ES2220923T3 - Lineas celulares estables capaces de expresar el gen de replicacion del virus adeno-asociado. - Google Patents

Abstract

LINEAS CELULARES DE EMPAQUETAMIENTO ESTABLES DERIVADAS DE LAS CELULAS 293 HUMANAS QUE SE TRANSFECTAN CON UN VECTOR DEL AAV QUE TIENE EL GEN DE REP DEL AAV UNIDO DE FORMA OPERATIVA A UN PROMOTOR DE LA TRANSCRIPCION HETEROLOGO, TAL COMO EL PROMOTOR DE METALOTIONEINA, O UN PROMOTOR HOMOLOGO INSENSIBLE A LA REP78 DEL AAV Y QUE SON CAPACES DE PRODUCIR PROTEINAS DE REP DEL AAV Y SON UTILES PARA EL EMPAQUETAMIENTO DE VECTORES DEL AAV RECOMBINANTES QUE CONTIENEN POLINUCLEOTIDOS OBJETIVO.

Description

Líneas celulares estables capaces de expresar el gen de replicación del virus adeno-asociado.

Campo técnico

Esta invención se refiere a la terapia génica y más específicamente a líneas celulares estables que son útiles para empaquetar vectores recombinantes del virus adeno-asociado de tipo 2 (AAV), sin producir AAV de tipo silvestre.

Antecedentes

Los vectores de AAV se encuentran entre una pequeña cantidad de sistemas de vectores víricos recombinantes en los que se ha observado una utilidad como agentes de transferencia génica in vivo (revisado por Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539; Muzcyzka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129) y tienen potencialmente, por tanto, una gran importancia para la terapia génica humana. Los vectores de AAV son capaces de integrar y expresar ADN estable de alta frecuencia en una variedad de células que incluyen las células epiteliales nasales y bronquiales de la fibrosis quística (FQ) (Flotte y col., 1992a, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356; Egan y col., 1992, Nature, 358:581-584; Flotte y col., 1993a, J. Biol. Chem. 268:3781-3790; Flotte y col., 1993b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, en prensa), las células humanas de eritroleucemia derivadas de la médula ósea (Walsh y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7257-7261) y algunas otras. AAV puede no requerir la división celular activa para tener una expresión estable, lo que sería una clara ventaja sobre otros retrovirus, especialmente en tejidos tales como el epitelio de las vías respiratorias humanas en donde la mayoría de las células se diferencian terminalmente y no se dividen.

AAV es un parvovirus defectuoso que crece sólo en células en las que ciertas funciones se proporcionan mediante un virus auxiliar de la coinfección. Revisiones generales sobre el AAV se pueden encontrar en Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, vol. I, págs. 169-228, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, vol. I, págs. 169-228, Berns, 1990, Virology, págs. 1743-1746, Raven Press, Nueva York). Ejemplos de virus co-infectantes que proporcionan funciones auxiliares para el crecimiento y la replicación de AAV, son los adenovirus, los virus herpes y, en algunos casos, los poxvirus como el virus vaccinia. La naturaleza de la función auxiliar no es conocida pero parece ser que algún efecto indirecto del virus auxiliar vuelve permisiva a la célula para la replicación de AAV. Este concepto se apoya en la observación de que en ciertos casos la replicación de AAV tiene lugar con un bajo nivel de eficacia en ausencia de coinfección con el virus auxiliar, si las células se tratan con agentes que son genotóxicos o que interrumpen el ciclo celular.

AAV tiene un campo muy amplio de hospedadores, sin ninguna especificidad obvia en tanto a la especie o el tejido y se replicará en virtualmente cualquier línea celular de origen humano, de simio o de roedor, con la condición de que esté presente un auxiliar adecuado. AAV es ubicuo y se ha aislado a partir de una amplia variedad de especies animales, incluyendo la mayoría de los mamíferos y algunas especies aviares.

AAV no ha sido identificado como la causa de ninguna enfermedad. AAV no es un virus transformante u oncogénico. La integración de AAV en los cromosomas de líneas celulares humanas no causa ninguna alteración significativa en las propiedades de crecimiento o en las características morfológicas de las células. Estas propiedades de AAV también lo hacen recomendable como un vector potencialmente útil para la terapia génica en humanos, debido a que la mayoría de los otros sistemas víricos propuestos para esta aplicación, tales como retrovirus, adenovirus, virus herpes o poxvirus, son virus que causan enfermedades.

El genoma de AAV tiene una copia del ITR (repetición terminal invertida) de 145 nucleótidos de longitud, en cada extremo y una región única de la secuencia de aproximadamente 4470 nucleótidos de longitud (Srivastava y col., 1983, J. Virol., 45:555-564) que contiene dos marcos principales de lectura abierta para los genes rep y cap (Hermonat y col., J. Virol. 51:329-339; Tratschin y col., 1984a, J. Virol. 51:611-619). La región única contiene tres promotores de la transcripción p_{5}, p_{19} y p_{40} (Laughlin y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5567-5571) que se emplean para expresar los genes rep y cap. Las secuencias de ITR son necesarias en cis y son suficientes para proporcionar un origen funcional de la replicación (ori) y también son suficientes para proporcionar señales necesarias para la integración en el genoma celular así como para la escisión eficaz y la recuperación de los cromosomas de las células hospedadoras o de los plásmidos recombinantes. Además, se ha observado que la ITR puede actuar directamente como un promotor de la transcripción en un vector de AAV (Flotte y col., 1993, véase arriba).

Los genes rep y cap son necesarios en trans para proporcionar funciones para la replicación y la encapsidación del genoma vírico, respectivamente. El gen rep se expresa a partir de dos promotores, p_{5} y p_{19}. La transcripción de p_{5} proporciona un ARNm de 4,2 kb sin cortes ni empalmes que codifica una proteína, Rep78, y un ARNm de 3,9 kb con cortes y empalmes, que codifica una proteína, Rep68. La transcripción de p_{19} proporciona un ARNm sin cortes ni empalmes, que codifica Rep52 y un ARNm de 3,3 kb con cortes y empalmes que codifica Rep40. Por tanto, las cuatro proteínas Rep comprenden todas una secuencia de una región interna común, pero difieren en relación con sus regiones amino y carboxi terminales. Sólo Rep78 y Rep68 son necesarias para la replicación del ADN bicatenario de AAV, pero Rep52 y Rep40 parecen ser necesarias para la acumulación de ADN monocatenario de la progenie. Las mutaciones en Rep78 y Rep68 son fenotípicamente Rep-, mientras que mutaciones que afectan sólo a Rep52 y a Rep40 son Rep+ pero Ssd-. Rep68 y Rep78 se unen específicamente a la configuración en horquilla de la ITR de AAV y poseen diversas actividades enzimáticas necesarias para resolver la replicación en los extremos de AAV. Rep52 y Rep40 no tienen ninguna de estas propiedades.

Las proteínas Rep, principalmente Rep78 y Rep68, muestran diversas actividades reguladoras pleyotrópicas que incluyen la regulación positiva y negativa de los genes de AAV y la expresión a partir de algunos promotores heterólogos, así como efectos inhibidores sobre el crecimiento celular (Tratschin y col., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894; Labow y col., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1320-1325; Khleif y col., Virology, 181:738-741). El promotor p_{5} de AAV está autorregulado negativamente por Rep78 o Rep68 (Tratschin y col., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894).

Los principios generales de la construcción del vector de AAV se han definido tal y como se han revisado recientemente (Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539; Muzyczka, 1992, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129). Los vectores de AAV se construyen en plásmidos recombinantes de AAV sustituyendo partes de la secuencia codificadora de AAV por ADN extraño, para generar un plásmido del vector. En el plásmido del vector, las partes terminales (ITR) de la secuencia de AAV se tienen que mantener intactas, porque estas regiones son necesarias en cis para diversas funciones que incluyen la escisión desde el plásmido después de la transfección, la replicación del genoma del vector y la integración y la recuperación desde un genoma de la célula hospedadora. El vector se puede empaquetar entonces en una partícula de AAV para generar un virus que transduce AAV mediante transfección del plásmido del vector en células que están infectadas con un virus auxiliar adecuado, tal como el adenovirus o el virus herpes. Para conseguir la replicación y la encapsidación del genoma del vector en las partículas de AAV, el plásmido del vector tiene que estar complementado con cualquier función de AAV necesaria en trans, es decir, rep y cap, que se habían delecionado en la construcción del plásmido del vector.

Tal y como se ha indicado, los vectores de AAV tienen una utilidad potencial para el tratamiento de enfermedades humanas mediante terapia génica. Uno de los factores limitantes de la terapia génica con AAV ha sido la relativa ineficacia de los sistemas de empaquetamiento del vector que se han empleado. Debido a la carencia de líneas celulares que expresan las funciones de AAV que se complementan en trans, tales como rep y cap, el empaquetamiento de los vectores de AAV se ha conseguido en células infectadas con adenovirus mediante la cotransfección de un plásmido de empaquetamiento y un plásmido de vector. La eficacia de este procedimiento puede estar limitada por la eficacia de la transfección de cada una de las estructuras artificiales del plásmido y por el nivel de expresión de las proteínas Rep de los plásmidos de empaquetamiento, descritas hasta la fecha. Cada uno de estos problemas parece estar relacionado con las actividades biológicas de las proteínas Rep de AAV. Además, tal y como se ha indicado anteriormente, todos los sistemas de empaquetamiento descritos anteriormente tienen la capacidad de generar AAV de tipo silvestre por recombinación.

La carencia de líneas celulares que expresen de forma estable una Rep funcional, refleja de forma evidente una función citotóxica o citostática de Rep, tal y como se muestra por la inhibición con Rep de la formación de colonias resistentes a neo (Labow y col., 1987; Trempe y col., 1991). Esto también parece estar relacionado con la tendencia de Rep a invertir el fenotipo inmortalizado en células cultivadas, lo que ha hecho extremadamente difícil la producción de líneas celulares que expresen Rep de forma estable. Se han realizado diversos intentos de generar líneas celulares que expresan Rep. Mendelson y col., (1988, Virology, 166:154-165) informaba de la obtención de una expresión a muy bajo nivel de ciertas proteínas Rep de AAV después de una transfección estable de células HeLa o células 293 con plásmidos que contenían un gen rep de AAV, pero el nivel era insuficiente para la producción de vectores. Winocour y col., (1992, Virology 190,:316-329) informaba sobre la obtención de expresión de Rep52 de AAV después de una transfección estable de células embrionarias de hámster chino (OD4) y sobre el empleo de las células transfectadas para investigar el efecto de la integración estable del gen rep de AAV sobre procesos celulares conectados con la reparación del ADN y la amplificación génica. Vincent y col., (1990, Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 353-359) intentaron generar líneas celulares que contenían los genes rep y cap de AAV expresados a partir de los promotores de AAV normales, pero esos intentos no tuvieron éxito porque los vectores estaban contaminados con 100 veces un exceso de partículas de AAV de tipo silvestre o porque los vectores se produjeron sólo con títulos muy bajos de menos de 4 x 10^{3}. En un acercamiento alternativo, Lebkowski y col., (documento de patente de EE.UU. nº 5.173.414, expedido el 22 de dic. de 1992) construyeron líneas celulares que contenían vectores de AAV en un plásmido episómico. Estas líneas celulares se podían infectar a continuación con adenovirus y se podían transfectar con las funciones rep y cap de AAV que se complementaban en trans, para generar preparaciones del vector de AAV. Se reivindica que esto permite producir mayores títulos de cantidades de AAV. Sin embargo, en los ejemplos mostrados, la única información en relación con los títulos es que una línea celular humana, K562, se podía transducir con eficacias de sólo 1% o menos, lo que no indica una alta producción de título para ningún vector de AAV. En este sistema el vector se transporta como un episoma (estructura artificial no integrada) y se expone que no se prefieren las copias integradas del vector.

El acercamiento para empaquetar los vectores de AAVE, descrito por Lebkowski y col., 1992, tienen diversos aspectos no deseables. En primer lugar, mantener el vector como un plásmido episomal con alto número de copias y no integrado en una línea celular, no es deseable porque no se puede controlar rigurosamente el número de copias por célula y el ADN del episoma tiene mucha más probabilidad de sufrir una transposición que conduce a la producción de vectores defectuosos. En segundo lugar, en este sistema el vector tiene que estar todavía empaquetado al infectar la línea celular con adenovirus e introducir un plásmido que contenga los genes rep y cap de AAV. El plásmido utilizado por Lebkowski y col., 1992, era de nuevo pBal, el cual, tal y como se ha mencionado anteriormente, tiene una homología solapante con las secuencias ITR del vector y dará como resultado la generación de AAV de tipo silvestre. En tercer lugar, en el plásmido de empaquetamiento pBal empleado por Lebkowski y col., 1988, 1992, el gen rep se expresa fuera de su promotor homólogo p_{5} y, por tanto, se autorregula negativamente y por ello es susceptible de limitar la expresión de rep.

El problema de niveles inferiores al óptimo de expresión de rep después de la transfección del plásmido se puede relacionar con otra actividad biológica de estas proteínas. Existe una evidencia (Tratschin y col., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894) de que las proteínas Rep de AAV dañan la regulación de su propia expresión desde el promotor p_{5} de AAV que se ha empleado en todas las estructuras artificiales de empaquetamiento descritas anteriormente, tales como pAAV/Ad (Samulski y col., 1989) o pBal (Lebowski y col., 1988, 1992).

La presente invención proporciona líneas celulares estables que son capaces de producir niveles relativamente altos de Rep78 y que son útiles para el empaquetamiento de vectores de AAV sin producir AAV de tipo silvestre.

Descripción de la invención

Un aspecto de la invención es una línea celular de mamíferos estable que posee un gen rep del virus adeno-asociado (AAV), ligado funcionalmente a un promotor heterólogo inducible, siendo capaz la línea celular de producir proteína Rep funcional.

Otro aspecto de la invención es un método de empaquetamiento de un vector de AAV recombinante sin producir AAV de tipo silvestre, que comprende cultivar una línea celular de la invención bajo condiciones que permitan la expresión de los genes rep y cap, en donde la línea celular está infectada con un virus auxiliar y el vector de AAV recombinante ha sido introducido en la línea celular, careciendo el vector de AAV de homología solapante con secuencias de AAV en el extremo de la célula y teniendo un gen funcional de la cápsida de AAV o estando complementado con un segundo vector que tiene un gen funcional de la cápsida de AAV, en donde el vector de AAV recombinante está empaquetado.

Aún otro aspecto de la invención es un método para producir una línea celular estable de la invención que comprende:

(a) seleccionar una célula que produce de forma estable la proteína Rep a partir de las células de una línea celular de mamífero capaz de ser infectada con AAV, en donde la línea celular ha sido transfectada con un vector de AAV que tiene el gen rep de AAV ligado funcionalmente a un promotor heterólogo inducible y en donde las células transfectadas se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión del gen; y

(b) dejar crecer la célula para producir la línea celular.

También se proporciona en la invención un método para infectar una línea celular con una partícula de AAV recombinante, comprendiendo el método:

(a) infectar una línea celular de acuerdo con la invención, en donde la línea celular está infectada con un virus auxiliar, con la partícula de AAV recombinante, conteniendo la partícula un vector que tiene un gen funcional de la cápsida de AAV o estando complementado con un segundo vector que tiene un gen funcional de la cápsida de AAV; y

(b) cultivar las células infectadas bajo condiciones que permitan la expresión de los genes rep y de la cápsida de AAV.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación del plásmido pMtrep.

La Figura 2 es una reproducción a media tinta de un análisis con transferencia de tipo Western de proteínas Rep procedentes de diversos clones resistentes a la neomicina, en ausencia (-) o en presencia (+) de inducción con metales pesados, o procedentes de células 293 transfectadas con pAW2 de pMtrep. La pista de E. coli contiene la proteína Rep procedente de un vector de expresión procarionte.

La Figura 3 es una reproducción a media tinta del ensayo de unión de la repetición terminal de AAV empleando Rep78 producida por células neo6. La reacción de unión del ADN no contiene extracto de células 293 (pista libre), o contiene 1 \mul de extracto nuclear de células 293 transfectadas con pCDM8 (pista pCDM8) o con pCDMrep (pista pCDMrep), por células neo5 o neo6 inducidas (+) o no inducidas (-).

La Figura 4 es una reproducción a media tinta del análisis con hibridación de la transferencia de tipo Southern de un ensayo de empaquetamiento de un genoma de AAV con el gen rep mutante en presencia (+) o en ausencia (-) de inducción.

La Figura 5 es una fotografía a media tinta de las placas del ensayo de la eficacia de formación de colonias (CFE).

La Figura 6 es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de crecimiento con MTT. Las curvas de crecimiento de las células en presencia (+) o en ausencia (-) de inducción con metales pesados se obtuvieron a partir de cuatro experimentos. Los resultados se expresan como densidades ópticas frente al tiempo transcurrido después de la extensión de las placas (días).

Modos para realizar la invención

La puesta en práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro del estado de la técnica. Tales técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véase, p. ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989), Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, compilador, 1984), Animal Cell Culture (R.I. Freshney, compilador, 1987), las series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammamlian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, compiladores, 1987), Handbook of Experimental Immunology, (D.M. Weir y C.C. Blackwell, compiladores), Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. Smith y K. Struhl, compiladores, 1987) y Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach y W. Strober, compiladores, 1991). Todos los documentos de patentes, de solicitudes de patentes y publicaciones mencionados en esta memoria, se incorporan en esta memoria como referencia.

Las líneas celulares de la invención se pueden obtener a partir de cualquier línea celular progenitora de mamífero que sea susceptible de infección con AAV. Tal y como se ha indicado previamente, AAV tiene una amplia gama de hospedadores y se ha aislado de una variedad de tipos celulares de mamífero, que incluyen los simios, el ser humano y los roedores. Para la terapia génica, se emplearán líneas celulares humanas en las que se pueden expresar funciones auxiliares adecuadas. Ejemplos de tales líneas celulares humanas a partir de las cuales se pueden obtener las líneas celulares de la invención, son 293, HeLa, A549, KB, Detroit y WI38. Las células 293 son particularmente preferidas.

Las líneas celulares de la invención se producen transfectando la línea celular progenitora con un plásmido que tiene el gen rep de AAV ligado funcionalmente a un promotor heterólogo o un promotor insensible a Rep78 de AAV, cultivando las células transfectadas en un medio selectivo, cultivando las células supervivientes bajo condiciones que favorecen la expresión del gen rep de AAV, seleccionando las células que producen Rep78 y cultivando las células que producen Rep78.

El plásmido que contiene el gen rep que se emplea para transfectar las células progenitoras debe ser capaz de integrarse de forma estable dentro de la célula y no debe ser rescatado por infección de la célula transfectada con un virus auxiliar. Incluye el gen rep de AAV ligado funcionalmente a un promotor heterólogo de la transcripción. El promotor puede ser homólogo, pero debe ser insensible a Rep78, al menos hasta el punto de que no se daña completamente la regulación con la proteína Rep78 expresada. En los promotores aceptables puede estar algo dañada la regulación, pero no fuertemente, por la expresión del gen rep. El promotor puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores inducibles incluyen los siguientes: promotores inducibles con iones de metales pesados, tales como el promotor de la metalotioneína; promotores inducibles con hormonas esteroides, tales como el promotor MMTV o el promotor de la hormona de crecimiento; promotores que serían inducibles por el virus auxiliar, tal como el promotor del gen temprano de adenovirus, inducible con la proteína E1A de adenovirus o el promotor tardío principal de adenovirus; el promotor del virus herpes inducible por proteínas del virus herpes, tales como VP16 o 1CP4; los promotores inducibles con el virus vaccinia o el poxvirus o los promotores inducibles por una polimerasa de ARN del virus de la viruela; un promotor bacteriano tal como el del fago T7 que podría ser inducible por una polimerasa de ARN del poxvirus; o un promotor bacteriano tal como el de la polimerasa de ARN de T7. El promotor es preferentemente un promotor del gen I de la metalotioneína de múridos. Más preferentemente, el promotor consta de un fragmento del gen I de la metalotioneína de múridos de aproximadamente -650 pb desde el sitio de inicio de la transcripción del gen hasta 69 pb aguas abajo del sitio. Los promotores constitutivos fuertes que serán adecuados para el uso como promotor heterólogo para la expresión de rep, incluyen el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus, el promotor de la actina \beta o el promotor de la globina \beta. También se pueden emplear promotores activados por la polimerasa III de ARN.

En los ejemplos mostrados a continuación, las células progenitoras se cotransfectaron con un vector que contenía el gen neo y la selección inicial se realizó cultivando en un medio que contenía geneticina. Es evidente, por supuesto, que se pueden utilizar otros marcadores selectivos. Después de la selección inicial, se aíslan las células supervivientes, se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión del gen rep (p. ej., en el caso de promotores inducibles, los que incluyen un agente de inducción en el medio de cultivo), se cosechan y se somete a ensayo la producción de Rep78. Se puede utilizar la transferencia de tipo Western u otros ensayos adecuados. Los clones que producen Rep78 se expanden para producir las líneas celulares inventivas (la expresión "línea celular" incluye la progenie (subclones) de una línea original). La estabilidad se manifiesta por la capacidad de producir Rep78 durante al menos 12 meses y más de aproximadamente 50 pases. El nivel de producción de proteína Rep78 por las células es suficiente para permitir el uso de las células para empaquetar vectores de AAV recombinantes. Según el método de la invención, los vectores empaquetados se han medido en el material sobrenadante con unos títulos en el intervalo de 2,8 x 10^{7} hasta 1,4 x 10^{8} partículas víricas por milímetro. Estos títulos del material sobrenadante se comparan muy bien con la técnica anterior, aunque en la técnica anterior general se describen niveles después de procedimientos de concentración.

Las líneas celulares de empaquetamiento de la invención se emplean para empaquetar vectores de AAV recombinante del modo siguiente.

El vector recombinante de AAV comprende las regiones de ITR de AAV y un promotor de la transcripción ligado funcionalmente a un polinucleótido diana. El promotor de la transcripción que está ligado al polinucleótido diana, permite la formación de transcritos e incluye, por ejemplo, promotores sin AAV, así como promotores de AAV tales como p_{5}, p_{19} y p_{40} y promotores de ITR de AAV. La transcripción y/o los productos de la traducción del polinucleótido diana se emplean preferentemente en la terapia génica. Por tanto, los polinucleótidos diana incluyen genes que se suministran para la terapia génica, por ejemplo, los que codifican cadenas de subunidades de hemoglobina, enzimas, proteínas tales como el regulador de la conducción transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) y similares. Los polinucleótidos diana también pueden ser polinucleótidos que cuando se transcriben tiene actividad como moléculas de hebra complementaria, como cebos que se unen a factores de la transcripción o de la traducción, como ribozimas y similares. Los polinucleótidos diana también incluyen genes que codifican moduladores de la respuesta inmune tales como citoquina y genes del complejo principal de histocompatibilidad. Otra clase de polinucleótidos que se puede emplear para la terapia génica son genes que vuelven a la célula receptora susceptible a fármacos específicos, tales como el gen de la quinasa de timidina del virus herpes y los genes de resistencia a metotrexato y la reductasa de dihidrofolato mutada. Otro polinucleótido diana es el ADNc supresor tumoral de p53 de tipo silvestre para la terapia por sustitución del gen p53 perdido o dañado que está asociado con cáncer de pulmón, de mama y con otros tipos de cáncer.

Las células se infectan con un virus auxiliar, tal como adenovirus o virus herpes y a continuación se transfectan con el vector. Se pueden emplear otros medios para introducir el vector, p. ej., la electroporación. Una función complementaria a la cápsida de AAV se proporciona cotransfectando las células con un vector que es capaz de expresar el gen cap de AAV. El vector complementario puede expresar el gen cap desde un promotor de AAV homólogo tal como el promotor p_{40} o desde un promotor heterólogo. Alternativamente, el gen cap de AAV puede estar incluido en el vector primario, eliminando de este modo la necesidad de un vector complementario. Para evitar el desarrollo de AAV de tipo silvestre, el vector de transfección de AAV no debe tener una homología solapante con secuencias de AAV ya presentes en las células infectadas con el virus auxiliar.

Después de la transfección, las células se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión de los genes rep y cap y la replicación de AAV. Si el gen rep está ligado funcionalmente a un promotor inducible, un agente de inducción adecuado se incluye en el medio. Se deja crecer las células típicamente durante 2-5 días, se preparan los lisados y se purifican las partículas del vector recombinante de AAV mediante métodos conocidos en la técnica.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención. No pretenden limitar la invención de ningún modo.

La línea celular neo6, descrita a continuación, fue depositada el 9 de noviembre de 1993 en la "American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn DR., Rockville, Maryland 20852, y se le ha asignado el número de orden CRL 11484. El depósito se realizó bajo los términos del Tratado de Budapest. Después de la asignación y la expedición de esta solicitud como una Patente de Estados Unidos, se eliminarán irrevocablemente todas las restricciones sobre la disponibilidad del depósito; y será posible el acceso a los depósitos mencionados mientras que la solicitud mencionada anteriormente esté en tramitación hasta la autorización determinada por el responsable según 37 CFR \NAK 1.14 y 35 USC \NAK 1.22. Además, los depósitos mencionados se mantendrán durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha del depósito, o durante cinco (5) años después de la última petición de depósito; o durante el periodo vigente de la patente de EE.UU., sin importar cuál es más largo. Los materiales depositados mencionados en esta memoria sólo pretenden ofrecer una comodidad y no son necesarios para la puesta en práctica de la presente invención, de cara a las descripciones de esta memoria y, además, estos materiales se incorporan a esta memoria como referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de Plásmidos

Para la construcción, el crecimiento y la purificación de los plásmidos se siguieron procedimientos convencionales (Ausubel y col. (compiladores) 1987. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.). El adenovirus de tipo 2 se empleó con una multiplicidad de la infección (MOI) de 5. El plásmido pMtrep (Fig. 1) contiene el gen rep de tipo silvestre desde el desoxirribonucleótido 263 hasta 2233 del genoma de AAV ligado funcionalmente a un fragmento de ADN de 1,9 kpb procedente del gen de la metalotioneína I de ratón que contiene un promotor de la transcripción inducible con metales pesados (Hamer y Walling. 1982. J. Mol. Appl. Genet. 1:273-288; Yang y col. 1992. J. Virol. 66:6058-6069). El plásmido pCDMrep contiene la misma secuencia del gen rep insertada en el vector pCDM8 (Invitrogen Corp.) (Yang y Trempe. 1993. J. Virol. 67:4442-4447).

El plásmido p\DeltaMtrep se construyó realizando una digestión parcial con KpnI de pMtrep y aislando un fragmento de 2725 pb que contenía el promotor de la metalotioneína I de ratón desde el sitio KpnI a -650 pb del sitio de comienzo de la transcripción hasta 69 pb aguas abajo del sitio de comienzo, aproximadamente a 18 pb de la secuencia del polienlazador pGEM3Z (desde los sitios HindIII hasta XhoI), las secuencias del gen rep d AAV contenidas en el fragmento de la endonucleasa de restricción AvaI desde 263-2233 en el genoma de AAV y aproximadamente a 21 pb de la secuencia del polienlazador pGEM3Z (desde los sitios XhoI hasta KpnI). El fragmento KpnI de 2725 pb se insertó en sitio KpnI del plásmido pAW1 para crear p\DeltaMtrep. El plásmido pAW1 se creó insertando un fragmento KpnI a SnaBI de 336 pb, que contenía la señal de poliadenilación de AAV procedente de pAV2 en los sitios EcoRI a KpnI de pGEM3Z, después de que el sitio EcoRI había sido convertido en un extremo romo con el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN de E. coli. Por tanto, p\DeltaMtrep contiene 69 pb de la secuencia líder del ARNm de la metalotioneína de ratón y los elementos reguladores inmediatamente aguas arriba que permiten la inducción con metales pesados, pero p\DeltaMtrep carece de los elementos potenciadores del promotor aguas arriba.

El plásmido pJDT279 contiene el genoma completo de AAV2 pero con una mutación por cambio del marco de lectura en el gen rep, en el sitio SstI, en el nucleótido 814 (Tratschin y col. 1984. J. Virol. 51:611-619). El plásmido pSV2neo ha sido descrito previamente (Southern y Berg. 1982. J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341).

Ejemplo 2 Producción de líneas celulares inducibles que expresan proteínas Rep

Las células 293 humanas (Graham y col. 1977. J. Gen. Virol. 36:59-72) se dejaron crecer en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) suplementado con antibióticos y 10% de suero bovino fetal. Todas las transfecciones del ADN se realizaron en cultivos que eran confluentes en 50-70%, empleando el método del fosfato cálcico un día después de la extensión de las células sobre las placas de cultivo (Ausubel y col. (compiladores) 1987. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.).

La inhibición de la proliferación celular mediada por el gen rep de AAV ha evitado el desarrollo de líneas celulares que expresan niveles significativos de proteínas Rep. Para sortear estos efectos antiproliferativos, el gen rep se ligó funcionalmente al promotor inducible de la transcripción de la metalotioneína I (Mt) de ratón (Yang y col., 1992. J. Virol. 66:6058-6069). El fragmento del promotor Mt empleado en la construcción de p\DeltaMtrep contiene 64 pb del primer exón del gen de la metalotioneína hasta -650 en el promotor. Este promotor tiene una expresión del nivel basal reducida pero conserva su inducibilidad con metales pesados (KARIN). p\DeltaMtrep y pSV2neo se cotransfectaron en células 293 y se empleó geneticina para seleccionar las células que habían adquirido y expresado el gen neo. Los clones resistentes a la geneticina se escrutaron en busca de producción de proteínas Rep después de la inducción. Se cotransfectaron 2 x 10^{5} células 293 humanas en placas de 35 mm con 2 \mug de pSV2neo y 6 \mug de p\DeltaMtrep. Las líneas celulares inducibles se dejaron crecer en medio MEM que contenía FBS dializado al 10% y 1 mg/ml (600 \mug/ml de componente activo) de geneticina (Sigma Chem. Co.). Todas las células se mantuvieron como un cultivo en monocapa a 37ºC en una atmósfera con CO_{2} al 5%. Dos días después, se tripsinizaron las células, se diluyeron y se extendieron en placas de 100 mm para permitir el crecimiento de clones de células aisladas. El medio selectivo que contenía 0,6 mg/ml del componente activo geneticina (Sigma Chemical Corp.) en MEM se puso sobre las células 48 h después.

Los cultivos se dejaron crecer en medio selectivo durante 10 a 14 días, después de lo cual se aislaron las colonias supervivientes, se cultivaron y se sometieron a ensayo en busca de expresión de la proteína Rep. Para inducir la expresión de la proteína Rep, el medio de cultivo celular se ajustó con CdSO_{4} 2 \mum y ZnCl_{2} 100 \mum, 16-24 h antes de cosechar los cultivos y analizar la expresión de la proteína Rep. Se realizaron análisis de transferencia de tipo Western para detectar la expresión de Rep, empleando antisuero específico de Rep (Trempe y col. 1987. Virology 161:18-28) tal y como se describe a continuación. Un clon, Neo6, se encontró que expresaba cantidades significativas de Rep78, tal y como se determinó por los ensayos de transferencia de tipo Western empleando antisuero anti-Rep (Fig. 2). Otro clon resistente a la geneticina, neo5, no expresaba ninguna proteína Rep detectable después de la inducción. La inmunofluorescencia indirecta de las células Neo6 indicaba que entre 30-70% de las células eran positiva para la expresión de la proteína Rep (Yang y Trempe, datos no publicados).

En un intento de obtener un mayor porcentaje de células positivas para Rep, se subclonaron células Neo6 limitando la dilución. La subclonación de Neo6 generaba clones Neo34, Neo36, Neo39 y Neo40, los cuales producían todos niveles significativos de Rep78 cuando se inducían (Fig. 2). Aunque el clon Neo34 no se muestra en esta transferencia de tipo Western, éste produce Rep78 con un nivel comparable al de Neo6 (Yang y Trempe, ibidem). La proporción de células que expresan proteínas Rep entre los subclones era comparable a la de células Neo6 progenitoras (aproximadamente 60%) tal y como se podía juzgar por inmunofluorescencia, y la tinción también se confinó al núcleo (Yang y Trempe, ibidem).

Extracción de proteínas y análisis

Se indujeron 3 x 10^{5} células resistentes a la geneticina en placas de 35 mm para la expresión de proteínas Rep. Las proteínas Rep de las líneas celulares o de las células transfectadas se extrajeron de los núcleos en NaCl 200 mM en tampón STM-NP, tal y como se ha descrito previamente (Yang, ibid). Los extractos proteicos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12,5% y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western tal y como se ha descrito previamente (Yang y col., 1992, J. Virol. 66:6058-6069) o se emplearon en ensayos de cambios de la movilidad en gel.

Ensayo de cambios de la movilidad en gel

Rep78 media en la replicación del ADN de AAV uniendo las secuencias de la repetición terminal de AAV que existen en una configuración de horquilla y esta característica se puede emular in vitro (Asktorab y Srivastave. 1989. J. Virol. 63:3034-3039; Im y Muzyczka. 1989. J. Virol. 63:3095-3104). Los siguientes ensayos de unión de la horquilla se realizaron para establecer que Rep78 procedente de células Neo6 es funcional. Se emplearon 5.000 cpm de horquilla de AAV radiomarcada en cada reacción. La Fig. 3 muestra un ensayo de unión de la horquilla de AAV con extractos nucleares de Neo5, Neo6 y células transfectadas con el plásmido del gen rep de tipo silvestre. La proteína Rep78 producida por células Neo6 inducidas se unía eficazmente a la horquilla radiomarcada; mientras que no se observó un cambio en la movilidad con extractos nucleares de células Neo6 no inducidas. Esto es compatible con los análisis de transferencia de tipo Western de las células Neo6, en donde no se detectó Rep78 en ausencia de inducción (Fig. 2). La banda desplazada se puede eliminar con la adición de un exceso de horquilla de AAV no marcada o se puede superdesplazar mediante un anticuerpo contra las proteínas Rep (Yang y Trempe, datos no publicados).

Como testigo positivo para estos ensayos de cambios de la movilidad, se prepararon extractos nucleares a partir de células 293 transfectadas con pCDMrep que se sabe que contienen Rep78 que se une eficazmente a las secuencias de la repetición terminal de AAV (Yang y Trempe, 1993. J. Virol. 67:4442-4447). Los extractos nucleares de las células 293 transfectadas con pCDM8 o el clon Neo5 testigo, fallaron para cambiar la estructura de la horquilla. La unión de la proteína Rep78 al ADN radiomarcado de la horquilla de AAV se realizó tal y como se ha descrito previamente (Yang y Trempe, ibidem). Rep78 producida por estas líneas celulares después de la unión tiene movilidades similares a las de Rep78 de células 293 humanas transfectadas con pMtrep y las proteínas unidas aparecen en forma de doblete, tal y como han observado otros (Im y Muzyczka. 1992. J. Virol. 66:1119-1128).

La forma predominante de la proteína Rep expresada en estas células es Rep78. Esto puede ser debido a la ausencia de infección con virus auxiliar que permite un corte y empalme eficaz del ARNm de AAV, el cual a su vez limitará la síntesis de Rep68 (Trempe y Carter. 1988. J. Virol. 62:3356-3363). La falta de expresión de Rep52 también puede ser debida a la ausencia de infección con adenovirus lo que ha mostrado que incrementa la expresión de p_{19} (Tratschin y col., 1984. Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081) o la carencia de secuencias de la repetición terminal de AAV lo que también tiene un efecto estimulador sobre la expresión de p_{19} (Beaton y col., 1989. J. Virol. 63:4450-4454).

Replicación del ADN de AAV y ensayos de empaquetamiento

Para determinar la replicación del ADN de AAV, se transfectaron 2 \mug de pJDT279 en las líneas celulares indicadas en presencia de coinfección con adenovirus de tipo 2 (MOI = 5). Dos días después de la transfección, se preparó ADN sobrenadante de Hirt (Hirt, 1967. J. Mol. Biol. 26:365-369). El ADN se digirió a continuación con DpnI, se separó por electroforesis en gel de agarosa, se transfirió a papel de filtro de nitrocelulosa, se hibridó con una sonda radiomarcada del gen cap de AAV y se procesó por autorradiografía empleando técnicas convencionales (Ausubel y col. (compiladores) 1987. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.). La sonda de hibridación era un fragmento cortado con la endonucleasa de restricción HincII, procedente de pJDT279 que contenía secuencias desde 2397 hasta 3981 del genoma de AAV.

Ejemplo 3 Empaquetamiento de vectores de AAV recombinantes

En los métodos convencionales para producir partículas de AAV mutantes e infecciosas se emplean cotransfecciones de un plásmido del vector de AAV que contiene los orígenes víricos de replicación y un plásmido que contiene los genes rep y cap de AAV. Una limitación de este método es que si no hay ninguna secuencia homóloga compartida entre los dos plásmidos cotransfectados, tiene lugar una recombinación sustancial dando como resultado la producción de AAV de tipo silvestre. Por tanto, hay que tener precaución para evitar homologías solapantes entre los dos plásmidos transfectados.

pYT45 contiene las secuencias de la repetición terminal de AAV, el gen cat bacteriano dirigido por el promotor de la transcripción p5 de AAV y la señal de poliadenilación de AAV (Khlief y col. 1991. Virology 181:738-741). Para el empaquetamiento de pYT45 en un virión infeccioso, se empleó p1097cap para proporcionar las secuencias del gen cap que aportan las proteínas de la cápsida para ensamblar el virión de AAV. p1097cap no produce ninguna de las proteínas Rep debido a la falta del promotor de la transcripción p5 y un enlazador de oligonucleótidos XhoI de 12 pb que se inserta en el nucleótido 1097 de las secuencias del gen rep de AAV. p1097cap contiene secuencias de AAV desde el nucleótido 263 hasta 4493 insertadas en el plásmido pGEM3Z (Promega Corp.).

Para el empaquetamiento de las secuencias de pYT45, se cotransfectaron 10 \mug de p1097cap y 5 \mug de pYT45 sobre 5 x 10^{5} células de cada línea celular, que habían sido infectadas con adenovirus e inducidas con sales de cadmio y de zinc. Dos días después de la transfección, el pYT45 empaquetado, vYT45, se cosechó tal y como se ha descrito anteriormente y se empleó para infectar nuevos cultivos (5 x 10^{5} células) de las mismas líneas celulares a partir de las cuales se habían obtenido, después de haber inducido los cultivos con metales pesados y haber infectado con adenovirus. Dos días después de la infección, se cosecharon los cultivos, se prepararon los extractos y la mitad del extracto de 5 x 10^{5} células, se empleó para los ensayos con la enzima Cat (Ausubel y col. (compiladores) 1987. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.). El porcentaje de acetilación del cloramfenicol se determinó por recuento del centelleo de las placas en cromatografía de capa fina.

Para empaquetar el mutante del gen rep AAVs, se transfectaron 10 \mug de pJDT279 en 5 x 10^{5} células productoras de Rep infectadas con adenovirus, que se habían inducido con metales pesados. Dos días después, se cosecharon los cultivos raspando las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía MgCl_{2} 5 mM, se congelaron y se descongelaron tres veces, se calentaron a 60ºC durante 30 minutos para inactivar el adenovirus y a continuación se trataron durante 30 minutos a 37ºC con 100 unidades/ml de ADNasaI pancreática (Sigma Chemical Corp.). El extracto se centrifugó a 10.000 x g durante 20 minutos a 4ºC, y el material sobrenadante se empleó para las infecciones posteriores. Los extractos se utilizaron para infectar nuevos cultivos (5 x 10^{5} células) de las mismas líneas celulares a partir de las cuales se habían obtenido, después de que los cultivos se habían inducido con sales de cadmio y de zinc, tal y como se ha descrito anteriormente y se infectaron con adenovirus. Dos días después, se cosecharon los cultivos, se realizaron preparaciones de ADN Hirt y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa e hibridaciones de transferencias de tipo Southern con la misma sonda radiomarcada del gen cap que se empleó para los ensayos de replicación del ADN.

Para determinar si las líneas celulares inducibles con Rep eran capaces de producir una progenie infecciosa, portadora de una mutación en el gen rep, el plásmido pJDT279 se transfectó en las líneas celulares inducidas con metales pesados que se habían infectado con adenovirus. Dos días más tarde, se cosecharon los cultivos y se prepararon extractos celulares en bruto tal y como se ha descrito anteriormente. Los extractos se utilizaron a continuación para infectar nuevos cultivos que se habían inducido con metales pesados y se habían infectado con adenovirus. Dos días más tarde, se cosecharon los cultivos, se realizaron preparaciones de ADN Hirt y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y las hibridaciones de las transferencias de tipo Southern se analizaron con una sonda del gen cap radiomarcada. En la Fig. 4, la pista pMtrep contiene ADN de células 293 que se habían infectado con vJDT279 que se había producido por cotransfección de pMtrep y pJDT279 en las células 293 infectadas con adenovirus. La pista pJDT279 contiene una digestión parcial con BglII del plásmido, que produce un plásmido linealizado y ADN con longitud de monómero. Las posiciones de la forma replicativa dímera (D) y monómera (M) y los ADNs monocatenarios (SS) están indicados. Según la Fig. 4, es evidente que todas las líneas celulares productoras de Rep dirigían el conjunto de AAV infecciosos que contenían un gen rep mutante. (La forma replicativa (RF) del ADN monómero se podía observar en la pista de Neo40 después de una exposición más larga de la autorradiografía).

Los virus no infecciosos se amplificaron en ausencia de inducción, indicando que no había una producción detectable de virus de tipo silvestre durante la transfección inicial. Tal y como se esperaba, las células Neo5 no producían ningún virus infeccioso bajo condiciones de inducción o de no inducción. Como testigo para estos experimentos, pMtrep se cotransfectó con pJDT279 en células 293 infectadas con adenovirus y se cosecharon los virus de la progenie. Después de una infección posterior de las células 293 infectadas con adenovirus, es evidente que el AAV de tipo silvestre era generado a partir de la cotransfección inicial de pJDT279 y pMtrep, se observó una cantidad significativa de ADN RF, lo que es indicativo de recombinación entre las secuencias comunes del gen rep entre pMtrep y pJDT279. Estos experimentos indican que las líneas celulares productoras de Rep proporcionan un método mejorado para generar virus infecciosos mutantes en el gen rep, sin producir AAV de tipo silvestre por recombinación.

Ensayo de crecimiento con MTT

Se hizo una comparación de las tasas de crecimiento con condiciones inducidas o no inducidas, para células neo5, neo6 y neo40 empleando ensayos de inhibición del crecimiento con MTT.

Se sembraron 1 x 10^{3} células Neo5, Neo6 o Neo40 en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Veinticuatro horas después de extender las placas, se cambió el medio de la mitad de los cultivos para incluir sales de cadmio y de zinc. Los días 2, 4, 8 y 12 después de la extensión en placas, se reemplazó el medio con MEM exento de suero y exento de rojo de fenol que contenía 0,05 mg/ml de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil tetrazolio; Sigma Chemical Co.). Los cultivos se incubaron a continuación durante 4 h adicionales a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%. A continuación se retiró el medio por aspiración y los cultivos se trataron con 200 \mul de solución de detención (HCl 0,04 N en isopropanol). Las placas se agitaron vigorosamente durante una hora para disolver los cristales de formazano. Se determinó la absorbancia (a 595 nm) de la solución de detención. Las soluciones de material MTT se prepararon disolviendo en primer lugar MTT en PBS, pH 7,5, hasta una concentración de 5 mg/ml. La solución se filtró con filtros de jeringuilla de 0,45 \mu para eliminar cualquier cristal no disuelto.

Después de la inducción de la expresión del gen rep, las células neo6 y neo40 crecieron mucho más despacio que en los cultivos no inducidos (Fig. 6). Por el contrario, las células neo5 testigos no fueron inhibidas por la inducción con metales pesados. Entre los días ocho y doce, las células neo6 y neo40 parecían volver a crecer de nuevo. Esto podía ser debido a la pérdida de la expresión de la proteína Rep o a la aclimatación celular a la presencia de proteínas Rep. La tinción inmunofluorescente que empleaba anticuerpos anti-Rep de los cultivos inducidos hasta catorce días después de la inducción, revelaba que el 50-60% de las células todavía contenían proteína Rep (Yang y Trempe, datos no publicados). Este porcentaje es similar al de las células neo6 o neo40 después de dos días de inducción.

Ejemplo 4 Producción de líneas celulares estables

Las líneas celulares Neo6 y Neo40 se habían cultivado durante más de diez meses y más de 50 generaciones. La capacidad de estas células para producir las proteínas Rep después de la inducción, no disminuye durante ese periodo de tiempo. Ambas líneas celulares mantienen la capacidad de inducción y no hay un cambio en la población de células que son sensibles a la inducción con metales pesados, tal y como se mide por la producción de proteína Rep (Yang y Trempe, datos no publicados). Un periodo crítico en el desarrollo de las líneas celulares se observó en el pase 10 a 15, durante este periodo de tiempo las células de las líneas celulares inducibles no se podían tripsinizar y se volvían a extender en placas con baja densidad (más de una dilución 1 a 3). Después de este periodo de crisis, los clones se podían mantener como líneas celulares establecidas con la excepción del subclon Neo34, que no se pudo cultivar más de 20 pases. El clon Neo34 expresaba cantidades detectables de proteína Rep y se comportaba de forma similar en ensayos funcionales a otros clones (Yang y Trempe, datos no publicados).

Ensayo de la eficacia de formación de colonias (CFE)

La presencia de secuencias de ADN de AAV da como resultado unas propiedades de crecimiento alteradas en las células infectadas, y en algunos casos, una detención del crecimiento celular. Para determinar los efectos de la proteína Rep sobre las líneas celulares, se determinaron las tasas de crecimiento y la eficacia de formación de colonias de las líneas celulares neo5, neo6 y neo40. El tiempo de duplicación de las células inducibles con Rep (medido por la exclusión de azul de tripano) indicaba que se multiplicaban más lentamente que las células neo5 con un tiempo de duplicación de aproximadamente 35 horas para neo5, 43 horas para neo6 y 50 horas para neo40 (Yang y Trempe, datos no publicados).

1 x 10^{3} células Neo5, Neo6 y Neo40 se extendieron en placas de 6 cm en forma restringida, por triplicado para someter a ensayo su eficacia de clonación en presencia y en ausencia de expresión de la proteína Rep. Dos de los tres cultivos en cada grupo contenía sales de cadmio y de zinc en el medio, y el tercero contenía un medio normal. Después de 14 días de incubación, el cultivo no inducido y un cultivo inducido de cada grupo se fijaron en formaldehído al 18% en PBS y se tiñeron con violeta de cristal, tal y como se ha descrito previamente (Yang y col. 1992. J. Virol. 66:6058-6069). El medio que contenía metales pesados en el tercer cultivo en cada grupo, se sustituyó por medio normal y estos cultivos fueron incubados durante 14 días adicionales. Estos cultivos de 28 días se fijaron a continuación y se tiñeron y se contó el número de focos. Se contaron los focos mayores de 2 mm.

La inducción con metales pesados (acompañada por síntesis de Rep) tenía un efecto inhibidor moderado sobre la CFE de las células neo5 (Fig. 5). Dos semanas después de la incubación, se tiñeron las placas inducidas (B, D, G) y las no inducidas (A, C, F). El resto de las placas (E, H) se cultivaron de nuevo en medio normal durante dos semanas adicionales y después se tiñeron. Sin embargo, el crecimiento de las células que expresaban Rep78 se redujo drásticamente en presencia de inducción. Para las células neo6 y neo40 había una reducción del CFE superior al 90% en presencia de Rep78. Cuando se expresaba Rep78, muy pocas colonias de neo6 y neo40 formaban focos que fueran visibles sin ampliación.

El examen microscópico de las placas antes de la tinción revelaba que las células que no crecían en grupos eran morfológicamente normales (Yang y Trempe, datos no publicados). Algunos de los focos grandes de las células neo6 inducidas, se cultivaron de nuevo (con inducción) y se sometieron a ensayo mediante inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpo específico de Rep para determinar si conservaban la capacidad de expresar proteína Rep. Todos los clones sometidos a ensayo mostraban niveles similares de inmunofluorescencia como las células neo6 que se habían inducido durante dos días (Yang y Trempe, datos no publicados).

Análisis por citometría de flujo

La proteína Rep78 de AAV inhibe la replicación del ADN de SV40 en células 293 y COS-1 y la síntesis de ADN celular en células NIH3T3 (Yang y col. Manuscrito presentado a J. Virol.). La inhibición puede ser debida a una interferencia directa de la replicación del ADN celular o a una inhibición de la progresión del ciclo celular por la proteína Rep. Para investigar estas dos posibilidades, se realizó citometría de flujo en las líneas celulares inducibles del modo siguiente. 2 x 10^{6} células Neo6, neo40 y células neo5 testigos se extendieron en placas de 15 cm en presencia o en ausencia de metales pesados. Después de 72 horas de incubación, las células se lavaron con PBS y se almacenaron en nitrógeno líquido en tampón citrato (sacarosa 250 mM y citrato sódico 40 mM) que contenía DMSO al 5%, a una concentración de 5 x 10^{6} células/ml. La tinción con yoduro de propidio se realizó tal y como se ha descrito (Vindelov y col., 1983. Cytometry 3:323-327). La citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo de Colter. La población de células en diferentes fases del ciclo celular se calculó con una determinación polinómica de segundo orden, empleando un programa de Multicycle, descrito por Peter S. Rabinovitch (Phoenix Flow System).

La Tabla 1 resume los resultados. Los metales pesados no tienen efecto sobre la progresión del ciclo celular en células neo5, tal y como se muestra por los porcentajes similares de células en las fases G1, G2 y S del ciclo celular (Tabla 1). El clon neo40, sin embargo, mostraba un incremento significativo del número de células en la fase S cuando la proteína Rep estaba inducida. Las células Neo6 también mostraban un incremento modesto de células en la fase S después de la inducción. Sin inducción, las células neo5 tenías menos células en la fase S que las células neo40 o neo6. Este efecto puede ser debido a bajos niveles de proteína Rep que permanece indetectable en el estado no inducido. Si es así, un bajo nivel de proteína Rep expresada con un promotor de metalotioneína no inducido, puede ejercer un efecto inhibidor. No se observó un pico agudo en ningún punto de la fase S. Al contrario, el incremento estaba distribuido por todo el proceso de síntesis de ADN, indicando que Rep78 no introduce un bloqueo del ciclo pero acelera el progreso de la célula a través de la fase de síntesis de ADN. Estos resultados sugieren que los efectos antiproliferativos de las proteínas Rep son probablemente la consecuencia de la inhibición o la ralentización de la síntesis de ADN, en lugar de la introducción de un bloqueo del ciclo celular en las fases G1, G2 o M.

TABLA 1. Distribución del ciclo celular de clones inducidos y no inducidos*

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}[t]{155mm}* Las líneas celulares indicadas se
extendieron en placas con una densidad de  2 x 10 ^{6}  células en
ausencia (-) o en presencia (+) de sales de metales  pesados sobre
placas de 15 cm. 72 h después de la extensión en placas, se 
cosecharon las células tal y como se ha descrito en el texto y se
analizaron por  citometría de flujo. Se proporcionan los porcentajes
de células en las fases  indicadas del ciclo celular  \pm 
desviación típica. Los resultados son una  compilación de cuatro
experimentos.\end{minipage} \cr}

Claims (10)

1. Una línea celular de mamífero estable que posee un gen rep del virus adeno-asociado (AAV), ligado funcionalmente a un promotor heterólogo inducible, siendo capaz la línea celular de expresar la proteína Rep funcional.

2. Una línea celular según la reivindicación 1, que se obtiene a partir de células 293 humanas.

3. Una línea celular según las reivindicaciones 1 a 2, en donde el promotor es un promotor del gen I de la metalotioneína de múridos.

4. Una línea celular según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el promotor consta de un fragmento del gen I de la metalotioneína de múridos, desde aproximadamente -650 pb desde el sitio de inicio de la transcripción del gen hasta 69 pb aguas abajo del sitio.

5. La línea celular Neo6 depositada en la ATCC con el número de orden CRL 11484.

6. Un método de empaquetamiento de un vector de AAV recombinante sin producción de AAV de tipo silvestre, comprendiendo el método: cultivar una línea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, bajo condiciones que permiten la expresión de los genes rep y cápsida de AAV, en donde la línea celular está infectada con un virus auxiliar y el vector de AAV recombinante ha sido introducido en la línea celular, careciendo el vector de AAV de homología solapante con secuencias de AAV en la línea celular y teniendo un gen funcional de la cápsida de AAV o estando complementado con un segundo vector que tiene un gen funcional de la cápsida de AAV, en donde el vector de AAV recombinante está empaquetado.

7. Un método según la reivindicación 6, en donde la introducción del vector de AAV recombinante es mediante transfección con un plásmido que contiene el vector de AAV recombinante.

8. Un método según la reivindicación 6, en donde la introducción del vector de AAV recombinante es mediante infección con una partícula de AAV que contiene el vector de AAV recombinante.

9. Un método para infectar una línea celular con una partícula de AAV recombinante, comprendiendo el método:

(a) infectar la línea celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la línea celular está infectada con un virus auxiliar, con la partícula de AAV recombinante, conteniendo la partícula un vector que tiene un gen funcional de la cápsida de AAV o estando complementado con un segundo vector que tiene un gen funcional de la cápsida de AAV; y

(b) cultivar las células infectadas bajo condiciones que permiten la expresión de los genes rep y cápsida de AAV.

10. Un método para producir una línea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el método:

(a) seleccionar una célula que produce de forma estable la proteína Rep a partir de las células de una línea celular de mamífero capaz de ser infectada con AAV, en donde la línea celular ha sido transfectada con un vector de AAV que tiene el gen rep de AAV ligado funcionalmente a un promotor heterólogo inducible y en donde las células transfectadas se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión del gen;

(b) dejar crecer la célula para producir la línea celular.