínas dentro del complejo de troponina/miofilamento.
En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ARN interferente que comprende al menos una región bicatenaria, típicamente el elemento silenciador de la molécula de ARN interferente, que comprende una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias con una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos contiguos, que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada dentro del trascrito de ARN de un gen diana del complejo de troponina/miofilamento.
En una realización, el gen diana codifica una proteína wings up A - de alas levantadas - (troponina I) de insecto (por ejemplo, un ortólogo de insecto de la proteína CG7178 Dm), estando representado dicho gen diana por las SEQ ID NO: 1 y 2. En una realización preferida, el ortólogo de insecto tiene al menos un 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID NO: 79.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición para prevenir y/o controlar una infestación por parte de una plaga de insectos, que comprende al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente y al menos un vehículo, excipiente o diluyente adecuado, donde el ARN interferente funciona, tras la captación por la plaga, regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga,
donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador en el que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
La composición de la invención puede usarse para la prevención y/o control de infestación por parte de plagas. En ciertas realizaciones, la composición puede usarse como plaguicida para una planta o para el material de propagación o reproductor de una planta. En un aspecto adicional, en este documento se proporciona una combinación para prevenir y/o controlar una infestación por parte de una plaga, que comprende la composición de la invención y al menos otro agente activo.
En un aspecto adicional, en este documento se proporciona un método para regular por disminución la expresión de un gen diana en una especie de plaga de insectos, para prevenir y/o controlar la infestación por parte de la plaga, que comprende poner en contacto dicha especie de plaga con una cantidad eficaz de al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente, donde el ARN interferente funciona, tras la captación por la plaga, regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga, donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador, en el que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
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De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido que comprende al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas, o, y
donde dicho polinucleótido tiene una longitud no mayor de 10 000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.
En un aspecto particular de la invención, el polinucleótido aislado es parte de una molécula de ARN interferente, típicamente parte del elemento silenciador, que comprende al menos una región bicatenaria que comprende una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias a una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. Más particularmente, el polinucleótido aislado se clona en una construcción de ADN en una orientación codificante y no codificante de forma tal que al transcribirse el polinucleótido codificante y no codificante se forma una molécula de ARNbc, que funciona tras la captación por parte de una plaga inhibiendo o regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que se clona en una construcción de ADN en una orientación codificante y no codificante de modo que tras la transcripción del polinucleótido codificante y no codificante se forme una molécula de ARNbc, que funciona tras la captación por un insecto inhibiendo o regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro del complejo de troponina/miofilamento.
En una realización, el gen diana codifica una proteína wings up A - de alas levantadas - (troponina I) de insecto (por ejemplo, un ortólogo de insecto de la proteína CG7178 Dm), estando representado dicho gen diana por las SEQ ID NO: 1 y 2. En una realización preferida, el ortólogo de insecto tiene al menos un 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID NO: 79.
De acuerdo con otras realizaciones, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que se clona en una construcción de ADN en una orientación codificante y no codificante de modo que tras la transcripción del polinucleótido codificante y no codificante se forme una molécula de ARNbc, que funciona, tras la captación por un insecto, inhibiendo o regulando por disminución la expresión de un gen diana que codifica una proteína ribosómica de insecto.
Preferiblemente, los métodos de la invención tienen aplicación práctica en la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas de insectos, en particular, control de infestación por parte de plagas de plantas de cultivo tales como, aunque sin limitación, algodón, patata, arroz, fresas, alfalfa, soja, tomate, colza, girasol, sorgo, mijo, maíz, berenjena, pimiento y tabaco. Además, el ARN interferente de la invención puede introducirse en las plantas a proteger mediante técnicas de ingeniería genética de rutina.
En todos los aspectos de la divulgación, en aspectos preferidos, el gen diana
(i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, o que tienen una secuencia de nucleótidos tal que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, son al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
Estos genes diana codifican proteínas dentro del complejo de troponina/miofilamento.
Breve descripción de las Tablas y las Figuras
Tabla 1 Dianas novedosas de Lygus hesperus identificadas de la primera detección.
Tabla 1B Dianas novedosas de Lygus hesperus en la ruta de Lh594.
Tabla 1C Dianas novedosas de Lygus hesperus identificadas de la segunda ronda de detección.
Tabla 2 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en Lygus hesperus.
Tabla 3 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en Lygus hesperus.
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Tabla 4 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) que corresponden a genes diana de Lygus hesperus y cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 5 Dianas de Lygus hesperus clasificadas de acuerdo con las curvas de respuesta a dosis (DRC) y comparadas con las dianas de referencia Lh423 y Lh105.
Tabla 6 Dianas de Lygus hesperus de la clasificación de la segunda ronda de detección de acuerdo con las DRC y comparadas con las dianas de referencia Lh423 y Lh594.
Tabla 7 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en el escarabajo de la patata de Colorado (CPB). Tabla 8 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en CPB.
Tabla 9 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) que corresponde a genes diana de CPB y cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 10 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en el saltamontes pardo del arroz (BPH).
Tabla 11 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en BPH.
Tabla 12 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) correspondientes a los genes diana de BPH y los cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 13 Cebadores utilizados para la amplificación de ADNc de áfidos, basados en la secuencia genómica de pulgón del guisante.
Tabla 14 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en áfidos.
Tabla 15 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en áfidos.
Tabla 16 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) correspondientes a los genes diana de áfidos y los cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 17 Cebadores degenerados utilizados para la amplificación de ADNc de Ld594 de CPB
Tabla 18 Cebadores degenerados utilizados para la amplificación de ADNc de BPH
Tabla 19: Dianas novedosas de Leptinotarsa decemlineata de la detección.
Tabla 20: Diana novedosa identificada de Nilaparvata lugens.
Tabla 21: Dianas novedosas identificadas de Acyrthosiphon pisum.
Figura 1: Segundo ensayo de confirmación de las placas Lh001_009. barras claras: mortalidad en el día 6 a 8. Los clones candidatos se "Lygxxx" y los códigos de nomenclatura de dianas "Lhxxx".
Figura 2: Segundo ensayo de confirmación de las placas Lh010_020. barras claras: mortalidad en el día 6 a 8. Los clones candidatos se "Lygxxx" y los códigos de nomenclatura de dianas "Lhxxx".
Figura 3: Análisis de mortalidad de dianas novedosas de Lygus de las placas Lh001 a Lh009, expresado como % de mortalidad en un periodo de 10 días. Los controles se indican con líneas de puntos. Control positivo: ARNbc de Lh423 (RpL19). Controles negativos: ARNbc de GFP y dieta únicamente (Control).
Figura 4: Análisis de mortalidad de dianas novedosas de Lygus de las placas Lh010 a Lh020, expresado como % de mortalidad en un periodo de 10 días. Los controles se indican con líneas de puntos. Control positivo: Lh423 (RpL19). Controles negativos: GFP y dieta únicamente (Control).
Figuras 5 a 9 Dianas novedosas de Lygus hesperus - curvas de respuesta a la dosis a concentraciones de ARNbc sintético purificado que varían de 0,4 a 0,025 pg/pl (en la figura, la unidad "pg/pl" no se muestra). Se usaron ARNbc de GFP y agua milliQ como controles negativos. Los ARNbc de las dianas se produjeron usando los cebadores como se describe en la sección 1.1 de ejemplos.
Figura 10 Curva de respuesta a la dosis de Lh594, a concentraciones de ARNbc que varían de 0,05 a 0,001 pg/pl. Se usaron ARNbc de gFp y agua milliQ como controles negativos.
Barras oscuras: mortalidad en el día 3 a 6, nombraron usando los códigos de cribado
Barras oscuras: mortalidad en el día 3 a 6, nombraron usando los códigos de cribado
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Figura 11 A Actividad de ARNbc en bioensayo de Lygus hesperus en ausencia de ARNt. Lh594 (5 pg/pl); control positivo: Lh423 (5 pg/pl); controles negativos: ARNbc de GFP (5 pg/pl) y agua milliQ; B Identificación del límite de actividad de Lh594 usando una concentración decreciente de ARNbc (de 5 pg a 0,25 pg). Controles negativos: ARNbc de GFP (5 pg/pl) y agua milliQ.
Figura 12 Segundo ensayo de confirmación de las placas Lh010 a Lh020 de las dianas de la segunda detección. Barras oscuras: mortalidad en el día 4 a 8, barras claras: mortalidad en el día 4 a 6. Los clones candidatos se nombraron usando los códigos de cribado "Lygxxx" y los códigos de nomenclatura de dianas "Lhxxx".
Figura 13 Resultados del ensayo para las dianas de la ruta de troponina de Lygus, ensayadas a 0,5 pg/pl fijos.
Figuras 14 A-B Dianas novedosas de Lygus hesperus de la ruta de troponina - curvas de respuesta a la dosis a concentraciones de ARNbc sintético purificado que varían de 0,4 a 0,025 pg/pl (en la figura, la unidad "pg/pl" no se muestra siempre). Se usaron ARNbc de GFP y agua milliQ como controles negativos.
Figuras 15 A-D Dianas novedosas de Lygus hesperus de las dianas de la segunda detección - curvas de respuesta a dosis a concentraciones de ARNbc sintético purificado que varían de 0,5 a 0,05 pg/pl. Se usaron ARNbc de GFP y agua milliQ como controles negativos.
Figura 16 Análisis de supervivencia de larvas de CPB tratadas con 1 pg de ARNbc de Ld594, Ld619 y Ld620. Los controles positivos incluyeron 1 pg de ARNbc de las dianas de referencia Ld513 y Ld049. Los controles negativos incluyeron agua milliQ y FP.
Figura 17 Efectos de ARNbc de Ld594, Ld619 y Ld620 tras pupación de larvas de CPB de 4.° estadio, en comparación con el control sin tratar (UTC). Se alimentaron chinches con 1 pg de ARNbc dispensado en discos de hojas de patata, luego se dejaron alimentarse con hojas de patata sin tratar (A) durante 4 días antes de colocarse sobre vermiculita. Para evaluar el efecto del ARNbc, los insectos muertos se excavaron de la vermiculita (debido a los efectos fuertes inducidos por el ARNbc de Ld594, no se recuperaron pupas de la vermiculita y, por lo tanto, no hay ninguna imagen disponible para este ARNbc diana) (B).
Figura 18 Efecto del ARNbc de Ld594, 619 y 620 de CPB en la supervivencia y estado físico de adultos de CPB. Las evaluaciones se realizaron en los días 4, 6, 7, 8, 11 y 13. Control MQ: agua milliQ.
Figura 19 Actividad del ARNbc de la ruta de Nl594 en saltamontes pardo del arroz. Los ARNbc se evaluaron a 0,5 pg/pl en presencia de un 0,1% de CHAPSO. Control positivo: ARNbc de Nl537 (0,5 pg/pl), controles negativos: ARNbc de GFP (0,5 pg/pl) y dieta únicamente.
Figura 20 Actividad del ARNbc de Ap594, Ap423, Ap537 y Ap560 en A. pisum. Los ARNbc se ensayaron a 0,5 pg/pl en presencia de 5 pg/pl de ARNt. Control negativo: ARNbc de GFP (0,5 pg/pl).
Figura 21 Porcentajes de mortalidad de larvas de L. decemlineata con dieta tratadas con ARNbc. Ld583, Ld584, Ld586 y Ld588 representan clones diana. Control positivo: Ld513; control negativo: FP.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención han descubierto que la regulación por disminución de la expresión de genes diana particulares en especies de plagas de insectos mediante iARN puede utilizarse para prevenir y/o controlar de modo eficaz la infestación por parte de dichas plagas de insectos.
Como se usa en este documento, el término "control" de una infestación por plaga se refiere a cualquier efecto sobre una plaga que sirve para limitar y/o reducir los números de organismos de plagas y/o la lesión provocada por la plaga. Los genes diana preferidos son, por lo tanto, genes esenciales que controlan o regulan una o más funciones biológicas esenciales dentro de la plaga de insectos, por ejemplo, división celular, reproducción, metabolismo energético, digestión, función neurológica y similares. La regulación por disminución de estos genes esenciales mediante técnicas de iARN puede provocar la muerte del insecto o de otra forma, retardar de modo significativo el crecimiento y desarrollo o deteriorar la capacidad de la plaga de colonizar un ambiente o infestar organismos hospedadores.
Los autores de la presente invención ahora han identificado genes diana mejores de especies de plagas de insectos que pertenecen al género Lygus, Leptinotarsa, Nilaparvata y Acyrthosiphum, que son dianas concebidas para su uso individual o en combinación como un medio eficaz para el control mediado por iARN de la infestación por parte de insectos, por ejemplo, de cultivos agronómicamente importantes. Los ortólogos de estos genes diana recientemente identificados pueden utilizarse en otras especies de insectos para controlar la infestación por parte de plagas de los cultivos relevantes correspondientes.
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Más específicamente, los autores de la presente invención describen en esta ocasión que los genes que codifican las proteínas del complejo de troponina/miofilamento forman excelentes genes diana para la supresión por parte de la maquinaria de inhibición de aRn. Uno de estos genes diana codificaba la proteína troponina I de insecto (wings up A) que es un ortólogo de la proteína de Drosophila CG7178. Esta proteína está implicada en la contracción muscular y pertenece a una ruta fisiológica que aún no había sido totalmente explorada para el control de plagas (insectos) mediante la inhibición de ARN. Además, dado que este complejo proteínico es específico para animales, no se conocen homólogos u ortólogos de genes vegetales, lo que reduce el riesgo de fenotipos vegetales de tipo incorrecto al expresar el ARNbc diana en plantas. Adicionalmente, en Drosophila, la troponina I se describe como un gen haploinsuficiente que exhibe un fenotipo mutante en estado heterocigoto. Estos genes son particularmente susceptibles a los niveles de expresión de ARNm reducidos y, como tales, pueden considerarse dianas ideales de la iARN.
A continuación se enumeran genes diana interesantes adicionales de este complejo de troponina/miofilamento.
ID anotación
Citología Identificador de Dm
up
sostenida CG7107
Tm1
tropomiosina 1 CG4898
Tm2
tropomiosina 2 CG4843
Mhc
cadena pesada de miosina CG17927
Mlc-c
cadena citoplásmica ligera de miosina CG3201
sqh
calabacín CG3595
_zjp_________________
cremallera CG15792
Por tanto, de acuerdo con una realización, la presente invención se refiere a un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona, tras la captación por una especie de plaga de insectos, regulando por disminución un gen diana en dicha plaga de insectos, donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador donde el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
En una realización preferida, el gen diana codifica una proteína de insecto troponina I (por ejemplo, un ortólogo de insecto de la proteína CG7178 Dm).
Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona, tras la captación por una especie de plaga de insectos, regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos.
Como se usa en este documento, un "gen diana" comprende cualquier gen en la plaga de insectos que se pretende regular por disminución. En una realización preferida, el gen diana se regula por disminución de forma tal que controla la infestación por parte de la plaga, por ejemplo, alterando un proceso biológico esencial de la plaga, o disminuyendo la patogenicidad de la plaga. Los genes diana preferidos incluyen, por lo tanto, aunque sin limitación, aquellos que tienen funciones clave en la regulación de la alimentación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción, infestación e infectividad. De acuerdo con una realización, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula por disminución o se inhibe, la plaga de insectos muere. De acuerdo con otra realización, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula por disminución o se inhibe, se previene o retarda o atrofia o retrasa o impide el crecimiento de la plaga, se previene la reproducción de la plaga, o se previene la transición a través de ciclos vitales de la plaga. De acuerdo con otra realización de la invención, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula por disminución o se inhibe, se reduce el daño causado por la plaga y/o la capacidad de la plaga de infectar o infestar ambientes, superficies y/o especies de plantas o cultivos; o la plaga deja de alimentarse de sus recursos alimenticios naturales tales como plantas y productos de las plantas. En general, los términos "infestar" e "infectar" o "infestación" e "infección" se utilizan indistintamente en todo el documento.
Los genes diana pueden expresarse en todas o algunas de las células de la plaga de insectos. Además, los genes diana pueden expresarse solamente por la plaga de insectos en una etapa particular de su ciclo vital, por ejemplo, la fase de adulto maduro, la fase de ninfa o larva inmadura o la etapa de huevos.
Como se usa en este documento, las especies de "plaga" son preferiblemente especies de insectos que causan infección o infestación, preferiblemente de plantas. La especie de insecto puede comprender una especie que pertenezca a los órdenes Coleóptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera o Siphonaptera.
Los insectos patógenos de plantas preferidos de acuerdo con la invención son plagas de plantas que se seleccionan del grupo que consiste en Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L.
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juncta (falso escarabajo de la patata) o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes pardo del arroz)); Laodelphax spp. (por ejemplo, L. striatellus (saltamontes pardo pequeño del arroz)); Nephotettix spp. (por ejemplo, N. virescens o N. cincticeps (saltahojas verde) o N. nigropictus (saltahojas del arroz)); Sogatella spp. (por ejemplo, S. furcifera (saltaplantas de dorso blanco)); Chilo spp. (por ejemplo, C. suppressalis (barrenador bandeado de los tallos del arroz), C. auricilius (barrenador de franjas doradas de los tallos) o C. polychrysus (barrenador de cabeza oscura de los tallos)); Sesamia spp. (por ejemplo, S. inferens (barrenador rosa del arroz)); Tryporyza spp. (por ejemplo, T. innotata (barrenador blanco del arroz) o T. incertulas (barrenador amarillo del arroz)); Anthonomus spp. (por ejemplo, A. grandis (gorgojo del algodón)); Phaedon spp. (por ejemplo, P. cochleariae (escarabajo de las hojas de la mostaza)); Epilachna spp. (por ejemplo, E. varivetis (barrenador de las judías mexicano)); Tribolium spp. (por ejemplo, T. castaneum (escarabajo rojo del suelo)); Diabrotica spp. (por ejemplo, D. virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental), D. barberi (gusano de la raíz del maíz norteño), D. undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz sureño), D. virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano); Ostrinia spp. (por ejemplo, O. nubilalis (barrenador del maíz europeo)); Anaphothrips spp. (por ejemplo, A. obscrurus (arañuela del césped)); Pectinophora spp. (por ejemplo, P. gossypiella (gusano cogollero rosa)); Heliothis spp. (por ejemplo, H. virescens (gusano de los brotes del tabaco)); Trialeurodes spp. (por ejemplo, T. abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas), T. vaporariorum (mosca blanca de invernadero)); Bemisia spp. (por ejemplo, B. argentifolii (mosca blanca de hojas plateadas)); Aphis spp. (por ejemplo, A. gossypii (pulgón del algodón)); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchada) o L. hesperus (chinche manchada del oeste)); Euschistus spp. (por ejemplo, E. conspersus (chinche hedionda moteada)); Clorochroa spp. (por ejemplo, C. sayi (chinche de las llanuras)); Nezara spp. (por ejemplo, N. viridula (chinche verde del sur)); Thrips spp. (por ejemplo, T. tabaci (arañuelas de la cebolla)); Frankliniella spp. (por ejemplo, F. fusca (arañuela del tabaco) o F. occidentalis (arañuela de las flores occidental)); Acheta spp. (por ejemplo, A. domesticus (grillo del hogar)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgón verde del melocotonero)); Macrosiphum spp. (por ejemplo, M. euphorbiae (pulgón de la patata)); Blissus spp. (por ejemplo, B. leucopterus leucopterus (chinche de los cereales)); Acrosternum spp. (por ejemplo, A. hilare (chinche hedionda verde)); Chilotraea spp. (por ejemplo, C. polychrysa (barrenador de las cañas del arroz)); Lissorhoptrus spp. (por ejemplo, L. oryzophilus (gorgojo del agua del arroz)); Rhopalosiphum spp. (por ejemplo, R. maidis (pulgón de las hojas del maíz)); y Anuraphis spp. (por ejemplo, A. maidiradicis (pulgón de la raíz del maíz)).
De acuerdo con una realización más específica, la invención es aplicable para especies que pertenecen a la familia de Chrysomelidae o galerucas. Escarabajos crisomélidos, tales como escarabajos de la patata de Colorado, pulguillas, gusanos de la raíz del maíz y curculiónidos tales como los gorgojos del arroz son plagas particularmente importantes. Especies Leptinotarsa específicas para controlar de acuerdo con la invención incluyen el escarabajo de la patata de Colorado (Leptinotarsa decemlineata (Say) y falso escarabajo de la patata (Leptinotarsa juncta (Say). CPB es una plaga (grave) de nuestra patata nacional, otras especies de patata de tubérculo y sin tubérculo cultivadas y silvestres y otras especies de plantas solanáceas (solanos) incluyendo las especies de cultivo tomate, berenjena, pimientos, tabaco (especies Nicotiana incluyendo plantas ornamentales), alquequenje, arroz, maíz o algodón; y las especies de malezas/hierbas, ortiga de caballo, solano común, manzana espinosa, beleño y duraznillo. Los gusanos de la raíz del maíz incluyen especies encontradas en el género Diabrotica (por ejemplo, D. undecimpunctata undecimpunctata, D. undecimpunctata howardii, D. longicornis, D. virgifera y D. balteata). Los gusanos de la raíz del maíz provocan grandes daños al maíz y las cucurbitáceas.
De acuerdo con una realización más específica, la invención es aplicable para especies que pertenecen al orden de hemípteros (familia de Aphidoidea), tales como Myzus persicae (pulgón verde del melocotonero, Aphis fabae (pulgón de la judía negra), Acyrthosiphum pisum (pulgón del guisante), Brevicoryne brassicae (pulgón del repollo), Sitobion avenae (pulgón de los cereales), Cavariella aegopodii (pulgón de la zanahoria), Aphis craccivora (pulgón del cacahuate), Aphis gossypii (pulgón del algodón), Toxoptera aurantii (pulgón negro de los cítricos), Cavariella spp (pulgón del sauce), Chaitophorus spp (pulgones de las hojas del sauce), Cinara spp. (pulgones del pino negro), Drepanosiphum platanoides (pulgones del sicomoro) Elatobium spp (pulgones del abeto) que causan daño a plantas tales como árboles Prunus, particularmente melocotonero, albaricoquero y ciruelo; árboles que son principalmente cultivados para producción de madera tales como sauces y álamos, a cultivos en hileras tales como maíz, algodón, soja, trigo y arroz, a cultivos de hortalizas de las familias Solanaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae y Cucurbitaceae, incluyendo aunque sin limitación, alcachofa, espárrago, judías, remolachas, brécol, coles de Bruselas, repollo, zanahoria, coliflor, cantalupo, apio, maíz, pepino, hinojo, col rizada, colirrábano, nabo, berenjena, lechuga, mostaza, quingombó, perejil, chirivía, guisante, pimiento, patata, rábano, espinaca, calabacín, tomate, nabo, berro y sandía; o cultivos de campo tales como, aunque sin limitación, tabaco, remolacha azucarera y girasol; un cultivo de flores u otras plantas ornamentales tales como pinos y coníferas. Otros hemípteros pertenecen a Nilaparvata ssp. (por ejemplo, N. lugens, Sogatella furcifera) y causan daños a las plantas del arroz. Otros hemípteros pertenecen a Lygus ssp. (por ejemplo, Lygus hesperus, Lygus rugulipennis, Lygus lineolaris, Lygus sully) y otras especies de insectos que se alimentan de plantas en la familia de los Miridae, y causan daño a plantas de algodón, patatas, fresas, algodón, alfalfa, colza, melocotón, ciruelas, uva, lechuga, berenjena, cebolla y judías verdes. También varios árboles mediterráneos y varios árboles ornamentales tales como el olmo (Ulmus spp.), pino piñonero (Pinus Pinea), plátano de Londres (Platanus Acerifolia), pomera blanca (Malus alba). Otros hemípteros pertenecen a la familia de los Pentatomoidea y son comúnmente conocidos como chinche de escudo y chinches hediondas (por ejemplo, la chinche hedionda marmórea marrón (Halyomorpha halys), la chinche hedionda moteada (Euschistus conspersus), chinche verde del sur (Nezara viridula), chinche del bosque (Pentatoma rufipes), chinche
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Arlequín (Murgantia histrionica) y chinche del arroz (Oebalus pugnax)) y causan daño a frutas, incluyendo manzanas, melocotones, higos, moras, frutas cítricas y caquis, mora, y hortalizas, incluyendo maíz dulce, tomates, semillas de soja, judías de Lima y pimientos verdes, repollo, coliflor, nabos, rábano picante, coles, mostaza, coles de Bruselas, patata, berenjena, quingombó, judías, espárrago, remolachas, malezas, árboles frutales y cultivos de campo tales como campos de maíz y semillas de soja. Las chinches también son una plaga de céspedes, sorgo y arroz.
Una planta a usar en los métodos de la invención, o una planta transgénica de acuerdo con la invención, abarca cualquier planta, pero es preferiblemente una planta que es susceptible a ser infestada por parte de un insecto patógeno de planta.
Por consiguiente, la presente invención incluye plantas y métodos como se describe en este documento, donde la planta se elige del siguiente grupo de plantas (o cultivos): alfalfa, manzana, albaricoque, alcachofa, espárrago, aguacate, plátano, cebada, judías, remolacha, mora, arándano, brécol, coles de Bruselas, repollo, colza, zanahoria, yuca, coliflor, un cereal, apio, cereza, cítrico, clementina, café, maíz, algodón, pepino, berenjena, escarola, eucalipto, higos, uvas, pomelo, cacahuetes, alquequenje, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino, maíz, mango, melón, mijo, champiñón, semillas de avena, quingombó, cebolla, naranja, una planta o flor o árbol ornamental, papaya, perejil, guisante, melocotón, cacahuete, turba, pimiento, caqui, piña, plátano grande, ciruela, granada, patata, calabaza, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, soja, semilla de soja, espinacas, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, mandarina, té, tabaco, tomate, una vid, sandía, trigo, ñames y calabacín.
En realizaciones específicas, la presente invención proporciona genes diana que codifican proteínas implicadas en la función de una proteína wings up A (troponina I), una proteína mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad II o una de las proteínas ribosómicas especificadas en la tabla 1.
En realizaciones preferidas, la presente invención proporciona genes diana seleccionados del grupo de genes (i) que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, o que tienen una secuencia de nucleótidos tal que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, son al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas;
y donde la secuencia de nucleótidos de dicho gen tiene una longitud no mayor de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.
Como se usa en este documento, la expresión "que tiene" tiene el mismo significado que "que comprende".
Como se usa en este documento, la expresión "identidad de secuencia" se utiliza para describir la relación de secuencia entre dos o más nucleótidos o secuencias de aminoácidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación (un número definido de posiciones), donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, brechas) en comparación con la secuencia de referencia para lograr una alineación óptima. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base nucleotídica o resto de aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones "coincidentes", dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100. Los métodos y programas informáticos para determinar la identidad de secuencia están disponibles en la técnica e incluyen el software Blast y el análisis GAP. Para ácidos nucleicos, el porcentaje de identidad se calcula preferiblemente mediante la herramienta de alineación BlastN, con la cual se calcula el porcentaje de identidad en la totalidad de la longitud de la secuencia de nucleótidos de consulta.
Un experto en la materia reconocerá que pueden identificarse homólogos u ortólogos (homólogos que existen en diferentes especies) de los genes diana representados por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189. También se divulgan estos homólogos y/u ortólogos de plagas. Los homólogos y/u ortólogos preferidos son genes de secuencia de nucleótidos similar a un grado tal que cuando los dos genes se alinean de forma óptima y se comparan, el homólogo y/o el ortólogo tienen una secuencia que es al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90% o un 95%, y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas. Otros homólogos son genes que son alelos de un gen que comprende una secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189. Homólogos preferidos adicionales son genes que comprenden al menos un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en comparación con un gen que comprende una secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189.
El "ácido ribonucleico (ARN) interferente" de la presente divulgación es cualquier tipo de molécula de ARN capaz de regular por disminución o de "silenciar" la expresión de un gen diana incluyendo, aunque sin limitación, ARN codificante, ARN no codificante, ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aRn bicatenario (ARNbc),
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ARN en horquilla (ARN) y similares. Los métodos para evaluar moléculas funcionales de ARN interferente son bien conocidos en la técnica y se describen en otras partes de este documento.
Las moléculas de ARN interferente de la presente invención producen la regulación por disminución específica de las secuencias de expresión de un gen diana mediante la unión a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La unión se produce como resultado de la formación de pares de bases entre regiones complementarias del ARN interferente y la secuencia de nucleótidos diana. Como se usa en este documento, la expresión "elemento silenciador" se refiere a la porción o región del ARN interferente que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana, y que funciona como la porción activa del ARN interferente para dirigir la regulación por diminución de la expresión de dicho gen diana. En una realización de la invención, el elemento silenciador comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana.
Como se usa en este documento, "expresión de un gen diana" se refiere a la transcripción y acumulación del transcrito de ARN codificado por un gen diana y/o la traducción del ARNm en proteína. La expresión "regular por disminución" pretende hacer referencia a cualquiera de los métodos conocidos en la técnica mediante los cuales las moléculas de ARN interferente reducen el nivel del transcritos primarios de ARN, ARNm o proteína producida a partir de un gen diana. En ciertas realizaciones, la regulación por disminución se refiere a una situación en la que el nivel de ARN o proteína producida a partir de un gen se reduce al menos un 10%, preferiblemente al menos un 33%, más preferiblemente al menos un 50%, aún más preferiblemente al menos un 80%. En realizaciones particularmente preferidas, la regulación por disminución se refiere a una reducción en el nivel de ARN o proteína producida a partir de un gen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, y aún más preferiblemente al menos un 99% dentro de las células de la plaga de insectos en comparación con una plaga de insectos de control apropiada que, por ejemplo, no se ha expuesto a un ARN interferente o se ha expuesto a una molécula de ARN interferente de control. En la técnica se conocen bien los métodos para detectar reducciones en los niveles de ARN o proteína e incluyen hibridación en solución de ARN, hibridación de tipo Northern, transcripción inversa (por ejemplo, análisis por RT-PCR cuantitativa), análisis de micromatrices, unión de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y transferencia de Western. En otra realización de la invención, la regulación por disminución se refiere a una reducción en los niveles de ARN o proteína suficiente para provocar un cambio detectable en un fenotipo de la plaga en comparación con un control de plaga apropiado, por ejemplo, muerte celular, detención del crecimiento o similares. La regulación por disminución puede medirse, por tanto, mediante análisis fenotípico de la plaga de insectos utilizando técnicas de rutina en la técnica.
En un aspecto preferido de la divulgación, el ARN interferente regula por disminución la expresión génica por interferencia de ARN o iARN. La iARN es un proceso de regulación génica específica de secuencia típicamente mediada por moléculas de ARN bicatenarias tales como ARN interferentes pequeños (ARNip). Los ARNip comprenden una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias con una hebra de ARN no codificante. La hebra codificante o "hebra guía" de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. La hebra codificante del ARNip es capaz, por lo tanto, de hibridar con el transcrito de ARN mediante formación de pares de bases de Watson-Crick y de dirigirse al ARN para su degradación dentro de un complejo celular conocido como el complejo del silenciamiento inducido por iARN o RISC. Por tanto, en el contexto de las moléculas preferidas de ARN interferente de la presente invención, el elemento silenciador como se menciona en este documento puede ser una región bicatenaria que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales al menos una hebra comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria o al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. En una realización, la región bicatenaria tiene una longitud de al menos 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 pares de bases.
También se contemplan dentro del alcance de la presente invención moléculas de ARN bicatenarias (ARNbc) más largas que comprenden uno o más elementos silenciadores bicatenarios funcionales como se describe en otras partes en este documento y capaces de lograr el silenciamiento de genes mediado por iARN. Dichas moléculas de ARNbc más largas comprenden al menos 80, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 pares de bases. Estas moléculas de ARNbc pueden servir como precursores para las moléculas de ARNip activas que dirigen el transcrito de ARN al complejo RISC para la posterior degradación. Las moléculas de ARNbc presentes en el entorno que rodea a un organismo o las células del mismo pueden captarse por el organismo y procesarse por una enzima llamada Dicer para producir moléculas de ARNip. De forma alternativa, el ARNbc puede producirse in vivo, es decir, transcribirse de un polinucleótido o polinucleótidos que codifican el mismo, presente dentro de una célula, por ejemplo, una célula bacteriana o célula vegetal, y a continuación procesarse mediante Dicer dentro de la célula hospedadora o preferiblemente dentro de las células de la plaga de insectos tras la captación del precursor de ARNbc más largo. El ARNbc puede estar formado por dos hebras de ARN (codificante y no codificante) separadas que hibridan en virtud de la formación de pares bases complementarias. De forma alternativa, el ARNbc puede ser de una sola hebra que es capaz de plegarse sobre sí misma para formar un ARN en horquilla (ARN) o estructura de tallo-bucle. En el caso de un ARN, la región bicatenaria o "tallo" se forma a partir de dos regiones o segmentos del ARN que son esencialmente repeticiones invertidas del otro y presentan complementariedad suficiente para permitir la formación de una región bicatenaria.
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Uno o más elementos silenciadores bicatenarios funcionales pueden estar presentes en esta región de "tallo" de la molécula. Las regiones de repeticiones invertidas están típicamente separadas mediante una región o segmento del ARN conocido como la región de "bucle". Esta región puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que confiera flexibilidad suficiente para permitir que se produzca el autoemparejamiento entre las regiones complementarias flanqueadoras del ARN. En general, la región de bucle es básicamente monocatenaria y actúa como un elemento separador entre las repeticiones invertidas.
Todas las moléculas de ARN interferente de la invención producen la regulación por disminución específica de las secuencias de expresión de un gen diana mediante la unión a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La unión se produce como resultado de la formación de pares de bases complementarias entre el elemento silenciador del ARN interferente y la secuencia de nucleótidos diana. Las moléculas de ARN interferente de la invención comprenden al menos uno o al menos dos elementos silenciadores. En una realización de la presente invención, la secuencia de nucleótidos diana comprende una secuencia de nucleótidos representada por el transcrito de ARN del gen diana, o un fragmento del mismo, donde el fragmento es preferiblemente de al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos. En una realización preferida de la presente invención, la secuencia de nucleótidos diana comprende una secuencia de nucleótidos equivalente al transcrito de ARN codificado por cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en (i) un polinucleótido que comprende al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas. En una realización más preferida de lo anterior, dicho polinucleótido no es más largo de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.
Preferiblemente, las moléculas de ARN interferente de la presente invención comprenden al menos una región bicatenaria, típicamente el elemento silenciador del ARN interferente, que comprende una hebra de ADN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias con una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada dentro del transcrito de ARN del gen diana.
El elemento silenciador, o al menos una hebra del mismo donde el elemento silenciador es bicatenario, puede ser totalmente complementario o parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos diana del gen diana. Como se usa en este documento, la expresión "totalmente complementario" significa que todas las bases de la secuencia de nucleótidos del elemento silenciador son complementarias o "coinciden" con las bases de la secuencia de nucleótidos diana. La expresión "al menos parcialmente complementario" significa que hay una coincidencia menor a un 100% entre las bases del elemento silenciador y las bases de la secuencia de nucleótidos diana. El experto en la materia comprenderá que el elemento silenciador necesita ser solo al menos parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos diana para mediar la regulación por disminución de la expresión del gen diana. En la técnica existe constancia de que las secuencias de ARN con inserciones, eliminación y emparejamientos incorrectos con respecto a la secuencia diana pueden seguir siendo eficaces para la iARN. De acuerdo con la presente invención, se prefiere que el elemento silenciador y la secuencia de nucleótidos diana del gen diana compartan al menos un 85% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90% o 95% de identidad de secuencia, o más preferiblemente al menos un 97% o 98% de identidad de secuencia y aún más preferiblemente al menos un 99% de identidad de secuencia. De forma alternativa, el elemento silenciador puede comprender 1, 2 o 3 emparejamientos incorrectos en comparación con la secuencia de nucleótidos diana en cada extensión de 24 nucleótidos parcialmente complementarios.
El experto en la materia apreciará que el grado de complementariedad compartido entre el elemento silenciador y la secuencia de nucleótidos diana puede variar dependiendo del gen diana a regularse por disminución o dependiendo de la especie de plaga de insectos cuya expresión de genes se tiene que controlar.
En otra realización de la presente invención, el elemento silenciador comprende una secuencia de nucleótidos que es el ARN equivalente de cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en un polinucleótido que comprende al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, donde dicho polinucleótido no es más largo de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos. Se apreciará que en dichas realizaciones el elemento silenciador puede comprender o consistir en una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra, la hebra codificante, comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana.
La secuencia de nucleótidos diana se puede seleccionar de cualquier región o secuencia de nucleótidos adecuada del gen diana o transcrito de ARN de la misma. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos diana puede estar ubicada dentro de la 5'UTR o 3'UTR del gen diana o transcrito de ARN o dentro de regiones exónicas o intrónicas del gen.
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El experto en la materia conocerá métodos para identificar las secuencias de nucleótidos diana más adecuadas dentro del contexto del gen diana completo. Por ejemplo, pueden sintetizarse y evaluarse múltiples elementos silenciadores dirigidos a diferentes regiones del gen diana. Como alternativa, se puede utilizar la digestión del transcrito de ARN con enzimas tales como ARNasa H para determinar sitios en el ARN que se encuentran en una conformación susceptible al silenciamiento génico. Los sitios diana también pueden identificarse utilizando estrategias informáticas, por ejemplo, el uso de algoritmos informáticos diseñados para predecir la eficacia del silenciamiento génico en función del direccionamiento a diferentes sitios dentro del gen completo.
Los ARN interferentes de la presente invención pueden comprender un elemento silenciador o múltiples elementos silenciadores, donde cada elemento silenciador comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana y que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de dicho gen diana. Las construcciones concateméricas de ARN de este tipo se describen en el documento WO2006/046148. En el contexto de la presente invención, el término "múltiple" significa al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, etc. y hasta al menos 10, 15, 20 o al menos 30. En una realización, el ARN interferente comprende múltiples copias de un único elemento silenciador, es decir, repeticiones de un elemento silenciador que se une a una secuencia de nucleótidos diana particular dentro de un gen diana específico. En otra realización, los elementos silenciadores dentro del ARN interferente comprenden o consisten en diferentes secuencias de nucleótidos complementarias a diferentes secuencias de nucleótidos diana. Debe estar claro que las combinaciones de múltiples copias del mismo elemento silenciador combinadas con elementos silenciadores que se unen a secuencias de nucleótidos diana diferentes se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Las diferentes secuencias de nucleótidos diana pueden originarse a partir de un solo gen diana en una especie de plaga de insectos para alcanzar una regulación por disminución mejorada de un gen diana específico en una especie de plaga de insectos. En ese caso, los elementos silenciadores pueden combinarse en el ARN interferente en el orden original en el que las secuencias de nucleótidos diana se encuentra en el gen diana, o los elementos silenciadores pueden mezclarse y combinarse aleatoriamente en cualquier orden de importancia en el contexto del ARN interferente en comparación con el orden de las secuencias de nucleótidos diana en el gen diana.
De forma alternativa, las diferentes secuencias de nucleótidos diana representan un solo gen diana pero se originan de diferentes especies de plagas de insectos.
De forma alternativa, las diferentes secuencias de nucleótidos diana pueden originarse de diferentes genes diana. Si el ARN interferente es para utilizarse en la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas, se prefiere que los diferentes genes diana se seleccionen del grupo de genes que regulan las funciones biológicas esenciales de las especies de plagas de insectos, incluyendo, aunque sin limitación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad. Los genes diana pueden regular las mismas o diferentes rutas biológicas o procesos. En una realización, al menos uno de los elementos silenciadores comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana donde el gen diana se selecciona del grupo de genes como se describe anteriormente.
En una realización adicional de la invención, los diferentes genes diana de los diferentes elementos silenciadores se originan de la misma especie de plaga de insectos. Esta estrategia está diseñada para lograr un ataque mejorado contra una sola especie de plaga de insectos. En particular, los diferentes genes diana pueden expresarse diferencialmente en las diferentes etapas del ciclo de vida del insecto, por ejemplo, las etapas de adulto maduro, larva inmadura y huevos. El ARN interferente de la invención, por tanto, puede utilizarse para prevenir y/o controlar una infestación por parte de plagas de insectos en más de una etapa del ciclo de vida del insecto.
En una realización alternativa de la invención, los diferentes genes diana de los diferentes elementos silenciadores se originan de diferentes especies de plagas de insectos. El ARN interferente de la invención, por tanto, puede utilizarse para prevenir y/o controlar una infestación por parte de más de una especie de plaga de insectos simultáneamente.
Los elementos silenciadores pueden disponerse como una región contigua del ARN interferente o pueden separarse mediante la presencia de secuencias conectoras. La secuencia conectora puede comprender una secuencia de nucleótidos aleatoria corta que no sea complementaria a ninguna secuencia de nucleótidos diana o genes diana. En una realización, el conector es una secuencia de ARN que es autoescindible de manera condicional, preferentemente un conector sensible al pH o un conector sensible a la hidrofobicidad. En una realización, el conector comprende una secuencia de nucleótidos equivalente a una secuencia intrónica. Las secuencias conectoras de la presente invención pueden tener una longitud de aproximadamente 1 par de bases a aproximadamente 10 000 pares de bases, siempre que el conector no altere la capacidad del aRn interferente de reducir la expresión del gen o los genes diana.
Además del o los elementos silenciadores y cualquier secuencia conectora, el ARN interferente de la invención puede comprender al menos una secuencia polinucleotídica adicional. En diferentes realizaciones de la invención, la secuencia adicional se selecciona de (i) una secuencia capaz de proteger el ARN interferente del procesamiento del
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ARN, (ii) una secuencia que afecta a la estabilidad del ARN interferente, (iii) una secuencia que permite la unión a la proteína, por ejemplo, para facilitar la captación del ARN interferente por parte de las células de la especie de la plaga de insectos, (iv) una secuencia que facilita la producción a gran escala del ARN interferente, (v) una secuencia que es un aptámero que se une a un receptor o a una molécula en la superficie de las células de la plaga de insectos para facilitar la captación, o (v) una secuencia que cataliza el procesamiento del ARN interferente dentro de las células de la plaga de insectos y mejora de esta forma la eficacia del ARN interferente. Las estructuras para potenciar la estabilidad de las moléculas de ARN son bien conocidas en la técnica y se describen adicionalmente en el documento WO2006/046148.
La longitud del ARN interferente de la invención necesita ser suficiente para la captación por parte de las células de una especie de plaga de insectos y la regulación por disminución de genes diana dentro de la plaga como se describe en otras partes de este documento. Sin embargo, el límite superior de longitud puede depender de (i) la necesidad de que el ARN interferente sea captado por las células de la plaga y (ii) la necesidad de que el ARN interferente sea procesado en las células de la plaga para mediar el silenciamiento de genes mediante la ruta de iARN. La longitud también puede determinarse por el método de producción y la formulación para la liberación del ARN interferente a células. Preferiblemente, el ARN interferente de la presente divulgación será de una longitud entre 21 y 10 000 nucleótidos, preferiblemente entre 50 y 5000 nucleótidos o entre 100 y 2500 nucleótidos, más preferiblemente de una longitud entre 80 y 2000 nucleótidos.
El ARN interferente puede contener bases de ADN, bases no naturales o uniones del esqueleto o modificaciones del esqueleto de azúcar-fosfato no naturales, por ejemplo, para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento o mejorar la resistencia a la degradación por parte de las nucleasas. Además, el experto en la materia puede producir el ARN interferente química o enzimáticamente mediante reacciones manuales o automatizadas. Como alternativa, el ARN interferente se puede transcribir a partir de un polinucleótido que lo codifique. Por lo tanto, en este documento se proporciona un polinucleótido aislado que codifica cualquiera de los ARN interferentes de la presente invención.
En este documento también se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en (i) un polinucleótido que comprende al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, y donde dicho polinucleótido no es más largo de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.
En realizaciones preferidas, el polinucleótido aislado es parte de una molécula de ARN interferente, típicamente parte del elemento silenciador, que comprende al menos una región bicatenaria que comprende una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias a una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. La hebra codificante del ARNbc, por lo tanto, es capaz de hibridar con el transcrito de ARN y de dirigirse al ARN para su degradación dentro del complejo del silenciamiento inducido por iARN o RISC.
Los polinucleótidos de la invención pueden insertarse mediante técnicas de clonación molecular de rutina en vectores o construcciones de ADN conocidos en la técnica. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, se proporciona una construcción de ADN que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención. Preferiblemente, en este documento se proporciona una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que codifica al menos uno de los ARN interferentes de la presente invención. La construcción de ADN puede ser un vector de ADN recombinante, por ejemplo, un vector bacteriano, vírico o de levadura. En una realización preferida de la invención, la construcción de ADN es una construcción de expresión y el polinucleótido se encuentra unido de forma funcional a al menos una secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica. La expresión "secuencia reguladora" debe considerarse en un contexto amplio y pretende hacer referencia a cualquier secuencia de nucleótidos capaz de lograr la expresión de los polinucleótidos a los cuales está unido de forma funcional incluyendo, aunque sin limitación, promotores, potenciadores y otros elementos activadores de la transcripción sintéticos o naturales. La secuencia reguladora puede ubicarse en el extremo 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica. La expresión "unido de forma funcional" se refiere a una unión funcional entre la secuencia reguladora y la secuencia polinucleotídica de tal forma que la secuencia reguladora dirige la expresión del polinucleótido. Los elementos unidos de forma funcional pueden ser contiguos o no contiguos.
Preferiblemente, la secuencia reguladora es un promotor que se selecciona del grupo que comprende, aunque sin limitación, promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de tejido y promotores específicos de etapa de crecimiento/desarrollo. En una realización, el polinucleótido se coloca bajo el control de un promotor constitutivo fuerte tal como cualquiera seleccionado del grupo que comprende el promotor CaMV35S, promotor CaMV35S doble, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor de rubisco, promotor GOS2, promotor 34S del virus del mosaico de la escrofularia.
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Opcionalmente, una o más secuencias de terminación de transcripción pueden incorporarse en la construcción de expresión de la invención. La expresión "secuencia de terminación de la transcripción" abarca una secuencia de control al final de una unidad de transcripción, que señala la terminación de la transcripción, el procesamiento en 3' y la poliadenilación de un transcrito primario. Las secuencias reguladoras adicionales incluyendo, aunque sin limitación, potenciadores de la traducción o la transcripción, pueden incorporarse en la construcción de expresión, por ejemplo, como con el promotor CaMV35S doble potenciado.
La presente invención también abarca un método para generar cualquiera de los ARN interferentes de la invención que comprende las etapas de (i) poner en contacto un polinucleótido que codifica dicho ARN interferente o una construcción de ADN que lo comprende con componentes sin células; o (ii) introducir (por ejemplo, mediante transformación, transfección o inyección) un polinucleótido que codifica dicho ARN interferente o una construcción de ADN que lo comprende dentro de una célula.
La invención también, por tanto, se refiere a cualquier ribonucleótido bicatenario producido a partir de la expresión de un polinucleótido descrito en este documento.
Por consiguiente, en este documento también se proporciona una célula hospedadora transformada con cualquiera de los polinucleótidos descritos en este documento. La presente invención también abarca células hospedadoras que comprenden cualquiera de los ARN interferentes de la presente invención, cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención o una construcción de ADN que los comprende. La célula hospedadora puede ser una célula procariota incluyendo, aunque sin limitación, células bacterianas gram-positivas y gram-negativas, o una célula eucariota incluyendo, aunque sin limitación, células de levadura o células vegetales. Preferiblemente, dicha célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula vegetal. La célula bacteriana puede elegirse del grupo que comprende, aunque sin limitación, células Gram positivas y Gram negativas que comprenden Escherichia spp. (por ejemplo, E. coli), Bacillus spp. (por ejemplo, B. thuringiensis), Rhizobium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Pseudomonas spp. y Agrobacterium spp. El polinucleótido o construcción de ADN de la invención puede existir o mantenerse en la célula hospedadora como un elemento extracromosómico o puede incorporarse de forma estable en el genoma de la célula hospedadora. Las características de interés particular en la selección de una célula hospedadora para los propósitos de la presente invención incluyen la facilidad con la que el polinucleótido o la construcción de ADN que codifica el ARN interferente puede introducirse en el hospedador, la disponibilidad de los sistemas de expresión compatibles, la eficacia de la expresión y la estabilidad del ARN interferente en el hospedador.
Preferiblemente, los ARN interferentes de la invención se expresan en una célula hospedadora de una planta. Las plantas de interés preferidas incluyen, aunque sin limitación, algodón, patata, arroz, tomate, colza, soja, girasol, sorgo, mijo, maíz, alfalfa, fresas, berenjena, pimiento y tabaco.
En situaciones en las que el ARN interferente se expresa dentro de una célula hospedadora y/o se utiliza para prevenir y/o controlar una infestación por parte de plagas de un organismo hospedador, se prefiere que el ARN interferente no exhiba efectos inesperados significativos, es decir, el ARN interferente no afecte a la expresión de los genes dentro del hospedador. Preferiblemente, el elemento silenciador no exhibe complementariedad significativa con secuencias de nucleótidos que no sean la secuencia de nucleótidos diana pretendida del gen diana. En una realización de la invención, el elemento silenciador muestra menos de un 30%, más preferiblemente menos de un 20%, más preferiblemente menos de un 10% y aún más preferiblemente menos de un 5% de identidad de secuencia con cualquier gen de la célula u organismo hospedador. Si los datos de la secuencia genómica están disponibles para el organismo hospedador, es posible verificar de forma cruzada la identidad con el elemento silenciador utilizando herramientas bioinformáticas convencionales. En una realización, no hay identidad de secuencia entre el elemento silenciador y un gen de la célula hospedadora u organismo hospedador en una región de 17, más preferiblemente en una región de 18 o 19 y aún más preferiblemente en una región de 20 o 21 nucleótidos contiguos.
En la aplicación práctica de la invención, los ARN interferentes de la invención pueden utilizarse para prevenir y/o controlar cualquier plaga de insectos pertenecientes a los órdenes Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera y Siphonaptera.
Además, de acuerdo con otro aspecto de la invención, en este documento se proporciona una composición para prevenir y/o controlar una infestación por parte de una plaga de insectos, que comprende al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente y opcionalmente al menos un vehículo, excipiente o diluyente adecuado, donde el ARN interferente funciona, tras la captación por la plaga, regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga. El ARN interferente puede ser cualquiera de los divulgados en otra parte en este documento. Preferiblemente, el ARN interferente comprende o consiste en al menos un elemento silenciador y dicho elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales (la hebra codificante) comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. El "gen diana" puede ser cualquiera de los genes diana de plagas divulgados en otra parte en este documento incluyendo, aunque sin limitación, genes implicados en la regulación de la supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad de la plaga.
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Como alternativa, la composición comprende al menos una célula hospedadora que comprende al menos una molécula de ARN interferente o construcción de ADN que la codifica y, opcionalmente, al menos un vehículo, excipiente o diluyente adecuado, donde el ARN interferente funciona, tras la captación de la célula hospedadora por la plaga de insectos, regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga.
En la aplicación práctica de la invención, la composición puede usarse para prevenir y/o controlar cualquier plaga de insectos pertenecientes a los órdenes Coleóptera, Lepidoptera, Díptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera y Siphonaptera. La composición, por lo tanto, puede estar en cualquier forma adecuada para su aplicación a plagas de insectos o para su aplicación a sustratos y/u organismos, en particular plagas, susceptibles a infestación por dicha plaga de insectos. En una realización, la composición es para su uso en la prevención y/o control de infestación por parte de plagas de plantas o material de propagación o reproductor de plantas y, por tanto, está dirigida a especies de plagas de insectos que infestan plantas. La composición de la presente invención es particularmente eficaz cuando la plaga de insectos pertenece a la categoría de insectos "masticadores" que causan daños considerables a las plantas al comer tejidos de la planta tales como raíces, hojas, flores, yemas, vástagos y similares. Los ejemplos de esta gran categoría de insectos incluye escarabajos y sus larvas.
La composición de la invención puede usarse para controlar plagas de insectos en todas las etapas de su ciclo vital, por ejemplo, la etapa de adulto maduro, la etapa larvaria y la de huevo.
En el contexto de la composición de la invención, el ARN interferente puede producirse a partir de una construcción de ADN, en particular una construcción de expresión como se describe en otra parte en este documento, que comprende un polinucleótido que la codifica. En realizaciones preferidas, el ARN interferente puede producirse dentro de una célula hospedadora u organismo genomanipulado para que exprese dicho ARN interferente a partir de un polinucleótido que lo codifique.
Los organismos hospedadores adecuados para su uso en las composiciones de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, microorganismos que se sabe que colonizan el ambiente sobre y/o alrededor de las plantas o cultivos de interés, es decir, plantas o cultivos susceptibles a infestación por parte de especies de insectos que son plagas. Dichos microorganismos incluyen, aunque sin limitación, aquellos que ocupan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de la planta). Estos microorganismos se seleccionan para que puedan competir satisfactoriamente con cualquier organismo de tipo silvestre presente en el ambiente de la planta. Los microorganismos adecuados para su uso como hospedadores incluyen diversas especies de bacterias, algas y hongos. Queda claro que los microorganismos elegidos no deben ser tóxicos para las plantas. Dichas composiciones aplicadas a plantas susceptibles de infestación por especies de insectos que son plagas quedarán ingeridas por las plagas de insectos que se alimentan de las plantas tratadas.
Los organismos hospedadores que no colonizan de forma natural las plantas y/o su ambiente también están dentro del alcance de la presente invención. Dichos organismos pueden servir únicamente como medio para generar el ARN interferente de la composición. Por ejemplo, en una realización, el ARN interferente se fermenta/produce en un hospedador bacteriano y las bacterias posteriormente se inactivan/eliminan. Las bacterias resultantes pueden procesarse y usarse como pulverización insecticida de la misma manera que las cepas de Bacillus thuringiensis que se han usado como insecticida para una aplicación de pulverización. En ciertas realizaciones, un extracto o lisado bacteriano puede purificarse adecuadamente para dejar un extracto que contenga ARN interferente sustancialmente puro, que posteriormente se formula en una de las composiciones de la invención. Las técnicas convencionales de extracción/purificación serían conocidas para los expertos en la materia.
Las composiciones de la invención pueden estar en cualquier forma física adecuada para su aplicación a insectos. Por ejemplo, la composición puede estar en forma sólida (polvo, gránulo o cebo), forma líquida (incluyendo una forma administrada como insecticida pulverizado) o forma de gel. En una realización específica, la composición puede ser un recubrimiento, pasta o polvo que puede aplicarse a un sustrato para proteger a dicho sustrato de la infestación por parte de insectos. En esta realización, la composición puede usarse para proteger a cualquier sustrato o material que sea susceptible a la infestación o los daños causados por un insecto.
La naturaleza de los excipientes y la forma física de la composición pueden variar dependiendo de la naturaleza del sustrato que se desea tratar. Por ejemplo, la composición puede ser un líquido que se aplica con brocha o se pulveriza o deposita en el material o sustrato a tratar, o un recubrimiento o polvo que se aplica al material o sustrato a tratar.
En una realización, la composición está en forma de un cebo. El cebo está diseñado para atraer al insecto para que entre en contacto con la composición. Tras entrar en contacto con la misma, la composición entonces se internaliza en el insecto, por ingesta, por ejemplo, y media la iARN para eliminar de ese manera al insecto. Dicho cebo puede comprender un sustancia alimenticia, tal como un alimento de base proteínica, por ejemplo, harina de pescado. También puede usarse ácido bórico como cebo. El cebo puede depender de la especie que será la diana. También puede usarse un atrayente. El atrayente puede ser una feromona, tal como una feromona masculina o femenina, por ejemplo. Como ejemplo, en la invención pueden usarse las feromonas mencionadas en el libro "Insect Pheremones and their use in Pest Management" (Howse et al., Chapman y Hall, 1998). El atrayente actúa atrayendo al insecto
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hasta el cebo, y puede estar dirigido a un insecto particular o puede atraer a una gama completa de insectos. El cebo puede estar en cualquier forma adecuada, tal como una forma sólida, de pasta, de gránulo o en polvo.
El cebo también puede ser transportado por el insecto de vuelta a la colonia. El cebo entonces puede actuar como fuente de alimento para otros miembros de la colonia, proporcionando de esta manera un control eficaz de una gran cantidad de insectos y potencialmente una colonia completa de plaga de insectos. Esto es una ventaja asociada con el uso del ARN bicatenario de la invención, porque la acción retardada de los efectos mediados por iARN sobre la plaga permite que el cebo sea transportado de vuelta a la colonia, proporcionando de este modo el máximo impacto en términos de exposición a los insectos.
Además, las composiciones que entran en contacto con los insectos permanecen en la cutícula del insecto. Cuando se limpian, ya sea un insecto individual limpiándose a sí mismo o insectos que se limpian entre sí, las composiciones pueden ingerirse y, por tanto, pueden mediar sus efectos en el insecto. Esto requiere que la composición sea suficientemente estable, de manera que el ARN interferente permanezca intacto y con la capacidad de mediar la iARN incluso cuando se expone a las condiciones ambientales externas durante un espacio de tiempo, que puede ser un periodo de días, por ejemplo.
Los cebos pueden proporcionarse en un "alojamiento" adecuado o "trampa". Dichos alojamientos o trampas están disponibles en el mercado y las trampas existentes pueden adaptarse para que incluyan las composiciones de la invención. Cualquier alojamiento o trampa que pueda atraer a un insecto para que entre se incluye dentro del alcance de la invención. El alojamiento o trampa puede ser con forma de caja, por ejemplo, y puede proporcionarse en estado preformado o puede formarse de cartón plegable, por ejemplo. Los materiales adecuados para un alojamiento o trampa incluyen plástico y cartón, particularmente cartón corrugado. Las dimensiones adecuadas para dicho alojamiento o trampa son, por ejemplo, 7-15 cm de anchura, 15-20 cm de longitud y 1-5 cm de altura. Las superficies interiores de las trampas pueden estar revestidas de una sustancia pegajosa para restringir el movimiento del insecto una vez dentro de la trampa. El alojamiento o trampa puede contener un bebedero adecuado dentro del cual se puede alojar el cebo en su sitio. Una trampa se distingue de un alojamiento porque el insecto no puede abandonar fácilmente una trampa después de entrar, mientras que un alojamiento actúa como "estación de alimentación" que proporciona al insecto un ambiente preferido en que puede alimentarse y sentirse seguro de los depredadores.
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención proporciona un alojamiento o trampa para insectos, que contiene una composición de la invención, que puede incorporar cualquiera de las características de la composición descrita en este documento.
En una realización alternativa adicional, la composición puede proporcionarse en forma de pulverización. Por tanto, un usuario humano puede pulverizar la plaga directamente con la composición. La composición entonces se internaliza por el insecto, desde donde puede mediar la interferencia de ARN, controlando de esta manera el insecto. La pulverización es preferiblemente una pulverización presurizada/atomizada o una pulverización de bomba. Las partículas pueden ser de tamaño adecuado, de manera que se adhieran al insecto, por ejemplo, al exoesqueleto, y pueden absorberse desde el mismo. El tamaño de partícula puede medirse por medios conocidos, tales como por el uso de un Mastersizer, que es un dispositivo disponible en el mercado.
En una realización adicional más, el vehículo es una partícula o polvo cargado electrostáticamente que se adhiere al insecto. Las partículas y polvos adecuados que pueden adherirse a un insecto y proporcionar de este modo las construcciones de ARN de la invención se describen en detalle en los documentos WO 94/00980 y WO 97/33472.
Como alternativa, el vehículo puede comprender partículas magnéticas que se adhieren a la cutícula del insecto. Las partículas magnéticas que pueden adherirse a un insecto y proporcionar de este modo las construcciones de ARN de la invención se describen en detalle en el documento WO 00/01236.
En una realización adicional más, el vehículo de la composición comprende partículas metálicas que inicialmente están sin magnetizar, pero que pueden quedar polarizadas magnéticamente cuando se someten al campo eléctrico proporcionado por el cuerpo del insecto. Este modo de acción se describe en detalle en el documento WO 2004/049807.
Preferiblemente, la composición incorpora un vehículo que aumenta la captación del ARN interferente en la plaga de insectos. Dicho vehículo puede ser un vehículo de base lipídica, que comprende preferiblemente uno o más de, emulsiones de aceite en agua, micelas, colesterol, lipopoliaminas y liposomas. Otros agentes que promueven la captación de las construcciones de la invención son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen policationes, dextranos y lípidos (tris) catiónicos, tales como CS096, CS102 etc. Los liposomas disponibles en el mercado incluyen LIPOFECTIN® y CELLFECTIN® etc. Se enumeran varios vehículos adecuados en el encabezado "Transfection promoting agent" del documento WO 03/004644 y cada uno de los ejemplos proporcionados.
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En una realización preferida adicional, el vehículo es un agente condensador de ácido nucleico. Preferiblemente, el agente condensador de ácido nucleico comprende espermidina o sulfato de protamina o un derivado del mismo.
Cuando la composición de la invención es para su uso en la prevención y/o control de la infestación por parte de plagas de una planta, la composición puede contener un vehículo agronómicamente adecuado. Dicho vehículo puede ser cualquier material que la planta a tratar pueda tolerar, que no cause daños excesivos al ambiente u otros organismos del mismo y que permita que el ARN interferente permanezca eficaz contra la especie de insecto que es plaga. En particular, las composiciones de la invención pueden formularse para su suministro a plantas de acuerdo con prácticas agrícolas rutinarias usadas en la industria de bioinsecticidas. La composición puede contener además componentes que pueden realizar otras funciones incluyendo, aunque sin limitación, (i) potenciar o promover la captación del ARN interferente por las células de la plaga y (ii) estabilizar los componentes activos de la composición. Los ejemplos específicos de dichos componentes adicionales contenidos en la composición que comprende el ARN interferente, son ARNt de levadura o ARN total de levadura.
Las composiciones pueden formularse para aplicación directa o como una concentración de una composición principal que requiere dilución antes de su uso. Como alternativa, la composición puede suministrarse como un kit que comprende el ARN interferente o la célula hospedadora que comprende o expresa el mismo en un recipiente y el diluyente o vehículo adecuado para el ARN o la célula hospedadora en un recipiente diferente. En la aplicación práctica de la invención, la composición puede aplicarse a una planta o cualquier parte de una planta en cualquier etapa del desarrollo de la planta. En una realización, la composición se aplica a las partes aéreas de una planta, por ejemplo, durante el cultivo de cultivos de plantas en un campo. En una realización adicional, la composición se aplica a las semillas de una planta mientras están en almacenamiento o una vez se han sembrado en el suelo. Generalmente es importante obtener un buen control de las plagas en las primeras etapas de crecimiento de la planta, ya que ese es el momento en que la planta puede verse más gravemente dañada por las especies que son plagas.
La composición puede aplicarse al ambiente de una plaga de insectos por diversas técnicas incluyendo, aunque sin limitación, pulverización, atomizado, espolvoreo, dispersión, inundación, recubrimiento de semillas, tratamiento de semillas, introducción en el suelo e introducción en el agua de riego. En el tratamiento de plantas susceptibles a infestación por parte de plagas, la composición puede suministrarse a la planta o parte de una planta antes de que aparezca la plaga (con fines de prevención), o una vez han empezado a aparecer signos de infestación por parte de la plaga (con fines de control de plagas).
En una realización adicional de la invención, las composiciones de la invención pueden formularse para que contengan al menos un agente activo adicional. Por tanto, la composición puede proporcionarse como un "kit de partes" que comprende la composición que contiene el ARN interferente en un recipiente y uno o más principios activos adecuados, por ejemplo, un plaguicida químico o biológico, en un recipiente diferente. Como alternativa, las composiciones pueden proporcionarse como una mezcla que es estable y a usarse junto con otra.
Los principios activos adecuados que pueden actuar de una manera complementaria a las moléculas de ARN interferente de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, los siguientes: Clorpirifós, Aletrina, Resmetrina, Tetrabromoetilo, ácido dimetil-ciclopropano carboxílico (que se incluyen generalmente en composiciones líquidas); e Hidrametilnona, Avermectina, Clorpirifós, Sulfuramid, Hidropreno, Fipronil (receptor de GABA), carbamato de isopropilfenil metilo, Indoxacarb (PARA), Noviflumuron (inhibidor de la síntesis de quitina), Imiprotrina (PARA), Abamectina (canal de cloruro abierto por glutamato), Imidacloprid (receptor de acetilcolina) (que se incluyen generalmente en composiciones de cebo).
En una realización preferida, se sabe que el principio activo es un insecticida preferido en términos de consideraciones de salud y ambientales, tales como, por ejemplo, Hidrametilnona y Avermectina.
En una realización adicional de la invención, la composición se formula para que contenga al menos un agente agronómico adicional, por ejemplo, un herbicida o un plaguicida adicional. Como se usa en este documento, un "segundo plaguicida" o "plaguicida adicional" se refiere a un plaguicida diferente de la primera molécula de ARN interferente u original de la composición. Como alternativa, la composición de la invención puede suministrarse en combinación con al menos otro agente agronómico, por ejemplo, un herbicida o un segundo plaguicida. En una realización, la composición se proporciona en combinación con un herbicida seleccionado de cualquiera conocido en la técnica, por ejemplo, glifosato, imidazolinona, sulfonilurea y bromoxinil. En una realización adicional, la composición se proporciona en combinación con al menos un plaguicida adicional. El plaguicida adicional puede seleccionarse de cualquier plaguicida conocido en la técnica y/o puede comprender un ácido ribonucleico interferente que funcione, tras la captación por una plaga, regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie que es plaga. En una realización, la plaga diana es una especie de insecto que es plaga y el ARN interferente se selecciona de cualquiera de los ARN interferentes como se describe en este documento. En una realización adicional, el plaguicida adicional comprende un ARN interferente que funciona regulando por disminución la expresión de un gen conocido en cualquier especie diana que sea plaga, sin limitarse a plagas de insectos. La molécula de ARN interferente original de la composición y el segundo plaguicida o plaguicidas o adicionales puede tener como diana la misma especie de insecto que es plaga o pueden estar destinados a tener como diana
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diferentes especies de insectos que son plaga. Por ejemplo, el ARN interferente original y el segundo plaguicida puede tener como diana diferentes especies de plagas de insectos o puede tener como diana diferentes familias o clases de organismos que son plaga, por ejemplo, hongos o nematodos o insectos. Será evidente para los expertos en la materia la manera en que ensayar combinaciones de moléculas de ARN interferente y otros agentes agronómicos para obtener efectos sinérgicos. En una realización preferida, la composición contiene una primera molécula de ARN interferente descrita en otra parte en este documento y uno o más plaguicidas adicionales, cada uno tóxico para la misma plaga de insectos, donde el uno o más plaguicidas adicionales se seleccionan de una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporous, una proteína insecticida de Bacillus spaericus y una lignina, y donde la proteína insecticida de Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que consiste en una Cry1Ab, una Cry1C, una Cry2Aa, una Cry3, una TIC851, una CryET70, una Cry22, una VIP, una TIC901, una TIC1201, una TIC407, una TIC417, una proteína insecticida binaria seleccionada de CryET33 y CryET34, CryET80 y CryET76, TIC100 y TIC101, y PS149B1, y quimeras insecticidas de cualquiera de las proteínas insecticidas precedentes.
Los diferentes componentes de las combinaciones descritas en este documento pueden administrarse, por ejemplo, a un organismo hospedador susceptible a infestación por plagas, en cualquier orden. Los componentes pueden suministrarse simultánea o secuencialmente al área u organismo a tratar.
En este documento también se proporciona un método para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas, que comprende poner en contacto una especie de plaga de insectos con una cantidad eficaz de al menos un ARN en donde el ARN funciona tras captarse por dicha plaga regulando por disminución la expresión de un gen diana esencial de la plaga. El gen diana esencial puede ser cualquier gen de la plaga implicado en la regulación de un proceso biológico esencial necesario para que la plaga inicie o mantenga la infestación incluyendo, aunque sin limitación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad. En particular, el gen diana puede ser cualquier gen de la plaga como se describe en otras partes de este documento.
En los métodos descritos en este documento para regular por disminución la expresión de un gen diana en una especie de plaga de insectos, las moléculas de ARN bicatenarias que comprenden al menos 35 pb, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos 35 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas, pueden usarse para regular por disminución la expresión del gen diana ortólogo en un insecto coleóptero, hemíptero, lepidóptero o díptero elegido del grupo que comprende, aunque sin limitación, Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (falso escarabajo de la patata) o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes pardo del arroz)); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchada) o L. hesperus (chinche manchada del oeste)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgón verde del melocotonero)); Diabrotica spp. (por ejemplo, D. virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental), D. barberi (gusano de la raíz del maíz norteño), D. undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz sureño) o D. virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano).
Además, en este documento se proporciona un método para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos en un campo de plantas de cultivo, comprendiendo dicho método expresar en dichas plantas una cantidad eficaz de un ARN interferente como se describe en este documento.
Cuando el método es para el control de infestación por parte de plagas, la expresión "cantidad eficaz" abarca la cantidad o concentración de ARN interferente que se necesita para producir un efecto fenotípico en la plaga de tal forma que se reduzcan las cantidades de organismos de la plaga que infestan un organismo hospedador y/o se reduzca el daño causado por la plaga. En una realización, el efecto fenotípico es la muerte de la plaga y el ARN interferente se utiliza para alcanzar al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% de mortalidad de la plaga en comparación con plagas de insectos de control. En una realización adicional, los efectos fenotípicos incluyen, aunque sin limitación, atrofia en el crecimiento de la plaga, cese de la alimentación y puesta de huevos reducida. Las cantidades totales de organismos de la plaga que infestan un organismo hospedador pueden reducirse, por tanto, al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% en comparación con plagas de control. De forma alternativa, el daño causado por la plaga de insectos pude reducirse al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% en comparación con plagas de insectos de control. Por lo tanto, el método de la invención puede utilizarse para alcanzar al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% de control de la plaga.
Como se usa en este documento, el término "planta" puede incluir cualquier material reproductor o de propagación para una planta. Las referencias a una planta también pueden incluir células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos vegetales, callos vegetales, acúmulos vegetales y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces y similares.
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En este documento también se proporciona el uso del ácido ribonucleico (ARN) interferente como se describe en este documento o la construcción de ADN como se describe en este documento para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos, preferiblemente infestación por parte de plagas de insectos de plantas.
La invención se comprenderá además con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1 Identificación de genes diana en especies de plagas de insectos
1.1. Biblioteca de ADNc normalizado de Lygus hesperus y preparación de ARNbc en placas de múltiples pocilios para ensayos de detección
Se aislaron ácidos nucleicos de ninfas de Lygus hesperus de diferentes etapas de vida, incluidas ninfas recién eclosionadas de 2, 4, 6 y 9 días de edad y adultas. Se preparó una biblioteca de ADNc usando el kit de síntesis de ADNc por PCR SMARTer™, siguiendo las instrucciones del fabricante (Clontech Cat. n.° 634925). La biblioteca de ADNc se normalizó usando el kit Trimmer (Evrogen Cat. n.° NK001) y se clonó en el vector PCR4-TOPO (Invitrogen). La normalización de los clones introdujo adaptadores M2 (Trimmer Kit, Evrogen, SEQ ID NO 92: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) orientados en dirección opuesta en cada extremo de los clones. Las construcciones del vector recombinante se transformaron en células de la cepa TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen). Posteriormente se diluyeron las células transformadas y se sembraron en placa para obtener colonias individuales o clones. Los clones se revisaron para asegurarse de que la redundancia de clones para la biblioteca no excediera un 5%. Se recogieron clones únicos en medios de LB (caldo Luria) líquido, en placas de 96 pocillos profundos y se cultivaron durante una noche a 37°C. Las placas también incluyeron clones de control positivo (Lh423) y negativo (FP).
Para generar el ARNbc, se generaron mediante PCR fragmentos de ADN codificantes y no codificantes que contenían la secuencia promotora T7. En resumen, por clon, se distribuyó 1 pl de suspensión bacteriana en placas de PCR de múltiples pocillos que contienen REDTaq® (Sigma Cat. n.° D4309) y los cebadores oGCC2738 (SEQ ID NO 93: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) y oGCC2739 (SEQ ID NO 94:
GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGTATCAACGCAG) basados en las secuencias M2 y T7-M2, respectivamente. La reacción de PCR estuvo seguida por transcripción in vitro, donde por clon, se añadieron 6 pl de producto de PCR a 9 pl del sistema de producción de ArN a gran escala-T7 RiboMAX™(Promega Cat. n.° P1300) y se incubaron durante una noche a 37°C. La solución final de ARNbc se diluyó 2 veces en dieta de sacarosa de L. hesperus, que contenía sacarosa a un 15% y 5 pg/pl de ARNt de levadura (Invitrogen Cat. n.° 15401-029) y se usó para la detección. El ARNbc correspondiente al clon de control positivo Lh423 es la SEQ ID NO 101 y al clon de control negativo FP es la SEQ ID nO 104 (véase la Tabla 4).
1.2. Detección de genes diana de Lygus hesperus novedosos y potentes usando una biblioteca de ADNc de expresión de ARNbc
Se ha desarrollado un nuevo ensayo de detección de dianas de Lygus hesperus. La configuración del ensayo fue la siguiente: cada pocillo de una placa de 96 pocillos aloja una ninfa de L. hesperus de un día de vida expuesta a un bolsita de parafilm que contiene dieta de sacarosa que incluye el ARNbc de ensayo o el ARNbc de control en presencia de ARNt. Cada placa contenía ARNbc de 90 clones diferentes, 3 x Lh423 (control positivo) y 3 x FP (proteína fluorescente; control negativo). Cada clon (ARNbc de prueba) se replicó en tres placas. Después de tres días de exposición, se registró el número de supervivencia de las ninfas y la dieta se remplazó con una dieta (compleja) de cultivos frescos en ausencia de ARNbc. La mortalidad se evaluó en los días 4, 6 y 8. Se usó una configuración idéntica para los ensayos de confirmación de primera y segunda ronda, con 8 y 20 insectos respectivamente, con una ninfa por pocillo.
El sistema de ensayo se validó usando ARNbc correspondiente a la diana Lh423 como control positivo y un ARNbc de proteína fluorescente como control negativo: más de un 90% fueron verdaderos positivos y menos de un 5% fueron falsos positivos, respectivamente.
Se evaluaron veinte placas de 96 pocillos, denominadas Lh001 a Lh020 (véase la línea inferior en las Figuras 1 y 2), que contenían 1800 clones individuales. Se identificaron 205 candidatos y se evaluaron en un primer ensayo de confirmación. Al fijar el umbral para que muestre > 50% de mortalidad, se identificaron 41 clones independientes y evolucionaron hasta una segunda ronda de confirmación. En el ensayo, los clones se compararon con los controles positivos Lh423 (RpL19) y Lh105.2 (Sec23) y el control negativo Pt (que codifica una proteína fluorescente de coral). El ARNbc correspondiente al clon de control positivo (Lh423) es la SEQ ID NO 101, al clon de control positivo Lh105.2 es la SeQ ID NO 102 y al clon de control negativo (Pt) es la SEQ ID NO 104 (véase la Tabla 4).
La segunda ronda de ensayos de confirmación, que evaluó 20 insectos / ARNbc de prueba, se inició para todos los ARNbc de prueba que exhibieron > 50% de mortalidad en la primera confirmación (Figuras 1 y 2). Las dianas
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candidatas correspondientes a los ARNbc de ensayo confirmados se nombraron con un "número Lhxxx" (véase la Tabla 1). Usando el mismo corte a > 50% de mortalidad, se confirmaron 15 dianas en la primera detección.
Se realizó una segunda detección para identificar más dianas de Lygus hesperus. Los resultados de los ensayos de confirmación de segunda ronda se representan en la Figura 12. Usando el mismo corte a > 50% de mortalidad, se confirmaron varias dianas en la segunda detección (véase la Tabla 1C).
1.3. Identificación de dianas de Lygus
En paralelo a los ensayos de confirmación de insectos, se secuenciaron los insertos que correspondían a los clones positivos y se utilizaron búsquedas de BlastX en bases de datos de proteínas de Drosophila y Tribolium para confirmar la identidad de las dianas. La Tabla 1 proporciona un resumen del análisis bioinformático y la anotación actual de las novedosas secuencias diana de L. hesperus identificadas.
Se identificaron quince novedosas dianas de L. hesperus en la primera detección y se identificaron 11 novedosas dianas de L. hesperus en la segunda detección. Todas las dianas muestran alta potencia contra ninfas de L. hesperus, lo que indica que los ADNc que codifican los ARN bicatenarios contenidos en los mismos son esenciales para la supervivencia de la plaga y, por tanto, representan genes diana de interés con fines de control de plagas. Las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron, por lo tanto, y se proporcionan en las Tablas 2 y 3 respectivamente.
Lh594, el ortólogo de Lygus hesperus de troponina I de Drosophila, que participa en la contracción muscular y, por lo tanto, está ausente en las plantas, representa una novedosa clase de diana que pertenece a una ruta fisiológica específica de animales en la que aún no se ha explorado el GM-iARN. En la mosca de la fruta, la troponina I se describe como un gen haploinsuficiente que exhibe un fenotipo mutante en estado heterocigoto. Dichos genes pueden ser particularmente susceptibles a niveles de expresión de ARNm reducidos y de esa forma pueden considerarse dianas de iARN ideales.
En esta ruta de Lh594, se seleccionaron ocho dianas (véase la Tabla 1B). Para cada diana, se diseñaron hasta 4 pares de cebadores de PCR degenerados basados en las alineaciones de las secuencias de varios insectos, incluidos abeja, Tribolium y áfido. Los cebadores se utilizan para amplificar los segmentos de dianas de Lygus hesperus. Las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron y se proporcionan en las Tablas 2 y 3 respectivamente.
Tabla 1: Las novedosas dianas de Lygus hesperus se clasificaron en % de mortalidad de acuerdo con los resultados del segundo ensayo de confirmación (primera detección).___________________________________________
ID de la diana
confirmad ón de 2.° categoría Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Lh594
1 CG7178 wings up A (troponina I) wupA
Lh618
2 CG2168 proteína ribosómica S3A RpS3A
Lh609
3 CG4087 proteína ribosómica LP1 RpLP1
Lh595
4 - no se encontró coincidencia con Drosophila, diana/secuencia específica de Lygus
Lh611
5 CG6779 proteína ribosómica S3 RpS3
Lh560
6 CG10423 proteína ribosómica S27 RpS27
Lh596
7 - no se encontró coincidencia con Drosophila, diana/secuencia específica de Lygus RpL34b
Lh615
8 CG11522 proteína ribosómica L6 RpL6
Lh617
9 CG7283 proteína ribosómica L10Ab RpL10Ab
Lh612
10 CG13389 proteína ribosómica S13 RpS13
Lh246
11 CG3195 proteína ribosómica L12 RpL12
Lh429
12 CG8900 proteína ribosómica S18 RpS18
Lh610
13 CG5502 proteína ribosómica L4 RpL4
Lh597
14 no hit found
5
10
15
20
25
Lh598
15 CG34069 subunidad II de citocromo c oxidasa mitocondrial mt:CoII
Lh614
- CG7610 cadena de ATP sintasa-Y ATPsyn-Y
Tabla 1B: Dianas novedosas de Lygus hesperus en la ruta de Lh594
ID de la diana
Mejor(es) coincidencia(s) con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Lh619
CG7107 troponina T (sostenida) up
Lh620
CG17927 cadena pesada de miosina Mhc
Lh621
CG4843 tropomiosina 2 (Tm2) Tm2
Lh622
CG3201 cadena citoplásmica ligera de miosina Mlc-c
Lh623
CG3595 calabacín sqh
Lh624
CG15792 cremallera zip
Lh625
*CG2981,CG7930,CG907 3,CG6514,CG12408 troponina C
Lh626
*CG9073,CG7930,CG298 1,CG12408,CG6514 troponina C
*incierto: múltiples coincidencias en la familia - clasificadas de acuerdo con el valor e
Tabla 1C: Las novedosas dianas de Lygus hesperus se clasificaron en % de mortalidad de acuerdo con los resultados del segundo ensayo de confirmación (segunda detección).__________________________
ID de la diana
confirmación de 2.° clasificación Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Lh631
1 CG6846 Proteína ribosómica L26 RpL26
Lh634,2
2 CG12775 Proteína ribosómica L21 RpL21
Lh634,1
3 CG12775 Proteína ribosómica L21 RpL21
Lh630
4 CG11271 Proteína ribosómica S12 RpS12
Lh632
5 CG2998 Proteína ribosómica S28b RpS28b
Lh618,2
6 CG2168 Proteína ribosómica S3A RpS3A
Lh629
7 CG4651 Proteína ribosómica L13 RpL13
Lh633,2
8 CG17521 Proteína ribosómica L10 RpL10
Lh628
9 CG17489 Proteína ribosómica L5 RpL5
Lh633
10 CG17521 Proteína ribosómica L10 RpL10
Lh627
11 CG2033 Proteína ribosómica S15Aa RpS15A
1.4. Clonación de ADNc de longitud completa por RACE (amplificación rápida de los extremos de ADNc)
Para clonar el ADNc de longitud completa, empezando desde un clon conocido del fragmento interno de las dianas más potentes, se usó el kit de RACE de 5'/3' (Roche, Cat. n.° 1 734 792; basado en Sambrook, J. y Russell, D.M). Se siguió el protocolo convencional, descrito en el Manual de Instrucciones. En resumen, para una RACE de 5', se diseñó un cebador no codificante específico de la secuencia diana en la secuencia conocida y se utilizó para una primera síntesis de ADNc de primera hebra, usando ARN de Lygus como molde. Se agregó una cola al ADNc de primera hebra y se utilizó como ancla para la síntesis de la segunda hebra y amplificación de una porción del extremo desconocida del transcrito. Para una RACE de 3', se utilizó un cebador de ancla oligo dT para la síntesis de ADNc de primera hebra. Para las RACE de 5' y 3', se utilizaron cebadores anidados, específicos para la secuencia diana en una segunda reacción de PCR. Los fragmentos de PCR se analizaron sobre gel de agarosa, se purificaron, se clonaron y se secuenciaron para confirmación.
Las secuencias de ADNc de longitud completa que corresponden a las dianas se ensamblaron en VectorNTi, un paquete de software de análisis de secuencias completamente integrado para análisis de secuencia de ADN (Invitrogen).
Ejemplo 2 producción in vitro de ARN bicatenario para el silenciamiento de genes
2.2. Producción de ARNbc que corresponde a las secuencias parciales de los genes diana de Lygus hesperus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se sintetizó ARN bicatenario en cantidades de miligramos. Primero se generaron mediante PCR dos moldes separados de promotor de polimerasa de ARN 5' T7 (un molde codificante y un molde no codificante). Se diseñaron y se llevaron a cabo PCR para producir polinucleótidos de molde codificante y no codificante, que tenía cada uno el promotor T7 en una orientación diferente con respecto a la secuencia diana a transcribir.
Para cada uno de los genes diana, el molde codificante se generó usando un cebador directo T7 específico de diana y un cebador inverso específico de diana. Los moldes no codificantes se generaron usando los cebadores directos específicos de diana y los cebadores inversos T7 específicos de diana. Las secuencias de los cebadores respectivos para amplificar los moldes codificante y no codificante mediante PCR para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 4. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron. Los moldes T7 codificante y no codificante resultantes se mezclaron y se transcribieron mediante la adición de la ARN polimerasa T7. Los ARN monocatenarios producidos mediante transcripción a partir de los moldes se dejaron hibridar, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron mediante precipitación. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 4.
2.2. Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de Lygus hesperus
Para posibilitar la clasificación de acuerdo con la potencia, los ARNbc in vitro correspondientes a las novedosas dianas se sintetizaron y aplicaron a L. hesperus en bioensayos de análisis de supervivencia de 10 días. En resumen, se colocaron ninfas de L. hesperus de un día de vida en placas de 96 pocillos con sellos de sacarosa que contenían 0,5 |jg/|jl del ARNbc diana, enriquecido con 5 jg/jl de ARNt de levadura. Las placas se incubaron durante 3 días en condiciones de cultivo de Lygus convencionales. El día 3, 6 y 8, los sellos de dieta se renovaron con sellos que contenían dieta de Lygus únicamente. Se utilizó Lh423 (RpLl9) como control positivo y se utilizó ARNbc de GFP y dieta de sacarosa como controles negativos.
Los resultados de los análisis de supervivencia confirmaron los datos del primer y el segundo ensayo de confirmación. Se estableció Lh594 como una diana muy potente, con actividad y velocidad hasta destrucción más fuerte que el control fuerte Lh423.
Hasta ahora, la detección de Lygus en busca de novedosas dianas identificó nuevas dianas con actividades mayores o en el intervalo del control positivo Lh423; estos incluyen Lh429, Lh594, Lh609, Lh610, Lh611, Lh617 y Lh618. La mortalidad inducida por estas dianas se muestra en las Figuras 3 y 4.
Para obtener una clasificación más precisa de las dianas de acuerdo con su actividad, se realizaron análisis de concentración de respuesta a la dosis. Las novedosas dianas se ensayaron en ensayos in vitro, con concentraciones que varían de 0,4 a 0,025 jg/jl. Por condición, se evaluaron ninfas de 24 horas de vida en la configuración de placas de 96 pocillos, en dieta de sacarosa enriquecida con vehículo de ARNbc y ARNt. Los resultados se presentan como % de supervivencia en un experimento de 10 días (Figuras 5 a 9) y se resumen en la Tabla 5.
Basándose en los análisis de la curva de concentración, las dianas se clasificaron por comparación con los controles de referencia Lh423 y Lh105 (Tabla 5).
Tabla 5: Clasificación de novedosas dianas de Lygus de acuerdo con DRC y comparadas con las dianas de referencia Lh423 y Lh105. __________________________________________
ID de la diana
Potencia expresada como jg/jl de ARNbc necesaria para alcanzar un 90% de destrucción en el día 7
Lh594
0,025 (en el día 6)
Lh618
0,05-0,1
Lh612
0,05
Lh615
0,05
Lh423
0,1
Lh595
0,1
Lh560
0,1
Lh610
0,1
Lh617
0,1
Lh105
0,2
Lh614
0,2 (en el día 6)
5
10
15
20
25
30
35
Lh611
0,2
Lh596
0,3
Lh609
ND
Lh429
ND
La potencia de Lh594 se confirmó adicionalmente. El efecto de esta diana se observa claramente al menos un día antes que las otras dianas y el control positivo de referencia Lh105 y Lh423. Dado que Lh594 era muy potente, la LD50 no se alcanzó en el experimento de DRC convencional, con una concentración en el intervalo de 0,4 a 0,025 |jg/|jl de ARNbc (Figura 6), el experimento de Lh594 por lo tanto se repitió, incluidas concentraciones más bajas en el intervalo de 0,05 a 0,001 jg/jl de ARNbc (Figura 10). En conclusión, la actividad de Lh594 se observó a una concentración de 0,0025 jg/jl y aproximadamente un 90% de destrucción (correspondiente a aproximadamente un 10% de supervivencia) se obtuvo en el día 6 con 0,025 jg de ARNbc.
Para explorar más la potencia de Lh594 y la función del vehículo de ARNt en la respuesta de la iARN en Lygus hesperus, se configuraron ensayos de alimentación in vitro adicionales en ausencia del ARNt portador. Se produjeron ARNbc de Lh594, Lh423 (control de referencia) y GFP (control negativo) in vitro, usando el método convencional. Los ARNbc se purificaron y se evaluaron a 5 jg/jl en ausencia de ARNt (Figura 11 A).
En ausencia de ARNt, las dianas Lh594 y Lh423 indujeron una letalidad alta en ninfas de Lygus. Los resultados de este experimento se han reproducido desde entonces. El ARNbc diana fue capaz de inducir efectos de iARN por alimentación en ninfas de Lygus en ausencia de ARNt.
Para investigar la actividad de ARNbc a concentraciones más bajas en ausencia del ARNt portador, se configuraron experimentos adicionales, usando cantidades decrecientes de ARNbc (Figura 11 B).
Se siguió una estrategia similar para las dianas de Lygus que se identificaron en la segunda detección. Para obtener una clasificación de las dianas de acuerdo con su actividad, se realizaron análisis de concentración de respuesta a la dosis. Las novedosas dianas se ensayaron en ensayos in vitro, con concentraciones que varían de 0,5 a 0,05 jg/jl. Por condición, se evaluaron ninfas de 24 horas de vida en la configuración de placas de 96 pocillos, en dieta de sacarosa enriquecida con vehículo de ARNbc y ARNt. Los resultados se presentan como % de supervivencia en un experimento de 9 días (Figuras 15 A-D). Lh594 y Lh423 se han incluido en el ensayo como dianas de referencia. Los resultados se resumen en la Tabla 6. Basándose en los análisis de curvas de concentración, las dianas se clasificaron por comparación con el control de referencia Lh423.
Tabla 6: Dianas novedosas de Lygus de la clasificación de la segunda detección de acuerdo con DRC y comparados con las dianas de referencia Lh423 y Lh594._______________________
ID de la diana
Potencia expresada como jg/jl de ARNbc necesaria para alcanzar un 90% de destrucción en el día 7
Lh594
0,025 (en el día 6)
Lh634
0,1
Lh423
0,1
Lh631
0,4
Lh633
0,4
Lh627
0,5
Lh628
0,5
Lh630
0,5
Lh632
0,5
Lh629
ND
Ejemplo 3 Detección de la ruta de troponina
Para posibilitar el ensayo de las dianas de la ruta de Troponina, los ARNbc producidos in vitro correspondientes a Lh6l9, Lh620, Lh621, Lh622, Lh622, Lh623, Lh624, Lh625 y Lh626 se sintetizaron y aplicaron a L. hesperus en bioensayos de análisis de supervivencia de 10 días. En resumen, se colocaron ninfas de L. hesperus de un día de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
vida en placas de 96 pocilios con sellos de sacarosa que contenían 0,5 pg/pl del ARNbc diana, enriquecido con 5 |jg/|j| de ARNt de levadura. Las placas se incubaron durante 3 días en condiciones de cultivo de Lygus convencionales. El día 3, 6 y 8, los sellos de dieta se renovaron con sellos que contenían dieta de Lygus únicamente. Se utilizó Lh594 (Troponina I) como control positivo y se utilizó ARNbc de GFP y dieta de sacarosa como controles negativos (Figura 13). Luego se incluyeron cuatro dianas en análisis de curvas de respuesta a la dosis en un ensayo in vitro, con concentraciones en el intervalo de 0,4 a 0,025 pg/pl. Por condición, se evaluaron ninfas de 24 horas de vida en la configuración de placas de 96 pocillos, en dieta de sacarosa enriquecida con vehículo de ARNbc y ARNt. Los resultados se presentan como % de supervivencia en un experimento de 10 días (Figuras 14 A-B).
Ejemplo 4 Identificación de genes diana en Leptinotarsa decemlineata
4.1. Biblioteca de ADNc normalizado de Leptinotarsa decemlineata y preparación de ARNbc en placas de múltiples pocillos para ensayos de detección
Se aislaron ácidos nucleicos de larvas de Leptinotarsa decemlineata de diferentes etapas. Se preparó una biblioteca de ADNc usando el kit de síntesis de ADNc por PCR SMARTer™, siguiendo las instrucciones del fabricante (Clontech Cat. n.° 634925). La biblioteca de ADNc se normalizó usando el kit Trimmer (Evrogen Cat. n.° NK001) y se clonó en el vector PCR®-BLUNTII-TOPO® (Invitrogen). La normalización de los clones introdujo adaptadores M2 (Trimmer Kit, Evrogen, SEQ ID NO 92: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) orientados en dirección opuesta en cada extremo de los clones. Las construcciones del vector recombinante se transformaron en células de la cepa TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen). Posteriormente se diluyeron las células transformadas y se sembraron en placa para obtener colonias individuales o clones. Los clones se revisaron para asegurarse de que la redundancia de clones para la biblioteca no excediera un 5%. Se inocularon clones únicos en medios de LB (caldo Luria) líquido, en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante una noche a 37°C. Las placas también incluyeron clones control positivos (Ld513) y negativos (FP).
Para generar el ARNbc, se generaron mediante PCR fragmentos de ADN codificantes y no codificantes que contenían la secuencia promotora T7. En resumen, por clon, se distribuyó 1 pl de suspensión bacteriana en placas de PCR de múltiples pocillos que contienen REDTaq® (Sigma Cat. n.° D4309) y los cebadores oGCC2738 (SEQ ID NO 93: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) y oGCC2739 (SEQ ID NO 94:
GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGTATCAACGCAG) basados en las secuencias M2 y la T7-M2, respectivamente. La reacción de PCR estuvo seguida de una transcripción in vitro, donde, por clon, se utilizaron 6 pl de producto de PCR en un volumen de reacción de 20 pl que contenía los reactivos de transcripción proporcionados por el Sistema de Producción de ARN a Gran Escala RiboMAX™ - kit T7 (Promega Cat. n.° P1300) y se incubaron durante toda la noche a 37°C. La solución de ARNbc final se diluyó en agua Milli-Q estéril y se utilizó para la detección. El ARNbc que corresponde al clon de control de Ld513 positivo es la SEQ ID NO 400 (véase la Tabla 9) y al clon de control de FP negativo es la SEQ ID NO 104 (véase la Tabla 4).
4.2. Detección de genes diana novedosos y potentes de Leptinotarsa decemlineata usando una biblioteca de ADNc de expresión de ARNbc
Cada pocillo de una placa de 48 pocillos contenía 0,5 ml de dieta artificial pretratada con una capa tópica de 25 pl (o 1 pg) del ARNbc de prueba o control. Una larva L2 se colocó en cada pocillo y se evaluaron 3 larvas por clon. Los números de supervivencia de CPB se evaluaron los días 4, 7 y 10.
En un segundo bioensayo, las larvas de CPB se alimentaron con dieta y se trataron con un ARNbc de prueba aplicado tópicamente generado a partir de clones derivados de una biblioteca de ADNc normalizado. Una larva se colocó en un pocillo de una placa de 48 pocillos que contenía una dieta de 0,5 ml pretratados con una capa de 25 pl de una solución de 40 ng/pl de ARNbc. Se evaluó un total de veinticuatro larvas por tratamiento (clon). El número de insectos supervivientes se evaluó en los días 4, 5, 6, 7, 8 y 11. El porcentaje de mortalidad larvaria se calculó respecto al día 0 (inicio del ensayo) (véase la Figura 21).
4.3. Identificación de dinas del escarabajo L. decemlineata
Las nuevas secuencias diana de la detección de 5.2. y las secuencias diana correspondientes a las dianas de la ruta de troponina, ortólogas a las secuencias Lh594, Lh619 y Lh620 de Lygus, se han identificado en L. decemlineata. Los cebadores que proporcionaron fragmento de ADNc relevante para Ld594 se enumeran en la Tabla 17. Las secuencias de ADNc y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron y se proporcionan en las Tablas 7 y 9 respectivamente.
4.4. Producción de ARNbc correspondientes a las secuencias parciales de los genes diana de L. decemlineata
El ARNbc se sintetizó usando los cebadores proporcionados en la Tabla 9. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de los genes diana se proporciona en la Tabla 9.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
4,5. Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de L. decemlineata Ensayo de larvas tempranas
Se produjeron ARNbc sintéticos para las 3 dianas, Ld594, Ld619 y Ld620, y se evaluaron en un ensayo de alimentación con las larvas de CPB (véase la Figura 16). Se llevó a cabo un ensayo de 10 días en placas de 48 pocilios, con dieta artificial (basada en Gelman et al, J Ins Sc,1:7, 1-10: Artificial diets for rearing the Colorado Potato Beetle), enriquecida con 1 |jg de ARNbc/pocillo, con 12 larvas por condición.
Pudo observarse un claro efecto en el desarrollo de las larvas. Se configuró un segundo ensayo para investigar el efecto de estos ARNbc durante el transcurso de la pupación y la metamorfosis (véase el ensayo de pupación más abajo).
Ensayo de pupación
Se configuró un ensayo de pupación de CPB para investigar el efecto de la desactivación por iARN de Ld594, Ld619 y Ld620 durante la pupación y la metamorfosis. Las larvas de cuarto estadio se alimentaron con 1 jg de ARNbc sintetizado in vitro dispensado en un disco de hoja de patata y luego se transfirieron a un caja que contenía hojas de patata frescas sin tratar. Cuatro días después los insectos que sobrevivieron se colocaron en vermiculita para permitir la pupación. Los insectos tratados con Lh594 fueron lentos, más pequeños y en mayor medida fueron incapaces de superar la pupación. La eclosión de la pupa se evaluó al final del experimento. Para el control sin tratar, puparon 24 larvas y todas eclosionaron en adultos saludables. Para Ld620, se observó una disminución del número de larvas que evolucionaron hasta pupación. Para las tres dianas evaluadas, ninguna larva evolucionó en pupas saludables y ninguna emergió como adulto. Los insectos muertos recuperados de la vermiculita mostraron varios grados de malformaciones (Figura 17).
Ld594, Ld619 y Ld620 primero aparecieron como dianas no letales en el ensayos de larvas de CPB, a pesar de que se observó claramente una reducción de la vitalidad en los insectos tratados con ARNbc. Por otro lado, en el ensayo de pupación, las 3 dianas indujeron efectos importantes e inhibieron la entrada en pupación y/o metamorfosis.
Ensayo de adultos
Para evaluar la actividad de Ld594, Ld619 y Ld620 en adultos de CPB, se configuró un ensayo de disco de hojas. Un disco de hoja de patata (1,7 cm de diámetro) se recubrió con ARNbc o controles y se colocó en una placa Petri de 3,5 cm con un escarabajo adulto. Al día siguiente se proporcionó un disco nuevo de hojas tratadas a los insectos. El tercer día, los adultos se transfirieron a una caja que contenía suficientes hojas de patata frescas sin tratar para soportar la supervivencia de los controles sin tratar. Por tratamiento, se ensayaron 6 adultos y se contaron los números de supervivientes y de insectos moribundos a intervalos regulares desde el día 6 hasta el día 13. Los insectos se consideraban moribundos si eran incapaces de erguirse por sí mismos tras colocarlos sobre el dorso.
A pesar del nivel relativamente alto de fondo en el control negativo en este ensayo particular, se observaron claros efectos para los insectos que se habían expuesto a ARNbc de Ld594 o Ld619 (Figura 18).
Ejemplo 5 Identificación de genes diana en Nilaparvata lugens
5.1 Identificación de dianas de Nilaparvata lugens
Se han identificado en saltamontes pardo del arroz, Nilaparvata lugens, nuevas secuencias diana, que corresponden a las dianas de la ruta de Troponina y nombrados como Nl594 (Troponina I), Nl619 (Troponina T) y Nl626 (Troponina C). Las secuencias ortólogas de los genes de Lygus, nombrados como Nl594 (Troponina l), Nl619 (Troponina T) y Nl625/626 (Troponina C), se clonaron a través de PCR con cebador degenerado, usando ADNc de BPH como molde. Además, el ADNc de longitud completa se identificó para Nl594, usando RACE (véase el método anteriormente). Se utilizó el sistema de PCR AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante y con condiciones convencionales para las reacciones de PCR con cebador degenerado, normalmente de la siguiente forma: 1 ciclo con 10 minutos a 95°C, posteriormente 40 ciclos con 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto a 72°C y posteriormente 10 minutos a 72°C. Para aumentar la tasa de éxito, se diseñaron hasta 10 cebadores degenerados diferentes, directos e inversos, basándose en alineaciones de secuencias ortólogas en otras especies, y se utilizaron en varias combinaciones. Los fragmentos de PCR obtenidos se purificaron a partir del gel mediante el kit de extracción de gel (Qiagen Cat. n.° 28706) y se clonaron en un vector TOPO TA (Invitrogen). Se secuenciaron los clones y se utilizaron las secuencias de consenso en búsquedas Blast en bases de datos de secuencias de insectos disponibles para confirmar la relevancia del inserto. Los cebadores degenerados que resultaron en una amplificación exitosa se enumeran en la Tabla 18.
Se determinaron las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana y otro gen diana (NI537) y se proporcionan en las Tablas 10 y 11, respectivamente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
5.2 Producción de ARNbc que corresponde a las secuencias parciales de los genes diana de Nilaparvata lugens
El ARNbc se sintetizó usando los cebadores proporcionados en la Tabla 12. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 12.
5.3 Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de Nilaparvata lugens
Los ARNbc se sintetizaron y se evaluaron en ensayos de iARN por alimentación de BPH previamente optimizados, en presencia del detergente zwitteriónico, CHAPSO, a un 0,1% de concentración final. Los ARNbc se evaluaron a 0,5 |jg/|jl de concentración final. Se utilizó Nl537, una diana potente en los ensayos de BPH como una diana de referencia en el ensayo. La supervivencia de los insectos se evaluó en el trascurso de 9 días.
Los resultados del bioensayo mostraron que en BPH, Nl594, Nl619 y Nl626 también fueron dianas de iARN potentes en BPH (Figura 19).
Ejemplo 6 Identificación de genes diana en Acyrthosiphon pisum
6.1 Identificación de dianas de Acyrthosiphon pisum
Se han identificado nuevas secuencias diana en áfidos y se nombraron como Ap423, Ap537, Ap560 y Ap594, siguiendo la misma nomenclatura: "Apxxx", donde "Ap" corresponde a Acyrthosiphon pisum y "xxx" a la ID de la diana. Los cebadores se diseñaron basándose en la predicción de genes de dominio público de AphidBase (ref:
http://www.aphidbase.com/) (Tabla 13).
Las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron y se proporcionan en las Tablas 14 y 15 respectivamente.
6.2 Producción de ARNbc que corresponden a las secuencias parciales de los genes diana de áfidos
El ARNbc se sintetizó usando los cebadores proporcionados en la Tabla 16. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 16.
6.3 Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de áfidos
Se evaluó la iARN por alimentación en Acyrthosiphon pisum (pulgón del guisante) con 4 dianas: Ap594, Ap423, Ap560, Ap537. Las secuencias se amplificaron mediante PCR usando cebadores, diseñados sobre la información de secuencias de dominio público (
http://www.aphidbase.com) y se preparó ADNc de áfidos. Se prepararon y se evaluaron ARNbc sintéticos a una concentración final de 0,5 jg/jl en presencia de 5 jg/jl de ARNt de levadura en una dieta de sacarosa. Diez ninfas de pulgón del guisante recién nacidas se colocaron en una placa Petri (32 mm). Se colocaron en una pipeta cincuenta jl de dieta (con ARNt y ARNbc) sobre la primera capa de parafilm. Una segunda capa de parafilm cubrió la dieta y creó una bolsita de alimentación donde los áfidos pudieron alimentarse. Por diana se configuraron cinco repeticiones de diana de 10 ninfas recién nacidas. El ARNbc de GFP se utilizó como control negativo. La dieta se renovó el día 4 y 7 de los ensayos y se evaluó la supervivencia (Figura 20).
Tabla 2
ID de la diana
Secuencia de ADNc (hebra codificante) 5' ^ 3'
Lh594
SEQ ID NO 1
Lh609
SEQ ID NO 3
Lh610
SEQ ID NO 5
Lh610 (b)
SEQ ID NO 139
Lh611
SEQ ID NO 7
Lh611 (b)
SEQ ID NO 140
Lh617
SEQ ID NO 9
Lh618
SEQ ID NO 11
Lh618 (b)
SEQ ID NO 141
Lh429
SEQ ID NO 13
Lh423
SEQ ID NO 95
Lh105,2
SEQ ID NO 96
Lh560
SEQ ID NO 15
Lh615
SEQ ID NO 17
Lh612
SEQ ID NO 19
Lh246
SEQ ID NO 21
Lh597
SEQ ID NO 23
Lh598
SEQ ID NO 25
Lh619
SEQ ID NO 121
Lh619 (b)
SEQ ID NO 142
Lh619 (c)
SEQ ID NO 143
Lh620
SEQ ID NO 122
Lh620 (b)
SEQ ID NO 144
Lh620 (c)
SEQ ID NO 145
Lh621
SEQ ID NO 123
Lh622
SEQ ID NO 124
Lh623
SEQ ID NO 125
Lh623 (b)
SEQ ID NO 146
Lh624
SEQ ID NO 126
Lh624 (b)
SEQ ID NO 147
Lh625
SEQ ID NO 127
Lh625 (b)
SEQ ID NO 148
Lh626
SEQ ID NO 128
Lh626 (b)
SEQ ID NO 149
Lh614
SEQ ID NO 129
Lh627
SEQ ID NO 150
Lh628
SEQ ID NO 152
Lh629
SEQ ID NO 154
Lh630
SEQ ID NO 156
Lh631
SEQ ID NO 158
Lh632
SEQ ID NO 160
Lh633,1
SEQ ID NO 162
Lh633,2
SEQ ID NO 163
Lh634,1
SEQ ID NO 165
Lh634,2
SEQ ID NO 167
Lh595,1
SEQ ID NO 168
Lh595,2
SEQ ID NO 170
Lh596
SEQ ID NO 172
Tabla 3
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 2
Lh594
SEQ ID NO 79
Lh609
SEQ ID NO 80
Lh610
SEQ ID NO 81
Lh610 (b)
SEQ ID NO 326
Lh611
SEQ ID NO 82
Lh611 (b)
SEQ ID NO 327
Lh617
SEQ ID NO 83
Lh618
SEQ ID NO 84
Lh618 (b)
SEQ ID NO 328
Lh429
SEQ ID NO 85
Lh429 (b)
SEQ ID NO 329
Lh423
SEQ ID NO 99
Lh105,2
SEQ ID NO 100
Lh560
SEQ ID NO 86
Lh615
SEQ ID NO 87
Lh612
SEQ ID NO 88
Lh246
SEQ ID NO 89
Lh597
SEQ ID NO 90
Lh598
SEQ ID NO 91
Lh619
SEQ ID NO 330
Lh620
SEQ ID NO 331
Lh621
SEQ ID NO 332
Lh622
SEQ ID NO 333
Lh623
SEQ ID NO 334
Lh624
SEQ ID NO 335
Lh625
SEQ ID NO 336
Lh626
SEQ ID NO 337
Lh614
SEQ ID NO 338
Lh627
SEQ ID NO 339
Lh628
SEQ ID NO 340
Lh629
SEQ ID NO 341
Lh630
SEQ ID NO 342
Lh631
SEQ ID NO 343
Lh632
SEQ ID NO 344
Lh633,1
SEQ ID NO 345
Lh633,2
SEQ ID NO 346
Lh634,1
SEQ ID NO 347
Lh634,2
SEQ ID NO 348
Tabla 4
ID de la diana
Cebadores directos 5' ^ 3' Cebadores inversos 5' ^ 3' ARNbc: hebra codificante representada por la secuencia de aDn equivalente 5' ^ 3'
Lh594
SEQ ID NO 27 SEQ ID NO 28 SEQ ID NO 2
SEQ ID NO 29 SEQ ID NO 30
Lh609
SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 32 SEQ ID NO 4
SEQ ID NO 33 SEQ ID NO 34
Lh610
SEQ ID NO 35 SEQ ID NO 36 SEQ ID NO 6
SEQ ID NO 37 SEQ ID NO 38
Lh611
SEQ ID NO 39 SEQ ID NO 40 SEQ ID NO 8
SEQ ID NO 41 SEQ ID NO 42
Lh617
SEQ ID NO 43 SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 10
SEQ ID NO 45 SEQ ID NO 46
Lh618
SEQ ID NO 47 SEQ ID NO 48 SEQ ID NO 12
SEQ ID NO 49 SEQ ID NO 50
Lh429
SEQ ID NO 51 SEQ ID NO 52 SEQ ID NO 14
SEQ ID NO 53 SEQ ID NO 54
Lh423
SEQ ID NO 105 SEQ ID NO 106 SEQ ID NO 101
SEQ ID NO 107 SEQ ID NO 108
Lh105,2
SEQ ID NO 109 SEQ ID NO 110 SEQ ID NO 102
SEQ ID NO 111 SEQ ID NO 112
GFP
SEQ ID NO 113 SEQ ID NO 114 SEQ ID NO 103
SEQ ID NO 115 SEQ ID NO 116
Pt
SEQ ID NO 117 SEQ ID NO 118 SEQ ID NO 104
SEQ ID NO 119 SEQ ID NO 120
Lh560
SEQ ID NO 55 SEQ ID NO 56 SEQ ID NO 16
SEQ ID NO 57 SEQ ID NO 58
Lh615
SEQ ID NO 59 SEQ ID NO 60 SEQ ID NO 18
SEQ ID NO 61 SEQ ID NO 62
Lh612
SEQ ID NO 63 SEQ ID NO 64 SEQ ID NO 20
SEQ ID NO 65 SEQ ID NO 66
Lh246
SEQ ID NO 67 SEQ ID NO 68 SEQ ID NO 22
SEQ ID NO 69 SEQ ID NO 70
Lh597
SEQ ID NO 71 SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 24
SEQ ID NO 73 SEQ ID NO 74
Lh598
SEQ ID NO 75 SEQ ID NO 76 SEQ ID NO 26
SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 78
Lh619
SEQ ID NO 206 SEQ ID NO 207 SEQ ID NO 130
SEQ ID NO 208 SEQ ID NO 209
Lh620
SEQ ID NO 210 SEQ ID NO 211 SEQ ID NO 131
SEQ ID NO 212 SEQ ID NO 213
Lh621
SEQ ID NO 214 SEQ ID NO 215 SEQ ID NO 132
SEQ ID NO 216 SEQ ID NO 217
Lh622
SEQ ID NO 218 SEQ ID NO 219 SEQ ID NO 133
SEQ ID NO 220 SEQ ID NO 221
Lh623
SEQ ID NO 222 SEQ ID NO 223 SEQ ID NO 134
SEQ ID NO 224 SEQ ID NO 225
Lh624
SEQ ID NO 226 SEQ ID NO 227 SEQ ID NO 135
SEQ ID NO 228 SEQ ID NO 229
Lh625
SEQ ID NO 230 SEQ ID NO 231 SEQ ID NO 136
SEQ ID NO 232 SEQ ID NO 233
Lh626
SEQ ID NO 234 SEQ ID NO 235 SEQ ID NO 137
SEQ ID NO 236 SEQ ID NO 237
Lh614
SEQ ID NO 238 SEQ ID NO 239 SEQ ID NO 138
SEQ ID NO 240 SEQ ID NO 241
Lh627
SEQ ID NO 242 SEQ ID NO 243 SEQ ID NO 151
SEQ ID NO 244 SEQ ID NO 245
Lh628
SEQ ID NO 246 SEQ ID NO 247 SEQ ID NO 153
SEQ ID NO 248 SEQ ID NO 249
Lh629
SEQ ID NO 250 SEQ ID NO 251 SEQ ID NO 155
SEQ ID NO 25 SEQ ID NO 253
Lh630
SEQ ID NO 254 SEQ ID NO 255 SEQ ID NO 157
SEQ ID NO 256 SEQ ID NO 257
Lh631
SEQ ID NO 258 SEQ ID NO 259 SEQ ID NO 159
SEQ ID NO 260 SEQ ID NO 261
Lh632
SEQ ID NO 262 SEQ ID NO 264 SEQ ID NO 263 SEQ ID NO 265 SEQ ID NO 161
Lh633,2
SEQ ID NO 266 SEQ ID NO 268 SEQ ID NO 267 SEQ ID NO 269 SEQ ID NO 164
Lh634,1
SEQ ID NO 270 SEQ ID NO 271 SEQ ID NO 166
SEQ ID NO 272 SEQ ID NO 273
Lh595
SEQ ID NO 274 SEQ ID NO 275 SEQ ID NO 169
SEQ ID NO 276 SEQ ID NO 277
Lh596
SEQ ID NO 278 SEQ ID NO 279 SEQ ID NO 173
SEQ ID NO 280 SEQ ID NO 281
Tabla 7 __________________________________
ID de la | Secuencia de ADNc (hebra codificante)
diana
5' ^ 3'
Ld594
SEQ ID NO 174
Ld619
SEQ ID NO 176
Ld620
SEQ ID NO 178
Ld583
SEQ ID NO 386
Ld584
SEQ ID NO 387
Ld586
SEQ ID NO 388
Ld588
SEQ ID NO 389
Ld513
SEQ ID NO 394
Tabla 8
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 9
Ld594
SEQ ID NO 349
Ld619
SEQ ID NO 350
Ld620
SEQ ID NO 351
Ld583
SEQ ID NO 390
Ld584
SEQ ID NO 391
Ld586
SEQ ID NO 392
Ld588
SEQ ID NO 393
Ld513
SEQ ID NO 395
Tabla 9
ID de la diana
Cebadores directos Cebadores inversos ARNbc: hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente
5' ^ 3' 5' ^ 3' 5' ^ 3'
Ld594
SEQ ID NO 282 SEQ ID NO 283 SEQ ID NO 175
SEQ ID NO 284 SEQ ID NO 285
Ld619
SEQ ID NO 286 SEQ ID NO 287 SEQ ID NO 177
SEQ ID NO 288 SEQ ID NO 289
Ld620
SEQ ID NO 290 SEQ ID NO 291 SEQ ID NO 179
SEQ ID NO 292 SEQ ID NO 293
Ld513
SEQ ID NO 396 SEQ ID NO 397 SEQ ID NO 400
SEQ ID NO 398 SEQ ID NO 399
Tabla 10
ID de la diana
Secuencia de ADNc (hebra codificante) 5' ^ 3'
NI594
SEQ ID NO 180
NI619
SEQ ID NO 182
NI626
SEQ ID NO 184
NI537
SEQ ID NO 186
Tabla 11
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 12
NI594
SEQ ID NO 352
NI619
SEQ ID NO 353
NI626
SEQ ID NO 354
NI537
SEQ ID NO 355
10 Tabla 12 _______________________________________________________________________________
T ID de la | Cebadores | Cebadores | ARNbc: hebra codificante representada por la
diana
directos inversos secuencia de ADN equivalente
5' ^ 3' 5' ^ 3' 5' ^ 3'
NI594
SEQ ID NO 294 SEQ ID NO 295 SEQ ID NO 181
SEQ ID NO 296 SEQ ID NO 297
NI619
SEQ ID NO 298 SEQ ID NO 299 SEQ ID NO 183
SEQ ID NO 300 SEQ ID NO 301
NI626
SEQ ID NO 302 SEQ ID NO 303 SEQ ID NO 185
SEQ ID NO 304 SEQ ID NO 305
NI537
SEQ ID NO 306 SEQ ID NO 307 SEQ ID NO 187
SEQ ID NO 308 SEQ ID NO 309
Tabla 13
Diana
Secuencia de cebador directo Secuencia de cebador inverso
Ap594
SEQ ID NO 369 SEQ ID NO 370
Ap423
SEQ ID NO 371 SEQ ID NO 372
Ap537
SEQ ID NO 373 SEQ ID NO 374
Ap560
SEQ ID NO 375 SEQ ID NO 376
Tabla 14
ID de la diana
Secuencia de ADNc (hebra codificante) 5' ^ 3'
Ap594
SEQ ID NO 188
Ap423
SEQ ID NO 200
Ap537
SEQ ID NO 202
Ap560
SEQ ID NO 204
5
Tabla 15
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 16
Ap594
SEQ ID NO 356
Ap423
SEQ ID NO 357
Ap537
SEQ ID NO 358
Ap560
SEQ ID NO 359
Tabla 16
ID de la diana
Cebadores directos Cebadores inversos ARNbc: hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente
5' ^ 3' 5' ^ 3' 5' ^ 3'
Ap594
SEQ ID NO 310 SEQ ID NO 311 SEQ ID NO 189
SEQ ID NO 312 SEQ ID NO 313
Ap423
SEQ ID NO 314 SEQ ID NO 315 SEQ ID NO 201
SEQ ID NO 316 SEQ ID NO 317
Ap537
SEQ ID NO 318 SEQ ID NO 319 SEQ ID NO 203
SEQ ID NO 320 SEQ ID NO 321
Ap560
SEQ ID NO 322 SEQ ID NO 323 SEQ ID NO 205
SEQ ID NO 324 SEQ ID NO 325
10 Tabla 17
Diana
Cebador directo Cebador inverso
Ld594
SEQ ID NO 377 SEQ ID NO 378
Tabla 18
Diana
Cebador directo Cebador inverso
Nl594
seq id no 379 seq id no 380
Nl619
seq id no 381 seq id no 382
Nl626
seq id no 383 seq id no 384
Tabla 19
ID de la diana
Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Ld583
CG4759 Proteína ribosómica L27 RpL27
Ld584
CG 17331 Proteasoma, subunidad tipo beta
Ld586
CG13704 desconocido
Ld588
CG4157 Rpn12
5
Tabla 20
ID de la diana
Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Nl594
CG7178 wings up A (troponina I) wupA
Nl619
CG7107 troponina T (sostenida) up
Nl626
*CG9073, CG7930, CG2981, CG12408, CG6514, CG2981, CG7930, CG9073, CG6514, CG12408 troponina C
Nl537
CG32744 Ubiquitina- 5E; proceso de modificación de proteína
*incierto: múltiples coincidencias en la familia
Tabla 21
ID de la diana
Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Ap594
CG7178 wings up A (troponina I) wupA
Ap423
CG2746 proteína ribosómica L19 RpL19
Ap537
CG32744 Ubiquitina-5E; proceso de modificación de proteína
Ap560
CG10423 proteína ribosómica S27 RpS27
10
Los expertos en la materia apreciarán que pueden hacerse numerosas variaciones y/o modificaciones a los ensayos mencionados anteriormente. Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de averiguar, usando poco más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a los ejemplos específicos. El presente ejemplo, por lo tanto, debe considerarse en todos los aspectos como ilustrativo y no restrictivo.
15

Claims (38)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona, tras la captación por una especie de plaga de insectos, regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en el que el ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador en el que dicho elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra comprende o consiste en una secuencia de al menos 35 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
  2. 2. El ARN interferente de la reivindicación 1, en el que el ARN comprende al menos dos elementos silenciadores, en el que cada elemento silenciador comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana.
  3. 3. El ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicha especie de plaga de insectos es una plaga de plantas.
  4. 4. El ARN interferente de la reivindicación 3, en el que dicha plaga de plantas es una especie de plaga de insectos seleccionada de las especies de insectos pertenecientes a los órdenes Coleóptera, Hemiptera, Lepidoptera, Díptera, Dichyoptera, Orthoptera y Siphonaptera.
  5. 5. El ARN interferente de la reivindicación 4, en el que la plaga insectos de plantas se selecciona del grupo que consiste en Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (falso escarabajo de la patata) o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes pardo del arroz)); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchada) o L. hesperus (chinche manchada del oeste)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgón verde del melocotonero)); Diabrotica spp. (por ejemplo, D. virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental), D. barben (gusano de la raíz del maíz norteño), D. undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz sureño), D. virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano).
  6. 6. El ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho gen diana codifica una proteína troponina I de insecto.
  7. 7. El ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la regulación por disminución de la expresión de dicho gen diana causa disminución del crecimiento, desarrollo, reproducción o supervivencia de dicha plaga en comparación con dicha especie de plaga expuesta a un ácido ribonucleico interferente que tiene como diana un gen no esencial o un ácido ribonucleico interferente que no regula por disminución ningún gen dentro de dicha especie de plaga.
  8. 8. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  9. 9. Una construcción de ADN que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.
  10. 10. La construcción de ADN de la reivindicación 9, que es una construcción de expresión, en la que dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho ARN interferente está unida de forma funcional a al menos una secuencia reguladora que puede dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos.
  11. 11. Una célula hospedadora que comprende un ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el polinucleótido de la reivindicación 8 o al construcción de ADN de la reivindicación 9 o 10.
  12. 12. La célula hospedadora de la reivindicación 11, que es una célula procariota o una célula eucariota.
  13. 13. La célula hospedadora de la reivindicación 12, que es una célula bacteriana.
  14. 14. Una composición para prevenir y/o controla una infestación por parte de una plaga de insectos, que comprende al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y al menos un vehículo, excipiente o diluyente adecuado.
  15. 15. Una composición que comprende una célula hospedadora que expresa o puede expresar un ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  16. 16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicha célula hospedadora es una célula bacteriana.
  17. 17. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, que está en forma sólida, líquida o de gel.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
  18. 18. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, que se formula como una pulverización de insecticida.
  19. 19. La composición de la reivindicación 18, en la que la pulverización es una pulverización presurizada/atomizada o una pulverización de bomba.
  20. 20. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 14-19, en la que la composición comprende además al menos un agente plaguicida seleccionado del grupo que consiste en un insecticida químico, una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporus y una proteína insecticida de Bacillus sphaericus.
  21. 21. La composición de la reivindicación 20, en la que dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que consiste en una Cry1, una Cry3, una TIC851, una CryET170, una Cry22, una TIC901, una TIC201, una TIC407, una TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812, y una proteína insecticida binaria PS149B1.
  22. 22. Un alojamiento o trampa para una plaga de insectos, que contiene una composición definida en cualquiera de las reivindicaciones 14-21.
  23. 23. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, para prevenir y/o controlar una infestación por parte de una plaga.
  24. 24. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 como plaguicida para una planta o material de propagación o reproductor de una planta.
  25. 25. Una combinación para prevenir y/o controlar una infestación por parte de una plaga, que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 y al menos otro agente activo.
  26. 26. La combinación de la reivindicación 25, para prevenir y/o controlar una infestación por parte de una plaga de una planta, en la que dicho agente activo diferente comprende un herbicida.
  27. 27. La combinación de la reivindicación 26, en la que el herbicida se selecciona de una versión insensible a glifosato de una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una enzima catabólica que es capaz de descomponer dicamba, tal como dicamba monooxigenasa o un gen de la fosfinotricina acetil transferasa que es capaz de catabolizar glufosinato de amonio.
  28. 28. Un método para regular por disminución la expresión de un gen diana en una especie de plaga de insectos para prevenir y/o controlar la infestación por parte de una plaga, que comprende poner en contacto dicha especie que es plaga con una cantidad eficaz de al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  29. 29. El método de la reivindicación 28, en el que la regulación por disminución de la expresión de dicho gen diana es dicha especie de plaga de insectos se usa para obtener al menos un 20% de control de la plaga o al menos un 20% de mortalidad de la plaga en comparación con el control de plagas de insectos en contacto con un ácido ribonucleico (ARN) interferente que tiene como diana un gen no esencial de la plaga o un gen diana que no se expresa en dicha plaga.
  30. 30. El método de la reivindicación 28 o 29, en el que el método se usa para prevenir y/o controlar la infestación por parte de una plaga de una planta.
  31. 31. El método de la reivindicación 30, en el que la planta se elige del grupo que comprende algodón, patata, arroz, colza, girasol, sorgo, mijo, maíz, fresas, soja, alfalfa, tomate, berenjena, pimiento y tabaco.
  32. 32. Uso del ácido ribonucleico (ARN) interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, la construcción de ADN de la reivindicación 9 o reivindicación 10, o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 14-21, para prevenir y/o controlar la infestación por parte de una plaga de insectos.
    202
    Figura 1
    100,0
  33. 90.0
  34. 80.0
  35. 70.0
  36. 60.0
    ro 50,0
    ;o
    £ 40,0
    o
    E 30,0
    <D
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    00
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    >* —J
    __1 __1 > —i __i —1 -1 —i
    □% muerte d6-c 8 ■% muerte d3-c 6
    LhOOl - Lh009 confirmación 2
    imagen2
    imagen3
    -Lh423 Control
    Lli246
    Lh594
    Lh597
    Lh598
    33 60
    Ih599
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    Figura 3
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    - Lh423 Control
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    Días
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    Dias
    Figura 6 continuación
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    Figura 7
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    219
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    Figura 9 continuación
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