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ES2647452T3 - Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato - Google Patents

Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato Download PDF

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ES2647452T3
ES2647452T3 ES07801562.5T ES07801562T ES2647452T3 ES 2647452 T3 ES2647452 T3 ES 2647452T3 ES 07801562 T ES07801562 T ES 07801562T ES 2647452 T3 ES2647452 T3 ES 2647452T3
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ES
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oligonucleotide
cells
rna
cell
ifn
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ES07801562.5T
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English (en)
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Veit Hornung
Gunther Hartmann
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Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Original Assignee
Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
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Abstract

Un oligonucleótido capaz de inducir la producción de un IFN tipo I, para uso en la inducción de la apoptosis de células tumorales, por medio de la unión a RIG-I en el tratamiento de un tumor en un animal vertebrado, en donde el oligonucleótido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 3, más preferiblemente al menos 6 ribonucleótidos en el extremo 5', en donde el oligonucleótido comprende un grupo trifosfato en el extremo 5', y en donde el grupo trifosfato está libre de cualquier caperuza o modificación, en donde el oligonucleótido es de al menos 21 nucleótidos de longitud, y en donde el oligonucleótido es un ligando de RIG-I.

Description

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Se generaron oligonucleótidos de RNA trifosfato iniciados con adenosina con todas las permutaciones posibles de bases (A, C, G y U) de la 2ª, 3ª y 4ª posición de la secuencia (5’→ 3’) mediante transcripción in vitro (véase la Tabla 2). Posteriormente se aislaron los monocitos de tres donantes independientes y se transfectaron con los respectivos oligonucleótidos de RNA. 36 horas después de la transfección, se analizaron los sobrenadantes para producción de IFN-α. Los niveles de inducción de IFN-α obtenidos de todos los oligonucleótidos se normalizaron al nivel de inducción media de todos los oligonucleótidos (= 100 %). Los niveles de inducción normalizados obtenidos de los tres donantes se resumieron como valores medios ± SEM.
Figura 14: Cancelada
Figura 15: Combinación de funciones inmunoestimulantes potentes con actividad eficiente de silenciamiento génico en una molécula de RNA
(a)
Se sembraron células B16 en placas de 24 pocillos. A una confluencia del 50 %, las células B16 se transfectaron con los siRNA sintetizados químicamente seleccionados (anti-Bcl-2 2.1, anti-Bcl-2 2.2 y anti-Bcl-2 2.3) a 1,2 µg/pocillo (100 pmol) usando lipofectamina 2000 (2,0 µl). 48 horas después de la transfección se analizó la expresión de proteínas de Bcl-2 murino por transferencia Western. Posteriormente, el siRNA anti-Bcl-2 2.2 (OH-2.2) fue transcrito in vitro (denominado 3p-2.2) y se analizó su capacidad para inducir el silenciamiento génico. El siRNA de control y el 3p-GC, un 3p-RNA de cadena doble no específico, sirvieron como control negativo. Se muestra un experimento representativo de cuatro.
(b)
Para determinar la expresión endógena de RIG-I, se estimularon células B16 con 3p-2.2 (1,2 µg/pocillo) e IFN-β murino (1000 U/ml). Después de 6 horas se lisaron las células y se analizaron para la expresión endógena de RIG-I por transferencia Western. Las células HEK293 que sobreexpresan RIG-I de longitud completa sirvieron como control positivo. Se muestra un experimento representativo de dos.
(c)
Para monitorizar la activación de IFN-β transitorio en células tumorales, se sembraron células B16 en placas de 24 pocillos y se transfectaron con los plásmidos de expresión indicados utilizando PEI de alto peso molecular o lipofectamina 2000. Se estimularon 24 células con poli(I:C) (200 ng/pocillo), 3p-2.2 (200 ng/pocillo) y OH-2.2 (200 ng/pocillo). El IRF3-5D sirvió como control positivo. 16 h después de la transfección se analizaron las células para la actividad de luciferasa con un luminómetro de microplacas (LUMIstar, BMGLabtechnologies).Los datos se muestran como las medias ± SEM de tres experimentos independientes (*P<0,05 entre 3p-2.2, OH-2.2 y poli(I:C); ensayo t).
(d)
Se sembraron células B16 en placas de 24 pocillos y se co-transfectaron con siRNA sintéticos (10 pmol) y los plásmidos de expresión indicados (200 ng) como se ha descrito. 24 horas después de la transfección se estimularon las células con 3p-2.2 durante 16 horas. Los datos se muestran como las medias ± SEM de tres experimentos independientes (*P<0,05 entre el control siRNA (siCO) + 3p-2.2 frente a RIG-I siRNA (siRIG-I) + 3p-2.2; ensayo t)
(e)
Se transfectaron células B16 con los plásmidos de expresión indicados durante 24 horas y se estimularon con 3p-2.2 durante 16 horas. Los datos se muestran como las medias ± SEM de dos experimentos independientes (*P<0,05, NS3-4A* + 3p-2.2 frente NS3-4A + 3p-2.2; ensayo t).
Figura 16: La transfección de 3p-2.2 desencadena directamente la apoptosis independiente de Cardif en las células tumorales, pero no en las células primarias
Se sembraron células B16 murinas en placas de 24 pocillos y se transfectaron con 3p-2.2 (1,2 µg/pocillo), OH-2.2 (1,2 µg/pocillo) y siRNA de control (1,2 µg/pocillo) utilizando lipofectamina (2,0 µl). 24 horas después de la transfección se analizaron las células por citometría de flujo para la apoptosis mediante desconexión de las células anexina V-positivas. Se excluyeron las células anexina V-positivas y PI-positivas (últimas células apoptóticas o muertas).
(a)
Se muestra un análisis FACS representativo de cuatro experimentos independientes.
(b)
Los resultados de la apoptosis de las células B16 se muestran como las medias ± SEM de cuatro experimentos independientes (P**<0,01 3p-2.2 frente a OH-2.2 y el siRNA de control; ensayo t).
(c)
Se sembraron células B16 murinas en placas de 24 pocillos y se transfectaron con pNS3-4A y pNS3-4A* durante 24 h. Después, se lavaron las células y se estimularon durante 24 horas con 3p-2.2 y se determinó el número de células apoptóticas por análisis FACS. Los datos se muestran como las medias ± SEM de dos experimentos independientes.
(d)
Los resultados de la apoptosis en las PBMC humanas se muestran como las medias ± SEM de dos experimentos independientes.
(e)
Se incubaron células B16 con siRNA de control, 3p-2.2 y poli(I:C) durante 24 horas y se evaluaron para la actividad de caspasa-1 por medio de inmunotransferencia. Como control de carga sirvió α-Tublin. Se muestra un experimento representativo de tres.
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Figura 17: La producción de IFN-α por 3p-2.2 requiere TLR7 en pDCs y RIG-I en cDCs y se limita a ciertos subconjuntos de células inmunitarias
Las cDCs derivadas de GMCSF de ratones naturales (WT), de ratones deficientes en RIG-I (a), de ratones deficientes en MDA5 (b) y de ratones deficientes en TLR7 (c), y las pDCs derivadas de Flt3-L de ratones deficientes en TLR7 (d) se transfectaron con 200 ng de 3p-2.2, dsDNA (Sigma; dAdT), poli(I:C) (Sigma) complejados con lipofectamina 2000 y CpG-A 2216 (3 µg/ml) en placas de 96 pocillos. Después de 24 h, se midió el IFN-α en los sobrenadantes mediante ELISA. Los datos se expresan como la media ± SEM de dos experimentos independientes.
(e) Se purificaron células B, células NK y células T CD8 procedentes de bazos de ratones naturales (WT) utilizando selección celular magnética y se estimularon con 200 ng de 3p-2.2. Las pDCs seleccionadas de cultivos de médula ósea inducidas por Flt3-L y las cDCs derivadas de GMCSF estimuladas con 3p-2.2 sirvieron como control positivo. Los datos se expresan como la media ± SEM de dos experimentos independientes.
Figura 18: El 3p-2.2 encapsulado conduce a la activación inmunitaria sistémica in vivo
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 200 µl que contenían 3p-2.2 o OH-2.2 (50 µg/ratón) complejado con jetPEI™. Posteriormente, se inyectaron los complejos en la vena retro-orbital. Se recogió el suero después de 6 horas a menos que se indique otra cosa. Se obtuvo sangre entera cortando la cola a los puntos de tiempo indicados. Los niveles de citocinas de IFN-α (a), IL-12p40 (b) y IFN-γ (c) se determinaron por ELISA. El CpG1826 sirvió como control positivo. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 6 experimentos independientes; P** <0,01 o P* <0,05. (d-e) Se inyectaron ratones C57BL/6 y TLR7-/-por vía intravenosa con 3p-2.2 y OH-2.2 (50 µg) complejados con jetPEI™ (Biomol). Después de 6 horas, se sacrificaron los ratones y se analizó el suero para la producción de IFN-α (d), IL-12p40 (e) e IFN-γ (f) por ELISA. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
Figura 19: Activación dependiente de la dosis de subconjuntos de células inmunitarias por 3p-2.2 in vivo
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 200 µl de 3p-2.2 (25, 50 o 75 µg/ratón) complejado con jetPEI™ en la vena retro-orbital. Se recogió el suero después de 6 h a menos que se indique otra cosa.
(a) Los niveles de citocinas en suero de IFN-α, IL-12p40 y IFN-γ se determinaron por ELISA. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 5 experimentos independientes.
(b-c) Se inyectaron ratones C57BL/6 con 200 µl de ácido nucleico (25, 50 o 75 µg/ratón) complejado con jetPEI™. Se aislaron células del bazo 48 horas después de la inyección y se analizó la expresión de CD86 o CD69 en pDCs, mDCs, células NK, células T CD4 y células T CD8 por citometría de flujo. La tinción del antígeno de superficie se realizó como se ha descrito previamente. (b) Histogramas de un experimento representativo después de la estimulación con 50 µg de 3p-2.2 (barra gris, ratones de control no estimulados), (c) La activación dependiente de la dosis por 3p-2.2 de diferentes subconjuntos de células inmunitarias. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
Figura 20: La estimulación por 3p-2.2 conduce a un aumento de niveles de IFN-α en suero durante menos de dos días e induce una trombocitopenia y leucopenia moderada in vivo.
(a)
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 50 µg de 3p-2.2 o de OH-2.2 complejado con jetPEI™. Se recogió el suero 12 h, 24 h, y 48 h después de la inyección a menos que se indique otra cosa. Los niveles séricos de IFN-α se determinaron por ELISA. Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
(b)
Se inyectaron ratones C57BL/6 con 50 µg de 3p-2.2 complejado con jetPEI™. Se recogió la sangre después de 48 h y se procesó como plasma con EDTA para la medida de los leucocitos (WBC) y de las plaquetas. Se realizaron los recuentos de las células sanguíneas en el Laboratorio Central del Departamento de Medicina Interna, Universidad de Munich, en el punto de tiempo indicado (P** <0,01 entre el recuento de plaquetas de 3p-2.2 y CpG). Los datos se muestran como las medias ± SEM de 2 experimentos independientes.
Figura 21: La administración de 3p-2.2 encapsulado produce la reducción de las metástasis de pulmón de melanoma B16 inducidas experimentalmente
(a)
Régimen terapéutico: Se enfrentaron los ratones con 4x105 células de melanoma B16 por vía intravenosa para inducir experimentalmente metástasis de pulmón el día 0. Se trataron los ratones por vía intravenosa con el ácido nucleico indicado complejado con jetPEI™ los días 3, 6 y 9 como se indica. 14 días después del enfrentamiento, se contó el número de metástasis de melanoma visibles macroscópicamente en la superficie de los pulmones con ayuda de un microscopio de disección o se calculó el peso del pulmón.
(b)
Se enfrentaron grupos de cinco ratones C57BL/6 con 4x105 B16 y se trataron como se describe. Se trataron los ratones intravenosamente los días 3, 6 y 9 con 50 µg de OH-2.2, 50 µg de 3p-2.2, 50 µg de 3p-GC (un 3p-RNA no específico de cadena doble) o 50 µg de ligando de oligonucleótido CpG, cada uno de ellos complejado con jetPEI™. Los grupos de control recibieron 100 µl de glucosa al 5 % o 50 µg de poliA complejado con jetPEI™. Se evaluó el
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sustituidos o arabinósidos 2'-sustituidos incluyen, sin limitación, 2'-amino-, 2'-fluoro-, 2'-alil-, y 2'-propargilribonucleósidos o arabinósidos.
El término "oligonucleótido" incluye oligonucleótidos híbridos y quiméricos. Un "oligonucleótido quimérico" es un oligonucleótido que tiene más de un tipo de enlace internucleósido. Un ejemplo preferido de tal oligonucleótido quimérico es un oligonucleótido quimérico que comprende una región fosforotioato, fosfodiéster o fosforoditioato y enlaces no iónicos tales como enlaces alquilfosfonato o alquilfosfonotioato (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.635.377 y 5.366.878).
Un "oligonucleótido híbrido" es un oligonucleótido que tiene más de un tipo de nucleósido. Un ejemplo preferido de tal oligonucleótido híbrido comprende un ribonucleótido o región de ribonucleótido 2' sustituido, y una región de desoxirribonucleótido (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.652.355, 6.346.614 y 6.143.881).
Los oligonucleótidos de RNA expuestos en la presente memoria incluyen por lo demás RNA sin modificar, así como RNA que ha sido modificado (por ejemplo, para mejorar la eficacia), y polímeros de sustitutos de nucleósidos.
El RNA sin modificar se refiere a una molécula en la que los componentes del ácido nucleico, a saber, azúcares, bases y restos de fosfato, son los mismos o esencialmente los mismos que existen en la naturaleza, preferiblemente como existen naturalmente en el cuerpo humano. La técnica se ha referido a los RNA raros o inusuales, pero de origen natural, los RNA como RNA modificados, véase, por ejemplo, Limbach et al. 1994, Nucleic Acids Res 22: 2183-2196. Tales RNA raros o inusuales, denominados a menudo RNAs modificados (aparentemente porque son típicamente el resultado de una modificación postranscripcional) están dentro del término RNA sin modificar, como se usa en la presente memoria.
El RNA modificado como se utiliza aquí se refiere a una molécula en la que uno o más de los componentes del ácido nucleico, a saber, azúcares, bases y restos de fosfato, son diferentes de los que existen en la naturaleza, preferiblemente diferentes de los que existen en el cuerpo humano. Aunque se conocen como "RNA" modificados, por supuesto, debido a la modificación, incluyen moléculas que no son RNA.
Los sustitutos de nucleósidos son moléculas en las que la cadena principal de ribofosfato se reemplaza con un constructo de no ribofosfato que permite que las bases se presenten en la relación espacial correcta de tal modo que la hibridación es sustancialmente similar a la que se ve con una cadena principal de ribofosfato, por ejemplo, imitadores no cargados de la cadena principal de ribofosfato.
Todas las secuencias de ácido nucleico listadas en la presente memoria están en la dirección 5' a 3’ a menos que se indique otra cosa.
El oligonucleótido de RNA de la invención puede ser de cadena sencilla (ssRNA), de cadena doble (dsRNA), o parcialmente de cadena doble (parcialmente dsRNA).
Un oligonucleótido de RNA de cadena sencilla puede contener secuencias autocomplementarias y forma una horquilla. Por ejemplo, 5'-GACCTAGCCTAAAACTAGGTC-3'. La secuencia autocomplementaria puede ser una secuencia palindrómica. Por ejemplo, 5’-AAAGATCCGGATCAAAA-3'.
Un oligonucleótido de RNA de cadena doble puede tener uno o dos nucleótidos que cuelgan en el extremo 5’ o 3' de una o ambas cadenas.
Un oligonucleótido de RNA parcialmente de cadena doble puede comprender dos cadenas de la misma o diferente longitud, en donde al menos una de las cadenas contiene nucleótidos fuera de la secuencia complementaria. Por ejemplo,
Ejemplo 1: 5’-AAAAGUUCAAAGCUCAAAA-3’
3’-CAAGUUUCGAG-5’ '
Ejemplo 2: 5’-UCAAAGUCAAAAGCUCAAAGUUGAAAGUUUAAA-3’
3'-GACUUGAAAAUUUCAGUUUUCGAGUUUAAGUUGAAAACUCG-5’
Ejemplo 3: 5'-UCAAAGUCAAAAGCUCAAAGUUGAAA-3'
3'-UUUCAGUUUUCGAGUUUAAGUUGAAAACUCG-5'
La longitud de un oligonucleótido de RNA de cadena sencilla es el número de nucleótidos contenidos en el oligonucleótido.
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En el caso de un oligonucleótido de cadena doble o parcialmente de cadena doble, la longitud del oligonucleótido es la longitud de las cadenas individuales. En otras palabras, un oligonucleótido parcialmente de cadena doble puede tener dos longitudes.
Aumento de la resistencia a la nucleasa
Para una mayor resistencia a las nucleasas y/o afinidad de unión a la diana, un oligonucleótido puede incluir, por ejemplo, unidades de ribosa 2’-modificada y/o enlace o enlaces de fosforotioato y/o enlace o enlaces de pirofosfato. Por ejemplo, el grupo 2' hidroxilo (OH) puede ser modificado o reemplazado con un número de diferentes sustituyentes “oxi” o “desoxi”.
Los ejemplos de modificaciones del grupo "oxi"-2' hidroxilo incluyen alcoxi o ariloxi (OR, por ejemplo, R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) en los cuales se conecta el 2’ hidroxilo, por ejemplo, mediante un puente de metileno, al carbono 4’ del mismo azúcar ribosa; O-amina y aminoalcoxi, O(CH2)namina, (por ejemplo, amina = NH2 ; alquilamino, dialquilamino, heterociclil amino, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, o diheteroaril amino, etilendiamina, poliamino). Es de destacar que los oligonucleótidos que contienen sólo el grupo metoxietilo (MOE), (OCH2CH2OCH3, un derivado de PEG), presentan estabilidades de nucleasa comparables a los modificados con la modificación robusta de fosforotioato.
Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno (es decir, azúcares desoxirribosa, que son de particular relevancia para las porciones colgantes de los RNA parcialmente de cadena doble); halo (por ejemplo, fluoro); amino (por ejemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, diheteroaril amino, o aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-amina (amina = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilamino, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino), -NHC(O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con una función amino.
Los sustituyentes preferidos son 2'-metoxietilo, 2'-OCH3, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, y 2'-fluoro.
Para maximizar la resistencia a las nucleasas, se pueden utilizar las modificaciones en 2' en combinación con una o más modificaciones de enlaces fosfato (por ejemplo, fosforotioato). Los denominados oligonucleótidos "quiméricos" son aquellos que contienen dos o más modificaciones diferentes.
La inclusión de azúcares de furanosa en la cadena principal del oligonucleótido también puede disminuir la escisión endonucleolítica. Un agente oligonucleótido puede ser modificado además incluyendo un grupo catiónico en 3', o invirtiendo el nucleósido en el extremo 3' con un enlace 3'-3'. En otra alternativa, el extremo 3’ puede ser bloqueado con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un 3' C5-aminoalquilo dT. Otros conjugados en 3' pueden inhibir la escisión exonucleolítica en 3'-5'. Aunque sin limitarse a ninguna teoría, un conjugado en 3' , tal como el naproxeno o el ibuprofeno, puede inhibir la escisión exonucleolítica bloqueando estéricamente la exonucleasa de la unión al extremo 3' del oligonucleótido. Incluso las cadenas pequeñas de alquilo, grupos arilo, o conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa etc.) pueden bloquear las 3'-5'-exonucleasas.
De manera similar, los conjugados en 5’ pueden inhibir la escisión exonucleolítica en 5'-3'. Aunque sin limitarse a ninguna teoría, un conjugado en 5', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la escisión exonucleolítica bloqueando estéricamente la exonucleasa de la unión al extremo 5’ del oligonucleótido. Incluso las cadenas pequeñas de alquilo, grupos arilo, o conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa etc.) pueden bloquear las 5'-3'-exonucleasas.
Los oligonucleótidos de RNA de cadena sencilla que contienen secuencias autocomplementarias y que forman una estructura de horquilla han mejorado la resistencia a la nucleasa en comparación con los oligonucleótidos de cadena sencilla que no lo hacen.
Ligandos anclados
Los oligonucleótidos de RNA incluyen también aquellos con ligandos anclados. Las propiedades de un oligonucleótido de RNA, incluyendo sus propiedades farmacológicas, pueden ser influenciadas y adaptadas por la introducción de ligandos, por ejemplo, ligandos anclados.
Los ligandos se pueden acoplar, covalentemente o no covalentemente, preferiblemente covalentemente, ya sea directamente o indirectamente por medio de un anclaje intermedio, al oligonucleótido de RNA. En realizaciones preferidas, el ligando se une al oligonucleótido por medio de un anclaje intermedio.
En realizaciones preferidas, un ligando altera la distribución, orientación o vida útil de un oligonucleótido de RNA al que se incorpora. En realizaciones preferidas, un ligando proporciona una afinidad mejorada para una diana seleccionada, por ejemplo, molécula, célula o tipo celular, un compartimento celular o de un órgano, un tejido, órgano o región del cuerpo.
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Los ligandos preferidos pueden mejorar el transporte, la hibridación, y las propiedades de especificidad y pueden mejorar también la resistencia a las nucleasas del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descritos en la presente memoria y/o ribonucleótidos naturales o modificados.
Se puede utilizar una amplia variedad de ligandos. Los ligandos pueden incluir agentes que permiten la orientación específica del oligonucleótido hacia un objetivo; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores que permiten la monitorización de la distribución del oligonucleótido; agentes de reticulación; restos que confieren resistencia a las nucleasas; y nucleobases naturales o inusuales. Ejemplos generales incluyen moléculas lipófilas, lípidos, lectinas, esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsasapogenina, friedelina, epifriedelanol, ácido litocólico derivatizado), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico), proteínas, agentes de unión a proteínas, moléculas dirigidas a integrinas, policatiónicos, péptidos, poliaminas y compuestos peptídicos miméticos.
El ligando puede ser una molécula de origen natural o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Ejemplos de poliaminoácidos incluyen, sin limitación, poli L-lisina, ácido poli-Laspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero poli (L-lactida-coglicol), copolímero de éter divinílico-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de Nisopropilacrilamida, o polifosfazina. Ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, poli lisina, espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudopéptido, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, restos catiónicos, por ejemplo, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa helicoidal.
Los ligandos pueden incluir también grupos de dirección al objetivo, por ejemplo, un agente de direccionamiento a una célula o tejido, por ejemplo, una tirotropina, melanotropina, proteína surfactante A, carbohidrato de mucina, un poliaminoácido glucosilado, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un péptido RGD o péptido mimético de RGD.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glucoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo, lipoproteína de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula de cáncer, célula endotelial, o célula ósea. Los ligandos pueden incluir también hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 MAP cinasa, o un activador de NF-kB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la absorción del agente oligonucleótido en la célula, por ejemplo, mediante la ruptura del citoesqueleto de la célula, por ejemplo, mediante la ruptura de microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, o mioservina.
En una realización, el ligando es un lípido o molécula basada en lípidos. Dicho lípido o molécula basada en lípido se une preferiblemente a una proteína sérica, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado en un tejido diana, por ejemplo, tejido hepático, incluyendo las células del parénquima del hígado. Otras moléculas que se pueden unir a HSA se pueden usar también como ligandos. Por ejemplo, se pueden utilizar neproxinao aspirina. Un ligando de lípidos o basado en lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar la orientación o transporte a una célula o membrana celular diana, y/o (c) se puede utilizar para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA.
Un ligando basado en lípidos puede ser utilizado para modular la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o un ligando basado en lípidos que se une a HSA con más fuerza será menos propenso a ser dirigido al riñón y por lo tanto menos probable que sea aclarado del cuerpo. Se puede utilizar un lípido o ligando basado en lípidos que se une a HSA menos fuertemente para dirigir el conjugado al riñón.
En otra realización, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina o un nutriente, que es absorbido por una célula diana, por ejemplo, una célula en proliferación. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación no deseada de células, por ejemplo, de tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Los ejemplos de vitaminas incluyen vitamina A, E, y K. Otras vitaminas ejemplares incluyen las vitaminas B, por ejemplo, ácido fólico, vitamina B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las células cancerosas.
En otra realización, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación de células helicoidales. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente ejemplar es un péptido tal como tat o antennapedia. Si el agente es un péptido, puede ser modificado, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros,
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enlaces de no péptidos o seudo-péptidos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que tiene preferiblemente una fase lipófila y una fase lipófoba.
En una realización preferida, el ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo que es específico para un resto presente en una célula a seleccionar. El resto puede ser una proteína, una estructura de carbohidrato, un polinucleótido, o una combinación de los mismos. El resto puede ser secretado, asociado con la membrana plasmática (por ejemplo, sobre la superficie extracelular o intracelular), citosólico, asociado a orgánulos intracelulares (por ejemplo, ER, complejo de Golgi, mitocondrias, endosoma, lisosoma, vesícula secretora) o nuclear. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser quimérico o humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena única. El fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, o cualquier fragmento que retiene la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo intacto.
Actividad inmunoestimulante
Como se utiliza en la presente memoria, "actividad inmunoestimulante" se refiere a la capacidad de un agente, tal como una molécula o una composición, para inducir una respuesta inmunitaria. En una realización, la actividad inmunoestimulante se refiere a la actividad inductora de IFN tipo I, en particular, la actividad inductora de IFN-α.
Como se usa en la presente memoria, "inducir una respuesta inmunitaria" significa iniciar o causar un aumento en una o más entre la activación de células B, activación de células T, activación de células asesinas naturales, activación de células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células B, células dendríticas, monocitos y macrófagos), producción de citocinas, producción de quimiocinas, expresión de marcador de superficie celular específico, en particular, la expresión de moléculas co-estimulantes. En un aspecto, tal respuesta inmunitaria implica la producción de IFN tipo I (IFN-α y/o IFN-β), en particular, IFN-α, en células tales como PDC (células dendríticas plasmacitoides) y/o monocitos.
Como se usa en esta memoria, "actividad inductora de IFN tipo I" incluye la actividad inductora de IFN-α y/o la actividad inductora de IFN-β.
Como se usa en la presente memoria, "actividad inductora de IFN-α" se refiere a la capacidad de un agente, tal como una molécula o composición, para inducir la producción de IFN-α a partir de una célula capaz de producir IFNα. Las células capaces de producir IFN-α incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (por ejemplo, células B, células dendríticas (células dendríticas mieloides y células dendríticas plasmacitoides), macrófagos, monocitos, células asesinas naturales, granulocitos), células endoteliales, y líneas celulares.
Como se usa en esta memoria, "actividad inductora de IFN-β" se refiere a la capacidad de un agente, tal como una molécula o composición, para inducir la producción de IFN-β de una célula capaz de producir IFN-β. Cualquier célula somática, tal como las PBMC, las células dendríticas mieloides, monocitos, PDC, fibroblastos, son capaces de producir IFN-β.
Respuesta antiviral
Como se usa en la presente memoria, "respuesta antiviral" se refiere a la respuesta de una célula, tejido u organismo a la infección por un virus con el fin de eliminar o incapacitar el virus. Las respuestas antivirales típicas incluyen, pero no se limitan a, producción de IFN tipo I, MIP1-a, MCP, RANTES, IL-8, IL-6, IP-10, e IFN-γ.
Respuesta antibacteriana
Una respuesta antibacteriana es la respuesta de una célula, tejido u organismo a la infección por una bacteria con el fin de eliminar o incapacitar la bacteria. Las respuestas antibacterianas típicas incluyen, pero no se limitan a, eliminación, mediada por las células T o por las células NK, de la célula infectada o por apoptosis mediada por el receptor o por apoptosis mediada por citocinas por medio de TNF o TRAIL, fagocitosis de macrófagos o monocitos.
Una respuesta antibacteriana, en particular, la producción de IFN tipo I y tipo II, puede ser inducida en células inmunitarias o en células no inmunitarias. Las células inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células dendríticas plasmacitoides (PDC), células dendríticas mieloides (MDC), células B, macrófagos, monocitos, células asesinas naturales, células NKT, células T CD4+, células T CD8+, granulocitos. Las células no inmunitarias incluyen, entre otras, células tumorales, células epiteliales, células endoteliales, y fibroblastos.
Genes, RNA y antígeno relacionados con un trastorno/enfermedad
Como se utiliza en la presente memoria, "gen relacionado con un trastorno/enfermedad" se refiere a un gen que se expresa o sobreexpresa en una enfermedad/trastorno y que no se expresa o se expresa en cantidad reducida en las células sanas normales . Por ejemplo, un gen CF mutante se expresa en pacientes con fibrosis quística, pero no en un individuo sin fibrosis quística; ErbB2 (o Her2) se sobreexpresa en las células de cáncer de mama en comparación con las células de mama normales; un gen vírico o un gen del hospedante inducido víricamente se expresa en las
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células infectadas, pero no en las células no infectadas. El producto génico del gen relacionado con el trastorno/ enfermedad se denomina aquí como el "antígeno relacionado con un trastorno/enfermedad". Un "RNA relacionado con un trastorno/ enfermedad" se refiere a una molécula de RNA que está presente o se presenta en un nivel elevado en una célula enferma y que no está presente o se presenta en un nivel reducido en una célula sana normal. Un RNA relacionado con un trastorno/enfermedad puede ser un mRNA, un miRNA, o otro RNA no codificante tal como rRNA o tRNA.
Mamífero
Como se utiliza en la presente memoria, el término "mamífero" incluye, sin limitación, ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ovejas, ganado, vacas, cerdos, conejos, primates no humanos, y seres humanos.
Oligonucleótido
La presente divulgación proporciona un oligonucleótido capaz de inducir la producción de IFN tipo I, en donde el oligonucleótido comprende al menos tres grupos fosfato en el extremo 5' , en donde el grupo fosfato está libre de cualquier estructura o modificación de caperuza, en donde el oligonucleótido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, más preferiblemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, aún más preferiblemente al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, lo más preferiblemente al menos 18, 19, 20, 21 ribonucleótidos en el extremo 5', y en donde el oligonucleótido tiene al menos 21 nucleótidos de longitud.
El oligonucleótido puede ser de cadena sencilla, de cadena sencilla que contiene una secuencia autocomplementaria que puede formar una estructura de horquilla, de cadena doble, o parcialmente de cadena doble.
Cuando el oligonucleótido es de cadena sencilla, de cadena sencilla que contiene una secuencia autocomplementaria o cadena doble, la longitud del oligonucleótido es la longitud de una sola cadena.
Cuando el oligonucleótido es parcialmente de cadena doble, la longitud del oligonucleótido es la longitud de la cadena más larga. Por lo tanto, el oligonucleótido incluye oligonucleótidos parcialmente de cadena doble en donde al menos una de las cadenas es al menos de 21 nucleótidos de longitud.
En el oligonucleótido, el al menos 1 ribonucleótido en el extremo 5' comprende un trifosfato. En el caso de un oligonucleótido de cadena doble o parcialmente de cadena doble, al menos una de las cadenas comprende al menos un grupo 5' trifosfato. Cuando ambas cadenas comprenden grupos 5' fosfato, el número de grupos fosfato puede ser el mismo o puede ser diferente en las dos cadenas. Por lo tanto, los oligonucleótidos de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, o 6 grupos 5' fosfato en la forma de monofosfato, difosfato y/o trifosfato. En el caso de un oligonucleótido parcialmente de cadena doble, el al menos 1 ribonucleótido en el extremo 5' que comprende el al menos un 5’ trifosfato puede estar sobre la cadena larga o sobre la corta, en donde al menos la cadena larga es al menos de 21 nucleótidos de longitud.
En el oligonucleótido, los al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ribonucleótidos en el extremo 5' están en la misma cadena.
En una realización, al menos uno de los grupos 5' fosfato no está comprendido en un trifosfato. En otra realización, el oligonucleótido comprende al menos un grupo seleccionado de un monofosfato y un difosfato en el extremo 5' , en donde el monofosfato y/o difosfato está libre de cualquier caperuza o modificación.
En una realización, el primer ribonucleótido en el extremo 5' del oligonucleótido comprende un ribonucleótido seleccionado de A, U, C y G. En una realización preferida, el primer ribonucleótido en el extremo 5' del oligonucleótido comprende un ribonucleótido seleccionado de A, C y U. En una realización más preferida, el primer ribonucleótido en el extremo 5’ del oligonucleótido comprende un ribonucleótido seleccionado de A y C. En la realización más preferida, el primer ribonucleótido en el extremo 5' comprende una adenina (A).
En realizaciones preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5’ del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, AACG, AUGA, AGUU, AUUG, AACA, AGAA, AGCA, AACU, AUCG, AGGA, AUCA, AUGC, AGUA, AAGC, AACC, AGGU, AAAC, AUGU, ACUG, ACGA, ACAG, AAGG, ACAU, ACGC, AAAU, ACGG, AUUC, AGUG, ACAA, AUCC, AGUC, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
En realizaciones más preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5' del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, AACG, AUGA, AGUU, AUUG, AACA, AGAA, AGCA, AACU, AUCG, AGGA, AUCA, AUGC, AGUA, AAGC, AACC, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
En realizaciones aún más preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5’ del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, AACG, AUGA, AGUU, AUUG, AACA, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
En las realizaciones más preferidas, la secuencia de los 4 primeros nucleótidos en el extremo 5' del oligonucleótido se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, en donde todas las secuencias están en la dirección 5'→ 3’.
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En otras realizaciones, el primer nucleótido de las secuencias de 4-nucleótidos en 5' listadas anteriormente es una U, C o G en lugar de A.
En una realización preferida, el oligonucleótido comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, preferiblemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, más preferiblemente al menos 11, 12, 13, 14, 15, aún más preferiblemente al menos 16, 17, 18, 19, 20, y lo más preferiblemente al menos 21, 22, 23, 24, 25 inosinas (I). En una realización, al menos 1, 2, 3, 4, 5 %, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 25, 30, más preferiblemente al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60 %, aún más preferiblemente al menos 70, 80, o 90 % de la adenosina (A) y/o de la guanosina (G) en el oligonucleótido se reemplaza con inosina (I).
El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido de RNA, o un oligonucleótido de RNA-DNA quimérico. Un oligonucleótido de RNA-DNA quimérico comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Los ribonucleótidos y los desoxirribonucleótidos pueden estar en la misma cadena, o pueden estar en diferentes cadenas.
En una realización, el oligonucleótido (RNA o RNA-DNA quimérico) comprende una cadena principal de fosforotioato. En realizaciones preferidas, al menos 1, preferiblemente al menos 2, más preferiblemente al menos 3, aún más preferiblemente al menos 4 nucleótidos son fosforotioato.
En una realización preferida, el oligonucleótido no contiene ninguna modificación tal como pseudouridina, 2tiouridina, 2'-flúor-dNTP, NTP 2'-O-metilado, en particular, 2'-flúor-dCTP, 2’-flúor-dUTP, CTP 2'-O-metilado, UTP 2'O-metilado.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene actividad de silenciamiento génico. En una realización, el oligonucleótido es activo en la interferencia de RNA (RNAi), o es una molécula de RNAi. La molécula de RNAi puede ser un siRNA (RNA interferente pequeño, de cadena doble), shRNA (RNA pequeño de horquilla, de cadena sencilla con una estructura de horquilla) o miRNA (micro RNA, de cadena sencilla con una estructura de horquilla).
En una realización preferida, el oligonucleótido de RNA es un oligonucleótido de RNA de cadena sencilla que no contiene ninguna secuencia que sea capaz de formar alguna estructura intramolecular o intermolecular de cadena doble consigo misma en condiciones fisiológicas, en particular, condiciones fisiológicas dentro de una célula, y la secuencia de nucleótidos del RNA de cadena sencilla es complementaria de un RNA en una célula diana.
En una realización, el RNA se expresa de una manera específica de un tejido, célula y/o etapa de desarrollo. En una realización preferida, el RNA es un RNA relacionado con una enfermedad/trastorno. En una realización, el RNA relacionado con una enfermedad/trastorno es un mRNA de un gen relacionado con una enfermedad/trastorno. En otra realización, el RNA relacionado con una enfermedad/trastorno es un miRNA. El RNA relacionado con una enfermedad/trastorno puede ser un RNA endógeno celular, un RNA vírico, un RNA de un microorganismo u organismo invasor tal como una bacteria, un hongo, o un parásito.
El grado de complementariedad es preferiblemente al menos 50 %, 60 %, 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, aún más preferiblemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y lo más preferiblemente 100 %. Tal como se utiliza en la técnica, el término "grado de complementariedad" entre dos oligonucleótidos/polinucleótidos se refiere al porcentaje de bases complementarias en la región de solapamiento de los dos oligonucleótidos. Dos bases son complementarias entre sí si pueden formar un par de bases mediante enlaces de hidrógeno. Los pares de bases incluyen tanto pares de bases de Waston-Crick como pares de bases de balanceo. Los pares de bases de Waston-Crick incluyen A-T, C-G, A-U; los pares de bases de balanceo incluyen G-U, I-U, I-A, I-C. El grado de complementariedad puede ser determinado por los expertos utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, ya sea manualmente o automáticamente por diversos medios tales como BLAST. Por ejemplo, ATCG tiene 100 % de complementariedad con CGAT y CGATGG, y 75 % de complementariedad con CGTT y CGTTGG. En una realización preferida, existe complementariedad entre el oligonucleótido y el RNA diana en la célula diana en toda la longitud del oligonucleótido.
El término "condición fisiológica" se usa en la presente memoria como se entiende comúnmente en la técnica. Condición fisiológica dentro de una célula se refiere a parámetros tales como la fuerza iónica, osmolaridad, concentración de sal, pH, temperatura, que se encuentran normalmente dentro de una célula, es decir, en el citosol. La célula puede estar in vivo, in vitro o ex vivo. La célula puede ser una célula sana o normal o una célula enferma o anormal. Una célula enferma o anormal puede ser, por ejemplo, una célula infectada por bacterias o virus, una célula tumoral, una célula autoinmunitaria, una célula que tiene una respuesta inflamatoria. Condición fisiológica se refiere a las condiciones en el interior o en el exterior de una célula in vivo, in vitro o ex vivo. Las condiciones fisiológicas se pueden encontrar en un organismo, tejido, o célula vivos o se pueden obtener artificialmente en un laboratorio. Un ejemplo de una condición fisiológica es NaCl 150 ± 50 mM, pH 7,4 ± 0,8, y 20 ± 20 ºC.
Si un oligonucleótido de RNA contiene o no alguna estructura de cadena doble puede ser determinado fácilmente por un experto utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un espectrómetro para medir los espectros de absorción de la cadena doble frente a la cadena sencilla, mientras que se aumenta la temperatura. En ciertas realizaciones, el número de pares de bases dentro de la estructura de cadena doble es al menos 6, 7, 8, 9, preferiblemente al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, más preferiblemente al menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, aún más preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25. Los pares de bases incluyen tanto pares de bases de Waston
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Crick como pares de bases de balanceo. Los pares de bases de Waston-Crick incluyen A-T, C-G, A-U; los pares de bases de balanceo incluyen G-U, I-U, I-A, I-C.
El oligonucleótido de RNA de cadena sencilla puede ser generado por síntesis química.
En una realización, el oligonucleótido de RNA de cadena sencilla no tiene ninguna actividad de silenciamiento génico.
En otra realización, el oligonucleótido de RNA de cadena sencilla tiene actividad de silenciamiento génico.
Como se usa en la presente memoria, el "precursor del oligonucleótido" se refiere a cualquier molécula que puede ser procesada para generar el oligonucleótido. Los precursores del oligonucleótido incluyen, pero no se limitan a, moléculas de DNA o RNA que pueden servir como moldes para la síntesis de los oligonucleótidos de RNA de la invención, moléculas de RNA o de RNA-DNA quiméricas que pueden ser escindidas enzimáticamente para producir los oligonucleótidos de la invención.
El oligonucleótido o su precursor pueden contener también motivos o firmas moleculares que son reconocidos por los TLR. Por ejemplo, los dsRNA largos (más de 30 bases) que llevan un 5' fosfato pueden servir como ligando tanto para RIG-I como para TLR3. Un oligonucleótido de RNA-DNA quimérico que comprende un ssRNA que lleva un 5’ fosfato y un ssDNA que contiene CpG puede servir como un ligando tanto para RIG-I como para TLR9. Los ssRNA o dsRNA que llevan un 5’ fosfato y motivos definidos de secuencia (S. S. Diebold et al., Science 303, 1529 (Mar 5, 2004); F. Heil et al., Science 303, 1526 (Mar 5, 2004); V. Hornung et al., Nat Med 11, 263 (Mar, 2005); documento WO 03/086280; solicitud de patente europea nº 05020020.3) pueden servir como un ligando tanto para RIG-I como para TLR7. Los ssRNA que llevan un 5’ trifosfato y motivos ricos en GU (documento WO 03/086280, solicitud de patente europea nº 05 020 019.5) pueden servir como un ligando tanto para RIG-I como para TLR8.
En una realización, el oligonucleótido o precursor del mismo comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, aún más preferiblemente al menos cuatro, incluso más preferiblemente al menos cinco, y lo más preferiblemente al menos seis, de los motivos de 4-nucleótidos (4 meros) seleccionados del grupo que consiste en:
GUUC (Nº 1), GUCA (Nº 2), GCUC (Nº 3), GUUG (Nº 4), GUUU (Nº 5), GGUU (Nº 6), GUGU (Nº 7), GGUC (Nº 8), GUCU (Nº 9), GUCC (Nº 10), GCUU (Nº 11), UUGU (Nº 12), UGUC (Nº 13), CUGU (Nº 14), CGUC (Nº 15), UGUU (Nº 16), GUUA (Nº 17), UGUA (Nº 18), UUUC (Nº 19), UGUG (Nº 20), GGUA (Nº 21), GUCG (Nº 22), UUUG (Nº 23), UGGU (Nº 24), GUGG (Nº 25), GUGC (Nº 26), GUAC (Nº 27), GUAU (Nº 28), UAGU (Nº 29), GUAG (Nº 30), UUCA (Nº 31), UUGG (Nº 32), UCUC (Nº 33), CAGU (Nº 34), UUCG (Nº 35), CUUC (Nº 36), GAGU (Nº 37), GGUG (Nº 38), UUGC (Nº 39), UUUU (Nº 40), CUCA (Nº 41), UCGU (Nº 42), UUCU (Nº 43), UGGC (Nº 44), CGUU (Nº 45), CUUG (Nº 46), UUAC (No.47),
en donde las secuencias de nucleótidos de los motivos van de 5' →3',
en donde el oligonucleótido o precursor del mismo tiene entre 12 y 64, preferiblemente entre 12 y 50, más preferiblemente entre 14 y 40, aún más preferiblemente entre 16 y 36, y lo más preferiblemente entre 18 y 25 nucleótidos de longitud.
En una realización, los motivos de 4 meros se seleccionan del grupo que consiste en el Nº 1-19, Nº 1-18, Nº 1-17, Nº 1-16, preferiblemente, Nº 1-15, Nº 1-14, Nº 1-13, Nº 1-12, más preferiblemente, Nº 1-11, Nº 1-10, Nº 1-9, Nº 1-8, Nº 1-7, aún más preferiblemente, Nº 1-6, Nº 1-5, Nº 1-4, Nº 1-3, lo más preferiblemente, Nº 1-2 de los motivos de 4 meros.
El oligonucleótido o precursor del mismo puede comprender una o más copias del mismo motivo de 4 meros, o una
o más copias de diferentes motivos de 4 meros.
En otra realización, el oligonucleótido o un precursor del mismo comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, aún más preferiblemente al menos cuatro, incluso más preferiblemente al menos cinco, y lo más preferiblemente al menos seis, de los motivos de 4-nucleótidos (4 meros) seleccionados del grupo que consiste en:
UCGU (Nº 1), GUUG (Nº 2), UGGU (Nº 3), UGGC (Nº 4), GGUA (Nº 5), UGAU (Nº 6), UGCU (Nº 7), UUGC (Nº 8), UUGU (Nº 9), UAGU (Nº 10), GGUU (Nº 11), GUUU (Nº 12), UGUG (Nº 13), GUGU (Nº 14), UGCC ( Nº 15), GUAU (Nº 16), GUGC (Nº 17), UGUA (Nº 18), UGUC (Nº 19), CUGU (Nº 20), UGAC (Nº 21), UGUU (Nº 22), UAAU (Nº 23), GUAG (Nº 24), UCUU (Nº 25), UUGG (Nº 26), UUUG (Nº 27), GGAU (Nº 28), UUUU (Nº 29), CGUU (Nº 30), UUAU (Nº 31), GUUC (Nº 32), GUGG (Nº 33), GGUG (Nº 34), UAUU (Nº 35), UCUG (Nº 36 ), GUAC (Nº 37), UAGG (Nº 38), UCUC (Nº 39), UAGC (Nº 40), UAUC (Nº 41), CUAU (Nº 42), UACU (Nº 43) , CGGU (Nº 44), UGCG (Nº 45), UUUC (Nº 46), UAUG (Nº 47), UAAG (Nº 48), UACC (Nº 49), UUAG (Nº 50), GCUU (Nº 51), CAGU (Nº 52), UGAG (Nº 53), GAUU (Nº 54), GAGU (Nº 55), GUUA (Nº 56), UGCA (Nº 57), UUCU (Nº 58), GCCU (Nº 59), GGUC (Nº 60), GGCU (Nº 61), UUAC (Nº 62), UCAU (Nº 63), GCGU (Nº 64), GCAU (Nº 65), GAUG (Nº 66), GUCU (Nº 67), CGUA (Nº 68), CGAU (Nº 69),
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en donde las secuencias de nucleótidos de los motivos van de 5' →3' ,
en donde el oligonucleótido o precursor el mismo tiene entre 12 y 64, preferiblemente entre 12 y 50, más preferiblemente entre 14 y 40, aún más preferiblemente entre 16 y 36, y lo más preferiblemente entre 18 y 30 nucleótidos de longitud.
En una realización, los motivos de 4 meros se seleccionan del grupo que consiste en el Nº 1-11, preferiblemente Nº 1-10, Nº 1-9, Nº 1-8, más preferiblemente Nº 1-7, Nº 1-6, Nº 1-5, Nº 1-4, aún más preferiblemente Nº 1-3, Nº 1-2 de los motivos de 4 meros listados anteriormente, lo más preferiblemente, el motivo de 4 meros es UCGU.
El oligonucleótido o precursor del mismo puede comprender una o más copias del mismo motivo de 4 meros, o una
o más copias de diferentes motivos de 4 meros.
El oligonucleótido o el precursor del mismo se puede utilizar para generar una gran cantidad de IFN tipo I, en particular, IFN-α, IL-18 y/o IL-1β in vitro y/o in vivo. Dichas citocinas se pueden generar en altas cantidades a partir de diferentes fuentes celulares, incluyendo tanto las células inmunitarias como no inmunitarias, de diferentes especies de vertebrados.
El oligonucleótido y el precursor del mismo se pueden preparar por métodos sintéticos incluyendo, pero sin limitarse a, síntesis química, transcripción in vitro y transcripción in vivo. En la transcripción in vitro, se pueden utilizar polimerasas, incluyendo, pero sin limitarse a, una polimerasa de bacteriófago tal como polimerasa T7, polimerasa T3, polimerasa SP6, polimerasas víricas, y RNA polimerasa de E. coli. La transcripción in vivo se puede conseguir en las células infectadas por virus, o bacterias que son infectadas o no infectadas con un fago.
Además, los oligonucleótidos o sus precursores, en particular, los oligonucleótidos de RNA, para uso de la invención pueden ser unidos covalentemente o no covalentemente a uno o más grupos lipófilos que mejoran la estabilidad y/o la actividad y/o facilitan la administración de los oligonucleótidos o precursores de los mismos.
Tal como se utiliza aquí, el término "lipófilo" o "grupo lipófilo" se refiere en términos generales a cualquier compuesto
o resto químico que tiene una afinidad por los lípidos. Los grupos lipófilos engloban compuestos de muchos tipos diferentes, incluyendo aquellos que tienen características aromáticas, alifáticas o alicíclicas, y combinaciones de los mismos.
En realizaciones específicas, el grupo lipófilo es una sustancia alifática, alicíclica, o polialicíclica, tal como un esteroide (por ejemplo, esterol) o un hidrocarburo alifático ramificado. El grupo lipófilo comprende generalmente una cadena de hidrocarburo, que puede ser cíclico o acíclico. La cadena de hidrocarburo puede comprender varios sustituyentes y/o al menos un heteroátomo, tal como un átomo de oxígeno. Tales restos alifáticos lipófilos incluyen, sin limitación, ácidos grasos saturados o insaturados, ceras (por ejemplo, ésteres de alcohol monovalente de ácidos grasos y diamidas grasas), terpenos (por ejemplo, los terpenos C10, sesquiterpenos C15, diterpenos C20, triterpenos C30, y tetraterpenos C40), y otros hidrocarburos polialicíclicos.
El grupo lipófilo se puede unir por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo por medio de un agrupamiento funcional presente en o introducido en el oligonucleótido de RNA, tal como un grupo hidroxi (por ejemplo, -CO-CH2-OH). Se puede producir la conjugación del oligonucleótido de RNA y el grupo lipófilo, por ejemplo, mediante la formación de un enlace de éter o de éster carboxílico o de carbamoilo entre el hidroxi y un grupo alquilo R-, un grupo alcanoilo RCO-o un grupo carbamoilo sustituido KNHCO-. El grupo alquilo R puede ser cíclico (por ejemplo, ciclohexilo) o acíclico (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada; y saturado o insaturado). El grupo alquilo R puede ser un grupo butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo u octadecilo, o similares. Preferiblemente, el grupo lipófilo se conjuga con el grupo 5' hidroxilo del nucleótido terminal. En una realización preferida, el grupo lipófilo es bisdecilamida de ácido 12hidroxidodecanoico.
En otra realización, el grupo lipófilo es un esteroide, tal como esterol. Los esteroides son compuestos policíclicos que contienen un sistema de anillo perhidro-1,2-ciclopentanofenantreno. Los esteroides incluyen, sin limitación, ácidos biliares (por ejemplo, ácido cólico, ácido desoxicólico y ácido deshidrocólico), cortisona, digoxigenina, testosterona, colesterol y esteroides catiónicos, tales como la cortisona.
En una realización preferida, el grupo lipófilo es colesterol o un derivado del mismo. Un "derivado de colesterol" se refiere a un compuesto derivado de colesterol, por ejemplo, por sustitución, adición o separación de sustituyentes. El esteroide se puede unir al oligonucleótido de RNA mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización preferida, el grupo lipófilo es carbamato de (6-hidroxihexil)colesterilo.
En otra realización, el grupo lipófilo es un resto aromático. En este contexto, el término "aromático" se refiere en términos generales a hidrocarburos mono y poliaromáticos. Los grupos aromáticos incluyen, sin limitación, restos de arilo C6-14 que comprenden uno a tres anillos aromáticos, que pueden estar opcionalmente sustituidos; grupos “aralquilo” o "arilalquilo" que comprenden un grupo arilo unido covalentemente a un grupo alquilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente independientemente sustituido o no sustituido; y grupos "heteroarilo". Como se utiliza en la presente memoria, el término "heteroarilo" se refiere a grupos que tienen 5 a 14 átomos en el anillo,
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una realización preferida, el agente de complejación es un lípido catiónico. En otra realización preferida, el agente de complejación es polietilenimina (PEI) (K. Wu et al., Brain Research 1008 (2): 284-287 (May 22, 2004); B. Urban-Klein et al. Gene Therapy 12(5): 461-466 (2005)). Ejemplos adicionales de agente de complejación incluyen, pero no se limitan a, derivados de colágeno (Y. Minakuchi et al. Nucleic Acids Research 32(13):e109 (2004)), y microesferas biodegradables tales como liposomas (M. Sioud, D. Sorensen, Biochem Biophys Res Commun 312(4): 1220-1225 (2003); PY Chien et al. Cancer Gene Therapy 12(3): 321-328 (2005)), virosomas (J de Jonge et al. Gene Therapy,
13: 400-411 (2006)), SNALPs (JJ Rossi, Gene Therapy 13: 583-584 ( 2006)), SICOMATRIX® (CSL Limited) (I. D. Davis et al. PNAS 101 (29): 10697-10702 (July 20, 2004); MJ Pearse, D. Drane, Adv Drug Deliv Rev 57(3):465-474 (Jan 10, 2005)), y microesferas de copolímero de poli (D,L-lactida-co-glicolida) (PLGA) (A. Khan et al. J Drug Target 12(6): 393-404 (2004)).
La polietilenimina (PEI) puede ser lineal o ramificada. En una realización preferida, PEI es jetPEI™ in vivo que es una PEI lineal desarrollada por PolyPlus-transfection para la administración eficaz y reproducible de oligonucleótidos aniónicos con baja toxicidad in vivo. Las vías de administración preferidas in vivo incluyen, pero no se limitan a las vías, intravenosa, intracerebral e intraperitoneal.
Los virosomas son envolturas víricas reconstituidas que se preparan a partir de virus con membrana de envoltura, en particular, virus de la gripe, por solubilización de la membrana vírica con un detergente adecuado, separación de las nucleocápsidas por ultracentrifugación y reconstitución de la envoltura vírica por medio de la extracción del detergente. Típicamente, los virosomas contienen lípidos víricos y glucoproteínas víricas (tales como hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) en el caso de virosomas de la gripe), se asemejan a las partículas de virus nativas en tamaño y morfología y retienen la especificidad del objetivo y la actividad fusogénica de las partículas víricas nativas.
Las SNALP indican partículas estables de ácido nucleico-lípido y contienen una bicapa lipídica compuesta de una mezcla de lípidos catiónicos y fusogénicos recubiertos con polietilenglicol difusible (PEG). Las SNALP están en el intervalo de tamaño de diámetro de 120 nanómetros, protegen al ácido nucleico incluido de las nucleasas séricas y permiten la absorción endosómica celular y la posterior liberación citoplasmática del ácido nucleico.
ISCOMATRIX® está hecho de saponina, colesterol y fosfolípidos en condiciones definidas y forma estructuras tipo jaula típicamente de 40 nm de diámetro. ISCOMATRIX® tiene la capacidad dual de facilitar la administración de la carga (por ejemplo, antígeno) y estimular el sistema inmunitario, tanto la respuesta inmunitaria celular como la humoral.
En otra realización, el agente de administración es un virus, preferiblemente un virus de replicación deficiente. En una realización, el oligonucleótido descrito en la invención está contenido en una cápsula vírica.
Los virus adecuados incluyen, pero no se limitan a, polimixovirus que se dirigen a los epitelios del tracto respiratorio superior y otras células, el virus de la hepatitis B que se dirige a las células del hígado, el virus de la gripe que se dirige a las células epiteliales y otras células, los adenovirus que se dirigen a una serie de diferentes tipos de células, los virus del papiloma que se dirigen a las células epiteliales y escamosas, el virus del herpes que se dirige a las neuronas, los retrovirus tales como el VIH que se dirige a las células T CD4+ y células dendríticas y otras células, y el virus Vaccinia Ankara modificado que se dirige a una variedad de células. Los virus pueden ser seleccionados en función de su especificidad de objetivo.
En una realización, el virus es un virus oncolítico. Los virus oncolíticos se dirigen a las células tumorales y causan la lisis de las células tumorales infectadas. Ejemplos de virus oncolíticos incluyen, pero no se limitan a, virus naturales de la enfermedad de Newcastle producida naturalmente (A. Phuangsab et al. Cancer Lett. 172: 27-36 (2001)), cepas atenuadas de reovirus (MC Coffey et al. Science 282: 1332-1334 (1998)) y virus de la estomatitis vesicular (VSV) (DF Stojdl et al. Nat Med. 6: 821-825 (2000)), mutantes de ingeniería genética de virus herpes simplex tipo 1 (HSV1), adenovirus, virus de la viruela y virus del sarampión (Chiocca EA Nat Rev Cancer 2: 938-950 (2002); Russell SJ Cancer gene Ther 9: 961-966 (2002); HJ Zen, DL Bartlett Cancer gene Ther 9: 1001-1012 (2002)).
Además de ser administrado por un agente de administración, el oligonucleótido o precursor del mismo puede ser administrado a las células por medio de medios físicos tales como la electroporación, administración por ondas de choque (Tschoep K et al., J Mol Med 2001; 79: 306-13), transfección desencadenada por ultrasonidos, y administración por pistola de genes con partículas de oro.
La composición farmacéutica puede comprender además otro agente tal como un agente que estabiliza el oligonucleótido, en particular, oligonucleótido de RNA, por ejemplo, una proteína que forma complejo con el agente oligonucleótido para formar una iRNP. Aún otros agentes incluyen quelantes, por ejemplo, EDTA (por ejemplo, para eliminar los cationes divalentes tales como Mg2+), sales, inhibidores de RNasa (por ejemplo, un inhibidor de RNasa de amplia especificidad tal como RNAsin) y así sucesivamente.
Una composición formulada puede asumir una variedad de estados. En algunos ejemplos, la composición es al menos parcialmente cristalina, uniformemente cristalina, y/o anhidra (por ejemplo, menos de 80, 50, 30, 20, o 10 % de agua). En otro ejemplo, el agente oligonucleótido está en una fase acuosa, por ejemplo, en una solución que incluye agua, siendo esta forma la forma preferida para la administración mediante inhalación.
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La fase acuosa o las composiciones cristalinas se pueden incorporar a un vehículo de administración, por ejemplo, un liposoma (en particular para la fase acuosa), o una partícula (por ejemplo, una micropartícula que puede ser apropiada para una composición cristalina). Generalmente, la composición de oligonucleótidos se formula en una forma que sea compatible con el método de administración pretendido.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a ellas, las vías oral o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica, por vías respiratorias (aerosol), ocular, rectal, vaginal, y tópica (incluyendo bucal y sublingual). En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas se administran por perfusión o inyección intravenosa o intraparenteral. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar también intraparenquimalmente, intratecalmente, y/o por inyección estereotáctica.
Para la administración oral, el oligonucleótido se proporcionará generalmente en forma de comprimidos o cápsulas, como un polvo o gránulos, o como una solución o suspensión acuosa.
Los comprimidos para uso oral pueden incluir los ingredientes activos mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal.
Las cápsulas para uso oral incluyen cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido, y cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un aceite tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, las composiciones farmacéuticas generalmente se proporcionarán en soluciones o suspensiones acuosas estériles, tamponadas a un pH e isotonicidad apropiados. Los vehículos acuosos adecuados incluyen solución de Ringer y cloruro de sodio isotónico. Las suspensiones acuosas según la invención pueden incluir agentes de suspensión tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y goma de tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Los conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y de n-propilo.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también formulaciones encapsuladas para proteger el oligonucleótido contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilen-vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos víricos) también se pueden utilizar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.522.811; en la publicación PCT WO 91/06309; y en la publicación de patente europea EP-A-43075.
En general, una dosis adecuada de un oligonucleótido estará en el intervalo de 0,001 a 500 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día (por ejemplo, de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 100 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo por kilogramo a aproximadamente 75 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 10 microgramos por kilogramo a aproximadamente 50 miligramos por kilogramo, o de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo). La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día, o el oligonucleótido se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis a intervalos apropiados a lo largo del día. En ese caso, el oligonucleótido contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño con el fin de lograr la dosis diaria total. La unidad de dosificación también se puede componer para administración durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona una liberación sostenida del agente durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica. En esta realización, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
Los expertos apreciarán que ciertos factores pueden influir en la dosis y en el tiempo requerido para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a la gravedad de la enfermedad/trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades/trastornos presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos. Las estimaciones de las dosis eficaces y las semividas in vivo para el oligonucleótido
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individual se pueden hacer utilizando metodologías convencionales o sobre la base de los ensayos in vivo utilizando un modelo animal apropiado.
La toxicidad y la eficacia terapéutica del oligonucleótido y de la composición farmacéutica se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren agentes oligonucleótidos que presenten altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. Las dosificaciones de las composiciones están preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier agente oligonucleótido para uso en la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración circulante en plasma del agente oligonucleótido que incluye la IC50 (es decir, la concentración del agente oligonucleótido de ensayo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía de líquidos de alta resolución.
El médico dispensador puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de la composición farmacéutica en base a los resultados observados utilizando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria.
La composición farmacéutica se puede utilizar para generar una gran cantidad de IFN tipo I, en particular, IFN-α, IL18 y/o IL-1β, in vitro y/o in vivo. El IFN tipo I, en particular, IFN-α, IL-18 y/o IL-1β, se puede generar en altas cantidades a partir de diferentes fuentes celulares, incluyendo tanto las células inmunitarias como las no inmunitarias, de diferentes especies de vertebrados.
La composición farmacéutica se puede usar para prevenir y/o tratar una enfermedad y/o un trastorno en un animal vertebrado, en particular, un mamífero, en la práctica médica y/o veterinaria. La enfermedad y/o trastorno es un tumor.
Preparación combinada
La presente divulgación proporciona una preparación combinada que comprende un oligonucleótido y un agente farmacéuticamente activo, en donde el oligonucleótido y el agente son para administración simultánea, separada o secuencial.
Los agentes farmacéuticamente activos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos de RNA inmunoestimulantes, oligonucleótidos de DNA inmunoestimulantes, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, antibióticos, factores antiangiogénicos, agentes quimioterapéuticos, agentes antivíricos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antiparasitarios, anticuerpos y agentes de silenciamiento génico.
La preparación combinada puede comprender uno o más agentes farmacéuticamente activos. Los uno o más agentes farmacéuticamente activos pueden ser de la misma o diferente categoría como se ha ejemplificado anteriormente.
En una realización, la preparación combinada comprende un oligonucleótido y un agente inmunoestimulante, en donde el oligonucleótido y el agente son para administración simultánea, separada o secuencial. En una realización, la preparación combinada comprende además un agente antivírico y/o antitumoral.
En otra realización, la preparación combinada comprende un oligonucleótido y un agente antivírico y/o antibacteriano y/o antitumoral, en donde el oligonucleótido y el agente son para administración simultánea, separada o secuencial. En una realización, la preparación combinada comprende además un agente inmunoestimulante.
El oligonucleótido y el agente farmacéuticamente activo pueden estar comprendidos en la misma composición o en composiciones separadas. Las composiciones separadas se pueden administrar simultáneamente o secuencialmente.
La preparación combinada puede comprender además ácido retinoico y/o IFN tipo I. Se sabe que el ácido retinoico y/o el IFN tipo I regulan por incremento la expresión de RIG-I en la mayoría de tipos de células, incluyendo por ejemplo células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, células inmunitarias y células tumorales.
Un agente inmunoestimulante es un agente, tal como una molécula o una composición, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Los agentes inmunoestimulantes incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos de RNA
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moldes de más de 40 pb por medio de PCR utilizando el pBluescript KS como un molde (para una lista detallada de todos los moldes de transcripción in vitro véase la tabla 1). Los moldes obtenidos contenían un promotor de consenso de la RNA polimerasa T7 seguido por la secuencia de interés a ser transcrita. Se incubaron 20 pmol del molde de DNA con 30 U de RNA polimerasa T7, 40 U de inhibidor de RNasa, 0,3 U de pirofosfatasa inorgánica de 5 levadura en un tampón que contiene Tris-HCl 40 mM pH 8,0, DTT 10 mM, espermidina-HCl 2 mM (Sigma) y MgCI2 20 mM. El RNA con caperuza se transcribió utilizando el Kit Opti mRNA (Curevac). Para transcribir los RNA modificados en nucleósidos, se reemplazó la uridina-5'-trifosfato por pseudouridina-5'-trifosfato o por 2-tiouridina-5'trifosfato (ambas de TriLink, San Diego, USA) durante la reacción de transcripción in vitro. Para la incorporación de UTP 2'-O-metilado (Trilink), se utilizó polimerasa T7 R&DNA™ (Eipcentre, Madison, USA). Esta polimerasa tiene 10 mutaciones del sitio activo de una sola base que permiten la incorporación de los NTP con 2'-sustituyentes tales como 2'-O-metilo. La transcripción in vitro se llevó a cabo durante la noche a 37 ºC. El molde de DNA se sometió a digestión utilizando DNasa I (Fermentas) y, posteriormente, los RNA se purificaron utilizando el kit de aislamiento de RNA de alta pureza de Roche (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) con las siguientes modificaciones: El tampón de unión era tiocianato de guanidina 2,0 M en etanol al 70 % y el tampón de lavado fue sustituido por NaCl
15 100 mM, EDTA 4,5 mM, Tris HCl 10 mM en etanol al 70 %. Después de elución, el exceso de sales y los NTP se eliminaron haciendo pasar los RNA por medio de una columna Mini Quick Spin™ Oligo Column (Roche). El tamaño y la integridad del RNA se comprobó mediante electroforesis en gel.
Tabla 1
A: Oligonucleótidos de DNA para la generación de moldes de transcripción in vitro:
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Cadenas correspondientes:
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B: Cebador de PCR para la generación de moldes de transcripción in vitro utilizando pBKS como el molde de PCR Cebador directo:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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Cebador reverso:
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Extractos celulares
Se prepararon lisados celulares según Meister et al. (G. Meister et al., Mol Cell 15, 185 (Jul 23, 2004)) con modificaciones menores. Se transfectaron células HEK 293 utilizando polietilenimina de alto peso molecular (25 kDa) (PEI; Sigma, 40.872-7). A una confluencia del 80-90 %, se transfectaron las células con una relación PEI:DNA de 1,5:1. 24-36 horas después de la transfección se recogieron las células y el sedimento celular se resuspendió en cinco volúmenes de sedimento de KCI 10 mM, MgCl2 1,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, HEPES-NaOH 10 mM (pH 7,9), PMSF 0,5 mM y se incubó durante diez minutos en hielo. Posteriormente se lavaron las células y el sedimento celular se resuspendió en dos volúmenes de sedimento del tampón descrito anteriormente y se homogeneizó por trituración. Los núcleos de las células se retiraron del lisado de células por centrifugación a 2000 g durante diez minutos. El sobrenadante se transfirió a tubos de microcentrífuga y se aclaró adicionalmente por centrifugación a 2000 g durante diez minutos y centrifugación adicional durante 30 minutos a 20.000 g para obtener el extracto citoplasmático. La concentración de KCI del extracto se elevó posteriormente a 100 mM por adición de KCl 2 M y se añadió glicerol hasta un porcentaje del 10 %. Para la purificación de los complejos de RIG-IC marcados con FLAG, se incubaron los extractos citoplásmicos en perlas de agarosa FLAG M2 (Sigma). Las perlas de agarosa FLAG M2 se lavaron una vez con glicina 0,1 M (pH 3,5) y se equilibraron por lavado con Tris-HCl 1 M (pH 8,0). Después se resuspendieron las perlas en tampón C (KCI 0,1 M. MgCl2 5 mM, 10 % de glicerol, 10 % de Tween 20, ßmercaptoetanol 10 mM, PMSF 0,2 mM, y Tris-HCl 20 mM [pH 8,0]) y se incubaron con extractos citoplasmáticos durante cuatro horas a 4 ºC con rotación. Se recogieron las perlas y se lavaron dos veces en tampón de lavado (NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM [pH 7,5]) complementado con 0,1 % de NP40. Se eluyeron entonces los complejos unidos por afinidad agitando las perlas en 3x péptido FLAG a 0,2 µg/ml (Sigma) en tampón de lavado durante dos horas a 10 ºC y después de la centrifugación se recogió el eluato.
Estudios de unión a ligando
El lisado de células enteras o 25 µl de eluato de RIG-IC se incubó con 0,375 µg de RNA biotinilado en presencia de 40 U de inhibidor RNasa (Fermentas), PMSF 0,5 mM en un volumen final de 100 µl en tampón de lavado durante dos horas a 4 ºC con rotación. Se añadieron al lisado 50 µl de perlas recubiertas con estreptavidina (Pierce, Rockford, USA; 20347) durante otra hora a temperatura ambiente con rotación. Se lavaron entonces las perlas cuatro veces con tampón de lavado complementado con 0,1 % de NP40. Se lisaron el sobrenadante y las perlas en tampón de Laemli para su posterior análisis de inmunotransferencia.
Transferencia Western
Para la transferencia Western, se separaron muestras mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham-Biosciences, UK) mediante electrotransferencia semi-seca. Como anticuerpo primario, se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-Flag (Sigma). Como anticuerpo secundario, se utilizó anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (Amersham-Biosciences). Los anticuerpos unidos se visualizaron por el sistema de quimioluminiscencia potenciada (ECL) según el protocolo del fabricante (Amersham-Biosciences).
Ensayos de reportero
12-16 horas antes de la transfección, se sembraron células HEK 293 en placas de 48 pocillos. A una confluencia del 80 %, se transfectaron las células HEK 293 utilizando PEI con 300 ng de un plásmido reportero (pIFNβ-luc), 500 ng de un plásmido de normalización (que expresa la β-galactosidasa del virus del sarcoma de Rous) y los plásmidos de expresión indicados dando un total de 1,5 µg de DNA/pocillo. 24 horas después de la transfección se aspiró el medio de cultivo y se lavaron las células una vez en 0,5 ml de PBS que contenía EDTA 10 mM. Después se lisaron las células en 50 µl de tampón de lisis de luciferasa (10 % de glicerol, 1 % de Triton-X, EDTA 2 mM, TrisHCI 25 mM [pH 7,8], DTT 2 mM). Se mezclaron 20 µl de cada muestra con 20 µl de reactivo de detección de luciferasa (Promega) y
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Ejemplo 10: Cancelado
Ejemplo 11. Combinación de funciones inmunoestimulantes potentes con eficiente actividad de silenciamiento génico en una molécula de RNA
Se identificaron varias secuencias dirigidas a Bcl-2 murino y posteriormente se generaron tres siRNAs sintéticos (anti-Bcl-2.1, anti-Bcl-2.2, anti-Bcl-2.3) dirigidos a diferentes porciones del mRNA Bcl-2 murino (para una lista detallada de todos los oligonucleótidos de RNA sintetizados químicamente véase la Tabla 3).
Tabla 3. Secuencias de RNA sintetizadas químicamente
SEQ. ID. No.
Nombre Tipo Secuencia 5’→3
103
Bcl-2 murino 2.1 sentido RNA AUGCCUUUGUGGAACUAUA
104
Bcl-2 murino 2.1 antisentido RNA UAUAGUUCCACAAAGGCAU
105
Bcl-2 murino 2.2 sentido RNA GCAUGCGACCUCUGUUUGA
106
Bcl-2 murino 2.2 antisentido RNA UCAAACAGAGGUCGCAUGC
107
Bcl-2 murino 2.3 sentido RNA GGAUGACUGAGUACCUGAA
108
Bcl-2 murino 2.3 antisentido RNA UUCAGGUACUCAGUCAUCC
109
Poli-A RNA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
175
RIG-I murino sentido RNA GAAGCGUCUUCUAAUAAUU
176
RIG-I murino antisentido RNA AAUUAUUAGAAGACGCUUC
177
Control RNA UUCUCCGAACGUGUCACGU
178
Control antisentido RNA ACGUGACACGUUCGGAGAA
10 Después de la transfección de los diferentes anti-Bcl-2-siRNAs y un siRNA de control en células de melanoma B16, se determinó la regulación por disminución de Bcl-2 mediante transferencia de Western de los lisados celulares (Fig.15a, panel superior). Diferentes siRNAs mostraron diferentes eficiencias en la regulación por disminución objetivo. El tratamiento de las células de melanoma B16 con una dosis única de anti-Bcl-2.2 (denominado ahora OH2.2) dio como resultado una regulación por disminución eficiente de la expresión de Bcl-2 48 h después de la
15 transfección en comparación con el siRNA de control (Fig. 15a, panel superior). Esta reducción específica de Bcl-2 ya fue observada después de 18 h, se prolongó durante al menos 72 h y se confirmó por análisis FACS de Bcl-2 intracelular (no se muestran datos).
Posteriormente, el anti-Bcl-2.2 fue transcrito in vitro teniendo así 5’ trifosfatos (denominado ahora 3p-2.2; para una lista detallada de todos los moldes de transcripción in vitro véase la Tabla 4).
20 Tabla 4. Moldes de DNA para la transcripción in vitro
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Claims (1)

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