ES2657233T3 - Potenciador viral baciliforme de la caña de azúcar (SCBV) y su uso en la genómica vegetal funcional - Google Patents
Potenciador viral baciliforme de la caña de azúcar (SCBV) y su uso en la genómica vegetal funcional Download PDFInfo
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Abstract
Una región quimérica reguladora de la transcripción que comprende: una o más copias del elemento potenciador viral baciliforme de la caña de azúcar (SCBV) mostrado de la posición 337 a la posición 618 de la SEQ ID NO: 1, o de un homólogo del mismo que tenga una identidad de al menos el 90% de la posición 337 a la posición 618 de la SEQ ID NO: 1; y, operativamente ligado a las mismas, un promotor heterólogo que comprende un sitio de unión de la ARN polimerasa y un sitio de iniciación de ARNm, en la que, cuando se transcribe una secuencia de nucleótidos de interés bajo el control regulador de la región quimérica reguladora de la transcripción, la cantidad del producto de transcripción se potencia en comparación con la cantidad del producto de transcripción obtenida con la región quimérica reguladora de la transcripción que comprende el promotor y que no comprende la o las secuencias del potenciador de SCBV.
Description
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Los nucleótidos fundamentales del ADN son desoxiadenosina 5′-trifosfato (dATP o A), desoxiguanosina 5′-trifosfato (dGTP o G), desoxicitidina 5′-trifosfato (dCTP o C) y desoxitimidina 5′-trifosfato (dTTP o T). Los nucleótidos fundamentales del ARN son adenosina 5′-trifosfato (ATP o A), guanosina 5′-trifosfato (GTP o G), citidina 5′-trifosfato (CTP o C) y uridina 5′-trifosfato (UTP o U). La inosina es también una base que puede integrarse en el ADN o el ARN en un nucleótido (dlTP o ITP, respectivamente).
Especies (vegetales) oleícolas: Especies vegetales que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, fundamentalmente en semillas. Tales especies incluyen, sin limitación, soja (Glycine nizax), colza y canola (tal como Brassica napus, Brassica rapa y Brassica campestris), girasol (Helianthus annus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), cacao (Theobroina cacao), cártamo (Carthamus tinctorius), palma aceitera (Elaeis guineensis), palma cocotera (Cocos nucifera), lino (Linum usitatissimum), ricino (Ricinus communis) y cacahuete (Arachis hypogaea).
Oligonucleótido: Un oligonucleótido es una pluralidad de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster, de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 300 nucleótidos en longitud. Un análogo de oligonucleótido se refiere a compuestos que actúan de forma similar a los oligonucleótidos, pero tienen porciones que no se dan de forma natural. Por ejemplo, los análogos de oligonucleótidos pueden contener porciones que no se dan de forma natural, tales como restos de azúcares alterados o enlaces entre azúcares, tales como un fosforotioato oligodesoxinucleótido. Los análogos funcionales de polinucleótidos que se presentan de forma natural pueden enlazarse con el ARN o el ADN.
Operativamente ligado: Esta expresión se refiere a una yuxtaposición de componentes, particularmente secuencias de nucleótidos, de modo que la función normal de los componentes se pueda llevar a cabo. Así, una primera secuencia de ácidos nucleicos está operativamente ligada con una segunda secuencia de ácidos nucleicos cuando la primera secuencia de ácidos nucleicos es puesta en una relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado con una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o a la expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN operativamente ligadas son contiguas y, cuando ello es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, se encuentran en el mismo marco de lectura. Una secuencia codificante que está “operativamente ligada” a una o varias secuencias reguladoras se refiere a una configuración de secuencias de nucleótidos, pudiendo expresarse la secuencia codificante bajo el control regulador (por ejemplo, control de transcripción y/o de traducción) de las secuencias reguladoras.
ORF (marco abierto de lectura): Una serie de tripletes (codones) de nucleótidos que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación. Estas secuencias suelen ser traducibles formando un péptido.
Identidad porcentual de secuencias: El porcentaje de nucleótidos idénticos en una secuencia lineal de polinucleótidos de una molécula de polinucleótidos de referencia (“consulta”) (o de su cadena complementaria), a diferencia de una molécula de polinucleótidos de ensayo (“sujeto”) (o de su cadena complementaria), cuando las dos secuencias están óptimamente alineadas (con inserciones, deleciones apropiadas de nucleótidos o huecos que totalicen menos del 20 por ciento de la secuencia de referencia con respecto a la ventana de comparación). El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación es muy conocido para los expertos en la técnica y puede llevarse a cabo usando herramientas tales como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, o el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman. Tales comparaciones se llevan a cabo, preferentemente, usando las implementaciones informatizadas de estos algoritmos, tales como GAP, BESTFIT, PASTA y TFASTA, disponibles como parte del GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Burlington, Massachusetts). Una “fracción de identidad” para segmentos alineados de una secuencia de ensayo y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que son compartidos por dos secuencias alineadas dividido por el número total de componentes en el segmento de la secuencia de referencia (es decir, toda la secuencia de referencia o una parte definida menor de la secuencia de referencia). La identidad porcentual de secuencias se representa como la fracción de identidad multiplicada por 100. La comparación de una o más secuencias de polinucleótidos puede ser con una secuencia de polinucleótidos de longitud máxima o con una porción de la misma, o con una secuencia de polinucleótidos más larga. La identidad sustancial porcentual de secuencias es una identidad de secuencias de al menos aproximadamente el 80%, una identidad de secuencias de al menos aproximadamente el 90%, o una identidad de secuencias aun mayor, tal como una identidad de secuencias de aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99%.
Planta: Cualquier planta y la progenie de la misma. El término también incluye partes de plantas, incluyendo la semilla, esquejes, tubérculos, el fruto, flores, etc. En diversas realizaciones, el término planta se refiere a especies vegetales cultivadas, tales como maíz, algodón, canola, girasol, soja, sorgo, alfalfa, trigo, arroz, plantas frutícolas y verduras, y el césped y especies vegetales ornamentales. La expresión célula vegetal, usada en la presente memoria, se refiere a la unidad estructural y fisiológica de las plantas, consistente en un protoplasto y la pared circular circundante. La expresión órgano vegetal, usada en la presente memoria, se refiere a una parte definida y visiblemente diferenciada de una planta, tal como la raíz, el tallo, la hoja o el embrión.
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Más en general, la expresión tejido vegetal se refiere a cualquier tejido de una planta in planta o en cultivo. Esta expresión incluye una planta entera, una célula vegetal, un órgano vegetal, un protoplasto, un cultivo celular, o cualquier grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional.
Molécula de polinucleótidos: ADN o ARN mono o bicatenarios de origen genómico o sintético; es decir, un polímero de bases desoxirribonucleótidas o ribonucleótidas, respectivamente, leído desde el extremo 5′ (corriente arriba) al extremo 3′ (corriente abajo).
Molécula de polipéptidos: Un polímero en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que están unidos entre sí a través de enlaces de amida. Cuando los aminoácidos son aminoácidos alfa, puede usarse ya sea el isómero óptico L o el isómero óptico D, prefiriéndose los isómeros L. El término polipéptido o proteína, usado en la presente memoria, abarca cualquier secuencia de aminoácidos e incluye secuencias modificadas tales como glucoproteínas. El término polipéptido está concebido específicamente para abarcar las proteínas que se dan de forma natural, así como las que son producidas de forma recombinante o sintética.
Silenciamiento postranscripcional de genes (PTGS): Una forma de silenciamiento de genes en la que el mecanismo inhibidor se produce después de la transcripción. Esto puede dar como resultado ya sea un nivel reducido del estado estacionario de una diana específica de ARN o una inhibición de la traducción (Tuschl, ChemBiochem, 2: 239-245, 2001). En la bibliografía, las expresiones interferencia por ARN (iARN) y cosupresión postranscripcional se usan a menudo para indicar el silenciamiento postranscripcional de genes.
Promotor: Un conjunto de secuencias de control de ácidos nucleicos que dirigen la transcripción de un ácido nucleico, mediante el reconocimiento y el enlace, por ejemplo, con la ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un promotor incluye las secuencias necesarias de ácidos nucleicos cerca del sitio de inicio de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Mínimamente, un promotor incluye normalmente al menos un sitio de unión de la ARN polimerasa y también puede incluir uno o más sitios de unión del factor de transcripción, que modulan la transcripción en respuesta a la ocupación por factores de transcripción. En la presente memoria se describen ejemplos representativos de promotores (y de elementos que pueden ser ensamblados para producir un promotor). Los promotores pueden definirse por su patrón de expresión temporal, espacial o de desarrollo.
Un promotor vegetal es un promotor nativo o no nativo que es funcional en las células vegetales.
Proteína: Una molécula biológica —por ejemplo, un polipéptido—, expresada por un gen y constituida por aminoácidos.
Protoplasto: Una célula vegetal aislada sin pared celular, que tiene el potencial de ser transformada y/o de regeneración en un cultivo celular o en una planta completa.
Purificado: El término “purificado” no requiere absoluta pureza; está pensado, más bien, como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación purificada de una proteína de fusión es aquella en la que la proteína de fusión está más enriquecida que la proteína en su entorno generativo; por ejemplo, dentro de una célula o en una cámara de reacción bioquímica. Preferentemente, una preparación de una proteína de fusión es purificada de modo que la proteína de fusión represente al menos el 50% del contenido proteínico total de la preparación.
Recombinante: Un ácido nucleico recombinante es aquel que tiene una secuencia que no se da de forma natural o que tiene una secuencia que está hecha mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencias separados en otros casos. Esta combinación artificial se logra a menudo mediante síntesis química o, más comúnmente, por manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.
De manera similar, una proteína recombinante es aquella codificada por una molécula de ácido nucleico recombinante.
Promotor regulable: Un promotor cuya actividad es regulada (directa o indirectamente) por un agente, tal como un factor de transcripción, un compuesto químico, una condición ambiental o una molécula de ácido nucleico.
Regulación de la expresión génica: Procesos de control de la expresión de un gen aumentando o disminuyendo la expresión, la producción o la actividad de un agente que afecta a la expresión génica. El agente puede ser una proteína, tal como un factor de transcripción, una molécula de ácido nucleico, tal como un miARN o una molécula de ARNip, que, cuando está en contacto con el gen o con sus secuencias reguladoras corriente arriba, o con un ARNm codificado por el gen, aumenta o disminuye la expresión génica.
Secuencias o elementos reguladores: Estos términos se refieren generalmente a una clase de moléculas de polinucleótidos (tales como moléculas de ADN, que tienen secuencias de ADN) que controlan o influyen en la transcripción o la traducción de una molécula de polinucleótido transcribible ligada operativamente y, con ello, en la expresión de los genes. En la expresión están incluidos promotores, potenciadores, líderes, intrones, regiones de control de locus, elementos límite/aisladores, silenciadores, regiones de unión a la matriz (también denominadas
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Los métodos de alineamiento de secuencias para su comparación son muy conocidos en la técnica. Se describen diversos programas y algoritmos de alineamiento en: Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981); Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970); Pearson y Lipman (PNAS. USA 85: 2444, 1988); Higgins y Sharp (Gene, 73: 237-244, 1988); Higgins y Sharp (CABIOS 5: 151-153, 1989); Corpet et al. (Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988); Huang et al. (Comp. Appls Biosci. 8: 155-65, 1992); y Pearson et al. (Methods in Molecular Biology 24: 307-31, 1994). Altschul et al. (Nature Genet., 6: 119-29, 1994) presentan una consideración detallada de métodos de alineamiento de secuencias y cálculos de homología.
Las herramientas de alineamiento ALIGN (Myers y Miller, CABIOS 4: 11-17, 1989) o LFASTA (Pearson y Lipman, 1988) pueden ser usadas para llevar a cabo comparaciones de secuencias (Internet Program© 1996, W.R. Pearson y la Universidad de Virginia, “fasta20u63”, versión 2.0u63, puesto en circulación en diciembre de 1996). ALIGN compara entre sí secuencias enteras, mientras que LFASTA compara regiones de similitud local. Estas herramientas de alineamiento y sus respectivos tutoriales están disponibles en Internet en biology.ncsa.uiuc.edu.
Los ortólogos y los parálogos (más en general, homólogos) de las secuencias dadas a conocer se caracterizan normalmente por la posesión de una identidad de secuencias superior al 75% contada con respecto al alineamiento de longitud total con la secuencia con la que se comparan usando ALIGN configurado con los parámetros por defecto. Las secuencias con similitud aún mayor con las secuencias de referencia presentarán identidades porcentuales crecientes cuando sean evaluadas por este método, tales como una identidad de secuencias de al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 92%, al menos el 95%, o al menos el 98%. Además, la identidad de secuencias puede compararse con respecto a toda la longitud de uno o ambos dominios de unión de las proteínas de fusión dadas a conocer. En tal caso, las identidades porcentuales serán esencialmente similares a las divulgadas para la identidad de secuencias de longitud máxima.
Cuando, de cara a la identidad de secuencias, se compara una longitud significativamente menor que toda la secuencia, los homólogos poseerán normalmente una identidad de secuencias de al menos un 80% en ventanas pequeñas de 10-20 aminoácidos, y pueden poseer identidades de secuencias de al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99%, dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. La identidad de secuencias en ventanas tan cortas puede ser determinada usando LFASTA; se pueden encontrar métodos en la dirección biology.ncsa.uiuc.edu de la red mundial. Un experto en la técnica apreciará que estos intervalos de identidad de secuencias son proporcionados únicamente a título orientativo; es del todo posible que pudieran obtenerse homólogos muy significativos que se encuentren fuera de los intervalos proporcionados. La presente divulgación proporciona no solo los homólogos de péptidos que han sido descritos anteriormente, sino también moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales homólogos.
Una indicación alternativa de que dos moléculas de ácido nucleico están estrechamente relacionadas es que las dos moléculas se hibriden entre sí en condiciones estrictas. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y son diferentes bajo parámetros ambientales distintos. En general, se seleccionan condiciones estrictas que sean aproximadamente de 5°C a 20°C más bajos que el punto térmico de fusión (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Pueden encontrarse condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos y el cálculo de grados de rigor en Sambrook et al. (en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y Tijssen (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Part I, cap. 2, Elsevier, Nueva York, 1993). Las moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones estrictas con las secuencias potenciadoras dadas a conocer de SCBV normalmente se hibridarán con una sonda en función ya sea de toda la secuencia codificante de la proteína de fusión, de un dominio de unión completo o de otras porciones seleccionadas de la secuencia codificante en condiciones de lavado de 0,2× SSC, 0,1% SDS a 65°C.
Las secuencias de ácidos nucleicos que no presentan un alto grado de identidad pueden, no obstante, codificar secuencias similares de aminoácidos, debido a la degeneración del código genético. Se entiende que los cambios en la secuencia de ácidos nucleicos pueden realizarse usando esta degeneración para producir múltiples secuencias de ácidos nucleicos, cada una de las cuales codifica sustancialmente la misma proteína.
ARN interferente pequeño (ARNip): ARN de aproximadamente 21-25 nucleótidos que es procesado a partir de un ARNbc por una enzima DICER (en animales) o una enzima DCL (en plantas). Los productos iniciales DICER o DCL son bicatenarios, en los cuales las dos cadenas son normalmente de 21-25 nucleótidos de longitud y contienen dos pares no emparejadas en cada extremo 3′. Las cadenas individuales dentro de la estructura del ARNip bicatenario están separadas, y normalmente uno de los ARNip está asociado entonces con un complejo de subunidades múltiples: el complejo de silenciamiento inducido por iARN (RISC). Una función típica del ARNip es guiar el RISC a la diana en función de la complementariedad de las parejas de bases.
Molécula de polinucleótido transcribible: Cualquier molécula de polinucleótido capaz de ser transcrita a una molécula de ARN. Las personas con un dominio normal de la técnica conocen métodos para introducir constructos en una célula de tal manera que la molécula de polinucleótido transcribible se transcriba formando una molécula funcional de ARNm que es traducida y, por lo tanto, expresada como un producto proteínico. Los constructos también pueden ser construidos para ser capaces de expresar moléculas de ARN antisentido, para inhibir la
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descritos en la presente memoria en la puesta en práctica o el ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la situación quedará zanjada por la presente memoria, que incluye explicaciones de los términos. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
III. Visión general de varias realizaciones
La presente divulgación describe regiones de iniciación de transcripción novedosas que comprenden un dominio potenciador y, bajo el control de potenciamiento del dominio potenciador, un dominio regulador de la transcripción. El dominio potenciador comprende varias (por ejemplo, de dos a cuatro o más) copias de un potenciador natural, pero previamente no reconocido, de SCBV dispuestas en tándem. Las regiones reguladoras de la transcripción (promotores) de la presente divulgación proporcionan una transcripción mejorada con respecto al promotor en ausencia del dominio potenciador. En una realización, se da a conocer una región quimérica reguladora de la transcripción que comprende una o más copias del elemento potenciador de SCBV mostrado de la posición (o de un homólogo del mismo); y, operativamente ligado a las mismas, un promotor que comprende un sitio de unión de la ARN polimerasa y un sitio de iniciación de ARNm, en la que, cuando se transcribe una secuencia de nucleótidos de interés bajo el control regulador de la región quimérica reguladora de la transcripción, la cantidad del producto de transcripción se potencia en comparación con la cantidad del producto de transcripción obtenida con la región quimérica reguladora de la transcripción que comprende el promotor y que no comprende la o las secuencias del potenciador de SCBV. En algunas realizaciones, la región quimérica reguladora de la transcripción comprende un promotor obtenido de la región corriente arriba de un gen de virus de una planta, de un gen bacteriano, de un gen fúngico, de un gen nuclear de una planta, de un gen extranuclear de una planta, de un gen de un invertebrado o de un gen de un vertebrado.
También se proporcionan constructos de ADN que comprenden una región reguladora descrita de la transcripción y una secuencia de ADN que ha de ser transcrita. En algunas realizaciones, se da a conocer un constructo de ADN que comprende la región de iniciación transcripcional operativamente ligada a una molécula de polinucleótido transcribible operativamente ligada a una molécula de polinucleótido de terminación de transcripción en 3′. En una realización, la molécula de polinucleótido transcribible confiere un rasgo agronómico a una planta en la que se expresa.
También se proporcionan plantas transgénicas. En una realización, una planta transgénica es transformada de manera estable con un constructo divulgado de ADN. En algunas realizaciones, la planta transgénica es una dicotiledónea. En otras realizaciones, la planta transgénica es una monocotiledónea. En una realización particular, la planta transgénica es una planta de maíz.
Se proporciona, además, una semilla de una planta transgénica dada a conocer. En una realización, la semilla comprende el constructo divulgado de ADN.
Se proporcionan también, además, una célula o un tejido vegetales transgénicos. En una realización, una célula o un tejido vegetales transgénicos comprenden una región quimérica reguladora de la transcripción que se da a conocer. En algunas realizaciones, la célula o el tejido vegetales se derivan de una dicotiledónea. En otras realizaciones, la célula o el tejido vegetales proceden de una monocotiledónea. En una realización particular, la célula o el tejido vegetales son de una planta de maíz.
También se proporcionan métodos de producción de una planta, una célula, una semilla o un tejido vegetales transgénicos. En algunas realizaciones, el método comprende la transformación de una célula o de un tejido vegetales con un constructo divulgado de ADN.
Se proporcionan, además, una célula vegetal, un fruto, una hoja, una raíz, un brote, una flor, una semilla, un esqueje u otro material reproductivo útil en la propagación sexual o asexual, plantas descendientes, incluyendo híbridos F1, plantas masculinas estériles y todas las demás plantas y los productos vegetales derivables de las plantas transgénicas divulgadas.
También se divulgan una célula, un tejido o una planta de maíz que comprenden una o más copias de un elemento potenciador de SCBV mostrado de la posición 337 a la posición 618 de la SEQ ID NO: 1 y, operativamente ligado a las mismas, un promotor heterólogo que comprende un sitio de unión de la ARN polimerasa y un sitio de iniciación de ARNm.
En una realización, una célula, un tejido o una planta de maíz comprende una o más copias de un elemento potenciador de SCBV mostrado de la posición 337 a la posición 618 de la SEQ ID NO: 1, insertándose las una o más copias del elemento potenciador de SCBV en el genoma de la célula, el tejido o la planta de maíz en una ubicación aleatoria. En algunas realizaciones, el potenciador de SCBV imparte una transcripción de una secuencia de interés de nucleótidos que está bajo el control regulador del potenciador de SCBV mejorada con respecto a la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en ausencia del potenciador de SCBV.
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IV. El potenciador de SCBV y sus usos
La presente divulgación proporciona una región potenciadora no reconocida anteriormente procedente del genoma del badnavirus baciliforme de la caña de azúcar (SCBV), potenciador que es útil para mejorar la eficacia de la transcripción, que puede resultar en una transcripción mejorada de secuencias de ADN bajo el control del potenciador. De particular interés es la transcripción mejorada de secuencias de genes que pueden ser del mismo origen genético que el anfitrión o de origen foráneo, ya se trate de las secuencias que se dan de forma natural (tanto en la orientación sentido como antisentido) o de secuencias preparadas sintéticamente. Los presentes potenciadores comprenden una pluralidad de dos o más copias de un dominio natural potenciador del SCBV no reconocido anteriormente (cuya secuencia es proporcionada en la SEQ ID NO: 1, de la posición 337 a la 618). El potenciador comprende al menos dos copias de la secuencia del dominio potenciador —en algunas realizaciones tres o cuatro o más copias— dispuestas en tándem.
También se contemplan potenciadores homólogos. Sin pretender una limitación en modo alguno, las secuencias homólogas representativas pueden incluir las procedentes de otros promotores de SCBV; por ejemplo, procedentes de diferentes aislados de SCBV, tales como los descritos en Braithwaite et al. (Plant Cell Rep. 23:319-326, 2004; incorporado a la presente memoria por referencia en su integridad) o en la patente estadounidense nº 5.994.123 (incorporada a la presente memoria por referencia en su integridad).
Un potenciador natural comprende una secuencia de ADN que, en su entorno nativo, está corriente arriba con respecto a un promotor y a menos de aproximadamente 600 pb del mismo. Tomando el nucleótido inicial del ARNm como 0, la secuencia que contiene un potenciador se encuentra de aproximadamente -50 a aproximadamente
1.000 pb, habitualmente de aproximadamente -50 a -950 pb, comprendiendo generalmente de aproximadamente 100 a -800 pb. Un dominio potenciador actúa en cis e, idealmente, está situado a menos de aproximadamente
10.000 pb, habitualmente aproximadamente 2.000 pb, más habitualmente adyacente a una secuencia de iniciación de la transcripción que ha de ser potenciada, o a menos de aproximadamente 1.000 pb de la misma.
El potenciador puede estar en cualquier orientación con respecto a la secuencia de iniciación de la transcripción y puede estar situado corriente arriba o corriente abajo en relación con el promotor que potencia, aunque suele estar corriente arriba. El dominio potenciador de la presente divulgación halla uso en una amplia variedad de secuencias de iniciación, incluyendo promotores que se encuentran de forma natural bajo el control del potenciador —por ejemplo, en una posición cis (adyacente y homóloga)—, así como las normalmente no asociadas con el potenciador particular (por ejemplo, heterólogas). El dominio potenciador y el dominio de iniciación de la transcripción pueden ser de reinos, familias o especies iguales o diferentes. Las especies de interés incluyen los procariotas y los eucariotas, tales como bacterias, plantas, insectos, mamíferos, etc. Las combinaciones incluyen el o los dominios potenciadores (virales) descritos de SCBV con una región de iniciación de transcripción de un gen estructural de: un anfitrión para el SCBV (procedente, por ejemplo, de la caña de azúcar), otra especie vegetal (por ejemplo, de una familia igual o diferente), un insecto, un animal vertebrado, una bacteria, un hongo, etcétera.
La divulgación también contempla constructos de ADN que comprenden una región de iniciación de transcripción sujeto y, bajo el control de la región de iniciación de transcripción, una secuencia de ADN que ha de ser transcrita. La secuencia de ADN puede comprender un marco abierto natural de lectura que incluye secuencias flanqueantes 5′ y 3′ transcritas. Alternativamente, puede comprender una secuencia antisentido, porque codifique el complemento de una molécula de ARN o una porción del mismo. Cuando el constructo incluye un marco abierto de lectura (ORF) que codifica una proteína, se obtiene una tasa mejorada de iniciación de la transcripción, habitualmente proporcionando una mayor cantidad del producto de expresión de polipéptido del gen. Cuando el constructo comprende una secuencia antisentido, la transcripción mejorada de ARN complementario a la forma natural suprime la expresión del ARNm de la forma natural, disminuyendo con ello la cantidad del producto de expresión de polipéptido; se contempla que el ARNm de la forma natural en cuestión pueda corresponder a un ARNm nativo de la célula anfitriona o al ARNm de un patógeno, tal como un virus o un hongo.
En diversas realizaciones, la secuencia de ADN que ha de ser transcrita incluye: una o v arias secuencias codificantes de proteínas de un gen (procedentes, por ejemplo, de una planta, un animal, una bacteria, un virus o un hongo), que pueden incluir: uno o varios marcos abiertos de lectura naturales que codifican un producto proteínico; secuencias de ADN complementario (ADNc) derivadas del ARNm codificado por un gen; ADN sintético que dé la o las secuencias codificantes deseadas; una o varias secuencias codificantes de proteínas derivadas de exones de un gen natural, tales como uno o más marcos abiertos de lectura producidos por ligadura de exones; y/o combinaciones de dos o más cualesquiera de los mismos. Unidas a estas secuencias hay secuencias apropiadas de terminación/poliadenilación de transcripción; secuencias procedentes de un gen natural (por ejemplo, procedente de una planta, un animal, una bacteria, un virus o un hongo) que codifique un producto de ARN primario que consista en exones e intrones (por ejemplo, genes de eucariotas transcritos por polimerasa II y polimerasa III naturales); secuencias de ADN sintético que codifiquen un ARN o un producto proteínico específicos; secuencias de ADN modificadas a partir de una secuencia codificante conocida (por ejemplo, una secuencia de genes naturales) por mutagénesis (tal como la mutagénesis específica al sitio) y/u otra tecnología de ingeniería genética; quimeras de cualesquiera de los anteriores logradas por ligadura de fragmentos de ADN, incluyendo quimeras que codifican proteínas de fusión; y/o secuencias de ADN que codifiquen el complemento de moléculas de ARN o porciones del mismo.
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La transcripción mejorada en plantas puede encontrar uso en la mejora de la producción de proteínas características de la planta (endógenas; es decir, normalmente encontradas en el anfitrión de la forma natural) o de aquellas proteínas de otras fuentes genéticas (exógenas; es decir, normalmente no encontradas en el anfitrión de la forma natural). Ejemplos de tipos de secuencias para ser expresadas a partir de potenciadores y regiones quiméricas reguladoras de la transcripción descritos en la presente memoria incluyen: ARN antisentido o inhibidores pequeños (para la supresión de genes); proteínas nutricionalmente importantes; factores promotores del crecimiento; proteínas que dan protección a la planta en ciertas condiciones ambientales —por ejemplo, proteínas que confieren resistencia a metales, a la sal o a otra toxicidad; proteínas relacionadas con el estrés, que dan tolerancia a extremos de temperatura, congelación, etc.—; proteínas que confieren a la planta protección relacionada con plagas o infecciones —por ejemplo, proteínas que dan resistencia a una infección bacteriana, fúngica o microbiana de otro tipo—; o resistencia a la depredación por insectos (por ejemplo, la toxina B. thuringiensis) o a otros animales invertebrados o vertebrados; compuestos de importancia médica fuera de la planta —por ejemplo, antimicrobianos, antitumorales, etc.—; proteínas u otros compuestos de valor comercial específico; mayor nivel de proteínas —por ejemplo, enzimas de sistemas metabólicos (por ejemplo, sistemas para la producción de compuestos polifenólicos u otros metabolitos secundarios)—; mayores niveles de productos de valor estructural para una planta anfitriona; etcétera. Las secuencias de interés que se transcriben serán al menos de aproximadamente 8 pb, al menos de aproximadamente 12 pb, al menos de aproximadamente 20 pb, y pueden tener una longitud de uno o más kilopares base (kpb).
V. Constructos
Los constructos de la presente divulgación contienen normalmente una región quimérica reguladora de la transcripción que comprenden una o más copias del elemento potenciador de SCBV proporcionado operativamente ligadas a un promotor (que habitualmente contiene, al menos, un sitio de unión de la ARN polimerasa y un sitio de iniciación de ARNm), región que está operativamente ligada a una molécula de polinucleótido transcribible operativamente ligada a una molécula de polinucleótido de terminación de transcripción en 3′. Además, los constructos pueden incluir, sin limitación, moléculas de polinucleótidos reguladoras adicionales procedentes de la región no traducida 3′ (3′ UTR) de genes vegetales (por ejemplo, una 3′ UTR para aumentar la estabilidad del ARNm, tal como la región de terminación PI-II de la patata o las regiones de terminación 3′ de octopina o nopalina sintasa). Los constructos pueden incluir, sin limitación, las regiones no traducidas 5′ (5′ UTR) de una molécula de polinucleótidos de ARNm que pueden desempeñar un papel importante en la iniciación de la traducción y también puede ser un componente genético en un constructo de expresión vegetal. Por ejemplo, se ha demostrado que las moléculas de polinucleótidos de líderes 5′ no traducidos derivados de genes de proteínas de choque térmico mejoran la expresión génica en plantas (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 5.659.122 y 5.362.865, cada una de las cuales está incorporada por referencia en su integridad). Tales moléculas adicionales de polinucleótidos reguladoras corriente arriba y corriente abajo en el constructo pueden estar derivadas de una fuente que sea nativa o heteróloga con respecto a los otros elementos presentes en el constructo.
Así, una realización es un constructo que comprende una región quimérica reguladora de la transcripción que comprende ella misma una o más copias (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más copias) del elemento potenciador de SCBV mostrado de la posición 337 a la posición 618 de la SEQ ID NO: 1 (o de un homólogo del mismo) operativamente ligado a un promotor, operativamente ligado a una molécula de polinucleótido transcribible para dirigir la transcripción de dicha molécula de polinucleótido transcribible a un nivel deseado y/o en un tejido deseado o un patrón de desarrollo tras la introducción del constructo en una célula vegetal. En algunos ejemplos, la molécula de polinucleótido transcribible comprende una región codificante de proteínas de un gen, y la región quimérica reguladora de la transcripción proporciona la transcripción de una molécula funcional de ARNm que es traducida y expresada como un producto proteínico a partir del constructo. En otra realización, la molécula de polinucleótido transcribible comprende una región antisentido de un gen, y la región quimérica reguladora de la transcripción afecta a la transcripción de una molécula de una molécula de ARN antisentido o de otro ARN inhibidor similar para inhibir la expresión de una molécula de interés específica de ARN en una célula anfitriona diana.
Más constructos ejemplares adicionales de la presente divulgación incluyen constructos de ADN de borde del plásmido It doble que tienen las regiones del borde derecho (RB o AGRtu.RB) y del borde izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plásmido It aisladas del Agrobacterium tumefaciens, que comprenden un ADN-T, que, junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células Agrobacterium, permiten la integración del ADN-T en el genoma de una célula vegetal. Los constructos también pueden contener segmentos de ADN de la cadena principal del plásmido que proporcionan una función de replicación y selección antibiótica en células bacterianas; por ejemplo, un origen de replicación de Escherichia coli tal como ori322, un origen de replicación de una amplia gama de anfitriones tal como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador seleccionable tal como Spec/Strp, que codifica la Tn7 aminoglucósido adeniltransferasa (aadA), que confiere resistencia a la espectinomicina o a la estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, cepas bacterianas anfitrionas representativas incluyen Agrobacterium tumefaciens ABI, C58 o LBA4404; sin embargo, pueden usarse otras cepas conocidas por los expertos en la técnica de transformación de plantas.
También se contemplan constructos que comprenden al menos un elemento potenciador de SCBV (opcionalmente, en el contexto de una región quimérica reguladora de la transcripción), constructo que es un constructo de etiquetado de activación. El etiquetado de activación es un método por medio del cual los genes son regulados
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maduración de los frutos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.512.466), mejor digestibilidad (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 6.531.648), mejor sabor (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 6.011.199), baja rafinosa (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 6.166.292), mejor nutrición animal y/o humana (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 6.723.837, 6.653.530, 6.541.259, 5.985.605, 6.171.640), resistencia al estrés medioambiental (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 6.072.103), péptidos deseables (por ejemplo, péptidos farmacéuticos o secretables) (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 6.812.379, 6.774.283, 6.140.075, 6.080.560), rasgos mejorados de procesamiento (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 6.476.295), producción industrial de enzimas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.543.576), fijación de nitrógeno (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.229.114), producción de semillas híbridas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.689.041), biopolímeros (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense nº USRE37.543, las patentes estadounidenses nos 6.228.623,
5.958.745 y la publicación estadounidense nº US20030028917) y la producción de biocombustibles (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.998.700).
Alternativamente, una molécula de polinucleótido transcribible puede influir en una característica vegetal mencionada anteriormente (o en otra) o en fenotipos codificando una molécula antisentido o de ARN que cause la inhibición seleccionada de la expresión de un gen endógeno; por ejemplo, mediante ARN inhibidor (ARNi) antisentido, o mecanismos arbitrados por la cosupresión. El ARN también podría ser una molécula catalítica de ARN (una ribozima) diseñada para escindir un producto deseado de ARNm endógeno. Así, cualquier molécula de polinucleótido transcribible que codifique una molécula de ARN transcrito que afecte a un cambio de interés en el fenotipo, bioquímico o morfológico puede beneficiarse de la mejora transcripcional permitida por las secuencias y los constructos proporcionados en la presente memoria.
El potenciador descrito de SCBV o la región quimérica reguladora de la transcripción que comprende una o más copias del mismo pueden ser incorporados en un constructo con uno o más genes marcadores (cualquier molécula de polinucleótido transcribible cuya expresión pueda ser evaluada o calificada de alguna manera) y sometidos a ensayo en análisis en plantas transitorias o estables para proporcionar una indicación del patrón de la expresión génica del elemento regulador en plantas transgénicas estables. Los genes marcadores para ser usados en la puesta en práctica de tales realizaciones incluyen, sin limitación, moléculas de polinucleótidos transcribibles que codifican β-glucuronidasa (GUS, descrita en la patente estadounidense nº 5.599.670) y la proteína fluorescente verde (GFP, descrita en las patentes estadounidenses nos 5.491.084 y 6.146.826), proteínas que confieren resistencia a antibióticos , o proteínas que confieren tolerancia a herbicidas. En la técnica se conocen marcadores útiles de resistencia a antibióticos, incluyendo los que codifican proteínas que confieren resistencia a la kanamicina (nptII), a la higromicina B (aph IV), a la estreptomicina o a la espectinomicina (aad, spec/strep) y a la gentamicina (aac3 y aacC4). Los herbicidas a los cuales se ha demostrado tolerancia y a los que se puede aplicar el método de la presente invención, incluyen, sin limitación: herbicidas de glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, dalapón, ciclohexanodiona, inhibidores de la tropoporfirinógeno oxidasa, e isoxaflutol. En la técnica se conocen moléculas de polinucleótidos que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas, e incluyen, sin limitación, una molécula de polinucleótido que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS, descrito en las patentes estadounidenses nos 5.627.061, 5.633.435, 6.040.497 y en la patente estadounidense nº
5.094.945 para la tolerancia al glifosato); polinucleótidos que codifican una glifosato oxidorreductasa y una glifosatoN-acetil transferasa (GOX, descrito en la patente estadounidense nº 5.463.175, y GAT, descrito en la publicación estadounidense nº 20030083480); una molécula de polinucleótido que codifica la bromoxinil nitrilasa (Bxn, descrita en la patente estadounidense nº 4.810.648 para la tolerancia al bromoxinil); una molécula de polinucleótido que codifica la fitoeno desaturasa (crtI), descrita en Misawa et al. (Plant J. 4:833-840, 1993) y Misawa et al. (Plant J. 6:481-489, 1994) para la tolerancia a la norflurazona; una molécula de polinucleótido que codifica la acetohidroxiácido sintasa (AHAS, también denominada ALS), descrita en Sathasiivan et al. (Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990) para la tolerancia a los herbicidas de sulfonilurea; una molécula de polinucleótido que codifica una enzima oxigenasa degradadora de la dicamba (descrita en las publicaciones de patente estadounidense US20030135879 y US20030115626, para la tolerancia a la dicamba); y el gen bar, descrito en DeBlock et al. (EMBO
J. 6:2513-2519, 1987) para la tolerancia al glufosinato y al bialafós. Los elementos reguladores de la presente divulgación pueden expresar moléculas de polinucleótidos transcribibles que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, EPSPS resistente a glifosato, aminoglucósido fosfotransferasa, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, higromicina fosfotransferasa, neomicina fosfotransferasa, dalapón deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinil, antranilato sintasa, glifosato oxidorreductasa y glifosato-N-acetil transferasa.
Los constructos que contienen al menos un potenciador de SCBV (por ejemplo, en el contexto de una región quimérica reguladora de la transcripción) operativamente ligado a un gen marcador o a otra secuencia de nucleótidos de interés pueden ser distribuidos a tejidos (por ejemplo, transformados) y los tejidos analizados por el mecanismo apropiado, dependiendo del marcador o la secuencia que se esté transcribiendo. Tales análisis cuantitativos o cualitativos pueden ser usados como herramientas para evaluar el perfil de expresión potencial de un elemento regulador cuando está operativamente ligado a un gen de interés agronómico en plantas estables. El gen marcador puede ser usado en un ensayo transitorio; las personas con un dominio normal de la técnica conocen métodos de ensayo para la identificación de la expresión del gen marcador en ensayos transitorios. La expresión transitoria de genes marcadores ha sido documentada usando diversas plantas, tejidos y sistemas de distribución de ADN. Por ejemplo, los sistemas de análisis transitorios incluyen, sin limitación, distribución directa de genes
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