ES2647849T3 - Compuestos de pirido[2,3-d]pirimidin-4-ona como inhibidores de la tanquirasa - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula: **Fórmula** en la que: Y es:**Fórmula** X es -CH2-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-; R1 es hidrógeno, hidroxi, o halo; R2 es hidrógeno, halo, -CN, -CH3, CF3, o -OCH3; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Compuestos de pirido[2,3-d]pirimidin-4-ona como inhibidores de la tanquirasa

La señalización de Wnt desencadena tres cascadas de señalización intracelular que incluyen la ruta canónica mediada por l3-catenina, la pOlaridad de célula plana no canónica y la ruta Wntlcalcio. La ruta de señalización Wnt canónica conservada evolutivamente regula muchos procesos celulares, que incluyen la proliferación, diferenciación, adhesión y mantenimiento celular. La ruta canónica, que regula los niveles de proteina l3-catenina dentro de las células, se inicia cuando los ligandos Wnt se enlazan a los coreceptores (LRP)516 de proteínas relacionadas con el receptor de Frizzled y lipoproleina de superficie celular, que a su vez promueven el desplazamiento de la quinasa GSK3 del complejo de destrucción APC/Axin/GSK-3 (poliposis adenomalosa coli (APC), Axin, glucógeno sintasa quinasa 30113 (GSK3». En presencia de enlazamiento de Wnt (estado activo), se activa Desorientada (una proteína en la ruta Wnt) que, a su vez, recluta GSK3 lejos del complejo de destrucción que conduce a la acumulación de 13catenina citosólica, translocación de l3-catenina al núcleo, interacción con factores de transcripción de la familia del factor de células T/factor potenciador linfoide (TCF/LEF) y transcripción de genes sensibles a la ruta canónica Wnl. En ausencia de ligandos de Wnt (estado desactivado), la l3-catenina cilosólica se fosforila constitutivamente y es direccionada a ubiquitinación y degradación por el proleosoma.

Las dos isoformas de tanquirasa humana altamente homólogas, la tankyrasa 1 y 2 (TNKS1 y TNKS2) son miembros de la familia de enzimas poli(AOP-ribosa)polimerasa (PARP) que catalizan la modificación postraduccional de las proteínas usando 13 NAO+ como sustrato para sucesivamente añadir fracciones AOP ribosa sobre proteínas diana (parilación o parsilación). Uno de los sustratos proteicos para las tanquirasas es Axin, un componente limitante de la concentración del complejo de destrucción de P-catenina; la parsilación marca Axin para la degradación y la inhibición de la tanquirasa conduce a la estabilización de Axin, a la inhibición de la señalización de Wnt y a la degradación de la l3-catenina.

Las mutaciones que activan la ruta de señalización Wnt se encuentran en una amplia gama de cánceres y se cree que contribuyen a la iniciación, mantenimiento yfo progresión del tumor. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de la tanquilasa parece ser un enfoque prometedor en el tratamiento de cánceres tales como cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de mama (incluido el cáncer de mama triple negativo), cáncer de ovario, meduloblasloma, melanoma, cancer de pulmón (incluido cancer de pulmón de células pequeñas), cancer de páncreas, cáncer de próstata, glioblasloma, linfoma de células T, linfoma T-linfoblástico, leucemia linfocítica aguda de células T (ALL), linfoma de células del manto, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica y leucemia mieloide aguda

Se han realizado esfuerzos considerables para identificar agentes farmacéuticos que inhiban la ruta de señalización canónica de Wntll3-calenina. Se conocen inhibidores de TNKS1 y TNKS2 tales como WO 2013f117288.

A pesar del documento WO 2013f117288, existe la necesidad de encontrar compuestos que tengan actividad inhibidora de TNKS1 y TNKS2. Existe una necesidad adicional de encontrar compuestos que tengan inhibición selectiva de TNKS1 y TNKS2 sobre otros PARP

La Figura 1 es un patrón representativo de XRPO para la sal de ácido 8-Metil-2-[4-(pirimidin-2-ilmetil)piperazin-1-il)3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona 4-metilbencenosulf6nico, el compuesto del Ejemplo 6.

Un aspecto de la presente invención son compuestos de Fórmula 1:

y,X~Nl CH

~NyN'",I' HN~

O

en la que·

y es:

X es -CHz-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-; R' es hidrógeno, hidroxi, o halo;

2 R2 es hidrógeno, halo, -CN, -CH3, CF3, o -OCH3;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo . Preferiblemente, un aspecto adicional de la presente invención proporciona compuestos de Fórmula I en la que: Y es:

o

X es -CH2-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-; R1es hidrógeno, hidroxi, o halo; R2es hidrógeno, halo, -CN, -CH3, CF3, o -OCH3;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .

10 Preferiblemente, otro aspecto de la presente invención proporciona compuestos de Fórmula I en la que· Yes

X es -CH2-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-; 2

Res hidrógeno, halo, -eN, -CH3, CF3, o -OCH3;

15 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo Otro aspecto preferido de la presente invención proporciona compuestos de Fórmula I en la que: Yes o

R(YI',

N

R'

X es -CH2-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H.; 20 R1 es hidrógeno, hidroxi, o halo; R2es hidrógeno, halo, -CN, -CH3, CF3, o -OCH3;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Un aspecto preferido de la presente invención es un compuesto: 8-Metil-2-[4-(pirimidin-2-ilmetil)piperazin-1-il]3,S,6,7-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; 8-Metil-2-[4-(1

25 pirimidin-2-iletil)piperazin-1-il)-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; 2-[4-[(4-Cloropiri mid in-2 -il)metil)piperazin-1-il]-8-metil-3 ,5,6,7 -tetrahidropirido[2 ,3-d]piri mid in-4-ona, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o 2-[4.[(4.metoxipirimidin-2-il)metil]piperazin-1-il]-8-melil-3,5,6,7tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona, o una sal farmacéulicamente aceptable del mismo

Otro aspecto preferido de la presente invención es un compuesto: 2-[4-[(3-Bromo-2-piridil)metil]piperazin-1 -il]-8-metil

30 3,S,6,7-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; 2-[4-[(3-Cloro-2piridil)metil)piperazin-1-il]-8-metil-3,S,6,7-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; 2-[4·[( 3-Fluoro-2 -pirid il)metil]piperazin-1.il]-8-metil-3 ,5,6,7 -tetrah idropirido[2 ,3-d)pirimidin-4-ona,

o una sal farmacéutica mente aceptable del mismo; o 2-[[4-(8-Metil-4-oxo-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-2il)piperazin-1-il]metil)piridin-3-carbonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

35 Un aspecto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula " o una sal farmacéutica mente aceptable del mismo, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable Todavía un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I para su uso en un

procedimiento para inhibir la Tanquirasa 1 y 2 en un paciente con cancer en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de Fórmula 1, o una sal farmacéutica mente aceptable del mismo, a dicho paciente

Otro aspecto de la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I para su uso en un procedimiento para tratar un cancer que es cancer colorrectal, cancer gástrico, cáncer de hígado, cancer de mama, cáncer de mama triple negativo, cáncer de ovario, meduloblastoma, mela noma, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de células T, linfoma linfoblástico T, leucemia linfocitica aguda de células T (T-ALL), linfoma de células del manto, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica o leucemia mieloide aguda en un paciente que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de Fórmula 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Un aspecto todavía adicional de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un cáncer que es cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de higado, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo, cancer de ovario, meduloblastoma, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de células T, linfoma T-linfoblástico, leucemia linfodtica aguda de células T (T-ALL), linfoma de células del manto, mieloma múltiple , leucemia mieloide crónica o leucemia mieloide aguda

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que es cancer coJorrectal, cancer gástrico, cancer de higado, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo, cáncer de ovario, meduloblastoma, meJanoma, cáncer de pulmón, cancer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pancreas, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de células T, linfoma T-linfoblástico, leucemia linfocítica aguda de células T (T-ALL), linfoma de células del manto, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica o leucemia mieloide aguda.

El término "paciente" significa mamífero y "mamífero" incluye, pero no se limita a, un humano.

El término "cáncer de mama triple negativo" se refiere a un cáncer de mama caracterizado por una muestra tumoral que arrojó resultados negativos para receptores de estrógeno (ER), receptores de progesterona (PR) y receptores 2 de factor de crecimiento epidérmico hormonal (HER2/neu).

"Cantidad terapéutica mente efectiva" o "cantidad efectiva" significa la dosificación de un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que contiene un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, necesaria para inhibir la rula de señalización WnUp-catenina en un paciente con cancer y bien sea destruyen las células cancerosas objetivo o ralentizan o detienen la progresión del cáncer en un paciente. Las dosificaciones anticipadas de un compuesto o una sal farmacéutica mente aceptable del mismo están en el intervalo de 0,1 a 200 mg/paciente/día. Las dosis preferidas se anticipan en el intervalo de 1 a 175 mg/paciente/día. Se anticipa que las dosis más preferidas están en el intervalo de 5 a 150 mg/paciente/día. La dosificación exacta requerida para tratar a un paciente y la duración del tiempo de tratamiento serán determinados por un médico en vista de la etapa y la gravedad de la enfermedad, así como las necesidades específicas y la respuesta del paciente individual. Aunque se expresa como dosificación por día, el régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar un beneficio terapéutico más óptimo para un paciente y para gestionar y/o mejorar los efectos farmacodinámicos indeseables. Además de la dosificación diaria, puede ser apropiado la dosificación cada dos días (02D); día por medio durante un período de cinco días seguido de dos días sin dosificación (nw.); o cada tres días (03D) .

Los términos "tratamiento", "trato" y "tratar" pretenden incluir todo el espectro de intervención para el cáncer del cual el paciente está sufriendo, tal como la administración del compuesto activo para aliviar, ralentizar o reversar uno o mas de los sintomas y para retrasar la progresión del cancer, incluso si el cancer no se elimina realmente. El paciente que se va a tratar es un mamífero, en particular un ser humano

Un compuesto de la presente invención se formula preferiblemente como una composición farmacéutica usando un vehiculo farmacéutica mente aceptable y se administra por una variedad de rutas Preferiblemente, tales composiciones son para administración oral. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY

(A. Gennaro, et al., eds., 19th ed ., Mack Publishing Co ., 1995). En una realización particular, la composición farmacéutica comprende 8-metil-2-[4-(pirimidin-2-ilmetil)piperazin-1-il]-5,6,7 ,8-tetrahidropirido [2,3-<1] pirimidina4(3H)-ona o una sal farmacéutica mente aceptable de la misma, junto con un vehículo farmacéutica mente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos particularmente para el tratamiento de un tipo específico de cáncer.

Un compuesto de la presente invención es capaz de reaccionar con un número de ácidos inorgánicos y orgánicos para formar sales de adición de ácidos fannacéuticamente aceptables_ Tales sales farmacéuticamente aceptables y la metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica_ Véase, por ejemplo, P_ Stahl, el al., HANOBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION ANO USE, (VCHAlWiley-VCH, 2002);

S.M. Serge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Phannaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977.

Un compuesto de la presente invención, tal como el Ejemplo 1, se denomina: 8-metil-2-[4-(pirimidin-2ilmetil)piperazin-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4(3H)-ona (IUPAC); y también puede ser denominado: pirido[2 ,3-d)pirim idin-4(3H )-ona, 5,6,7 ,8-tetrahidro-8-metil-2 -[ 4-(2 -pirimid in ilmetil)-1-piperazinil]-(CAS); y otros nombres pueden usarse para identificar inequívocamente un compuesto de la presente invención

Se entenderá que los compuestos de Fórmula I se representan como un solo estereoisómero. Un sustituyente definido particular puede dar lugar a un centro quiral que proporciona una mezcla racémica o dos estereoisómeros. Como se usa en la presente memoria, a menos que se indique otra cosa, las referencias a un compuesto especifico pretenden incluir estereoisómeros individuales y mezclas racémicas que incluyen el compuesto nombrado. Los estereoisómeros específicos pueden prepararse por síntesis estereoespecíflca usando materiales de partida enantioméricamente puros o enriquecidos_ Los estereoisómeros especiflcos bien sea de materiales de partida, intermedios o mezclas racémicas se pueden resolver mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las encontradas en Stereochemistry of Organic Compounds, E. l. Eliel and S. H. Wilen (Wiley 1994) and Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J_, Jacques, A_ Collet, and S_ H_Wilen (Wiley 1991), que incluyen cromatografía sobre fases estacionarias quirales, resoluciones enzimáticas, o cristalización fraccionada o cromatografía de diastereómeros formados para ese fin , tales como sales diastereoméricas . Cuando se aisla o resuelve un compuesto quiral en sus isómeros, pero no se determinan configuraciones absolutas o rotaciones ópticas, los isómeros se designan arbitrariamente como isómero 1 e isómero 2 que corresponden al orden que cada uno eluye de la cromatografía quiral y si la cromatografía quiral se inicia temprano en la síntesis, la misma designación se aplica a intermedios y ejemplos subsecuentes

Un experto en la técnica reconocerá que los compuestos de Fórmula I pueden existir en equilibrio tautomérico Para fines ilustrativos, el equilibrio se muestra a continuación·

y,X'N1 CH

~N'0W~

N'

~.>=======....

13 I 8 7

N,,4

6

OH

5

Por conveniencia, la forma 4-oxo se representa en la Fórmula 1, y la nomenclatura correspondiente se usa a lo largo de esta especificación. Sin embargo, tales representaciones incluyen la forma hidroxi tautomérica correspondiente.

Los compuestos empleados como materiales de partida iniciales en la síntesis de compuestos de la presente invención son bien conocidos y, en la medida en que no están disponibles comercialment e, se sintetizan fácilmente usando referencias específicas proporcionadas, mediante procedimientos estándar comúnmente empleados por los expertos en la técnica, o se encuentran en textos de referencia generales

Los ejemplos de procesos y procedimientos conocidos incluyen los descritos en textos de referencia generales tales como Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volúmenes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Estructura, 5a Edición, Michael B_ Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4a Edición, Parte B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer AcademiC/Plenum Publishers, 2000, etc_, y referencias citadas en este documento

Adicionalmente, ciertos compuestos intermedios descritos en los siguientes esquemas pueden contener uno o más grupos protectores de nitrógeno_ El grupo proteclor variable puede ser el mismo o diferente en cada caso, dependiendo de las condiciones de reacción particulares y de las transformaciones particulares que se van a realizar. Las condiciones de protección y desprotección son bien conocidas por los expertos en la técnica y se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, "Greene's Proteclive Groups in Organic Synthesis", cuarta edición, por Peter GM Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

Las abreviaturas usadas en la presente memoria se definen de acuerdo con A1drichimica Acla, vol. 17, No_ 1, 1984 Otras abreviaturas se definen como sigue: "APC" se refiere a poliposis coli adenomatosa; "BID" se refiere a dosificación dos veces al día; "NAO+ biotinilado" se refiere a 6-biotina-17-nicotinamida-adenina-dinucleótido; "BOC" se refiere a tert-butiloxicarbonilo; "DCM" se refiere a diclorometano; "DMF" se refiere a dimetilformamida; "DMAP" se refiere a 4-dimetilaminopiridina; "OMEM~ se refiere al Medio de Eagle Modificado de Oulbecco; "OMSO" se refiere a dimetilsulfóxido; "OPBS" se refiere a solución salina tamponada con fosfato de Oulbecco; "OTT' se refiere a ditiotreitol; "EDCI" se refiere a 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; "EGFP" se refiere a Proteína Fluorescente Verde Mejorada; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "FBS" se refiere a Suero de Bovino Fetal; "Etiqueta Flag" se

refiere al péptido Flag DYKOOOOK, terminal N a Terminal C (SEC ID NO: 6); "HEK" se refiere al riñón embrionario

humano; "HEPES" se refiere a ácido 4-(2-hidroxietil).1-piperazinetanosulfónico; "HOAc" se refiere a ácido acético;

"HRP" se refiere a peroxidasa de rábano picante; "IPAm" se refiere a isopropilamina; "MEM" se refiere al Medio

Esencial Mínimo; "MeOH" se refiere a metanol; "MOl" se refiere a la multiplicidad de infección; "NCBI" se refiere al

5 National Center for Biotechnology Information; "PBS" se refiere a solución salina tamponada con fosfato; "RPMI" se

refiere al Roswell Park Memorial Institute; "SCX" se refiere a una columna de purificación de ácido fenil sultónico de

intercambio catiónico fuerte enlaazado a sil ice; "SCX-2" se refiere a una columna de purificación de acido

propilsulfónico de intercambio catiónico tuerte enlazado a sílice; "SFC" se refiere a cromatografía de fluido

supercrítico; "TBS" se refiere a solución salina tamponada Tris; "THF" se refiere a tetrahidroturano; "TBME" se 10 refiere a tert-butil metil éter; "Peroxidasa de TMB" se refiere a 3,3',5,5'-tetrametilbencidina; "Tris "se refiere a tris(hidroximetil)aminometano, y" X-Phos "se refiere a 2-(diciclohexilfosfino}-2',4',6'-triisopropilbifenilo

Los compuestos de la presente invención, o las sales de los mismos, se pueden preparar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en los Esquemas, Preparaciones y Ejemplos a continuación. Los pasos sintéticos especificos para cada una de las rutas descritas se pueden combinar 15 de diferentes maneras, o junto con pasos de diferentes esquemas, para preparar compuestos de Fórmula " o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los productos de cada etapa en los esquemas a continuación pueden recuperarse por procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, que incluyen extracción, evaporación, precipitación, cromatografía, filtración, trituración y cristalización. En los esquemas a continuación, todos los sustituyentes a menos que se indique otra cosa, son como se definieron previamente. Los reactivos y materiales de

20 partida estan facilmente disponibles para una persona de experiencia normal en la técnica

Esquema 1 PG'Nl

1\ NH HCI ~N N N

PG-N N-{ +

P"o A Y>Ií'l~ Paso B

\.....J NH2

,. HN~ •

(1 )

(3) o

PG'N""PG'N""

) I l· I I HNl I "-.--NyN)'N; Z PasoC Paso O

.. ~NY:;oN ~NY:;oN

N N

•

HN~ HN I HN I

(41 O (51 (61

¡ O O

nTFA

Z = I o CH30 S0 3

p,,,, E

n=2-4 TFA PG = Grupo protector HNl I

~NyN)'NI

HNy0

(71 O

El esquema 1 representa la formación de 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona (6) como una sal de TFA, el material neutro (7) y la sal metil trifluoroboranato de (7)

En el Paso A, se obtiene una 2-piperazin-1-il-3H-pirido [2,3-d) pirimidin-4-ona protegida (3) a partir de la ciclación de

25 una sal de clorhidrato de piperazin-1-carboxamida protegida (1) con 2-doronicotinato de etilo (2). La reacción transcurre en un disolvente inerte, tal como OMF, en presencia de una base fuerte, tal como tert-butóxido de potasio, a una temperatura de 50-120 OC. El grupo protector preferido es un tert-butiloxicarbonilo pero podrían usarse otros grupos protectores de carbamato

En el Paso B, una 2-piperazin-1-il-3H-pirido[2,3-d)pirimidin-4-ona protegida (3) se metila usando yoduro de metilo

30 para dar la sal cuaternaria, yoduro de 8-metil-2-piperazin-1 -il.3H-pirido[2,3-d)pirimidin-8io-4-ona (4) (Z es " Esquema 1). La reacción transcurre en un autoclave en un disolvente inerte, tal como THF o dioxano, a una temperatura de 50-120 oC durante 4 a 24 h. Alternativamente, la sal de sulfato de metilo se puede formar añadiendo sulfato de dimetilo al compuesto (3) en un disolvente aprótico polar tal como DMF con calentamiento a aproximadamente 60-80 oC. La solución se transfiere a temperatura ambiente a un recipiente que contiene TMBE para precipitar el producto

(4) para Z es CH30S03.

5 En el Esquema 1, Paso C, la sal cuaternaria (4, Z es 1) se reduce para proporcionar 8-metil-2-piperzin-1-il-3,S,6,7tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona protegida (5). La reducción puede realizarse usando un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio en una mezcla de DMFfTFA de aproximadamente 10f1 El TFA Y el agente reductor se agregan a una temperatura de 0-5 oC, no permitiendo que la temperatura se eleve por encima de 15 oC. Entonces se deja que la reacción transcurra de 12 a 24 h a TA. Se pueden agregar cantidades ad icionales de TFA y agente

10 reductor con enfriamiento para guiar la reacción hasta su finalización

Alternativamente, el Paso C puede realizarse reduciendo la sal de sulfato de metilo (4, Z es CH30S03) con un agente reductor tal como óxido de platino e hidrogenandose a aproximadamente 1.054 kPa en un disolvente polar tal como MeOH para dar el compuesto (5).

En el Paso D, el anillo de piperazinilo se desprotege para proporcionar 8-metil-2-piperazin-1-il-3,S,6,7

15 tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona (6). Las condiciones acidas para la eliminación de grupos protectores tales como BOC son bien conocidas en la técnica. Las condiciones preferidas usan una mezcla 1/1 de DCM y TFA a TA durante un período de 2 a 24 h para dar el producto como una sal de TFA con 2-4 equivalentes de TFA presentes La forma de sal no está caracterizada, pero se calcula por peso

El Paso E muestra la desprotección del grupo protector como se discutió anteriormente para dar la sal de TFA que

20 puede ser neutralizadda con una resina de intercambio iónico o una columna SCX usando amoniaco/MeOH para dar el material neutro (7). El nitrógeno del anillo de pirazina puede convertirse en la sal de trifluoroboranato de metilo usando trifluoroborato de bromometilo de potasio en un disolvente tal como THF para dar una forma de sal como se muestra en el Paso F, compuesto 8

Esquema 2

HN1 I F'8/'--N1

~NyN'¡(1 F'F ~NyNIí~1

HNyV HNyV

m o (a) O

"TFA

/

25 El Esquema 2 ilustra la formación de compuestos de Fórmula I a partir de la forma de sal (6), el material neutro (7) o la sal de trifluoro boranato de metilo (8). Hay muchas maneras de formar compuestos de Fórmula I a partir de los intermedios (6), (7) Y (8) tales como alquilación, alquilación reductiva o acoplamientos de Suzuki dependiendo de la disponibilidad o sintesis de aldehídos o cetonas apropiados para alquilaciones reductivas, reactivos de haluro apropiados para alquilaciones o reactivos de ácido borónico para acoplamientos de Suzuki. La sal de amina de TFA

30 (6) o la amina neutra (7) pueden usarse en alquilaciones reductivas o alquilación para dar compuestos de Fórmula I Las alquilaciones reductivas son bien conocidas en la técnica e implican la reacción de un aldehido con una amina usando un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio en un disolvente apropiado tal como DMF a temperatura ambiente u otros agentes reductores tales como triacetoxiborohidruro de sodio en un disolvente apropiado tal como DCM a temperatura ambiente Si se desea, se puede usar una cantidad catalítica de metanol

con DMF Y cianoborohidruro de sodio para impulsar la reacción más rápido. Se puede usar un haluro de aril metilo

apropiado para alquilar la sal de amina de TFA (6) o el material neutro (7) usando una base orgánica apropiada tal como trietilamina o una base inorgánica tal como carbonato de potasio en un disolvente tal como acetonitrilo o DCM. El yoduro de sodio puede usarse in situ para convertir un sustrato de clorometilo en un sustrato de yodo metilo más reactivo para completar la alquilación de la pirazina, piridina o pirimidina apropiadas. Las reacciones se pueden ag itar a temperatura ambiente durante 1-3 días para dar compuestos de Fórmula ,.

El compuesto (8) se puede acoplar con haluros de arilo bajo condiciones de acoplamiento cruzado catalizadas por paladio de Suzuki para formar productos sustituidos con N-metilheteroarilo. El compuesto 8, la sal metil trinuoroboranato, proporciona otra variación para preparar compuestos de Fórmula ,. El experto en la técnica reconocerá hay una variedad de condiciones útiles para facilitar tales reacciones de acoplamiento cruzado. Por consiguiente, un reactivo de paladio adecuado incluye acetato de paladio (11) y un reactivo organofosforado adecuado tal como X-phos con una base tal como carbonato de cesio, carbonato de sod io, carbonato de potasio o monohidrato de fosfato de potasio tribásico. Otros reactivos de organofósforo y paladio adecuados incluyen cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (11), tris(dibencilidenacetona)dipaladio (O) con triciclohexilfosfina, cloruro de (1,1 'bis(difenilfosfino)ferroceno)paladio (11) o tetrakistrifenilfosfina de paladio.

En un paso opcional, se puede formar una sal farmacéutica mente aceptable de un compuesto de Fórmula " tal como una sal de hidrocloruro, por reacción de un compuesto de base libre de Fórmula I con un ácido apropiado en un disolvente adecuado bajo condiciones estandar. Adicionalmente, la formación de tales sales puede ocurrir simultáneamente después de la desprotección de un grupo protector de nitrógeno

Las siguientes preparaciones y ejemplos ilustran además la invención. A menos que se indique lo contrario, los compuestos ilustrados en la presente memoria se nombran y numeran usando Accelrys® Draw versión 4.0 (Accelrys, Inc., San Diego, CA), IUPACNAME ACDLABS o ChemDraW® Ultra 12.0.

Descripción general del procedimiento de purificación en fase reversa

Sistema: Agilent 1200 LCMIMS equipado con el espectrómetro de masas Detector Selectivo Masivo (MSD) y el automuestreador Leap/recolector de fracciones; Columna: Phenomenex Gemini-NX de 75 x 30 mm, columna de tamaño de partícula de 5 IJ con protector de 10 x 20 mm; Sistema de disolvente: A: bicarbonato de amonio 10 mM, pH 10 como fase acuosa, B: ACN como fase orgánica; Caudal: 85 ml/min; Prcedimiento: El gradiente para cada procedimiento se designa en el nombre del procedimiento como el % B de inicio-% B final (por ejemplo, como en pH alto 13-48). El gradiente se establece de la siguiente manera: 0-1 min (mantener al % B de iniCio), 1-8 min (gradiente desde comenzar % B de inicio-% B final), 8-8,1 min (rampa desde el % B final hasta 100 % B), 8,1-9 min (mantener 100 % B)

Preparación 1

4-Metoxipirimidina-2-carbaldehido

Combinar 4-metoxipirimidin-2-metanol (300 mg, 2,14 mmol) y cloruro de oxalilo (1 mi, 2,0 M en DCM) en DCM (5 mi) y se enfría hasta -78 oC. Añada DMSQ (0,33 mi, 4,71 mmol) y agitar la mezcla durante 2 h. Añada trietilamina (0,66 mi, 4,71 mmol) y calentar la mezcla hasta temperatura ambiente durante la noche. Agregar agua (5 mI), agitar

durante 1 hora y extraer con DCM (2 x 50 mi). Secar los extractos orgánicos combinados sobre sulfato de sodio, filtrar y concentrar el filtrado bajo presión reducida para dar un sólido de color marrón claro y usar sin purificación adicional. lH RMN (400 MHz, CDCb) ti pico de aldehído 9,94 (s, lH), los picos restantes no asignables debido a la mezcla de más de un compuesto .

Preparación 2

4-Metilpirimidin-2-carbaldehído

Preparar 4-metilpirimidin-2-carboxaldehido esencialmente como se describe en la Preparación 1 usando (4metilpirimidin-2-il)metanol para obtener el compuesto dellítulo y usar sin purificación adicional lH RMN, 400 MHz, CDCI3) 610,06 (s, lH), 8,79 (d, lH, J:= 5,2 Hz), 7,33 (d, lH, J := 4,8 Hz), 2,65 (s, 3H)

4-(Trifluorometil)-2-vinil-pirimidina

Combinar 2-cloro-4-(trifluorometil) pirimidina (250 mg, 1,37 mmol), viniltrifluoroborato de potasio (184 mg, 1,37

5 mmol), carbonato de cesio (1,34 g, 4,11 mmol), THF (5 mi) yagua (0,5 mi) en un vial Se desgasifica con una corriente de nitrógeno durante 1 mino Agregue cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (11) (48 mg, 0,069 mmol), selle el vial y caliente la mezcla a 85 oC durante 3 días. Enfriar, diluir la mezcla con DCM, filtrar a través de tierra de diatomáceas y concentrar el filtrado bajo presión reducida para dar el compuesto del título (0,200 g, 84 %) que se usa sin purificación adicional. lH RMN (400 MHz, CDCb) ti 8,93 (d, lH, J = 5,0 HZJ, 7,43 (d, lH, J = 5,0 Hz), 6,94

10 (ABX, lH, JA)( = 17,3, Jex= 10,47), 6,74 (ABX, lH, JAB = 1,54, JA)( = 17,3), 5,84 (ABX, H, JAB = 1,54, JBX = 10,47).

Preparación 4

5-Metil-2-vinil-pirimidina

Preparar el compuesto del titulo esencialmente como se describe en la Preparación 3 usando 2-cloro-5

15 metilpirimidina y usar sin pu rificación adicional (220 mg, 94 %). lH RMN (400 MHz, CDCh) ti 8,38 (s, 2H ), 6,73 (ABX, l H, JA)( = 17,4, Jex = 10,7), 6,41 (ABX, l H, JAB = 1,8, JA)( = 17,4), 5,54 (ABX, l H, JAB = 1,8, JBX = 10,7), 2,16 (s, 3H).

Preparación 5

4-(Trifluorometil)pirimidina-2-carbaldehído

o

N"N

~CF3

20 Combinar 4-(trifluorometil)-2-vinil-pirimidina (200 mg, 0,84 mol) con peryodato de sodio (737 mg, 3,45 mmol) y tetróxido de osmio, polímero enlazado (292 mg, 0,057 mmol) en dioxano (3 mi) yagua (1 mi) y agitar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Diluir la mezcla con EtOAc (5 mi) yagua (5 mi). Filtrar la mezcla a través de lana de vidrio y separar las capas. Secar la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, filtrar y concentrar el filtrado para dar el compuesto del titulo (40 mg, 20 %). Utilice el material crudo sin purificación adicional. lH RMN (400 MHz,

25 CDCI3) ti aldehído 10,16 (s, lH), los picos restantes no asignables debido a la mezcla de más de un compuesto

Preparación 6

5-Metilpirimidin-2-carbaldehido

Preparar 5-metilpirimidina-2-carbaldehido esencialmente como se describe en la Preparación 5, usando 2-cloro-5

metil-pirimidina para dar el compuesto del titulo (90 mg, 44 %) Y usar sin purificación adicional lH RMN (400 MHz,

CDCI3) li 10,06 (s, l H), 8,79 (s, 2H), 2,42 (s, 3H)

Preparación 7

2-(Bromometil)-4-cloro-pirimidina

rNyB' "'yN

CI

Combine 2-metil-4-cloropirimidina (200 mg, 1,55 mmol), tetracloruro de carbono (5 mL), N-bromosuccinimida (304 mg, 1,71 mmol) y peróxido de benzoilo (38 mg, 1,6 mmol) en un vial, purgar con nitrógeno durante 2 minutos, sellar y calentar a 80 OC durante la noche. Use la mezcla de reacción cruda sin purificación adicional. GC-MS m/e:e9sRf1Sr 2051207 (M').

Preparación 8

2-(Cloromelil)pirazina

(:( CI

N

Disolver 2.pirazinilmetanol (2,0 g, 18,1 mmol) en DCM (200 mi) y se enfriar hasta O oC mientras se agita bajo nitrógeno. Agregue cloruro de tianito (4,63 mi, 63,6 mmo1) gota a gola durante 10 minutos, y deje calentar hasta 25 oC. Agitar a temperatura ambiente durante 16 h. Concentre la mezda y luego diluya con DCM. Lavar la solución cruda con NaHC03 saturado, secar sobre MgS04, filtrar y concentrar. Disolver el residuo crudo en DCM y purificar por cromatografía instantánea en gel de sílice (hexanofEtOAc, gradiente de 95:5 a 100 % de EtOAc) para dar el compuesto del título como un aceite de color amarillo pálido. lH RMN (400 MHz, CDCh) i5 4,67 (s = 2H), 8,50-8,55 (m, 2H), 8,73 (s, 'H)

Preparación 9

2-(Bromometil)-3-cloro-pirazina

Añadir juntos 2-cloro-3-metil-pirazina (5,0 g, 38,9 mmol), N-bromosuccinimida (6,92 g, 38,9 mmol), peróxido de benzoilo (0,471 g, 1,94 mmol) y tetracloruro de carbono (50 mi) y calentar a reflujo bajo nitrógeno durante 16 h Enfriar la mezcla de reacción hasta 25 OC Y diluir con hexanos. Filtrar la mezcla, concentrar el líquido bajo presión reducida, y purificar mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 95:5 con gradiente a 40:60) para dar el compuesto del título como un aceite de color marrón (3,93 g, 49 %) l H RMN (400 MHz, CDCI3) i5 4,66 (s '" 2H), 8,32 (d, J '" 2,4 Hz, lH), 8,47 (d, J '" 2,4 Hz, 'H)

Preparación 10

3,5o.{jifluoropiridin-2-carboxilato de metilo

° /

, I °

d

F "-F

Añadir juntos ácido 3,5-difluoropiridin-2-carboxílico (1,4 g, 8,8 mmol) y DCM (30 mi) y enfriar hasta O oC. Añadir MeOH (3 mi), DMAP (1 ,32 g, 10,6 mmol) y EDCI (2,1 g, 10,6 mmol). Permita que la mezcla se caliente hasta temperatura ambiente y agite durante la noche. Se concentra la mezcla de reacción bajo presión reducida y se purifica el residuo por cromatografía sobre gel de sílice (elución con 10/1 de éter de petróleo/EtOAc) para dar el compuesto del titulo (1 ,03 g, 72 %) LC-ES/MS mIz 174 (M+Hf

Preparación 11

(3 ,5-Difluoro-2 -pirid il)meta nol

¡"NrOH

F~F

Añadir juntos 3,5-difluoropiridin-2-carboxilato de metilo (1,0 g, 4,6 mmol), THF (10 mi) y borohidruro de litio 2 M en

THF (15 mi, 23 mmoL). Agite la mezcla a temperatura ambiente durante 2 dias. Se concentra bajo presión reducida y se pUrifica el residuo mediante cromatografia en gel de silice eluyendo con DCM para dar el compuesto del titulo (0,448 g, 60 %)

Preparación 12

2 -(Clorometil)-3,5-d ifluo ropiridina

N

r""Y'CI

F~F

Añadir juntos (3,5-difluoro-2-piridil)metanol (200 mg, 1,4 mmol), DCM (4 mi), DMF (0,1 mi) y cloruro de tionilo (1 mI) y agitar la mezcla durante 4 horas. Ajustar el pH a aproximadamente 7,0 con bicarbonato de sodio acuoso 4 M Y extraer la mezcla con DCM (3 x 50 mi). Se combinan las porciones organicas, se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra y se concentra para dar el compuesto del título (182 mg, 81 %) como un aceite de color naranja.

Preparación 13

Clorhidrato de 4-carbamimidoilpiperazin-1-carboxilato de tert-butilo

Cargar un reactor encamisado de 10 I con piperazin-1-carboxilalo de tert-bulilo (1500 g, 8,054 mol) y DMF (4,051). Revuelva hasta que se obtenga una solución. Añadir 1 H-pirazol-1-carboxamida HCI (1180 g, 8,054 mol) seguido de diisopropilamina (1041 g, 8,054 mol) durante 15 min a 22 hasta 28 oC. Calentar a 55 hasta 60 oC durante 5 hy luego enfriar hasta 20 oC. Transfiera la mezcla de reacción a un reactor encamisado de 50 I que contiene TBME (30 1)

durante 15 hasta 20 minutos y enjuague las lineas de transferencia con DMF (400 mi). Agite la suspensión durante 1 hora a 20 OC Yluego filtre a través de tres embudos Buchner de 26 cm separados. Lavar cada torta de producto con TMBE (2 x 1000 mi) y secar en un horno de vacío a 60 oC durante la noche para dar el compuesto del título (1898 g, 89 %) como un sólido blanco. lH RMN (400 MHz, DMSO-da) i5 1,41 (s, 9H), 3.42-3,50 (m, 4H), 3,33-3,42 (m, 4H), 7,77 (s, 4H)

Preparación 14

4-(4-oxo-3H-pirido[2,3-d]pirimidin-2-il)piperazin-1-carboxilalo de lert-bulilo

Se carga un matraz de fondo redondo de 22 I con clorhidrato de 4-carbamimidoilpiperazin-1-carboxilato de tert-butilo (1897 g, 7,165 mol), DMF (10,11) Y 2-cloronicotinato de etilo (1266 g, 6,824 mol). Agregue tert-butóxido de potasio (1293 g, 11 ,52 mol) en porciones durante 55 minutos mientras permite que la temperatura suba gradualmente de 17 hasta 62 OC. Calentar la reacción a 100 oC durante 2,5 h. -Se enfría la mezcla de reacción hasta 20 oC y se transfiere a un reactor encamisado de 30 I que contiene agua (15,2 1) usando DMF (350 mi) para enjuagar el reactor y las líneas de transferencia. Introducir ácido clorhídrico 3 N (1 ,52 1) hasta que se obtenga un pH de 5 a 6 y agitar la suspensión durante 2 horas a 20 oC. Recoja el producto por filtración a través de tres embudos Buchner de 26 cm separados y lave cada torta con agua (3 >( 1,5 1). Combine las tortas, suspéndalas en agua (15,0 1) Y revuelva durante 60 minutos a 20 OC. Recoja el producto por filtración a través de dos embudos Buchner de 26 cm separados y lave la torta con agua (2 x 1,5 1). Secar el sólido en un horno de vacío a 60 oC durante 24 horas para dar el compuesto dellítulo (1332 g, 59 %) como un sólido amarillo. l H RMN (400 MHz, DMSO-(6) i5 1,43 (s, 9H), 3,36-3,49 (m, 4H), 3,62-3,76 (m, 4H), 7,13-7,20 (m, 1 H), 8,22-8,27 (m, l H), 8,62 _8,70 (m, lH)

Preparación 15 4-(8-metil-4-oxo-3H-pirido[2,3-d)pirim idin -8-io-2 -il )piperazin-1-carboxilato de tert-butilo, metil sulfato

~olNl

I

~NyNI(~HN~

O

Cargar un reactor encamisado de 20 I con 4-(4-oxo-3H-pirido[2,3-d)pirimidin-2-il)piperazin-1-carboxilato de tert-butilo (1331 g, 4.017 mol) y DMF (6,66 1). Agregue dimetilsulfato (583 g, 2,83 mol) durante 5-10 min y observe una ligera exotermia hasta 38 oC. Calentar la solución a 63 hasta 73 OC durante 30 minutos. A continuación, introduzca dimetilsulfato adicional (50,7 g, 0,402 mol) y caliente a 68 hasta 73 oC durante 30 mino La muestra de la reacción muestra un 2,0 % de material de partida restante. Agregar dimetilsulfato adicional (50,7 g, 0,402 mol) y calentar a 68 hasta 73 oC. La muestra de nuevo mustra el restante 1.3 % del material de partida. Se enfria la reacción hasta 20 oC y se transfiere durante 20 hasta 30 minutos a un reactor de camisa de 50 I que contiene TBME (26,61), 4-(8-metil-4oxo-3H-pirido[2 ,3-d)pirimidin-8-io-2-il)piperazin-1-carboxylato de tert-butilo y semillas (1 g) usando DMF (300 mi) para enjuagar el reactor y las líneas de transferencia. Agitar la suspensión durante la noche a 20 OC durante la noche y recoger el producto por filtración usando tres embudos Buchner de 26 cm separados. Enjuague cada torta con TBME (3 )( 1,3 1), combine las tres porciones y suspenda el material en TMBE (13,3 1), revuelva durante 1 hora a 20 oC, y recoja el producto en dos embudos Buchner de 26 cm separados. Lavar cada torta con TBME (3 x 2,0 1) Y secar en un horno de vacío a 55 hasta 60 oC durante 16 horas para dar el compuesto del titulo (1812 g, 9a %) como un sólido amarillo. lH RMN (400 MHz, DMSO-de) (5 1,44 (s, 9H), 3,37 (s, 3H), 3,45-3,55 (m, 4H), 3,80-3,95 (m, 4H), 4,08 (s, 3H), 7.40-7,45 (m, 'H), 8.72-8,76 (m, 'H), 8.86-8,91 (m, lH)

Preparación 15 Formación de cristales de semillas

~olNl

I

~NyNI(~HN~

O

Cargar un reactor de 250 mi con 4-(4-oxo-3H-pirido [2,3-d] pirimidin-2-il}piperazin-1-carboxilato de tert-butilo (15 g, 45,3 mmol) y dimetilformamida (75 mi) Añadir dimetilsulfato (6,28 g, 49,8 mmol) en una porción a la mezcla en agitación (observar una ligera exotermia hasta 34 oC). Calentar la solución resultante a 68 hasta 73 OC durante 3 horas. Se agrega dimetilsulfato (0,57 g, 4,5 mmol) y se agita a 68 hasta 73 oC durante 1 hora adicional. Se enfría hasta 20 oC y se transfiere gota a gota a un matraz de 1 I que contiene TBME (300 mi). Observe el cambio sólido pegajoso a la suspensión agitable, agite durante la noche a 20 oC y filtre en un embudo Buchner. Lave la torta del producto con TBME (3 x 35 mi) y suspenda en TBME (100 mi). Agitar la suspensión durante 1 hora a 20 oC, filtrar en un embudo Buchner y lavar la torta con TBME (2 x 35 mi). Secar los sólidos en un horno de vacío a 55 hasta 60 OC durante 16 horas para dar 4-(8-metil-4-oxo-3H-pirido[2,3-d) pirimidin-8-io-2-il) piperazin-1-carboxilato de tert-butilo, metilsulfato (18,84 g, 91 % de rendimiento) (pureza de HPLC 95 %).

Preparación 16

Yoduro de 4-(8-metil-4-oxo-3H-pirido[2 ,3-d]piri mid in-8-io-2-il)piperazin-1-carboxilato tert -butilo

O

o)lNí

,

.)( ~N'00JN

~.

1"'" "'" I

HN '>

O

Combine 4-(4-oxo-3H-pirido [2,3-d) pirimidin-2-il) piperazin-1-carboxilato de tert-butilo (115,43 g), THF (1,4 1) Y yoduro de metilo (24 mL) en un autoclave Parr de 2 I con agitador mecánico. Selle el autoclave y mezcle la reacción con calentamiento a 70 oC durante 22 horas. Se enfría la reacción hasta temperatura ambiente y se transfiere la suspensión resultante de color amarillo brillante a un matraz de fondo redondo usando MeOH. Se concentra la suspensión y se seca el sólido resultante en un horno de vacio a 50-60 oC para dar el compuesto del titulo como un sólido amarillo (167,44 g, 100 %). LC-ESIMS mIz 346,2 [M+H]', TR o: 1,16 min

Preparación 17 4-(8-metil-4-oxo-3, 5,6, 7 -tetra hidropirido[2, 3-d]pirimidin-2-il )piperazin-1-carboxilato de tert-b utilo

Cargue un recipiente a presión de 0,90 I con 4-(8-metil-4-oxo-3H-pirido [2,3-d)pirimidin-8-io-2-il) piperazin-1carboxilato de tert-butilo, sulfato de metilo (881 g, 1.927 mol) y MeOH (4,9 1). Agregue óxido de platino (1 % p/p, 8,81 g) Y presurice con hidrógeno a 1.054 kPa. Agitar durante 4 horas a 22-28 oC. Filtrar a través de un cartucho de filtro para recoger el catalizador. Separe el filtrado que se va a combinar con el filtrado de una segunda hidrogenación Repita la reacción en otra porción de 4-(8-metil-4-oxo-3H-pirido [2,3-d) pirimidin-8-io-2-il)piperazin-1 -carboxilato de tert-butilo, sulfato de metilo (925 g, 2,023 mol), MeOH (5,01) Y óxido de platino (1 % p/p, 9,25 g) como antes se filtran y combinan los dos filtrados y se concentran para dar un residuo oleoso. Se disuelve el residuo en DCM (9,3 1) Y se lava con HOAc acuoso 0,1 N (2 x 2,0 I Y 2 x 1,11) y NaOH 0,5 M (8,0 1). Agregue agua (4,0 1) Y ajuste a pH 6-7 con HOAc acuoso 0,1 N (aproximadamente 1,9 1). Separar las capas y secar la capa orgánica sobre sulfato de magnesiO, filtrar y concentrar a un volumen de aproximadamente 4,5 1 Y agregar EtOAc (16,0 1) para cristalizar el producto. Concentrar la suspensión a un volumen de aproximadamente 4,5 1, enfriar a O a 5 OC Y recoger el producto por filtración. Lavar la torta con EtOAc (2 x 2,0 I Y 2 x 1,1 1) Y secar en un horno de vacío a 55 hasta 65 OC durante 16 h para dar el compuesto dellítulo (1185 g, 77 %) como un sólido blanco (muy electrostático ) l H RMN (400 MHz, CDCb) i5 1,45 (s, 9H), 1.76-1 ,88 (m, 2Hl, 2,53 (t-l J = 6,3 Hz, 2h), 3,04 (s, 3H), 3,20-3,26 (m, 2H), 3,40-3,52 (m, 4 H), 3,60-3,70 (m, 4H), 5,01 (s, 'H), 12,1-12,3 (brs, H). 13C RMN (101 MHz, CDCh) 6 20,00, 21,63, 28,81, 36,55, 44,99, 50,20, 80,38, 85,85, 152,38, 155,15, 160,14, 164,03 ESII MS mIz 350,0 [M+Ht

Preparación 17 Sintesis alternative

Cargar un matraz de fondo redondo con yoduro de 4-(8-metil-4-oxo-3H-pirido [2,3-d)pirimidin-8-io-2-il) piperazin-1carboxilato de tert-butilo (167,44 g, 353,76 mmol) y DMF (815 mL) y enfriar en un baño de hielo a una temperatura interna de 0-5 oC. Agregue ácido trifluoroacético (80,25 mL, 1,06 mol) a una tasa para mantener la temperatura interna por debajo de 15 oC (45 min). Enfríe la reacción a una temperatura interna de 0-5 OC Y agregue cianoborohidruro de sodio (66,69 g, 1,06 mol) a una tasa para mantener la temperatura por debajo de 15 oC (aproximadamente 50 min). Agitar la reacción durante 18 h mientras se calienta hasta 25 OC. Enfríe la reacción de vuelta hasta 0-5 oC y agregue ácido trifluoroacético (80,25 mL, 1,06 mol) a una tasa para mantener la temperatura por debajo de 15 oC (10 min) seguido de cianoborohidruro de sodio (66,69 g, 1,06 mol) a tasa para mantener la temperatura por debajo de 15 oC (10 min). Agite la reacción durante la noche mientras se calienta hasta 25 oC Enfríe la reacción de vuelta hasta 0-5 oC y agregue ácido trifluoroacético (26,6 mi, 0.345 mol) a una tasa para mantener la temperatura por debajo de 10 oC (5 min) seguido de cianoborohidruro de sodio (22,3 g, 0.345 mol) en dos porciones durante 10 mino Agitar durante la noche mientras se calienta hasta 25 oC. Coloque un cangilón de 121 con un agitador superior y cárguelo con bicarbonato de sodio (297,18 g, 3,54 mol) yagua (7,2 1). Agregue la mezcla de reacción cruda a la solución de bicarbonato usando un embudo de decantación durante un período de 30 minutos y observe la evolución del gas. Agitar la mezcla durante 2 horas y luego dejar reposar a 25 oC durante la noche. Recoger el sólido resultante por filtración y enjuagar con agua y dietil éter. Secar el sólido en un horno de vacío a aproximadamente 60 oC durante la noche para dar el compuesto del título (111,34 g, 90 %) como un sólido beige. LC-ES/MS mIz 350,0 [M+Hf, T R = 1,93 min

Preparación 18

Sal de bis-(acido 2,2,2-trifluoroacético) 8-Metil-2-piperazin-1-il-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona

Añadir juntos 4-(8-metil-4-oxo-3,5,6, 7 -tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-2-il)piperazin-1--carboxilato de tert-butilo (46,8 g, 133,9 mmol) y DCM (100 mi). Añadir trifluoroacético (80 mi, 1,09 moles) durante 15 minutos y agitar a 25 oC durante la noche. Se concentró bajo presión reducida, añadir DCM (200 mi) y reconcentrar bajo presión reducida cuatro Preparación 19

8-Metil-2-piperazin-1-il-3 ,5, 6,7 -tetra hidropirido[2 ,3-d]pirim id in-4-ona; ácido tri-2 ,2 ,2 -trifluoroacético

HNl I

~NyNI(1

HNy0

O

Agrega r juntos 4-(8-metil-4-oxo-3,5,5,7 -tetrahidropirido [2,3-d]pirimidin-2-il)piperazin-1-carboxilato de terl-butilo

(195,0 g, 560,8 mmol) y DCM (783 mL). Enfriar la suspensión turbia en un baño de hielo hasta una temperatura

interna de 4 oC y agregar ácido trifluoroacético (254 mi) durante 10 min mientras se agita. Agitar durante 42 horas a

10 temperatura ambiente. Eliminar los volátiles bajo presión reducida y disolver en DCM. Eliminar los volátiles bajo presión reducida y secar bajo vacio a 40 oC durante la noche para dar el compuesto del titulo (431 , 5 g, 99 %) como un sólido blanco. lH RMN (300 MHz, DMSO-de) ti 8,95 (s ancho, 2H), 7,49 (s ancho, TFAlagua, 9H), 3,78 (t, 4H, J o: 5 Hz), 3,29 (t, 2H, J o: 5 Hz), 3,15 (s, 4H), 3,04 (s, 3H), 2,37 (t, 2H, J o: 5,3 Hz), 1,75 (pt, 2H, J o: 5,8 Hz

Preparación 20

15 8-Metil-2 -piperazin-1-il-3,5, 6,7 -tetrahidropirido[2 ,3-d]pirim id in-4-ona; acido tetra-2, 2 ,2-trifluoroacético

HNl I

~NyNIí"1

HNy0

O

Añadir juntos 4-(8-metil-4-oxo-3,5,6, 7 -tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)piperazin-1-carboxilato de tert-butilo (0,29 g, 0,83 mmol) , DCM (3 mi) y ácido trifluoroacético (3 mi). Agitar la reacción a temperatura ambiente durante 4 horas. Concentrar la mezcla y disolver el residuo en DCM (2x) y concentrar la mezcla. Se seca bajo vacio durante 1 hora

20 para dar el compuesto del titulo (0,556 g, 95 %) que se usa sin purificación o caracterización.

Preparación 21

8-Metil-2 -piperazin-1-il-3,5,6,7 -tetra hidropirido[2,3-d]pirim id in-4-ona

HNl I

~NyNIí"1

HNy0

O

Cargar un matraz de fondo redondo con 4-(8-metil-4-oxo-3,5,6,7 -tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il) piperazin-1

25 carboxilato de terl-bulilo (730 mg) , 1,53 mmol), DCM (15 mI) y ácido trifluoroacético (15 mi) y agitar la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Se concentra bajo presión reducida, se disuelve el residuo en metanol, se agrega la resina de intercambio iónico DoweX® 50WX4-400 (5,5 g) Y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Filtrar la mezcla y lavar la resina de intercambio iónico con amoniaco 7 M en melanol. Combine el fillrado y los lavados, y concéntrese bajo presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido naranja

30 (385 mg, 95 %). LC-ES/MS mIz 250 [M+Hr.

Preparación alternativa 21

Prelave una columna SCX-2 de 10 g con DCM (30 mi) y cargue con una solución de bis-(ácido 2,2,2-trifluoroacético) 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6,7-tetrahidropirido [2,3-d]pirimidin-4-ona (0,5 g, 1,05 mmol) en DCM (10 mi) y MeOH (1 mi). Lavar la columna con DCM (30 mi), seguido de MeOH (30 mi) y eluir con NH3 2 MfMeOH (60 mi). Se concentran las fracciones que contienen el producto bajo presión reducida para dar el compuesto del título (0,26 g, 100 %)

Preparación 22

trifluoro-[[4-(8-metil-4-oxo-3,5, 6, 7 -tetrahidropirido[2,3-d]pi rimidin-2 -il) piperazin-1-il]metil]boranu ide de potasio

K'

F'B-~Nl

¡'F l....-NyNIí~¡ HN~

O

Disuelva 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona (250 mg, 1,00 mmol) en THF (4 mi) y añada bromometil trifluoroborato de potasio (208 mg, 1,00 mmol), Calentar a 80 oC durante 90 min y luego concentrar bajo una corriente de nitrógeno. Agregar acetona (30 mi) y bicarbonato de potasio (100 mg, 1,00 mmol) y agitar a temperatura ambiente durante la noche. Eliminar los sólidos por filtración y concentrar el filtrado bajo presión reducida para dar el compuesto del titulo (273 mg, 73 %) como un sólido blanquecino ES/MS mIz 330 [M-K-]"

Ejemplo 1

8-Metil-2 -[4-(pirim id in-2 -ilmetil)piperazin-1-il]-3,5,6, 7 -tetra h idropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona

Ny"Nl I

CIíN¡

"-N l....-Ny N

HN~

O

Disolver 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6, 7 -tetrahidropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona; ácido tri-2,2,2-trifluoroacético (409 g, 531 mmol) en DCM (2,0 1) en un embudo de extracción de 5 1. Purgue el embudo con nitrógeno y equípelo con un agitador mecánico superior. Añadir pirimidin-2-carboxaldehído (66,6 g, 616 mmol) y agitar durante 40 minutos. A continuación, agregue triacetoxiborohidruro de sodio (225,1 g, 1060 mmol) en porciones y observe una exotermia de 20 hasta 36 OC inmediatamente después de la adición. Agitar la reacción a temperatura ambiente durante la noche Vierta la reacción cuidadosamente en NaOH 1 M (2,32 1) a 20 oC en un reactor de 10 I mientras se controla la exotennia resultante con un enfriador. Ajuste el pH a 8 a 9 con NaOH 1 N (2,55 1). Recoja la capa orgánica y extraiga la capa acuosa con DCM (2,32 1). Se combinan las capas orgánicas, se concentran y se secan bajo una corriente de nitrógeno durante la noche para dar el compuesto del título (193 g, producto crudo al 100 %). l H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 6 (br s, lH), 8,78 (d, 2H, J = 5,5 Hz), 7,41 (1, lH, J = 4,9 Hz), 3,76 (s, 2H), 3,52 (br s, 4H), 3,187 (1, 2H , J = 5,2 Hz), 2,96 (s, 3H ), 2,54 (m, 2H), 2,28 (t, 2H, J = 6Hz), 1,72 (pt, 2H, J =: 5,2 Hz), Esle lote se combina con otros 4 lotes para purificación (203 g). Se purifica mediante filtración con sílice (20 cm de diámetro por 8 cm de altura) y se

eluye con 90 % de DCMf10 % de NH3 2 M en MeOH para dar el compuesto del título. (162 g, 84 %), lH_RMN (300 MHz, CDCh): i5 8,74 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 7,20 (t, J = 5,1 Hz, lH), 3,85 (s, 2H), 3,78-3,69 (m, 4H), 3,27-3,19 (m, 2H ), 3,03 (2, 3H ), 2,68-2,59 (m, 4H), 2,47-2,38 (m, 2H ), 1,88-1,76 (m, 2H),

Ejemplo 1 Síntesis Alterna

Combinar ácido tri-2 ,2,2 -trifluoroacéti co de 8-metil-2-piperazin -1-il-3,5, 6,7 -tetrahidro pirido[2,3-d)pirim idin-4-ona (203,23 g, 344 mmol), pirimidin-2-carbaldehido (40 g, 370 mmol) y DMF (343 mi) y se agila hasta que se obtiene una solución homogénea (30 minutos). Enfriar la solución en un baño de hielo y añadir cianoborohidruro de sodio (25 g, 397 mmol) en una porción de 5 g seguida de una porción de 10 g 5 minutos más tarde. Agitar durante 1,5 horas y agregar los últimos 10 g de cianoborohidruro. Agite durante 30 minutos mientras mantiene la temperatura por debajo de 25 oC. Agite la reacción durante la noche y deje calentar hasta 25 oC. Verter la mezcla de reacción en un vaso de precipitados (4 1) equipado con un agitador superior que contiene bicarbonato de sodio (115 g, 1,37 mol) yagua (350 mi). Agitar la mezcla durante 20 minutos y luego agregar EtOAc (1 1) Y agitar durante 30 minutos. Vierta la mezcla a través de tierra de diatomaceas (700 g) durante aproximadamente 30 minutos y filtre por gravedad durante

aproximadamente 1 hora. Luego aplique vacío y enjuague la tierra de diatomáceas con EtOAc (2 x 1 1). Combine y concentre la capa organica para dar un aceite amarillo viscoso con un peso crudo de 117 g. Purificar el aceite por cromatografía instantánea sobre gel de sílice (DCM a 90 % de DCM/MeOH, gradiente). Secar el material resultante en un horno de vacío a 50 oC para dar el compuesto del título como un sólido espumoso blanco (44,22 g, 38 %). LCESIMS mIz 342,3 [M+Hf, T R = 0,96 mino

Ejemplo 2

('Ny--Nl I LVC1 ~NyNI(1

HNy0

O

Añadir juntos 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6, 7 -tetrahidropirido[2,3-dlpirimidin-4-ona; ácido tetra 2,2,2-trifluoroacético (0,556 g, 0,788 mmol), 3-cloropicolinaldehido (557,87 mg, 3,94 mmol) en DMF (3 mi) seguido de cianoborohidruro

5 de sodio (148,6 mg, 2,36 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 días. Diluir la reacción con CHCI3 (75 mi) y lavar con NaHC03 saturado y salmuera. Secar sobre Na2S04, filtrar y concentrar hasta sequedad. El producto crudo se purifica por cromatografía en gel de sílice eluyendo con DCM hasta 90 % de DCM/MeOH para dar el producto del título (214 mg, 72 %). LC E ES/MS mIz 375,3 eSCI) (M+H)~.

Los siguientes Ejemplos 3, 4 Y5 se preparan esencialmente sigu iendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2,

10 usando el aldehído o la cetona apropiados, agitando a temperatura ambiente durante 2 horas hasta 48 horas y monitorizando la reacción para completar, añadiendo más cianoborohidruro de sodio si es necesario y agitando por otras 24 horas

Tabla 1 5

Ej.No. ,

Nombre quimico Estructura LCES/MS miz

3'

2-[ 4-[(3-Bromo-2 -piridil)metillpiperazin-1-il]-8melil-3 ,5,6,7 -lelrahidropirido[2,3-dlpirimidin4-ona OCN1 I '" B,~Ny))HN O 419,1(9Br) (M+Hf

4' ,

2-[ 4-[(3-Hidroxi-2 -piridil )metil]piperazin-1 -il]8-m etil-3,5, 6,7 -tetrah idropirido[2 ,3dlpirimidin-4-ona OH órN1 I '" N ~Ny))HN I O 357,2 (M+H)·

5'

8-Metil-2-[4-[ 1-[5-(trifluorometil)pirimidin -2il]etil]pi perazin-1-il]-3,5, 6 ,7tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona ~ylN'l I F '" N ~NyXJHN a 374,2 (M+H)·

... Se añadió MeOH (1 mi) además de DMF como disolvente. b . El diclorometano es un d isolvente y se usa triacetoxiborohidruro de sodio en lugar de borohidruro de sodio. c. MeOH es disolvente

Ejemplo 6

15

Sal de ácido d]pirimidin-4-ona 4-metilbencenosulfónico 8-Metil-2-[4-(pirimidin-2-ilmetil)piperazin-1-il]-3,5,6,7 -tetrahidropirido[2,3

16

NIf"Nl I '" N ~NyNI(1HN~

US~

O

o· 'OH

Añadir 8-melil-2-[4-(pirimidin-2-ilmetil)piperazin+ 1-il].3,5,6, 7 -telrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona (274,5 mg, 0,804 mmot) a elanol (0,5 mi) y añadir monohidrato de ácido toluenosulfónico (160 mg). Se somete a sonicación para dar una solución de color rojo ámbar oscuro. Agregue heplano (5 mi), tape la mezcla, agite y caliente la mezcla hasta 80 oC. La mezcla se solidifica en un sólido marrón oscuro. Agitar la mezcla durante 30 minutos, recoger el sólido por filtración al vacio y secar al aire para dar el compuesto del titulo (387 mg, 94 %)

Ejemplo 6 Difracción en polvo de rayos X

Los patrones XRPD de sólidos cristalinos se obtienen en un difractómetro en polvo de rayos X Bruker D4 Endeavor, equipado con una fuente CuKa (11 = 1,54060 Á) Y un detector Vantec, que funciona a 35 kV Y 50 mA. La muestra se escanea entre 4 y 40" en 28, con un tamaño de paso de 0,0087" en 28 y una velocidad de escaneo de 0,5 segundos/paso, y con divergencia de 0,6 mm, antispersión fija de 5.28mm y ranuras detectoras de 9,5 mm. El polvo seco se empaqueta en un soporte de muestra de cuarzo y se obtiene una superficie lisa utilizando un portaobjetos de vidrio. Es bien conocido en la técnica de la cristalografía que, para cualquier forma cristalina dada, las intensidades relativas de los picos de difracción pueden variar debido a la orientación preferida que resulta de factores tales como la morfología y hábito del cristal. Donde están presentes los efectos de la orientación preferida, las intensidades maximas se alteran, pero las posiciones pico caracteristicas del polimorfo no cambian. Véase, por ejemplo The U. S. Pharmacopeia 35 -National Formulary 30 Chapter <941> Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD) Official December 1, 2012-May 1, 2013 Adicionalmente, también es bien conocido en el arte de la cristalografía que para cualquier forma cristalina dada, las posiciones de los picos angulares pueden variar ligeramente. Por ejemplo, las posiciones de los picos pueden cambiar debido a una variación en la temperatura o humedad a la que se analiza una muestra, el desplazamiento de la muestra o la presencia o ausencia de un estandar interno. En el presente caso, una variabilidad de posición pico de ± 0,2 en 28 tendrá en cuenta estas variaciones potenciales sin obstaculizar la identificación inequívoca de la forma de cristal indicada. La confirmación de una forma de cristal se puede hacer con base en cualquier combinación única de picos distintivos (en unidades de " 28), típicamente los picos más prominentes. Los patrones de difracción en forma de cristales, recogidos a temperatura ambiente y humedad relativa, se ajustaron con base en los picos estándar NIST 675 a 8,85 y 26,77 grados 2-theta

Una muestra preparada del Ejemplo 6 se caracteriza por un patrón de XRPD que usa radiación CuKa que tiene picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la Tabla 1 a continuación. Especificamente, el patrón contiene un pico a 7,68 en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste en 12,02, 12,93, 15,17, 19,24 Y 23,21 con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0,2 grados.

Picos de difracción en polvo de rayos X del Ejemplo 6

Tabla 2

Pico

Ángulo (2-Theta ") Intensidad Relativa ( %)

1

7,28 20

2

7,68 100

3

9,88 15

4

12,02 46

5

12,42 16

6

12,93 69

7

13,11 36

Pico

Angulo (2-Theta ") Intensidad Relativa ( %)

8

13,76 33

9

15,17 45

10

17,02 32

11

17,24 17

12

19,24 83

13

19,88 19

14

20,27 27

15

21 ,85 36

16

22 ,06 47

17

22 ,52 23

18

23 ,21 75

19

23,42 27

20

24 ,36 38

21

24 ,80 33

22

25 ,76 21

23

25 ,87

23

24

28 ,58 28

Ejemplo 7 8-Metil-2-[4-( 1-pirimidin-2 -iletil)piperazin-1-il]-3 ,5,6 ,7 -letra h idropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona

NylN"]

I

e"N ~NyNIí"1 HNy0

5 O

Ejemplo 8 8-Melil-2-[4-( 1-pirimidin-2 -iletil)piperazin-1-il]-3 ,5,6,7 -tetra h idropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona, Isómero 1

NylNí Ie'" N ~NyNI(1

HNy0

O

Ejemplo 9

8-Metil-2 -[4.( 1 pirim idin-2 -iletíl )piperazin-1-il)-3 ,5,6,7 -letra hidropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona, Isómero 2

5 Combine la sal de bis-(ácido 2,2,2-trifluoroacético) 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6,7-tetrahidropirido [2,3-d]pirimidin-4ona (1 ,0 g), 2,1 mmol), 2-acetilpirimidina (0,38 g, 3,14 mmol), DMF (3 mi), MeOH (1 mi), cianoborohidruro de sodio (0,20 g, 3,14 mmol) y agitar a temperatura ambiente durante 20 horas. Añadir 2-acelilpirimidina adicional (0,38 g, 3,14 mmol) y cianoborohidruro de sodio (0,20 g, 3,14 mmol) y calentar a 80 OC durante la noche. Se evapora la DMF bajo una corriente de nitrógeno durante 4 días y se purifica por cromatografía instantánea sobre gel de sílice

10 eluyendo con DCM a 90 % de DCMfMeOH para dar el compuesto del titulo, Ejemplo 7 (330 mg, 44 %) como racemato

Separa r 8-metil-2 -[4-( 1-pirimid in-2-iletil)piperazin -1-il]-3 ,5,6,7 -tetrahidropirido[2, 3-d]pirimid in-4-ona usando SFC en una columna Phenomene® LuX® Cellulose-2 (2,1 x 25 cm, 5 ¡Jm). Fase móvil: 40 % de EtOH (0,2 % de IPAm)fdióxido de carbono. Caudal: 70 mlfmin. Detección: 225 nm. Obtenga el primer pico de elusión como Isómero

15 1 Y el segundo pico de elusión como Isómero 2

Ejemplo 8, Isómero 1 135 mg, 99,25 0/0 puro con 0,75 % de Isómero 2 como una impureza (TA = 4,59 min; columna PhenomeneX® LuX® Cellulose-2 (2,1 )( 25 cm, 5 ¡Jm), fase móvil: 40 % EtOH (0,2 % de IPAm)fdiÓxido de carbono, caudal: detección de 5 mlfmin: 225 nm). LC-ESfMS mfz 356,3 (M+H)'.

Ejemplo 9, isómero 2: 121 mg, 96,63 % de pureza con 3,36 % de isómero 1 como impureza (TA = 5,91 min,

20 columna PhenomeneX® Lux® Cellulose-2 (2,1 x 25 cm, 5 ¡Jm), fase móvil: 40 % EtOH (0,2 % de IPAm)/dióxido de carbono, caudal: 5 ml/min, detección: 225 nm). LC-ES/MS mIz 356,3 (M+Hf.

Ejemplo 10

8-Metil-2 -[4-( 1 pirim idin-2 -ilpropil)piperazin-1 -il)-3 ,5,6,7 -te trahidropirido[2,3-d)pirimid in-4-ona

IN0~í

'" N ~NyNIí"1

HNy0

o

25 Ejemplo 11

8-Metil-2-[4-( 1-pirimidin-2-ilpropil )piperazin-1-il)-3,5 ,6, 7 -tetrahidropirido[2,3-d)piri mid in-4-on a, Isómero 1

IN0~í

'" N ~NyNIí"1

HNy0

O

Ejemplo 12 8-Metil-2-[4-( 1-pirim idin-2-ilpropil)piperazin-1-il)-3,5 ,6,7 -tetrahidropirido[2 ,3-d)piri mid in-4-on a, Isómero 2

NyC~"l

I

C

'" N ~NyNIí"1

HNy0

O

Preparar los Ejemplos 10, 11 Y 12 siguiendo esencialmente el proceso descrito en los Ejemplos 7, 8 Y 9 usando 1-(2pirimidinil)-1-propanona y purificar mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de DCM al 90 % DCM/MeOH. Purificar por segunda vez mediante cromatografía sobre gel de sílice usando las 5 mismas condiciones. A continuación, purificar adicionalmente mediante HPLC preparativa de pH alto (Columna: 150 9 C18 Gold de alla resolución; inicial: 5 % de acetonitrilof95 % de bicarbonato de amonio 10 mM con MeOH al 5 % con gradiente hasta 60 % de acetonilrilo/40 % de bicarbonato de amonio con 5 % MeOH durante 30 min., Longitudes de onda de detección 239, 254, 280 Y 290 nm) para dar el compuesto del titulo, Ejemplo 10 (140 mg, 18 %). Separar la mezcla enantiomerica resultante usando SFC usando las condiciones descritas para los Ejemplos 8 y

10 9 con la excepción de que se usa una columna LuX® Ce!lulose-4

Ejemplo 11 , Isómero l ' 50 mg,> 99,9 % de pureza (T R "" 4,26 min; columna Phenomenex® LuX® Cellulose-4 (2,1 x 25 cm, 5 ~m), fase móvil: 40 % EtOH (0,2 % IPAm)/dióxido de carbono, caudal: 5 ml/min, detección: 225 nm). LCESIMS miz 370,2 (M+H¡+.

Ejemplo 12, Isómero 2: 47 mg,> 99,9 % de pureza (TR =lO 5,67 min; columna Phenomenex® LuX® CeUulose-4 (2 ,1 x 15 25 cm, 5 ~m). Fase móvil' 40 % EtOH (0,2 % IPAm)/ dióxido de carbono. Caudal: 5 ml/min. Detección: 225 nm), LCES/MS mIz 370,2 (M+H¡+.

Ejemplo 13

2-[4-[( 4-metoxipirim idin-2-il)metil]piperazin -1-il]-8-m etil-3,5 ,6, 7 -tetrah idropi rido[2,3-d]pirim id in-4-ona

/OyNIf'N"l I

~N ~NyNIíNI

HNy0

O

20 Combine la sal de bis-(acido 2,2,2-trifluoroacético) 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d] pirimidin-4ona (0,5 g) , 1,0 mmol), 4-metoxipirimidin-2-carbaldehído (150 mg, 1,08 mmol), DMF (10 mi), MeOH (1 mi) y cianoborohidruro de sodio (136 mg, 2,17 mmol) y se agita a temperatura ambiente durante 3 días. Se diluye con MeOH y se absorbe sobre una columna SCX-2, se enjuaga con MeOH y luego se eluye con NH3 2 M en MeOH, se concentra y se purifica por cromatografía instantanea en gel de sílice eluyendo con DCM/MeOH al 90 % para dar el

25 compuesto del titulo (43 mg, 11 %). LC-ES/MS mIz 372,1 (M+H)'TR= 1,519 mino

Los siguientes Ejemplos se preparan esencialmente siguiendo el procedimiento del Ejemplo 13, usando el aldehído apropiado y la cromatografía apropiada.

Tabla 3

Ej. No,

Nombre Químíco Estructura LCES/MS miz

14 ' I

8-Metil-2-[4-[(4-metilpirimidin-2il)metil]piperazin-1-il]-3,5,6, 7tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona '(If'N"l I '" N ~Ny)OHN I O 356,1 (M+H)'

Ej . No,

Nombre Quimico Estructura Le-ES/MS miz

15'

8-Metil-2-[4-{[5-(trifluoro metil)pirimid in-2il]metil] piperazin+ 1-il]-3,5,6, 7 tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona ~y"Ní I e '" N ~Ny))F3 r IHN o 41 0, 1 (M+Hf

16

8-Metil-2-[4-![4-(trifluorometil)pirimid in-2il]meti1] piperazin-1-il]-3 ,5 ,6,7tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona ~y"Ní I '" N ~Ny)) CF3 HN I o 410,2 (M+H)·

17'

8-Metil-2 -[4-[ (5-metilpirimid in-2il)metil]piperazin-1-il]-3 ,5 ,6,7tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona ~y"Ní I '" N ~Ny))HN I o 356,3 (M+ Hf

1'"'

2-[4-[ (5-Cloropirimidin -2iI)metil]piperazin-1·il]-8-metil-3,5,6,7 tetrah idropirido [2 ,3-d]pi rimidin-4-ona -Cy"Nl I el '" N ~Ny))HN o 376,0 (35CI) (M+H)·

19'

8-Metil-2 -[4-(2 -piridilmetil)piperazin-1.il]3,5,6,7 -tetra hidropirido [2 ,3-d]pirimid in-4ooa (('rl I'" N~Ny)OHN I O 341 ,2 (M+ Hf

1. Agitar la reacción durante 3 dias 2. Agregar aldehído adicional (1 eq) y cianoboroh idruro de sod io (1 ,5 eq); luego callentar a 80 oC durante 6 h, Purificación ad icional mediante procedimiento general de cromatografia en fase reversa (pH allo 5-100). 3. Purificación adicional mediante procedimiento general de cromatografla en fase reversa (pH alto 9-24) ~. Purificación adicional mediante procedimiento general de cromatografía en fase reversa (pH bajo 0,1 % TFA/ACN) seguido por cromatografía en una columna SCX-2. 1'· Agita, la ,eaocióo a 'empe,a',", ambieo'e d"ao'e 12 ho"" Y p""ca, adiciooalmeo'e mediante un procedimiento general de cromatografía en fase reversa (pH allo 13-48).

2 -[4-[(3-Fluoro-2-piridil )metil]piperazin-1-il]-8-metil-3,5 ,6,7 -tetrah idropirido[2,3-d]pirimid in-4-ona

~N'l

I

~) ~NyNIí"1

HNyV

O

Suspender bis-(ácido 2,2,2 -trifluoroacético) 8-metil-2 -piperazin -1-il-3, 5, 6, 7 -tetrahidro pirido[2 ,3-d]pirim idin-4-ona

5 (20,31 g, 34,34 mmol) en DCM (114 mi) y purgar con nilrógeno. Agregar 3-f1uoropiridin-2-carbaldehido (5,26 g, 41,2 mmol) y agitar durante 60 minulos. Luego agregue Iriacetoxiborohidruro de sodio (14,56 g, 68,68 mmol) en una porción y observe una exoterma hasta reflujo. Agite y deje que la reacción se enfríe hasta temperatura ambiente durante 1 hora. Verter en NaOH 0,5 M (200 mi) y ajuslar el pH: 7-8 con NaOH 2M. Recoger la capa orgánica y extraer la capa acuosa con DCM (2 x 200 mi). Combine y seque las capas orgánicas sobre sulfato de sodio, filtre y

10 concentrese para obtener un aceite. Se purifica por cromatografía en gel de sílice (400 g), eluyendo con 95 % de DCM/5 % de MeOH para 8 volúmenes de columna y con 90 % de DCM/10 % de MeOH para 8 volúmenes de columna para dar el compuesto dellitulo (7,59 g, 61,7 °/0) 97 % de pureza por HPLC y también 2,64 g (21 ,5 %) de producto adicional con 87 % de pureza por HPLC. LC ES/MS mIz 359,1 (M+1 f.

Ejemplo 21

15 2-[4-[(2 -Metoxifenil)meti l]piperazin-1-il]-8-metil-3,5,6, 7 -tetra hidropirido[2,3-d]pirim idin-4-ona

'o

.!rr'l

I

U ~NyNIí"1

HNyG

o

Combine sal de bis-(2,2,2-ácido trifluoroacético) 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6, 7 -tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona (0,25 g , 0,52 mmol), 2-metoxibenzaldehído (0,21 g, 1,57 mmol), DMF (15 mi), MeOH (5 mi) y cianoborohidruro de sodio (100 mg, 1,57 mmol) y se agita a temperatura ambiente durante 12 horas. Diluir con metanol y absorber en

20 una columna SCX-2, enjuagar con MeOH y luego eluir con NH3 2 M en MeOH, concentrar y purificar por cromatografia en fase reversa, véase el procedimiento general para cromatografía reversa (pH alto 21-55) para dar el compuesto del titulo (223 mg , 59 %). LC-ES/MS mIz 370,2 {M+H(

Los Siguientes compuestos se preparan esencialmente como se describe en el Ejemplo 21 usando el aldehído apropiado

25 Tabla 4 Ejemplo 28 D ihidrocloruro de 2-[4-[( 3-Fluoro-2 -piridil )melil]piperazin-1-il]-8-metil-3,5, 6, 7 -letrahidropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona

Ej . No. ,

Nombre químico Estructura Le-ESfMS miz

22

2-[4-[ {2-Fluorofenil )meti l]piperazin-1-il)-8-metil3,5,6,7 -tetrah idropirido[2 ,3-d)pirimidin -4-ona F(rN'l I'" ~Ny)OHN I O 358,2 (M+H)'

Ej. No. ,

Nombre químíco Estructura le-ES/MS miz

23'

8-Metil-2-[4-( o-tolilmetil)piperazin-1-il]-3 ,5,6,7 tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona (rN'l 1 >~Ny))HNI O 354,2 (M+H(

24"

8-Metil-2 -[4-[(3-metil-2 -piridil )metil]piperazin-1il]-3 ,5, 6 , 7 -tetrahidropirido [2 ,3-d]pirimid in-4-ona (rN'l 1"N ~Ny))HN I O 355,2 (M+H)+

25'

2 -[4-[(3-Metoxi-2 -piridil )metil]piperazin-1-il]-8metil-3 ,5,6,7 -letrahidropirido[2 ,3-d]pirimid in-4ooa o/(('N'l 1 ~ N~Ny))HN I O 371 ,2 (M+H(

26"

8-Metil-2 -[4-[[3-(trifluorometil)-2piridil]metil]piperazin-1-il]-3,5,6, 7tetrahidropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona CF, (('N'l 1 ~ N~Ny))HNI O 409,2 (M+H(

27'

8-Metil-2-[4-[[2-(trifluorometil)fenil]meth il]piperazin-1-il]-3, 5, 6,7-telra hidropirido 12 ,3d]pirimidin-4-ona CF,ÓJN'l 1" ~Ny))HNI o 408,2 (M+H)+

•. Cromatografía en fase reversa (pH alto 30-64) b. Cromatografía en fase reversa (pH alto 23-57) l'emmalogea!;a eo la,e ,e,e",a (pH alto 13-48) d. Cromatografía en fase reversa (pH alto 39-73)

~NlHCI I

Hel

lv~ ~NyNIí"1 HN~

o

En 2 viales, agregue a cada uno DCM (5 mi) Hel 4M en dioxano (1 mi, 4 mmol) y 2-[4-[(3-fluoro-2-piridil) metil]piperazin-1-il]-8-metil-3,S,6,7-letrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona (0,127 g, 0,65 mmol). Agite los viales durante 1 hora, combine en 1 vial y luego evapórese bajo una corriente de nitrógeno durante la noche. Secar el material en un horno de vacio durante la noche para dar el compuesto del titulo (0,28 g, 99 %). LC-ES/MS mIz 359,2 [M+Hf. TR: 1,04 min

Los siguientes Ejemplos se preparan esencialmente como se describe en el Ejemplo 28 usando el compuesto apropiado de los Ejemplos 21 -27

Tabla 5

Ej. No,

Nombre químico Estructura LC-ES/MS mIz

29

dihidrocloruro de 2-[4-[(2Metoxifen il)melil]piperazin+1-il]-8-melil+3,5, 6,7lelrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona ' O Hel Hel (rNl I " ~Ny):)HN I O 370,2 (M+Ht

30

dihidrocloruro de 2-[4-[(2Fluorofen il)metil]piperazin-1-il]-8-melil-3 ,5,6,7lelrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona F Hel Hel (rNl I " ~Ny):)HN I O 358,2 (M+Ht

31

dihidrocloruro de 8-Melil-2-[4-(ololilmelil)piperazin-1-il]-3,5,6 , 7 lelrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona HelCr Hel P ""'l I ,,1 ~"Y):)HN I O 354,2 (M+Ht

Ej , No,

Nombre químico Estructura lC-ESIMS mIz

32

dihidrocloruro de 8-Metil-2-4-[(3-melil-2piridil)melil]piperazin-1-il]-3,5,6, 7letrahidropirido[2,3-d]pirim idin-4-ona Cr Hel Hel v , rrl I '" N ~"yNIí"1HNy0 o 355,2 (M+ Ht

33

dihidrocloruro de 2-[4-[(3-Meloxi-2. piridil )melil]piperazin-1-il]-8-metil-3,5 ,6, 7 lelrahidropirido[2,3-d]pirim idin-4-ona o 371 ,2 (M+ Ht

34

dihidrocloruro de 8-Melil-2-[4-(2-piridil melil}piperazin-1-il]-3, 5,6,7tetrah idropirido[2,3-d]pirim idin-4-ona Ha Hel ("'¡("'N1 I ~N ~NyNIíNI HN~ O 341 ,2 (M+ Ht

35

dihidrocloruro de 8-Melil-2-[4-[[3-(lrifluorometil)2-pirid il]melil]piperazin-1-il]-3,5,6,7 -tetrah idropirido[2,3-d]pirim idin-4-ona ¿rO:N)~'HN~ O 409,2 (M+ Ht

36

dihidrocloruro de 8-Melil-2-[4-[[2(Irifluoromelil)fenil]metil]pi perazin-1 -il]-3,5,6,7tetrah idropirido[2,3-d]pirim idin-4-ona CF3 HCI () He l V 1 "1 I '" ~NyNIíNIHN~ O 408,2 (M+ Ht

Ejemplo 37

2 -[[4-(8-Melil.4-oxo-3, 5,6,7 -telrahidropirido[2, 3-d]pirimidin-2-il)piperazin.1-il]metil]benzonilrilo; acido bis-2,2,2trifluoroacético

cY o

N Jl \,

1 Ha IF

F

r I N1 I

"" ~N'f':;oNN

HN I

o

o Jl LF

Ha' I

F

Combine una solución de bis-(ácido 2,2,2-lrifluoroacélico) 8-melil-2-piperazin-1-il-3,S,6,7-tetrahidropirido [2,3-d) pirimidin-4-ona (0,364 g, 0,76 mmol) en DMF (3,2 mi) con 2-cianobenzaldehido (0,499 g, 3,18 mmol) y se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. Agregar cianoborohidruro de sodio (0,143 g, 2,28 mmol) y agitar a 5 temperatura ambiente durante la noche. Viértalo en agua e inlenle recogerlo por filtración. Observe la obstrucción del filtro y luego agregue NaOH 2 N Y NaCI (acuoso) y extraiga el produclo crudo en acetato de etilo (3x). Combine las capas organicas, seque sobre sulfato de sodio, filtre y concentre. Se purifica por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con 98 % de DCM/elanol isocrático al 2 % durante 10 min con gradiente por etapas hasta 95 % de DCM/etanol al 5 % Y se mantiene durante 45 minutos. Purificar adicionalmente por cromatografía en fase reversa

10 preparativa eluyendo con 5 % de acetonitrilo {0.1 % de TFA)/95 % de agua (0.1 % de TFA) gradiente a 54 % de acetonitrilo {0.1 % de TFA)/46 % de agua (0.1 % de TFA) para dar el compuesto del titulo (48,1 mg, 10,7 %). LCES/MS mIz 365,2 [M+Hf

Ejemplo 38

2 -[4-[{2 -Clorofen il)metil)piperazin-1-iI)-8-m etil-3,5 ,6, 7 -tetrahidropirido[2 ,3-d )pirimidin-4-ona

15 o

Preparar el compuesto del título esencialmente como se describe en el Ejemplo 37 usando 2-cloro-5-metil-pirimidina 2-clorobenzaldehído. Se purifica el material crudo por cromatografia instantanea en gel de silice (EtOH al 5 %ICHCI3 hasta gradiente de EtOH al 10 %ICHCI3). Recristalizar el material de DMSOIMeOH para obtener un sólido blanco (83 mg, 29 %). LC-ESIMS mIz 374,3 eSCI) [M+Ht

20 Ejemplo 39

2-[4-[(5-Fluoropirimidin-2 -il )metil)piperazi n -1-ilj-8-m etil-3,S,6, 7 -tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona

Combine trifluoro-[[4-(8-metil-4-oxo-3, 5,6,7 -tetrahidropirido[2 ,3-d)pirimid in-2-il)piperazin-1-il)metil) boranu ida de potasio (273 mg, 0,74 mmol), 2-cloro-5-nuoropirimidina (98 mg, 0,74 mmol), carbonato de cesio (723 mg, 2,22 25 mmol), X-Phos (71 mg, 0,15 mmol), THF (10 mi) yagua (1 mi) y desgasificar con una corriente de nitrógeno durante 2 minutos. Agregar acetato de paladio (11) (17 mg. 0,074 mmol) y calentar a 80 oC durante la noche. Someter a partición la mezcla entre acetato de etilo yagua y separar la capa orgánica. Secar sobre sulfato de magnesio, filtrar y concentrar el filtrado bajo presión reducida. Se purifica el residuo resultante mediante cromatografía instantánea de gel de sílice eluyendo con DCM hasta DCM/MeOH al 90 % para dar el compuesto del título (20 mg, 7,5 %). LC

30 ESIMS mIz 360 ,2 [M+Hf .

Ejemplo 40

2 -[[4-(8-Metil-4-oxo-3, 5,6,7 -telra hidropirido[2, 3-d]pirimidin-2-il)piperazin-1-il]metil)piridin-3-carbonitrilo

J, -N1 I

(Y'~NyN"NI

HNy0

o

Disolver 2-[4 -[(3-bromo-2-piridil) metíl) piperazin-1-il]-8-metil-3,S,6,7-letrahidropirido [2,3-d] pirimidin-4-ona (167 mg, 0,388 mmol) en DMF (10 mi) y desgasificar con una corriente de nitrógeno durante 1 minuto. Agregue tetrakis(trifenilfosfina)paladio (92 mg, 0,080 mmol) y cianuro de zinc (187 mg, 1,59 mmol) y calentar la mezcla a 120 oC durante la noche. Enfriar la reacción y diluir con MeOH. Transferir la mezcla a una columna SCX-2 de 10 9 Y eluir con NH3 2 M en MeOH. Se concentra y se purifica adicionalmente la cromatografía en fase reversa del residuo resultante (pH allo 9-29) para dar el compuesto del titulo (35 mg, 24 %)_LC-ESfMS mIz 366,2 (M+H)'

Ejemplo 41

2-[4-[(4-Cloropirimid in-2-il )metil]piperazin-1 il]-8-metil-3,5 ,6,7 -tetra hidropirido [2 ,3-d]pirimid in-4-ona

e, N-,./'-/'-..

y··...11 N 1 I "vN ~NyN"NI

HNy0

o

Combinar 2-(bromometil)-4-cloro-pirimidina (322 mg, 1,55 mmol) como una solución cruda en tetracloruro de carbono (5 mi), DCM (2 mi), trietilamina (0,65 mi, 4,65 mmol) y bis-(ácido 2,2,2-triftuoroacético) 8-metil -2-piperazin1-il-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d] pirimidin-4-ona (739 mg, 1,55 mmol) y agitar a 25 oC durante 3 dias. Someter a partición la mezcla de reacción entre DCM yagua y extraer la capa acuosa con DCM. Combine las capas orgánicas, seque sobre MgS04, filtre y concentre. Purificar el residuo resultante mediante SFC guiada por masa (columna: 4nitrobenceno sulfonamida, cromatografía Princeton, 150 >< 30 mm, caudal = 100 ml/min; procedimiento: 95 % de C02famoniaco 14 mM en MeOH isocrático durante 30 segundos, luego gradiente a 60 % de C02famoniaco 14 mM en gradiente de MeOH durante 330 segundos, luego aumentar al 50 % de COzfamoniaco 14 mM en MeOH durante 10 segundos y mantener durante 30 segundos) para dar 71 mg de producto deseado con impurezas de sal de amoníaco El producto se purifica adicionalmente mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (CH2ClzfMeOH, 90:10) para dar el compuesto dellítulo (28 mg, 5 %). LC-ESfMS mfz 376,0 [M+H]'

Ejemplo 42

8-Metil-2 -[4-(pirazin-2 ·ilmetil )piperazin-1-il]-3, 5,6,7 -tetrahidropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona

pNI

rN1

"N) ~NyN"NI

HNy0

O

Combinar bis-(acido 2,2,2-trifluoroacético) 8-metil-2.piperazin-1-il-3,5,6,7 -tetrahidropirido[2,3-d)pirimidin-4-ona (500 mg, 1,05 mmol), trielilamina (0,73 mi, 5,2 mmol), yoduro de sodio (78,5 mg, 0,52 mmol) y acetonitrilo (7 mi). Se agrega 2-(clorometil)pirazina (201 mg, 1,57 mmol) y se agita a 25 oC durante 72 h. Diluya la reacción con DCM y agua y extraiga el producto en DCM. Lave la porción orgánica con NaHC03 saturado y salmuera, secar sobre Na2S04, filtrar y concentrar. Se purifica el residuo resultante mediante cromatografía instantanea sobre gel de sílice (DCMfNH32 M en MeOH, 90:10) para dar el compuesto del título como un sólido amarillo (249 mg, 0,72 mmol, 70 %). LC-ESfMS mfz 342,0 [M+H]', TR =0,99 min

Los siguientes Ejemplos se preparan esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 42, usando la halo-metilpirazina apropiada

Ej. No,

Nombre químico Estructura l C-ES/MS miz

43

2 -[4-[{3-Cloropirazin-2 -il)metil]piperazin -1iIj-8-m etil-3,5, 6,7 -tetrah idropirido[2 ,3d]pirimid in-4-ona (:eN1 I'N CI~Ny))HN I O 376,0 [M+H]' , T, = 1,17 mln,

44 I

8-Metil-2 -4-[ (3-metilpirazin-2il)melil]piperazin-1-il]-3,5,6, 7tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4-ona (JCNl I'N ~Ny))HN I O 356,0 [M+H]' , T, = 1,03 min,

Ejemplo 45

2 -[4-[{3 ,5-0ifluoro-2-piridil )metil]piperazin-1-il]-8-metil-3 ,5 ,6, 7 -tetra hidropiri do [2 ,3-d]pirimid in-4-ona

(-'N'('Nl I

F~F ~NyNI(1HN~

5 O

Añadir 2-{clorometil)-3,5-difluoropiridina (182 mg, 1,11 mmol), 8-metil-2-piperazin-1-il-3,5,6,7 -tetrahidropirido[2,3d]pirimidina-4-ona (260 mg, 1,04 mmol), carbonato de potasio (2,2 g, 15 mmot) y acetonitrilo (5 mt) y agitar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche_ Se concentra la mezcla de reacción bajo presión reducida y se purifica el residuo mediante cromatografía sobre gel de sílice (elucíón con MeOH/OCM, 1120) para dar el compuesto del título

10 (160 mg, 43 %). LC-ESfMS mfz 377,2 (M+H) +, T RO: 1,11 mino

El cáncer se reconoce cada vez más como una colección heterogénea de enfermedades cuya in iciación y progresión son inducidas por la activación o función aberrante de uno o más genes que regulan la reparación del AON, la estabilidad del genoma, la proliferación celular, la muerte celular, la adhesión, la angiogénesis, la invasión y la metástasis en microambientes celulares y tisulares_ La función variante o aberrante de los genes ·cancerosos· 15 puede ser resultado del polimolfismo de AON natural, cambios en el número de copias del genoma (a través de amplificación, deleción, pérdida cromosómica o duplicación), cambios en la estructura génica y cromosómica (a través de translocación cromosómica, inversión o otra reordenación que conduce a la expresión génica desregulada) y mutaciones puntuales. Las neoplasias cancerosas pueden ser inducidas por una función génica aberrante, y mantenidas por la misma función genética aberrante, o mantenimiento y progresión exacerbados por activaciones o

20 funciones de genes aberrantes adicionales

Más allá de las aberraciones cromosómicas genéticas mencionadas anteriormente, cada uno de los cánceres también puede incluir modificaciones epigenéticas del genoma, incluida la melilación del AON, la impresión genómica y la modificación de histonas por acetilación, metilación o fosforilación. Una modificación epigenética puede desempeñar un papel en la inducción yfo mantenimiento de la malignidad

25 Se conocen y se usa de forma rutinaria el diagnóstico de malignidades cancerosas mediante biopsia, inmunofenotipo y otras pruebas. Además de las bandas cromosómicas de alta resolución y las tecnologías de imágenes cromosómicas avanzadas, las aberraciones cromosómicas en casos sospechosos de cáncer se pueden determinar mediante analisis citogenéticos como hibridación fluorescente in situ (FISH), cariotipo, cariotipo espectral (SKY), F1SH múltiple (M-F1SH ), hibridación genómica comparativa (CGH), matrices de polimorfismos de un solo nucleótido

30 (Chips SNP) y otras pruebas de diagnóstico y de análisis conocidas y usadas por los expertos en la técnica.

Una parte importante de la ruta de señalización de Wntl¡3-catenina es la proteólisis regulada de la ¡3-catenina en dirección 3 mediante el complejo de destrucción de ¡3-catenina. Los principales constituyentes del complejo de destrucción de ¡3-catenina son la poliposis adenomatosa coli (APC), Axin y GSK3a/¡3. En ausencia de la activación de la ruta Wnt, la ¡3-catenina citosólica se fosforila constitutivamente y se dirige a la degradación. Tras la 35 estimulación de Wnt, el complejo de destrucción de ¡3-catenina se disocia, lo que conduce a la acumulación de ¡3

Se han realizado esfuerzos considerables para identificar agentes farmacéuticos que inhiban la ruta de señalización canónica de WnU¡3-catenina. Inhibidores de TNKS1 y TNKS2 tales como XAV939, Huang et al., Nature, 2009, 461, 614; JW55, Waaler et al., Cancer Res ., 2012, 72(11), 2822; G007-LK, Lau et al., Cancer Res., 2013, 73(10), 3132; TNKS656, Shultz et al., J. Med. Chem. publicado en línea el11 de julio de 2013, DOI: 10.1021/jm400807n; y WO 2013/117288 son conocidos. A pesar de estos esfuerzos, en este momento no han surgido agentes terapéuticos inhibidores clínicos de TNKS1 y TNKS2.

Se ha observado en cánceres la activación aberrante de la ruta , mediada por la sobreexpresión de proteínas Wnt o mutaciones que afectan a los componentes del complejo de destrucción de ¡3-catenina, lo que conduce a la estabilización de ¡3-catenina. Notablemente, las mutaciones truncadoras de APC son las alteraciones genéticas más prevalentes en carcinomas colorrectales (Miyaki, M. et al. Cancer Res. 1994, 54, 3011-20; Miyoshi, Y. et al. Hum.

Mol. Gene!. 1992, 1, 229-33; and Powell, S. M. et al. Nature 1992, 359, 235-7). Además, las mutaciones Axin1 y Axin2, reguladores negativos de la ruta de señalización Wnt, se han identificado en pacientes con hepatocarcinomas y cáncer colorrectal respectivamente (Taniguchi, K. et al. Oncogene 2002, 21, 4863-71; Liu, W. et al. Na!. Gene!. 2000, 26, 146-7; Lammi, L. et al. Am. J. Hum. Gene!. 2004, 74, 1043-50). Estas mutaciones somáticas dan como resultado la estabilización de ¡3-catenina independiente de Wnt y la activación constitutiva de la transcripción mediada por ¡3-catenina.

La actividad de la ruta de señalización Wnt aberrante ha sido implicada en varios cánceres (Waaler et al. Cancer Res. 2012, 72, 2822-2832; Busch et al. BMC Cancer 2013, 13, 211; Yang et al. Oncogene 2011, 30, 4437-4446; De Robertis et al. Mol. Cancer Ther. 2013, 12, 1180-1189; Polakis, P. Curr. Opino Gene!. Dev. 2007, 17, 45-51; and Barker, N. et al. Na!. Rev. Drug Discov. 2006, 5, 997-1014), incluyendo cáncer colorrectal, gastrico, hepático, de mama, cáncer de mama triple negativo, ovario, meduloblastoma, melanoma, pulmón, pulmón de células no pequeñas, páncreas, cáncer de próstata y glioblastomas. La actividad de señalización de la ruta aberrante de WnV¡3catenina ha sido implicada en el linfoma de células T, linfoma T -linfoblástico, leucemia linfocitica aguda de células T (T-ALL) Groen et al. Cancer Res. 2008, 68, 6969-6977; mieloma múltiple Oiang et al. Oncogene 2003, 22, 15361545, Y Chim et al. Leucemia 2007, 21, 2527-2536; linfoma de células de manto Gelebart et al. Blood 2008, 112, 5171-5179; leucemia mieloide crónica (CML), Heidel et al. Cell Stem Ce1l 2012, 10(4):412-424, y leucemia mieloide aguda (AML), Ysebaert et al. Leukemia 2006, 20, 1211-1216.

Se ha descubierto que la degradación de ¡3-catenina puede promoverse estabilizando el complejo de destrucción Axin/APC/GSK3a/¡3 a través de la inhibición de las enzimas poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) tanquirasa 1 y tanquirasa 2, Huang et al. Nature 2009, 461, 614-620.

Los siguientes estudios in vitro e in vivo demuestran la actividad inhibidora de la ruta de señalización de WnU¡3catenina y la eficacia de compuestos ejemplificados y probados de Fórmula 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la inhibición de hTNKS1 y hTNKS2, estabilización de Axin2 en células HEK293, selectividad contra la inhibición de PARP1, reducir la expresión de la expresión de genes inducibles por Wnt y la actividad antitumoral in vivo. Estos ensayos generalmente son reconocidos por los expertos en la técnica como indicativos de la actividad quimioterapéutica clínica humana. Se cree que la inhibición de TNKS 1 y TNKS 2 es efectiva contra la activación aberrante de la ruta de señalización WnU¡3-catenina. Los ensayos que evidencian la actividad inhibidora de la ruta de señalización de Wntl¡3-catenina y la eficacia se pueden llevar a cabo sustancialmente de la siguiente manera o mediante ensayos similares que proporcionan datos similares.

Ensayos

En general, las lineas celulares se generan usando materiales comercialmente disponibles y mediante procedimientos conocidos y utilizados rutina riamente por los expertos en la técnica

Ensayo bioquímico para demostrar la inhibición compuesta de la actividad de la enzima hTNKS

La actividad enzimatica de hTNKS1 y hTNKS2 se establece usando un ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELlSA) que detecta poli ADP ribosa incorporada en la proteína de factor 1 de enlazamiento repetitivo Telomárico (TRF1) enlazada a placa (NCBJ, Número de acceso NP _059523.2 (SEO ID NO: 1) en un formato de 384 pozos. Utilizando la enzima recombinante hTNKS1 (NCBI, Número de acceso NP _003738.2 (SEO ID NO: 2) o hTNKS2 (NCBI, Número de acceso NP_079511.1 (SEO ID NO: 3), este ensayo usa NAD+ biotinilado y mide su incorporación en hTRF1 recombinante utilizando un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano (HRP) y sustrato de peroxidasa TMB para generar una señal calorimétrica. La proteína hTRF1 etiquetada con Flag recombinante se genera expresando proteína TRF1 humana de longitud completa con una etiqueta Flag en Ntenninal en E. coli. La proteína recombinante Flag -hTNKS1 (con un cambio de 083P) se genera expresando TNKS1 humana de longitud completa con una etiqueta Flag de N-terminal en Baculovirus de acuerdo con el protocolo del fabricante del sistema de Expresión de Baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen™; Véase también el Manual de usuario de Invitrogen™, Versión F, de 4 de septiembre de 2010; y el Manual de instrucciones de Invitrogen™ con fecha del

Se diluye Flag-TRF1 a 5 ¡Jgfml usando tampón de recubrimiento TBS (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCI 150 mM) y se añaden 25 ¡JI a cada pozo de una placa Corning 3700 (Tewksbury, MA # CLS3700). Las placas se incuban durante 5 la noche a 4 oC. Al día siguiente, las placas se lavan 3 veces con 50 ¡Jlfpozo de tampón de lavado (PBS (preparado a partir de concentrado 10x usando Hyclone, Logan, UT # SH30258.01) con Tween-20 al 0,1 % (Sigma, SI. Louis, MO # 7949» seguido de bloqueo durante 1,5 horas a temperatura ambiente usando 50 ¡JI de tampón de bloqueo de caseína al1 % (Thermo Scientific, Waltham, MA n.o 37528) en 1x PBS (Rache, Indianapolis, IN # 11666789001). Después del bloqueo, las placas se lavan 3 veces con 50 ¡JI/pozo de tampón de lavado. El ensayo enzimático se 10 establece usando 2 ¡Jg/ml de Flag-hTNKS1, 9,5 ¡JM de NAO+ (Sigma, SI. Louis, MO #N0632), 0,5 ¡JM de biotinaNAO+ (Trevigen, Gaithersburg, MO # 4670-500-01 ), Ycompuestos diluidos de 10 ¡JM a concentración final 4 nM en Tris 50 mM, pH 8,0 (Invitrogen™, Grand Island, NY # 15568-025), MgCI2 4 mM, DIT 0,2 mM, Triton X-100 al 0,5 % (Rache, Indianapolis), IN # 11332481001) y 1.0 % de OMSO en un volumen total de 25 ¡JI. La reacción se incuba durante 120 minutos a temperatura ambiente y se detiene lavando la placa 3 veces con 50 ¡Jlfpozo de tampón de 15 lavado. La detección de la incorporación de biotina-NAO+ se realiza usando 25 ¡Jlfpozo de estreptavidina-HRP (GE Life Sciences Pittsburgh, PA # RPN1231V) diluido 1. 3000 con tampón de lavado e incubado durante 60 minutos a temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces usando 50 ¡JI/pozo de tampón de lavado. Esto es seguido por la incubación con 25 ¡Jlfpozo del kit de sustrato de peroxidasa TMB (KPL, Gaithersburg, MO # 50-76-02 Y# 50-65-02) durante 15 minutos a temperatura ambiente y deteniendo la reacción usando 25 ¡JI/pozo de H2S04 2 N. La

20 absorbancia se lee a 450 nm usando un modelo Envision 2103.

Siguiendo sustancialmente los procedimientos descritos anteriormente para hTNKS1, y usando hTNKS2, se prepara un ensayo de ElISA esencialmente similar.

La actividad de esos compuestos probados contra ambas isofonnas hTNKS se muestra en la Tabla 7

Tabla 7

Ejemplo No.

hTNKS1 ICso (nM) hTNKS2 ICso (nM)

1

19 ,1 (t 17,7, n=13) 13 ,7 (t 7,77, n=13)

2

10 ,7 (t7 ,13 , n=617) 6,25 (t 1,20 , n=5)

3

10,9 (t 10,5, n=4) 6,58 (%4,48, n"'5)

4

26,4 (t 11 ,2, n=5) 11 ,6 (t6 ,88 , n"'5)

5

85 ,2 (t 35,5, n=8) 69,4 (t17 ,6, n"'8)

6

17 ,5 (t 6,48, n=3) 9,95

7

41 ,9 (t 19,9, n=5) 37 ,1 (t8 ,12 , n"'5)

8

94 ,8 (t 2,99 , n=3 f4) 68 ,7 (t 8,48 , n=3f4)

9

83 ,3 (t 89,4 , n=4) 54 ,9 (t 44,7, n=4)

10

158 (t 89 ,0, n"'4) 121 (t11 ,3, n"'4 )

11

32 ,7 (t 29,9, n=5) 24 ,7 (t 20,0, n=5)

12

27 ,5 (t 32,7 , n=5) 22 ,0 (t 15,1, n=5)

13

14 ,9 (t 9,89 , n=617) 12,4 (t3 ,67 , n"'6)

14

22 ,8 (t 13,0, n=7) 11 ,7(t7,32 , n=6)

Ej emplo No,

hTNKS1 ICso (nM) hTNKS2 ICso (nM)

15

25,3 (i: 5,05, n;6f7) 16,7 (i:5, 16, n-S)

16

55,1 (i: 32,5, n=6) 43,4 (i: 23,8, n=4)

17

67,6 (i:64,7, n=5) 81 ,5 (i:9,15, n=4)

18

114 (i:84,2, n=6) 85,1 (i: 6,72, n=5)

19

19,9 (i: 6,75, n=5) 11 ,8 (i: 6,55, n=5)

20

31 ,8 (i:38 ,2, n=6) 11 ,3 (i: 4,26 , n=5)

28

29,5 (i: 47,3, n=5) 35,8 (i: 19,1 , n=4f5)

29

18,4 (i:13 ,3, n=5) 14,1 (i: 3,57 , n=5)

30

41 ,7 (i:40 ,2, n=5) 24 ,5 (i:22 ,6, n=5)

31

15,2 (i:5 ,04 , n=5) 12,2 (i: 4,59 , n=5)

32

37 ,2 (i:39 ,7, n=6) 22 ,7 (i:24 ,2, n=6)

33

35 ,8 (i: 32,5 , n=6) 26 ,6 (i: 20,8 , n=6)

34

47 ,6 (i:36 ,6, n=5) 11 ,6 (i:4,30 , n=4)

35

21 ,6 7,54

36

26 ,2 (i: 2,55 , n=5) 17,6 (i:11 ,0, n=5)

37

19,8 (i: 13,3, n=4) 10,8 (i: 1,34 , n=4)

38

45 ,3 (i: 32,0 , n=4) 30 ,2 (i: 5,13, n=4)

39

30,3 (i: 26,6, n=6) 15,9 (i: 8,48, n=6)

40

14,3 (i: 4,89, n=5) 8,41 (i: 1,99, n=5)

41

14,5 (i: 10,7, n=5) 10,6 (i: 3,51 , n=5)

42

19,8 (i: 15,9, n=5) 13,0 (i:7,41 , n=5)

43

34 ,3 (i: 12,7, n=4) 12,7 (i: 6,54 , n=4)

44

17,6 (i: 8,49 , n=6) 12,7 (i: 2,49 , n=6)

45

37 ,3 (i: 11,1 , n=6) 19,6 (i: 9,93 , n=6)

Med ia i: SEM; SEM = error estándar de la media

Ensayo de estabilización de EGFP Axin2 para demostrar la actividad basada en células de los inhibidores de la tanguilarasa

5 l as células de Proteína Fluorescente Verde Mejorada-Axin2 (EGFP-Axin2) se preparan por transfección estable de células HEK293 con un constructo Axin2 que contiene una etiqueta de EGFP truncada en terminal N (aminoácidos 228-466; SEO ID NO: 7). Los cambios en los niveles de Axin2, específicamente la estabilización de Axin2, se monitorizan mediante la cuantificación del nivel de EGFP en la línea celular estable después de diversos tratamientos en un formato de 384 pozos. Los incrementos en la fluorescencia, que reflejan la estabilización de la

10 proteína de fusión EGFP-Axin2 como consecuencia de la inhibición de la tanquirasa, se monitoeizan en un Citómetro de Barrido Láser Acumen

Las células HEK293 (ATCC, Manassas, VA # CRL-1 573) se mantienen en medio completo de DMEM: F12 (lnvitrogen N, Grand Island, NY # 93-0152DK) que contiene FBS al 5 % (Invitrogen N, Grand Island, NY # 10082147), HEPES 20 mM (Hyclone, Logan, UT # SH30237.01) y Glutamax (Invitrogen ™, Grand Island, NY n .o 3505015 061). Las células EGFP-Axin2 se generan transfectando células HEK293 con Axin2 humano de longitud completa (NCBI, número de acceso NP _004646.3 (SEO ID N°: 4» que contiene una etiqueta N-terminal EGFP truncada (aminoácidos 228-466) (EGFP de longitud completa, NCBI, número de acceso ABG78037.1 (SEO ID NO: 5) en pcDNA3.1+ (de acuerdo con el protocolo del fabricante, Invitrogen™, Grand Island, NY # V79020). Las células EGFP-Axin2 estables se mantienen en medio completo de HEK293 anterior con la adición de 800 j.Jg/ml de G418 20 (Invitrogen™, Grand Island, NY # 10131-035). El ensayo de estabilización de EGFP-Axin2 se realiza sembrando en placas 2000 células EGFP-Axin2/pozo en una placa de 384-pozo SD recubierta de poli-D-lisina. (BD Biosciences, San Jose, CA # 356663) e incubando en 30 j.Jl/pozo medio completo de HEK293 y crecimiento durante la noche a 37 oC, 5 % de CO2. Compuestos en DMSO al 100 % se agregan directamente a los medios celulares en 100 nI/pozo. La concentración final de los compuestos probados en el ensayo es de 33 j.JM -1 ,7 nM con una concentración final de 25 DMSO en el ensayo de 0,33 %. Las células se incubaron con compuesto durante 24 horas a 37 oC, 5 % de CO~ y las células se fijaron usando una concentración final de formaldehído al 2 % durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavan dos veces durante 20 minutos cada una en 40 j.Jl/pozo de PBS (Hyclone, Logan, UT # SH30264.01 ) que contiene 0,1 % de Triton X-100 (Thermo Fisher Scientific, Wallham, MA # BP151 500). Luego se tiñen usando 30 j.Jl/pozo de PSS que contiene 10 j.Jgfml de yoduro de propidio (Invitrogen ™, Grand

30 Island, NY # P3566) Y 50 j.Jg/ml de RNasaA (Sigma, SI. Louis, MO # R6513). La intensidad de EGFP se mide usando un Citómetro de Barrido Laser Acumen modelo eX3 Acumen cerrado para tener un 10 % de EGFP/célula

Tabla 8

Ejemplo No.

Estabilización de Axin2 EC50 (nM)

1

65,9 (± 22,7, n=11 )

2

32,0 (± 9,34, n=4)

3

18,4 (± 15,8, n=3)

4

26,9 (± 11 ,5, n=3)

5

115(±78,3, n=4)

6

59,5 (± 6,94, n=4)

7

121 (± 21 ,9, n=3)

8

71 ,5 (± 28,7, n=5)

9

70 ,9 (± 30,6, n=4)

10

590 (± 228, n=3)

Ej emplo No,

Estabilización de Axin2 ECso (nM)

11

119(:t26,6, n-4)

12

122 (t 31 ,2, n=4)

13

101 (:t 26,8, n=4)

14

52 ,7 (t 23,9, n=4)

15

115(t17,5, n=4)

16

509 (:t 130, n=3)

17

198 (:t 57,4, no; 3)

18

901 (:t 138, n=3)

19

62 ,6 (:t 14,6, n=4)

20

77 ,9 (:t 29,6, n=3)

28

130 (:t 79,4 , n=4)

29

41 ,7 (:t 12,9, n=3)

30

57 ,7 (:t27,1 , n=3)

31

38 ,5 (:t 6,69 , n=3)

32

136 (:t 84 ,8, n=4)

33

122 (:t 73 ,6, n=4)

34

156(:t141 , n=3)

35

27 ,8

36

29 , 1(:t 8,88, n=3)

37

23 ,9 (:t 4,48, n=3)

38

34 ,8 (:t 4,46 , n=3)

39

181 (:t 64 ,9, n=5)

40

39 ,8 (:t 16,2, n=6)

41

61 ,6 (:t 10,5, n=4)

42

141 (:t 44 ,0, n=3)

Ejemplo No,

Estabilización de Axin2 ECso (nM)

43

74,5 (:1: 20,0, n;4)

44

118(:1:33,2, n=4)

45

144 (:1: 1,88 n=3)

Media :1: SEM; SEM = error estándar de la media

Los datos en la Tabla 8 proporcionan evidencia de que los compuestos probados estabilizan Axin2 en células HEK293

Ensayo enzimático de PARPl humano para detenninar la selectividad de los inhibidores de la tanguirasa (vs 5 PARP1)

El ensayo Poly ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1) es un ELlSA que detecta poli ADP ribosa incorporada en la proteína histona unida a la placa en un formato de 384 pozos, Usando la enzima hPARP1 recombinante, este ensayo usa NAD+ biotinilado y mide la incorporación en histonas usando un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y sustrato de peroxidasa de TMB para generar una señal calorimétrica,

10 La histona se diluye a 0,1 mgfml en tampón de recubrimiento (Na.zC0350 mM, pH 9.4, Mallinckrodt, SI. Louis, MO) y se añaden 25 ¡JI a cada pozo de una placa Corning 3700, Las placas se incuban durante la noche a 4 oC, Al día siguiente las placas se lavan 3x con 50 ¡Jlfpozo de tampón de lavado (PBS (preparado a partir de 10x concentrado) con Tween-20 al 0,1 %) seguido de bloqueo durante 1,5 horas a temperatura ambiente usando 50 ¡JI de tampón de bloqueo de caseína all % en 1 x PBS (Rache, Indianapolis, IN # 11666789001), Después del bloqueo, las placas se

15 lavan 3 veces con 50 ¡Jlfpozo de lampón de lavado, El ensayo de enzima PARPl se establece usando 0,01 Uf¡J1 de hPARPl (Trevigen, Gaithersburg, MD # 4668-500-01), cóctel de 0.5X PARP, ADN activado (Trevigen, Gaithersburg, MO # 4671-096-03 Y # 4671 ·096-06) Y compuestos diluidos a partir de una concentración final de 10 ¡JM a 4 nM en tampón de ensayo que contiene Tris 50 mM, pH 8,0, MgCI.z 10 mM, DTT 1 mM (Invitrogen™, Grand Island, NY # 15508-013), Triton X-l OO al 0,5 % Y OMSO al 1.0 %. La reacción se incuba durante 60 minutos a temperatura

20 ambiente y se detiene lavando la placa 3 veces con 50 ¡Jlfpozo de tampón de lavado. La detección de la incorporación de biotina-NAD+ se realiza usando 25 ¡Jlfpozo de Strepavidina-HRP diluido 1 :3000 con tampón de lavado y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente. La placa se lava entonces 3 veces usando 50 ¡Jlfpozo de tampón de lavado. Esto es seguido por la incubación con 25 ¡Jlfpozo del kit de sustrato de peroxidasa TMB (KPL, Gaithersburg, MD # 50-76-02 Y# 50-65-02) durante 15 minutos a temperatura ambiente y deteniendo la

25 reacción usando 25¡Jlfpozo de H2S04 2 N La absorbancia se lee a 450 nm usando un modelo Envision 2103

Tabla 9

Ejemplo No.

Inhibición de PARPl leso (nM)

1

4.510 (:1: 3030, n=2)

2

919 (n=I /2)

3

2 .330 (:1: 234, n=2)

4

3.020 (:1: 197, n=2)

5

7.660 (:1: 1450, n=2)

6

2.670 (:1: 433, n=2)

7

5.930 (:1: 647. n=2)

8

5470

Ejemplo No.

Inhibición de PARP1 leso (nM)

9

3940

10

33 .700 (t 3130, n=2)

11

13.500

12

5.050

13

3.470 (t 318, n=2)

14

5.660 (t 698, n=2)

15

6 .910 (t 746, n=2)

16

187 (t 183, n=2)

17

7.220 (t 1790, n=2)

18

77.600 (t 24000, n=2)

19

5390

20

8.240 (t10800, n=4)

29

6.070 (t 1730, n=2)

30

8.800 (t 1720, n=2)

31

17.400 (t 48.1 , n=2)

32

21 .500 (t 2340, n=2)

33

15.300 (t 2230, n=2)

34

16.200 (± 5740, n=2)

36

95.700 (± 6420, n=2)

37

2.440 (± 598, n=2)

38

46.700 (t 23700, n=2)

39

7.740

40

2.840

41

4.660

42

2.650 (t 143, n=2)

35 (continuación)

Ejemp lo No.

Inhibición de PARP1 ICso (n M)

43

6.390 (i: 1430, n=2)

44

5.830 (t 229, n=2)

45

3.530 (t 2030, n=2)

Media i: SEM; SEM = error estándar de la media

Los datos en la Tabla 9 proporcionan evidencia en cuanto a la inhibición selectiva de cada compuesto probado de las tanquirasas cuando se compara con la inhibición de PARP1.

Ensayo DLD-l TOPFlash para determinar la capacidad de los inhibidores de la tanguirasa para reducir la expresión de genes inducibles por Wnt

Las células DLD-1 contienen una mutación en el gen de adenoma poliposis coli (APC) que codifica una proteína APC truncada. Esta proteína es incapaz de enlazarse al complejo de destrucción y causa una ruta Wnt activada constitutivamente al permitir que la p-catenina se transloque al núcleo y active los factores de transcripción TCF/LEF. DLD-1 TOPFlash es una linea celular informadora derivada de células DLD-1 (adenocarcinoma colorrectal humano) mediante transfección estable de un promotor TCF4 unido a un informador de luciferasa. La cantidad de luciferasa en los lisados celulares se cuantifica midiendo la luminiscencia en un formato de 96 pozos

Las células DLD-1 (ATCC, Manassas, VA, # CCL-221) se mantienen en medio completo de RPMI (Invitrogen™, Grand Istand, NY # 11875-093) que contiene 10 % de SFB (Hyclone, Logan, UT # SH30070.03). Las células DLD-1 TOPFlash se generan de acuerdo con el protocolo del fabricante infectando células DLD-1 con Cignal Lenti TCF/LEF Reporter (Luc) (Qiagen, Valencia, CA # CLS-018L-8, lote # BX16) a una MOl de 10. Se agrega Polybreen (Sigma, SI. Lou is, MO # H9268) a una concentración final de 8 ¡.Jgfml y las células se incuban durante la noche a 37 oc, C02 al 5 %. Al dia siguiente, el medio se cambia a medio de crecimiento fresco que contiene 10 ¡.Jgfml de puromicina (Clontech, Mountain View, CA # 631305) Ylas células se incuban durante 3 dias adicionales a 37 OC , C02 al 5 % para generar una línea celular estable. El ensayo TOPFlash se realiza sembrando en placas células DLD-1 TOPFlash a 10.000 célulasfpozo en una placa blancaftransparente Corning de 96 pozos (Coming Tewksbury, MA # 3610) e incubando en medio completo 30 ¡.Jlfpozo que contiene RPMI (Hyclone, Logan, UT # SH30027.01 ), 10 % de FBS y 10 ¡.Jgfml de puromicina y se hizo crecer durante la noche a 37 OC, C02 al 5 %. Los compuestos en 100 % de DMSO se diluyen 28,5 veces en OptiMEM® (Invitrogen™, Grand Island, NY # 31985-062) que contiene 0.2 % de BSA (d iluido de 7.5 % de BSA Invitrogen™, Grand Island, NY # 15260-037) Y5 ¡.JI de compuesto diluido añadido a los 30 ¡.JI de medio de cultivo celular/pozo. La concentración final de los compuestos probados en el ensayo es 50 ¡.JM -1,5 nM siendo la concentración final de DMSO en el ensayo de 0.48 %. Las células se incuban con el compuesto durante 24 horas a 37 oC, C02 al 5 % Y las placas se retiran de la incubadora y se ponen a temperatura ambiente durante 30 minutos. El reactivo BugLite™ (3x) se prepara disolviendo 2,296 g de DTT (Sigma, SI. Louis, MO # 00632),1,152 9 de CoA (Sigma, SI. Louis, MO # C3019), 0,248 9 de ATP (Sigma, SI. Louis, MO # A7699) Y 0,42 9 de Luciferina (Biosynth AG, Itasca, IL # L-8240) en 1 litro de tampón de lisis Triton-Xl00 que contiene Tris 150 mM (108,15 mi de HCI Tris 1 M Y41 ,85 mi de Base Tris 1M (Sigma, SI. Louis, MO # T3253 y T-1503», MgCI2 3 mM y Trilon X-lOO al 3 %. Después de equilibrar las placas a temperatura ambiente, se añaden 18 ¡.JI de reactivo BugLite 3x a cada pozo y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. La luminiscencia se mide usando un modelo Envision 2103.

Tabla 10

Ej emplo No.

Inibíc ión de la expresión del gen índucíble por Wnt ICso(J.lM)

1

0,0132 (t 0,00595, n=6)

2

0,00817 (i: 0,00587, n=4)

3

0,00866 (i: 0,00190, n=3)

Ej emplo No,

Inibición de la expresión del gen inducible por Wnt ICso(~M)

•

0,00671 (:t 0,00248, n-3)

5

0,0211 (tO,00437, n=4)

6

0,00720 (:t 0,00120, n=2)

7

0,0146 (t 0,0128, n=3)

8

0,0184 (t 0,0110, n=3)

9

0,0282 (:t 0,0257 , n=4)

10

0,171 (t 0,0474, n=3)

11

0,0281 (:t 0,00945, n=3)

12

0,0195 (:t 0,0111 , n=3)

13

0,0230 (:t 0,0126 , n=3)

1.

0,00935 (:t 0,00872 , n=3)

15

0,0154 (:t 0,00630, n=3)

16

0,102 (:t 0,0268, n=3)

17

0,0373 (:t 0,0103 , n=3)

18

0,156 (:t 0,0724, n=3)

19

0,0126 (:t 0,00325, n=3)

20

0,0222 (:t 0,00155, n=2)

28

0,0228 (:t 0,0105, n=3)

29

0,0177 (:t 0,0138, n=3)

30

0,0168 (:t 0,0124, n=3)

31

0,0178 (:t 0,0119 , n=3)

32

0,0201 (:t 0,0178 , n=3)

33

0,0268 (:t 0,0229 , n=3)

3.

0,0236 (:t 0,0246 , n=3)

35

0,0058

Ejempl o No,

Inibic ión de la expresión del gen inducible por Wnt I Cso(~M)

36

0,0208 (i: 0,0168, n.3)

37

0,00622 (i: 0,00286, n=3)

38

0,0222 (i: 0,00824, n=3)

39

0,0206 (i: 0,0129, n=4)

40

0,00695 (i: 0,00456, n=4)

41

0,0138 (i: 0,00253, n=3)

42

0,0220 (i: 0,00397, n=3)

43

0,0110 (i: 0,00217, n=3)

44

0,0112 (i: 0,00315, n=3)

45

0,0188 (i: 0,00510, n=4)

Med ia i: SEM; SEM = error estándar de la media

Los datos en la Tabla 10 demuestran que los compuestos probados son inhibidores de genes inducibles por Wnt med idos por el ensayo informador TOPFlash Wnt.

5 Establecimiento de la actividad antitumoral in vivo de los inhibidores de la tanguirasa:

Los ratones de la cepa C57BLl6J-Apc""nfJ portan una mutación truncada en el codón 850 del gen Apc y desarrollan pÓlipos intestinales y neoplasmas colorrectales a la edad de 3-6 meses, El truncamiento en el gen APC conduce a la activación de la ruta de señalización de Wnt y se detectan niveles elevados de ¡3-catenina en lesiones preneoplásicasfneoplásicas en estos ratones

10 Con el fin de evaluar la actividad antitumoral in vivo de los inhibidores de la tanquirasa, los ratones de la cepa C57BL/6J-Apc""nfJ se adquieren de Jackson Laboratories (número de inventario 002020) y se aclimatan durante 1 semana, Los animales se dividen en 2 grupos y se tratan con 25 mg/kg (BID) del Ejemplo 1 o vehículo durante 60 dias consecutivos. Al final del período de tratamiento, los animales se sacrifican y se cuenta el número de pólipos en el intestino de~ado bajo un microscopio de disección. Como se muestra en la Tabla 11, los ratones de la cepa

15 C57BL/6J-Apc "/J tratados con el compuesto del Ejemplo 1 tienen un número estadísticamente significativo menor de tumores en el intestino delgado en comparación con los animales tratados con vehículo.

Tabla 11

Tratamiento

Número de animales por grupo Número promed io de pólipos por animal Valor p

Vehículo

13 7,3 i: 0,53

Ejemplo 1

9 4,3 i: 0,70 0,0028

Los datos en la Tabla 11 proporcionan evidencia de que el tratamiento in vivo con el Ejemplo 1 reduce el número de 20 pólipos intestinales en ratones de la cepa C57BLf6J-ApcMi"fJ

Ensayo de formación de colonias El compuesto del Ejemplo 1 también se prueba en un ensayo de formación de colonias in vitro contra cuatro líneas celulares tumorales humanas diferentes, tres derivadas de tumores pancreáticos (Capan -2, HPAF-II y Panc 04.03) y una derivada de cáncer de pulmón de células no pequeñas (A549). Este ensayo se lleva a cabo usando materiales comercialmente disponibles por procedimientos conocidos y utilizados de foona rutinaria por los expertos en la

5 técnica .

Las células A549 (ATCe, Manassas, VA # CCL-185) se mantienen en medio completo de F12K (Hyclone, Logan, UT # SH30526) que contiene 10 % de FBS (Invitrogen, Grand Island, NY # 16000-044). Las células Capan-2 (ATCC, Manassas, VA # HTB-BO) se mantienen en medio completo de McCoys 5A (Hyclone, Logan, UT # SH30200) que contiene 10 % de FBS (Invitrogen, Grand Istand, NY # 16000-044). Las células HPAF-II (ATCC, Manassas, VA # 10 CRL-1997) se mantienen en medio completo de EMEM (Hyclone, Logan, UT # SH30024) que contiene 10 % de FBS (Invitrogen, Grand Island, NY # 16000-044). Las células Panc 04.03 (ATCC, Manassas, VA # CRL-2555) se mantienen en medio completo de RPMI (Hyclone, Logan, UT # SH30255) que contiene 15 % de FBS (lnvitrogen, Grand Island, NY # 16000-044) Y 20 IJgfml de insulina (Sigma, SI. Louis, MO # 19278). Los ensayos de foonación de colonias se realizan sembrando en placas células A549 a 250 células/pozo; células Capan-2 a 2000 células/pozo; 15 células HPAF-II a 1000 células/pozo o células Panc 04.03 a 2000 célulasfpozo cada una en una placa de 6 pozos (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA # 353046), incubando en 2 mi de medio completo y cultivadas durante la noche a 37 oC, C02 al 5 %. Al día siguiente, se retira el medio y se reemplaza con 2 mi de medio de crecimiento respectivo fresco para cada linea celular. Los compuestos de prueba en 100 % de DMSO se diluyen en 100 % de DMSO a una concentración de 1000X y se agregan 2 IJI a 2 mi de medio en el pozo para lograr una concentración 20 final de 0,03 a 3 IJM. Las células se incuban a 37 OC, 5 % de COz. Cada tres o cuatro días, se retira el medio y se reemplaza con 2 mi de medio completo nuevo para cada linea celular como antes. Después del cambio de medio, se agrega el compuesto fresco como se indicó anteriormente. Las células se incuban un total de 11 dias en presencia del compuesto. El día 11, se retira el medio y las células se lavan una vez con 5 mi de DPBS (Hyclone, Logan, UT # SH30028). Se añade tinción de cristal violeta {0,5 % de violeta cristal (Sigma, St Louis, MO, nO C3886) en metanol al

25 20 % (EMD Millipore, Bil1erica, MA # MX0490-4) a cada pozo (0,4 mi) y se incuba a temperatura ambiente durante 15 mino Los pozos se lavan dos veces con oPBS y las placas se fotografían con Fuji LAS4000 (FujiFilm, Tokio, Japón). El análisis del área de la colonia dentro de cada pozo se realiza utilizando el software FujiFilm Colony Version 1.1 (FujiFilm, Tokio, Japón)

Tab la 12

Efecto del compuesto del Ejemplo 1 en la formación de colo nias

% de inhibición de la formación de colonias

Compuesto de la concentración del Ejemplo 1

A549 Capan-2 HPAF-II Panc 04.03

Control

O O O O

0,031J M

25,46 -20,82 2,44 .34,35

0,11 IJM

46,50 18,04 40,47 51 ,39

0,331J M

54,23 55,90 61 ,65 92,79

"M

74,35 63,92 85,22 92,51

3 ,M

72,07 70,73 88,23 90,03

Los datos en la Tabla 12 demuestran que el compuesto del Ejemplo 1 inhibe la formación de colonias cuando se compara con el control contra cada una de las lineas celulares analizadas.

Tabla 13

Polipéptido usado en ensayos

Secuencias de aminoacidos

hTRF1

(SEO ID NO: 1)

Polipéptido usado en ensayos

Secuencias de aminoácidos

NCBI , Número de acceso NP 059523.2

hTNKS1

(SEO ID NO 2)

NCBI , Número de acceso NP 003738.2

hTNKS2

(SEO ID NO: 3)

NCBI , Número de acceso NP 07951 1.1

hAxin2

(SEa ID NO: 4)

NCBI , Número de acceso NP 004646.3

EGFP

(SEa ID NO: 5)

NCBI , Número de acceso ABG78037.1

Péptido Flag

(SEa ID NO: 6)

Sigma-Aldrich

EGFP

(SEa ID NO: 7)

Am inoácidos 228-466

NCBI , Número de acceso ABG78037.1

Secuencias

SEa ID NO: 1 -hTRF1 -proteína

MAEDVSSAAPSI'RUCAI)URI)AI)I"rJ3EQMAETERNIJEEQliECQELLECQVQVUA PEEEEEEEEDAGL V AEAEAVAAGWMLDFLCLSLCRAFRDGR$EDFRRTRN$AEAI IIIGI SSITACQl,RTIYICQrt ,TRIAAG KTI .OAQrENOP.RITPI ,rSAI ,MTWGSIPKP.II DKLHEEIQNLIKIQ!\LA VCMENGNFKEAEEVFT::RIFGDPNSHMPFKSKLLMIISQKD TFHSFFQI-IFSYNHMMEKI KSYVNYVL$F.KSSn1 .M KAAA KVVESKRTRTITSQDK

PSUNIJVEMEI'UANLIJTRKSVSDKQSA VTESSUU'rVSLLRSl1 KNLI 'LSKLQIIUTQ

QQDLNKKERRVGTPQSTKKKKESRRATESRIPVSKSQPVTPEKI-IRi\ RKRQi\ WLW EEI)KN LRSGVR K YGEGNWSKILLlI y KFNNKTS VM LKDKWRTM K KLKLlSSI)SE

5 D SEa ID NO: 2 -hTNKS1 -proteína

ASPRHGLALPEGDGSRDPPDRPRSPDPVDGTSCCSTrSTICTVAAAPVVPAVSTSS AAGV A PNPAGSGSNNSrSSSSSPTSSSSSSPSSPGSSI.AESPEAAGVSST A PI,Gr GA AGPGTGVPAVSGALRELLEACRNGDVSRVKRLVDAANVNAKDMAGR KSSPLHF AAGFGRKDVVEI-ILLQMGANVI-IARDDGGLlPLJ-I NACSFGI-IAEVVSLLLCQGADP NARDNWNYTPI.1IEAA I KGKIDVClVI,LQII GADI'NIRNTDGKSAL.DI,A DPSAKA V L TGEYKKDELLEAAR$GNEEKLMALL TPLNVNCHA$DG RKSTPLI-ILAAG YNRV RIVQLLLQHGADVI-lAKDKGGLVPLHNACSYG HYEVTELLLKHGACVNAMDLW Qvn'LIIEAASKNRV[;VCSLLLSIIGADI~I'LVNCIIG KSA VDMA I'TPELRERL'!'Y EI I KGI-ISLLQAAREADLAKVKKTLALE UNFKQPQSI-I E'TALI-I CAV ASLI-IPKRKQVTEL LLR KGANVNEKNKDFMTPLl IV AAERAr INDVMEVI.1IKIIGA KMN AI,DTLGQT A LHRAALAUJ-ILQTCRLLLSYUSDPS II SLQU I,' I'AAQMGNEAVQQ ILSl!STPIRTSDV DYRLLEASKAGDLETVKQLCSSQNVNCRDLEGR HSTPLHFAAGYNRVSVVEYLL 1IIIGADVIIAKDKGGI.YI'I ,IINACSYGIIYI~VAI ~ I.1 ,VRIIGASVNVADI,WKV!'PI ,IIE AAA KGKYEI CKLLLKJ-IGADPTKKNRDGNTPLDLVKEGOTD IQDLLRGDAALLD AA KKOCI .AR VQKI .CTPENINCRDTQGRNSTPI.HI .AAGYNNJ ,EVAEYI.1 .F.HGAD VNAQDKGG I,IPI ,IINAASYGIIVDIAAJ ,1.lKYNTCVNATDKWAI-TI'I ,IIEAAQKGR

'!'QLCALLLA J-IUADIYrMKNQEUQ'I'PLDLA'I'ADDIRALUDAMI'PEALPTCFKPQAI' VVSASI.JSPASTPSCI .SAAS:'lIDNI.TGPJ ,AEI.A VGGA$NAG DGAAGTPR KEGEV A GLDMNISQFLKSLGLEI-ILR DIFETEQ ITLDVLADMGHEELKEIG INAYGJ-IRI-IKUK GVER1.l .GGQQGTNPY1.TFHCVNQGTI1.l .Dl .APEDKEYQSVf:EEMQSTIR EJ-IRDG GNAGGIFNRYNVlR IQKVVNKKLRERFCHRQKEVSEEN HNHHNERMLFI-IGSPFIN AIIIIKGF1WR II A YIGGMFGAG IY FAENSS KSNQYVYGIGGGTGCPTlIKDRSCYI C HRQMLFCR VTLGKSFLQFSTMKMAHAI'PGHHSV IG RPSVNG LA y AEYVIYRGEQ AYPRY I.lTYQ IMKPEAPSQTATAAEQKT

SEO ID NO: 3 -hTNKS2 • proteína

TAGRKSTPLHFMGFGRKDVVEYLLQNGANVQARDDGGLlPLHNACSFGHAEV VNLLLRlIGADPNA IillNWNYTPLI1 EAAl KGKLDVCl VLLQIIGAEPTlKNTDGKI'A LDLAI)PSA KA VLTGEY KKDELLESARSGNEEKMMALLTPLNVNCI-}ASDGRKSTP LlILAAGYNRVKrVQtLLQI rGADVllA KDKGDL VPLl INACSYGIIYEVTELL VKIIG ACVNAMDLWQrTPLI-IEAASKNRVEVCSLLI..5YGADPTLLNCI-INKSAIDLAlyrPQ LKERl A YEFKGHSLLQAAREADVTRIKKHLSLEMVNFKI-IPQTI-IETALI-ICAAASP YPKR KQICH,LLRKUANINEKTKEFLTI'Ll IV ASE KA IINDVVEVVV KIIEA K VNAL DNLGQTSLHRAA YCG HLQTCRLLLSYGCDPNIISLQGFrALQMGNENVQQLLQE GISLGNSEADRQI J ,EAAKAGDVETVK KI ,CTVQSVNCH DrEGRQSTPLI IF AAGYN R VSVVEYLLQHGAD VHAKDKUUL VPLHNACSYUHYEV AELL VKJ-IGA VVNV AD LWKFrPLHEAAA KG KYEICKLLLQI-IGADPTKKNRDGNTPLDL VKDGDTDIQDLL RGDAAI J JJAA KKGCIA RVKKISSPDNVNCRDTQGRIISTPIJ II ,AAGYNNI J':VAI ~ YLLQHGADVNAQDKGGLIPLHNAASYGI-IVDV AA LLI KYNACVNATDKW AFrPL IlEAAQKGKrQLCALLLA IIGAD l-'rLKNQEGQ'I'PLDLVSADDVSALLI'AAMPPSAL PSCYKPQVLNliVRSPliA IADALSSGPSSPSSLSAASSLDNLSUSlisn.ssvvSSSli'r EGASSI ,EKKEVPGVDFSITQFVRNI ,GI,EI-II ,M DlFEREQHLDVI ,VEMGH KEI ,KEIG INAYGI-IRHKUKGVERLlSUQQULNI'YLI'LNTSUSGTlLl DL,sI'DDKEliQSVEEEM QSTVREHRDGGHAGGlfNRYNILKI QKVCN KKLWERYrHRRKEVSEENHNHANE RMLFIIGSI'I-'VNAIII 1 KGFDERIIA YlCjGM¡"GAGIYI-'A I~NSSKSNQYVYGIGGGTGC

PVHKDRSCYICI-IRQLLFCRV'I'LGKSR QFSAMKMAHSI'PGHHSV'I'ORPSVNGLA

LAEYVIYRGEQAYPEYLlTYQIM RPEGMVDG

SEO ID NO: 4 -hAxin2 4 proteína

MSSAML V I'CLPDPSSSFREDAPRPPVPGEEGErpPCQPGVGKGQV'I' KPMPVSSNT RRNEDGLGEPEGRASI'DSI'LTRWTKSLI-ISLLGDQDGA YLFRTfLEREKCVD'I'LDF WFACNOFRQMNI.K DTKTI ,R V A KAI Y KU YTFNNSI VS KQI.K P ATKTYTR DOI K KQ QIDS IMPDQAQTEIQSVMEENA YQM FLTSI)JY LEYVRSGGENTA YMSNGULGSLK VVCG YLfYTLNEEEEWTCADFKCKLSIYf'VVGLSSKTLRAT ASVRSTETVDSGYRSF KRSDPVNPYIIIGSGYVFAI'A'I'SANDSEISSDALTDDSMSM"I'[)SSVDG IPPY RVGS KKQLQREMHRSVKANGQVSLI'H FPRTHRLI'KEMTPVEI' 1\ TF 1\1\ELI$RLEKLKLE 1,ESUI-ISI.EERI.QQIRPDEEREGSFI:I'I ,NSREGAlyrQI-IPI .SI.I ,PSGSYEEDPQTII .I) D HLSRVLKTPGCQSPGVGRYSPRSRSPDHHHHHHSQYHSLLPPGGKLI'PA1\1\SPG1\ CPLLGGKGFVTKQ'IT KHVHHHYIHI-[J-IAVPKTKEEIEAEATQRVHCFCPGGSEYY CYSKCKSIISKAI'I:'TMPSEQliGGSRGSTU' KRNGKG I'UI'GLALPAREGGAPGGAG ALQLPREEODRSQDVWQWMLESERQS KPKI'HSAQSTKKI\ YPLESARSS POERAS R III IL WGGNSG IIPRTIT'RAIILFTQDPAMPPLTPI'NTLAQLEEACRR LA EVSKPI'K QRCCV ASQQRDRNI-ISATVQTGATPPSNPSLAPEDH KEPKKLAGVI-I ALQASELVV TYH ICGEElPYRRMLKAQSLTLGI-IFKEQLSKKGNYRYYFKKASDEFACOA Vfl3EI WFDETVl.PMYEGR rI ,GKVERID

SEO ID NO: 5 -EGFP -proteína de longitud completa

MDR KFVFLVsn..sIVVASVTGErI'RAIYIYWI'PTlYWIYI'P'WIYI'PTP']YrPTP'Wrp lYll)TP'1'PTPTP'1'PTP'1'PTP'1'Pl'P'1'P'1'PTPTVfP1YrPTPTP'1'PTPTPTIYrPTPTIYJ'PTPT

IYIYI'IYI'IYI'\"IYI'IYI'VI'!-'"I'IYIYI'P'IYI'IYI'I'"I'PIYI'IYI'IYI'F'I'VI'IYI'VIYI'IYI'P'IYI'VI'!-"I'P'I'P 'WIYI'P'WWI'PTP'rPTPTP'wrPTPTPTP'IYI'P'I'IYwrPTP'wrSMVSKGEELJ7rGVV

PIL VELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKL TLKAC1TGKLPVPWPTLVTILTYG VQCI''SR y PD] 1M KQII mVKSAMI'EG YVQERTlFFKDDONY KTRAEV KH~GDTLV NRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGS VQI ,A OI-IYQQNTPIO DOPVI.I ,PDNHYI BTQSAI5; KDPNRK RDI-IM VI J .EFVTAAGI TLGMDEI ,VK

SEa ID NO: 6 -Péptido Flag

DYKDDDDK

SEa ID NO: 7 -EGFP -aminoácidos proteicos truncados 228-466

MVSKGl:l!U : ruVVPILVELDGDVNUHKFSVSGEGEGDAr YGKU'LKFICITGKLP

VPWPTI Vn'I.TYGVQCFSRVPDI1M KQ1IDFFKSAMPEG YVQFRlTFFKDDGNYKT RAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGN[LGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIK

VNIKIRI-INIEDGSVQLAD I-IY(¿QN'!'PIGDGPVLLi'DNI-IYLS'rQSALSKDPNE KRDI-I MVT.T.PFVTAAGTTI,GMDPT.YK

1. Un compuesto que tiene la fórmula:

en la que: Y es:

X es -CH2-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-; R1es hidrógeno, hidroxi, o halo; 2

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   y,X'N~ CH

   "---NyNIíN¡'

   HN~

   O

   Res hidrógeno, halo, -CN, -CH3, CF3, o -OCH3; 10 o una sal farmaceuticamenle aceptable del mismo.
2. 2. Un compuesto de la reivindicación 1 en el que' y es:

   N ' '"

   R'-f'Y R I

   'C(

   N

   ~N

   R'

   o

   X es -CH2"", -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-; 15 R1 es hidrógeno, hidroxi, o halo; 2

   Res hidrógeno, halo, -CN, -CH3, CF3, o -OCH3;

   o una sal farmaceuticamenle aceptable del mismo.
3. 3. Un compuesto de la reivindicación 1 o 2 en el que:

   Ye,

   N '

   R'-f' Y

   ~N

   20 X es -CH2-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-; R2es hidrógeno, halo, -CN, -CH3, CF3, o -OCH3;

   o una sal farmacéuticamenle aceptable del mismo
4. 4. Un compuesto de la reivindicación 1 o 2 en el que: 25 Yes' farmacéuticamente aceptable del mismo .

   X es -CH2-, -C(CH3)H-, o -C(CH2CH3)H-;

   R1es hidrógeno, hidroxi, o halo;

   R2es hidrógeno, halo, -CN , -CH3, CF3, o -OCH3;

   o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo .

5. 5. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 3 que es;

   8-Metil-2 -[4-(pirimid in-2 -ilmetil)piperazin-1-il]-3 ,5,6,7 -tetra hidropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona ,

   o "na ,al

   fa rmacéuticamente aceptable del mismo;

   8-Metil-2 -[4-( 1-pirimidin-2 -iletil)piperazin-1-il]-3 ,5,6,7 -tetra hidropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona,

   o "na ,al

   farmacéuticamente aceptable del mismo;

   2-[4-[(4-Cloropirimid in-2 -il )metil]piperazin-1-il]-8-metil-3,5,6, 7 -tetra hidropirido [2,3-d]pirimid in-4-ona ,

   o ""a ,al

   fa rmacéuticamente aceptable del mismo; o

   2-[4-[( 4-metoxipirim idin-2-il)metil]piperazin -1-il]-8-metil-3,S ,6, 7 -tetrah idropi rido[2,3-d]pirim id in-4-ona,

   o una sal

   farmacéuticamente aceptable del mismo

6. 6. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4 que es:

   2 -[4-[(3-Bromo-2 -piridil )metil]piperazin-1-il]-8-metil-3,5,6, 7 -tetrahidropirido[2 ,3-d]pirimid in-4-ona

   o "na ,al

   farmacéuticamente aceptable del mismo ;

   2 -[4-[(3-Cloro-2 -pirid il)m etil]piperazin-1-il ]-8-metil-3 ,5,6,7-tetrahidropirido

   [2 ,3-d]pirimidin-4-ona, o "na ,al

   farmacéuticamente aceptable del mismo ;

   2 -[4-[(3-Fluoro-2-piridil )metil]piperazin-1-il]-8-metil-3,5 ,6, 7 -tetrah idropirido[2 ,3-d]pirimidin-4-ona,

   o "na ,al

   farmacéuticamente aceptable del mismo ; o

   2 -[[4-(8-Metil-4-oxo-3, 5,6,7 -tetrahid ropirido[2 , 3-d]pirimidin-2-il)piperazin-1-il]metil]piridin-3-carbonitrilo,

   o una sal

7. 7.

   Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 5 que es 8-metil-2-[4-{pirimidin-2ilmetil)piperazin-1-il]-3,5,6,7-tetrahidropirido[2,3-d]pirimidin-4(3H)-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo .

8. 8.

   Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 o 7 que es sal de acido 8-Metil-2-[4-(pirimidin-2ilmetil)piperazin-1-il]-3,5,6, 7 -tetrah idropirido[2,3-d)pirimid i n-4-ona 4-metilbencenosulfónico

9. 9.

   Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéutica mente aceptable del mismo, en asociación con un vehiculo farmacéuticamente aceptable.

10. 10.

    Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.

11. 11 . Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un cancer que es cáncer colorrectal, cancer gaslrico, cancer de hígado, cáncer de mama, cancer de mama triple negativo, cancer de ovario, meduloblastoma, melanoma, cancer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, glioblastoma, linfoma de células T, linfoma T-linfoblastico, leucemia linfocitica aguda de células T (T-ALL), linfoma de células del manto, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica o leucemia mieloide aguda.