CN115266633B - 一种利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，该方法包括利用Dual‑PAM叶绿素荧光仪对处于低温条件或弱光条件下的待测番茄叶片以及对照组叶片进行远红外光吸收检测，得到远红外吸收动力学曲线；计算得到待测番茄叶片和对照组番茄叶片的曲线参数R和曲线参数dx，从而诊断待测番茄状态。本发明在获得快速远红外吸收值A₈₃₀的动力学曲线的基础上，按特定的规则处理数据，得到一个参数R，将曲线标准化后拟合得到参数dx；根据对照条件下叶片的R和dx所在值域，能够诊断植株是否遭受胁迫，并分别根据R和dx所处的值域诊断植株所受胁迫类型，有利于及时获取作物的光合效率信息。

Description

一种利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光 胁迫状态的方法

技术领域

本发明涉及植物胁迫诊断技术领域，尤其涉及一种利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法。

背景技术

主要设施作物番茄、辣椒、黄瓜等均为喜温作物，而低温弱光是我国冬春季节设施生产的主要逆境，设施环境内光照温度波动大，极易发生光抑制和叶片损伤。在胁迫下光合作用最先受到损伤，作物酶活性的破坏会导致叶绿体吸收的光能过剩并产生氧化胁迫。

目前，判断作物是否遭受低温弱光胁迫主要通过测定光合速率，可溶性糖含量，抗氧化酶活性以及光合系统的活性等方法。植物的光合系统主要包括光系统I和光系统II，而现有的大多数研究主要基于光系统II量子效率，即叶绿素荧光变化，例如，公告号为CN104034710A的发明专利申请公开了“基于叶绿素荧光及成像技术的植物病害检测方法及装置”；公告号为CN106706579A的发明专利申请提出了“一种利用叶绿素荧光技术筛选耐高温玉米品种的方法”。

虽然，叶绿素荧光已广泛应用于作物生物和非生物胁迫的检测，但现有研究对光系统I活性的变化重视不足，有研究发现低温和弱光胁迫下，光系统II和光系统I都会发生光抑制，但光系统I受到的光抑制比光系统II更严重，这表明光系统I是低温和弱光胁迫下光抑制的首要位点，而光化学反应的活性取决于光系统中活性较低的那一个，同时光系统II有快速修复机制，而光系统I没有此机制，光系统I一旦发生不可逆损伤后将导致温度恢复阶段植株的氧化胁迫，因此在低温弱光胁迫下研究光系统I活性的变化更有实际意义。

温度和光照对植物的生长发育至关重要，尤其对作物的光合作用有极大的影响，植物在光和温度感测中有共同的信号存在，其信号转导十分复杂。低温胁迫和弱光胁迫耦合性较强，能够显著降低作物生长活力和生长发育速度，常规的测定净光合速率及叶绿素荧光参数方法能够检测作物是否遭受胁迫，并且基本已经能区分温度、病害、缺素等胁迫，但对于低温胁迫和弱光胁迫之间，还是不能很好地分辨。

总而言之，传统诊断方法难以区分低温和弱光胁迫，同时存在设备成本高、不易携带以及测定耗时久的缺点，不便于普及，无法在生产实践中大规模应用，因此快速准确诊断低温和弱光胁迫的技术问题亟待解决。

发明内容

现有的植物胁迫诊断技术中诊断速度较慢，往往还存在只能判断某一种胁迫的问题，不能区分低温和弱光胁迫，为了提高诊断效率，本发明提供了一种利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，可以同时诊断低温胁迫和弱光胁迫，诊断准确率高。

具体技术方案如下：

本发明一种利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，包括如下步骤：

(1)以正常温度条件或正常光照条件下的番茄植物作为对照组，利用Dual-PAM叶绿素荧光仪对处于低温条件或弱光条件下的待测番茄叶片以及对照组叶片进行远红外光吸收检测，采集检测时间内番茄叶片的远红外吸收值A₈₃₀(光系统I PSI在830nm近远红外光吸收值)，得到远红外吸收动力学曲线；

Dual-PAM叶绿素荧光仪的运行方法为：启动P700模式，仪器运行4～6s后，打开远红光，持续8～12s，再打开饱和脉冲，并立即开启光化光，持续8～12s后，关闭光化光，18～22s后关闭远红光，结束运行；

(2)采用以下方法分别诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态；

(2-1)根据步骤(1)的远红外吸收动力学曲线和公式(I)，计算得到待测番茄叶片和对照组番茄叶片的曲线参数R；

判断待测番茄叶片的曲线参数R是否小于对照组番茄叶片的曲线参数R的80％；若小于，则诊断待测番茄处于低温胁迫状态；反之，则诊断待测番茄不处于低温胁迫状态；

R＝(A₂-A₁)/(A₃-A₁) 式(I)；

式(I)中，R为曲线参数；A₁为紧邻远红外光打开前连续5～8个点的远红外光吸收均值；A2为紧邻饱和脉冲打开前连续5～8个点的远红外光吸收均值；A3为整个远红外吸收动力学曲线中的最大远红外吸收值；

(2-2)先根据公式(II)对远红外吸收值进行标准化处理，再以时间为横坐标，标准化后的远红外吸收值为纵坐标，利用origin软件对标准化后25.04～29秒时间段的远红外吸收值做散点图，选择Sigmoidal函数进行曲线拟合，得到曲线参数dx；

判断待测番茄叶片的曲线参数dx是否大于对照组番茄叶片的曲线参数dx的150％；若大于，则诊断待测番茄处于弱光胁迫状态；反之，则诊断待测番茄不处于弱光胁迫状态；

An(t)＝(A_t-A₀)/(A₃-A₀) 式(II)；

式(II)中，An(t)为标准化后的任意时间点的远红外吸收值；A_t为任意时间点远红外吸收值为At；A₀为起始远红外吸收值；A₃为最大远红外吸收值。

低温胁迫会对PSI造成伤害，导致有活性的PSI减少，经试验和数据分析，参数R能够反映有活性的PSI占PSI总量的比例，弱光胁迫下卡尔文循环相关酶的活性钝化，导致PSI电子传递受阻及光化学反应效率降低，从而阻碍远红外处理下A₈₃₀值的升高，经试验和数据分析，参数dx能够反映PSI光化学反应效率。

进一步地，所述正常温度条件为20～25℃；正常光照条件为200～300μmol m^-2s^-1；所述低温条件为小于等于10℃；所述弱光条件为小于等于50μmol m^-2s^-1。

进一步地，所述待测番茄叶片以及对照组叶片均为成熟功能叶片。

进一步地，步骤(1)中，所述远红外光的波长为830nm。

进一步地，步骤(1)中，Dual-PAM叶绿素荧光仪的运行方法为：启动P700模式，调零后打开自定义程序，具体程序为：运行5s后打开远红光，设置远红外光的强度为10000μE，持续10s后，再打开饱和脉冲，设置饱和脉冲的强度为10000μE，并立即开启光化光，设置光化光的强度为216μE，持续10s后，再关闭光化光，20s后关闭远红光，结束运行。

进一步地，步骤(2-2)中，所述Sigmoidal函数的公式为：

y＝(M-N)/(1+exp((x-x0)/dx))+N 式(III)；

式(III)中，y为曲线标准化后相对变化值；M为标准化曲线最高渐近线对应值；N为标准化曲线最低渐近线对应值；x为时间；x0为初始时间；dx为标准化曲线变化系数，反映变化速度；exp为以自然常数e为底数，(x-x0)/dx为指数的指数函数，e＝2.71828183…。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明在利用Dual-PAM荧光仪按照自定义程序获得快速远红外吸收值A₈₃₀的动力学曲线的基础上，按特定的规则处理数据，得到一个参数R，将曲线标准化后拟合得到参数dx；根据对照条件下叶片的R和dx所在值域，能够诊断植株是否遭受胁迫，并分别根据R和dx所处的值域诊断植株所受胁迫类型，有利于及时获取作物的光合效率信息。

(2)本发明方法可以应用于育种过程筛选抗性种质，可以用于监测环境变化对植物光合生理过程造成的影响，为作物栽培条件的改善提供依据。

(3)本发明方法有利于农业生产往科学化、精细化方向发展，同时也可以应用于胁迫诊断领域的专家系统，能够进一步提高农产品的产量与品质。

(4)本发明方法优点在于操作简单，速度快，不会对植物造成损伤，相比于传统叶绿素荧光测定方法，此方法着重于光系统I的变化，不需要进行暗适应，节省了较多时间，同时此方法可用于区分和判断低温及弱光两种胁迫，有利于实现冬春季节对作物健康状态的有效监测，及时采取防护措施从而保证作物正常生长发育。

附图说明

图1为本发明方法利用Dual-PAM荧光仪的具体运行程序界面。

图2为本发明方法利用双通道Dual-PAM荧光仪测定远红外吸收值A₈₃₀动力学曲线；

其中，A为标准化前远红外吸收动力学曲线；B为标准化后远红外吸收动力学曲线；B为标准化后25.04～29s远红外吸收动力学曲线。

图3为利用Origin软件所作对照组、低温组、弱光组的净光合速率及参数R与dx均值柱状图；

其中，A为净光合速率；B为参数R；C为参数dx。

图4为利用Excel软件所作对照组、低温组、弱光组的参数R与dx数值散点图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

一、材料与方法

供试材料为野生型番茄品种(Condine Red)。将种子放入50℃温水浸15分钟后，再置于恒温摇床(28℃，200rpm/min)催芽，胚根长度为0.5～1cm时播于穴盘中，基质包含草炭和蛭石(3：1，v/v)，置于植物工厂中培养，光周期12小时/12小时，平均昼夜温度为25℃/20℃，光照强度为200μmol m^-2s^-1。待幼苗生长至三叶一心后，选取生长一致的幼苗移于直径为10cm的育苗钵中，继续培养至六叶一心。

挑选长势良好且一致的番茄，平均分成三组，其中两组分别进行低温处理和弱光处理；另外一组作为对照在气候箱生长，光周期为12小时/12小时，平均昼夜温度为25℃，光照强度为200μmol m^-2s^-1。

弱光处理方法是将番茄植株置于植物气候箱中，光照强度控制为20μmol m^-2s^-1，24小时后待测；低温处理方法是将番茄植株置于植物气候箱中，温度调至8℃，24小时后待测；对照处理方法是将番茄植株置于植物气候箱中，温度为25℃，光照强度为200μmol m^-2s^-1，24小时后待测。需要说明的是，在各胁迫处理过程中，除了胁迫因子，其他环境因子均与对照组相同。

依次取出待测的各组番茄，首先测量各组番茄植株的净光合速率，将对照组光合速率均值作为判断胁迫组是否遭受胁迫的依据，接着利用Dual-PAM荧光仪的P700模式，调零后，按照自定义程序(如图1)，具体为：运行5s后打开远红光(强度为10000μE)，持续10s，打开饱和脉冲(强度为10000μE)，立即打开光化光(强度为216μE)，持续10s，随后关闭光化光，20s后关闭远红光，结束运行；测量两组受胁迫植株及对照植株的叶片，得到远红外吸收值和对应的时间(如图2)。

数据测定完成后，保存到表格中，按自定义公式(A₂-A₁)/(A₃-A₁)计算自定义参数R，紧邻远红光打开时A₈₃₀上升前连续8个点的均值为A₁，紧邻饱和脉冲打开前A₈₃₀值上升前连续8个点的均值为A₂，整个曲线中A₈₃₀最大值为A₃。将远红外吸收值进行标准化处理，以时间为横坐标，An(t)值为纵坐标，利用origin软件做出散点图，拟合曲线，求得曲线参数dx；具体做法是复制25.04～29秒时间段内的An(t)值到origin中，依次点击“Plot”→“Symbol”→“Scatter”，做出散点图；选中散点图后，依次点击“Analysis”→“Fitting”→“Sigmoidal”→“Fit”，完成曲线拟合，得到参数dx；

最后一步，观察待检测叶片叶绿素荧光参数R和dx所落值域，与对照组两个参数值域进行比较，即可诊断植株是否受胁迫，以及受何种胁迫。具体做法如下：

(1)此次实验中对照组番茄植株叶片参数R均值为0.87，观察待检测番茄植株叶片的R值是否低于对照组均值的80％：若低于，则诊断待检测植株受低温胁迫；例如，图3中低温组参数R均值为0.68，低于对照组参数R均值的80％，由此可以判断，本发明中的低温处理后的待测番茄植株受胁迫。

(2)此次实验中对照组番茄植株叶片参数dx均值在0.58左右，观察待检测番茄植株叶片的dx值是否高于对照组均值的150％，若高于，可以判定番茄植株受弱光胁迫。例如，图3中弱光组参数dx均值为1.67，高于对照组参数dx均值的150％，由此可以判断，本发明中的弱光处理后的待测番茄植株受胁迫。

将对照组、低温组、弱光组的参数R和dx作散点图，我们发现图4中不同处理组植株所对应散点基本被聚为一类。经过本次试验验证，针对番茄植株，参数R和dx可有效判断低温和弱光胁迫，受到低温、弱光胁迫时，得到的R和dx变化趋势不同，低温胁迫下，参数R变化明显，dx变化不明显，而在弱光胁迫下，参数dx变化明显，R变化不明显；针对不同的胁迫，得到待检测叶片的曲线参数R和dx后，可根据对照番茄叶片R和dx所落值域，同时考虑温度、光照等环境因素，对待检测叶片受胁迫类型进行诊断。

净光合速率能够在整体上反映植物光合作用能力的强弱，虽然番茄植株在遭受不同胁迫后净光合速率均会显著降低，但仅凭借此参数并不能准确区分低温胁迫和弱光胁迫。前人研究表明在低温和弱光胁迫下，PSI均会遭到抑制，对光合影响较大，因此相比于测定净光合速率，本发明通过PSI的活性来判断番茄植株是否遭受胁迫更具有现实意义，实例数据表明参数R在低温胁迫下明显降低，在对照组均值80％(不包含)以下，差异显著，而弱光胁迫下变化不明显，参数dx在弱光胁迫下明显升高，在对照组均值150％(不包含)以上，差异显著，而低温胁迫下变化不明显，以上结果表明该方法能够准确区分低温胁迫和弱光胁迫。

Claims (6)

1.一种利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以正常温度条件或正常光照条件下的番茄植物作为对照组，利用Dual-PAM叶绿素荧光仪对处于低温条件或弱光条件下的待测番茄叶片以及对照组叶片进行远红外光吸收检测，采集检测时间内番茄叶片的远红外吸收值A₈₃₀，得到远红外吸收动力学曲线；

Dual-PAM叶绿素荧光仪的运行方法为：启动P700模式，仪器运行4～6s后，打开远红光，持续8～12s，再打开饱和脉冲，并立即开启光化光，持续8～12s后，关闭光化光，18～22s后关闭远红光，结束运行；

(2)采用以下方法分别诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态；

(2-1)根据步骤(1)的远红外吸收动力学曲线和公式(I)，计算得到待测番茄叶片和对照组番茄叶片的曲线参数R；

判断待测番茄叶片的曲线参数R是否小于对照组番茄叶片的曲线参数R的80％；若小于，则诊断待测番茄处于低温胁迫状态；反之，则诊断待测番茄不处于低温胁迫状态；

R＝(A₂-A₁)/(A₃-A₁) 式(I)；

式(I)中，R为曲线参数；A₁为紧邻远红外光打开前连续5～8个点的远红外光吸收均值；A2为紧邻饱和脉冲打开前连续5～8个点的远红外光吸收均值；A3为整个远红外吸收动力学曲线中的最大远红外吸收值；

(2-2)先根据公式(II)对远红外吸收值进行标准化处理，再以时间为横坐标，标准化后的远红外吸收值为纵坐标，利用origin软件对标准化后25.04～29秒时间段的远红外吸收值做散点图，选择Sigmoidal函数进行曲线拟合，得到曲线参数dx；

判断待测番茄叶片的曲线参数dx是否大于对照组番茄叶片的曲线参数dx的150％；若大于，则诊断待测番茄处于弱光胁迫状态；反之，则诊断待测番茄不处于弱光胁迫状态；

An(t)＝(A_t-A₀)/(A₃-A₀) 式(II)；

式(II)中，An(t)为标准化后的任意时间点的远红外吸收值；A_t为任意时间点远红外吸收值为At；A₀为起始远红外吸收值；A₃为最大远红外吸收值。

2.如权利要求1所述的利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，其特征在于，所述正常温度条件为20～25℃；正常光照条件为200～300μmol m^{- 2}s^-1；所述低温条件为小于等于10℃；所述弱光条件为小于等于50μmol m^-2s^-1。

3.如权利要求1所述的利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，其特征在于，所述待测番茄叶片以及对照组叶片均为成熟功能叶片。

4.如权利要求1所述的利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述远红外光的波长为830nm。

5.如权利要求1所述的利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，其特征在于，步骤(1)中，Dual-PAM叶绿素荧光仪的运行方法为：启动P700模式，调零后打开自定义程序，具体程序为：运行5s后打开远红光，设置远红外光的强度为10000μE，持续10s后，再打开饱和脉冲，设置饱和脉冲的强度为10000μE，并立即开启光化光，设置光化光的强度为216μE，持续10s后，再关闭光化光，20s后关闭远红光，结束运行。

6.如权利要求1所述的利用远红外吸收快速诊断番茄是否处于低温胁迫或弱光胁迫状态的方法，其特征在于，步骤(2-2)中，所述Sigmoidal函数的公式为：

y＝(M-N)/(1+exp((x-x0)/dx))+N 式(III)；

式(III)中，y为曲线标准化后相对变化值；M为标准化曲线最高渐近线对应值；N为标准化曲线最低渐近线对应值；x为时间；x0为初始时间；dx为标准化曲线变化系数，反映变化速度；exp为以自然常数e为底数，(x-x0)/dx为指数的指数函数。