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ES2661680T3 - Composiciones basadas en VAAr y métodos para tratar deficiencias de alfa-1 anti-tripsina - Google Patents

Composiciones basadas en VAAr y métodos para tratar deficiencias de alfa-1 anti-tripsina Download PDF

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ES2661680T3
ES2661680T3 ES12774597.4T ES12774597T ES2661680T3 ES 2661680 T3 ES2661680 T3 ES 2661680T3 ES 12774597 T ES12774597 T ES 12774597T ES 2661680 T3 ES2661680 T3 ES 2661680T3
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vaar
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ES12774597.4T
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Terence Flotte
Christian Mueller
Phillip David Zamore
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University of Massachusetts Amherst
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University of Massachusetts Amherst
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Abstract

Un VAAr que contiene un ácido nucleico que comprende: una primera región que codifica uno o más primeros miARN que se pueden hibridar, e inhibir su expresión, con un ARNm endógeno de un sujeto que codifica una proteína Z-AAT; y, una segunda región que codifica un ARNm exógeno que codifica una proteína M-AAT que tiene una o más mutaciones silenciosas en comparación con el ARNm endógeno, en donde el uno o más primeros miARN no comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias para hibridarse con, e inhibir, la expresión del ARNm exógeno, y en donde la primera región está situada entre el último codón del ARN exógeno y una parte de la segunda región que codifica la secuencia de poliadenilación del ARNm exógeno.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones basadas en VAAr y métodos para tratar deficiencias de alfa-1 anti-tripsina Campo de la invención
La invención se refiere a vectores basados en VAAr y composiciones útiles para tratar enfermedades genéticas. Antecedentes de la invención
Numerosas enfermedades están asociadas a mutaciones heredades o somáticas. En muchos casos, estas mutaciones están presentes en las regiones de transcritos de genes, cuyos productos controlan importantes funciones fisiológicas que incluyen, por ejemplo, la expresión génica, la señalización celular, la estructura de tejidos, y el metabolismo y catabolismo de diversas biomoléculas. Las mutaciones en estos genes, que son a menudo únicamente cambios en un único nucleótido (por ejemplo, mutaciones interruptoras, mutaciones de aminoácido), pueden tener efectos negativos sobre la expresión, estabilidad y/o función del producto génico resultantes en alteraciones en una o más funciones fisiológicas.
Se han identificado numerosas mutaciones diferentes en el gen de la alfa-1 antitripsina (AAT). AAT es una de las anti-proteasas séricas primarias en circulación en seres humanos. AAT inhibe varias serina proteinasas, siendo una de las neutrófilo elastasas fisiológicamente más importantes, así como la inhibición de numerosas metaloproteinasas y otras moléculas proinflamatorias y proapoptóticas. AAT se produce normalmente en hepatocitos y macrófagos, donde las AAT derivadas de hepatocitos forman el volumen de la reserva fisiológica de AAT.
Aproximadamente un 4 % de las poblaciones de Norteamérica y Europa del Norte poseen al menos una copia de un alelo mutante, conocido como PI*Z (Z-AAT) que es el resultado de una única sustitución del aminoácido lisina por glutamato en la posición 342 en la proteína madura (posición 366 en la proteína precursora). En el estado homocigótico, esta mutación conduce a una grave deficiencia de AAT, y puede dar como resultado dos estados patológicos distintos: una enfermedad pulmonar que es principalmente debida a la pérdida de la función antiproteasa, y una enfermedad hepática (presente en un grado significativo en aproximadamente un 10-15 % de pacientes) debida a una ganancia tóxica de la función de la proteína mutante Z-AAT.
Se han desarrollado productos clínicos de investigación de terapia génica para el aumento del gen de la AAT como potenciales tratamientos para la enfermedad pulmonar utilizando vectores víricos adenoasociados recombinantes (VAAr). Los investigadores han aplicado también tecnologías genéticas en un esfuerzo para regular por defecto los niveles del ARNm de AAT. Una solución fue utilizar ribozimas de tipo cabeza de martillo diseñadas para escindir el ARNm de AAT en un sitio específico. Otra solución implica el uso de la interferencia del ARN para disminuir los niveles del transcrito de ARNm mutante.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a la materia sujeto como se define en las reivindicaciones 1, 14 y 15. Se consiguen ventajas adicionales en las realizaciones indicadas mediante las reivindicaciones dependientes.
Se divulgan en el presente documento métodos mejorados basados en terapia génica para el tratamiento de enfermedades genéticas. Se divulgan también en el presente documento composiciones mejoradas mediante terapia génica y la metodología relacionada para tratar enfermedades pulmonares y/o enfermedades hepáticas utilizando los vectores víricos adenoasociados recombinantes. En algunas realizaciones, los métodos utilizan vectores basados en VAAr (por ejemplo, VAAr9, VAAr2, VAAr1) para aumentar la expresión de AAT. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos para disminuir la expresión de la proteína Pi*Z mutante de AAT. En dichas realizaciones, las composiciones y métodos son útiles para detener y/o mejorar el daño hepatocelular y otro daño a tejidos asociados a la AAT mutante.
De acuerdo con algunos aspectos de la invención, las composiciones son útiles para inactivar la proteína PiZ aumentando al mismo tiempo los niveles de la proteína M-AAT (la proteína AAT natural). En algunas realizaciones, se proporciona un vector no tóxico de doble función que es capaz de inactivar Z-AAT aumentando a la vez M-AAT. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporcionan métodos y composiciones para la expresión a largo plazo de ARNm terapéuticos que utilizan la plataforma del virus adenoasociado recombinante (VAAr). En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos terapéuticos descritos en el presente documento se aprovechan de la ruta del miARN alterando la secuencia de siembra de los miARN naturales para dirigirse al gen AAT endógeno. En algunas realizaciones, los métodos son más seguros y menos tóxicos que las soluciones basadas en ARNhc.
Se divulgan también en el presente documento, composiciones basadas en VAAr y se proporcionan métodos que dirigen simultáneamente agentes de silenciamiento hacia el hígado para disminuir la expresión de Z-AAT y dirigir el aumento de genes a otros sitios. Sin embargo, en algunas realizaciones, el hígado es un tejido diana óptimo para el aumento. En algunas realizaciones, se proporciona una solución basada en un miARN para regular por defecto de
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manera estable Z-AAT en hepatocitos. En algunas realizaciones, la solución permite el aumento simultáneo de genes M-AAT a partir del mismo vector de administración del gen de VAAr sin perturbación grave del perfil del miARN hepático global. En algunas realizaciones, el vector específico utilizado es un vector derivado de la cápsida de VAAr9 administrado sistémicamente. Se divulga también en el presente documento, que esta solución tiene una amplia utilidad en trastornos genéticos que se originan a partir de mutaciones dominantes negativas y mutaciones de ganancia de funciones así como para administrar miARN artificiales junto con genes terapéuticos.
Se divulga también en el presente documento, ácidos nucleicos aislados proporcionados. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados comprenden (a) una primera región que codifica uno o más primeros miARN que comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias con un ARNm endógeno de un sujeto para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm endógeno, en el que el ARNm endógeno codifica una primera proteína; y (b) una segunda región que codifica un ARNm exógeno que codifica una segunda proteína, en el que la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la primera proteína, en el que el uno o más primeros miARN no comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm exógeno, y en el que la segunda región se sitúa en una parte sin traducir de la segunda región. En algunas realizaciones, la parte sin traducir es un intrón. Se divulga también en el presente documento, que la primera región está entre el primer codón del ARNm exógeno y 1000 nucleótidos en la dirección 5' del primer codón.
Se divulgan también en el presente documento, los ácidos nucleicos aislados que comprenden (a) una primera región que codifica uno o más primeros miARN que comprende un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias con un ARNm endógeno de un sujeto para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm endógeno, en el que el ARNm endógeno codifica una primera proteína; y (b) una segunda región que codifica un ARNm exógeno que codifica una segunda proteína, en el que la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la primera proteína, en el que el uno o más primeros miARN no comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm exógeno, y en el que la primera región se sitúa en la dirección 3' de una parte de la segunda región que codifica la cola poliA del ARNm exógeno.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados comprenden además una tercera región que codifica uno o más segundos miARN que comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm endógeno, en el que la tercera región se sitúa en una parte no traducida de la segunda región. En algunas realizaciones, la parte sin traducir es un intrón. En algunas realizaciones, la primera región está entre el último codón del ARNm exógeno y una posición de 1000 nucleótidos en la dirección 3' del último codón. En algunas realizaciones, la tercera región está entre el primer codón del ARNm exógeno y una posición de 1000 nucleótidos en la dirección 5' del primer codón.
En algunas realizaciones de los ácidos nucleicos aislados, la primera región codifica dos primeros miARN. En algunas realizaciones, la primera región codifica tres primeros miARN. En algunas realizaciones, la tercera región codifica dos segundos miARN. En algunas realizaciones, la tercera región codifica tres segundos miARN. En algunas realizaciones, uno o más de los primeros miARN tienen la misma secuencia de ácido nucleico que una o más de los segundos miARN. En algunas realizaciones, cada uno de los primeros miARN tiene la misma secuencia de ácidos nucleicos que uno de los segundos miARN. En algunas realizaciones, la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la primera proteína. En algunas realizaciones, la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la primera proteína. En algunas realizaciones, la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 % idéntica a la primera proteína. En algunas realizaciones, la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a la primera proteína. En algunas realizaciones, la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 100 % idéntica a la primera proteína.
En algunas realizaciones de los ácidos nucleicos aislados, la primera proteína es una proteína alfa 1 -antitripsina (AAT). En algunas realizaciones, la proteína AAT es una proteína AAT humana. En algunas realizaciones, la proteína AAT tiene una secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o 2 o una o más mutaciones de la misma como se identifica en la Tabla 1, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3 o 4. En algunas realizaciones, el primer ARNm comprende un ácido nucleico codificado por una secuencia que se muestra en las SEQ ID NOS: 5-16. En algunas realizaciones, el uno o más miARN tiene una secuencia de ácido nucleico codificada por una secuencia procedente del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 17-19 y 21-23. En algunas realizaciones de los ácidos nucleicos aislados, el ARNm exógeno tiene una o más mutaciones silenciosas en comparación con el ARNm endógeno. En algunas realizaciones, el ARNm exógeno tiene una secuencia de ácido nucleico codificada por una secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 20.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados comprenden además repeticiones terminales invertidas (RTI) de unos serotipos de VAA seleccionados entre el grupo que consiste en: VAA1, VAA2, VAA5, VAA6, VAA6.2, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y variantes de los mismos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados comprenden además un promotor unido operativamente con la(s) región(es) que codifican el uno o más primeros miARN, el ARNm exógeno, y/o el uno o más segundos miARN. En determinadas realizaciones, el promotor es un
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promotor específico de tejido. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor de la p-actina.
Se divulgan también en el presente documento, los virus adenoasociados recombinantes (VAA) proporcionados que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones, los VAA recombinantes comprenden una o más proteínas de la cápsida de uno o más serotipos de VAA seleccionados entre el grupo que consiste en: VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y variantes de los mismos.
Se divulgan también en el presente documento, las composiciones proporcionadas que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento. Se divulgan también en el presente documento, las composiciones proporcionadas que comprenden cualquiera de los VAA recombinantes divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además un transportador farmacéuticamente aceptable.
Se divulgan también en el presente documento, los kits proporcionados que comprende uno o más recipientes que alojan una composición, un ácido nucleico aislado o un VAAr divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits comprenden además instrucciones escritas para administrar un VAAr a un sujeto.
Se divulgan también en el presente documento, los métodos proporcionados para expresar la proteína alfa 1- antitripsina (AAT). En algunas realizaciones, los métodos comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de cualquier virus adenoasociado recombinante (VAAr) divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, el VAAr se administra con un transportador farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones de los métodos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene una deficiencia de alfa 1- antitripsina. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene una mutación en un gen AAT. En determinadas realizaciones, la mutación codifica una proteína AAT mutante. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además determinar que el sujeto tiene la mutación. En determinadas realizaciones, la mutación es una mutación relacionada en la Tabla 1. En determinadas realizaciones, la mutación es una mutación de aminoácido. En determinadas realizaciones, la mutación da como resultado una sustitución de glutamato a lisina en la posición 366 del aminoácido de acuerdo con la secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones, la proteína AAT mutante fracasa en plegarse adecuadamente.
En algunas realizaciones de los métodos, la cantidad eficaz de VAAr el período es de 10 , 10 , 10 , o 10 copias de genoma. En algunas realizaciones, la administración se lleva a cabo por vía intravascular, intravenosa, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o intranasal. En determinadas realizaciones, la administración se lleva a cabo mediante inyección en la vena porta hepática.
En algunas realizaciones de los métodos, la administración se lleva acabo ex vivo aislando células o tejido de un sujeto, poniendo en contacto la célula o tejido con una cantidad eficaz de un VAAr, produciendo por tanto células o tejidos, y administrando las células o los tejidos al sujeto. En determinadas realizaciones, el tejido es tejido adiposo. En determinadas realizaciones, las células son citoblastos derivados de tejido adiposo. En algunas realizaciones, se lleva a cabo la administración de células transfectadas por vía intravascular, intravenosa, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o intranasal. En determinadas realizaciones, se lleva a cabo la administración de células transfectadas mediante el trasplante de células transfectadas en un tejido diana. En determinadas realizaciones, el tejido diana es pulmón o hígado.
En algunas realizaciones de los métodos, el sujeto es un ratón, una rata, un conejo, un perro, un gato, una oveja, un cerdo, un primate no humano o un ser humano. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
En algunas realizaciones de los métodos, tras la administración del VAAr, se determina el nivel de expresión de la primera proteína en el sujeto. En algunas realizaciones, tras la administración del VAAr, se determina el nivel de expresión de la segunda proteína en el sujeto. En algunas realizaciones, se lleva a cabo la administración en dos o más ocasiones. En determinadas realizaciones, se determina el nivel de la primera proteína y/o el nivel de la segunda proteína en el sujeto después de al menos una administración.
En algunas realizaciones de los métodos, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 85 % tras la administración del VAAr. En algunas realizaciones, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 90 % tras la administración del VAAr. En algunas realizaciones, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 95 % tras la administración del VAAr. En algunas realizaciones, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 85 % en 2 semanas tras la administración del VAAr. En algunas realizaciones, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 90 % en 2 semanas tras la administración del VAAr. En algunas realizaciones, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 85 % en 4 semanas de administración del VAAr. En algunas realizaciones, tras 7 semanas de administración del VAAr, el nivel en suero de la primera proteína está a un nivel de al menos un 50 % en comparación con el nivel en sueros de la primera proteína antes de la administración del VAAr. En algunas realizaciones, tras 7 semanas de administración del VAAr, el nivel en suero de la primera proteína está a
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un nivel de al menos un 75 % en comparación con el nivel en sueros de la primera proteína antes de la administración del VAAr.
En algunas realizaciones de los métodos, tras la administración del VAAr se evalúa al menos un parámetro del resultado clínico asociado a la deficiencia de AAT en el sujeto. En algunas realizaciones, el al menos un parámetro del resultado clínico evaluado tras la administración del VAAr se compara con el al menos un parámetro del resultado clínico determinado antes de la administración del VAAr para determinar la eficacia del VAAr, en el que al menos una mejora en el parámetro del resultado clínico tras la administración del VAAr indica la eficacia del VAAr. En algunas realizaciones, el parámetro del resultado clínico se selecciona entre el grupo que consiste en: niveles en suero de la primera proteína, niveles en suero de la segunda proteína, presencia de glóbulos de AAT intracelulares, presencia de foci inflamatorios, capacidad respiratoria, capacidad de toser, producción de flema, frecuencia de resfriado de pecho o neumonía, y tolerancia para el ejercicio. En algunas realizaciones, se evalúan los glóbulos de AAT intracelulares o los foci inflamatorios en tejido pulmonar o tejido hepático.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 Comparación de ARNhc y miARN mediados por inactivación de AAT humana. Se transfectaron simultáneamente células HEK-293 con el plásmido Z-AAT humano y cualquier de un plásmido que expresa 3 ARNhc anti-AAT de un promotor U6 o un plásmido que expresa 3 miARN anti-AAT de un promotor híbrido de la beta actina de pollo. (a) Se recogieron los medios de cultivo a las 24, 48 y 72 horas y se analizaron para la concentración de AAT mediante ELISA. (b) A las 72 horas se recogieron y se lisaron para la concentración de AAT mediante ELISA. *<0,05 como se determinó mediante un test de la t de student bilateral sin emparejar. Figura 2 silenciamiento in vivo AAT humano mediante los miARN expresados por VAAr9. Se inyectaron ratones transgénicos que expresaban el alelo PiZ humano con 5x1011 partículas de vector o VAAr9 que expresaba los miARN frente AAT bajo el control del promotor híbrido de la beta-actina de pollo mediante la vena de la cola. Se recogieron los sueros de cada cohorte semanalmente y se utilizaron para evaluar la concentración de Z-AAT mediante ELISA. Se expresaron los datos como promedios de grupo + SEM (n=6).
Figura 3 Histología del hígado de ratones transgénicos PiZ 5 semanas después de la administración de VAAr9. Los hígados de ratones que recibieron vectores VAAr9 con controles de miARN y GFP se fijaron con formalina y se tiñeron para la AAT o con un ensayo PAS-D. Las secciones de hígados de ratones se tiñeron utilizando un anticuerpo dirigido contra AAT humana de un ratón tratado con (a) 3XmiR intrónicoso (b) controles de GFP. Secciones de hígado de ratón se tiñeron con un ensayo de ácido de Schiff periódico resistente a diastasa procedente (e y f) de 3XmiR intrónicos o (c y d) controles de GFP. (g) Se llevó a cabo el análisis cuantitativo de imágenes pixeladas de secciones de hígado completas comparando los recuentos de píxeles de los glóbulos positivos para PASD en controles GFP (N=7) con los recuentos de píxeles de los glóbulos positivos para PASN en 3XmiR (N=7) intrónicos.
Figura 4 Optimización In vivo de la administración de miARN de anti-AAT en vectores VAAr9. Se inyectaron ratones transgénicos que expresaban el alelo PiZ humano con 5x1011 partículas de vector o VAAr9 que expresaba los miARN frente AAT bajo el control del promotor híbrido de la beta-actina de pollo mediante la vena de la cola. Se recogieron los sueros de cada cohorte semanalmente y se utilizaron para evaluar la concentración de Z-AAT mediante ELISA.
Figura 5 RT-PCR cuantitativa para miARN artificial in vivo. Se utilizó el ARN total de hígados de ratón para evaluar la presencia de 3 miARN artificiales anti-AAT procedentes de ratones que recibieron vectores de miARN- VAAr9. *<0,05 como se determinó mediante un test de la t de student bilateral sin emparejar.
Figura 6 silenciamiento a largo plazo in vivo de AAT humano mediante los miARN expresados por VAAr9. Se inyectaron ratones transgénicos que expresaban el alelo PiZ humano con 1x1012 partículas de vector o VAAr9 que expresaba los miARN frente a AAT bajo el control del promotor híbrido de la beta-actina de pollo mediante la vena de la cola. (a) Se recogieron los sueros de cada cohorte semanalmente y se utilizaron para evaluar la concentración de Z-AAT mediante ELISA. (b) se analizaron las AAT procedentes de los lisados de hígados de ratones mediante inmunotransferencia tras la separación monomérica y polimérica. Las Z-AAT de 52 kDa procedían de los hígados procesados y separados en un combinado de monómeros y polímeros. Se llevó a cabo el análisis densitométrico de los combinados (c) monoméricos y (d) poliméricos utilizando el software Image J. Se utilizaron los valores iniciales de los sueros y aquellos recogidos dos semanas después de la administración de VAAr9 para analizar la función hepática como se determinó mediante la concentración de (e) ALT y (f) AST. Se expresaron los datos como promedios de grupo + SEM. *<0,05 como se determinó mediante un test de la t de student bilateral sin emparejar, comparando las cohortes de VAAr9 frente al valor inicial.
Figura 7 Evaluación in vitro del plásmido provírico de doble función. Se transfectaron simultáneamente células
HEK-293 con el plásmido Z-AAT humano y cualquiera del plásmido doó/e-6XmiR-CB-AAT, un control de GFP o
PBS. Se procesaron células para la determinación del ARN a las 72 horas y se analizaron para la determinación
de (a) PiZ-ARNm o (b) PiM ARNm con la qRT-PCR. Se expresaron los datos como promedios de grupo + SEM
(n=6). *<0,05 como se determinó mediante un test de la t de student bilateral sin emparejar.
Figura 8 Inactivación in vivo de Z-AAT con aumento simultáneo de M-AAT tras la administración del vector W 12 VAAr9 de doble función. Se inyectaron ratones transgénicos que expresaban el alelo PiZ humano con 1x10
partículas de vector o VAAr9 que expresaba los miARN frente a AAT y un ADNc de M-AAT natural etiquetado
con cMyc dirigido a de bajo el control del promotor híbrido de la beta-actina de pollo mediante la vena de la cola.
(a) Se recogieron los sueros de cada cohorte semanalmente y se utilizaron para evaluar la concentración de Z-
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AAT mediante ELISA específico de Z-AAT y los niveles de M-AAT mediante ELISA de CMyc. Se utilizó el ARN total de los hígados de ratones para evaluar la presencia de cualquiera de (b) ARNm de Z-AAT o (c) ARNm de M-AAT mediante qRT-PCR. Se expresaron los datos como promedios de grupo + SEM (n=6). *<0,05 como se determinó mediante un test de la t de student bilateral sin emparejar.
Figura 9 El miARN tiene mínimo impacto sobre los perfiles hepáticos del miARN endógeno. Se recogió ARN hepático 3 meses después de la administración de los animales inyectados con los siguientes vectores: 3XmiR- GFP/ntrón/co, Po//A-3XmiR-GFP, Doó/e-6XmiR-GFP, Se utilizaron CB-GFP junto con la forma de ARN de ratones PiZ sin tratar y ratones C57B16 silvestres para analizar una micromatriz de miARN. Cada grupo consistió en 5 muestras de ARN de ratón y se analizó de forma independiente con una única micromatriz de color (Cy5).
Descripción detallada de determinadas realizaciones de la invención
Se divulgan en el presente documento composiciones mejoradas mediante terapia génica y los métodos relacionados para tratar deficiencias de alfa-1 antitripsina (AAT denominado también algunas veces SERPINA1) utilizando los vectores víricos adenoasociados recombinantes (VAAr). En algunas realizaciones, se proporciona un vector no tóxico de doble función que es capaz de inactivar AAT mutante aumentando a la vez la expresión de la AAT natural. Los vectores basados en VAAr y los métodos relacionados proporcionan una expresión a largo plazo de los miARN terapéuticos y la expresión de la proteína natural. De acuerdo con otros aspectos, se proporcionan composiciones y métodos basados en VAAr que dirigen simultáneamente agentes de silenciamiento hacia el hígado para disminuir la expresión de Z-AAT y dirigir la expresión génica en otros sitios (por ejemplo, tejido pulmonar). En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos que son útiles para tratar la deficiencia de AAT inactivando la proteína PiZ (una proteína aAt mutante) aumentando al mismo tiempo a la vez los niveles de la proteína M-AAT (la proteína AAT natural). Se apreciará que las soluciones terapéuticas basadas en VAAr divulgadas en el presente documento pueden aplicarse a otros trastornos genéticos de ganancia de funciones o dominantes negativos tales como la enfermedad de Huntington, que anteriormente no han sido adecuados para una solución de terapia génica de vector único.
Determinados vectores de VAAR proporcionados en el presente documento incorporan secuencias de miARN que se dirigen al gen AAT impulsando a la vez le expresión reforzada del gen AAT natural (un gen AAT natural que no está dirigido por el miARN), consiguiendo de esta manera la inactivación simultánea de la AAT mutante, por ejemplo, en el hígado, con una expresión aumentada de la AAT natural. En un ejemplo, se inyectaron ratones transgénicos que expresan el alelo PiZ humano con los vectores del control o los vectores VAAr9 de doble función que expresan los miARN y un gen AAT reforzado con una etiqueta cMyc. En este ejemplo, los niveles de PiZ en suero se inactivaron consistentemente en un promedio del 80 % de los niveles de los valores iniciales siendo la inactivación estable y persistente durante un periodo de 13 semanas. En un ejemplo, las cohortes que recibieron los vectores de doble función presentaron la inactivación de PiZ AAT secretando a la vez niveles crecientes en suero de la AAT natural como se determinó mediante ELISA específicos de PiZ y PiM. En este ejemplo, la histología del hígado desveló una acumulación globular significativamente disminuida de PiZ AAT plegados incorrectamente en hepatocitos junto con una reducción en las infiltraciones inflamatorias cuando se compararon con los controles.
En un ejemplo, los perfiles de expresión globales del miARN del hígado fueron mínimamente afectados por los miARN artificiales administrados mediante el VAAr, mostrando solo unos pocos miARN diferencias estadísticamente significativas. En un ejemplo, se observó una diferencia en miR-1 que se redujo en los ratones PiZ transgénicos que recibieron vectores VAAr a los niveles normales que se observan en ratones B6 naturales. En un ejemplo, los niveles de miR-122 no se vieron afectados en todos los ratones que recibieron VAAR que expresaban miARN que se dirigía al gen AAT. En consecuencia, en algún ejemplo, los vectores VAAr de doble función son eficaces en la inactivación de PIZ AAT aumentando simultáneamente a la vez la AAT natural sin perturbar los perfiles hepáticos del miARN endógeno.
Deficiencia de a/fa-1 ant/tr/ps/na
La alfa-1 antitripsina (AAT), conocida también en la técnica como inhibidor de la serpina peptidasa, clado A (SERPINA1), es una proteína que funciona como un inhibidor de la proteinasa (proteasa). la AAT se produce principalmente en el hígado, pero funciona en los pulmones y el hígado, principalmente. Tal como se usa en el presente documento, el término, "deficiencia de alfa-1 antitripsina" se refiere a una dolencia resultante de una deficiencia de la AAT funcional en un sujeto. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene una deficiencia de AAT produce cantidades insuficientes de alfa-1 antitripsina. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene una deficiencia de AAT produce una AAT mutante. En algunas realizaciones, cantidades insuficientes de AAT o la expresión de AAT mutante dan como resultado un daño al pulmón y/o el hígado de un sujeto. En algunas realizaciones, la deficiencia de AAT conduce a enfisema y/o enfermedad hepática. Normalmente, las deficiencias de AAT son el resultado de uno o más defectos genéticos en el gen AAT. El uno o más defectos pueden estar presentes en una o más copias (por ejemp/o, alelos) del gen AAT en un sujeto. Normalmente, Las deficiencias de AAT son más comunes entre los europeos y los norteamericanos descendientes de europeos. Sin embargo, se pueden encontrar deficiencias de AAT también en sujetos de diferentes descendientes.
Los sujetos (por ejemplo, sujetos adultos) con graves deficiencias de AAT es probable que desarrollen enfisema. El
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inicio del enfisema se produce a menudo antes de los 40 años en sujetos que tienen deficiencias de AAT. El tabaquismo puede aumentar el riesgo de enfisema en sujetos que tienen deficiencias de AAT. Los síntomas de deficiencias de AAT incluyen insuficiencia respiratoria, con y sin esfuerzo, y otros síntomas comúnmente asociados a enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Otros síntomas de deficiencias de AAT incluyen síntomas de enfermedad hepática grave (por ejemplo, cirrosis), pérdida de peso no intencionada, y sibilancias. Un examen físico puede desvelar un tórax en tonel, sibilancias, o disminución de los sonidos respiratorios en un sujeto que tiene una deficiencia de AAT.
Las siguientes pruebas ilustrativas pueden ayudar con el diagnóstico de un sujeto que tiene una deficiencia de AAT: una prueba de alfa-1 antitripsina en sangre, examen de los gases de la sangre arterial, una radiografía de tórax, una TC del tórax, una prueba genética, y una prueba de la función pulmonar. En algunos casos, un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una deficiencia de aAt se somete a una prueba genética para detectar la presencia de una o más mutaciones en el gen AAT. En algunas realizaciones, una o más de las mutaciones relacionadas en la Tabla 1 se detectan en el sujeto.
En algunos casos, un médico puede sospechar que un sujeto tiene una deficiencia de AAT si el sujeto tiene enfisema en una edad temprana (por ejemplo, antes de los 45 años), un enfisema sin haber fumado nunca o sin haber estado expuesto a toxinas, enfisema con antecedentes familiares de una deficiencia de AAT, enfermedad hepática o hepatitis cuando no se pueden encontrar otra causa, enfermedad hepática o hepatitis y antecedentes familiares de deficiencia de AAT.
En algunas realizaciones, la deficiencia de alfa-1 antitripsina puede dar como resultado dos tipos distintos de patologías: una enfermedad pulmonar que es principalmente debida a la pérdida de la función antiproteasa, y una enfermedad hepática debida a una ganancia de funciones tóxicas de la proteína AAT mutante (por ejemplo PiZ-AAT mutante). Por ejemplo, debido a que el mutante AAT-PiZ presenta una toxicidad hepatocelular por ganancia de funciones que se acumula en el retículo endoplásmico, los tratamientos dirigidos a disminuir los niveles del ARNm de AAT-PiZ pueden mejorar o incluso invertir la patología del hígado. Además, la secreción aumentada de la proteína AAT funcional protege los pulmones de la neutrófilo elastasa y de las enzimas proteolíticas asociadas. Los solicitantes han desarrollado algunos vectores VAAr que proporcionan la administración de microARN dirigidos contra la AAT mutante, en el mismo casete provírico que un gen que codifica la AAT natural. En algunas realizaciones, los microARN se administran utilizando vectores de VAAr que se han utilizando anteriormente en ensayos clínicos.
Ácidos nucleicos aislados
En general, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados, que pueden ser vectores de VAAr, útiles para tratar una enfermedad genética. Los ácidos nucleicos aislados comprende una o más regiones que codifican uno o más ARN inhibidores que se dirigen a un ARNm endógeno de un sujeto. Los ácidos nucleicos aislados comprenden también normalmente una o más regiones que codifican uno o más ARNm exógenos. La(s) proteína(s) codificada(s) por los uno o más ARNm exógeno(s) puede ser diferente o no en la composición de la secuencia de la(s) proteína(s) codificada(s) por los uno o más ARNm endógeno(s). Por ejemplo, los uno o más ARN endógenos pueden codificar una versión natural y una versión mutante de una proteína concreta, tal como puede ser el caso cuando un sujeto es heterocigótico para una mutación concreta, y el ARNm exógeno puede codificar un ARNm natural de la misma proteína concreta. En este caso, normalmente, la secuencia del ARNm exógeno y el ARNm endógeno que codifican la proteína natural son suficientemente diferentes de tal manera que el ARNm exógeno no está dirigido por el uno o más ARN inhibidores. Esto puede lograrse, por ejemplo, introduciendo una o más mutaciones silenciosas en el ARNm exógeno de tal manera que codifique la misma proteína que el ARNm endógeno pero tenga una secuencia de ácido nucleico diferente. En este caso, el ARNm exógeno puede denominarse "reforzado". Como alternativa, el ARN inhibidor (por ejemplo, miARN) puede dirigirse a las regiones 5' y/o 3' no traducidas del ARNm endógeno. Estas regiones 5' y/o 3' pueden a continuación eliminarse o sustituirse en el ARNm exógeno de tal manera que el ARNm exógeno no esté dirigido por el uno o más ARN inhibidores.
En otro ejemplo, los uno o más ARN endógenos pueden codificar solo versiones mutantes de una proteína concreta, tal como puede ser el caso cuando un sujeto es homocigótico para una mutación concreta, y el ARNm exógeno puede codificar un ARNm natural de la misma proteína concreta. En este caso, la secuencia del ARNm exógeno puede reforzarse como se ha descrito anteriormente, o los uno o más ARN inhibidores pueden diseñarse para discriminar el ARNm endógeno mutado procedente del ARNm exógeno.
En algunos casos, los ácidos nucleicos aislados comprenden una primera región que codifica uno o más primeros miARN inhibidores (por ejemplo, miARN) que comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias con un ARNm endógeno de un sujeto para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm endógeno, en el que el ARNm endógeno codifica una primera proteína. Los ácidos nucleicos incluyen también normalmente una segunda región que codifica un ARNm exógeno que codifica una segunda proteína, en el que la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la primera proteína, en el que los uno o más ARN inhibidores no comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm exógeno. Se divulga también en el presente documento, que la primera
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región puede situarse en cualquier localización adecuada. La primera región puede situarse en una parte no traducida de la segunda región. Se divulga también en el presente documento, que la primera región puede situarse en cualquier parte no traducida del ácido nucleico, incluyendo, por ejemplo, un intrón, una región 5' o 3' no traducida, etc.
Como se divulga también en el presente documento, puede ser deseable situar la primera región en la dirección 5' del primer codón del ARNm exógeno. Por ejemplo, la primera región puede situarse entre el primer codón del ARNm exógeno y 2000 nucleótidos en la dirección 5' del primer codón. La primera región puede situarse entre el primer codón del ARNm exógeno y 1000 nucleótidos en la dirección 5' del primer codón. La primera región puede situarse entre el primer codón del ARNm exógeno y 500 nucleótidos en la dirección 5' del primer codón. La primera región puede situarse entre el primer codón del ARNm exógeno y 250 nucleótidos en la dirección 5' del primer codón. La primera región puede situarse entre el primer codón del ARNm exógeno y 150 nucleótidos en la dirección 5' del primer codón.
Se divulga también en el presente documento, que la primera región puede situarse en la dirección 3' de una parte de la segunda región que codifica la cola poli-A del ARNm exógeno. La primera región puede estar entre el último codón del ARNm exógeno y una posición de 2000 nucleótidos en la dirección 3' del último codón. La primera región puede estar entre el último codón del ARNm exógeno y una posición de 1000 nucleótidos en la dirección 3' del último codón. La primera región puede estar entre el último codón del ARNm exógeno y una posición de 500 nucleótidos en la dirección 3' del último codón. La primera región puede estar entre el último codón del ARNm exógeno y una posición de 250 nucleótidos en la dirección 3' del último codón. La primera región puede estar entre el último codón del ARNm exógeno y una posición de 150 nucleótidos en la dirección 3' del último codón.
El ácido nucleico puede comprender también una tercera región que codifica uno o más segundos ARN inhibidores (por ejemplo, miARN) que comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias para hibridarse e inhibir la expresión del ARNm endógeno. Como con la primera región, la tercera región puede situarse en cualquier localización adecuada. Por ejemplo, la tercera región puede situarse en una parte no traducida de la segunda región, incluyendo, por ejemplo, un intrón, una región 5' o 3' no traducida, etc. la tercera región puede situarse en la dirección 5' de una parte de la segunda región que codifica el primer codón del ARNm exógeno. La tercera región puede situarse en la dirección 3' de la segunda región que codifica la cola poli-A del ARNm exógeno. En algunos casos, cuando la primera región se sitúa en la dirección 5' del primer codón, la tercera región se sitúa en la dirección 3' de la parte de la segunda región que codifica la cola poli-A del ARNm exógeno, y viceversa.
En algunos casos, la primera región y las terceras regiones codifican el mismo conjunto de uno o más ARN inhibidores (por ejemplo, miARN). En otros casos, la primera región y la tercera regiones codifican un conjunto diferente de uno o más ARN inhibidores (por ejemplo, miARN). En algunos casos, los uno o más ARN inhibidores (por ejemplo, miARN) codificados en la primera región diana se dirigen a uno o más de los mismos genes que los uno o más ARN inhibidores (por ejemplo, miARN) codificados por la tercera región. En algunos casos, los uno o más ARN inhibidores (por ejemplos, miARN) codificados por la primera región no se dirigen a cualquiera de los mismos genes que los uno o más ARN inhibidores (por ejemplo, miARN) codificados por la tercera región. Debe apreciarse que los ARN inhibidores (por ejemplo, miARN) que se dirigen a un gen tienen suficiente complementariedad con el gen para unirse e inhibir la expresión (por ejemplo, mediante degradación o inhibición de la traducción) del miARN correspondiente.
La primera y la tercera regiones pueden codificar también un número diferente de ARN inhibidores (por ejemplo, miARN). Por ejemplo, la primera región y la tercera regiones pueden codificar de forma independiente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más ARN inhibidores (por ejemplo, miARN). La primera y la tercera regiones no se limitan a comprometer un ARN inhibidor concreto cualquiera, y pueden incluir, por ejemplo, un miARN, un ARNhc, un ARN TuD, una esponja de microARN, un ARN de sentido contrario, una ribozima, un aptámero, u otro ARN inhibidor adecuado. En algunos casos, la primera región y/o la tercera región comprende uno o más miARN. Los uno o más miARN pueden comprender una secuencia de ácido nucleico codificada por una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 17-19 y 21-23.
Tal como se divulga en el presente documento, la segunda proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la primera proteína. En consecuencia, la segunda proteína puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 88 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos un 99 % o más idéntica a la primera proteína. En algún caso, la segunda proteína difiere de la primera proteína en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos. En algunos casos, una o más de las diferencias entre la primera proteína y la segunda proteína son las sustituciones conservativas de aminoácidos. Como se usa en el presente documento, una "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera la carga relativa o las características de tamaño de la proteína en la que se realiza la sustitución del aminoácido. Se pueden preparar variantes de acuerdo con los métodos para alterar la secuencia polipeptídica conocida por una persona normalmente experta en la materia tal como se encuentras en las referencias que compilan dichos métodos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones realizadas entre aminoácidos en los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D. Por consiguiente, las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden proporcionar variantes funcionalmente equivalentes, u homólogos de una proteína
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endógena.
Debe apreciarse que en algunos casos, la segunda proteína puede ser una proteína marcadora (por ejemplo, una proteína fluorescente, una proteína de fusión, una proteína etiquetada, etc.). Dichas construcciones pueden ser útiles, por ejemplo, para estudiar la distribución de las proteínas codificadas en una célula o en un sujeto y son también útiles para evaluar la eficacia del direccionamiento y la distribución de VAAr en un sujeto.
En algunas realizaciones de los ácidos nucleicos aislados, la primera proteína es una proteína alfa 1 -antitri psina (AAT). Se proporciona una secuencia ilustrativa de una AAT natural en la SEQ ID NO: 1 o 2. En consecuencia, en algunos casos, el ARNm endógeno puede comprender la secuencia de ARN especificada por la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 5. El ARNm endógeno puede comprender la secuencia de ARN que se especifica por una cualquiera de las secuencias que se muestran en las SEQ ID NOS: 6-16. En algunos casos, la proteína AAT es una proteína AAT humana. La proteína AAT puede tener una secuencia como la que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o 2 o una o más mutaciones de la misma como se identifica en la Tabla 1, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3 o 4. El ARNm exógeno puede tener una o más mutaciones silenciosas en comparación con el ARNm endógeno. El ARNm exógeno puede comprender la secuencia de ARN especificada por la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 20. La secuencia de ARNm exógeno puede codificar o no una etiqueta peptídica (por ejemplo, una etiqueta myc, una etiqueta his, etc.) unida a la proteína codificada. A menudo, en una construcción utilizada con propósitos clínicos, la secuencia de ARNm exógeno no codifica una etiqueta peptídica unida a la proteína codificada.
Como se describe adicionalmente a continuación, los ácidos nucleicos aislados pueden comprender repeticiones terminales invertidas (RTI) de unos serotipos de VAA seleccionados entre el grupo que consiste en: VAA1, VAA2, VAA5, VAA6, VAA6.2, VaA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y variantes de los mismos. Los ácidos nucleicos aislados pueden incluir también un promotor unido operativamente con los uno o más ARN inhibidores, el ARNm exógeno, y/o el uno o más segundos ARN inhibidores. El promotor puede ser un promotor específico de tejido, un promotor constitutivo o un promotor inducible.
Tabla 1: Mutaciones en la AAT humana - Ingrese la ID ^ del gen: 5265
posición
posición
id del clúster Función alelo resto
posición
posición
94844794
1822 rs78787657 mutación de aminoácido A Lys [K] 1 417
cóntigo de referencia C Gln [Q] 1 417
94844797
1819 rs3191200 mutación de aminoácido C Pro [P] 1 416
cóntigo de referencia A Thr [T] 1 416
94844842
1774 rs17850837 mutación de aminoácido A Lys [K] 1 401
cóntigo de referencia C Gln [Q] 1 401
94844843
1773 rs1303 mutación de aminoácido C Asp [D] 3 400
cóntigo de referencia A Glu [E] 3 400
94844855
1761 rs13170 sinónimo T Phe[F] 3 396
cóntigo de referencia C Phe [F] 3 396
94844866
1750 rs61761869 mutación de aminoácido T Ser [S] 1 393
cóntigo de referencia C Pro [P] 1 393
94844887
1729 rs12233 mutación de aminoácido T Ser [S] 1 386
cóntigo de referencia C Pro [P] 1 386
94844912
1704 rs28929473 mutación de aminoácido T Phe [F] 3 377
cóntigo de referencia A Leu [L] 3 377
94844926
1690 rs12077 mutación de aminoácido T Trp [W] 1 373
cóntigo de referencia G Gly [G] 1 373
94844942
1674 rs1050520 sinónimo G Lys [K] 3 367
cóntigo de referencia A Lys [K] 3 367
94844947
1669 rs28929474 mutación de aminoácido A Lys [K] 1 366
cóntigo de referencia G Glu [E] 1 366
94844954
1662 rs1050469 sinónimo G Thr [T] 3 363
cóntigo de referencia C Thr [T] 3 363
94844957
1659 rs1802961 sinónimo T Leu [L] 3 362
cóntigo de referencia G Leu [L] 3 362
94844959
1657 rs1131154 mutación de aminoácido A Met [M] 1 362
cóntigo de referencia C Leu [L] 1 362
94844960
1656 rs13868 sinónimo A Val [V] 3 361
cóntigo de referencia G Val [V] 3 361
94844961
1655 rs1131139 mutación de aminoácido C Ala [A] 2 361
cóntigo de referencia T Val [V] 2 361
94844962
1654 rs72555357 desplazamiento del marco 1 361
cóntigo de referencia G Val [V] 1 361
94844965
1651 rs1802959 mutación de aminoácido A Thr [T] 1 360
cóntigo de referencia G Ala [A] 1 360
94844972
1644 rs10427 sinónimo C Val [V] 3 357
cóntigo de referencia G Val [V] 3 357
94844975
1641 rs9630 sinónimo T Ala [A] 3 356
cóntigo de referencia C Ala [A] 3 356
94844977
1639 rs67216923 desplazamiento del marco 1 356
desplazamiento del marco (15pb) 1 356
cóntigo de referencia G Ala [A] 1 356
94845814
1625 rs72555374 desplazamiento del marco 2 351
cóntigo de referencia T Leu [L] 2 351
94845845
1594 rs28929471 mutación de aminoácido A Asn [N] 1 341
cóntigo de referencia G Asp [D] 1 341
94845893
1546 rs1802962 mutación de aminoácido T Cys [C] 1 325
cóntigo de referencia A Ser [S] 1 325
94845902
1537 rs55704149 mutación de aminoácido T Tyr [Y] 1 322
cóntigo de G Asp [D] 1 322
referencia
94845914
1525 rs117001071 mutación de aminoácido T Ser [S] 1 318
cóntigo de referencia A Thr [T] 1 318
94845917
1521 rs35624994 desplazamiento del marco Ser [S] 3 316
desplazamiento del marco C Ser [S] 3 316
cóntigo de referencia CA Ser [S] 3 316
94847218
1480 rs1802963 mutación finalizadora T xxx [X] 1 303
cóntigo de referencia G Glu [E] 1 303
94847262
1436 rs17580 mutación de aminoácido T Val [V] 2 288
cóntigo de referencia A Glu [E] 2 288
94847285
1413 rs1049800 sinónimo C Asp [D] 3 280
cóntigo de referencia T Asp [D] 3 280
94847306
1392 rs2230075 sinónimo T Thr [T] 3 273
cóntigo de referencia C Thr [T] 3 273
94847351
1347 rs34112109 sinónimo A Lys [K] 3 258
cóntigo de referencia G Lys [K] 3 258
94847357
1341 rs8350 mutación de aminoácido G Trp [W] 3 256
cóntigo de referencia T Cys [C] 3 256
94847386
1312 rs28929470 mutación de aminoácido T Cys [C] 1 247
cóntigo de referencia C Arg [R] 1 247
94847407
1291 rs72552401 mutación de aminoácido A Met [M] 1 240
cóntigo de referencia G Val [V] 1 240
94847415
1283 rs6647 mutación de aminoácido C Ala [A] 2 237
cóntigo de referencia T Val [V] 2 237
94847452
1246 rs11558264 mutación de aminoácido C Gln [Q] 1 225
cóntigo de referencia A Lys [K] 1 225
94847466
1232 rs11558257 mutación de aminoácido T Ile [I] 2 220
cóntigo de referencia G Arg [R] 2 220
94847475
1223 rs11558265 mutación de aminoácido C Thr [T] 2 217
cóntigo de referencia A Lys [K] 2 217
94849029
1119 rs113813309 sinónimo T Asn [N] 3 182
cóntigo de referencia C Asn [N] 3 182
94849053
1095 rs72552402 sinónimo T Thr [T] 3 174
cóntigo de referencia C Thr [T] 3 174
94849061
1087 rs112030253 mutación de aminoácido A Arg [R] 1 172
cóntigo de referencia G Gly [G] 1 172
94849109
1039 rs78640395 mutación finalizadora T xxx [X] 1 156
cóntigo de referencia G Glu [E] 1 156
94849140
1008 rs11558263 mutación de aminoácido A Arg [R] 3 145
cóntigo de referencia C Ser [S] 3 145
94849151
997 rs20546 sinónimo T Leu [L] 1 142
cóntigo de referencia C Leu [L] 1 142
94849160
988 rs11558261 mutación de aminoácido A Ser [S] 1 139
cóntigo de referencia G Gly [G] 1 139
94849201
947 rs709932 mutación de aminoácido A His [H] 2 125
cóntigo de referencia G Arg [R] 2 125
94849228
920 rs28931572 mutación de aminoácido A Asn [N] 2 116
cóntigo de referencia T Ile [I] 2 116
94849303
845 rs28931568 mutación de aminoácido A Glu [E] 2 91
cóntigo de referencia G Gly [G] 2 91
94849325
823 rs111850950 mutación de aminoácido A Thr [T] 1 84
cóntigo de referencia G Ala [A] 1 84
94849331
817 rs113817720 mutación de aminoácido A Thr [T] 1 82
cóntigo de referencia G Ala [A] 1 82
94849345
803 rs55819880 mutación de aminoácido T Phe [F] 2 77
cóntigo de referencia C Ser [S] 2 77
94849364
784 rs11575873 mutación de aminoácido C Arg [R] 1 71
cóntigo de referencia A Ser [S] 1 71
94849381
767 rs28931569 mutación de aminoácido C Pro [P] 2 65
cóntigo de referencia T Leu [L] 2 65
94849388
760 rs28931570 mutación de aminoácido T Cys [C] 1 63
cóntigo de referencia C Arg [R] 1 63
94849466
682 rs11558262 mutación de aminoácido G Ala [A] 1 37
cóntigo de referencia A Thr [T] 1 37
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656 rs11558259 mutación de aminoácido G Arg [R] 2 28
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cóntigo de referencia A Gln [Q] 2 28
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600 rs11558260 sinónimo T Ile [I] 3 9
cóntigo de referencia C Ile [I] 3 9
codón de inicio 1
Métodos de uso
Se divulgan también en el presente documento métodos para expresar la proteína alfa 1 -antitripsina (AAT) en un sujeto. Normalmente, el sujeto tiene o se sospecha que tiene una deficiencia de AAT. Los métodos implican normalmente administrar a un sujeto una cantidad eficaz de cualquier virus adenoasociado recombinante (VAAr) que hospeda cualquiera de los ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento. En general, la "cantidad eficaz" de un VAAr se refiere a una cantidad suficiente para estimular la respuesta biológica deseada. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz se refiere a la cantidad de VAAr eficaz para transducir una célula o tejido ex vivo. En otras realizaciones, la cantidad eficaz se refiere a la cantidad eficaz para dirigir la administración de VAAr a un sujeto. Como apreciarán las personas normalmente expertas en la materia, la cantidad eficaz del VAA recombinante de la invención varía dependiendo de dichos factores tales como el criterio de valoración biológico deseado, la farmacocinética de los producto de expresión, la dolencia que se está tratando, el modo de administración, y el sujeto. Normalmente, el VAAr se administra con un transportador farmacéuticamente aceptable.
El sujeto puede tener una mutación en un gen AAT. La mutación puede dar como resultado una expresión disminuida de la proteína AAT natural (normal). El sujeto puede ser homocigótico para la mutación. El sujeto puede ser heterocigótico para la mutación. La mutación puede ser una mutación de aminoácido. La mutación puede ser una mutación finalizadora. La mutación puede ser una mutación relacionada en la Tabla 1. La mutación puede dar como resultado la expresión de una proteína AAT mutante. La proteína mutante puede ser un mutante con ganancia de funciones o un mutante con pérdida de funciones. La proteína AAT mutante puede ser incapaz de inhibir la actividad de la proteasa. La proteína AAT mutante puede fracasar en plegarse adecuadamente. La proteína AAT mutante puede dar como resultado la formación de agregados de proteínas. La proteína AAT mutantes puede dar como resultado la formación de glóbulos de AAT intracelulares. La mutación puede dar como resultado una sustitución de glutamato a lisina en la posición 366 del aminoácido de la proteína precursora de acuerdo con la secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID NO: 3. En la proteína madura, esta misma mutación se produce en la posición 342 del aminoácido (SEQ ID NO: 4). Los métodos pueden implicar también determinar si el sujeto tiene una mutación. Por consiguiente, los métodos pueden implicar obtener un genotipo del gen AAT en el sujeto.
En algunos casos, tras la administración del VAAr, se determina el nivel de expresión de la primera proteína y/o la segunda proteína en el sujeto. La administración puede llevarse a cabo en una o más ocasiones. Cuando la administración se lleva a cabo en una o más ocasiones, el nivel de la primera proteína y/o el nivel de la segunda proteína en el sujeto se determinan a menudo después de al menos una administración. En algunos casos, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 85 % tras la administración del VAAr. El nivel en suero de la primera proteína en el sujeto puede reducirse en al menos un 90 % tras la administración del VAAr. El nivel en suero de la primera proteína en el sujeto puede reducirse en al menos un 95 % tras la administración del VAAr. Sin embargo, en algunos casos, el nivel en suero de la primera proteína en el sujeto se reduce en al menos un 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, o al menos el 80 % tras la administración del VAAr.
El nivel (por ejemplo, el nivel en suero) de la primera proteína en el sujeto puede reducirse en al menos un 85 % en 2 semanas tras la administración del VAAr. El nivel en suero de la primera proteína en el sujeto puede reducirse en al menos un 90 % en 2 semanas tras la administración del VAAr. El nivel en suero de la primera proteína en el sujeto puede reducirse en al menos un 85 % en 4 semanas de administración del VAAr. La reducción puede observarse en un plazo de 1 día, en un plazo de 2 días, en un plazo de 3 días, en un plazo de 4 días, en un plazo de 5 días, en un plazo de 6 días, en un plazo de 1 semana, en un plazo de 2 semanas, en un plazo de 3 semanas, en un plazo de 4 semanas o más.
La reducción en el nivel de la de la primera proteína puede sostenerse durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 7 semanas, al menos 8 semanas, al menos 9 semanas, al menos 10 semanas, al menos 11 semanas o más. En algunos casos, tras 7 semanas de administración del VAAr, el nivel en suero de la primera proteína está a un nivel de al menos un 50 % en comparación con el nivel en sueros de la primera proteína antes de la administración del VAAr. En determinados casos, tras 7 semanas de administración del VAAr, el nivel en suero de la primera proteína está a un nivel de al menos un 75 % en comparación con el nivel en sueros de la primera proteína antes de la administración del VAAr.
En algunos casos, tras la administración del VAAr se evalúa al menos un parámetro del resultado clínico asociado a
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la deficiencia de AAT en el sujeto. Normalmente, el parámetro del resultado clínico evaluado tras la administración del VAAr se compara con el parámetro del resultado clínico determinado en un momento antes de la administración del VAAr para determinar la eficacia del VAAr. A menudo, una mejora en el parámetro del resultado clínico tras la administración del VAAr indica la eficacia del VAAr. Se puede utilizar cualquier parámetro de resultado clínico adecuado. Normalmente, el parámetro del resultado clínico es indicativo de los uno o más síntomas de una deficiencia de AAT. Por ejemplo, el parámetro del resultado clínico se puede seleccionar entre el grupo que consiste en: niveles en suero de la primera proteína, niveles en suero de la segunda proteína, presencia de glóbulos de AAT intracelulares, presencia de foci inflamatorios, capacidad respiratoria, capacidad de toser, producción de flema, frecuencia de resfriado de pecho o neumonía, y tolerancia para el ejercicio. Los glóbulos de AAT intracelulares o foci inflamatorios se evalúan en tejidos afectados por la deficiencia de AAT, incluyendo, por ejemplo, tejido pulmonar o tejido hepático.
VAA recombinantes
En algunos aspectos, la invención proporciona VAA aislados. Como se usa en el presente documento con respecto a los VAA, el término "aislado" se refiere a un VAA que se ha aislado de su entorno natural (por ejemplo, de una célula hospedadora, tejido, o sujeto) o se ha producido de forma artificial. Los VAA aislados pueden producirse utilizando métodos recombinantes. Dichos VAA se denominan en el presente documento "VAA recombinantes". Los VAA recombinantes (VAAr) tienen preferentemente capacidades de direccionamiento específicas de tejidos, de tal manera que un transgén del VAAr se administrará específicamente a uno o más tejido(s) predeterminados. La cápsida del VAA es un importante elemento en la determinación de estas capacidades de direccionamiento específicas de tejidos. De este modo, se puede seleccionar un VAAr que tiene una cápsida adecuada para el tejido que constituye el objetivo. En algunas realizaciones, el VAAr comprende una proteína de la cápsida que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a uno cualquiera de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y variantes de los mismos. Los VAA recombinantes transportan normalmente un ácido nucleico aislado de la invención.
Son bien conocidos en la técnica los métodos para obtener VAA recombinantes que tienen una proteína de la cápsida deseada (Véase, por ejemplo, el documento US 2003/0138772). Las proteínas de la cápsida de VAA que se pueden usar en los VAAr de la invención incluyen, por ejemplo, las divulgadas en G. Gao, et al., J. Virol, 78(12):6381-6388 (junio de 2004); G. Gao, y col., Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (13 de mayo de 2003); documentos US 2003-0138772, US 2007/0036760, US 2009/0197338, y WO 2010/138263. Normalmente, los métodos implican cultivar una célula hospedadora que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápsida de VAA o fragmento de la misma; un gen rep funcional; un vector VAA recombinante compuestos por repeticiones terminales invertidas (RTI) de VAA y un transgén; y suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del vector VAA recombinante en las proteínas de la cápsida de VAA.
Se pueden proporcionar los componentes que se van a cultivar en la célula hospedadora para empaquetar un vector VAAr en una cápsida de VAA a la célula hospedadora en trans. Como alternativa, se pueden proporcionar uno cualquiera o más de los componentes requeridos (por ejemplo, un vector de VAA recombinante, secuencias rep, secuencias cap, y/o funciones auxiliares) por una célula hospedadora estable que se ha diseñado mediante ingeniería genética para contener uno o más de los componentes requeridos utilizando los métodos conocidos por los expertos en la materia. De forma más adecuada, dicha célula hospedadora estable contendrá los componente(s) requeridos bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, los componente(s) requeridos pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo. Se proporcionan en el presente documento ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados. En otra alternativa más, una célula hospedadora estable seleccionada puede contener componente(s) seleccionados bajo el control de un promotor constitutivo y otros componente(s) seleccionados bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una célula hospedadora estable que se deriva de células 293 (que contienen funciones E1 auxiliares bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contienen las proteínas rep y/o car bajo el control de promotores inducibles. Un experto en la materia puede generar otras células hospedadoras estables adicionales.
Pueden administrarse el vector VAA recombinante, las secuencias rep, las secuencias cap, y las funciones auxiliares requeridas para producir el VAAr de la invención a la célula hospedadora empaquetada utilizando cualquier elemento genético adecuado (vector). El elemento genético seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo aquellos descritos en el presente documento. Son conocidos por los expertos en la manipulación de ácidos nucleicos los métodos utilizados para construir cualquier realización de la presente invención e incluyen la ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. De forma similar, son bien conocidos los métodos para generar viriones de VAAr y la selección de un método adecuado no es una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993) y patente de Estados Unidos n.° 5.478.745.
En algunas realizaciones, se pueden producir VAA recombinantes utilizando el método de transfección triple (por ejemplo, como se describe en detalles en la patente de Estados Unidos n.° 6.001.650). Normalmente, los VAA recombinantes se producen transfectando una célula hospedadora con un vector VAA recombinante (que
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comprende un transgén) que se va a empaquetar en partículas VAA, un vector VAA de función auxiliar, y un vector de función accesoria. Un vector VAA de función auxiliar codifica las secuencias de "función auxiliar del VAA" (es decir, rep y cap), que funcionan en trans para la reproducción productora y la encapsidación del VAA. Preferentemente, el vector VAA de función auxiliar soporta una producción eficaz del vector VAA sin generar ningunos viriones del VAA natural detectables (es decir, viriones del VAA que contienen los genes rep y cap funcionales). Los ejemplos no limitantes adecuados para el uso con la presente invención pueden incluir pHLP19, descrito en la patente de Estados Unidos n.° 6.001.650, y el vector pRep6cap6, descrito en la patente de Estados Unidos n.° 6.156.303. El vector de función accesoria codifica las secuencias de nucleótidos para las funciones víricas no derivadas de VAA y/o las funciones celulares tras las cuales, VAA es dependiente de la replicación (es decir, "funciones accesorias"). Las funciones accesorias incluyen aquellas funciones requeridas para la replicación de VAA, incluyendo, sin limitación, aquellos restos implicados en la activación de la transcripción génica de VAA, el corte y empalme del ARNm de VAA específico de etapa, replicación del ADN de VAA, síntesis de productos de expresión de cap, y ensamblaje de la cápsida de VAA. Las funciones accesorias basadas en virus se pueden derivar de cualesquiera virus auxiliares conocidos tales como adenovirus, herpesvirus (otros diferentes del virus del herpes simple de tipo 1), y virus vaccinia.
Se divulgan también en el presente documento células hospedadoras transfectadas. El término "transfección" se utiliza para referirse a la captación del ADN extraño por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. Se conocen generalmente en la técnica numerosas técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al. (1981) Gene 13:197. Se pueden usar dichas técnicas para introducir uno o más ácidos nucleicos exógenos, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácidos nucleicos, en células hospedadoras adecuadas.
Una "célula hospedadora" se refiere a cualquier célula que alberga, o es capaz de albergar, una sustancia de interés. A menudo, una célula hospedadora es una célula de mamífero. Se puede utilizar una célula de mamífero como un receptor de una construcción auxiliar de VAA, un plásmido de un minigen de VAA, un vector de función accesoria, u otro ADN de transferencia asociado a la producción de VAA recombinantes. La expresión incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. De este modo, una "célula hospedadora" como se usa en el presente documento puede referirse a una célula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exógeno. Se entiende que la progenie de una única célula precursora puede no se necesariamente completamente idéntica en la morfología o el complemento del ADN total que la célula precursora original, debido a mutación natural, accidental, o deliberada.
Se divulgan también en el presente documento células aisladas. Como se usa en el presente documento con respecto a una célula, el término "aislado" se refiere a una célula que se ha aislado de su entorno natural (por ejemplo, de un tejido o sujeto). Como se usa en el presente documento, la expresión "línea celular" se refiere a una población de células capaz de un crecimiento continuo o prolongado y de la división in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una única célula precursora. Se sabe además en la técnica que se pueden producir cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o la transferencia de dichas poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea de células referida pueden no ser precisamente idénticas a las células o cultivos ancestrales, y la línea de células referida incluye dichas variantes. Como se usa en el presente documento, la expresión "célula recombinante" se refiere a una célula en la que se ha introducido un segmento de ADN exógeno, tal como un segmento que conduce a la transcripción de un polipéptido biológicamente activo o la producción de un ácido nucleico biológicamente tal como un ARN.
Como se usa en el presente documento, el término "vector" incluye cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, cromosoma artificial, virus, virión, etc., que es capaz de replicación cuando se asocia a los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias génicas entre células. De este modo, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores víricos. En algunas realizaciones, se contemplan vectores útiles por ser aquellos vectores en los que el segmento de ácido nucleico que se va a transcribir se sitúa bajo el control de la transcripción de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o introducida en la maquinaria sintética, requerida para iniciar la transcripción específica de un gen. Las frases "situado operativamente" "bajo control" o "bajo el control de la transcripción" significan que el promotor está en la localización y orientación correcta en relación con el ácido nucleico para controlar el inicio de la ARN polimerasa y la expresión del gen. La frase "vector o construcción de expresión"significa cualquier tipo de construcción genética que contiene un ácido nucleico en el que parte o toda la secuencia que codifica el ácido nucleico es capaz de transcribirse. En algunas realizaciones, la expresión incluye la transcripción del ácido nucleico, por ejemplo, para generar un producto polipeptídico biológicamente activo o un ARN inhibidor (por ejemplo, ARNhc, miARN) de un gen transcrito.
Los métodos anteriores para el empaquetado de vectores recombinantes en las cápsidas de VAA deseadas para producir los VAAr de la invención no se entiende que sean limitantes y otros métodos adecuados serán evidentes para los técnicos expertos.
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Vectores de VAA recombinantes
Los ácidos nucleicos aislados de la invención pueden ser vectores de VAA recombinantes. El vector de VAA recombinantes puede empaquetarse en una proteína de la cápsida y administrarse a un sujeto y/o administrarse a una célula diana seleccionada. Los "vectores de VAA recombinantes (VAAr) están normalmente compuestos de, como mínimo, por un transgén y sus secuencias reguladoras, y las repeticiones terminales invertidas (RTi) 5' y 3' de VAA. El transgén puede comprender, como se divulga en otras parte del presente documento, una o más regiones que codifican uno o más ARN inhibidores (por ejemplo, miARN) que comprenden un ácido nucleico que se dirige a un ARNm endógeno de un sujeto. El transgén puede comprender también una región que codifica un ARNm exógeno que codifica una proteína (por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a la proteína codificada por el ARNm endógeno), en el que uno o más ARN inhibidores no se dirigen al ARNm endógeno.
Las secuencias de VAA del vector comprenden normalmente las secuencias 5' y 3' de repeticiones terminales invertidas que actúan en cis (Véase, por ejemplo, B. J. Carter, en "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, págs. 155 168 (1990)). Las secuencias de RTI tienen aproximadamente 145 pb de longitud. Preferentemente, de forma sustancial las secuencias completas que codifican las RTI se utilizan en la molécula, aunque es permisible algún grado de modificación menor de estas secuencias. La capacidad de modificar estas secuencias de RTI están comprendidas en las capacidades del experto en la materia. (Véase, porejemplo, textos tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); y K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)). Un ejemplo de dicha molécula empleada en la presente invención es un plásmido "que actúa en cis" que contiene el transgén, en el que la secuencia del transgén seleccionado y los elementos reguladores asociados están flanqueados por las secuencias 5' y 3' de RTI de VAA. Las secuencias de RTI de VAA pueden obtenerse de cualquier vAa conocido, incluyendo los tipos de VAA de mamíferos identificados actualmente.
Además de los elementos mayores identificados anteriormente para el vector de VAA recombinante, el vector incluye también elementos de control convencionales que están unidos operativamente con elementos del transgén de una manera que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectadas con el vector o infectada con el virus producido por la invención. Como se usa en el presente documento, las secuencias "unidas operativamente" incluyen las secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés. Las secuencias de control de la expresión incluyen un inicio de la transcripción adecuado, las secuencias de terminación, del promotor y del potenciador; las señales de procesamiento del ARN eficaces tales como las señales de corte y empalme y las señales de poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNM citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desea, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Se conocen en la técnica y se pueden utilizar numerosas secuencias de control de la expresión, incluyendo promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejidos.
Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de codificación) y las secuencias reguladoras están unidas de manera operativa cuando se unen covalentemente de tal manera que colocan la expresión de la transcripción de la secuencia de ácido nucleico bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias de ácidos nucleicos se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operativamente si la inducción de un promotor en las secuencias 5' reguladoras da como resultado la transcripción de la secuencia de codificación y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora de dirigir la transcripción de las secuencias de codificación, o (3) interfiere con la capacidad de transcibir el ARN correspondiente para traducirse en una proteína. De este modo, una región promotora se uniría operativamente a una secuencia de ácido nucleico si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de la secuencia de ADN de tal manera que el transcrito resultante pueda traducirse en la proteína o el polipéptido deseados. De manera similar, dos o más regiones de codificación se unen de manera operativa cuando se unen de tal manera que su transcripción a partir de un promotor común da como resultado la expresión de dos o más proteínas que se han traducido en marco. En algunas realizaciones, las secuencias unidas operativamente dan como resultado una proteína de fusión. En algunas realizaciones, las secuencias de codificación unidas operativamente dan como resultado un ARN funcional (por ejemplo, miARN).
Para los ácidos nucleicos que codifican las proteínas, se inserta generalmente una secuencia de poliadenilación tras las secuencias del transgén y antes de la secuencia 3' de RTI de VAA. Una construcción VAAr útil en la presente invención puede contener también un intrón, localizado deseablemente entre la secuencia promotora/potenciadora y el transgén. Una posible secuencia intrón se deriva de SV-40 y se denomina secuencia intrón T de SV-40. Cualquier intrón puede proceder del gen de la p-actina. Otro elemento de vector que se puede usar es un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica en las células hospedadoras puede variar entre especies, tejidos o tipos de células, pero deberá en general incluir, según sea
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necesario, secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción, respectivamente, tales como la secuencia TATA, la secuencia de protección, la secuencias CAAT, los elementos potenciadores, y similares. Especialmente, dichas secuencias reguladoras 5' no transcritas incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control de la transcripción del gen unido operativamente. Las secuencias reguladoras pueden incluir también secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en la dirección 5' según se desee. Los vectores de la invención pueden incluir opcionalmente secuencias 5' líderes o secuencias señal. La elección y el diseño de un vector adecuado está comprendida en la capacidad y el criterio de una persona normalmente experta en la materia.
Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el virus del sarcoma de Rous retrovírico (VSR), el promotor LTR (opcionalmente, con el potenciador del VSR), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente, con el potenciador del CMV), el promotor del SV40, y el promotor de la dihidrofolato reductasa. Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y se pueden regular por compuestos suministrados de forma exógena, factores ambientales tales como temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación concreto de la célula, o únicamente en la replicación de células. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles a partir de varias fuentes comerciales, incluyendo, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito otros muchos sistemas y una persona experta en la materia puede seleccionarlos fácilmente. Los ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores suministrados de forma exógena incluyen el promotor de la metalotioneína (MT) de oveja inducible mediante cinc, el promotor vírico del tumor de mama (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de la polimerasa T7, el promotor de la ecdisona de insecto, el sistema represible por tetraciclina, el sistema inducible por tetraciclina, el sistema inducible por RU486 y el sistema inducible por rapamicina. Otros tipos adicionales de promotores inducibles que pueden ser útiles en el contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación concreto de la célula, o únicamente en la replicación de células. En otra realización, se utilizará el promotor nativo, o un fragmento del mismo, para el transgén. En una realización adicional, se pueden usar también otros elementos de control de la expresión nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak, para imitar la expresión nativa.
En algunas realizaciones, las secuencias reguladoras imparten capacidades de expresión génica específicas de tejidos. En algunos casos, las secuencias reguladoras específicas de tejidos se unen a factores de transcripción específicos de tejidos que induce la transcripción de una manera específica del tejido. Dichas secuencias reguladoras específicas de tejidos (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) son bien conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de la p-actina de pollo.
En algunas realizaciones, se incorporan uno o más sitios de unión para uno o más de los miARN en un transgén de un vector VAAr, para inhibir la expresión del transgén e uno o más tejidos de un sujeto que alberga los transgenes, por ejemplo, tejidos no hepáticos, tejidos no pulmonares. El técnico experto apreciará que se pueden seleccionar los sitios de unión para controlar la expresión de un transgén en un tejido de manera específica. Los sitios diana del miARN en el ARNm pueden estar en la 5' UTR, la 3' UTR o en la región de codificación. Normalmente, el sitio diana está en la 3' UTR del ARNm. Además, el transgén puede diseñarse de tal manera que múltiples miARN regulen el ARNm reconociendo el mismo o múltiples sitios. La presencia de múltiples sitios de unión al miARN puede dar como resultado una acción cooperativa de múltiples RISC y proporciona una inhibición muy eficaz de la expresión. La secuencia del sitio diana puede comprender un total de 5-100, 10-60, o más nucleótidos. La secuencia del sitio diana puede comprender al menos 5 nucleótidos de la secuencia del sitio de unión al gen diana.
En algunas realizaciones, la capacidad de clonación del vector de ARN recombinantes puede estar limitada y un sitio de codificación deseado puede implicar la sustitución completa del genoma de 4,8 kilobases del virus. Los genes grandes pueden, por lo tanto, en algunos casos, no ser adecuados para el uso en un vector de VAA recombinante normalizado. El técnico experto apreciará que están disponibles opciones en la técnica para superar una capacidad de codificación limitada. Por ejemplo, las RTI de VAA de los dos genomas pueden hibridarse para formar concatámeros de cabeza a cola, duplicando casi la capacidad del vector. La inserción de sitios de corte y empalme permite la eliminación de las RTI del transcrito. Serán evidentes para el técnico experto otras opciones para superar una capacidad de clonación limitada.
Administración de VAA recombinante
Los VAAr se administran en cantidades suficientes para transfectar las células de un tejido deseado y para proporcionar suficientes niveles de transferencia y expresión génica sin efectos adversos excesivos. Las rutas de administración convencional y farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no de forma limitativa, la administración directa al tejido seleccionado (por ejemplo, tejido hepático, tejido pulmonar) y la administración por vía subcutánea, intrapancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratecal, intracerebral, oral, intraperitoneal, mediante inhalación o mediante otras rutas. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea. La administración de determinados VAAr a un sujeto puede ser, por ejemplo, mediante administración en el torrente sanguíneo del sujeto. La administración en el torrente sanguíneo puede ser mediante inyección en una vena, una arteria, o cualquier otro conducto vascular.
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En determinadas circunstancias será deseable administrar las construcciones terapéuticas basadas en VAAr en composiciones farmacéuticas formuladas de manera adecuada, divulgadas en el presente documento tanto por vía subcutánea, intrapancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratecal, intracerebral, oral, intraperitoneal, o mediante inhalación.
Un experto en la materia puede apreciar que la administración deseable de construcciones terapéuticas basadas en VAAr puede incluir también la administración ex vivo. En algunas realizaciones, la administración ex vivo comprende (1) el aislamiento de células o tejido(s) de interés de un sujeto, (2) poner en contacto las células o tejido(s) con los VAAr en cantidades suficientes para transfectar las células o tejidos para proporcionar niveles suficientes de transferencia génica sin efectos adversos excesivos, y (3) transferir las células o tejidos posteriormente al sujeto. En algunas realizaciones, las células o tejidos pueden cultivarse ex vivo durante algunos días, antes y/o después de la transfección.
Las células o tejidos pueden aislarse de un sujeto mediante cualquier método adecuados. Por ejemplo, las células o tejidos pueden aislarse mediante cirugía, biopsia (por ejemplo, biopsia de un tejido de la piel, tejido pulmonar, tejido hepático, tejido adiposo) o una serie de fluidos biológicos tal como sangre. En algunas realizaciones, las células se aíslan de médula ósea. En algunas realizaciones, las células se aíslan de tejido adiposo. En algunas realizaciones, las células se aíslan de un lipoaspirado. Se conocen en la materia los métodos adecuados para aislar células de tejido adiposo para la transfección ex vivo. Véase, por ejemplo, Kuroda, M., et al., (2011), Journal of Diabetes Investigation, 2: 333-340; Kouki Morizono, et al. Human Gene Therapy. Enero de 2003, 14(1): 59-66; y Patricia A. Zuk, Viral Transduction of Adipose-Derived Stem Cells, Methods in Molecular Biology, 1, Volumen 702, Adipose- Derived Stem Cells, Parte 4, Páginas 345-357.
En algunas realizaciones, las células aisladas comprenden citoblastos, citoblastos pluripotentes, citoblastos derivados de lipoaspirados, células hepáticas (por ejemplo, hepatocitos), hemocitoblastos, citoblastos mesenquimales, células estromales, células hematopoyéticas, células sanguíneas, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales, u otras células adecuadas. En algunas realizaciones, las células que se van a transfectar son citoblastos pluripotentes inducidos preparados a partir de células aisladas de un sujeto.
En una realización, las células o tejido(s) se transducen a una multiplicidad de infección (MOI) de al menos 10 unidades infecciosas (u.i.) de un VAAr por célula (por ejemplo, 10, 100, 1,000, 5,000, 10,000, 100,000 o más u.i.) o en un número de copias víricas funcionalmente equivalente. En una realización, las células o tejido(s) se transducen a una MOI de 10 a 10.000 u.i. Las rutas para la transferencia de las células o tejido(s) transfectados en un sujeto incluyen, aunque no de forma limitativa, subcutánea, intrapancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intravascular, intramuscular, intratecal, intracerebral, intraperitoneal, o mediante inhalación. En algunas realizaciones, las células transfectadas se administran mediante inyección en la vena porta hepática. En algunas realizaciones, las células transfectadas se administran por vía intravascular. Los métodos para la administración ex vivo de VAAr son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Naldini, L. Nature Reviews Genetics (2011) 12, 301-315, Li, H. et al. Molecular Therapy (2010) 18, 1553-1558, y Loiler et al. Gene Therapy (2003) 10, 1551-1558).
Composiciones de VAA recombinantes
Los VAAr pueden administrarse a un sujeto en composiciones de acuerdo con cualquiera de los métodos adecuados conocidos en la técnica. Los VAAr, suspendidos preferentemente en un transportador fisiológicamente compatible (por ejemplo, en una composición), pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, un ser humano, ratón, rata, gato, perro, ovejas, conejo, caballo, vaca, cabra, cerdo, cobaya, hámster, pollo, pavo, o un primate no humano (por ejemplo, un macaco). Las composiciones de la invención pueden comprender un VAAr solo o en combinación con uno o más virus diferentes (por ejemplo, un segundo VAAr codificante que tiene uno o más transgenes diferentes).
Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente transportadores adecuados a la vista de la indicación para la cual se dirige el VAAr. Por ejemplo, un transportador adecuado incluye una solución salina, que puede formularse con varias soluciones tamponantes
(por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros transportadores ilustrativos incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. Otros más serán evidentes al técnico experto.
Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además de los VAAr y el(los) transportador(es), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes, o estabilizantes químicos. Los conservantes ilustrativos adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los estabilizantes químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
La dosis de viriones de VAAr requerida para conseguir un efecto deseado o "efecto terapéutico", por ejemplo, las unidades de dosis en genomas de vectores/por kilogramo de peso corporal (gv/kg), variarán en función de varios factores, incluyendo, aunque no de forma limitativa: la ruta de administración del VAAr, el nivel de expresión del gen
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o el ARN requerido para conseguir un efecto terapéutico, la enfermedad o trastorno específico que se está tratando, y la estabilidad del producto génico o de ARN. Un experto en la materia puede determinar fácilmente un intervalo de dosis del virión de VAAr para tratar un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno concreto basándose en los factores anteriormente mencionados, así como otros factores que son bien conocidos en la técnica. Una cantidad eficaz del VAAr está generalmente en el intervalo de entre aproximadamente 10 pl a aproximadamente100 ml de solución que contiene entre aproximadamente 109 a 1016 copias de genoma por sujeto. Se pueden utilizar otros volúmenes de solución. El volumen utilizado dependerá normalmente, entre otras cosas, del tamaño del sujeto, la dosis del VAAr, y la ruta de administración. Por ejemplo, para la administración intravenosa, se puede usar un volumen en el intervalo de 10 pl a 100 pl, 100 pl a 1 ml, 1 ml a 10 ml, o más. En algunos casos, es adecuada una dosificación entre aproximadamente 1010 a 1012 copias del genoma del VAAr por sujeto. En algunas realizaciones, el
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VAAr se administra a una dosis de 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , o 10 copias de genoma por sujeto. En algunas
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realizaciones, el VAAr se administra a una dosis de 10 , 10 , 10 , 10 , o 10 copias de genoma por kg.
En algunas realizaciones, las composiciones de VAAr se formulan para reducir la agregación de partículas de VAA en la composición, particularmente, cuando están presentes concentraciones de VAAr elevadas (por ejemplo, ~1013 CG/ml o más). Son bien conocidos en la técnica los métodos para reducir la agregación de los VAAr e, incluyen, por ejemplo, la adición de tensioactivos, el ajuste del pH, el ajuste de la concentración salina, etc. (Véase, por ejemplo, Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178)
La formulación de excipientes y soluciones transportadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la técnica, así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones concretas descritas en el presente documento en varios regímenes de tratamiento. Normalmente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente un 0,1 % de principio activo o más, aunque el porcentaje del(de los) principio(s) activo(s) puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 1 o 2 % y aproximadamente 70 % u 80 % o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de principio activo en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal manera que se obtendrá una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, la ruta de administración, la vida media del producto, así como otras consideraciones farmacológicas serán contemplados por un experto en la materia de preparar dichas formulaciones farmacéuticas, y como tales, pueden ser deseables varias dosificaciones y regímenes de tratamiento.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos. En muchos casos, la forma es estéril y fluida en la medida en que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede lograrse la absorción prolongada de la composición inyectable mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para la administración de una solución acuosa inyectable, por ejemplo, la solución puede tamponarse de forma adecuada, si es necesario, y el diluyente líquido se vuelve en primer lugar isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, se puede emplear un medio acuoso estéril que conocerán los expertos en las materia. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y se añade tanto a 1000 ml de fluido de hipodermocilisis como se inyecta en el sitio propuesto de la infusión, (véase, por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la dolencia del hospedador. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el hospedador individual.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el VAAr activo en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados en el presente documento, según sea necesario, seguido de esterilización por filtrado. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y criodesecado, que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de
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los mismos previamente esterilizada por filtración.
Las composiciones de VAAr divulgadas en el presente documento pueden también formularse o forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína, y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en varias formas farmacéuticas tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos, y similares.
Como se usa en el presente documento, "transportador" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes de retraso de la absorción, tampones, soluciones transportadoras, suspensiones, coloides, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Pueden incorporarse también principios activos complementarios en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones alérgicas o reacciones adversas similares cuando se administran a un hospedador.
Se pueden usar vehículos de administración tales como liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas, y similares, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células hospedadoras adecuadas. En particular, transgenes administrados por el vector VAAr se pueden formular para la administración tanto encapsulados en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o una nanopartícula o similar.
Dichas formulaciones pueden preferirse para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos de las construcciones de VAAr divulgadas en el presente documento. La formación y el uso de liposomas es generalmente conocido por los expertos en la materia. Recientemente, se desarrollaron liposomas con estabilidad en suero y tiempos medios de circulación mejorados (Patente de Estados Unidos n.° 5.741.516). Adicionalmente, se han descrito diversos métodos de preparación de liposomas y de preparaciones similares a liposomas como transportadores potenciales de fármacos (Patentes de Estados Unidos n.° 5.567.434; 5.552.157; 5.565.213; 5.738.868 y 5.795.587).
Se han usado con éxito liposomas en numerosos tipos de células que son normalmente resistentes a la transfección mediante otros procedimientos. Además, los liposomas está libres de limitaciones en la longitud del ADN que son típicas de sistemas de administración basados en virus. Los liposomas se han usado eficazmente para introducir genes, fármacos, agentes radioterapéuticos, virus, factores de transcripción y efectores alostéricos en varias líneas celulares cultivadas y animales. Además, se han completado con éxito algunos ensayos clínicos que examinan la eficacia de la administración de fármacos mediada por liposomas.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (denominadas también vesículas multilamelares (MLV). Las MLV tienen generalmente diámetros desde 25 nm a 4 pm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 ANG, que contienen una solución acuosa en el núcleo.
Como alternativa, se pueden usar formulaciones de nanocápsulas del VAAr. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar sustancias de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0,1 pm) deben diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contemplan para el uso nanopartículas de polialquil- cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requerimientos.
Además de los métodos de administración descritos anteriormente, se contemplan también las siguientes técnicas como métodos alternativos de administrar las composiciones de VAAr a un hospedador. Se ha utilizado y descrito la sonoforesis (es decir, los ultrasonidos) en la patente de Estados Unidos n.° 5.656.016 como un dispositivo para potenciar la velocidad y la eficacia de permeación del fármaco en ya través del sistema circulatorio. Otras alternativas a la administración de fármacos contempladas son la inyección intraósea (patente de Estados Unidos n.° 5.779.708), dispositivos de microchip (Patente de Estados Unidos n.° 5.797.898), formulaciones oftálmicas (Bourlais et al., 1998), matrices transdérmicas (patentes de Estados Unidos números 5.770.219 y 5.783.208) y administración controlada por retroalimentación (patente de Estados Unidos n.° 5.697.899).
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Kits y composiciones relacionadas
Los ácidos nucleicos aislados, las composiciones, vectores de VAAr, los VAAr, etc. descritos en el presente documento pueden, en algunas realizaciones, ensamblarse en kits farmacéuticos o diagnósticos o de investigación para facilitar su uso en aplicaciones terapéuticas, diagnósticas o de investigación. Un kit puede incluir uno o más recipientes que alojan los componentes de la invención y las instrucciones para el uso. Específicamente, dichos kits pueden incluir uno o más agentes descritos en el presente documento, junto con instrucciones que describen la aplicación prevista y el uso adecuado de estos agentes. En determinadas realizaciones, los agentes en un kit pueden estar en una formulación y dosificación farmacéuticas adecuadas para una aplicación concreta y para un método de administración de los agentes. Los kits para propósitos de investigación pueden contener los componentes en concentraciones o cantidades adecuadas para realizar diversos experimentos.
El Kit puede diseñarse para facilitar el uso de los métodos descritos en el presente documento por los investigadores y puede tomar muchas formas. Cada una de las composiciones del kit, cuando sea aplicable, puede proporcionarse en forma líquida (por ejemplo, en solución), o en forma sólida, (por ejemplo, un polvo seco). En determinados casos, algunas de las composiciones pueden ser constituibles o procesables de otra forma (por ejemplo, en una forma activa), por ejemplo, mediante la adición de un disolvente adecuado u otra especie (por ejemplo, agua o un medio de cultivo celular), que puede proporcionarse o no con el kit. Como se usa en el presente documento, "instrucciones" puede definir un componente de instrucción y/o promoción, y normalmente implica instrucciones escritas sobre o asociadas al envase de la invención. Las instrucciones pueden incluir también cualquier instrucción oral o electrónica proporcionada de cualquier forma, de tal manera que un usuario reconocerá claramente que las instrucciones se van a asociar al kit, por ejemplo, audiovisual (por ejemplo, cinta, DVD, etc.), Internet, y/o comunicaciones basadas en web, etc. las instrucciones escritas pueden estar en una forma prescrita por un organismo gubernamental regulador de la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyas instrucciones pueden reflejar también la homologación por el organismo de la fabricación, uso o venta para la administración animal.
El kit puede contener uno cualquiera o más de los componentes descritos en el presente documento en uno o más recipientes. Como ejemplo, en una realización, el kit puede incluir instrucciones para mezclar uno o más componentes del kit y/o aislar y mezclar una muestra y aplicar a un sujeto. El kit puede incluir un recipiente que aloja los agentes descritos en el presente documento. Los agentes pueden estar en la forma de un líquido, gel o sólido (polvo). Los agentes pueden prepararse de forma estéril, envasarse en una jeringuilla y enviarse refrigerados. Como alternativa, pueden alojarse en un vial o en otro recipiente para el almacenamiento. Un segundo recipiente puede tener otros agentes preparados de forma estéril. Como alternativa, el kit puede incluir los principios activos premezclados y enviados en una jeringuilla, un vial, tubo, u otro recipiente. El kit puede tener uno o más o todos los componentes requeridos para administrar los agentes a un sujeto, tal como una jeringuilla, dispositivos de aplicación tópica o IV tubos con aguja y bolsa.
Las realizaciones ilustrativas de la invención se describirán con más detalle en los siguientes ejemplos. Estas realizaciones son ilustrativas de la invención, que un experto en la materia reconocerá que no está limitada a las realizaciones ilustrativas.
Ejemplos
En la extensión que los Ejemplos contienen materia sujeto que no está comprendida en el alcance de las reivindicaciones, que la materia sujeto está incluida meramente a fines de referencia.
Introducción a los Ejemplos
La deficiencia en alfa-1 antitripsina (AAT) es una de las enfermedades más comúnmente heredadas en Norteamérica, con una frecuencia portadora de aproximadamente 4 % en la población de Estados Unidos. La mutación más común surge como un cambio de un único par de bases (Glu342Lys, PI*Z, SEQ ID 4) y conduce a la síntesis de la proteína Z-AAT mutante, que se polimeriza y acumula en los hepatocitos, impidiendo su secreción eficaz. La deficiencia relativa posterior de la AAT en suero predispone a la enfermedad pulmonar crónica. Doce a 15 % de los pacientes PI*ZZ homocigóticos desarrolla una significativa enfermedad hepática, que varía de la hepatitis neonatal, ictericia colestásica y cirrosis al inicio de cirrosis en adultos y carcinoma hepatocelular. Se considera que la lesión hepática es una consecuencia de la acumulación patológica de polímeros de proteína Z-AAT mutante en el retículo endoplásmico de los hepatocitos.
Las estrategias para aliviar la enfermedad hepática se centran en disminuir la presencia de la proteína Z-AAT mutante en los hepatocitos mediante tanto la reducción de la expresión de la proteína mutante, como el aumento de su proteolisis o secreción. Se han llevado a cabo los estudiosin vivo de un ARN interferente pequeño específico de alelo (ARNip) dirigido contra PI*Z AAT en el modelo de ratón transgénico de deficiencia AAT. Los estudiosin vitro usando clones de ARNhc impulsados por U6 en las estructuras principales de los virus adenoasociados recombinantes (VAAr) han identificado una secuencia eficaz de un ARNip específico de alelo (denominado p10) que puede reducir los niveles de la proteína Pi*Z AAT minimizar la inactivación de la Pi*M AAT normal. Utilizando la cápsida de VAA8, se empaquetó rAAV-U6-p10 y se administró mediante inyección en la vena porta hepática en
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ratones transgénicos Pi*Z para dirigir el direccionamiento in vivo del hígado. Un ARNip no específico empaquetado en VAA8 administrado de forma similar, rAAV-U6-NC, sirvió como control (NC). Los datos histológicos de estos estudios desvelaron zonas de eliminación completa o parcial de la proteína Z-AAT en el hígado 10 días después de la inyección en la cohorte p10. El análisis de los niveles de Z-AAT en suero muestra una reducción cinéticamente significativa durante 4 semanas después de la inyección en la cohorte p10 cuando se comparó con la cohorte del control NC. Para examinar la especificidad del alelo, se administró simultáneamente Pi*M-AAT empaquetado en VAA8 con cada construcción de ARNhc. Para los grupos p10 + Pi*M y NC + Pi*M, hubo una expresión considerable de AAT en el hígado por la tinción histológica y no hubo diferencias significativas en los niveles de AAT en suero.
La mutación Pi*Z (Glu342Lys) en el exón 5 de la alfa-1 antitripsina (AAT) produce una deficiencia de AAT en plasma (A1AD) que expone el tejido pulmonar a un ataque proteolítico descontrolado y puede dar como resultado un enfisema. La aAt mutante de Pi*Z se retiene en los hepatocitos y produce una enfermedad hepática en ~12 % de pacientes con la deficiencia. La administración de copias naturales de AAT no aborda la patología hepática, por lo tanto, las estrategias de regulación por defecto, incluyendo el ARNip se han dirigido al mensaje de la AAT en los hepatocitos. debido a que el mutante AAT-PiZ presenta una toxicidad hepatocelular por ganancia de funciones que se acumula en el retículo endoplásmico, la disminución de los niveles del ARNm de AAT-Pi*Z (y por tanto, la proteína) pueden mejorar o incluso invertir la patología hepática. Además, la secreción aumentada de la proteína AAT funcional protegerá teóricamente los pulmones de la neutrófilo elastasa y de las enzimas proteolíticas asociadas.
Las estrategias descritas en el presente documento incluyen el desarrollo de tratamientos mediados por VAAr para aumentar los niveles en suero de la AAT normal y regular por defecto el miARN que utiliza la AAT mutante. Para conseguir la expresión y la secreción de la AAT natural a la vez que se reducen simultáneamente los niveles de AAT-PiZ. Se seleccionaron tres secuencias de miARN que se dirigen al gen AAT en algunas realizaciones y se clonaron en dos localizaciones diferentes del casete de expresión. La primera localización está en el intrón del promotor CB que impulsa la expresión de GFP, y la segunda localización está entre la secuencia poliA y el extremo 3' del gen, se creó también una construcción adicional con miARN en ambas localizaciones. Estas tres construcciones se empaquetaron en VAAr8 y se administraron a ratones transgénicos que expresaban la forma mutante de AAT (hAAT Pi*Z) humana a 6X1011 partículas de vector por ratón mediante la vena de la cola. Estos experimentos mostraron aproximadamente de 60 % a 80 % de reducción en la proteína AAT secretada en suero de ratones cuando se comparó con el grupo al que se inyectó el vector CB-GFP del control. Se determinó que la construcción 3XD era la más eficaz para la inactivación de hAAT, en algunas realizaciones. La inmunohistología del hígado mostró también el aclaramiento de la proteína hAAT Pi*Z a las 4 semanas después de la administración del vector. La utilización de la secuencia de AAT con cambios de pares de bases silenciosos para evitar el silenciamiento del miARN permite la regulación en exceso de la expresión del gen AAT natural inactivando simultáneamente a la vez los niveles de proteína mutante con una única construcción del vector de VAAr.
Materiales y métodos
empaquetamiento y purificación de VAAr9: Se generaron los vectores VAA9 recombinantes utilizados en este estudio, se purificaron y se titularon mediante el UMass Gene Therapy Vector Core como se ha descrito anteriormente.
Cultivo y transfección celular: Se cultivaron células HEK-293 en medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero de feto de bovino al 10 % y 100 mg/l de penicilina-estreptomicina (Gemini Bio-products n.° Cat 400-109, Woodland, CA). Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C °C con un 5 % de CO2. Los plásmidos se transfectaron transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000 (n.° de Cat 1 1668-027 Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes de los cultivos celulares o las lisis de células se recogieron de acuerdo con ello.
ELISAS de AAT en suero
ELISA DE AAT humana: Se detectaron los niveles totales de la proteína AAT mediante ELISA. Placas de 96 pocillos de unión extra alta, (Immulon 4, n.° de cat 3855 Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) se revistieron con 100 pl de anticuerpo de cabra dirigido contra hAAT (diluido 1:500; n.° de cat 55111MP Biomedicals, irvine CA) en tampón de Voller durante la noche a 4 °C. Tras el bloqueo con leche en polvo desnatada al 1 % en PBS-T, se crearon las curvas patrón por duplicado (hAAT; n.° de cat 09, Athens Research and Technology, Athens, Georgia), y muestras desconocidas diluidas en serie se incubaron en la placa a temperatura ambiente durante 1 h, se incubó un segundo anticuerpo, anticuerpo de cabra dirigido contra hAAT (HRP) (diluido 1:5000, n.° de cat ab7635-5, Abcam Inc, Cambridge, MA) a temperatura ambiente durante 1 h. La placa se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS)-Tween 20 entre las reacciones. Tras la reacción con sustrato de peroxidasa de TMB (KPL, Inc, Gaithersburg, Maryland) se detuvieron las reacciones añadiendo 2 N H2SO4 (n.° de cat A300-500 Fisher, Pittsburg, PA). Se leyeron las placas a 450 nm en un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices).
ELISA DE Z-AAT: Se detectaron los niveles de proteínas Z-AAT humanas mediante ELISA utilizando anticuerpo de revestimiento (anticuerpo de ratón dirigido contra alfa-1-antitripsina-Z diluido 1:100, clon F50.4.1 del anticuerpo
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monoclonal n.° de cat MON5038, Cell Sciences, Inc., Cantón, MA). Se crearon las curvas patrón utilizando suero de ratón PIZ con BSA al 5 % (n.° de cat B4287 Sigma, St. Louis, MO). Muestras desconocidas diluidas en serie se incubaron en la placa a 37 °C durante 1 h, con anticuerpo secundario y tras seguir la etapa fueron iguales que el ELISA de la AAT humana patrón descrito anteriormente, excepto que el anticuerpo secundario se diluyó en BSA al 5 % y se incubó en la placa a 37 °C durante 1 h.
ELISA de c-Myc: Se cuantificaron los niveles de la etiqueta C-Myc mediante un método similar al que se ha descrito anteriormente. Las placas se revistieron con un anticuerpo contra c-Myc (anticuerpo de cabra dirigido contra c-Myc diluido 1:1000, MA n.° de cat AB19234 Abcam, Cambridge MA), a continuación se bloquearon las placas con BSA al 5 % a 37 °C durante 1 h. Se generaron las curvas patrón a partir de sobrenadantes recogidos de células transfectadas con c-Myc-AAT.
RT-PCR en tiempo real
Extracción de ARN: El tejido de hígado de ratón congelado rápidamente se molió con una mano de mortero y un mortero y se utilizó para extraer el ARN pequeño o total utilizando el kit de aislamiento del miARN ARN mirVana (n.° de cat AM1560 Ambion, Austin, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
qRT-PCR de microRNA: se cebó el microARN y se transcribió de forma inversa con el kit de transcripción inversa TaqMan MicroRNA (n.° de cat 4366596, Applied Biosystems Foster City, CA). Se llevó a cabo la PcR cuantitativa por duplicado en cebadores de RT-miARN específicos de gen y Applied Biosystems diseñó los ensayos de la PCR, utilizando la mezcla TaqMan Gene Expression Master (n.° de cat 436916, Applied Biosystems, Foster City, CA) en un instrumento de la PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA).
qRT-PCR de PIM y PIZ: Se cebó el ARN total con oligo(dT) y se transcribió de forma inversa con el kit SuperScript III First-Strand Synthesis para la RT-PCR (n.° de Cat 18989-51, Invitrogen, Carlsbad, CA). Se llevó a cabo la PcR cuantitativa mediante parejas de cebadores específicas de gen. PIM y PIZ comparten los cebadores, pero difieren en las sondas. Cebador directo CCAAgGcCGTGCATAAGG (SEQ ID NO: 29), Cebador inverso: GGCCCCAGCAGCTTCAGT (SEQ ID NO: 30), sonda PIZ: 6FAM-CTGACCATCGACAAGA-MGBNFQ (SEQ ID NO: 31) y la sonda PIM: 6FAM-CTGACCATCGACGAGA-MGBNFQ (SEQ ID NO: 32), Se llevaron a cabo las reacciones utilizando la mezcla TaqMan Gene Expression Master (n.° de cat 436916, Applied Biosystems, Foster City, CA) en un instrumento de la PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Ratones transgénicos Z-AATy administración de VAAr9: Se han descrito anteriormente los ratones transgénicos PiZ utilizados en este estudio8. Se llevaron a cabo todos los procedimientos animales de acuerdo con las directrices del Institutional Animal Care and Use Committee de la University of Massachusetts Medical School. Se administró el vector VAA9 recombinante mediante inyección en la vena de la cola de ratón. Se llevaron a cabo las inyecciones en las venas de los vasos más accesibles que corren a lo largo de la longitud de ambos aspectos laterales de la cola agarrando la cola en el extremo distal. Se llevaron a cabo los sangrados mediante preinyección en la vena facial y cada semana, después de la administración del VAAr9 en la vena de la cola hasta la finalización de los estudios.
Histología del hígado: Para la determinación de los cambios histológicos, se fijaron las muestras de hígado en formalina tamponada neutra al 10 % (Fisher Scientific), y se incluyeron en parafina. Se tiñeron secciones (5 pm) con hematoxilina y eosina y ácido de Schiff periódico (PAS) con o sin digestión de diastasa.
Se llevó a cabo la inmunohistoquímica para hAAT tal como se ha descrito anteriormente 14, en resumen, se desparafinaron secciones de tejido (5 pm), se rehidrataron, y se bloquearon para la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3 % en metanol durante 10 minutos. Para detectar la expresión de hAAT, se incubaron secciones de tejido con anticuerpo primario, anticuerpo de conejo dirigido contra AAT humana (1:800; RDI/Fitzgerald Industries, Concord, MA), durante la noche a 4 °C. Se detectó la tinción utilizando los kits ABC-Rb-HRP y DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Análisis de imágenes para histología. Los portas se tiñeron para PASD para eliminar el glicógeno. Se crearon imágenes digitales completas de los portas utilizando Aperio Cs ScanScope (V, CA) y se analizaron utilizando el algoritmo de recuento de píxeles positivos (versión 9). Los glóbulos positivos para PASD se expresaron como la proporción de píxeles positivos fuertes a píxeles totales utilizando un valor hue de 0,9, una anchura de hue de 0,15 y un umbral de saturación del color de 0,25. El umbral de intensidad para la positividad fuerte se ajustó a un límite superior de 100.
Análisis del monómero y el polímero de la proteína Z-AAT. Para la separación de las proteínas soluble/insoluble, se añadieron 10 mg del hígado completo a 2 ml de tampón a 4 °C (50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0), 150 mmol/l de NaCl, 5 mmol/l de KCl, 5 mmol/l de MgCl2, Triton X-100 al 0,5 %, y 80 pl de solución madre de inhibidor completo de la proteasa). Se homogeneizó el tejido en un homogeneizador Dounce preenfriado durante 30 repeticiones, a continuación se sometió a vortización vigorosamente. Una alícuota de 1 ml se pasó a través de una boquilla de calibre 28 10 veces. Se determinó la concentración de proteína total de la muestra, y se distribuyó en alícuotas una muestra de proteínas hepáticas totales de 5-pg y se centrifugó a 10.000 g durante 30 minutos a 4 °C. El
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sobrenadante (fracción (S) soluble) se retiró inmediatamente en tubos recientes; se tuvo un extremo cuidado en evitar la perturbación del aglomerado (fracción (l) insoluble). El aglomerado de polímeros insolubles (fracción l) se desnaturalizó y solubilizó mediante la adición de 10 l de tampón de lisis celular enfriado (Triton X-100 al 1 %, desoxicolato al 0,05 %, 10 mmol/l de EDTA en solución salina tamponada con fosfato), se sometió a vortización durante 30 segundos, se sonicó en hielo durante 10 minutos y se sometió a vortización. A cada muestra soluble e insoluble, se añadieron 2,5 de tampón de muestra (50 %, 5 de tampón de muestra (dodecil sulfato de sodio al 5 %, glicerol al 50 %, 0,5 mol/l de Tris (pH 6,8)), mercaptoetanol al 10 %, ddH2O al 40 %) a un volumen del 50 % del volumen de la muestra. Las muestras se sometieron a ebullición y se cargaron para la electroforesis en gel con gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE); cantidades iguales de la proteína total hepática se cargaron por pares solubles-insolubles en experimentos cuantitativos. Se llevó a cabo la densitometría utilizando el software Image J (NIH, Bethesda, MD).
Químicas del suero: Se analizaron las muestras de suero mediante el UMass Mouse Phenotyping Center Analytical Core, utilizando el Analizador de Química Clínica NExCT (Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, West Caldwell, NJ). Se analizó el suero para la alanina aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST) de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes.
Análisis de Expresión de la micromatriz de miARN: Se aislaron 8 pg del ARN total a partir de hígados de ratón congelados rápidamente utilizando el kit de aislamiento del miARN mirVana (Ambion). El diseño experimental incluyó seis grupos con muestras de ARN de 5 ratones cada uno que se evaluaron en matrices de un único color para un total de 30 micromatrices independientes. En resumen, el ARN se marcó con Cy5 y se hibridó en chips microfluídicos pParaFlo de micromatriz de doble canal (LC Sciences) que contenían sondas de miARN para miARN maduros de ratón disponibles en la base de datos Sanger miRBase (Release 16.0) como se ha descrito anteriormente15. Cada una de las sondas de detección punteadas consistió en una secuencia de nucleótidos complementaria con una secuencia de miARN específico y un separador sin nucleótidos largos que se extendió a la secuencia específica lejos de la superficie del chip. Se recogieron imágenes de fluorescencia utilizando un barrido láser (GenePix 4000B, Molecular Device) y se digitalizaron utilizando un software de análisis de imágenes Array-Pro (Media Cybernetics). Se analizaron los datos incluyendo la sustracción del fondo, utilizando un método LOWESS (regresión ponderada localmente) sobre los datos sustraídos del fondo como se ha descrito anteriormente 16 La normalización es para eliminar las variaciones relacionadas con el sistema, dichas variaciones en la cantidad de muestra, y las diferencias en la ganancia de señales de los escáneres. Se determinó la detección para ser positiva solo si los transcritos tenían una intensidad de la señal superior a 3x (SD de fondo) y una mancha VC<0,5. La VC como se calculó por (SD)/(intensidad de la señal), y en la que las sondas de repetición en la matriz produjeron señales de al menos un 50 % de las sondas de repetición por encima del nivel de detección. Los datos se representaron como un Log2 de la transformación. Los datos se filtraron adicionalmente para eliminar los miARN con valores de intensidad (normalizados) por debajo de un valor umbral de 32 a través de todas las muestras. Se llevaron a cabo los test de la t entre los grupos de muestra del "control" y el "test" donde los valores T se calcularon para cada miARN, y los valores p se calcularon a partir de la distribución t teórica. Si p< 0,05, se representa gráficamente como una mancha roja en una gráfica de dispersión log.
Los miARN artificiales son tan eficaces como los ARNhc en la regulación por defecto de la alfa-1 antitripsina in vitro
Se ha demostrado una eficaz inactivación de Z-AAT in vivo e in vitro utilizando ARNhc expresado a partir de un promotor pol III U6 utilizando VAAr8. A fin de determinar si una solución alternativa y potencialmente más segura podría emplearse utilizando la expresión del miARN impulsada por la polimerasa II, se clonaron tres miARN distintos que se dirigían al gen AAT humano en el intrón de un promotor híbrido de la beta-actina de pollo (CB) que impulsa la expresión de GFP (Tabla 2 y Figura 1). Se llevó a cabo una comparación in vitro de los ARNhc impulsados por U6 utilizados anteriormente frente a los miARN impulsados por pol II en las líneas de células que expresaban el gen Pi*Z AAT humano. Inicialmente, se observó un retraso en la inactivación de Z-AAT con los miARN a las 24 h, pero se observó una reducción eventual comparable de ~35 % en la proteína AAT secretada en 48 y 72 h para ambas construcciones en comparación con los controles de GFP (Figura 1a). Se observó una reducción similar en los niveles intracelulares de la proteína AAT evaluados a partir de aglomerados celulares a las 72 h (Figura 1 b).
Los niveles de miARN expresados en VAAr9 median en la inactivación eficaz de VAA in vivo
Basándose en los hallazgos in vitro, la construcción con las tres secuencias de miARN intrónico (3XmiR intrónico) junto con las otras tres construcciones de miARN individuales dirigidas contra la Z-AAT se empaquetaron en VAAr y se ensayaron in vivo en los ratones transgénicos PiZ. Cinco grupos de ratones de 5 semanas de edad recibieron: rAAV9-CB-GFP, 3xmiR-GFPintrónicode rAAV9-CB o vector con uno cualquiera de los miARN individuales mediante una inyección en la vena de la cola con 5,0x 1011 partículas de vector (vps) de VAA9r. Se sangraron ratones semanalmente durante un total de 5 semanas para comprobar los niveles de Z-AAT en circulación y se sacrificaron en el día 35 posterior a la administración de un VAAr. Como se muestra en la Figura 2, los ratones recibieron 3X miARN intrónicos (3Xmir intrónico) que tenía en promedio una disminución sostenida del 50-60 % en los niveles de AAT en suero en comparación con los valores de los criterios iniciales mientras que los ratones que recibieron los únicos miARN intrónicos tuvieron un promedio de inactivación del 30 % en comparación con los ratones que recibieron el vector GFP del control.
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Para evaluar el efecto que estaba teniendo la inactivación mediada por miARN a nivel del órgano, los hígados de estos ratones se evaluaron 5 semanas después de la administración del VAAr para la abundancia de la Z-AAT intracelular. Como se puede apreciar a partir de las inmunotinciones hepáticas de la AAT humana en la Figura 3, hubo una marcada disminución en la tinción positiva para AAT en los hígados que pertenecen a ratones en el grupo tratado con 3XmiR-GFP de VAAr9 intrónico. Además de la drástica reducción en la tinción positiva para AAT, hubo de igual forma una drástica disminución en los glóbulos de AAT intracelulares como se determinó por una tinción positiva PAS resistente a la diastasa (PASD). De forma importante, la reducción en la tinción PASD y hAAT se acompañó por una reducción en los foci inflamatorios en el grupo de GFP (Figura 3). Esto sugiere que la reducción en la acumulación de hAAT en los hígados de ratones PiZ puede aliviar la inflamación como se evidenció por la reducción en las infiltraciones inflamatorias.
El inicio y el grado de inactivación son dependientes de la localización del miARN en el casete de expresión
Aunque la administración de 3 miARN en el intrón del promotor CB fue satisfactoria en disminuir la expresión de Z- AAT, estuvo poco claro si la localización de los miARN en el casete de expresión tuvo cualquier efecto sobre su eficacia. Se investigó si la clonación de 3 miARN entre el extremo 3' del gen GFP y la cola poliA tendría un efecto sobre la cinética de la inactivación de AAT. Se evaluó igualmente si la clonación de los 3 miARN en ambas localizaciones aumentaría (por ejemplo, duplicaría) la cantidad de miARN que se produce y conduce a una potenciación adicional de la inactivación de AAT. Como en los experimentos anteriores, ratones Z-AAT transgénicos recibieron 5x1011 partículas de vector de vectores VAAr9 que expresaban los miARN tanto del intrón (3XmiR intrónico), la región poliA (PolyA-3XmiR) o en ambas localizaciones en una vez (Doble-6XmiR) (véase el diagrama en la Figura 4). El análisis de los niveles de Z-AAT en suero desveló que en cuatro semanas the PoliA-3XmiR y Doble-6XmiR fueron más eficaces que el vector 3XmiR intrónico al aclarar los niveles de Z-AAT en suero en un 8570 %, y, en algunos casos, en hasta un 95 % con el vector Doble-6XmiR (Figura 4). Se llevó a cabo el análisis de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real del tejido hepático procedente de estos ratones para evaluar la abundancia de cada uno de los tres vectores artificiales derivados de miRs (910, 914, 943). Como se ha indicado en la figura 5, los vectores PolyA-3XmiR y Doble-6XmiR produjeron aproximadamente dos veces más copias de cada uno de los miR (Figura 5).
Habiendo conseguido una inactivación a corto plazo clínicamente significativa de más del 50 % de los niveles de la proteína Z-AAT, fue necesario determinar si se sostendría su inactivación durante largos periodos de tiempo. Se administraron una vez de nuevo las tres construcciones de vectores se administraron mediante la vena de la cola a un título ligeramente mayor de 1,0x1012 partículas de vector por ratón y se controlaron los niveles de Z-AAT en suero semanalmente durante 3 meses. El inicio de la inactivación de los tres vectores varió en 7 semanas, el vector Doble- 6XmiR consiguió un 90 % de inactivación 2 semanas después de la administración, el PoliA-3XmiR alcanzó esta marca en la tercera semana mientras que el 3XmiR intrónico permaneció en el intervalo de 50-65 % de inactivación durante las primeras 7 semanas (Figura 6a). Se llevó a cabo el análisis adicional de los homogenados de hígado para determinar si esta reducción estaba en los combinados de monómeros o polímeros de Z-AAT en todos los grupos. Las fracciones de Z-AAT de monómeros y polímeros se separaron en condiciones no desnaturalizantes tras lo cual, las fracciones se desnaturalizaron y se evaluaron cuantitativamente mediante inmunotinción. Se observó una reducción en todos los grupos en el combinado monomérico 3 meses después del tratamiento del miARN. El análisis densitométrico de las bandas mostró significativas diferencias en el PoliA-3XmiR y Doble-6XmiR en comparación con ratones tratados con un vector del control (Figura 6 b-d). Esta inactivación observada a las dos semanas en la Figura 6a estuvo acompañada por una reducción significativa en la ALT y AST en suero en el grupo Doble-6XmiR con claras tendencias de disminución en los otros dos grupos que expresan un miR anti-AAT (Figura 6e y 6f). Aunque los niveles de Z-AAT aumentaron ligeramente en los animales de los grupos Doble-6XmiR y PoliA-3XmiR entre las semanas 7 y 13, los tres vectores se estabilizaron a un nivel sostenido de aproximadamente un 75 % de inactivación de Z-AAT durante el resto del estudio (Figura 6).
Administración in vitro de los miARN contra Z-AAY y corrección génica con M-AAT utilizando un único vector
Un vector de doble función que aumentaría simultáneamente los niveles de proteína de la proteína M-AAT natural, abordando por tanto la enfermedad hepática producida por la ganancia de funciones tóxica de los polímeros Z-AAT y la pérdida de funciones producida por M-AAT en circulación, se evaluó. Para conseguir esto, se sustituyó el gen GFP con un gen AAT natural que tenía cambios de pares de bases silenciosos en los sitios diana del miARN, haciéndolo de esta manera impermeable a la inactivación mediada por miARN. Se transfectaron simultáneamente células HEK- 293 con dos plásmidos, uno de los plásmidos expresó Z-AAT y el otro fue cualquiera del Doble-6XmiR-GFP, Doble- 6XmiR-AAT (que contienen el gen AAT reforzado, inactivado-impermeable) o un control. Las células transfectadas se incubaron durante 72 h y se recogió el ARN de los aglomerados celulares para un análisis de la RT-PCR de los transcritos Z-AAT y M-AAT. El análisis de los niveles del ARNm de Z-AAT desveló los Doble-6XmiR-GFP y Doble- 6XmiR-AAT produjo una inactivación significativa de hasta 37 veces en las copias de ARNm de Z-AAT mRNA en comparación para las células transfectada de forma simulada (Figura 7a). Además, la RT-PCR cuantitativa de los transcritos de MAAT naturales procedentes del mismo combinado de ARN, desveló que la construcción Doble- 6XmiR-AAT reguló en exceso la expresión de M-AAT en más de 100 vece sobre los niveles endógenos observados en las células transfectadas del control (Figura 7b).
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Administración in vivo de vectores de doble función
Tomando en consideración los hallazgos in vitro así como el inicio más rápido y la variabilidad disminuida en la inactivación observada con los vectores Doble-6XmiR y PoliA-3XmiR (Figura 6), se ensayaron ambas configuraciones como vectores de doble función in vivo. Tres cohortes de siete ratones cada una se dosificaron con 1,0x1012 partículas de vector con cualquiera de un control de GFP, Doble-6XmiR-CB-AAT o vectores PoliA-3XmiR- CB-AAT de VAAr9. Se recogió el suero semanalmente de los ratones durante 13 semanas y se analizó para los niveles de X-AAT en suero con un ELISA específico de PiZ y para los niveles de M-AAT con un ELISA que detectaba la etiqueta CMYC en el ADNc de M-AAT. Los cambios en los niveles de Z-AAT en suero fueron comparables a los experimentos anteriores, con una inactivación sostenida alrededor del 75-85 % para ambos vectores (Figura 8a, panel inferior). Se observó un inicio más rápido de la inactivación con el vector Doble-6XmiR pero el vector PolyA-3XmiR alcanzó una inactivación similar en la cuarta semana. A medida que progresó la inactivación de Z-AAt, se observó un aumento simultáneo en la M-AAT en circulación de ratones que recibieron los vectores de doble función (Figura 8a, panel superior).
Sorprendentemente, aunque la inactivación de ambos vectores fue similar cuatro semanas después de la administración, la producción de M-AAT fu sustancialmente diferente. El vector PoliA-3XmiR-CB-AAT produjo 8-10 veces más M-AAT que el vector the Doble-6XmiR-CB-AAT. Se extrajo el ARN del hígado de estos ratones al final del estudio para cuantificar los niveles de ARNm de Z-AAT y M-AAT. Se produjo una repentina disminución en el ARNm de Z-AAT en ambas cohortes de ratones que recibieron vectores con miARN en comparación con ratones que recibieron un control de rAAV9-CB-GFP (Figura 8B). Se llevó a cabo también la RT-PCR para M-AAT, para verificar la producción de M-AAT al nivel del ARN y para determinar si la diferencia en la producción de M-AAT entre los vectores de doble función estaba relacionada con la transcripción del ARNm. A pesar de la clara diferencia en los niveles de proteína M-AAT en suero, no hubo diferencias estadísticamente significativas en los niveles de ARNm de M-AAT entre los dos grupos (Figura 8 C). Esto indica que el procesamiento y la traducción del ARNm, pero no el nivel de la transcripción puede verse afectado en el grupo Doble-6XmiR-CB-AAT, en algunos casos.
Análisis de los perfiles globales del miARN hepático tras la administración de mi ARN artificiales con VAAr9
Se llevó a cabo un análisis de la micromatriz de los miARN endógenos de rató procedentes del tejido hepático para los 6 grupos de ratones con 5 ratones por grupo en 30 chips microfluídicos separados utilizando las muestras obtenidas de los experimentos de inactivación a largo plazo de Z-AAT (Figura 6) junto con los 5 ratones AAT transgénicos sin tratar y los 5 ratones C57/BL6. A fin de determinar las diferencias basales impartidas por el gen Z- AAT humano en ratones, se llevó a cabo una comparación inicial entre ratones PiZ sin tratar y ratones C57BL6 silvestres. Como se muestra en la Figura 9a y en la Tabla 3, hubo solo 4 diferencias estadísticamente significativas entre estos ratones con únicamente miR-1 que tenían una relación log2 mayor de 2, regulándose en exceso en ratones PiZ. Se compararon los efectos de rAAV9-CB-GFP, rAAV9-Doble-6XmiR-CB-GFP, rAAV9-PolyA-3XmiR-CB- GFP y la transducción en hígado del rAAV9-3XmiR-CB-GFP intrónicoen los perfiles del miARN hepático. Sorprendentemente, la expresión de los MiARN derivados del vector artificial tuvo un mínimo impacto sobre los perfiles globales del miARN (véase la Figura 9b-d). Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los ratones PiZ sin tratar y los ratones tratados con VAAr9 en 2-6 miARN expresados de forma diferencial. De estos miARN expresados de forma diferencial, el que tuvo el cambio más grande fue miR-1 donde se la regulación de nuevo a los niveles observados en el C57B16. Esta corrección de la regulación en exceso de miR-1 en ratones PiZ se observó en todos los grupos, incluyendo los ratones que recibieron solo rAAV9-GFP. Por lo tanto, parece ser dependiente de la administración de VAAr9 y no de la administración de miAR artificial.
Los resultados presentados en estos ejemplos describen un enfoque terapéutico combinatorio para el tratamiento de enfermedades tanto hepáticas como pulmonares que presentan deficiencia de alfa-1 antitripsina. Este enfoque terapéutico está basado en un único vector VAA de doble función para administrar ambos miARN que dirigen aAt para el aclaramiento del ARNm mutante junto con un ADNc de AAT resistente a miARN para el aumento de la proteína natural. Los datos presentados en el presente documento respaldan este enfoque, ya que las actividades moduladoras de los miARN se demuestran tanto en los experimentos con cultivos celulares, como in vivo después de numerosos experimentos con administración de vectores AAVr9 pseudotipificados en la vena de la cola. Dependiendo de la configuración de los miARN, se consiguió de una forma consistente una inactivación a largo plazo de Z-AAT en suero en circulación en un intervalo del 50-95 %. Además, en el caso de los vectores de doble función, esta inactivación va acompañada de una expresión y secreción igualmente sostenida del M-AAT natural.
La inactivación de la proteína Z-AAT mutante se observó en ratones transgénicos PiZ usando un vector VAAr8 que expresa ARNhc impulsados por U6. Los experimentos con cultivos celulares iniciales determinaron que, en 72 horas, la eficacia de los miARN utilizados en este estudio era comparable a la de los ARNhc (Figura 1). Los experimentos in vivo descritos en el presente documento corroboran este hallazgo, ya que se observó una disminución significativa de Z-AAT tras la administración del vector VAA9r rAAV9-CBintrónico3xmiR-GFP (Figura 2). Estos experimentos también destacan un efecto mejorado que se obtuvo usando 3 miARN con diferentes secuencias diana, ya que ninguno de los vectores con un solo miARN consiguió el nivel de inactivación observada cuando se administraron juntos (Figura 2). Otro efecto biológico además de la reducción de Z-AAT en suero que se observó incluyó una
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disminución significativa y extensa en la acumulación de Z-AAT dentro de los hepatocitos y una reducción de los foci de linfocitos inflamatorios dentro del hígado (Figura 3).
Sorprendentemente, la eficacia del miARN anti-AAT mejoró alterando la ubicación del miARN dentro del casete de expresión. Los experimentos realizados a corto plazo demostraron que la expresión de los miARN del extremo 3' del gen GFP, en lugar de los procedentes del intrón del promotor CB, producen un aumento del 25 % en las capacidades de silenciamiento de los miARN u también a una disminución significativa en la variabilidad de este efecto. Además, la duplicación de la dosis eficaz de miARN por vector, expresando los miARN desde ambas ubicaciones, condujo a un inicio más rápido de la inactivación de Z-AAT (Figura 4). Por otra parte, se observó un aumento en la producción de miARN en ambos vectores Po/yA-3XmiR-CB-GFP y Dob/e-6XmiR-CB-GFP en comparación con el vector rAAV9-/ntrón/co3xmiR-GFP. Esto indica que, en algunas realizaciones, el procesamiento del miARN desde el intrón del promotor CB puede no ser tan eficaz como desde el extremo 3' del gen GFP. En otras realizaciones, los experimentos a largo plazo demostraron que las diferencias cinéticas iniciales en la inactivación procedente de los tres vectores disminuye con el tiempo y en un plazo de ocho semanas, el 3xm/R /ntrón/co-GFP disminuye en variabilidad y aumenta en eficacia de silenciamiento.
La potencia y estabilidad de la disminución de Z-AAT en suero observada /n v/vo sugiere que cualquiera de estos valores disminuye los niveles de Z-AAT en pacientes Pi*ZZ hasta niveles terapéuticos, incluso por debajo de los observados en pacientes Pi*MZ heterocigóticos. Sin embargo, en algunos casos, se conseguiría un beneficio clínico máximo de un aumento simultáneo de M-AAT en circulación. A este respecto, se diseñaron vectores de funcionalidad doble para suministrar también un ADNc de M-AAT resistente a miARN. Los experimentos con cultivos celulares demostraron la factibilidad de esta estrategia, como se muestra por una disminución del ARNm específico de Z-AAT con un aumento simultáneo de M-AAT usando un único plásmido provírico (Figura 7). Estos experimentos respaldaron un estudio /n v/vo de los vectores de función doble. Los resultados de estos experimentos confirmaron los datos /n v/tro, demostrando claramente la factibilidad de la inactivación y aumento concomitante de la proteína mutante y natural, respectivamente. Estos experimentos también revelaron que la doble configuración de los miARN tiene un inicio más rápido de la inactivación de Z-AAA, pero la eficacia global con el tiempo era comparable al vector Po/yA-3XmiR-CB-AAT vector. Además de una mejora en la cinética de inactivación del vector Dob/e-6XmiR-CB-AAT, también se observó una disminución en la producción de M-AAT (Figura 8a). Inicialmente, se teorizó que esto podría ser un resultado de la disminución en la producción de ARNm de M-AAT debido a la presencia de miARN dentro del intrón de esta construcción, pero como se muestra en la Figura 8c, no se observó una diferencia estadísticamente significativa en el ARNm de M-AAT entre estos dos grupos. Aunque la transcripción y la estabilidad del ARNm no se ve afectada por la presencia de los miARN en el interior del intrón, su traducción a proteínas puede quedar impedida, como se observa en la disminución de los niveles de M-ATT en circulación en el suero de estos ratones.
A tener en cuenta para la terapia clínica es el efecto de la expresión de un miARN artificial sobre los perfiles del miARN endógenos del órgano diana. Para determinar si el VAAr9 expresaba miARN anti-AAT alteraban los perfiles del miARN en el hígado, se cuestionaron los hígados de 30 ratones al final del estudio descrito en la Figura 6 con una micromatriz de miARN. Como puede observarse en la Figura 9, ni la administración de rAAV9-GFP ni la de los vectores que expresaban miARN tuvieron un impacto significativo sobre los perfiles de miARN. De manera destacable, mir-122, que es el miARN más producido en el hígado quedo inalterado en cualquier grupo. Aunque se ha descubierto que algunos miARN se expresaban en niveles estadísticamente diferentes entre los grupos, estaban principalmente en el límite de las 2 veces de cambio con una excepción. Curiosamente, mir-1 pareció tener de forma consistente más de 2 veces de cambio con la intervención de VAAr9. En el caso de este miARN, las veces de cambio con la intervención del VAAr estuvieron en la dirección de revertir los niveles a los encontrados en los ratones C57BL6 silvestres (Figura 9a). De este modo, en resumen, los perfiles de miARN quedaron inalterados y, en algunos casos, 'corregidos' de vuelta a los niveles naturales con la administración del VAAr9.
Estos hallazgos indican que otras patologías que requieren la combinación entre un aumento de un alelo funcional y la supresión de un alelo mutante se pueden abordar de una forma similar. Uno de estos ejemplos es la enfermedad de Huntington (HD), en la que los alelos mutantes producen una enfermedad autosómica dominante grave, pero en la que un inactivación específica de alelo solamente sería factible si el alelo funcional se modificara para transmitir resistencia a una inactivación basada en miARN. Esto significa que estas manipulaciones dan como resultado perturbaciones mínimas en los perfiles de miARN endógeno. Esto es potencialmente importante para tener en cuenta la seguridad de los enfoques basados en miARN con un solo agente, que sería de utilidad en otras terapias con antivirales, por ejemplo, terapias dirigidas contra el VHB o el VHC. Como en el caso de las enfermedades genéticas anteriormente citadas, existen dolencias en las que la regulación por defecto de los genes diana durante periodos de tiempo prolongados puede suponer una ventaja. Por lo tanto, la aparición de una plataforma de miARN basada en VAAr como medio de abordar estos problemas también sería útil.
Tabla 2 Secuencias de miARN artificiales
miRNA910 (SEQ ID NO: 21)
5’-
TAAGCTGGCAGACCTTCTGTCGTTTTGGCCACTGAGTGACGACAGAAGCTGCCA
GCTTA
miRNA914 (SEQ ID NO: 22)
5
AATGTAAGCTGGCAGACCTTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAAGGTCTCAGCTT
ACATT
miRNA943 (SEQ ID NO: 23)
5:-
ATAGGTTCCAGTAAT GGACAGGTTT GGCCACTGACT GACCTGTCCATCT GGAAC CTAT
Tabla 3 Cambios estadísticamente significativos en los perfiles de los miARN hepáticos
Grupo 1 Grupo 2
B6 Control
PiZ Control
Nombre del indicador
valor p Intensidad media (n=5) Intensidad media (n=5) Log2 (G2/G1)
mmu-miR-762
2,39E-02 525 1.099 1,07
mmu-miR-23a
4,03E-02 1.247 1.593 0,35
mmu-miR-1
4,95E-02 126 2.776 4,46
mmu-miR-341 *
4,97E-02 4.340 2.287 -0,92
PiZ-GFP PiZ Control
mmu-miR-1
6,03E-03 5 2,776 9,13
mmu-miR-148a
7,48E-03 1.841 1.058 -0,80
mmu-miR-720
9,33E-03 1.264 3.440 1,44
mmu-miR-30c
1,03E-02 2.830 1.757 -0,69
mmu-miR-146a
1,71E-02 362 175 -1,05
mmu-miR-30d
4,64E-02 627 454 -0,47
PiZ PoliA Piz Control
mmu-miR-2145
1,40E-02 573 114 -2,32
mmu-miR-1
2,82E-02 22 2.776 6,95
mmu-miR-690
2,41 E-02 3,071 534 -2,52
mmu-miR-720
4,31 E-02 1.816 3.440 0,92
mmu-miR-146a
1,53E-02 445 175 -1,35
mmu-miR-1
3,04E-02 115 2.776 4,59
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Claims (19)

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    1. Un VAAr que contiene un ácido nucleico que comprende:
    una primera región que codifica uno o más primeros miARN que se pueden hibridar, e inhibir su expresión, con un ARNm endógeno de un sujeto que codifica una proteína Z-AaT; y,
    una segunda región que codifica un ARNm exógeno que codifica una proteína M-AAT que tiene una o más mutaciones silenciosas en comparación con el ARNm endógeno,
    en donde el uno o más primeros miARN no comprenden un ácido nucleico que tiene suficientes secuencias complementarias para hibridarse con, e inhibir, la expresión del ARNm exógeno, y en donde la primera región está situada entre el último codón del ARN exógeno y una parte de la segunda región que codifica la secuencia de poliadenilación del ARNm exógeno.
  2. 2. El VAAr de la reivindicación 1, en que la primera región está comprendida entre el último codón del ARNm exógeno y una posición a 1000 nucleótidos en la dirección 3' del último codón.
  3. 3. El VAAr de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además una tercera región que codifica uno o más miARN secundarios que se pueden hibridar con, y que inhiben, la expresión del ARNm endógeno, en donde la tercera región está situada en una parte no traducida de la segunda región.
  4. 4. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera región codifica tres primeros miARN.
  5. 5. El VAAr de las reivindicaciones 3 o 4, en el que la tercera región codifica tres segundos miARN.
  6. 6. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una proteína codificada por el ARNm exógeno tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 98 %, o al menos el 99 % idéntica a una proteína codificada por el ARNm endógeno.
  7. 7. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el Z-AAT es una proteína AAT humana.
  8. 8. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el Z-AAT tiene una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 1 o en el que el Z-AAT tiene una o más mutaciones de la misma como se identifica en la Tabla 1.
  9. 9. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer ARNm comprende un ácido nucleico codificado por una secuencia como se define en las SEQ ID NOS: 5-16.
  10. 10. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el uno o más miARN tienen una secuencia de ácido nucleico codificada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 17-19 y 2123.
  11. 11. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNm exógeno tiene una secuencia de ácido nucleico codificada por una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 20.
  12. 12. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además repeticiones terminales invertidas (RTI) de un serotipo de VAA seleccionado entre el grupo que consiste en: VAA1, VAA2, VAA5, VAA6, VAA6.2, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y variantes de los mismos.
  13. 13. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además una o más proteínas de la cápsida de uno o más serotipos de VAA seleccionados entre el grupo que consiste en: VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11 y variantes de los mismos.
  14. 14. Una composición que comprende el VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  15. 15. Un kit que comprende un recipiente que aloja la composición de la reivindicación 14.
  16. 16. El VAAr de cualquiera de las reivindicaciones anteriores o la composición de la reivindicación 14 que comprende el VAA recombinante, en donde el VAAr está formulado para su administración en una cantidad eficaz a un sujeto.
  17. 17. El VAA recombinante o la composición de la reivindicación 16, en donde la administración del VAAr se realiza por vía intravenosa, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o mediante inyección en la vena porta hepática del sujeto.
  18. 18. El VAA recombinante o la composición de las reivindicaciones 16 o 17, en donde tras 7 semanas de administración del VAAr, el nivel en suero de la Z-AAT está a un nivel de al menos un 50 % o al menos un 75 % en comparación con el nivel en suero de la Z-AAT antes de la administración del VAAr.
    109
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    Nivel PiZ sérico (% incactivación en comparación con controles GFP)
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    Fig. 3C Fig, 3D
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    imagen6
    112
    Nivel PiZ sérico (% inactivación)
    C
    ts
    imagen7
    113
    Cantidad relativa
    imagen8
    114
    imagen9
    -001-
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    Fig. 6D
    120-1
    ?100-
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    2 semanas después de la administración de VAAr9
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    2 semanas después de la administración de VAAr9
    Fig. 6E
    Fig. 6F
    116
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    ARNm PiZ
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    en
    seña! P¡Z - centro!
    Seña! P!Z - control
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