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ES2656050T3 - Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas - Google Patents

Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas Download PDF

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ES2656050T3 ES12735420.7T ES12735420T ES2656050T3 ES 2656050 T3 ES2656050 T3 ES 2656050T3 ES 12735420 T ES12735420 T ES 12735420T ES 2656050 T3 ES2656050 T3 ES 2656050T3
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Ethan Settembre
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GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende: (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico y (ii) un segundo antígeno polipeptídico; en la que dicho primer y segundo antígenos son antígenos de diferentes patógenos.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas Antecedente de la invención
Las vacunas de combinación combinan antígenos que previenen diferentes enfermedades o que protegen contra múltiples cepas de agentes infecciosos que causan la misma enfermedad en un único producto. Por tanto, reducen la cantidad de inyecciones necesarias para prevenir algunas enfermedades. Las ventajas potenciales de las vacunas de combinación incluyen a) reducción del coste de almacenamiento y administración de vacunas diferentes, b) reducción del coste de visitas adicionales de asistencia sanitaria y c) facilidad de añadir nuevas vacunas a programas de inmunización.
Las vacunas basadas en ácido nucleico son una estrategia atractiva para la vacunación. Por ejemplo, la inmunización intramuscular (IM) de ADN plasmídico que codifica un antígeno puede incluir respuestas inmunitarias celulares y humorales y protegen contra la exposición. Las vacunas de ADN ofrecen ciertas ventajas sobre las vacunas tradicionales que usan antígenos proteicos, o patógenos atenuados. Por ejemplo, en comparación con las vacunas de proteína, las vacunas de ADN pueden ser más eficaces en la producción de un antígeno apropiadamente plegado en su conformación nativa, y en la generación de una respuesta inmunitaria celular. Las vacunas de ADN además no tienen algunos de los problemas de seguridad asociados con los patógenos inactivados o atenuados. Por ejemplo, una preparación vírica inactivada puede contener virus vivos residuales, y un virus atenuado puede mutar y revertir a un fenotipo patogénico. Las vacunas de ADN generalmente son eficaces en la generación de inmunidad mediada por células (tales como linfocitos T específicos de antígeno que secretan interferón-Y y linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno), pero son menos eficaces en la generación de anticuerpos contra el antígeno codificado y expresado.
El documento WO 97/28818 divulga una vacuna que suministra un ácido nucleico y un antígeno proteico a células presentadoras de antígeno. El ácido nucleico puede codificar la misma proteína que el antígeno proteico. El ácido nucleico y la proteína forman "complejos", por ejemplo, por conjugación covalente. El complejo puede formularse como una partícula sintética de tipo virus. También se sugiere que pueden usarse sistemas liposómicos.
La patente de Estados Unidos n.° 7.604.803 divulga el cosuministro de ácido nucleico y su proteína codificada a la misma célula usando un sistema liposómico. La molécula de ADN y su proteína codificada quedan atrapadas dentro del mismo vehículo liposómico, de modo que las dos entidades llegan a las células presentadoras de antígeno juntas, lo que provoca el procesamiento y la presentación de la forma proteica del antígeno, junto con la expresión de la forma codifica de ADN del antígeno en la misma célula.
El documento WO 2009/074861 divulga una vacuna que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno del virus de la gripe recubierto sobre partículas de vehículo, y (ii) una proteína auxiliar para la administración secuencial o concomitante. La proteína auxiliar y el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico comparten al menos un epítopo común.
Se sabe que el ADN plasmídico no codificante tiene una acción inmunoadyuvante cuando queda atrapado junto con péptidos en vesículas liposómicas (Gursel, M. y col. Vaccine (1999) 17: 1376-1383) y el ADN con motivos CpG tiene un efecto adyuvante sobre el ADN desnudo y vacunas de péptido (Klinman, D. M. y col. Vaccine (1999) 17: 19-25).
Ha surgido preocupaciones respecto a la seguridad de las vacunas basadas en ADN. Las moléculas de ADN introducidas podrían integrarse potencialmente en el genoma huésped o, debido a su distribución a diversos tejidos, podría dar lugar a una expresión sostenida indeseable de los antígenos. Además, ciertos virus de ADN se han usado para suministrar moléculas de ADN. A causa de sus propiedades infecciosas, dichos virus consiguen una tasa de transfección muy elevada. Los virus usados se modifican genéticamente para evitar la formación de partículas infecciosas funcionales en la célula transfectada. A pesas de esas precauciones, sin embargo, no es posible descartar el riesgo de propagación incontrolada del gen introducido y los genes víricos, por ejemplo, debido a posibles eventos de recombinación. Esto también implica el riesgo de que el ADN se inserte en un gen intacto del genoma de la célula huésped por, por ejemplo, recombinación, con la secuencia de que el gen huésped puede mutarse y, por tanto, inactivarse completa o parcialmente o puede dar lugar a una información incorrecta. En otras palabras, la síntesis de un producto génico huésped que es vital para la célula puede suprimirse completamente o, como alternativa, puede expresarse un producto génico modificado o incorrecto.
También puede usarse moléculas de ARN que codifican un antígeno o un derivado del mismo como vacunas. Las vacunas de ARN ofrecen ciertas ventajas en comparación con las vacunas de ADN. Sin embargo, en comparación con las vacunas basadas en ADN, se ha dado relativamente menos atención a las vacunas basadas en ARN. Los ARN son muy susceptibles a la degradación por nucleadas cuando se administran como agente terapéutico o vacuna. Véase, por ejemplo, Vajdy, M., y col., Mucosal adjuvants and delivery systemsfor protein-, DNA- and RNA- based vaccines, Immunol Cell Biol, 2004. 82(6): pág. 617-27.
Los receptores de tipo toll (TLR) son un grupo de receptores de reconocimiento de patrones que se unen a patrones moleculares asociados a patógeno (PAMPS) de bacterias, hongos, protozoos y virus, y actúan como la primera línea
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de defensa contra patógenos invasores. Muchos TLR se han identificado en seres humanos, ratones y otras especies de mamífero. Las moléculas de ADN (tales como ADN bacteriano o vírico) se reconocen por TLR9, mientras que las moléculas de ARN (tal como ARN vírico monocatenario) se reconocen por TLR7 o TLR8.
Los linfocitos T y los linfocitos B reconocen antígenos de diferentes maneras. Los linfocitos T reconocen fragmentos peptídicos de proteínas que se integran en moléculas MHC de clase II o clase I en la superficie de las células, mientras que los linfocitos B reconocen características superficiales de un antígeno no procesado, mediante receptores de superficie celular de tipo inmunoglobulina. La diferencia en los mecanismos de reconocimiento de antígeno de los linfocitos T y los linfocitos B se reflejan en las diferentes naturalezas de sus epítopos. Por tanto, mientras que los linfocitos B reconocen características superficiales de un antígeno o un patógeno, los epítopos de linfocitos T (que comprenden péptidos de aproximadamente 8-12 aminoácidos de longitud) pueden ser "internos", así como "superficiales" cuando se observan en el contexto de la estructura tridimensional del antígeno. Por consiguiente, un epítopo de linfocito B se expone preferentemente sobre la superficie del antígeno o patógeno, y puede ser lineal o conformacional, mientras que un epítopo de linfocito T típicamente es lineal, pero no se requiere que esté disponible o sobre la superficie del antígeno.
La patente de Estados Unidos n.° 7.862.829 divulga un procedimiento de producción de una respuesta inmunitaria por administración de un antígeno y un adyuvante basado en alfavirus. El procedimiento se basa en el descubrimiento de que el alfavirus, un virus de ARNmc (+), puede actuar como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno, aunque el antígeno no se presente sobre o se exprese por el virus. Las partículas de alfavirus pueden suministrarse por un sistema liposómico.
El documento WO 2011/005799 describe ARN autorreplicante que codifica un antígeno, pero no divulga una composición inmunogénica que comprende además un segundo antígeno polipeptídico, de un patógeno diferente.
Bernstein y col. (Vaccine, 2009, vol. 28, n.° 2, 484-493) describe partículas de replicón vírico que comprenden un replicón que codifica un antígeno polipeptídico de CMV, pero no divulga una composición inmunogénica que comprende además un segundo antígeno polipeptídico, de un patógeno diferente.
Existe la necesidad de mejorar la eficacia de las vacunas de subunidad proteica y vacunas de ácido nucleico tales como vacunas de ARN.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere en líneas generales a composiciones inmunogénicas que comprenden un componente de ARN y un componente polipeptídico. Las composiciones inmunogénicas suministran una combinación de epítopos antigénicos en dos formas diferentes - un primer epítopo de un patógeno, en forma codificada de ARN; y un segundo epítopo de un patógeno diferente, en forma polipeptídica - y pueden inducir una respuesta inmunitaria contra ambos patógenos (por ejemplo, sin la necesidad de un adyuvante diferente). Un beneficio práctico de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento es que la cantidad total de composiciones inmunogénicas que se necesita administrar al paciente se reduce debido a la combinación de dos o más antígenos en una única composición inmunogénica. Esto es especialmente beneficioso para bebés y niños que reciben una gran cantidad de vacunaciones rutinarias.
La invención también se refiere a composiciones inmunogénicas para su uso en procedimientos para tratar o prevenir dos o más enfermedades infecciosas, procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria contra dos o más patógenos o procedimientos de vacunación de un sujeto, por cosuministro de una molécula de ARN y una molécula polipeptídica (coadministración).
En un aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico y (ii) un segundo antígeno polipeptídico, en la que el primer y segundo antígenos son antígenos de diferentes patógenos. En algunas realizaciones, el primer antígeno polipeptídico es un antígeno de citomegalovirus (CMV). En algunas realizaciones el segundo antígeno polipeptídico es un antígeno de parvovirus. El segundo antígeno polipeptídico puede estar en forma de una partícula de tipo virus (VLP).
En algunas realizaciones, el segundo antígeno polipeptídico es un polipéptido soluble y el primer antígeno polipeptídico es un polipéptido soluble o anclado a membrana.
En algunas realizaciones, el ARN autorreplicante es un replicón de ARN derivado de alfavirus. La molécula de ARN autorreplicante puede comprender uno o más nucleótidos modificados.
En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende además un lípido catiónico, un liposoma, un cocleato, un virosoma, un complejo inmunoestimulador, una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, una vesícula unilaminar, una vesícula multilaminar, una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite, un emulsoma, un péptido policatiónico o una nanoemulsión catiónica.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN se encapsula en, se une a o se adsorbe sobre un lípido catiónico, un
liposoma, un cocleato, un virosoma, un complejo inmunoestimulador, una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, una vesícula unilaminar, una vesícula multilaminar, una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite, un emulsoma, un péptido policatiónico, una nanoemulsión catiónica o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el primer y segundo antígenos polipeptídicos se obtienen independientemente de un 5 patógeno vírico, un patógeno bacteriano, un patógeno fúngico, un patógeno protozoico y un patógeno parasitario multicelular. El primer antígeno polipeptídico y el segundo antígeno polipeptídico pueden ser ambos antígenos víricos. En dichos casos, un antígeno vírico puede ser de CMV. En otro caso, un antígeno vírico puede ser de parvovirus. El antígeno de parvovirus puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 25-26. El antígeno vírico de CMV puede ser un antígeno gB, un antígeno gH o un antígeno gL. En algunas 10 realizaciones, el antígeno vírico de CMV puede ser un antígeno gH o un antígeno gL.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN codifica un antígeno gH y un antígeno gL. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico gH y un antígeno polipeptídico gL.
En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende además un adyuvante.
La invención también se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden (i) un antígeno polipéptido de 15 parvovirus y (ii) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un antígeno polipeptídico de CMV.
La invención también se refiere a composiciones inmunogénicas y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también se refiere a una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa, en la que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una 20 composición inmunogénica a un sujeto.
La invención también se refiere a una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, en la que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición inmunogénica al sujeto.
La invención también se refiere a una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento de vacunación 25 de un sujeto, en la que la composición inmunogénica se administra al sujeto.
Descripción detallada de la invención
Ciertos términos que se usan para describir la invención en este se definen y explican en el presente documento en la sección 6.
1. Visión general
30 Una ventaja particular de una vacuna de ARN es que las moléculas de ARN son autoadyuvantes. Por ejemplo, las moléculas de ARN pueden inducir la producción de citocinas, que pueden potenciar la respuesta inmunitaria del huésped conta el antígeno proteico que está codificado por la molécula de ARN.
Las estrategias de vacunación que combinan una molécula de ARN y una molécula polipeptídica (por ejemplo, administración de una composición inmunogénica que tiene un componente de ARN y un componente proteico) 35 proporcionan varios beneficios. Las moléculas de ARN promueven las respuestas auxiliares T de tipo 1 (Th1, IFN-Yhi, IL-4lD), mientras que las moléculas proteicas promueven las respuestas auxiliares T de tipo 2. Por tanto, la combinación de una molécula de ARN y una molécula polipeptídica puede promover tanto la inmunidad mediada por linfocitos T como la inmunidad humoral. Además, las moléculas de ARN pueden suministrarse a células usando sistemas de suministro tales como liposomas o emulsiones de aceite en agua. Los liposomas y las emulsiones de 40 aceite en agua también son conocidas por tener actividades adyuvantes. Por tanto, la actividad adyuvante de ARN junto que la actividad adyuvante del sistema de suministro, pueden actuar de forma sinérgica para potenciar la respuesta inmunitaria contra uno o ambos antígenos.
En un aspecto, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden un componente de ARN de un primer patógeno y un componente polipeptídico de un segundo patógeno. Las composiciones inmunogénicas que 45 suministran epítopos antigénicos en dos formas diferentes - un primer epítopo de un patógeno, en forma codifica de ARN; y un segundo epítopo de un patógeno diferente, en forma polipeptídica - pueden potenciar la respuesta inmunitaria contra uno o ambos patógenos.
Como se describe en el presente documento, los autores de la presente invención han evaluado las eficacias de composiciones inmunogénicas que comprenden (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un antígeno 50 de CMV y (ii) un antígeno polipeptídico de parvovirus. Estos estudios demostraron que la coadministración de una molécula de ARN que codifica un antígeno de CMV junto con el antígeno de parvovirus en forma polipeptídica, potenciaba la respuesta inmunitaria contra el antígeno de parvovirus, produciendo títulos de anticuerpo mayores en comparación con la administración de la molécula polipeptídica de parvovirus en solitario.
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Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden formularse como una vacuna para inducir o potenciar la respuesta inmunitaria del huésped contra un patógeno, tal como para inducir la inmunidad protectora. También se proporcionan en el presente documento composiciones inmunogénicas de la invención para su uso en un procedimiento para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita.
2. Composiciones inmunogénicas
En un aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico; y (ii) un segundo antígeno polipeptídico; en la que dichos primer y segundo antígenos polipeptídicos son de patógenos diferentes.
En ciertas realizaciones, la molécula de ARN puede codificar un primer antígeno polipeptídico que comprende una proteína de longitud completa de un patógeno (por ejemplo, una proteína vírica) o una parte antigénica del mismo, opcionalmente fusionado con una secuencia marcadora que puede facilitar la expresión, purificación y/o detección de la proteína. El segundo antígeno polipeptídico puede ser una proteína recombinante que comprende una proteína de longitud completa de un patógeno diferente, o una parte antigénica del mismo, opcionalmente fusionado con una secuencia marcadora que puede facilitar la producción, purificación o detección de la proteína. El primer antígeno polipeptídico, el segundo antígeno polipeptídico o ambos pueden comprender una variante de mutación de una proteína de un patógeno (por ejemplo, una proteína vírica que tiene una o más sustituciones, adiciones o eliminación de aminoácidos).
En ciertas realizaciones, el primer antígeno polipeptídico es un polipéptido soluble o anclado a membrana, y el segundo antígeno polipeptídico es un polipéptido soluble. Por ejemplo, si la proteína vírica de tipo silvestre es una proteína superficial transmembrana, la molécula de ARN puede comprender la secuencia codificante de longitud completa para producir el primer antígeno (anclado a membrana), mientras que la región transmembrana de la proteína vírica puede eliminarse para producir el segundo antígeno polipeptídico (que es soluble).
En ciertas realizaciones, el primer antígeno o el segundo antígeno es un polipéptido de fusión que comprende además un tercer epítopo. El tercer epítopo puede ser de un patógeno diferente, o de un antígeno diferente del mismo patógeno.
La molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico puede estar en forma de una VRP. El segundo antígeno polipeptídico puede estar en forma de una VLP.
A. Antígenos
Los antígenos adecuados para su inclusión en las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento (en forma polipeptídica o en forma codificada de ARN) pueden obtenerse de cualquier patógeno (por ejemplo, un patógeno bacteriano, un patógeno, vírico, un patógeno fúngico, un patógeno protozoico o un patógeno parasitario multicelular), alérgeno o tumor.
En ciertas realizaciones, el primer y/o segundo antígeno se obtienen de un patógeno vírico. Los patógenos víricos ejemplares incluyen, por ejemplo, el virus sincitial respiratorio (RSV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus Dengue, el virus del herpes simple (HSV; por ejemplo, HSV-I, HSV-II), el virus del molusco contagioso, el virus vaccinia, el virus de la viruela, lentivirus, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del papiloma humano (HPV), citomegalovirus (CMV), el virus de la varicela y zóster (VZV), rinovirus, enterovirus, adenovirus, coronavirus (por ejemplo, SARS), virus de la gripe (flu), virus paragripal, virus de las paperas, virus del sarampión, papovavirus, hepadnavirus, flavivirus, retrovirus, arenavirus (por ejemplo, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus Junin, virus Machupo, virus Guanarito o virus Lassa), norovirus, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia, filovirus (por ejemplo, virus Ébola o virus Marburgo), virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis A, morbillivirus (por ejemplo, virus del sarampión), rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas), rubivirus (por ejemplo virus de la rubéola), virus de la diarrea vírica bovina. Por ejemplo, el antígeno puede ser la glucoproteína gH o gL de CMV; parvovirus; la glucoproteína gp 120 o gp 140 de VIH, p55 gag, pol de VIH; o el antígeno F de RSV, etc.
En algunas realizaciones, el primer y/o segundo antígeno se obtienen de un virus que infecta peces, tales como: virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), virus del barbo de canal (CCV), virus de la enfermedad de la linfocistis de los peces (FLDV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), herpesvirus del koi, virus de tipo picorna del salmón (también conocido como virus de tipo picorna del salmón atlántico), virus del salmón encerrado (LSV), rotavirus del salmón atlántico (ASR), virus de la enfermedad del enrojecimiento de la trucha (TSD), virus del tumor del salmón plateado (CSTV) o virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
En algunas realizaciones, el primer y/o segundo antígeno se obtienen de un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. por tanto, la invención puede usarse para la inmunización contra el paludismo. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo antígenos se obtienen de un parásito de la familia Caligidae, particularmente los de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, piojo de mar tales como, Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
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En ciertas realizaciones, el primer y/o segundo antígeno se obtienen de un patógeno bacteriano. Los patógenos bacterianos ejemplares incluyen, por ejemplo, Neisseria spp, incluyendo N. gonorrhea y N. meningitides; Streptococcus spp, incluyendo S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. mutans; Haemophilus spp, incluyendo H. influenzae de tipo B, H. Influenzae no tipificable, H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M. catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis; Bordetella spp, incluyendo B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica, E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatogénica; Vibrio spp, incluyendo V. cholera, Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni y C. coli; Salmonella spp, incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H pylori; Pseudomonas spp, incluyendo P. aeruginosa, Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani, C. botulinum, C. difficile; Bacillus spp., incluyendo B. anthracis; Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae; Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi, B. garinii, B. afzelii, B. andersonii, B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la erliquiosis granulocítica humana; Rickettsia spp, incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis, C. neumoniae, C. psittaci; Leptsira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum, T. denticola, T. hyodysenteriae.
En ciertas realizaciones, el primer y/o segundo antígenos se obtienen de un patógeno fúngico (por ejemplo, una levadura o patógeno de moho). Los patógenos fúngicos ejemplares incluyen, por ejemplo, Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, A. terreus, A. nidulans, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans y Pneumocystis jirovecii.
En ciertas realizaciones, el primer y/o segundo antígenos se obtienen de un patógeno protozoico. Los patógenos protozoicos ejemplares incluyen, por ejemplo, Toxoplasma gondii, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae.
En ciertas realizaciones, el primer y/o segundo antígenos se obtienen de un patógeno parasitario multicelular. Los patógenos parasitarios multicelulares ejemplares incluyen, por ejemplo, trematodos (duelas), cestodos (tenias), nematodos (lombrices intestinales y) artrópodos.
En algunas realizaciones, el primer y/o segundo antígenos se obtienen de un alérgeno, tal como alérgenos del polen (alérgenos de polen de árboles, hierba, maleza y césped); alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos inhalantes, de saliva y veneno, por ejemplo, alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y mosquitos, alérgenos de veneno de himenóptera); alérgenos de pelo animal y caspa (de, por ejemplo, perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos de los alimentos (por ejemplo, una gliadina). Los alérgenos de polen importantes de árboles, céspedes y hierbas son aquellos originarios de los órdenes taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y Platanaceae incluyendo, aunque sin limitación, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), plátano (Platanus), el orden Poales incluyendo céspedes de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales incluyendo hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son aquellos de los ácaros del polvo doméstico del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de almacenamiento, por ejemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, aquellos de cucarachas, mosquitos y pulgas, por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y aquellos de mamíferos tales como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno incluyendo aquellos originarios de insectos picadores o mordedores tales como los del orden taxonómico de Hymenoptera incluyendo abejas (Apidae), avispas (Vespidea) y hormigas (Formicoidae).
En algunas realizaciones, el primer y/o segundo antígeno se obtienen de un antígeno tumoral seleccionado de: (a) antígenos cancerosos de testículo tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 así como polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que pueden usarse, por ejemplo, para abordar melanoma, tumores broncopulmonares, de cabeza y cuello NSCLC, de mama, gastrointestinal y de vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo p53 (asociado con diversos tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, broncopulmonar, de cabeza y cuello) p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal), CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma), MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociada con, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociada con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no hodgkiniano de linfocitos T), BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT; (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociada con, por ejemplo, cáncer colorrectal), Galectina 9 (asociada con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), WT 1 (asociado con, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbónica (asociada con, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociada con, por ejemplo, cáncer broncopulmonar), PRAME (asociado con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, de colon, broncopulmonar y de ovario), gamma-globina, alfa-fetoproteína (asociada con, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal), gastrina (asociada con, por ejemplo, cáncer pancreático y gástrico), proteína catalítica telomerasa, MUC-1 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama y de ovario), G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de células renales), p53 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, de colon) y antígeno carcinoembrionario
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(asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer broncopulmonar y cánceres del tubo gastrointestinal tales como cáncer colorrectal); (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocitos tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de la hormona estimuladora de melanocitos, tirosinasa, proteína-1 relacionada con tirosinasa/TRP1 y proteína-2 relacionada con tirosinasa/TRP2 (asociada con, por ejemplo, melanoma); (e) antígenos asociados a la próstata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con, por ejemplo, cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con, mieloma y linfomas de linfocitos B, por ejemplo). En ciertas realizaciones, los inmunógenos tumorales incluyen, aunque sin limitación, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2APRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (HPV), incluyendo E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de linfocitos T humanos, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA15-3 (CA 27.29\BCAA), CA195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.
1. CMV
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno es de CMV. En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno se obtiene de una proteína de la cápsida, una glucoproteína de la envuelta (tal como gB, gH, gL, gM, gN) o una proteína del tegumento. En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno se obtiene de una o más de las siguientes proteínas: pp65, IE1, gB, gD, gH, gL, gM, gN, gO, UL128, UL129, gUL130, UL150, UL131, UL33, UL78, US27, US28, RL5A, RL6, RL10, RL11, RL12, RL13, UL1, UL2, UL4, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL10, UL11, UL14, UL15A, UL16, UL17, UL18, UL22A, UL38, UL40, UL41A, UL42, UL116, UL119, UL120, UL121, UL124, UL132, UL147A, UL148, UL142, UL144, UL141, UL140, UL135, UL136, UL138, UL139, UL133, UL135, UL148A, UL148B, UL148C, UL148D, US2, US3, US6, US7, US8, US9, US10, US11, US12, US13, US14, US15, US16, US17, US18, US19, US20, US21, US29, US30 o US34A.
El antígeno de MV también puede ser un polipéptido de fusión de una o más proteínas de CMV, tales como pp65/IE1 (Reap y col., Vaccine (2007) 25:7441-7449), gH/gL (Chowdary y col., Nature Structural & Molecular Biology, 17, 882-888 (2010)).
Los antígenos adecuados de CMV incluyen gB, gH, gL, gO y pueden ser de cualquier cepa de CMV. Por ejemplo, las proteínas de CMV pueden ser de las cepas Merlin, AD169, VR1814, Towne, Toledo, TR, PH, TB40 o Fix de CMV. Las secuencias ejemplares de las proteínas de CMV que pueden usarse para la invención se muestran en la tabla 1.
Tabla 1
Polinucleótido gH de longitud completa
(gH FL de CMV) SEQ ID NO: 7
Polipéptido gH de longitud completa
(gH FL de CMV) SEQ ID NO: 8
Polinucleótido gL de longitud completa
(gL FL de CMV) SEQ ID NO: 11
Polipéptido gL de longitud completa
(gL FL de CMV) SEQ ID NO: 12
Polinucleótido gO de longitud completa
(gO FL de CMV) SEQ ID NO: 17
Polipéptido gO de longitud completa
(gO FL de CMV) SEQ ID NO: 18
Polinucleótido gH sol
(gH sol de CMV) SEQ ID NO: 9
Polipéptido gH sol
(gH sol de CMV) SEQ ID NO: 10
Polinucleótido UL128 de longitud completa
(UL128 FL de CMV) SEQ ID NO: 19
Polipéptido UL128 de longitud completa
(UL128 FL de CMV) SEQ ID NO: 20
Polinucleótido UL130 de longitud completa
(UL130 FL de CMV) SEQ ID NO: 21
Polipéptido UL130 de longitud completa
(UL130 FL de CMV) SEQ ID NO: 22
Polinucleótido UL131 de longitud completa
(UL131 FL de CMV) SEQ ID NO: 23
Polipéptido UL131 de longitud completa
(UL131 FL de CMV) SEQ ID NO: 24
Polinucleótido gB de longitud completa
(gB FL de CMV) SEQ ID NO: 1
Polipéptido gB de longitud completa
(gB FL de CMV) SEQ ID NO: 2
Polinucleótido gB sol 750
(gB 750 de CMV) SEQ ID NO: 3
Polipéptido gB sol 750
(gB 750 de CMV) SEQ ID NO: 4
Polinucleótido gB sol 692
(gB 692 de CMV) SEQ ID NO: 5
Polipéptido gB sol 692
(gB 692 de CMV) SEQ ID NO: 6
Polinucleótido gM de longitud completa
(gM FL de CMV) SEQ ID NO: 13
Polipéptido gM de longitud completa
(gM FL de CMV) SEQ ID NO: 14
Polinucleótido gN de longitud completa
(gN FL de CMV) SEQ ID NO: 15
Polipéptido gN de longitud completa
(gN FL de CMV) SEQ ID NO: 6
Antígenos gB
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno gB. Un antígeno gB puede ser la
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proteína gB de longitud completa o puede omitir una o más regiones de la proteína. Como alternativa, pueden usarse fragmentos de una proteína gB. Los aminoácidos de gB están numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de gB de longitud completa (gB FL de CMV) mostrada en la SEQ ID NO: 2, que es de 907 aminoácidos de longitud. Las regiones adecuadas de una proteína gB, que pueden excluirse de la proteína de longitud completa o incluirse como fragmento se incluyen: la secuencia señal (aminoácidos 1-24), un dominio de tipo desintegrina gB-DLD (aminoácidos 57-146), un sitio de escisión por furina (aminoácidos 459-460), una región repetida heptamérica (679-693), un dominio que abarca membrana (aminoácidos 751-771) y un dominio citoplasmático de los aminoácidos 771-906. En algunas realizaciones, un antígeno gB incluye los aminoácidos 67-86 (epítopo neutralizante AD2) y/o los aminoácidos 532-635 (epítopo inmunodominante AD1). Los ejemplos específicos de antígenos gB incluyen "gB sol 692", que incluye los primeros 692 aminoácidos de gB y "gB sol 750", que incluye los primeros 750 aminoácidos de gB. La secuencia señal, aminoácidos 1-24, puede estar presente o ausente de gB sol 692 y gB sol 750 según se desee.
En algunas realizaciones, el antígeno gB es un fragmento de gB de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850 o 875 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno gB que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a la SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
Antígenos gH
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno gH. Un antígeno gH puede ser una proteína gH de longitud completa (gH FL de CMV SEQ ID NO: 8, por ejemplo, que es una proteína de 743 aminoácidos). gH tiene un dominio que abarca membrana y un dominio citoplasmático que empieza en la posición 716 hasta a posición 743. La eliminación de los aminoácidos 717 a 743 proporciona una gH soluble (por ejemplo, gH sol de CMV SEQ ID NO: 10).
En algunas realizaciones, el antígeno gH es un fragmento de gH de 10 aminoácidos a más largo. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700 o 725 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno gH que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 8 o 10 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 8 o 10.
Antígenos gL
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno gL. Un antígeno gH puede ser una proteína gL de longitud completa (gL FL de CMV, sEq ID NO: 12, por ejemplo, que es una proteína de 278 aminoácidos). Como alternativa, puede usarse un fragmento de gL. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o 250 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno gL que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 12 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 12).
Antígenos gO
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno gO. Un antígeno gO puede ser una proteína gO de longitud completa (gO FL de CMV, SEQ ID NO: 18, por ejemplo, que es una proteína de 472 aminoácidos). Como alternativa, el antígeno gO puede ser un fragmento de gO de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno gO que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 18 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 18).
Antígenos gM
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno gM. Un antígeno gM puede ser una proteína gM de longitud completa (gM FL de CMV, SEQ ID NO: 14, por ejemplo, que es una proteína de 371 aminoácidos). Como alternativa, el antígeno gM puede ser un fragmento de gM de 10 aminoácidos o más largo. Por
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ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 o 350 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno gM que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 14 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 14).
Antígenos gN
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno gN. Un antígeno gN puede ser una proteína gN de longitud completa (gN FL de CMV, sEq ID NO: 16, por ejemplo, que es una proteína de 135 aminoácidos). Como alternativa, el antígeno gN puede ser un fragmento de gN de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 125 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno gN que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16).
Antígenos UL128
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno UL128. Un antígeno UL128 puede ser una proteína UL128 de longitud completa (UL128 FL de CMV, SEQ ID NO: 20, por ejemplo, que es una proteína de 171 aminoácidos). Como alternativa, el antígeno UL128 puede ser un fragmento de UL128 de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125 o 150 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno UL128 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 20 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 20).
Antígenos UL130
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno UL130. Un antígeno UL130 puede ser una proteína UL130 de longitud completa (UL130 FL de CMV, SEQ ID NO: 22, por ejemplo, que es una proteína de 214 aminoácidos). Como alternativa, el antígeno UL130 puede ser un fragmento de UL130 de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 o 200 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno UL130 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 22 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 22).
Antígenos UL131
En ciertas realizaciones, el primer o segundo antígeno puede ser un antígeno UL131. Un antígeno UL131 puede ser una proteína UL131 de longitud completa (UL131 FL de CMV, SEQ ID NO: 24, por ejemplo, que es una proteína de 129 aminoácidos). Como alternativa, el antígeno UL131 puede ser un fragmento de UL131 de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, la cantidad de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 o 200 aminoácidos.
La invención también puede usar un antígeno UL131 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 24 (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 24).
El antígeno de CMV puede ser un polipéptido de fusión. Por ejemplo, el antígeno puede comprender un primer dominio y un segundo dominio, en el que (i) el primer dominio comprende un primer antígeno de CMV y (ii) el segundo dominio comprende un segundo antígeno de CMV. El primer antígeno de CMV y el segundo antígeno de CMV se seleccionan independientemente de un antígeno gB, gH, gL, gO, gM, gN, UL128, UL130 o UL131 descritos anteriormente.
Complejos
Dos o más antígenos de CMV también pueden cosuministrarse de modo que formen un complejo in vivo (por ejemplo, complejo gH/gL, complejo gM/gN, complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131). Por ejemplo, la composición inmunogénica puede comprender una molécula de ARN que codifica dos antígenos diferentes, gH y gL.
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La composición inmunogénica también puede comprender dos antígenos polipeptídicos, gH y gL.
2. Parvovirus
En ciertas realizaciones, el antígeno polipeptídico se obtiene de parvovirus. Preferentemente, el parvovirus infecta seres humanos, es decir es del género Dependovirus, Erythrovirus, o Bocavirus. En ciertas realizaciones el parvovirus es parvovirus B19. En algunas realizaciones, el parvovirus es del género Parvovirus. Parvovirus B19 pertenece al género Erythroviruses de la familia Parvoviridae de virus pequeños de ADN. Es un virus icosaédrico sin envuelta que contiene un genoma de ADN lineal monocatenario. El virión del parvovirus B19 es de 20-25 nm de diámetro y tiene un genoma de 5,6 kb (Clewley, 1984, Cotmore & Tattersall, 1984). La cápsida del parvovirus B19 consiste en una proteína estructural menor de 83 kDa, VP1, y una proteína estructural principal de 58 kDa, VP2. Tiene un genoma de ADN monocatenario no segmentado rodeado por una cubierta proteica que contiene dos proteínas estructurales, VP1 y VP2 en una relación de ~5 % a ~95 % (Ozawa y col., 1987). Las secuencias de las dos proteínas son colineales, siendo VP2 idéntica a la región carboxilo terminal de VP1; sin embargo, VP1 comprende 227 aminoácidos adicionales en el extremo amino. Las respuestas de anticuerpo de larga duración están dirigidas a ambas proteínas VP1 y VP2 y, por tanto, se espera que estas proteínas en solitario generen una respuesta inmunitaria significativa.
El genoma de parvovirus B19 contiene tres fases de lectura abierta: una proteína no estructural de 77 kDa, NS1, está codificada por los nucleótidos 436-2451; la proteína estructural menor, VP1 está codificada por los nucleótidos 2444-4787 y la proteína estructural principal, VP2, está codificada por los nucleótidos 3125-4787 (Corcoran y col., J. Med. Microb., 2004). El parvovirus B19 usa un único promotor, p6, que es capaz de expresar los genes estructurales y no estructurales de forma diferencial (Blundell y col., 1987, Ozawa y col., 1987). Aunque la numeración anterior es relativa a la secuencia de nucleótidos del genoma de parvovirus B19, debe entenderse que las posiciones correspondientes en las secuencias obtenidas de otros genotipos y aislados de parvovirus también se pretende que estén abarcadas por la presente invención. Una cualquiera de las proteínas VP1 o VP2, así como variantes de las mismas, tales como fragmentos inmunogénicos de las mismas, y ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas pueden usarse en la práctica de la invención.
En ciertas realizaciones, el antígeno de parvovirus es una VLP. La VLP puede contener VP1 y VP2 de cualquier parvovirus deseado, o cualquier combinación deseada. En algunas realizaciones, las proteínas VP1 y VP2 pueden tener una secuencia de aminoácidos que es igual o sustancialmente igual a una VP1 o VP2 de parvovirus de origen natural, o pueden contener una o más sustituciones, eliminaciones o ediciones de aminoácido. Por ejemplo, VP1 puede mutarse para inactivar su actividad fosfolipasa. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de VP1 puede contener una mutación puntual (por ejemplo, His153A1a) o cualquiera de las mutaciones descritas en los documentos WO 06/032697, EP 1791858 o US 20070286870. Preferentemente, la VLP contiene VP1 y VP2 que son de un parvovirus que infecta seres humanos, es decir, un parvovirus del género Dependovirus, Erythrovirus o Bocavirus. En ciertas realizaciones, la VLP contiene VP1 de parvovirus B19 o VP2 de parvovirus B19.
En ciertas realizaciones, la VLP comprende VP1 en abundancia inferior respecto a VP2 (por ejemplo, la VP1 soluble se produce en menor abundancia que la VP2 soluble), como resultado de los elementos de control individuales que están unidos de forma funcional a los ácidos nucleicos que codifican VP1 y VP2 y/o como resultado de otras características de los ácidos nucleicos recombinantes que codifican VP1 y VP2, tales como uso optimizado de codones y uso desoptimizado de codones. Dichos elementos de control (por ejemplo, promotores) y características (por ejemplos, uso de codones) permiten controlar la producción relativa de VP1 y VP2.
Las secuencias ejemplares de proteínas de parvovirus que pueden usarse para la invención se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Antígenos de parvovirus
VP1 de parvovirus B19
(ParvoB19.Opti.VP1) polinucleótido SEQ ID NO: 25 (polipéptido codificado por la fase de lectura abierta mostrada en letra minúscula en la SEQ ID NO: 25)
VP2 de parvovirus B19
(ParvoB19.Opti.VP1) polinucleótido SEQ ID NO: 26 (polipéptido codificado por la fase de lectura abierta mostrada en letra minúscula en la SEQ ID NO: 26)
3. RSV
En algunos aspectos, el patógeno es RSV. RSV es un virus de ARN de hebra negativa no segmentado con envuelta de la familia Paramyxoviridae, género Pneumovirus. Para infectar una célula huésped, los paramixovirus tales como RSV, como otros virus con envuelta tales como el virus de la gripe y VIH, requiere la fusión de la membrana vírica con la membrana de una célula huésped. Para RSV, la proteína de fusión conservada (glucoproteína RSV-F) se fusiona con las membranas vírica y celular acoplando la proteína irreversible que se vuelve a plegar con yuxtaposición de las membranas. Los modelas actuales basados en estudios de paramixovirus, la proteína RSV-F inicialmente se pliega en una conformación de "prefusión" metaestable. Durante la entrada en la célula, la conformación prefusión experimenta un nuevo plegamiento y cambios conformacionales a su conformación de "'posfusión" estable. Véase, también, Swanson y col., PnAs USA 108(23):9619-9624 (2011) respecto a las estructuras prefusión y posfusión de RSV-F.
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En ciertas realizaciones, el primer y segundo antígenos son de RSV. Por ejemplo, el primer y segundo antígenos pueden obtenerse independientemente de las glucoproteínas superficiales de RSV fusión (F), glucoproteína (G), proteína hidrófoba pequeña (SH), las proteínas de matriz M y M2, las proteínas de la nucleocápsida N, P y L, y las proteínas no estructurales NS1 y NS2. En ciertas realizaciones preferidas, el primer y segundo antígenos son cada uno un antígeno RSV-F.
La glucoproteína F de RSV es una proteína de membrana integrada de un único paso de tipo I que tiene cuatro dominios generales: la secuencia señal de traslocación al RE N-terminal (SS), el ectodominio (ED) el dominio transmembrana (TM) y una cola citoplasmática (CT). La CT contiene un único resto de cisteína palmitoilado. La secuencia de la proteína F está muy conservada entre aislados de RSV, pero está evolucionando constantemente (Kim y col. (2007) J Med Virol 79: 820-828). A diferencia de la mayoría de los paramixovirus, la proteína F de RSV puede mediar la entrada y la formación de sincitios independientemente de las otras proteínas víricas (HN habitualmente es necesaria además de F en otros paramixovirus).
La glucoproteína RSV-F se traduce del ARNm a una proteína de aproximadamente 574 aminoácidos denominada F0. El procesamiento postraduccional de F0 incluye la eliminación de un péptido señal N-terminal por una peptidasa señal en el reticuló endoplasmático. F0 también se escinde en dos sitios (aproximadamente 109/110 y aproximadamente 136/137) por proteasas celulares (en particular furina) a través del aparato de Golgi. Esta escisión provoca la eliminación de una corta secuencia intermedia y genera dos subunidades denominadas F1 (~50 kDa; C-terminal; aproximadamente los restos 137-574) y F2 (~20 kDa; N-terminal; aproximadamente los restos 1-109) que permanecen asociadas entre sí. F1 contiene un péptido de fusión hidrófobo en su extremo N-terminal y también dos regiones repetidas heptaméricas anfipáticas (hRa y HRB). HRA está cerca del péptido de fusión y hRb está cerca del dominio transmembrana. Se ensamblan tres heterodímeros F1-F2 como homotrímeros de F1-F2 en el virión.
Los antígenos RSV-F adecuados para su inclusión en las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento, en forma codificada de ARN o como polipéptidos, incluyen la glucoproteína RSV-F y variantes de la glucoproteína RSV-F. Las variantes de la glucoproteína RSV-F adecuadas incluyen, por ejemplo, la proteína F de longitud completa y variantes truncadas tales como ectodominios solubles, cada uno conteniendo opcionalmente una o más mutaciones, tales como mutaciones de escisión por furina, mutaciones de escisión por tripsina, mutaciones del péptido de fusión (por ejemplo, eliminaciones en su totalidad o en parte), mutaciones que estabilizan el trímero de HRB y mutaciones que desestabilizan el trímero de HRA.
Las glucoproteínas RSV-F de longitud completa y truncadas, incluyendo aquellas con una o más de estas mutaciones en una diversidad de combinaciones son bien conocidas en la técnica y se divulgan, por ejemplo, en el documento WO 2011/008974.
El destinatario experto se remite a las siguientes secciones del documento WO 2011/008974 que divulgan antígenos RSV-F ejemplares que pueden usarse, en forma de ARN o como polipéptidos, en las composiciones inmunogénicas: (i) página 15 línea 20 a página 16, línea 27, que describe RSV-F, su secuencia de aminoácidos y la estructura de dominios; (ii) página 16, línea 28 a página 18, línea 11, que describe ectodominios solubles de RSV-F; (iii) página 18, línea 14 a página 20, línea 15, que describe mutaciones de escisión por furina, mutaciones de escisión por tripsina, mutaciones del péptido de fusión; (iv) página 20, línea 16 a página 21, línea 8 y página 26, línea 29 a página 30, línea 14, que describe secuencias de oligomerización opcionales; (v) página 20, líneas 9-24, que describe sitios introducidos de escisión por proteasa; (vi) y página 30, línea 18 a página 32, línea 18, que describe mutaciones que estabilizan el trímero de HRB, desestabilizan el trímero de HRA y otras mutaciones que pueden incluirse.
B. La molécula de ARN
La composición inmunogénica descrita en el presente documento comprende un componente de ARN y un componente polipeptídico. El ARN es un ARN autorreplicante.
La composición puede contener más de una molécula de ARN que codifica un antígeno, por ejemplo, dos, tres, cinco, diez o más moléculas de ARN. Como alternativa o adicionalmente, una molécula de ARN también puede codificar más de un antígeno, por ejemplo, una molécula de ARN bicistrónica o tricistrónica que codifica antígenos diferentes o idénticos.
La secuencia de la molécula de ARN puede tener los codones optimizados o desoptimizados para su expresión en un huésped deseado, tal como una célula humana.
La secuencia de la molécula de ARN puede modificarse si se desea, por ejemplo, para aumentar la eficacia de la expresión o la replicación del ARN, o para proporcionar estabilidad adicional o resistencia a la degradación. Por ejemplo, la secuencia de ARN puede modificarse con respecto a su uso de codones, por ejemplo, para aumentar la eficacia de traducción y la semivida del ARN. Puede adherirse una cola de poli A (por ejemplo, de aproximadamente 30 restos de adenosina o más) al extremo 3' del ARN para aumentar su semivida. El extremo 5' del ARN puede encapucharse con un ribonucleótido modificado con la estructura m7G (5') ppp (5') N (estructura cap 0) o un derivado del mismo, que puede incorporarse durante la síntesis del ARN o puede diseñarse enzimáticamente después de la trascripción del ARN (por ejemplo, usando la enzima de encapuchado del virus Vaccinia (VCE) que consiste en la trifosfatasa de ARNm, la guanilil-transferasa y la guanina-7-metiltransferasa, que cataliza la
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construcción de estructuras cap 0 N7-monometiladas). La estructura cap 0 desempeña una función importante en el mantenimiento de la estabilidad y la eficacia de traducción de la molécula de ARN. La capucha 5' de la molécula de ARN puede modificarse adicionalmente por una 2'-O-metiltransferasa que provoca la generación de una estructura cap 1 (m7Gppp [m2'-O] N), que puede aumentar adicionalmente la eficacia de traducción.
Si se desea, la molécula de ARN puede comprender uno o más nucleótidos modificados además de cualquier estructura de capucha 5'. Hay más de 96 modificaciones nucleosídicas de origen natural encontradas en ARN de mamífero. Véase, por ejemplo, Limbach y col., Nucleic Acids Research, 22(12):2183-2196 (1994). La preparación de nucleótidos y nucleótidos modificados y nucleósidos es bien conocida en la técnica, por ejemplo, a partir de los números de patente de Estados Unidos 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679, 5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642, y muchos nucleósidos modificados y nucleótidos modificados están disponibles en el mercado.
Las nucleobases modificadas que pueden incorporarse en nucleósidos y nucleótidos modificados y que están presentes en las moléculas de ARN incluyen: m5C (5-metilcitidina), m5U (5-metiluridina), m6A (N6-metiladenosina), s2U (2-tiouridina), Um (2'-O-metiluridina), m1A (1-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am (2-1-O- metiladenosina); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina); i6A (N6-isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio- N6isopenteniladenosina); io6A (N6-(cis-hydroxiisopentenil)adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cis- hidroxiisopentil)adenosina); g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-trionil carbamoiladenosina); ms2t6A (2- metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A(N6- hidroxinorvalilcarbamoil adenosina); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O- ribosiladenosina(fosfato)); I (inosina); m1I (1-metilinosina); m'Im (1,2'-O-dimetilinosina); m3C (3-metilcitidina); Cm (2T-O-metilcitidina); s2C (2-tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5-fonilcitidina); m5Cm (5,2-O-dimetilcitidina); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina); k2C (lisidina); m1G (1-metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7- metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2-dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-O-ribosilguanosina (fosfato)); yW (wibutosina); o2yW (peroxiwibutosina); OHyW (hidroxiwibutosina); OHyW* (hidroxiwibutosina no modificada); imG (wiosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (manosil-queuosina); preQo (7-ciano-7-desazaguanosina); preQi (7-aminometil-7-desazaguanosina); G* (arqueosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5-metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido uridina 5- oxiacético); mcmo5U (éster metílico del ácido uridina 5-oxiacético); chm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina)); mchm5U (éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina); mcm5U (5-metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S- metoxicarbonil-metil-2-O-metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2- tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina); mnm5se2U (5- metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetiluridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina); cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximetilaminometil-2-L-O-metiluridina); cmnm5s2U (5- carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2'-O-metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3-metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenosina); m2'7G (N2,7-dimetilguanosina); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-O-dimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O- metilcitidina); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanosina); m'Am (1,2-O-dimetiladenosina)irinometiluridina); tm5s2U (S- taurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-desmetilguanosina); imG2 (isoguanosina); ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, derivados 7-sutituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo,
4- tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquil(C1-C6)-uracilo, 5-metiluracilo, 5-alquenil(C2-C6)-uracilo, 5-alquinil(C2-C6)-uracilo,
5- (hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquil(C1-C6)-citosina, 5-
metilcitosina, 5-alquenil(C2-C6)-citosina, 5-alquinil(C2-C6)-citosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-desazaguanina, 8-azaguanina, 7-desazaguania-7-sustituida, 7-desaza-7-alquinil(C2-
C6)guanina, 7-desazaguanina-8-sustituida, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6- cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-desazapurina sustituida, 7-desazapurina-7- sustituida, 7-desazapurina-8-sustituida, hidrógeno (resto abásico), m5C, m5U, m6A, s2U, W o 2'-O-metil-U. Muchas de estas nucleobases modificadas y sus ribonucleósidos correspondientes están disponibles en proveedores comerciales. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/005799.
Si se desea, la molécula de ARN puede contener enlaces fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no incluye nucleótidos modificados, por ejemplo, no incluye nucleobases modificadas y todos los nucleótidos en la molécula de ARN son ribonucleótidos normales convencionales A, U, G y C, con la excepción de una capucha 5' opcional que puede incluir, por ejemplo, 7-metilguanosina. En otras realizaciones, el ARN puede incluir una capucha 5' que comprende una 7'-metilguanosina y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos 5' pueden estar metilados en la posición 2' de la ribosa.
ARN autorreplicante
En ciertas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante se obtiene de o se basa en un alfavirus.
Las moléculas de ARN autorreplicantes son bien conocidas en la técnica y pueden producirse usando elementos de
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replicación obtenidos de, por ejemplo, alfavirus y sustituyendo las proteínas víricas estructurales con la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de interés. Las células transfectadas con ARN autorreplicante producen brevemente el antígeno antes de experimentar muerte apoptótica. Esta muerte probablemente es un resultado de los intermedios de ARN bicatenarios (bc) necesarios, que también se han mostrado a células dendríticas superactivas. Por tanto, la inmunogenicidad potenciada del ARN autorreplicante puede ser un resultado de la producción de ARNbc proinflamatorio, que imita una infección de virus de ARN de las células huésped.
De forma ventajosa, la maquinaria de la célula se usa por las moléculas de ARN autorreplicante para generar un aumento exponencial de los productos génicos codificados, tales como proteínas o antígenos, que pueden acumularse en las células o secretarse desde las células. La sobreexpresión de las proteínas o antígenos por moléculas de ARN autorreplicante aprovecha los efectos adyuvantes inmunoestimuladores, incluyendo la estimulación de los receptores de tipo toll (TLR) 3, y 8 y las rutas que no son de TLR (por ejemplo, RIG-1, MD-5) por los productos de replicación y amplificación de ARN, y la traducción que induce la apoptosis de la célula transfectada.
El ARN autorreplicante generalmente contiene al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en replicasas víricas, proteasas víricas, helicasas víricas y otras proteínas víricas no estructurales, y también comprende secuencias de replicación activas en cis del extremo 5' y 3' y, si se desea, una secuencia heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos deseada (por ejemplo, un antígeno de interés). Puede incluirse un promotor subgenómico que dirige la expresión de la secuencia heteróloga en el ARN autorreplicante. Si se desea, la secuencia heteróloga (por ejemplo, un antígeno de interés) puede fusionarse en fase a otras regiones codificantes en el ARN autorreplicante y/o puede estar bajo el control de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
En ciertas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante no se encapsula en una partícula de tipo virus. Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención pueden diseñarse de modo que la molécula de ARN autorreplicante no pueda inducir la producción de partículas víricas infecciosas. Esto puede conseguirse, por ejemplo, omitiendo uno o más genes víricos que codifican proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas víricas en el ARN autorreplicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN autorreplicante está basada en un alfavirus, tal como el virus Sinebis (SIN), el virus Semliki Forest y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) puede omitirse uno o más genes que codifican proteínas estructurales víricas, tales como glucoproteínas de la cápsida y/o la envuelta.
Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante de la invención también pueden diseñarse para inducir la producción de partículas víricas que están atenuadas o son virulentas, o para producir partículas víricas que tienen capacidad de una única ronda de infección posterior.
Cuando se suministra a una célula de vertebrado, una molécula de ARN autorreplicante puede dar lugar a la producción de múltiples ARN hijos por trascripción desde sí mismo (o desde una copia no codificante de sí mismo). El ARN autorreplicante puede traducirse directamente después del suministro a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que entonces produce trascritos del ARN suministrado. Por tanto, el ARN suministrado da lugar a la producción de múltiples ARN hijos. Estos trascritos son no codificantes respecto al ARN suministrado y pueden traducirse por sí mismos para proporcionar la expresión in situ de un producto génico, o pueden trascribirse para proporcionar trascritos adicionales con la misma polaridad de hebra que el ARN suministrado que se tradujo para proporcionar la expresión in situ del producto génico.
Un sistema adecuado para conseguir la autorreplicación es usar un replicón de ARN basado en alfavirus. Los alfavirus comprenden un conjunto de virus propagados por artrópodos genética, estructural y serológicamente relacionados de la familia Togaviridae. Se han clasificado veintiséis virus y subtipos de virus conocidos dentro del género alfavirus, incluyendo, el virus Sindbis, el virus Semliki Forest, el virus Ross River y el virus de la encefalitis equina venezolana. Por tanto, el ARN autorreplicante de la invención puede incorporar una replicasa de ARN obtenida del virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus Ross River u otros virus que pertenecen a la familia alfavirus.
Pueden usarse vectores de expresión de "replicón" basado en alfavirus en la invención. Los vectores de replicón pueden utilizarse en varios formatos, incluyen partículas de ADN, ARN y replicón recombinante. Dichos vectores de replicón se han obtenido de alfavirus que incluyen, por ejemplo, el virus Sindbis (Xiong y col. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky y col., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan y col. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo y col. (1999) PNAS 96:4598-4603), el virus Semliki Forest (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund y col. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565) y virus de la encefalitis equina venezolana (Pushko y col. (1997) Virology 239:389-401). Los replicones derivados de alfavirus generalmente son bastante similares en las características globales (por ejemplo, estructura, replicación), los alfavirus individuales pueden mostrar alguna propiedad particular (por ejemplo, unión al receptor, sensibilidad a interferones y perfil de enfermedad) que es única. Por lo tanto, los replicones de alfavirus quiméricos preparados a partir de familias de virus divergentes también pueden ser útiles.
Los replicones basados en alfavirus son replicones de hebra (+) que pueden traducirse después del suministro a una célula para proporcionar una replicasa (o replicasa-transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de hebra (-) genómica del ARN
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suministrado de hebra (+). Estos trascritos de hebra (-) pueden trascribirse por sí mismos para proporcionar copias adicionales del ARN precursor de hebra (+) y también para proporcionar un trascrito subgenómico que codifica el producto génico deseado. La traducción del trascrito subgenómico, por tanto, da lugar a la expresión in situ del producto génico deseado por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus Semliki Forest, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc.
Una molécula de ARN autorreplicante preferida, por tanto, codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede trascribir ARN a partir de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un antígeno polipeptídico. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende la proteína de alfavirus nsP4.
Aunque los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas estructurales del virión además de la replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN autorreplicante basada en alfavirus de la invención no codifique proteínas estructurales de alfavirus. Por tanto, el ARN autorreplicante puede dar lugar a la producción de copias de ARN genómico de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones de alfavirus que contienen ARN. La incapacidad de producir estos viriones significa que, a diferencia del alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN autorreplicante no puede perpetuarse a sí misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en virus de tipo silvestre están ausentes de los ARN autorreplicantes de la invención y su espacio se ocupa por uno o más genes que codifican el producto génico deseado, de modo que el trascrito subgenómico codifica el producto génico deseado en lugar de las proteínas estructurales del virión de alfavirus.
Por tanto, una molécula de ARN autorreplicante útil con la invención puede tener dos fases de lectura abierta. La primera fase de lectura abierta (5') codifica una replicasa; la segunda fase de lectura abierta (3') codifica un antígeno polipeptídico. En algunas realizaciones, el ARN puede tener fases de lectura abierta adicionales (en dirección 3'), por ejemplo, que codifican otros productos génicos deseados. Una molécula de ARN autorreplicante puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.
En otros aspectos, la molécula de ARN autorreplicante se obtiene de o está basada en un virus diferente a un alfavirus, preferentemente, un virus de ARN de hebra positiva y, más preferentemente un picornavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus o coronavirus. Las secuencias de alfavirus de tipo silvestre adecuadas son bien conocidas y están disponibles en depósitos de secuencias, tales como el American Type Culture Collection, Rockville, Md. Los ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), virus de la encefalomielitis equina oriental (AtCc VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC VR- 1277), Middleburg (ATCC VR-370), virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), virus Ross River (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), Semliki Forest (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR- 469), Una (ATCC VR-374), encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926) e Y-62-33 (ATCC VR-375).
Las moléculas de ARN autorreplicantes de la invención son más grandes que otros tipos de ARN (por ejemplo, ARNm). Típicamente, las moléculas de ARN autorreplicante de la invención contienen al menos aproximadamente 4 kb. Por ejemplo, el ARN autorreplicante puede contener al menos aproximadamente 5 kb, al menos aproximadamente 6 kb, al menos aproximadamente 7 kb, al menos aproximadamente 8 kb, al menos aproximadamente 9 kb, al menos aproximadamente 10 kb, al menos aproximadamente 11 kb, al menos aproximadamente 12 kb o más de 12 kb. En ciertos ejemplos, el ARN autorreplicante es de aproximadamente 4 kb a
aproximadamente
12 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 12 kb, de aproximadamente 6 kb a
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12 kb, de aproximadamente 7 kb a aproximadamente 12 kb, de aproximadamente 8 kb a
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12 kb, de aproximadamente 9 kb a aproximadamente 12 kb, de aproximadamente 10 kb a
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12 kb, de aproximadamente 11 kb a aproximadamente 12 kb, de aproximadamente 5 kb a
aproximadamente
11 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 5 kb a
aproximadamente
9 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 8 kb, de aproximadamente 5 kb a
aproximadamente
7 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 6 kb, de aproximadamente 6 kb a
aproximadamente
12 kb, de aproximadamente 6 kb a aproximadamente 11 kb, de aproximadamente 6 kb a
aproximadamente
10 kb, de aproximadamente 6 kb a aproximadamente 9 kb, de aproximadamente 6 kb a
aproximadamente
8 kb, de aproximadamente 6 kb a aproximadamente 7 kb, de aproximadamente 7 kb a
aproximadamente
11 kb, de aproximadamente 7 kb a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 7 kb a
aproximadamente
9 kb, de aproximadamente 7 kb a aproximadamente 8 kb, de aproximadamente 8 kb a
aproximadamente
11 kb, de aproximadamente 8 kb a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 8 kb a
aproximadamente
9 kb, de aproximadamente 9 kb a aproximadamente 11 kb, de aproximadamente 9 kb a
aproximadamente 10 kb o de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 11 kb.
Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención puede comprender uno o más nucleótidos modificados (por ejemplo, seudouridina, N6-metiladenosina, 5-metilcitidina, 5-metiluridina).
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La molécula de ARN autorreplicante puede codificar un único antígeno polipeptídico, u opcionalmente, dos o más antígenos polipeptídicos unidos juntos de una manera que cada una de las secuencias retiene su identidad (por ejemplo, unidos en serie) cuando se expresan como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos generados a partir del ARN autorreplicante entonces pueden producirse como un polipéptido de fusión o modificarse de tal manera que produzcan secuencias polipeptídicas o peptídicas separadas.
El ARN autorreplicante de la invención puede codificar uno o más antígenos polipeptídicos que contienen una gama de epítopos. Preferentemente, los epítopos capaces de provocar una respuesta de linfocitos T auxiliares o una respuesta de linfocitos T citotóxicos o ambas.
Las moléculas de ARN autorreplicante descritas en el presente documento pueden modificarse para expresar múltiples secuencias de nucleótidos, de dos o más fases de lectura abierta, permitiendo de ese modo la coexpresión de proteínas, tal como dos o más antígenos juntos con citocinas u otros inmunomoduladores, que pueden potenciar la generación de una respuesta inmunitaria. Dicha molécula de ARN autorreplicante puede ser particularmente útil, por ejemplo, en la producción de diversos productos génicos (por ejemplo, proteínas) al mismo tiempo, por ejemplo, como una vacuna bivalente o multivalente.
Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención pueden prepararse usando cualquier procedimiento adecuado. Se conocen varios procedimientos adecuados en la técnica para producir moléculas de ARN que contienen nucleótidos modificados. Por ejemplo, una molécula de ARN autorreplicante que contiene nucleótidos modificados puede prepararse trascribiendo (por ejemplo, trascripción in vitro) un ADN que codifica la molécula de ARN autorreplicante usando una ARN polimerasa dependiente de ADN adecuada, tal como la ARN polimerasa del fago T7, la ARN polimerasa del fago SP6, la ARN polimerasa del fago T3 y similares, o mutantes de estas polimerasas que permiten la incorporación eficaz de nucleótidos modificados en moléculas de ARN. La reacción de trascripción contendrá nucleótidos y nucleótidos modificados, y otros componentes que sostienen la actividad de la polimerasa seleccionada, tal como un tampón adecuado y sales adecuadas. La incorporación de análogos nucleotídicos en un ARN autorreplicante puede modificarse, por ejemplo, para alterar la estabilidad de dichas moléculas de ARN, para aumentar la resistencia contra RNasas, para establecer la replicación después de la introducción en células huésped apropiadas ("infectividad" del ARN) y/o para inducir o reducir las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas.
Los procedimientos sintéticos adecuados pueden usarse en solitario o en combinación con uno o más procedimientos diferentes (por ejemplo, tecnología de ADN o ARN recombinante), para producir una molécula de ARN autorreplicante de la invención. Los procedimientos adecuados para la síntesis de novo son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse para aplicaciones particulares. Los procedimientos ejemplares incluyen, por ejemplo, síntesis química usando grupos protectores adecuados tales como CEM (Masuda y col., (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51:3-4), el procedimiento de p-cianoetil fosforamidita (Beaucage S L y col. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); el procedimiento de nucleósido H-fosfonato (Garegg P y col. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler B C y col. (1986) Nucl Acid Res 14:5399-407; Garegg P y col. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney B L y col. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22). Estas características químicas pueden conseguirse o adaptarse para su uso con sintetizadores automatizados de ácidos nucleico que están disponible en el mercado. Se divulgan procedimientos sintéticos adecuados adicionales en Uhlmann y col. (1990) Chem Rev 90:544-84 y Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. La síntesis de ácidos nucleicos también puede realizarse usando procedimientos recombinantes adecuados que son bien conocidos y convencionales en la técnica, incluyendo clonación, procesamiento y/o expresión de polinucleótidos y productos génicos codificados por dichos polinucleótidos. El reordenamiento de ADN por fragmentación aleatoria y reemsamblaje por PCR de fragmentos génicos y polinucleótidos sintéticos son ejemplos de técnicas conocidas que pueden usarse para diseñar y modificar secuencias polinucleotídicas. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio para alterar ácidos nucleicos y las proteínas codificadas, por ejemplo, para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones y similares. Los procedimientos adecuados para la trascripción, traducción y expresión de secuencias de ácido nucleico son conocidos y convencionales en la técnica. (Véase, en líneas generales, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, y col., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; Bitter, y col., en Methods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern y col., Cold Spring Harbor Press, Vol. I y II, 1982; y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989.)
La presencia y/o cantidad de uno o más nucleótidos modificados en una molécula de ARN autorreplicante pueden determinarse usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, un ARN autorreplicante puede digerirse en monofosfatos (por ejemplo, usando nucleasa P1) y desfosforilarse (por ejemplo, usando una fosfatasa adecuada tal como CIAP), y los nucleótidos resultantes pueden analizarse por HPLC en fase inversa (por ejemplo, usando una columna YMC Pack ODS-AQ (5 pm, 4,6 x 250 mm) y puede eluirse usando un gradiente, 30 % de B (0-5 min) a 100 % de B (5-13 min) y a un 100 % B de (13-40) min, caudal (0,7 ml/min), detección UV (longitud de onda: 260 nm), temperatura de columna (30 °C). Tampón A (ácido acético 20 mM - acetato de amonio pH 3,5), tampón B (ácido acético 20 mM - acetato de amonio pH 3,5/metanol [90/10])).
Opcionalmente, las moléculas de ARN autorreplicante de la invención pueden incluir uno o más nucleótidos
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modificados de modo que la molécula de ARN autorreplicante tendrá menos actividad inmunomoduladora tras su introducción o entrada en una célula huésped (por ejemplo, una célula humana) en comparación con la molécula de ARN autorreplicante correspondiente que no contiene nucleótidos modificados.
Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante pueden cribarse o analizarse para confirmar sus propiedades terapéuticas y profilácticas usando diversos procedimientos de ensayo in vitro o in vivo que son conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden ensayarse vacunas que comprenden una molécula de ARN autorreplicante para su efecto sobre la inducción de la proliferación o función efectora del tipo de linfocito particular de interés, por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, líneas de linfocitos T y clones de linfocitos T. Por ejemplo, pueden aislarse esplenocitos de ratones inmunizados y la capacidad de los linfocitos T citotóxicos de lisar las células diana autólogas que contienen una molécula de aRn autorreplicante que codifica un antígeno polipeptídico. Además, puede analizarse la diferenciación de linfocitos T auxiliares midiendo la proliferación o producción de citocinas TH1 (IL-2 e IFN-y) y/o TH2 (IL-4 e IL-5) por ELISA o directamente en linfocitos T CD4+ por tinción de citocinas citoplasmáticas y citometría de flujo.
Las moléculas de ARN autorreplicante que codifican un antígeno polipeptídico también pueden ensayarse para su capacidad de inducir respuestas inmunitarias humorales, según se evidencia, por ejemplo, por la inducción de la producción por linfocitos B de anticuerpos específicos para un antígeno de interés. Estos ensayos pueden realizarse usando, por ejemplo, linfocitos B periféricos de individuos inmunizados. Dichos procedimientos de ensayos son conocidos para los expertos en la materia. Otros ensayos que pueden usarse para caracterizar las moléculas de ARN autorreplicante de la invención pueden implicar la detección de la expresión del antígeno codificado por las células diana. Por ejemplo, puede usarse FACS para detectar la expresión del antígeno sobre la superficie celular o de manera intracelular. Otra ventaja de la selección FACS es que se pueden clasificar diferentes niveles de expresión; a veces puede desearse una expresión inferior. Otro procedimiento adecuado para identificar células que expresan un antígeno particular implican el paneo usando anticuerpos monoclonales en una placa o la captura usando microesferas magnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales.
El ARN autorreplicante de la invención puede suministrarse por una diversidad de procedimientos, tal como suministro de ARN desnudo o en combinación con lípidos, polímeros u otros compuestos que facilitan la entrada en las células. Las moléculas de ARN de la presente invención pueden introducirse en células diana o sujetos usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, por inyección directa, microinyección, electroporación, lipofección, biolística y similares.
C. La molécula polipeptídica
La composición inmunogénica descrita en el presente documento comprende un componente polipeptídico y un componente de ARN. El componente polipeptídico puede ser un complejo polipeptídico o una VLP.
Los antígenos adecuados que pueden usarse como el componente polipeptídico (el "segundo antígeno polipeptídico") de la composición inmunogénica incluye proteínas y péptidos de cualquier patógeno, tal como un patógeno bacteriano, un patógeno vírico, un patógeno fúngico, un patógeno protozoico o un patógeno parasitario multicelular. Los antígenos ejemplares incluyen uno cualquiera de los antígenos descritos anteriormente, tal como un antígeno derivado de RSV VIH, parvovirus o CMV. La composición puede contener más de un antígeno polipeptídico. Como alternativa o adicionalmente, el polipéptido también puede ser un polipéptido de fusión que comprende dos o más epítopos de dos proteínas diferentes del mismo patógeno, o dos o más epítopos de dos patógenos diferentes.
El antígeno polipeptídico puede incluir secuencias adicionales, tal como una secuencia para facilitar la purificación o detección (por ejemplo, una secuencia poli-His.
El antígeno polipeptídico habitualmente estará aislado o purificado. Por tanto, no estará asociado con moléculas con las que se encuentra normalmente, en la naturaleza, si fuera aplicable.
Los polipéptidos habitualmente se prepararán por expresión en un sistema huésped recombinante. En general, se producen por expresión de construcciones recombinantes que codifican los ectodominios en células huésped recombinantes adecuadas, aunque puede usarse cualquier procedimiento adecuado. Las células huésped recombinantes adecuadas incluyen, por ejemplo, células de insecto (por ejemplo, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni), células de mamífero (por ejemplo, humanas, de primate no humano, de caballo, de vaca, de oveja, de perro, de gato y de roedor (por ejemplo, de hámster)), células de aves (por ejemplo, pollo, pato y ganso), bacterias (por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp.), células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenual polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica), células de Tetrahymena (por ejemplo, Tetrahymena thermophila) o combinaciones de las mismas. Muchas células de insecto y células de mamífero adecuadas son bien conocidas en la técnica. Las células de insecto adecuadas incluyen, por ejemplo, células Sf9, células Sf21, células Tn5, células Schneider S2 y células High Five (un aislado clonal derivado de la línea celular precursora Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (Invitrogen)). Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células de ovario de
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hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (células HEK293, típicamente transformadas por ADN de adenovirus de tipo 5 troceado), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, célula HeLa, células PERC.6 (número de depósito ECACC 96022940), células Hep G2, MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células pulmonares de feto de macaco (ATCC CL-160), células de riñón bovino de Madin-Darby ("MDBK"), células de riñón canino de Madin-Darby ("MDCK") (por ejemplo, MDCK (NBL2), ATCC CCL34; o MDCK 33016, DSM ACC 2219), células renales de cría de hámster (BHK), tales como BHK21-F, células HKCC y similares. Las células adecuadas de aves incluyen, por ejemplo, célula madre embrionarias de pollo (por ejemplo, células EBx®), fibroblastos embrionarios de pollo, células germinales embrionarias de pollo, células de pato (por ejemplo, líneas celulares AGE1.CR y AGE1.CR.pIX (ProBioGen) que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y el documento WO 2005/042728), células EB66 y similares.
Los sistemas de expresión de células de insecto adecuados, tales como sistemas de baculovirus, son conocidos para los expertos en la materia y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin n.° 1555 (1987). Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están disponibles en el mercado en forma de kit de, inter alia, Invitrogen, San Diego CA. Los sistemas de expresión de células de aves también son conocidos para los expertos en la materia y se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.340.740; 5.656.479; 5.830.510; 6.114.168; y 6.500.668; la patente europea n.° EP 0787180B; la solicitud de patente europea n.° EP 03291813.8; el documento WO 03/043415; y el documento WO 03/076601. Asimismo, también se conocen en la técnica sistemas de expresión de células bacterianas y de mamífero y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr y col., eds., 1989) Butterworths, Londres.
Las construcciones recombinantes que codifican un polipéptido pueden prepararse en vectores adecuados usando procedimientos convencionales. Varios vectores adecuados para la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto o de mamífero son bien conocidos y convencionales en la técnica. Los vectores adecuados pueden contener varios componentes incluyendo, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: un origen de replicación; un gen marcador de selección; uno o más elementos de control de la expresión, tal como un elemento de control de la trascripción (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un terminador) y/o una o más señales de traducción; y una secuencia señal o secuencia líder para dirigirlo a la ruta secretora en una célula huésped seleccionada (por ejemplo, originaria de mamífero u originaria de una especie heteróloga de mamífero o que no es de mamífero). Por ejemplo, para la expresión en células de insecto, se usa un vector de expresión de baculovirus adecuado, tal como pFastBac (Invitrogen), para producir partículas de baculovirus recombinantes. Las partículas de baculovirus se amplifican y usan para infectar células de insecto para expresar la proteína recombinante. Para la expresión en células de mamífero, se usa un vector que dirigirá la expresión de la construcción en la célula huésped de mamífero deseada (por ejemplo, células de ovario de hámster chino).
Los polipéptidos pueden purificarse usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, los procedimientos para purificar polipéptidos por cromatografía de inmunoafinidad son conocidos en la técnica. Ruiz-Arguello y col., J. Gen. Virol, 85:3677-3687 (2004). Los procedimientos adecuados para purificar las proteínas deseadas, incluyendo la precipitación y diversos tipos de cromatografía, tales como interacción hidrófoba, intercambio iónico, afinidad, quelante y de exclusión por tamaño son bien conocidos en la técnica. Pueden crearse esquemas de purificación adecuados usando dos o más de estos u otros procedimientos adecuados. Si se desea, los polipéptidos pueden incluir una "marca" que facilita la purificación, tal como una marca epitópica o una marca HIS. Dichos polipéptidos marcados pueden purificarse convenientemente, por ejemplo, de medio acondicionado, por cromatografía quelante o cromatografía de afinidad.
D. Sistemas de suministro de ARN opcionales
Además del componente proteico y el componente de ARN, opcionalmente pueden incluirse componentes adicionales, tales como lípidos, polímeros y otros compuestos en la composición inmunogénica como se describe en el presente documento para facilitar la entrada del ARN en las células diana.
Aunque el ARN puede suministrarse como ARN desnudo (por ejemplo, simplemente como una solución acuosa de ARN), para potenciar la entrada en las células y también los posteriores efectos intercelulares, la molécula de ARN se administra preferentemente en combinación con un sistema de suministro, tal como un sistema de suministro particulado o en emulsión. Los expertos en la materia conocen bien una gran cantidad de sistemas de suministro.
Por ejemplo, la molécula de ARN puede introducirse en las células mediante endocitosis mediada por receptores. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.090.619; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263:14621 (1988); y Curiel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850 (1991). Por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.083.741 divulga la introducción de un ácido nucleico exógeno en células de mamífero asociando el ácido nucleico a un resto policatiónico (por ejemplo, poli-L-lisina que tiene 3-100 restos de lisina), que se acopla por sí mismo al resto de unión al receptor de integrina (por ejemplo, un péptido cíclico que tiene la secuencia Arg-Gly-Asp).
La molécula de ARN de la presente invención puede suministrarse a las células mediante anfífilos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.071.890. Típicamente, una molécula de ácido nucleico puede formar un complejo con el anfífilo catiónico. Las células de mamífero en contacto con el complejo pueden recogerse
fácilmente.
Tres sistemas de suministro particularmente útiles son (i) liposomas, (ii) micropartículas poliméricas no tóxicas y biodegradables, (iii) emulsiones de aceite en agua submicrométricas catiónicas.
1. Liposomas
5 Diversos lípidos anfífilos pueden formar bicapas en un entorno acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo principal hidrófilo aniónico, catiónico o zwitteriónico. La formación de liposomas a partir de fosfolípidos aniónicos data de la década de 1960, y los lípidos que forma liposomas catiónicos se han estudiado desde la década de 1990. Algunos fosfolípidos son aniónicos mientras que otros son zwitteriónicos. Las clases adecuadas de fosfolípido incluyen, aunque sin limitación, 10 fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se enumeran en la tabla 2. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, aunque sin limitación, dioleoiltrimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DSdMa), 1,2-dioleiloxi-N,Ndimetill-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Lo lípidos zwitteriónicos incluyen, aunque sin limitación, lípidos zwitteriónicos de acilo y lípidos 15 zwitteriónicos de éter. Los ejemplos de lípidos zwitteriónicos útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden estar saturados o insaturados.
Tabla 2. Fosfolípidos
DDPC
1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DEPA
1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfato
DEPC
1,2-erucoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DEPE
1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DEPG
1,2-dierucoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DLOPC
1,2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DLPA
1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfato
DLPC
1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DLPE
1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DLPG
1,2-dilauroil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DLPS
1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DMG
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
DMPA
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato
DMPC
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DMPE
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DMPG
1,2-miristoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DMPS
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DOPA
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfato
DOPC
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DOPE
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DOPG
1,2-dioleoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DOPS
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DPPA
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato
DPPC
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DPPE
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DPPG
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DPPS
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DPyPE
1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
DSPA
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfato
DSPC
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DSPE
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DSPG
1,2-diestearoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DSPS
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
EPC
PC de huevo
HEPC
PC de huevo hidrogenada
HSPC
PC de soja hidrogenada de alta pureza
HSPC
PC de soja hidrogenada
LYSOPC MYRISTIC
1 -miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPC PALMITIC
1 -palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPC STEARIC
1-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
Esfingomielina de leche MPPC
1-miristoil,2-palmitoil-sn-glicero 3-fosfatidilcolina
MSPC
1-miristoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
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20
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(continuación)
PMPC
1-palmitoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
POPC
1-palmitoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
POPE
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
POPG
1,2-dioleoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol)...l
PSPC
1-palmitoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
SMPC
1-estearoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
SOPC
1-estearoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
SPPC
1-estearoil,2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
Los liposomas pueden formarse a partir de un único lípido o de una mezcla de lípidos. La mezcla puede comprender
(i) una mezcla de lípidos aniónicos, (ii) una mezcla de lípidos catiónicos, (iii) una mezcla de lípidos zwitteriónicos, (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos, (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwitteriónicos, (vi) una mezcla de lípidos zwitteriónicos y lípidos catiónicos o (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwitteriónicos. Asimismo, una mezcla puede comprender tanto lípidos saturados como lípidos insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwitteriónicos, saturado), DlinDMA (catiónico, insaturado) y/o DMPG (aniónico, saturado). Cuando se usa una mezcla de lípidos, no todos los lípidos componentes en la mezcla tienen que ser anfífilos, por ejemplo, puede mezclarse uno o más lípidos anfífilos con colesterol.
La parte hidrófila de un lípido puede estar PEGilada (es decir modificada por unión covalente de un polietilenglicol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad y evitar la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos pueden conjugarse a PEG usando técnicas tales como las divulgadas en Heyes y col. (2005) J Controlled Release 107:276-87.
Se usa una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMPG y colesterol en los ejemplos. Un aspecto diferente de la invención es un liposoma que comprende DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol. Este liposoma encapsula preferentemente aRn, tal como un aRn autorreplicante, por ejemplo, que codifica un inmunógeno.
Los liposomas se dividen habitualmente en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV); vesículas unilaminares pequeñas (SUV); y vesículas unilaminares grandes (LUV). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos diferentes. Las SUV y LUV tienen una única bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV típicamente tienen un diámetro < 50 nm, y las LUV tienen un diámetro > 50 nm. Los liposomas útiles con la invención son de forma ideal LUV con un diámetro en el intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos un 80 % en número debe tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav por intensidad) de la población idealmente está en el intervalo de 40-200 nm y/o (iii) los diámetros deben tener un índice de polidispersidad > 0,2.
Las técnicas para preparar liposomas adecuados son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase Liposomes: Methods and Protocols, Volumen 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X; Liposome Technology, Volúmenes I, II y III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006; y Functional Polymer Colloids and Microparticles Volumen 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady y Guyot). Citus Books, 2002. Un procedimiento útil implica mezclar (i) una solución etanólica de los lípidos,
(ii) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) tampón, seguido por mezcla, equilibrado, dilución y purificación (Heyes y col. (2005) J Controlled Release 107:276-87.).
El ARN se encapsula preferentemente dentro de los liposomas, y de esa manera el liposoma forma una capa exterior alrededor de un núcleo acuoso que contiene aRn. Se ha descubierto que esta encapsulación protege el ARN de la digestión con RNasa. Los liposomas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo, sobre la superficie de los liposomas), pero al menos la mitad del ARN (y de forma ideal todo) está encapsulado.
2. Micropartículas poliméricas
Diversos polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorber ARN. El uso de un polímero sustancialmente no tóxico significa que un destinatario puede recibir de forma segura las partículas, y el uso de un polímero biodegradable significa que las partículas pueden metabolizarse después del suministro para evitar la persistencia a largo plazo. Los polímeros útiles también se pueden esterilizar, para ayudar a preparar las formulaciones de calidad farmacéutica.
Los polímeros no tóxicos y biodegradables adecuados incluyen, aunque sin limitación, poli(a-hidroxiácidos), ácidos polihidroxibutíricos, politactonas (incluyendo policaprolactonas), polidioxanonas, polivalerolactona, poliortoésteres, polianhídridos, policianoacrilatos, policarbonatos derivados de tirosina, polivinil-pirrolidinonas o piesteramidas, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las micropartículas se forman a partir de poli(a-hidroxiácidos), tales como poli(láctidos) ("PLA"), copolímeros de láctido y glicólido tales como poli(D,L-láctido-co-glicólido) ("PLG") y copolímeros de D,L-láctido y caprolactona. Los polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen una relación molar de láctido/glicólido que varía, por ejemplo, de 20:80 a 80:20, por ejemplo, 25:75, 40:60, 45:55, 55:45, 60:40, 75:25. Los
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polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5000-200 000 Da, por ejemplo, entre 10 000-100 000, 20 000-70 000, 40 000-50 000 Da.
Las micropartículas de forma ideal tienen un diámetro en el intervalo de 0,02 pm a 8 pm. Para una composición que comprende una población de micropartículas con diferentes diámetros, al menos un 80 % en número debe tener diámetros en el intervalo de 0,03-7 pm.
Las técnicas para preparar micropartículas adecuadas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase Functional Polymer Colloids and Microparticles volumen 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002; Polymers in Drug Delivery. (eds. Uchegbu & Schatzlein). CRC Press, 2006. (en particular capítulo 7) y Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (eds. Cohen & Bernstein). CRC Press, 1996. Para facilitar la adsorción del ARN, una micropartícula puede incluir un tensioactivo catiónico y/o lípido, por ejemplo, como se divulga en O'Hagan y col. (2001) J Virology75:9037-9043; y Singh y col. (2003) Pharmaceutical Research 20: 247-251. Una manera alternativa de preparar micropartículas poliméricas es por moldeo y curado, por ejemplo, como se divulga en el documento WO 2009/132206.
Las micropartículas de la invención pueden tener un potencial zeta entre 40-100 mV.
El ARN puede adsorberse a las micropartículas, y la adsorción se facilita por la inducción de materiales catiónicos (por ejemplo, lípidos catiónicos) en la micropartícula.
3. Emulsiones catiónicas de aceite en agua
Se conocen las emulsiones de aceite en agua para ejercer efectos adyuvantes en vacunas contra la gripe, por ejemplo, el adyuvante MF59™ en el producto fLuAD™, y el adyuvante AS03 en el producto PREPANDRIX™. El suministro de ARN de acuerdo con la presente invención puede utilizar una emulsión de aceite en agua, con la condición de que la emulsión incluya una o más moléculas catiónicas. Por ejemplo, puede incluirse un lípido catiónico en la emulsión para proporcionar una superficie de gota positiva a la que pueda unirse un ARN de carga negativa.
La emulsión comprende uno o más aceites. El aceite o aceites adecuados incluyen aquellos de, por ejemplo, una fuente animal (tal como pescado) o vegetal. El aceite de forma ideal es biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. Puede usarse aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido del grano de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más ampliamente disponible, pero también puede usarse el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Pueden prepararse ésteres de ácido graso de 6-10 carbonos de glicerol y 1-2 propanodiol, aunque no existen de forma natural en aceites de semilla, por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y por tanto pueden usarse. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuente animales son bien conocidos en la técnica.
Principalmente el pesado contiene aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena tales como esperma de ballena, ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden usarse en el presente documento. Se sintetizan varios aceites de cadena ramificada de forma bioquímica en unidades de isopreno de 5-carbonos y generalmente se mencionan como terpenoides. También puede obtenerse escualeno de levaduras u otros microbios adecuados. En algunas realizaciones, el escualeno se obtiene preferentemente de fuentes no animales, tales como de oliva, aceite de oliva y levaduras. El escualano, el análogo saturado de escualeno también puede usarse. Los aceites de pescado, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica.
Otros aceites útiles son los tocoferoles, particularmente en combinación con escualeno. Cuando la fase oleosa de una emulsión incluye un tocoferol, puede usarse cualquiera de los a, p, y, 6, £ o ^ tocoferoles, pero se prefieren los a-tocoferoles. Puede usarse tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. Puede usarse una combinación de aceite que comprende escualeno y un tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).
Las emulsiones preferidas comprenden escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide insaturado ramificado ((C3qH50; [(CHa)2C[=CHCH2CH2C(CHa)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-
tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9).
El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceite, por ejemplo, escualeno y al menos un aceite adicional.
El componente acuoso de la emulsión puede ser agua corriente (por ejemplo w.f.i.) o puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampón, por ejemplo, sales citrato
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o fosfato, tales como sales de sodio. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris, un tampón borato; un tampón succinato; un tampón de histidina; o un tampón citrato. Se prefiere una fase acuosa tamponada, y los tampones típicamente estarán incluidos en el intervalo de 5-20 nM.
La emulsión también incluye un lípido catiónico. Preferentemente este lípido es un tensioactivo de modo que pueda facilitar la formación y estabilización de la emulsión. Los lípidos catiónicos útiles generalmente contienen un átomo de nitrógeno que está cargado positivamente en condiciones fisiológicas, por ejemplo, como una amina terciaria o cuaternaria. Este nitrógeno puede estar en el grupo principal hidrófilo de un tensioactivo anfífilo. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, aunque sin limitación: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 3'-[N-(N',N'- dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC colesterol), dimetildioctadecil-amonio (DDA, por ejemplo, el bromuro), 1,2-dimiristoil-3-trimetil-amoniopropano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetilamoniopropano (DPTAP), distearoiltrimetilamoniopropane (DSTAP). Otros lípidos catiónicos útiles son: cloruro de benzalconio (BAK), cloruro de bencetonio, cetramida (que contiene bromuro de tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC), N,N',N'-polioxietilen (10)-N-sebo-1,3 -diaminopropano, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de alquilmetilamonio mixto, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecilamonio, metóxido de benciltrimetilamonio, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB),cloruro de metilbencetonio, cloruro de decametonio, cloruro de metiltrialquilamonio mixto, cloruro de metiltrioctilamonio), cloruro de N,N-dimetil-N-[2 (2-metil-4- (1,1,3,3tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxy)eti]-bencenometanaminio (DEBDA), sales de dialquildimetilamonio, cloruro de [1- (2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N,trimetilampnio, 1,2-diacil-3-(trimetilamonio) propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, diestearoilo, dioleoilo), 1,2-diacil-3(dimetilamonio)propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, diestearoilo, dioleoilo), 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetil-amonio)butanoil-sn-glicerol, éster de colina de 1,2-dioleoil 3-succinil- sn-glicerol, butanoato de colesterilo (4-trimetilamonio), sales de N-alquilpiridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio), sales de N-alquilpiperidinio, electrolitros de bolaforma dicatiónicos (C12Me6; C12BU6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a dioleoilfosfatidiletanolamina, éster de colina de hemisuccinato de colesterol, lipopoliaminas, incluyendo, aunque sin limitación, dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), dipalmitoil fosfatidiletanol-amidoespermina (DPPES), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli(L (o D)-lisina conjugada con N- glutarilfosfatidiletanolamina, éster de glutamoto de didodecilo con grupo amino colgante (CAGluPhCnN ), éster de glutamato de ditetradecilo con grupo amino colgante (C14GIuCnN+), derivados catiónicos de colesterol, incluyendo, aunque sin limitación, sal de p-oxisuccinamidoetilentrimetilamonio de colesterilo-3, p-oxisuccinamidoetilen- dimetilamina de colesterilo-3, sal de p-carboxiamidoetilentrimetilamonio de colesterilo-3 y p-carboxiamidoetilendimetilamina de colesterilo-3. Otros lípidos catiónicos útiles se describen en el documento US 2008/0085870 y el documento US 2008/0057080.
El lípido catiónico es preferentemente biodegradable (metabolizable) y biocompatible.
Además del aceite y el lípido catiónico, una emulsión puede incluir un tensioactivo no iónico y/o un tensioactivo zwitteriónico. Dichos tensioactivos incluyen, aunque sin limitación: los tensioactivos de ésteres de sorbitán de polioxietileno (habitualmente mencionados como Tween), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), vendidos con el nombre comercial DOWFAX™, tales como copolímeros de bloque lineales de EO/PO; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi repetitivos (oxi-1,2-etanodiilo), siendo el octoxinol-9 (TritonX-100 o t-octilfenoxipolietoxietanol) de particular interés; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como tensioactivos Brij), tales como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); éter de polioxietilen-9-laurilo; y ésteres de sorbitán (habitualmente conocidos como Spans), tales como trioleato de sorbitán(Span 85) y monolaurato de sorbitán. Los tensioactivos preferidos para incluir en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietilensorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y TritonX-100.
Pueden incluirse en la emulsión mezclas de estos tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85 o mezclas de Tween 80/Triton-X100. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilensorbitán tal como monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Triton X100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilensorbitán y/o un octoxinol. Las mezclas útiles pueden comprender un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, polisorbato 80, con un HLB de 15,0) y un tensioactivo de un valor de HLB en el intervalo de 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitán, con un HLB de 1,8).
Las cantidades preferidas de aceite (% en volumen) en la emulsión final son entre un 2-20 % por ejemplo, 5-15 %, 6-14%, 7 13%, 8.12%. Es particularmente útil un contenido de escualeno de aproximadamente un 4-6% o aproximadamente un 9-11 %.
Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) en la emulsión final son entre un 0,001 % y un 8 %. Por ejemplo: ésteres de polioxietilensorbitán (tales como polisorbato 80) de un 0,2 a un 4 %, en particular entre un 0,4-0,6 %, entre un 0,45-0,55 %, aproximadamente un 0,5% o entre un 1,5-2%, entre un 1,8-2,2%, entre un 1,9-2, 1 %, aproximadamente un 2 % o un 0,85-0,95 %, o aproximadamente un 1 %; ésteres de sorbitán (tales como
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trioleato de sorbitán) de un 0,02 a un 2 %, en particular de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1 %; octil o nonilfenoxipolioxietanoles (tale como Triton X-100) de un 0,001 a un 0,1 %, en particular de un 0,005 a un 0,02 %; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) de un 0,1 a un 8 %, preferentemente de un 0,1 a un 10 % y en particular de un 0,1 a un 1 % o de aproximadamente un 0,5 %.
Las cantidades absolutas de aceite y tensioactivo, y su relación, pueden variarse dentro de amplios limites mientras formen aún una emulsión. Los expertos en la materia pueden variar fácilmente las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsión deseada, pero es típica una relación ponderal entre 4:1 y 5:1 para aceite y tensioactivo (exceso de aceite).
Un parámetro importante para asegurar la actividad inmunoestimuladora de una emulsión, particularmente en animales grandes, es el tamaño de la gota de aceite (diámetro). Las emulsiones más eficaces tienen un tamaño de gota en el intervalo submicrométrico. Adecuadamente los tamaños de gota estarán en el intervalo de 50-750 nm. De forma muy útil, el tamaño de gota promedio es de menos de 2520 nm, por ejemplo, de menos de 200 nm, menos de 150 nm. El tamaño de gota promedio está de forma útil en el intervalo de 80-180 nm. De forma ideal, al menos un 80 % (en número) de las gotas de aceite de la emulsión son de menos de 250 nm de diámetro y, preferentemente, al menos un 90 %. Los aparatos para determinar el tamaño de gota promedio en una emulsión, y la distribución de tamaños están disponibles en el mercado. Estos usan típicamente las técnicas de dispersión de luz dinámica y/o detección óptica de partículas individuales, por ejemplo, la serie Accusizer™ y Nicomp™ de instrumentos disponibles en Particle Sizing Systems (Santa Barbara, EE. UU.) o los instrumentos Zetasizer™ de Malvern Instruments (RU), o los instrumentos Particle Size Distribution Analyzer de Horiba (Kioto, Japón).
De forma ideal, la distribución de los tamaños de gota (en número) tiene únicamente un máximo, es decir, hay una única población de gotas distribuidas alrededor de un promedio (modo), en lugar de tener dos máximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersión de < 0,4, por ejemplo, 0,3, 0,2 o menos.
Las emulsiones adecuadas con gotas submicrométricas y una estrecha distribución de tamaños pueden obtenerse por el uso de microfluidificación. Esta técnica reduce el tamaño de gota de aceite promedio impulsando corrientes de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijos a alta presión y alta velocidad. Estas corrientes entran en contacto con las paredes de los canales, las paredes de la cámara y entre sí. Las fuerzas resultantes de cizalla, impacto y cavitación causan una reducción en el tamaño de gota. Las etapas repetidas de microfluidificación pueden realizarse hasta que se consigue una emulsión con un tamaño de gota promedio y distribución deseados.
Como alternativa a la microfluidificación, pueden usarse procedimientos térmicos para causar inversión de fases. Estos procedimientos también pueden proporcionar una emulsión submicrométrica con una estrecha distribución de tamaños de partícula.
Las emulsiones preferidas pueden esterilizarse por filtro, es decir, sus gotas pueden pasar a través de un filtro de 220 nm. Así como proporcionar una esterilización, este procedimiento también elimina cualquier gota grande en la emulsión.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico en la emulsión es DOTAP. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DOTAP de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,3 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente
1.4 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de
aproximadamente 1,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 24 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 22 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,9 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,8 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,7 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente
0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml,
aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente
1.4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml,
aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml de DOTAP, tal como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,6 mg/ml.
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En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DC colesterol. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DC colesterol de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de DC colesterol. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DC colesterol de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,46 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a
aproximadamente 4,92 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,46 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a
aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 2,46 mg/ml, aproximadamente 4,92 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 4,92 mg/ml de DC colesterol, tal como 2,46 mg/ml.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DDA. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de DDA. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DDA de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a
aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a
aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,45 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,45 mg/ml, etc. Como alternativa, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender dDa a aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21,5 mg/ml, aproximadamente 21,6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1,45 mg/ml.
Las moléculas de ARN de la invención también pueden suministrarse a células ex vivo, tal como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia tisular) o células madre hematopoyéticas donantes universales, seguido por reimplante de las células en un paciente, habitualmente después de la selección para células que se han transfectado con la molécula de ARN. La cantidad apropiada de células a suministrar a un paciente variará con las condiciones del paciente, y el efecto deseado, que pueden determinarse por los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.054.288; 6.048.524; y 6.048.729. Preferentemente, las células usadas son autólogas, es decir, células obtenidas del paciente que se está tratando.
E. Adyuvantes
En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento incluyen o incluyen opcionalmente uno o más agentes inmunorreguladores tales como adyuvantes. Los adyuvantes ejemplares incluyen, aunque sin limitación, un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, analizados adicionalmente a continuación. En ciertas realizaciones, los adyuvantes usados en las composiciones inmunogénicas proporcionados en el presente documento incluyen, aunque sin limitación: 1 2 3 4 5
1. Composiciones que contienen minerales;
2. Emulsiones oleosas;
3. Formulaciones de saponina;
4. Virosomas y partículas de tipo virus;
5. Derivados bacterianos o microbianos;
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6. Bioadhesivos y mucoadhesivos;
7. Liposomas;
8. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno;
9. Polifosfazeno (PCPP);
10. Muramil péptidos;
11. Compuestos de imidazoquinolona;
12. Compuestos de tiosemicarbazona;
13. Compuestos de triptantrina;
14. Inmunomoduladores humanos;
15. Lipopéptidos;
16. Benzonaftiridinas;
17. Macropartículas;
18. Polinucleótido inmunoestimulador (tal como ARN o ADN; por ejemplo, oligonucleótidos que contienen CpG)
1. Composiciones que contienen minerales
Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La composición inmunogénica puede incluir sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. (véase, por ejemplo, VACCINE DESIGN: THE SUBUNIT AND ADJUVANT APPROACH (Powell, M.F. y Newman, MJ. eds.) (Nueva York: Plenum Press) 1995, Capítulos 8 y 9), o mezclas de diferentes compuestos minerales (por ejemplo, una mezcla de un adyuvante de fosfato y uno de hidróxido, opcionalmente con un exceso del fosfato), adoptando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalino, amorfo, etc.), y prefiriéndose la adsorción de la sal o sales. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica (documento WO 00/23105).
Las sales de aluminio pueden incluirse en vacunas de la invención de modo que la dosis de Al3+ esté entre 0,2 y 1,0 mg por dosis.
En ciertas realizaciones, el adyuvante basado en aluminio es alumbre (sulfato de aluminio y potasio (AlK(SO4)2) o un derivado de alumbre, tal como el formado in situ mezclando un antígeno en tampón fosfato con alumbre, seguido por valoración y precipitación con una base tal como hidróxido de amonio o hidróxido de sodio.
Otro adyuvante basado en aluminio adecuado para su uso en las formulaciones de vacuna es adyuvante de hidróxido de aluminio (Al(OH)g) y oxihidróxido de aluminio (AlOOH) cristalino, que es un excelente adsorbente, que tiene un área superficial de aproximadamente 500 m2/g. Como alternativa, el adyuvante basado en aluminio puede ser adyuvante de fosfato de aluminio (APO4) o hidroxifosfato de aluminio, que contiene grupos fosfato en lugar de algunos o todos los grupos hidroxilo del adyuvante de hidróxido de aluminio. Los adyuvantes de fosfato de aluminio preferidos proporcionados en este documento son amorfos y solubles en medio ácido, básico y neutro.
En ciertas realizaciones, el adyuvante comprende tanto fosfato de aluminio como hidróxido de aluminio. En una realización más particular, el adyuvante tiene una mayor cantidad de fosfato de aluminio que de hidróxido de aluminio, tal como una relación de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o mayor de 9:1, en peso de fosfato de aluminio a hidróxido de aluminio. En otra realización, las sales de aluminio en la vacuna están presentes a 0,4 a 1,0 mg por dosis de vacuna, o de 0,4 a 0,8 mg por dosis de vacuna o de 0,5 a 0,7 mg por dosis de vacuna o de aproximadamente 0,6 mg por dosis de vacuna.
En general, el adyuvante o adyuvantes basados en aluminio preferidos, o la relación de múltiples adyuvantes basados en aluminio, tal como fosfato de aluminio a hidróxido de aluminio, se seleccionan por optimización de la atracción electrostática entre las moléculas, de modo que el antígeno porte una carga opuesta al adyuvante al pH deseado. Por ejemplo, el adyuvante de fosfato de aluminio (iep = 4) adsorbe lisozima, pero no albúmina a pH 7,4. Si la albúmina es la diana, se seleccionaría adyuvante de hidróxido de aluminio (iep = 4). Como alternativa, el pretratamiento de hidróxido de aluminio con fosfato disminuye su punto isoeléctrico, haciendo que sea un adyuvante preferido para antígenos más básicos.
2. Emulsiones oleosas
Las composiciones y formulaciones de emulsión oleosa adecuadas para su uso como adyuvantes (con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como muramil péptidos o componentes de la pared celular bacteriana) incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (5 % de escualeno, 0,5 % de Tween 80 y 0,5 % de Span 85, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidificador). Véase el documento WO 90/14837. Véase también, Podda (2001) VACCINE 19: 2673-2680; Frey y col., (2003) Vaccine 21 :4234-4237. MF59 se usa como adyuvante en la vacuna de subunidades trivalente del virus de la gripe FLUAD™.
Los adyuvantes de emulsión oleosa particularmente preferidos para su uso en las composiciones son emulsiones de aceite en agua submicrométricas. Las emulsiones de aceite en agua submicrométricas preferidas para su uso en el presente documento son emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente cantidades variables de MTP- PE, tal como una emulsión de aceite en agua submicrométrica que contiene un 4-5 % p/v de escualeno, un 0,25-
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1,0% p/v de Tween 80™ (monooleato de polioxietilensorbitán) y/o un 0,25-1,0% de Span 85™ (trioleato de sorbitán) y, opcionalmente, N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-SM-glicero-3- hidroxifosfoforiloxi)-etil-amina (MTP-PE), por ejemplo, la emulsión de aceite en agua submicrométrica conocida como "MF59" (documento WO 90/14837; patente de Estados Unidos n.° 6.299.884; patente de Estados Unidos n.° 6.451.325; y Ott y col., "MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. y Newman, Mj. eds.) (Nueva York: Plenum Press) 1995, pág. 277-296). MF59 contiene un 4-5 % p/v de escualeno (por ejemplo, un 4,3 %), un 0,25-0,5 % p/v de Tween 80™ y un 0,5 % p/v de Span 85™ y opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidificador tal como un microfluidificador modelo 11OY (Microfluidics, Newton, MA). Por ejemplo, MTP-PE puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0-500 mg/dosis, más preferentemente 0-250 mg/dosis y mucho más preferentemente 0-100 mg/dosis. Como se usa en el presente documento, el término "MF59-0" se refiere a la emulsión de aceite en agua submicrométrica anterior que carece de MTP-PE, mientras que el término MF59-MTP indica una formulación que contiene MTP-PE. Por ejemplo, "MF59- 100" contiene 100 |jg de MTP-PE por dosis y así sucesivamente. MF69, otra emulsión de aceite en agua submicrométrica para su uso en el presente documento, contiene un 4,3 % p/v de escualeno, un 0,25 % p/v de Tween 80™ y un 0,75 % p/v de Span 85™ y opcionalmente MTP-PE. Otra emulsión de aceite en agua submicrométrica más es MF75, también conocida como SAF, que contiene un 10% de escualeno, un 0,4% de Tween 80™, un 5% de polímero bloqueado pluronic L121 y thr-MDP, también microfluidificado en una emulsión submicrométrica. MF75-MTP indica una formulación MF75 que incluye MTP, tal como de 100-400 jg de MTP-PE por dosis.
Las emulsiones de aceite en agua submicrométricas, procedimientos de preparación de las mismas y agentes inmunoestimuladores, tales como muramil péptidos, para su uso en las composiciones, se describen en detalle en el documento WO 90/14837; patente de Estados Unidos n.° 6.299.884; y patente de Estados Unidos n.° 6.451.325.
También puede usarse adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) como adyuvantes en la invención.
3. Otros adyuvantes inmunológicos
Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso las flores de una amplia gama de especies de plantas. Las saponinas aisladas de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se han estudiado ampliamente como adyuvantes. Las saponinas también pueden obtenerse de forma comercial de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (planta jabonera). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como ISCOM. Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen adyuvante STIMULON® (Antigenics, Inc., Lexington, MA).
Las composiciones de saponina se han purificado usando cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HP-TLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC). Las fracciones purificadas específicas usando estas técnicas se han identificado, incluyendo QS7, QS 17, QS 18, QS21, Qh-A, QH-B y QH-C. preferentemente, la saponina es QS21. Se divulga un procedimiento de producción de QS21 en la patente de Estados Unidos n.° 5.057.540. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol (véase el documento WO 96/33739).
Las formulaciones de saponina pueden incluir esteroles, colesteroles y formulaciones lipídicas. Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden usarse para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM). Los ISCOM típicamente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Puede usarse cualquier saponina conocida en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de Quil A, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en los documentos EP 0 109 942, WO 96/11711 y WO 96/33739. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de uno o más detergentes adicionales. Véase el documento Wo 00/07621.
Puede encontrarse una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina en Barr y col., (1998) ADV. DRUG DEL. REV. 32:247-271. Véase también Sjolander y col., (1998) ADV. DRUG DEL. REV. 32:321-338
Los virosomas y partículas de tipo virus (VLP) generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Generalmente, son no patogénicas, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma vírico nativo. Las proteínas víricas pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus completos. Estas proteínas víricas adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tal como HA o NA), virus de la hepatitis B (tal como proteínas del núcleo o de la cápsida), virus de la hepatitis B, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la fiebre aftosa, retrovirus, virus Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago-Qp (tal como proteínas de la cubierta), fago-GA, fago-fr, fago AP205 y Ty (tal como la proteína pi del retrotransposón Ty). Las VLP se analizan adicionalmente en los documentos WO 03/024480; WO 03/024481; Niikura y col., (2002) VIROLOGY 293:273-280; Lenz y col., (2001) J. IMMUNOL. 166(9):5346-5355' Pinto y col., (2003) J. INFECT. DIS. 188:327-338; y Gerber y
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col., (2001) J. VIROL. 75(10):4752-4760. Los virosomas se analizan adicionalmente en, por ejemplo, Gluck y col.,
(2002) VACCINE 20:B10-B16. Se usan virosomas de la gripe reconstituidos inmunopotenciadores (IRIV) como el sistema de suministro de antígenos de subunidad en el producto INFLEXAL™ trivalente intranasal (Mischler y Metcalfe (2002) VACCINE 20 Suppl 5:B17-B23) y el producto INFLUVAC PLUS™.
Los derivados bacterianos y microbianos para su uso como adyuvantes incluyen, aunque sin limitación:
(1) Derivados no tóxicos de lipopolisacárido (LPS) enterobacteriano: dichos derivados incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). El 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferida de "partícula pequeña" de monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado se divulga en el documento EP 0 689 454. Dichas "partículas pequeñas" 3dMPL son suficientemente pequeñas para filtrarse a esterilidad a través de una membrana de 0,22 micrones (véase el documento EP 0 689 454). Otros derivados no tóxicos de LPS incluyen miméticos de monofosforil lípido A, tales como derivados de fosfato de aminoalquil glucosamínido, por ejemplo, RC-529. Véase Johnson y col., (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2273-2278.
(2) Derivados de lípido A: los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tales como oM-174. OM-174 se describe, por ejemplo, en Meraldi y col., (2003) Vaccine 21 :2485-2491; y Pajak y col., (2003) Vaccine 21 :836-842. Otro adyuvante ejemplar es el dímero fosfolipídico sintético E6020 (Eisai Co. Ltd., Tokio, Japón), que imita las propiedades fisicoquímicas y biológicas de muchos de los lípidos A naturales derivados de bacterias Gran negativas.
(3) Oligonucleótidos inmunoestimuladores: los oligonucleótidos inmunoestimuladores o moléculas poliméricas adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia que contiene una citosina no metilada seguida por guanosina y unida por un enlace fosfato). El ARN bicatenario bacteriano u oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o de poli(dG) también han demostrado ser inmunoestimuladoras. Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos nucleotídicos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Opcionalmente, la guanosina puede remplazarse con un análogo tal como 2'-desoxi-7-desaza-guanosina. Véase Kandimalla y col., (2003) Nucl. Acids Res. 31(9): 2393-2400; documento WO 02/26757; y documento WO 99/62923 para ejemplos de posibles sustituciones análogas. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se analiza adicionalmente en Krieg (2003) Nat. Med. 9(7):831- 835; McCluskie y col., (2002) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 32: 179-185; documento WO 98/40100; patente de Estados Unidos n.° 6.207.646; patente de Estados Unidos n.° 6.239.116; y patente de Estados Unidos n.° 6.429.199.
La secuencia CpG puede estar dirigida a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT. Véase Kandimalla y col.,
(2003) Biochem. Soc. Trans. 31 (parte 3):654-658. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria ThI, tal como un ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se describen en Blackwell y col., (2003) J. Immunol. 170(8):4061-4068; Krieg (2002) TRENDS Immunol. 23(2): 64-65; y el documento WO 01/95935. Preferentemente, el ODN CpG es un CpG-A.
Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de modo que el extremo 5' esté accesible para el reconocimiento por el receptor. Opcionalmente, pueden unirse dos secuencias oligonucleotídicas CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véase, por ejemplo, Kandimalla y col., (2003) BBRC 306:948-953; Kandimalla y col., (2003) Biochem. Soc. Trans. 3 1(parte 3):664-658' Bhagat y col., (2003) bBrC 300:853-861; y el documento WO03/035836.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores y moléculas poliméricas también incluyen estructuras de esqueleto polimérico alternativas tales como, aunque sin limitación, estructuras de polivinilo (Pitha y col., (1970) Biochem. Biophys. Acta 204(1):39-48; Pitha y col., (1970) Biopolymers 9(8):965-977) y estructuras morfolino (patente de Estados Unidos n.° 5.142.047; patente de Estados Unidos n.° 5.185.444). Se conocen en la técnica una diversidad de otros análogos polinucleotídicos cargados y no cargados. Se conocen en la técnica numerosas modificaciones estructurales incluyen, aunque sin limitación, enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos y carbamatos) y enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos y fosforoditioatos).
El adyuvante IC31, Intercell AG, Viena, Austria, es una formulación sintética que contiene un péptido antimicrobiano, KLK, y un oligonucleótido inmunoestimulador, ODNIa. La solución de dos componentes puede simplemente mezclarse con antígenos (por ejemplo, partículas de acuerdo con la invención con un antígeno asociado), sin conjugación requerida.
Toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas: pueden usarse toxinas ADP-ribosilantes bacterianas y derivados destoxificados de las mismas como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína se obtiene de E. coli (es decir, enterotoxina termoinestable de E. coli "LT"), cólera ("CT") o tosferina ("PT"). El uso de toxinas ADP-ribosilantes destoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en el documento WO 95/17211 y como adyuvantes parenterales en el documento WO 98/42375. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LTR192G. El uso de toxinas ADP-ribosilantes y derivados
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destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes, puede encontrarse en las siguientes referencias: Beignon y col., (2002) Infect. Immun. 70(6):3012-3019; Pizza y col., (2001) Vaccine 19:2534- 2541; Pizza y col., (2000) J. Med. Microbiol. 290(4-5):455- 461; Scharton-Kersten y col., (2000) Infect. Immun. 68(9):5306-5313' Ryan y col., (1999) Infect. Immun. 67(12):6270-6280; Partidos y col., (1999) Immunol. Lett. 67(3):209-216; Peppoloni y col., (2003) Vaccines 2(2):285-293; y Pine y col., (2002) J. Control Release 85(1-3):263- 270. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ADP-ribosilantes expuestas en Domenighini y col., (1995) MoI. Microbiol. 15(6): 1165-1167.
También pueden usarse bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado (Singh y col., (2001) J. Cont. Release 70:267-276) o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También pueden usarse quitosano y derivados del mismo como adyuvantes en la invención (véase el documento WO 99/27960).
Se describen ejemplos de formulaciones liposómicas adecuadas para su uso como adyuvantes en la patente de Estados Unidos n.° 6.090.406; la patente de Estados Unidos n.° 5.916.588; y la publicación de patente EP n.°EP 0 626 169.
Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno (véase, por ejemplo, el documento WO 99/52549). Dichas formulaciones incluyen además tensioactivos de éster de polioxietilensorbitán en combinación con un octosinol (documento WO 01/21207), así como tensioactivos de alquil éter o éster de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivos no iónico adicional tal como un octosinol (documento WO 01/21152). Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietilen-9-esteorilo, éter de polioxietilen-8-esteorilo, éter de polioxietilen-4-laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo y éter de polioxietilen-23-laurilo.
Las formulaciones PCPP adecuadas para su uso como adyuvantes se describen, por ejemplo, en Andrianov y col. (1998) Biomaterials 19(1-3): 109-115; y Payne y col. (1998) Adv. Drug Del. Rev. 31(3): 185-196.
Los ejemplos de muramil péptidos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-1-alanil-d- isoglutaminil-1-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfonloxi)-etilamina (MTP-PE).
Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolina adecuados para su uso como adyuvantes incluyen Imiquimod y sus análogos, que se describen además en Stanley (2002) Clin. Exp. Dermatol. 27(7):571-577; Jones (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4(2):214-218; y las patentes de Estados Unidos n.° 4.689.338; 5.389.640; 5.268.376; 4.929.624; 5.266.575; 5.352.784; 5.494.916; 5.482.936; 5.346.905; 5.395.937; 5.238.944; y 5.525.612.
Los ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona adecuados para su uso como adyuvantes, así como
procedimientos de formulación, fabricación y cribado de dichos compuestos, incluyen los descritos en el documento
WO 4/60308. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para producción de citocinas, tales como TNF-a.
Los ejemplos de compuestos de triptantrina adecuados para su uso como adyuvantes, así como procedimientos de formulación, fabricación y cribado de dichos compuestos, incluyen los descritos en el documento WO 04/64759. Los compuestos de triptantrina son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF-a. Los ejemplos de compuestos de
benzonaftiridina adecuados para su uso como adyuvantes incluyen:
Los ejemplos de compuestos de benzonaftiridina adecuados para su uso como adyuvantes, así como
procedimientos de formulación y fabricación, incluyen los descritos en el documento WO 2009/111337.
Los lipopéptidos adecuados para su uso como adyuvantes se describen anteriormente. Otros lipopéptidos ejemplares incluyen, por ejemplo, LP 40, que es un agonista de TLR2. Véase, por ejemplo, Akdis, y col., eUr. J. iMmUnOLOGY, 33: 2717-26 (2003). Los lipopéptidos de mureína son lipopéptidos derivados de E. coli. Véase, Hantke, y col., Eur. J. Biochem., 34: 284-296 (1973). Los lipopéptidos de mureína comprende un péptido unido a ácido N-acetil murámico y, por tanto, están relacionados con los muramil péptidos, que se describen en Baschang, y col., Tetrahedron, 45(20): 6331-6360 (1989).
Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen, aunque sin limitación citocinas, tales como, a modo de ejemplo únicamente, interleucinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12), interferones (tales como, a modo de ejemplo únicamente, interferón-Y), factor estimulador de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral.
Las micropartículas adecuadas para su uso como adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, micropartículas formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(alfa-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, un polioctoéster, un pilianhídrido, una policaprolactona, etc.), con pili(láctido-co-glicólido).
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En ciertas realizaciones, dichas micropartículas se tratan para que tengan una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB). Las micropartículas adecuadas para su uso como adyuvantes tienen un diámetro de partícula de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 150 pm de diámetro. En ciertas realizaciones, el diámetro de partícula es de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 pm, y en otras realizaciones, el diámetro de partícula es de aproximadamente 500 nm a 10 pm.
4. Composiciones inmunogénicas
En un aspecto, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden: (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico, y (ii) un segundo antígeno polipeptídico; en las que dicho primer y segundo antígenos polipeptídicos son de diferentes patógenos.
Las composiciones inmunogénicas típicamente incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un sistema de suministro adecuado como se describe en el presente documento, tales como liposomas, nanoemulsiones, micro y nanopartículas de PLG, lipoestructuras reticuladas, micro y nanopartículas de quitosano y otras poliestructuras reticuladas. Si se desea, pueden incluirse otros componentes farmacéuticamente aceptables, tales como excipientes y adyuvantes. Estas composiciones pueden usarse como vacunas antivíricas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan, en parte, por la composición particular que se está administrando, así como por el procedimiento particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones inmunogénicas de la presente invención. Puede usarse una diversidad de vehículos acuosos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en las composiciones inmunogénicas incluyen agua corriente (por ejemplo, w.f.i.) o un tampón, por ejemplo, un tampón fosfato, un tampón Tris, un tampón borato, un tampón succinato, un tampón de histidina o un tampón citrato. Las sales tamponantes típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 nM.
Las composiciones inmunogénicas son preferentemente estériles, y pueden esterilizarse por técnicas convencionales de esterilización.
Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según lo necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, y agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares.
Preferentemente, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden tener un pH entre 5,0 y 9,5, por ejemplo, entre 6,0 y 8,0.
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl es típica, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden tener una osmolalidad entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240-360 mOsm/kg o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir uno o más conservantes, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefieren composiciones sin mercurio, y pueden prepararse vacuna sin conservantes.
Las composiciones inmunogénicas de la invención son preferentemente apirógenas, por ejemplo, que contienen < 1 EU (unidades de endotoxina, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 EU por dosis. Las composiciones inmunogénicas de la invención preferentemente no tienen gluten.
Las concentraciones de la molécula polipeptídica y la molécula de ARN en las composiciones inmunogénicas pueden variar, y se seleccionarán basándose en los volúmenes de líquido, las viscosidades, el peso corporal y otras consideraciones de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del destinatario pretendido. Sin embargo, las composiciones inmunogénicas se formulan para proporcionar una cantidad eficaz de ARN + polipéptido, tal como una cantidad (en una dosis individual o como parte de una serie) que es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y estado físico del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate humano, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo de reaccionar al antígeno, la afección a tratar y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos rutinarios. El contenido de ARN de las composiciones generalmente se expresará en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene <200 mg, <100mg, < 50 mg o < 10 mg de ARN, y la expresión puede observarse a niveles muy inferiores, por ejemplo, < 1 pg/dosis, < 100 ng/ dosis, < 10 ng/ dosis, < 1 ng/ dosis, etc. La cantidad de polipéptido en cada dosis generalmente comprenderá de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 pg de polipéptido, prefiriéndose de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pg y prefiriéndose alternativamente de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 pg/dosis.
La cantidad de adyuvante, si lo hay, será una cantidad que inducirá una respuesta inmunomoduladora sin efecto
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secundario adverso significativo. Una cantidad opcional para una vacuna particular puede averiguarse por estudios convencionales que implican la observación de los títulos de anticuerpo de la vacuna y sus capacidades de neutralización del virus. La cantidad de adyuvante será de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 pg/dosis, prefiriéndose de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pg/dosis y prefiriéndose alternativamente de aproximadamente 20 a 50 pg/dosis.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, tal como, por ejemplo, por inyección intraarticular (en las articulaciones), intravenosa o intraperitoneal, y preferentemente por inyección intramuscular, intradérmica o subcutánea, incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes precintados monodosis o de múltiples dosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones de inyección y las suspensiones pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos. Las células transducidas por las moléculas de ARN también pueden administrarse por vía intravenosa o parenteral.
Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del ácido nucleico empaquetado suspendido en diluyentes, tales como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, sobrecitos o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido apropiado, y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimido pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, maicena, almidón de patata, tragacanto, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa de sodio, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, rellenos, aglutinantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, tintes, agentes disgregantes y vehículos farmacéuticamente compatibles. Las formas de gragea pueden comprender el ingrediente activo en un aroma, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sacarosa y emulsiones de goma arábiga, geles y similares que contienen, además del ingrediente activo, vehículos conocidos en la técnica.
Se reconoce que las moléculas polipeptídicas y de ARN, cuando se administran por vía oral, deben protegerse de la digestión. La protección de las moléculas polipeptídicas y de ARN típicamente puede conseguirse formando complejos de la molécula de ARN o la molécula polipeptídica con una composición para hacer que el ARN/polipéptido sea resistente a la hidrólisis ácida y enzimática, o empaquetando la molécula de ARN o la molécula polipeptídica en un vehículo apropiadamente resistente tal como un liposoma. Los medios de protección de ácidos nucleicos (tales como moléculas de ARN) y polipéptidos de la digestión son bien conocidos en la técnica.
Las composiciones inmunogénicas pueden encapsularse, por ejemplo, en liposomas o en una formulación que proporciona una liberación lenta del ingrediente activo. Por ejemplo, la molécula de ARN puede formularse como liposomas, después administrarse como una composición de sensibilización. Como alternativa, el ARN formulado en liposomas puede mezclarse con la molécula polipeptídica para producir la composición inmunogénica de ARN + polipéptido de la invención. Como alternativa, la molécula de ARN y la molécula polipeptídica pueden coencapsularse en liposomas.
Las composiciones descritas en el presente documento (composiciones inmunogénicas que comprenden un ARN y un polipéptido), en solitario o en combinación con otros componentes adecuados, pueden prepararse en formulaciones de aerosol (por ejemplo, pueden "nebulizarse") para administrarse mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol pueden ubicarse en gases inertes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
Las formulaciones de supositorio adecuadas pueden contener de ARN, el polipéptido o la combinación de polipéptido y ARN como se describe en el presente documento, y una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos de parafina. También es posible usar cápsulas rectales de gelatina rellenas de las moléculas de polipéptido y ARN como se describe en el presente documento, y una base adecuada, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles e hidrocarburos de parafina.
5. Procedimientos de generación o potenciación de las respuestas inmunitarias
En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento para inducir, generar o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, tal como un vertebrado, preferentemente un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición inmunogénica, que comprende: (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico y (ii) un segundo antígeno polipeptídico; en la que dicho primer y segundo antígenos polipeptídicos son de diferentes patógenos. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células.
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En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa en una sujeto (tal como un vertebrado, preferentemente un mamífero) que lo necesita, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición inmunogénica que comprende: (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico y (ii) un segundo antígeno polipeptídico; en la que dicho primer y segundo antígenos polipeptídicos son de diferentes patógenos.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento para vacunar a un sujeto, tal como un vertebrado, preferentemente un mamífero, o para inmunizar a un sujeto contra un patógeno (por ejemplo, un patógeno bacteriano, un patógeno vírico, un patógeno fúngico, un patógeno protozoico o un patógeno parasitario multicelular), que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la composición inmunogénica que comprende: (i) una molécula de aRn autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico y (ii) un segundo antígeno polipeptídico; en la que dicho primer y segundo antígenos polipeptídicos son de diferentes patógenos.
Los sujetos animales adecuados incluyen, por ejemplo, peces, aves, ganado bovino, cerdos, caballos, ciervos, ovejas, cabras, bisontes, conejos, gatos, perros, pollos, patos, pavos y similares. El mamífero es preferentemente un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o bebé), un adolescente o un adulto; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada para niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica controlar la infección patogénica después de la administración de las composiciones o vacunas divulgadas en el presente documento. Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunitarias, de forma sistémica (tal como controlando el nivel producción de IgG1 e IgG2a) y/o la mucosa (tal como controlando el nivel de producción de IgA), contra el antígeno. Típicamente, las respuestas de anticuerpo en suero específicas de antígenos se determinan después de la inmunización, pero antes de la exposición mientras que las respuestas de anticuerpos en la mucosa específicas de antígeno se determinan después de la inmunización y después de la exposición.
Otra manera de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones o vacunas divulgadas en el presente documento en las que la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, el ARN) codifica un antígeno proteico es expresar el antígeno proteico de forma recombinante para cribar sueros de pacientes o secreciones de la mucosa por inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha generado una respuesta inmunitaria contra la proteína en cuestión. Este procedimiento también puede usarse para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de los antígenos proteicos.
La eficacia de las composiciones también puede determinarse in vivo exponiendo modelos animales apropiados al patógeno de infección de interés.
Cuando la molécula de ARN y la molécula polipeptídica se coadministran, aún puede ser deseable empaquetar la molécula polipeptídica y la molécula de ARN por separado. Los dos componentes pueden combinarse, por ejemplo, en aproximadamente 72 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 10 minutos o aproximadamente 5 minutos antes de la administración. Por ejemplo, la molécula polipeptídica y la molécula de ARN pueden combinarse al lado de un paciente encamado.
La dosificación puede ser por un programa de una dosis o un programa de múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización principal y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o diferentes vías, por ejemplo, una sensibilización parenteral y un refuerzo en la mucosa, una sensibilización en la mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Las múltiples dosis típicamente se administrarán separadas en al menos 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). Las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento pueden usarse como la sensibilización y/o el refuerzo, independientemente de si la composición inmunogénica administrada es una sensibilización o refuerzo comprendida en una vacuna de un patógeno.
Las composiciones divulgadas en el presente documento que incluyen uno o más antígenos o se usan junto con uno o más antígenos pueden usarse para tratar tanto a niños como a adultos. Por tanto, un sujeto humano puede ser de menos de 1 años de edad, de 1-5 años de edad, de 5-15 años de edad, de 15-55 años de edad o de al menos 55 años de edad. Los sujetos preferidos para recibir las composiciones son los ancianos (por ejemplo, > 50 años de edad, > 60 años de edad y preferentemente > 65 años de edad), los jóvenes (por ejemplo < 5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, el servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, los enfermos crónicos o paciente inmunodeficientes. Las composiciones no son adecuadas únicamente para estos
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grupos, sin embargo, y pueden usarse de forma más general en una población.
Las vías preferidas de administración incluyen, aunque sin limitación, inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial e intraocular. También se contempla la administración oral y transdérmica, así como la administración por inhalación o supositorio. Las vías particularmente preferidas de administración incluyen inyección intramuscular, intradérmica o subcutánea, de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la composición se administra a un animal huésped usando un dispositivo de inyección sin aguja, que es bien conocido y está ampliamente disponible.
A veces es ventajoso emplear una vacuna dirigida a un tipo de célula diana particular (por ejemplo, una célula presentadora de antígenos o una célula de procesamiento de antígenos).
Pueden usarse catéteres o dispositivos similares para suministrar la composición de la invención, como polipéptido + ARN desnudo, polipéptido + ARN formulado con un sistema de suministro (por ejemplo, ARN encapsulado en liposomas), ARN únicamente o polipéptido únicamente en un órgano o tejido diana. Los catéteres adecuados se divulgan en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4.186.745; 5.397.307; 5.547.472; 5.674.192; y 6.129.705. las moléculas de ARN de la invención también pueden introducirse directamente en un tejido, tal como el músculo. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.580.859. También son adecuados otros procedimientos tales como transformación "biolística" o mediada por partículas (véase, por ejemplo, Sanford y col patente de Estados Unidos n.° 4.945.050; patente de Estados Unidos n.° 5.036.006) para la introducción de ARN en células de un mamífero. Estos procedimientos son útiles no solamente para la introducción in vivo de ARN en un mamífero, sino también para modificación ex vivo de las células para su reintroducción en un mamífero.
La presente invención incluye el uso de sistemas de suministro adecuados, tales como liposomas, micropartículas poliméricas o micropartículas de emulsión submicrométricas con ARN, o ARN + polipéptido encapsulado o adsorbido, para suministrar el ARN, o ARN + polipéptido para provocar una respuesta inmunitaria. La invención incluye liposomas, micropartículas, emulsiones submicrométricas o combinaciones de las mismas, con ARN, o ARN + polipéptido adsorbido y/o encapsulado.
Las composiciones divulgadas en el presente documento que incluyen uno o más antígenos, o se usan junto con uno o más antígenos, pueden administrarse a pacientes en sustancialmente el mismo momento que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario o centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo, en sustancialmente el mismo momento que una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubeola, una vacuna contra MMR, una vacuna contra la varicela, una vacuna contra MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tosferina, una vacuna contra DTP, una vacuna conjugada contra H. Influenzae de tipo b, una vacuna inactivada de poliovirus, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna de conjugado de meningococos (tal como una vacuna tetravalente A C W135 Y), una vacuna contra el virus respiratorio sincitial, etc.
6. Definiciones
El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere a +/-10 % de un valor.
Un "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (lineales, conformacionales o ambos).
Como se usa en el presente documento, un "antígeno polipeptídico" se refiere a un polipéptido que comprende uno o más epítopos (lineales, conformacionales o ambos), que provoca una respuesta inmunológica. Los antígenos polipeptídicos incluyen, por ejemplo, una proteína de origen natural, una variante mutacional de una proteína de origen natural (por ejemplo, una proteína que tiene una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos), una forma truncada de una proteína de origen natural (por ejemplo, un dominio intracelular o dominio extracelular de una proteína anclada a membrana), así como una proteína de fusión (una proteína que se obtiene de al menos dos proteínas o cadenas polipeptídicas diferentes de origen natural). Además, los antígenos polipeptídicos también abarcan polipéptidos que comprenden uno o más estereoisómeros, derivados o análogos de aminoácido. Por ejemplo, los derivados de aminoácido incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas de aminoácidos tales como alquilación, acilación, carbamilación, yodación, etc. Los análogos de aminoácido incluyen, por ejemplo, compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, tal como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Los antígenos polipeptídicos también abarcan polipéptidos que se modifican de forma postraduccional (tal como polipéptidos acetilados, fosforilados o glucosilados). Por lo tanto, un epítopo de un antígeno polipeptídico no está limitado a un péptido. Por ejemplo, un epítopo de un polipéptido glucosilado puede ser un grupo sacárido que está unido a la cadena polipeptídica.
La expresión "polipéptido de fusión" se refiere a un único polipéptido en que la secuencia de aminoácidos se obtiene de al menos dos proteínas o cadenas polipeptídicas diferentes de origen natural.
Un "epítopo" es una parte de un antígeno que se reconoce por el sistema inmunitario (por ejemplo, por un anticuerpo, un receptor de inmunoglobulina, un receptor de linfocito B o un receptor de linfocito T). Un epítopo puede ser lineal o conformacional. Habitualmente, un epítopo es un polipéptido o polisacárido en un antígeno de origen
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natural. En antígenos artificiales, puede ser una sustancia de bajo peso molecular tal como un derivado de ácido arsanílico. Normalmente, un epítopo de linfocito B incluirá al menos aproximadamente 5 aminoácidos, pero puede ser tan pequeño como 3-4 aminoácidos. Un epítopo de linfocito T, tal como un epítopo de CTL, típicamente incluirá al menos aproximadamente 7-9 aminoácidos y un epítopo de linfocito T auxiliar típicamente incluirá al menos aproximadamente 12-20 aminoácidos.
Cuando se inmuniza un individuo con un antígeno polipeptídico que tiene múltiples epítopos, en muchos casos la mayoría de los linfocitos T respondedores serán específicos para uno o unos pocos epítopos lineales de ese antígeno o una mayoría de los linfocitos B respondedores serán específicos para uno o unos pocos epítopos lineales o conformacionales de ese antígeno. Dichos epítopos típicamente se mencionan como "epítopos inmunodominantes". En un antígeno que tiene varios epítopos inmunodominantes, un único epítopo puede ser el más dominante, y típicamente se menciona como el epítopo inmunodominante "principal". Los epítopos inmunodominantes restantes típicamente se mencionan como epítopos inmunodominantes "secundarios".
Como se usan en el presente documento, las expresiones "proteína estructural menor' o "polipéptido estructural menor" o "proteína de la cápsida menor" o "polipéptido de la cápsida menor" o "VP1" en referencia a un parvovirus se refieren a un polipéptido que comprende una secuencia homóloga o idéntica al polipéptido codificado por ORF2 de un parvovirus, e incluye secuencias que presentan al menos aproximadamente un 80-100% de identidad de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, tal como un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de identidad de secuencia con la misma.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "proteína estructural principal" o "polipéptido estructural principal" o "proteína de la cápsida principal" o "polipéptido de la cápsida principal" o "VP2" en referencia a un parvovirus se refieren a un polipéptido que comprende una secuencia homóloga o idéntica al polipéptido codificado por ORF3 de un parvovirus, e incluye secuencias que presentan al menos aproximadamente un 80-100 % de identidad de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, tal como un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de identidad de secuencia con la misma.
El término "desnudo", como se usa en el presente documento, se refiere a ácidos nucleicos que están sustancialmente libres de otras macromoléculas, tales como lípidos, polímeros y proteínas. Un ácido nucleico "desnudo", tal como un ARN autorreplicante, no se formula con otras macromoléculas para mejorar la captación celular. Por consiguiente, un ácido nucleico desnudo no está encapsulado en, absorbido sobre o unido a un liposoma, una micropartícula o nanopartícula, una emulsión catiónica y similares.
Como se usa en el presente documento, "análogo nucleotídico" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una o más modificaciones químicas (por ejemplo, sustituciones) en o sobre la base nitrogenada del nucleósido (por ejemplo, citosina (C), (timina (T) o uracilo (U)), adenina (A) o guanina (G)). Un análogo nucleotídico puede contener modificaciones químicas adicionales en o sobre el resto de azúcar el nucleósido (por ejemplo, ribosa, desoxirribosa, ribosa modificada, desoxirribosa modificada, análogo de azúcar de seis miembros o análogo de azúcar de cadena abierta), o el fosfato.
Como se usa en el presente documento, el término "parvovirus" se refiere a todos los parvovirus asociados con especies de mamífero (por ejemplo, seres humanos, caninos, pollos, felinos, murinos, porcinos, mapaches, visones, rata kilham, lapina) y ampliamente a todos los géneros de la familia Parvoviridae (es decir, Parvovirus (por ejemplo, parvovirus canino), Dependovirus (por ejemplo, virus adenoasociado), Erythrovirus (por ejemplo, parvovirus B19) y Bocavirus). El término parvovirus también incluye aislados no caracterizados en el momento de la presentación,
Como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno de parvovirus" se refiere a una molécula derivada de un parvovirus incluyendo, sin limitación, cualquiera de los diversos aislados de parvovirus. La molécula no tiene que obtenerse físicamente del aislado particular en cuestión, sino que puede producirse de forma sintética o recombinante.
El término "patógeno" se refiere a un virus, eucariota, procariota o arqueobacteria que tiene capacidad de proliferación y causa una enfermedad o dolencia en un organismo huésped, tal como un vertebrada (por ejemplo, un mamífero). Un patógeno puede ser una especie de virus, bacteria, protozoo u hongo, así como una especie parasitaria multicelular.
Los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento", como se usan en el presente documento, incluyen el alivio, disminución o mejora de los síntomas de la enfermedad o afección, la prevención de síntomas adicionales, la mejora o prevención de las causas metabólicas subyacentes de los síntomas, la inhibición de la enfermedad o afección, por ejemplo, detención del desarrollo de la enfermedad o afección, alivio de la enfermedad o afección, provocación de la regresión de la enfermedad o afección, alivio de una afección causada por la enfermedad o afección, o detención de los síntomas de la enfermedad o afección. Los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" incluyen, aunque sin limitación, tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.
La expresión "partícula de replicón de virus" o "VRP" se refiere a viriones infecciosos recombinantes que no pueden generar descendencia infecciosa a causa de la eliminación de uno o más genes estructurales.
La expresión "partícula de tipo virus" o "VLP" se refiere a una estructura formada por proteínas de la cubierta del virus (por ejemplo, una cápsida) y opcionalmente una envuelta, pero que no tiene material genético. Una VLP se parece a una partícula vírica.
Ejemplificación
5 La invención que se está describiendo en líneas generales, se entenderá más fácilmente por referencia al siguiente ejemplo, que se incluye simplemente con fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no está destinado a limitar la invención.
Ejemplo 1:
Ratones BALB/c, 60 animales en total se dividieron en 6 grupos (10 animales por grupo). Diez ratones BALB/c, por 10 grupo, se exanguinaron antes de la inmunización para recoger sueros preinmunes. A los ratones se les administraron vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) en los días o, 21 y 42 con la formulación indicada en la tabla 1. El LNP (RV01(15) tenía la siguiente composición: 40 % de DlinDMA, 10 % de DSPC, 48 % de Chol, 2 % de PEG DMG 2000 y una relación de N:P de 8:1. Se recogió el suero para análisis inmunológico en los días 21 (3wp1), 42 (3wp2) y 63 (3wp3)
15 ________________________________Tabla 1: Grupos de vacunación________________________________
N.° de grupo
Antígeno de parvovirus Antígeno de CMV Adyuvante
1
VLP de VP1/VP2 mutante, 5 pg Ninguno Ninguno
2
VLP de VP1/VP2 mutante, 5 pg Ninguno MF59
3
Ninguno VRP de gH de longitud completa/gL, 1x106 UI Ninguno
4
Ninguno ARN de gH de longitud completa/gL, 1 pg LNP (RV01 (15))
5
VLP de VP1/VP2 mutante, 5 pg VRP de gH de longitud completa/gL, 1x106 UI Ninguno
6
VLP de VP1/VP2 mutante, 5 pg ARN de gH de longitud completa/gL, 1 pg LNP (RV01 (15))
Tres semanas después de la inmunización, los ratones se exanguinaron de nuevo y se recogieron los sueros para el ensayo. El siguiente día, los ratones recibieron una segunda inmunización con la misma vacuna administrada previamente a ellos. Tres semanas después de la segunda inmunización, los ratones se exanguinaron y se 20 recogieron los sueros para el ensayo. Se administró una tercera inmunización a los ratones el siguiente día. Tres semanas después de la tercera inmunización, los ratones se exanguinaron y se recogieron los sueros para el ensayo.
Se midió una respuesta especifica de parvovirus por ELISA para los títulos de IgG en suero. Se usó VP1/VP2 de parvovirus B19 de tipo silvestre para recubrir las placas de microvaloración. Los sueros recogidos de las 25 extracciones de sangre (preinmune, 3 semanas después de la 1.a inmunización y 3 semanas después de la 2.a inmunización) se combinaron para cada grupo de vacuna (n = 10) y se midieron para el título de IgG.
Tabla 2. Títulos de neutralización en suero de CMV de ratones BALB/c, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0, 21 y 42. El suero se recogió para el análisis en los días 42 (3wp2) y 63 (3wp3) y se incubaron con virus TB40 en células ARPE-19 sin complemento. El título de neutralización se define 30 como el recíproco de la dilución en suero que produce una reducción de un 50 % en la cantidad de focos de virus
positivos por pocillo, respecto a los controles.
Grupo de vacunación
3wp2 3wp3
VLP de parvovirus, 5 mg
<100 <100
VLP de parvovirus, 5 mg / MF59
<100 <100
VRP de CMV, 1E6
7943 14 430
ARN de CMV, 1 mg / RV01 (35)
5497 18 328
VLP de parvovirus + VRP de CMV
12 800 17 911
VLP de parvovirus + ARN de CMV / RV01
4569 22 688
Se observaron títulos mayores de IgG contra parvovirus en sueros de ratones que recibieron una vacuna en la que se añadió el antígeno de CMV (VRP de CMV o ARN de CMV) a la vacuna de VLP de parvovirus. Tres semanas 35 después de la primera inmunización, el título de IgG aumentó 6 veces (40 frente a 250) para la vacuna de VRP de parvovirus + cMv, en comparación con la vacuna de parvovirus en solitario. La diferencia fue incluso mayor (aumento de 50 veces (40 frente a 2000) tres semanas después de la primera inmunización, cuando el título de IgG de la vacuna de ARN de parvovirus + CMV se comparó con la vacuna de parvovirus en solitario.
Tres semanas después de la segunda inmunización, el título de IgG aumentó 2 veces (4000 frente a 9200) para la 40 vacuna de VRP de parvovirus + CMV, en comparación con la vacuna de parvovirus en solitario. Como se observa con la primera observación, la diferencia fue incluso mayor (aumento de 35 veces (4000 frente a 138 600)) tres semanas después de la segunda inmunización, cuando el título de IgG de la vacuna de ARN de parvovirus + CMV se comparó con la vacuna de parvovirus en solitario.
Tabla 3. Títulos de IgG en suero específicos de parvovirus de ratones BALB/c, 10 animales por grupo, 21 (3wp1), 42 (3wp2) y 63 (3wp3) días después de vacunación intramuscular en los días 0, 31 y 42. Los datos se representan como títulos combinados de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de < 25 (limite _____________________________de detección), se le asignó un título de 25.____________________________
Muestra de suero
Grupo de vacuna 3wp1 3wp2 3wk3
Preinmune
<25
1
VLP de parvovirus, 5 mg 41 3972 404
2
VLP de parvovirus, 5 mg / MF59 7868 365 181 53 603
3
VRP de CMV, 1E6 <25 <25 <25
4
ARN de CMV, 1 mg / RV01 (35) <25 <25 <25
5
VLP de parvovirus + VRP de CMV 246 9202 1505
6
VLP de parvovirus + ARN de CMV / RV01 (35) 2000 138 585 16 649
5
Los sueros combinados se ensayaron para una respuesta especifica de CMV midiendo los títulos de anticuerpo neutralizante en suero. No se observó cambio principal en los títulos de neutralización de CMV cuando se añadía VLP de parvovirus a vacunas de VRP de CMV o ARN de CMV.
Los títulos más altos se observaron con VLP de parvovirus y adyuvante MF59. Sin embargo, el título de la 10 composición de VLP de parvovirus/MF59 fue solamente ~3 veces mayor que el título observado cuando se combinaba VLP de parvovirus con ARN de CMV.
Tabla 4. Títulos de neutralización en suero de parvovirus de ratones BALB/c, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0, 21 y 42. Se recogió el suero, se combinó para el análisis en los días 42 (3wp2) y 63 (3wp3) y se ensayó usando un ensayo de neutralización de qRT-PCR basado en células progenitoras 15 eritroides.
% de títulos de neutralización
Dilución 1:500 1:2500 1:12500 1:62500 1:312500
3wp2
VLP de parvovirus/MF59 85,96 75,57 44,66 28,03 -46,09
3wp2
VLP de parvovirus + ARN de CMV /RV01 (35) 26,90 4,10 8,27 15,78 -14,01
3wp3
VLP de parvovirus 56,86 40,23 24,44 3,29 -5,88
3wp3
VLP de parvovirus/MF59 94,06 87,94 70,02 37,37 -19,09
3wp3
VLP de parvovirus + VRP de CMV 73,38 44,18 19,69 9,57 15,38
3wp3
VLP de parvovirus + ARN de CMV /RV01 (35) 83,93 73,10 40,08 32,36 25,06
5wp3
VLP de parvovirus 5 ug 89,74 80,49 58,67 57,08 25,13
PI -229,18 -191,24 -94,47 -112,55 -197,63
Secuencias
gB FL de CMV: (SEQ ID NO: 1)
atggaaagccggatctggtgcctggtcgtgtgcgtgaacctgtgcatcgtgtgcctgggagc
cgccgtgagcagcagcagcaccagaggcaccagcgccacacacagccaccacagcagccaca
ccacctctgccgcccacagcagatccggcagcgtgtcccagagagtgaccagcagccagacc
gtgtcccacggcgtgaacgagacaatctacaacaccaccctgaagtacggcgacgtcgtggg
cgtgaataccaccaagtacccctacagagtgtgcagcatggcccagggcaccgacctgatca
gattcgagcggaacatcgtgtgcaccagcatgaagcccatcaacgaggacctggacgagggc
atcatggtggtgtacaagagaaacatcgtggcccacaccttcaaagtgcgggtgtaccagaa
ggtgctgaccttccggcggagctacgcctacatccacaccacatacctgctgggcagcaaca
ccgagtacgtggcccctcccatgtgggagatccaccacatcaacagccacagccagtgctac
agcagctacagccgcgtgatcgccggcacagtgttcgtggcctaccaccgggacagctacga
gaacaagaccatgcagctgatgcccgacgactacagcaacacccacagcaccagatacgtga
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caccggcgacgtggtggacatcagccccttctacaacggcaccaaccggaacgccagctact
tcggcgagaacgccgacaagttcttcatcttccccaactacaccatcgtgtccgacttcggc
agacccaacagcgctctggaaacccacagactggtggcctttctggaacgggccgacagcgt
gatcagctgggacatccaggacgagaagaacgtgacctgccagctgaccttctgggaggcct
ctgagagaaccatcagaagcgaggccgaggacagctaccacttcagcagcgccaagatgacc
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tgcacaacctggtgtacgcacagctgcagttcacctacgacaccctgcggggctacatcaac
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catctccaccgtggacagcatgatcgccctggacatcgaccccctggaaaacaccgacttcc
gggtgctggaactgtacagccagaaagagctgcggagcagcaacgtgttcgacctggaagag
atcatgcgggagttcaacagctacaagcagcgcgtgaaatacgtggaggacaaggtggtgga
ccccctgcctccttacctgaagggcctggacgacctgatgagcggactgggcgctgccggaa
aagccgtgggagtggccattggagctgtgggcggagctgtggcctctgtcgtggaaggcgtc
gccacctttctgaagaaccccttcggcgccttcaccatcatcctggtggccattgccgtcgt
gatcatcacctacctgatctacacccggcagcggagactgtgtacccagcccctgcagaacc
tgttcccctacctggtgtccgccgatggcaccacagtgaccagcggctccaccaaggatacc
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ccctcccagctctgatgccagcacagccgcccctccctacaccaacgagcaggcctaccaga
tgctgctggccctggctagactggatgccgagcagagggcccagcagaacggcaccgacagc
ctggatggcagaaccggcacccaggacaagggccagaagcccaacctgctggaccggctgcg
gcaccggaagaacggctaccggcacctgaaggacagcgacgaggaagagaacgtctgataa
- 2727
gB FL de CMV (SEQ ID NO: 2)
MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQT
VSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEG
IMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCY
SSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNL
NCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFG
RPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMT
ATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGI
KQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYIN
RALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTS
VKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFI
AGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEE
IMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGLDDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGV
ATFLKNPFGAFTIILVAIAVVIITYLIYTRQRRLCTQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGSTKDT
SLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALARLDAEQRAQQNGTDS
LDGRTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV--
gB sol 750 de CMV: (SEQ ID NO: 3)
atggaaagccggatctggtgcctggtcgtgtgcgtgaacctgtgcatcgtgtgcctgggagc cgccgtgagcagcagcagcaccagaggcaccagcgccacacacagccaccacagcagccaca ccacctctgccgcccacagcagatccggcagcgtgtcccagagagtgaccagcagccagacc gtgtcccacggcgtgaacgagacaatctacaacaccaccctgaagtacggcgacgtcgtggg cgtgaataccaccaagtacccctacagagtgtgcagcatggcccagggcaccgacctgatca gattcgagcggaacatcgtgtgcaccagcatgaagcccatcaacgaggacctggacgagggc atcatggtggtgtacaagagaaacatcgtggcccacaccttcaaagtgcgggtgtaccagaa ggtgctgaccttccggcggagctacgcctacatccacaccacatacctgctgggcagcaaca ccgagtacgtggcccctcccatgtgggagatccaccacatcaacagccacagccagtgctac agcagctacagccgcgtgatcgccggcacagtgttcgtggcctaccaccgggacagctacga gaacaagaccatgcagctgatgcccgacgactacagcaacacccacagcaccagatacgtga ccgtgaaggaccagtggcacagcagaggcagcacctggctgtaccgggagacatgcaacctg aactgcatggtcaccatcaccaccgccagaagcaagtacccttaccacttcttcgccacctc caccggcgacgtggtggacatcagccccttctacaacggcaccaaccggaacgccagctact tcggcgagaacgccgacaagttcttcatcttccccaactacaccatcgtgtccgacttcggc agacccaacagcgctctggaaacccacagactggtggcctttctggaacgggccgacagcgt gatcagctgggacatccaggacgagaagaacgtgacctgccagctgaccttctgggaggcct ctgagagaaccatcagaagcgaggccgaggacagctaccacttcagcagcgccaagatgacc gccaccttcctgagcaagaaacaggaagtgaacatgagcgactccgccctggactgcgtgag ggacgaggccatcaacaagctgcagcagatcttcaacaccagctacaaccagacctacgaga agtatggcaatgtgtccgtgttcgagacaacaggcggcctggtggtgttctggcagggcatc aagcagaaaagcctggtggagctggaacggctcgccaaccggtccagcctgaacctgaccca caaccggaccaagcggagcaccgacggcaacaacgcaacccacctgtccaacatggaaagcg tgcacaacctggtgtacgcacagctgcagttcacctacgacaccctgcggggctacatcaac agagccctggcccagatcgccgaggcttggtgcgtggaccagcggcggaccctggaagtgtt caaagagctgtccaagatcaaccccagcgccatcctgagcgccatctacaacaagcctatcg ccgccagattcatgggcgacgtgctgggcctggccagctgcgtgaccatcaaccagaccagc gtgaaggtgctgcgggacatgaacgtgaaagagagcccaggccgctgctactccagacccgt ggtcatcttcaacttcgccaacagctcctacgtgcagtacggccagctgggcgaggacaacg agatcctgctggggaaccaccggaccgaggaatgccagctgcccagcctgaagatctttatc gccggcaacagcgcctacgagtatgtggactacctgttcaagcggatgatcgacctgagcag catctccaccgtggacagcatgatcgccctggacatcgaccccctggaaaacaccgacttcc gggtgctggaactgtacagccagaaagagctgcggagcagcaacgtgttcgacctggaagag atcatgcgggagttcaacagctacaagcagcgcgtgaaatacgtggaggacaaggtggtgga ccccctgcctccttacctgaagggcctggacgacctgatgagcggactgggcgctgccggaa aagccgtgggagtggccattggagctgtgggcggagctgtggcctctgtcgtggaaggcgtc gccacctttctgaagaactgataa - 2256
gB sol 750 de CMV (SEQ ID NO: 4)
MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQT VSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEG IMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCY SSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNL NCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDWDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFG RPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMT ATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGI KQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYIN RALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTS VKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFI AGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEE
IMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGLDDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGV
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atggaaagccggatctggtgcctggtcgtgtgcgtgaacctgtgcatcgtgtgcctgggagc cgccgtgagcagcagcagcaccagaggcaccagcgccacacacagccaccacagcagccaca ccacctctgccgcccacagcagatccggcagcgtgtcccagagagtgaccagcagccagacc gtgtcccacggcgtgaacgagacaatctacaacaccaccctgaagtacggcgacgtcgtggg cgtgaataccaccaagtacccctacagagtgtgcagcatggcccagggcaccgacctgatca gattcgagcggaacatcgtgtgcaccagcatgaagcccatcaacgaggacctggacgagggc atcatggtggtgtacaagagaaacatcgtggcccacaccttcaaagtgcgggtgtaccagaa ggtgctgaccttccggcggagctacgcctacatccacaccacatacctgctgggcagcaaca ccgagtacgtggcccctcccatgtgggagatccaccacatcaacagccacagccagtgctac agcagctacagccgcgtgatcgccggcacagtgttcgtggcctaccaccgggacagctacga gaacaagaccatgcagctgatgcccgacgactacagcaacacccacagcaccagatacgtga ccgtgaaggaccagtggcacagcagaggcagcacctggctgtaccgggagacatgcaacctg aactgcatggtcaccatcaccaccgccagaagcaagtacccttaccacttcttcgccacctc caccggcgacgtggtggacatcagccccttctacaacggcaccaaccggaacgccagctact tcggcgagaacgccgacaagttcttcatcttccccaactacaccatcgtgtccgacttcggc agacccaacagcgctctggaaacccacagactggtggcctttctggaacgggccgacagcgt gatcagctgggacatccaggacgagaagaacgtgacctgccagctgaccttctgggaggcct ctgagagaaccatcagaagcgaggccgaggacagctaccacttcagcagcgccaagatgacc gccaccttcctgagcaagaaacaggaagtgaacatgagcgactccgccctggactgcgtgag ggacgaggccatcaacaagctgcagcagatcttcaacaccagctacaaccagacctacgaga agtatggcaatgtgtccgtgttcgagacaacaggcggcctggtggtgttctggcagggcatc aagcagaaaagcctggtggagctggaacggctcgccaaccggtccagcctgaacctgaccca caaccggaccaagcggagcaccgacggcaacaacgcaacccacctgtccaacatggaaagcg tgcacaacctggtgtacgcacagctgcagttcacctacgacaccctgcggggctacatcaac agagccctggcccagatcgccgaggcttggtgcgtggaccagcggcggaccctggaagtgtt caaagagctgtccaagatcaaccccagcgccatcctgagcgccatctacaacaagcctatcg ccgccagattcatgggcgacgtgctgggcctggccagctgcgtgaccatcaaccagaccagc gtgaaggtgctgcgggacatgaacgtgaaagagagcccaggccgctgctactccagacccgt ggtcatcttcaacttcgccaacagctcctacgtgcagtacggccagctgggcgaggacaacg agatcctgctggggaaccaccggaccgaggaatgccagctgcccagcctgaagatctttatc gccggcaacagcgcctacgagtatgtggactacctgttcaagcggatgatcgacctgagcag catctccaccgtggacagcatgatcgccctggacatcgaccccctggaaaacaccgacttcc gggtgctggaactgtacagccagaaagagctgcggagcagcaacgtgttcgacctggaagag atcatgcgggagttcaacagctacaagcagtgataa - 2082
gB sol 692 de CMV: (SEQ ID NO: 6)
MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQT VSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEG IMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCY SSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNL NCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFG RPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMT ATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGI KQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYIN RALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTS VKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFI AGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEE IMREFNSYKQ--
gH FL de CMV: (SEQ ID NO: 7)
atgaggcctggcctgccctcctacctgatcatcctggccgtgtgcctgttcagccacctgct gtccagcagatacggcgccgaggccgtgagcgagcccctggacaaggctttccacctgctgc tgaacacctacggcagacccatccggtttctgcgggagaacaccacccagtgcacctacaac agcagcctgcggaacagcaccgtcgtgagagagaacgccatcagcttcaactttttccagag ctacaaccagtactacgtgttccacatgcccagatgcctgtttgccggccctctggccgagc agttcctgaaccaggtggacctgaccgagacactggaaagataccagcagcggctgaatacc tacgccctggtgtccaaggacctggccagctaccggtcctttagccagcagctcaaggctca ggatagcctcggcgagcagcctaccaccgtgccccctcccatcgacctgagcatcccccacg tgtggatgcctccccagaccacccctcacggctggaccgagagccacaccacctccggcctg cacagaccccacttcaaccagacctgcatcctgttcgacggccacgacctgctgtttagcac cgtgaccccctgcctgcaccagggcttctacctgatcgacgagctgagatacgtgaagatca ccctgaccgaggatttcttcgtggtcaccgtgtccatcgacgacgacacccccatgctgctg atcttcggccacctgcccagagtgctgttcaaggccccctaccagcgggacaacttcatcct gcggcagaccgagaagcacgagctgctggtgctggtcaagaaggaccagctgaaccggcact cctacctgaaggaccccgacttcctggacgccgccctggacttcaactacctggacctgagc gccctgctgagaaacagcttccacagatacgccgtggacgtgctgaagtccggacggtgcca gatgctcgatcggcggaccgtggagatggccttcgcctatgccctcgccctgttcgccgctg ccagacaggaagaggctggcgcccaggtgtcagtgcccagagccctggatagacaggccgcc ctgctgcagatccaggaattcatgatcacctgcctgagccagaccccccctagaaccaccct gctgctgtaccccacagccgtggatctggccaagagggccctgtggacccccaaccagatca ccgacatcacaagcctcgtgcggctcgtgtacatcctgagcaagcagaaccagcagcacctg atcccccagtgggccctgagacagatcgccgacttcgccctgaagctgcacaagacccatct ggccagctttctgagcgccttcgccaggcaggaactgtacctgatgggcagcctggtccaca gcatgctggtgcataccaccgagcggcgggagatcttcatcgtggagacaggcctgtgtagc ctggccgagctgtcccactttacccagctgctggcccaccctcaccacgagtacctgagcga cctgtacaccccctgcagcagcagcggcagacgggaccacagcctggaacggctgaccagac tgttccccgatgccaccgtgcctgctacagtgcctgccgccctgtccatcctgtccaccatg cagcccagcaccctggaaaccttccccgacctgttctgcctgcccctgggcgagagctttag cgccctgaccgtgtccgagcacgtgtcctacatcgtgaccaatcagtacctgatcaagggca tcagctaccccgtgtccaccacagtcgtgggccagagcctgatcatcacccagaccgacagc cagaccaagtgcgagctgacccggaacatgcacaccacacacagcatcaccgtggccctgaa catcagcctggaaaactgcgctttctgtcagtctgccctgctggaatacgacgatacccagg gcgtgatcaacatcatgtacatgcacgacagcgacgacgtgctgttcgccctggacccctac aacgaggtggtggtgtccagcccccggacccactacctgatgctgctgaagaacggcaccgt gctggaagtgaccgacgtggtggtggacgccaccgacagcagactgctgatgatgagcgtgt acgccctgagcgccatcatcggcatctacctgctgtaccggatgctgaaaacctgctgataa - 2232
gH FL de CMV: (SEQ ID NO: 8)
MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYN SSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNT YALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGL HRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLL IFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLS ALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAA LLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHL IPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCS LAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTM QPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDS QTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPY NEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC--
atgaggcctggcctgccctcctacctgatcatcctggccgtgtgcctgttcagccacctgct
gtccagcagatacggcgccgaggccgtgagcgagcccctggacaaggctttccacctgctgc
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gH sol de CMV: (SEQ ID NO: 10)
MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYN SSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNT YALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGL HRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLL IFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLS ALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAA LLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHL IPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCS LAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTM QPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDS QTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPY NEVWSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDWVDATD - -
atgtgcagaaggcccgactgcggcttcagcttcagccctggacccgtgatcctgctgtggtg
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gactgagctacggccggtccatcttcacagagcacgtgctgggcttcgagctggtgcccccc agcctgttcaacgtggtggtggccatccggaacgaggccaccagaaccaacagagccgtgcg gctgcctgtgtctacagccgctgcacctgagggcatcacaotgttctacggcctgtacaacg ccgtgaaagagttctgcctccggcaccagctggatccccccctgctgagacacctggacaag tactacgccggcctgcccccagagctgaagcagaccagagtgaacctgcccgcccacagcag atatggccctcaggccgtggacgccagatgataa - 840
gL FL de CMV: (SEQ ID NO: 12)
MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEG DKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLT LLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPP SLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDK YYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR- -
5 gM FL de CMV: (SEQ ID NO: 13)
1-
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qM FL de CMV: (SEQ ID NO: 14)
MAPSHVDKVNTRTWSASIVFMVLTFVNVSVHLVLSNFPHLGYPCVYYHVVDFERLNMSAYNV MHLHTPMLFLDSVQLVCYAVFMQLVFLAVTIYYLVCWIKISMRKDKGMSLNQSTRDISYMGD SLTAFLFILSMDTFQLFTLTMSFRLPSMIAFMAAVHFFCLTIFNVSMVTQYRSYKRSLFFFS RLHPKLKGTVQFRTLIVNLVEVALGFNTTVVAMALCYGFGNNFFVRTGHMVLAVFVVYAIIS IIYFLLIEAVFFQYVKVQFGYHLGAFFGLCGLIYPIVQYDTFLSNEYRTGISWSFGMLFFIW AMFTTCRAVRYFRGRGSGSVKYQALATASGEEVAALSHHDSLESRRLREEEDDDDEDFEDA-
atggaatggaacaccctggtcctgggcctgctggtgctgtctgtcgtggccagcagcaacaa cacatccacagccagcacccctagacctagcagcagcacccacgccagcactaccgtgaagg ctaccaccgtggccaccacaagcaccaccactgctaccagcaccagctccaccacctctgcc aagcctggctctaccacacacgaccccaacgtgatgaggccccacgcccacaacgacttcta caacgctcactgcaccagccacatgtacgagctgtccctgagcagctttgccgcctggtgga ccatgctgaacgccctgatcctgatgggcgccttctgcatcgtgctgcggcactgctgcttc cagaacttcaccgccaccaccaccaagggctactgataa - 411
gN FL de CMV: (SEQ ID NO: 16)
MEWNTLVLGLLVLSVVASSNNTSTASTPRPSSSTHASTTVKATTVATTSTTTATSTSSTTSA KPGSTTHDPNVMRPHAHNDFYNAHCTSHMYELSLSSFAAWWTMLNALILMGAFCIVLRHCCF QNFTATTTKGY--
gO FL de CMV: (SEQ ID NO: 17)
1-
atgggcaagaaagaaatgatcatggtcaagggcatccccaagatcatgctgctgattagcat cacctttctgctgctgtccctgatcaactgcaacgtgctggtcaacagccggggcaccagaa gatcctggccctacaccgtgctgtcctaccggggcaaagagatcctgaagaagcagaaagag gacatcctgaagcggctgatgagcaccagcagcgacggctaccggttcctgatgtaccccag ccagcagaaattccacgccatcgtgatcagcatggacaagttcccccaggactacatcctgg ccggacccatccggaacgacagcatcacccacatgtggttcgacttctacagcacccagctg cggaagcccgccaaatacgtgtacagcgagtacaaccacaccgcccacaagatcaccctgag gcctcccccttgtggcaccgtgcccagcatgaactgcctgagcgagatgctgaacgtgtcca agcggaacgacaccggcgagaagggctgcggcaacttcaccaccttcaaccccatgttcttc aacgtgccccggtggaacaccaagctgtacatcggcagcaacaaagtgaacgtggacagcca gaccatctactttctgggcctgaccgccctgctgctgagatacgcccagcggaactgcaccc ggtccttctacctggtcaacgccatgagccggaacctgttccgggtgcccaagtacatcaac ggcaccaagctgaagaacaccatgcggaagctgaagcggaagcaggccctggtcaaagagca gccccagaagaagaacaagaagtcccagagcaccaccaccccctacctgagctacaccacct ccaccgccttcaacgtgaccaccaacgtgacctacagcgccacagccgccgtgaccagagtg gccacaagcaccaccggctaccggcccgacagcaactttatgaagtccatcatggccaccca gctgagagatctggccacctgggtgtacaccaccctgcggtacagaaacgagcccttctgca agcccgaccggaacagaaccgccgtgagcgagttcatgaagaatacccacgtgctgatcaga aacgagacaccctacaccatctacggcaccctggacatgagcagcctgtactacaacgagac aatgagcgtggagaacgagacagccagcgacaacaacgaaaccacccccacctcccccagca cccggttccagcggaccttcatcgaccccctgtgggactacctggacagcctgctgttcctg gacaagatccggaacttcagcctgcagctgcccgcctacggcaatctgaccccccctgagca cagaagggccgccaacctgagcaccctgaacagcctgtggtggtggagccagtgataa - 5 1422
gO FL de CMV: (SEQ ID NO: 18)
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UL128 FL de CMV: (SEQ ID NO: 20)
MSPKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGE
VCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGA
AGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ--
UL130 FL de CMV: (SEQ ID NO: 21)
5
1-
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UL130 FL de CMV: (SEQ ID NO: 22)
MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYP SPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQR MPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDY SVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV--
UL131 FL de CMV: (SEQ ID NO: 23)
1-
atgcggctgtgcagagtgtggctgtccgtgtgcctgtgtgccgtggtgctgggccagtgcca gagagagacagccgagaagaacgactactaccgggtgccccactactgggatgcctgcagca gagccctgcccgaccagacccggtacaaatacgtggagcagctcgtggacctgaccctgaac taccactacgacgccagccacggcctggacaacttcgacgtgctgaagcggatcaacgtgac cgaggtgtccctgctgatcagcgacttccggcggcagaacagaagaggcggcaccaacaagc ggaccaccttcaacgccgctggctctctggcccctcacgccagatccctggaattcagcgtg cggctgttcgccaactgataa - 393
10 UL131 FL de CMV: (SEQ ID NO: 24)
MRLCRVWLSVCLCAVVLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLN YHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSV RLFAN--
ParvoB19.Opti.VP1 (SEQ ID NO: 25)
acgcgtacaaaacaaaATGTCTAAGAAATCTGGTAAATGGTGGGAATCTGATGATAAATTTGCTAAGGC TGTTTACCAACAATTTGTTGAATTTTACGAAAAGGTTACTGGTACTGATTTGGAATTGATTCAAATTTTGAAGGA TCATTACAACATTTCTTTGGATAATCCATTGGAAAATCCATCTTCATTGTTTGATTTGGTTGCTAGAATTAAGAA CAACTTGAAGAACTCTCCAGATTTGTATTCTCATCATTTCCAATCTCATGGTCAATTGTCTGATCATCCACATGC TTTATCTTCATCTTCATCTCATGCTGAACCAAGAGGTGAAAATGCTGTTTTATCTTCTGAAGATTTGCATAAACC AGGTCAAGTTTCTGTTCAATTGCCAGGTACTAATTACGTTGGTCCAGGTAATGAATTGCAAGCTGGTCCACCACA ATCTGCTGTTGATTCTGCTGCTAGAATTCATGATTTCAGATACTCTCAATTGGCTAAGTTGGGTATTAATCCATA TACTCATTGGACTGTTGCTGATGAAGAATTGTTGAAGAACATTAAGAATGAAACTGGTTTTCAAGCTCAAGTTGT TAAAGATTACTTCACTTTGAAAGGTGCTGCTGCTCCAGTTGCTCATTTTCAAGGTTCTTTGCCAGAAGTTCCAGC TTATAACGCTTCTGAAAAATATCCATCTATGACATCTGTTAATTCTGCTGAAGCATCTACTGGTGCAGGTGGAGG TGGTTCTAATTCTGTTAAATCTATGTGGTCTGAAGGTGCTACTTTTTCTGCTAATTCAGTTACTTGTACTTTCTC TAGACAATTCTTGATTCCATATGATCCAGAACATCATTACAAAGTTTTTTCACCAGCTGCTTCATCTTGTCATAA TGCTTCAGGTAAAGAAGCTAAGGTTTGTACTATTTCTCCAATTATGGGTTATTCTACTCCTTGGAGATACTTGGA TTTTAATGCTTTGAACTTGTTTTTTTCTCCATTGGAATTTCAACATTTGATTGAAAACTACGGTTCTATTGCTCC AGATGCTTTGACTGTTACTATTTCTGAAATTGCTGTTAAGGATGTTACTGATAAAACAGGTGGTGGTGTTCAAGT TACTGATTCTACTACTGGTAGATTGTGCATGTTGGTTGATCATGAATACAAATACCCATACGTTTTGGGTCAAGG TCAAGATACTTTGGCTCCAGAATTGCCAATTTGGGTTTATTTTCCACCACAATACGCTTATTTGACTGTTGGTGA TGTTAATACTCAAGGTATTTCTGGTGATTCTAAAAAGTTGGCTTCTGAAGAATCTGCTTTTTACGTTTTGGAACA TTCTTCTTTTCAATTGTTGGGTACTGGTGGTACTGCTTCTATGTCTTACAAATTTCCACCAGTTCCACCTGAAAA TTTGGAAGGTTGTTCTCAACATTTTTACGAAATGTACAATCCATTGTATGGTTCTAGATTGGGTGTTCCAGATAC TTTGGGTGGTGATCCAAAATTTAGATCTTTGACTCATGAAGATCATGCTATTCAACCACAAAATTTCATGCCAGG TCCATTGGTTAATTCTGTTTCTACTAAAGAAGGTGATTCTTCTAATACAGGTGCTGGTAAAGCATTGACTGGTTT GTCTACTGGTACTTCTCAAAACACTAGAATTTCTTTAAGACCAGGTCCAGTTTCACAACCATATCATCATTGGGA TACTGATAAGTACGTTACTGGTATTAATGCTATTTCACATGGTCAAACTACTTATGGTAATGCTGAAGATAAAGA ATATCAACAAGGTGTTGGTAGATTTCCAAACGAAAAAGAACAATTGAAACAATTGCAAGGTTTGAATATGCATAC TTACTTTCCAAACAAAGGTACTCAACAATACACTGATCAAATTGAAAGACCATTGATGGTTGGTTCTGTTTGGAA TAGAAGAGCTTTGCATTATGAATCTCAATTGTGGTCTAAGATTCCAAATTTAGATGATTCTTTCAAGACTCAATT TGCTGCTTTGGGTGGTTGGGGTTTGCATCAACCTCCACCACAAATTTTCTTGAAGATTTTGCCACAATCTGGTCC AATTGGTGGTATTAAATCTATGGGTATTACTACTTTGGTTCAATATGCTGTTGGTATTATGACTGTTACAATGAC TTTTAAGTTGGGTCCAAGAAAAGCTACAGGTAGATGGAATCCACAACCAGGTGTTTATCCACCACATGCTGCTGG TCATTTGCCTTACGTTTTGTATGATCCAACTGCTACTGATGCTAAACAACATCATAGACATGGTTATGAAAAACC TGAAGAATTGTGGACTGCTAAATCTAGAGTTCATCCATTGTAATGAgtcgac ParvoB19.Opti.VP2 (SEQ ID NO: 26)
5
10
15
20
25
cctaggacaaaacaaaATGACATCTGTTAATTCTGCTGAAGCATCTACTGGTGCAGGTGGAGGTGGTTCTAATTC
TGTTAAATCTATGTGGTCTGAAGGTGCTACTTTTTCTGCTAATTCAGTTACTTGTACTTTCTCTAGACAATTCTT
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GAACTTGTTTTTTTCTCCATTGGAATTTCAACATTTGATTGAAAACTACGGTTCTATTGCTCCAGATGCTTTGAC
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TACTGGTAGATTGTGCATGTTGGTTGATCATGAATACAAATACCCATACGTTTTGGGTCAAGGTCAAGATACTTT
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TTCTCAACATTTTTACGAAATGTACAATCCATTGTATGGTTCTAGATTGGGTGTTCCAGATACTTTGGGTGGTGA
TCCAAAATTTAGATCTTTGACTCATGAAGATCATGCTATTCAACCACAAAATTTCATGCCAGGTCCATTGGTTAA
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TTCTCAAAACACTAGAATTTCTTTAAGACCAGGTCCAGTTTCACAACCATATCATCATTGGGATACTGATAAGTA
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TGTTGGTAGATTTCCAAACGAAAAAGAACAATTGAAACAATTGCAAGGTTTGAATATGCATACTTACTTTCCAAA
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GCATTATGAATCTCAATTGTGGTCTAAGATTCCAAATTTAGATGATTCTTTCAAGACTCAATTTGCTGCTTTGGG
TGGTTGGGGTTTGCATCAACCTCCACCACAAATTTTCTTGAAGATTTTGCCACAATCTGGTCCAATTGGTGGTAT
TAAATCTATGGGTATTACTACTTTGGTTCAATATGCTGTTGGTATTATGACTGTTACAATGACTTTTAAGTTGGG
TCCAAGAAAAGCTACAGGTAGATGGAATCCACAACCAGGTGTTTATCCACCACATGCTGCTGGTCATTTGCCTTA
CGTTTTGTATGATCCAACTGCTACTGATGCTAAACAACATCATAGACATGGTTATGAAAAACCTGAAGAATTGTG
GACTGCTAAATCTAGAGTTCATCCATTGTAATGAgcggccgc
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> NOVARTIS AG
<120> Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas
<130> PAT054676-WO-PCT
<140>
<141 >
<150> 61/505.093 <151>
<160> 26
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 2727
<212> ADN
<213> Citomegalovirus
<400> 1

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Una composición inmunogénica que comprende: (i) una molécula de ARN autorreplicante que codifica un primer antígeno polipeptídico y (ii) un segundo antígeno polipeptídico; en la que dicho primer y segundo antígenos son antígenos de diferentes patógenos.
  2. 2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que:
    (i) dicho segundo antígeno polipeptídico está en la forma de una partícula de tipo virus (VLP); y/o
    (ii) dicho segundo antígeno polipeptídico es un polipéptido soluble y dicho primer antígeno polipeptídico es un polipéptido soluble o anclado a membrana.
  3. 3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 o 2, en la que la molécula de ARN autorreplicante:
    (i) es un replicón de ARN derivado de alfavirus; y/o
    (ii) comprende uno o más nucleótidos modificados.
  4. 4. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un lípido catiónico, un liposoma, un cocleato, un virosoma, un complejo inmunoestimulador, una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, una vesícula unilaminar, una vesícula multilaminar, una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite, un emulsoma, un péptido policatiónico o una nanoemulsión catiónica.
  5. 5. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la molécula de ARN está encapsulada en, unida a o adsorbida sobre un lípido catiónico, un liposoma, un cocleato, un virosoma, un complejo inmunoestimulador, una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, una vesícula unilaminar, una vesícula multilaminar, una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite, un emulsoma, un péptido policatiónico, una nanoemulsión catiónica o combinaciones de las mismas, o en la que la molécula de ARN está en forma de una partícula de replicón vírico (VRP).
  6. 6. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho primer y segundo antígenos polipeptídicos se obtienen independientemente del grupo que consiste en un patógeno vírico, un patógeno bacteriano, un patógeno fúngico, un patógeno protozoico y un patógeno parasitario multicelular.
  7. 7. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el primer antígeno polipeptídico y el segundo antígeno polipeptídico son ambos antígenos víricos.
  8. 8. La composición inmunogénica de la reivindicación 7, en la que un antígeno vírico es un antígeno de CMV.
  9. 9. La composición inmunogénica de la reivindicación 7, en la que un antígeno vírico es un antígeno de parvovirus, opcionalmente en la que el antígeno de parvovirus comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO: 25 y 26.
  10. 10. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que:
    (i) dicho primer antígeno polipeptídico es un antígeno de citomegalovirus (CMV); y/o
    (ii) dicho segundo antígeno polipeptídico es un antígeno de parvovirus.
  11. 11. La composición inmunogénica de la reivindicación 8, en la que (i) el antígeno vírico es un antígeno gB, un antígeno gH o un antígeno gL; o (ii) el antígeno vírico es un antígeno gH o un antígeno gL; o (iii) la molécula de ARN codifica un antígeno gH y un antígeno gL; o (iv) la composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico gH y un antígeno polipeptídico gL.
  12. 12. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además un adyuvante.
  13. 13. Una composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en: (i) un procedimiento para el tratamiento o prevención de una enfermedad infecciosa; o (ii) un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto; en la que el procedimiento comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición.
  15. 15. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en un procedimiento de vacunación de un sujeto, en la que el procedimiento comprende administrar a un sujeto que lo necesita la composición.
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