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ES2648169T3 - Productos de virus recombinantes y métodos para inhibición de la expresión de DUX4 - Google Patents

Productos de virus recombinantes y métodos para inhibición de la expresión de DUX4 Download PDF

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ES2648169T3
ES2648169T3 ES12816988.5T ES12816988T ES2648169T3 ES 2648169 T3 ES2648169 T3 ES 2648169T3 ES 12816988 T ES12816988 T ES 12816988T ES 2648169 T3 ES2648169 T3 ES 2648169T3
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dux4
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muscle
raav
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Scott Quenton HARPER
Jian Liu
Sara GARWICK
Lindsay WALLACE
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Nationwide Childrens Hospital Inc
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Abstract

Un virus adeno-asociado recombinante que comprende el ADN que codifica miARN de DUX4 que se presenta en la SEQ ID NO: 1 o 2, en el que el virus adeno-asociado recombinante carece de los genes rep y cap.

Description

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microorganismos puede ser provocada por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando rAAV en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización con filtro. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de la solución previamente filtrada de forma estéril del mismo.
La transducción con rAAV también se puede realizar in vitro. En una realización, las células musculares diana deseadas se retiran del sujeto, se transducen con rAAV y se reintroducen en el sujeto. Como alternativa, se pueden usar células musculares singénicas o xenogénicas en las que esas células no generarán una respuesta inmunológica inapropiada en el sujeto.
En la técnica se conocen métodos adecuados para la transducción y reintroducción de células transducidas en un sujeto. En una realización, las células se pueden transducir in vitro por combinación de rAAV con células musculares, por ejemplo, en medios apropiados, e identificando sistemáticamente esas células que albergan el ADN de interés usando técnicas convencionales tales como transferencias de Southern y/o PCR, o usando marcadores seleccionables. A continuación las células transducidas se pueden formular en composiciones farmacéuticas, y la composición se puede introducir en el sujeto mediante diversas técnicas, tales como mediante inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal, o mediante inyección en músculo liso y cardiaco, usando por ejemplo, un catéter.
La transducción de células con rAAV de la invención como resultado una expresión sostenida de los miARN de DUX4. Por lo tanto la presente invención proporciona métodos para administrar/proporcionar rAAV que expresa los miARN de DUX4 a un animal, preferentemente un ser humano. Estos métodos incluyen transducción de tejidos (que incluyen, pero no se limitan a, tejidos tales como músculo, órganos tales como hígado y cerebro, y glándulas tales como glándulas salivares) con uno o más rAAV de la presente invención. La transducción se puede realizar con casetes genéticos que comprenden elementos de control específicos de tejido. Por ejemplo, una realización de la invención proporciona métodos para transducir células musculares y tejidos musculares dirigidos por elementos de control específicos del músculo, que incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos a partir de las familias de genes de actina y miosina, tales como a partir de la familia de genes myoD [Véase Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], el factor MEF-2 de unión a potenciador específico de miocitos [Cserjesi y Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], elementos de control obtenidos a partir gen de actina del esqueleto humano [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], el gen de actina cardiaco, elementos de secuencia de creatina quinasa muscular [Véase Johnson et al., Mol Cell Biol, 9: 3393-3399 (1989)] y el elemento potenciador de creatina quinasa de murino (mCK), elementos de control obtenidos a partir del gen de la troponina C de contracción rápida esquelética, el gen de la troponina C de contracción lenta cardiaca y el gen de la troponina I de contracción lenta: factores nucleares inducibles por hipoxia [Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)], elementos inducibles por esteroides y promotores que incluyen el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE) [Véase Mader y White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)], y otros elementos de control.
El tejido muscular es una diana atractiva para administrar el ADN in vivo, porque no es un órgano vital y tiene un acceso fácil. La invención contempla la expresión sostenida de los miARN de miofibras transducidas.
Por "célula muscular" o "tejido muscular" se hace referencia a una célula o grupos de células obtenidas a partir de músculo de cualquier tipo (por ejemplo, músculo esquelético y músculo liso, por ejemplo del tracto digestivo, vejiga urinaria, vasos sanguíneos o tejido cardiaco). Las células musculares de este tipo pueden ser diferenciadas o no diferenciadas, tales como mioblastos, miocitos, miotubos, cardiomiocitos y cardiomioblastos.
El término "transducción" se usa para hacer referencia a la administración/suministro de miARN de DUX4 a una célula receptora ya sea in vivo o in vitro, a través de rAAV con déficit de replicación de la invención dando como resultado una expresión de un miARN de DUX4 por la célula receptora.
Por lo tanto, la invención proporciona métodos para administrar una dosis eficaz (o dosis, administradas esencialmente de forma simultánea o dosis administradas a intervalos) de rAAV que codifica miARN de DUX4 a un paciente con necesidad del mismo.
Breve descripción de las figuras
La Figura1 muestra la secuencia de ADN de DUX4 humano.
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proteína DUX4 de ~50 kDa de longitud completa se encuentran en biopsias y en líneas celulares de pacientes con FSHD. Estos datos son coherentes con un modelo de desrepresión transcripcional de la patogénesis de FSHD.
Además, a diferencia de los pseudogenes, las repeticiones de D4Z4 y DUX4 probablemente tienen importancia funcional, ya que las repeticiones de D4Z4 dispuestas en tándem se conservan en al menos once especies diferentes de mamíferos placentarios (los animales no placentarios carecen de repeticiones de D4Z4), con la mayor conservación de secuencia produciéndose dentro del ORF de DUX4. En segundo lugar, el DUX4 sobreexpresado es tóxico para células de cultivo tisular y precursores embrionarios de organismos inferiores en desarrollo in vivo. Esta toxicidad se produce al menos parcialmente a través de un mecanismo proapoptótico, indicado por activación de Caspasa-3 en células transfectadas con DUX4, y presencia de núcleos TUNEL-positivos en embriones de Xenopus con su desarrollo detenido a los que se inyecta ARNm de DUX4 en la etapa de dos células. Estos hallazgos son coherentes con estudios que muestran algunas proteínas pro-apoptóticas, incluyendo Caspasa-3, están presentes en músculos del paciente con FSHD. Además de estimular la apoptosis, DUX4 puede regular negativamente la miogénesis. DUX4 humano inhibe la diferenciación de mioblastos de C2C12 de ratón in vitro, potencialmente al interferir con PAX3 y/o PAX7, y provoca detención del desarrollo y una menor tinción de algunos marcadores musculares cuando se administra a células precursoras de pez cebra o embriones de Xenopus. Por último, la función anómala de DUX4 se asocia directamente con los cambios moleculares potencialmente importantes observados en los músculos del paciente con FSHD. De forma específica, el DUX4 humano de longitud completa codifica un factor de transcripción de homeodominio doble de aproximadamente 50 kDa, y su única diana conocida, Pitx1, estaba elevada en los músculos del paciente con FSHD que sobreexpresan DUX4. Estos datos respaldan que DUX4 cataliza numerosos cambios moleculares cadena abajo que son incompatibles con el mantenimiento de la integridad muscular normal.
Por lo tanto, mediante los siguientes se ilustran ejemplos aspectos y realizaciones de la invención. El Ejemplo 1 describe los miARN específicos para el gen DUX4. El Ejemplo 2 describe el efecto de los miARN en la expresión de DUX4 tal como se mide con el ensayo de luciferasa. El Ejemplo 3 describe el efecto in vitro de plásmidos provirales que expresan los miARN en la expresión de DUX4 tal como se mide mediante transferencia de Western. El Ejemplo 4 describe vectores rAAV que codifican los miARN de DUX4. El Ejemplo 5 describe el alivio de la miopatía inducida por DUX4 por vectores AAV6.miDUX4.405. El Ejemplo 6 describe la protección de los músculos contra los cambios patológicos musculares asociados con FSHD. El Ejemplo 7 describe la protección de ratones a partir de los déficits de fuerza de agarre asociados a DUX4.
Ejemplo 1
MicroARN específicos para el gen DUX4
Dos miARN específicos para el gen DUX4 gene se generaron mediante PCR. Se usaron cuatro cebadores de PCR que tenían las siguientes secuencias.
Cebador 662 (miDUX4hum405F):
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Cebador 663 (miDUX4hum405R): TTTTACTAGTAGGCAGTCCAGGATTCAGATCTGGTTTCCCATCTGTGGCTTTCAG (SEQ ID NO: 4) Cebador 665 (miDUX4hum1156F):
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Cebador 667 (miDUX4hum1156R):
TTTTACTAGTAGGCACAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACCCATCTGTGGCTTTCAG (SEQ ID NO: 6)
El ADN que codifica un miARN denominado hDux.mi405 se generó usando los cebadores 662 y 663. El ADN que codifica un miARN denominado hDux.mi1156 se generó usando los cebadores 665 y 667.
Un µg de cada cebador se añadió a una reacción de extensión de cebador de 1 ciclo: 95 ºC durante 5 min.; 94 ºC durante 2 min.; 52 ºC durante 1 min.; 72 ºC durante 15 min.; y a continuación manteniendo a 4 ºC. Los productos de PCR se limpiaron con el kit de Purificación de PCR QIAquick de Qiagen antes de su digestión durante una noche con enzimas de restricción XHOI y SPEI. A continuación el producto de digestión se desarrolló en un gel de TBE al
1,5 % y la banda se escindió y se purificó usando el Kit de Extracción en Gel QIAquick de Qiagen. Las secuencias de los miARN se presentan a continuación y en las Figuras 2A y 2B, respectivamente.
miDux4.405
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miDux4.1156
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10 Los dos productos de PCR se ligaron durante una noche a un vector U6T6 (a través de XhoI y XbaI) que contiene un promotor U6 de ratón y una señal de terminación de ARN polimerasa III (seis nucleótidos de timidina). Los miARN se clona en sitios de restricción XhoI y XbaI situados entre el extremo en la posición 3' del promotor U6 y la señal de terminación (el sitio SpeI en el extremo la posición 3' del molde de ADN para cada miARN tiene extremos cohesivos
15 complementarios con el sitio XbaI). El producto de ligación se transformó en células de E. coli químicamente competentes con un choque térmico a 42 ºC e incubado a 37 ºC con agitación durante 1 hora antes de su siembra en placas de selección de kanamicina. Se permitió que las colonias crecieran durante una noche a 37 ºC. Al día siguiente se mini-prepararon y se secuencian para precisión.
20 Ejemplo 2
Ensayo de Luciferasa para Efecto de Expresión de los miARN de DUX4
Se sometió a ensayo la expresión de la secuencia diana de DUX4 en presencia de los miARN de DUX4. Una
25 transfección con lipofectamina 2000 se realizó en 293 células en una placa de ensayo con paredes de color blanco, de 96 pocillos. Se transfectaron 140.000 células con 20 ng de un plásmido de Renilla-luciérnaga que contenía la secuencia diana de DUX4 (Figura 3A) y 180 ng de diversos vectores codificantes de miARN de DUX4, incluyendo los vectores miDux4.405 o miDux4.1156 dirigidos por U6T6 del Ejemplo 1. Un ensayo de luciferasa se realizó 24 horas más tarde.
30 El medio se retiró de las células y se añadieron 20 µl de tampón de lisis por pocillo. La placa se colocó en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de añadir 50 µl de sustrato de luciferasa. La primera lectura se tomó 10 minutos más tarde. A continuación, se añadieron 50 µl de sustrato de luciferasa Stop y Glo y la segunda lectura se tomó 10 minutos más tarde. La expresión de Renilla se dividió entre la expresión de luciérnaga
35 para calcular la expresión relativa. La expresión relativa se normalizó a continuación con respecto a la expresión de células que se transfectar aun con un miARN de control que se dirige a eGFP. Los resultados se muestran en la Figura 3B. Los miARN de DUX4, miDUX4.405 y miDUX4.1156, eran los más eficaces para reducir la expresión de proteína de luciferasa en células transfectadas.
40 Ejemplo 3
Ensayo de Transferencia de Western para Efecto de Expresión de los miARN de DUX4 de rAAV
A continuación, los casetes de expresión de miARN de U6T6.miDUX4 se clonaron en plásmidos provirales
45 AAV.CMV.hrGFP como se muestra en la Figura 4A. Los plásmidos provirales se co-transfectaron a continuación con un plásmido de expresión DUX4.V5 en 293 células y el efecto de la expresión de los miARN de DUX4 de los plásmidos provirales se sometió a ensayo mediante transferencia de Western. Una secuencia de U6.miGFP, que No se dirige a DUX4, se usó como control negativo para silenciamiento genético.
50 Un día antes de la transfección, se sembraron 293 células en una placa de 24 pocillos a 1,5 x 105 células/pocillo. A continuación las células se transfectaron con AAV-CMV-DUX4-V5 y AAV-CMV-miDUX4 (405 o 1156) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, N.º de Cat. 11668-019):
Grupo 1: 50 ng de AAV-CMV-DUX4-V5 + 800 ng de AAV-CMV-miDUX4 (1:16) 55 Grupo 2: 100 ng de AAV-CMV-DUX4-V5 + 800 ng de AAV-CMV-miDUX4 (1:8)
Treinta y seis h después de la transfección, las células se recogieron y se lavaron con PBS frío una vez. A continuación se añadieron setenta µl de tampón de lisis (NaCl 137 mM, Tris 10 mM pH = 7,4, NP40 al 1 %). Las células se volvieron a suspender completamente y se incubaron en hielo durante 30 min. Las muestras se
60 centrifugaron durante 20 min a 13.000 rpm a 4 ºC y el sobrenadante se recogió. El lisado celular se diluyó 5 veces Para el ensayo de concentración de proteína de Lowry (Reactivo A, B, S de Ensayo de Proteína Dc de Bio-Rad; N.º de Cat. 500-0113, 500-0114, 500-115). Se tomaron veintitrés µg de cada muestra y se añadieron 2x de tampón de
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muestra (Tris 100 mM a pH = 6,8, DTT 100 mM, glicerol al 10 %, SDS al 2 %, azul de bromofenol al 0,006 %). Las muestras se llevaron la ebullición durante 10 min y a continuación se pusieron en hielo.
Las muestras se cargaron sobre geles de poliacrilamida al 10 % (basándose en una proporción de 37,5:1 de acrilamida:bis acrilamida, Bio-Rad, N.º de Cat. 161-0158), 3,5 µg y 18 µg en dos geles para cada muestra. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF a 15 V durante 1 h usando transferencia semiseca (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell, Bio-Rad, N.º de Cat. 170-3940). Las transferencias se colocaron en tampón de bloqueo (leche seca sin grasa al 5 %, Tris 30 mM a pH = 7,5, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05 %) y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El tampón de bloqueo se decantó y se añadió una solución de anticuerpo primario anti-DUX4 (DUX4 p12, Santa Cruz, N.º de Cat. sc-79927,1:1,000) y se incubó con agitación durante una noche a 4 ºC. A continuación las membranas se lavaron durante 30 min, cambiando el tampón de lavado (NaCl 150 mM, Tris 30 mM a pH = 7,5, Tween-20 al 0,05 %) cada 10 min. Se añadió Anticuerpo de Burro Anti-Cabra conjugado con Peroxidasa (Jackson ImmunoReserch, N.º de Cat. 705-035-003, 1: 100.000) y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación las membranas se lavaron durante 30 min, cambiando el tampón de lavado cada 10 min. Las transferencias se colocaron en una solución de trabajo quimioluminiscente (Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore, N.º de Cat. WBKLS0500), incubado con agitación durante 5 min a temperatura ambiente, Y a continuación se expuso a una película de rayos X.
Las membranas se lavaron durante 20 min, cambiando el tampón de lavado cada 10 min. A continuación, se añadió tampón de separación (SDS al 2 %, Tris 62,5 mM a pH=6.7, b-ME 100 mM) a las transferencias y se incubó a 50 ºC durante 30 min. Las membranas se lavaron de nuevo durante 30 min, cambiando el tampón de lavado cada 10 min.
A continuación las membranas se bloquearon de nuevo y se volvieron a sondear con una solución de anticuerpo primario anti-GAPDH (Chemicon, N.º de Cat. MAB374, 1:200) y como anticuerpo secundario se usó Anticuerpo de Cabra Anti-Ratón conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoReserch, N.º de Cat. 115-035-146, 1:100.000).
Por último, las membranas se separaron de nuevo y se volvieron a sondear con anticuerpo anti-V5 (Invitrogen, N.º de Cat. R960-25, 1:5.000).
Los plásmidos provirales de AAV.miDUX4 reducían la expresión de proteína DUX4 in vitro. AAV-CMV-miDUX4.405 era el más eficaz para atenuación genética de la expresión de DUX4.
Ejemplo 4
Producción de rAAV Que Codifica MicroARN de DUX4
El vector se produjo mediante co-transfección en células HEK293 de tres plásmidos (auxiliar de pAd, auxiliar de AAV, y el genoma de rAAV que contenía miDUX4; descrito con detalle a continuación), seguido de cosecha celular, unificación de vector, valoración, y ensayos de control de calidad.
Plásmidos: el pAd auxiliar contiene los genes E2A, E4 ORF6, y VA I/II de adenovirus; los plásmidos auxiliares de AAV contienen rep2 y cap6 de AAV (por ejemplo, ha una preparación del serotipo 6 de AAV, el gen de la cápside se podría denominar cap6); el plásmido de rAAV contiene secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV que los elementos genéticos a empaquetar en el vector. Para el AAV.miDUX4, esto incluye el clonado U6.miDUX4 cadena arriba del indicador CMV.eGFP.
Transfección: los plásmidos se transfectaron en 293 células (Corning 10-Stack) usando CaPO4 a una proporción de
4:4:1 (20 ug de auxiliar de pAd: 20 ug de auxiliar de AAV: 5 ug de auxiliar de rAAV por placa.
Cosecha celular: Cuarenta y ocho h después de la transfección, las células se cosecharon y se volvieron a suspender en Tris 20 mM (pH 8,0), MgCl2 1 mM y NaCl 150 mM (T20M1N150) a una densidad de 5 x 106 células/ml. Las células se lisaron mediante cuatro ciclos secuenciales de congelación/descongelación y se añadió nucleasa Benzonasa (AIC, Solución de Reserva: 250 U/ul) para una concentración final de 90 U/ml antes de clarificación del lisado celular.
Purificación y Valoración del Vector: Los lisados clarificados se sometieron a purificación con gradiente en etapas de iodixanol como se ha descrito anteriormente (Xiao, X, et al., J. Virol 72: 2224-32). La fase de iodixanol al 40 % (que contiene rAAV) se diluyó 5 veces con un tampón de dilución no salino (pH que varía dependiendo del serotipo) y se aplicó a una columna Hi-Trap HP-Q/S. Después de elución con un gradiente salino de NaCl, se combinaron fracciones máximas de 1 ml (por lo general 3-5), se dializaron con T20M1N200 (pH 8,0), a continuación se filtraron de manera estéril y se complementaron con Pluronic F68 al 0,001 %. El vector se almacenó a -80 ºC. El virus purificado se valoró para vg usando Q-PCR como se ha descrito anteriormente [Schnepp y Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002)].
Los diagramas esquemáticos de los genomas de rAAV se muestran en la Figura 5.
imagen11

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