JPH08508714A

JPH08508714A - オリゴヌクレオチド・アルキルホスホネートおよびアルキルホスホノチオエート

Info

Publication number: JPH08508714A
Application number: JP6517287A
Authority: JP
Inventors: アール．カンディマラ、エカンバール; テンザマニ、ジャマル; アグラワル、スディール
Original assignee: Hybridon Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 1993-01-25
Filing date: 1994-01-25
Publication date: 1996-09-17
Also published as: ATE138384T1; WO1994017093A1; DK0677056T3; CN1121721A; FI953541A7; EP0677056A1; FI953541L; NZ262254A; EP0677056B1; ES2086997T3; KR960701077A; DE69400208T2; CA2154578A1; FI953541A0; AU6165494A; DE69400208D1; GR3020557T3

Abstract

(57)【要約】開示されるのは、少なくとも１つのリボヌクレオチドアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートを含くむオリゴヌクレオチド類似体である。この類似体は長さがは２から６０ヌクレオチドで、リボース基の２’位で置換された少なくとも１つのリボヌクレオチドを有している。さらに、このオリゴヌクレオチドを含くむ治療用製剤、ウイルス、病原菌またはその発現が疾病状態を伴うような細胞からの遺伝子発現を阻止する方法、ならびにウイルスまたは病原菌に感染したかもしくは細胞遺伝子の発現の結果として疾患にかかっている哺乳類を治療する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド・アルキルホスホネートおよびアルキルホスホノチオエート発明の背景本発明は、アンチセンスの応用に有用な合成オリゴヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、糖リン酸骨格にアンチセンス特性を増強するような修飾を施した合成オリゴヌクレオチドおよびその利用法に関する。発明の背景様々な生物分子を配列特異的に認識し、細胞の核酸標的にそれを結合させることは、遺伝子発現および遺伝子制御など分子生物学的処理における基本である。タンパク質およびＤＮＡの間の配列特異的な認識および相互作用について現時点ではあまりよくわかっていないので、治療目的など様々に利用するためのペプチドを基礎とした配列特異物質を設計することはきわめて難しい。しかし、水素結合の相互作用を介して核酸塩基が相補的に認識されるので、三重らせんをつくることによりＤＮＡ上に、また二重らせんをつくることによりＲＮＡ上に、あらかじめ決められたなんらかの配列に結合する配列特異的オリゴヌクレオチドを設計し、開発することは可能である。この原理に基づいて、分子生物学および細胞生物学におけるツールとして未変性オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドを広く利用し、生体系において特異的遺伝子が果たす役割を明らかにする。近年、オリゴヌクレオチドは細胞培養系でｍＲＮＡ種と相互作用させることにより特異的遺伝子の発現を阻止するのに使われている（ウルマンらによるChem． Rev．90巻543〜584頁（1990年）；ヘレンらによるBiochem．Biophys．Acta1049 巻99〜125頁（1990年））。これらの「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは、インビボで治療薬として利用することができる。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使って、ラット頸動脈における平滑筋細胞の移動または増殖を抑制できる（シモンズらによるNature359巻67〜70頁（1992年））。治療薬として有用であるためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞に取り込まれ、細胞内で働くことができなければならない。自然のホスホジエステル結合オリゴヌクレオチドは、ポリアニオン特性を持つために細胞に効率よく取り込まれない。また、細胞内においてヌクレアーゼの作用をきわめて受けやすく（たとえば、WickstromによるBiochem，Biophys．Meth．13巻97〜102頁（1986年）を参照）、インビボにおける生物学的利用性は制限される。細胞への取り込みおよびヌクレアーゼ作用に対する抵抗性を高めるために、これらのオリゴヌクレオチドの糖リン酸骨格の修飾が行われている。たとえば、ツォら（米国特許第4, 469,863号）およびミラーら（Biochem20巻1874〜1880頁（1981年））はメチルホスホネート結合を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを作製している。その他の修飾としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、およびホスフェートエステルがある。前記の修飾結合など複数タイプのヌクレオチド間結合を有する「キメラ」オリゴデオキシリボヌクレオチドが合成されている。たとえば、ペダーソンら（米国特許第5,149,797号、この教示を参考のため引用する）は、オリゴヌクレオチドメチルホスホネートまたはホスホルアミデートが隣接するオリゴヌクレオチドホスホジエステルまたはオリゴヌクレオチドホスホロチオエートのコア配列を有するキメラオリゴヌクレオチドを開示している。フルドンら（Nucleic Acids Res ．17巻9193〜9204頁（1989年））は、オリゴデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドメチルホスホネートのいずれかの領域に加えて、オリゴヌクレオチドホスホジエステルの領域を有するキメラオリゴデオキシリボヌクレオチドを開示している。カーチンら（Nucleic Acids Res．17巻7523〜7562（1989年））は、オリゴヌクレオチドホスホジエステルおよびオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの領域を有するキメラオリゴデオキシリボヌクレオチドを開示している。これらの修飾オリゴヌクレオチドの多くは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療への有効性を高めるのに役立ってきている。しかしながら、このようなオリゴヌクレオチドの治療薬としての有効性を制限する問題点が一部残っている。たとえば、アグラワルら（Proc ．Natl．Acad．Sci．（USA）87巻1401〜1405頁）は、ＲＮＡにハイブリダイズしたオリゴデオキシリボヌクレオチドホスホルアミデートはＲＮＡアーゼＨ（ＲＮＡｓｅＨ）を活性化せず、ＲＮＡアーゼＨ活性化させることがアンチセンスオリゴヌクレオチドが機能するうえに重要であることを明らかにしている。同様に、アグラワルら（Nucleosides & Nucleotides 8巻5〜6頁（1989年））は、オリゴデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートは、ＲＮＡにハイブリダイズされたときデュープレックス（duplex）の安定性が減少していることを明らかにしている。そこで、現在の技術でわかっているオリゴヌクレオチドの欠点を克服するようにオリゴヌクレオチドを改善することが必要となる。核酸分解による変性に対する抵抗力を有し、ＲＮＡと安定したデュープレックスを形成するオリゴヌクレオチドが理想的である。発明の概略まず第１に、本発明は非イオン性のヌクレオチド間結合によって作製される合成オリゴヌクレオチド類似体を提供する。このオリゴヌクレオチド類似体は、ヌクレアーゼに対して大きな抵抗力を持ち、ＲＮＡときわめて安定したデュープレックスを形成し、細胞にうまく取り込まれるための必要条件である疎水性を有している。こうした類似体に必要なことは、オリゴヌクレオチドの内部やまたはその片端もしくは両端から選んだ位置に、少なくとも１つのリボヌクレオチドアルキルホスホネートまたはリボヌクレオチドアルキルホスホノチオエートを有することである。本発明において「オリゴヌクレオチド」という用語には、少なくとも１つの５ ’端から３’端のヌクレオチド間結合により、リボヌクレオチド自体と結合しているか、または、デオキシリボヌクレオチドモノマーに結合している１ないし複数のリボヌクレオチドモノマーのポリマーをも含んでいる。これらの結合には、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する技術で公知の結合のすべてが含まれる。さらに、「オリゴヌクレオチド」という用語には、修飾された核酸塩基または糖あるいはその両者を有する分子、ジアミン、コレステリルまたはその他の親油基など追加された置換基、および２’−置換リボヌクレオシドモノマーも含まれる。「オリゴヌクレオチド類似体」という用語には、少なくとも１つのホスホジエステル以外のヌクレオチド間結合、または、修飾された核酸塩基もしくは糖または修飾された核酸塩基および糖の両者、あるいはそれらヌクレオチド間結合や修飾された核酸塩基や糖の両者を有するオリゴヌクレオチドまで含まれる。好ましい実施例では、本発明に従ったオリゴヌクレオチド類似体の長さは約２ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドにわたり、最も好ましいものの長さは約２５ヌクエオチドから約３０ヌクレオチドである。したがって、本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、１から約５９までのリボヌクレオチドアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート、あるいはそのような結合の組合せを有し、好ましくは約２４〜２９であるのがよい。本明細書でアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートと言う場合には、これらに限定はされないが、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基などの２’アルキル基と、ホスホネート結合またはホスホロチオエート結合を有するデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、あるいは２ ’−置換リボヌクレオチドのことである。本発明のいくつかの実施例では、オリゴヌクレオチド類似体は分子内のどこかの位置にアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートあるいはその両者を有し、他の位置にホスホジエステルによりまたは人工的結合により、あるいはその両者により結合した未変性のヌクレオチドを有する。これらは「キメラ」または「ハイブリッド」オリゴヌクレオチドとみなされる。ここで言う人工的ヌクレオチド間結合とは、リボヌクレオチドモノマーを５’ から３’に結合する非ホスホジエステル結合で、これらに限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、炭酸エステル、ホスフェートエステル、ホスホルアミデート、およびカーバメートなどがある。本発明の他の実施例では、オリゴヌクレオチド類似体は少なくとも１つの２’−置換リボヌクレオシドを含み、好ましくは６〜１０含むことが好ましい。本発明で「２’−置換」と言う場合は、リボース分子の２’−ＯＨをたとえば２’−Ｏ−メチル、２’−アリル、２’−アリール、２’−アルキル、２’−ハロ、または２’−アミノで置換することを意味し、２’−Ｈで置換することは入らない。ここでアリル基、アリール基、またはアルキル基は、たとえばハロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、カルボキシ基、トリフルオロメチル基、カルバルコキシ基またはアミノ基で置換されていても置換されていなくともよい。第２に、本発明はウイルス感染、病原菌による感染、または異常な遺伝子発現もしくは異常な遺伝子産物の発現の結果として生じる疾患の治療に有効な治療用製剤を提供する。このような治療用製剤には、生理学的に受け入れられる担体中における本発明の第１の特徴に従ったオリゴヌクレオチドがある。第３として、本発明は、前記のオリゴヌクレオチド類似体を使ってウイルス遺伝子、病原菌遺伝子、または細胞遺伝子の発現を阻止する方法を提供する。この方法には、前２者の例ではウイルスまたは病原菌に感染した細胞を、また後者の例では一般に細胞を本発明のオリゴリボヌクレオチド類似体を使って治療することが含まれる。第４に、本発明は、ウイルスまたは病原菌に感染した結果として、あるいは細胞遺伝子の異常な発現や異常な産物の結果として疾患または障害を被った哺乳類を治療する方法を提供する。この方法では、哺乳類に対して本発明に従ったオリゴヌクレオチド類似体を含む治療用製剤を、ウイルス、病原菌または遺伝子の核酸と安定したデュープレックスを形成してそれらを不活化するに十分な量で投与する。このような薬剤投与の好ましい経路は、経口投与、鼻腔内投与、直腸内投与、静脈内投与、局所投与である。この治療方法では、オリゴヌクレオチド類似体含有製剤と一緒に他の治療薬を投与することもできる。図面の簡単な説明本発明の前記の目的およびその他の目的、その様々な特徴、ならびに本発明そのものについては、添付の図面とあわせて以下の説明を読むことによって理解される。図１は、様々なホスフェート骨格の結合および修飾を図式化したもの。図１Ａはホスホジエステル、図１Ｂはメチルホスホノチオエート、図１Ｃはメチルホスホネート、図１Ｄはホスホロチオエート、図１Ｅはホスホロジチオエート、図１Ｆはホスホルアミデート、図１Ｇはホスフェートエステル。図２は、３’Ｏ−ホスホンアミダイト（3'O-phosphanamidite）の合成およびその後にオリゴヌクレオチドに組み込むところを図式化したもの。図３は、１１量体類似体１〜３（SEQ ID NO:1-3）および対照ｄ（Ａ）１１量体のイオン交換ＨＰＬＣプロフィールを比較した図。図４は、２５量体類似体（SEQ ID NO:4）ならびにＤＮＡ（Ａ）およびＲＮＡ（Ｂ）の相補的鎖で形成されるデュープレックスの融解特性を示したグラフ。図５は、オリゴヌクレオチド類似体（SEQ ID NO:4）（図５Ａ）および対照オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:5）（図５Ｂ）のヘビ毒ホスホジエステラーゼ消化後に得られた消化プロフィールの比較を示した図。図６は、オリゴヌクレオチド１〜３（SEQ ID NO:1-3）およびｄ（Ａ）₁₁（SEQ ID NO:6）の異なる時間間隔におけるホスホジエステラーゼＩ消化パターンのオートラジオグラム。図７は、１０％ウシ胎仔血清存在下におけるＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：５を有するオリゴヌクレオチドの安定性を示すポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラム。好ましい実施例の詳細な説明本発明は、アルキルホスホネート結合またはアルキルホスホノチオエート結合であるヌクレオチド間結合を少なくとも１つ有することを特徴とするオリゴヌクレオチド類似体を提供する。残りの結合は、ホスホジエステル結合またはその他の人工的ヌクレオチド間結合で、たとえばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、およびホスフェートエステルであるが、これらには限定されない。これらの結合の一部を図１に図示する。核酸の糖骨格をこのように修飾すると、細胞への取り込みおよびヌクレアーゼ作用に対する抵抗力が高まる。アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合の数は、１から最大、当該オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチド結合の数まで可能である。したがって、本発明で「オリゴヌクレオチドアルキルホスホネート」または「オリゴヌクレオチドアルキルホスホノチオエート」という場合には、このような実施例すべてを含む。好ましい実施例では、本発明に従ったオリゴヌクレオチドの長さは約２ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドにわたり、最も好ましいものの長さは約２５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドである。したがってこれらの実施例では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１〜約５９、または２４〜２９のアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートによるヌクレオチド間結合をそれぞれ有する。本発明のいくつかの実施例では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つ、好ましくは６〜１０の２’−置換リボヌクレオシドを含んでいる。有効な２’−置換としては、２’−Ｏ−メチル、２’−アリル、２ −アリール、２’−アルキル、２’−ハロ、または２’−アミノがあるが、２’−Ｈは入らない。ここでアリル基、アリール基、またはアルキル基は、たとえばハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、カルボキシ基、カルバルコキシ基またはアミノ基で置換されていても置換されていなくともよい。これらの置換は、当業者によく知られている方法で行うことができる（たとえば、グッドチャイルドによるBioconjugate Chem．1巻165〜187頁（1990年）を参照）。特に有用なオリゴヌクレオチドには、６つ以上のリボヌクレオシドまたは２’−置換リボヌクレオシドあるいはその両者があり、デュープレックスの安定性を増強している。本発明のオリゴヌクレオチドアルキルホスホネート類似体は、たとえば、基本的にはアグラワルおよびグッドチャイルドの方法（Tetr．Lett．28巻3539〜3542 頁（1987年））に従って２’−Ｏ−Ｍｅ５’−ＤＭＴリボヌクレオシドの３’ −ホスホンアミダイトを合成することによって作製できる。この手順を図式化したのが図２である。このようにして作製した乾燥ホスホンアミダイトを、ついで自動ＤＮＡ合成装置を使用して必要なオリゴヌクレオチドを作製することができる。カップリングは、適切に保護された２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオシドメチルホスホンアミダイトを希望する位置に用いて行なわれる。こうして合成したオリゴマーを制御細孔（ＣＰＧ）サポートから切り離し、ついでエチレンジアミンを使って保護を外す。本発明の代表的なオリゴヌクレオチド類似体を、ＳＥＱＩＤＮＯ：１−４および７として説明する。本発明のオリゴヌクレオチドメチルホスホノチオエートは、図２ｂに示したアルキルホスホネート合成に用いるのと同じ方法で作製できるが、ただし、酸化剤としてＩ₂／Ｈ₂Ｏ／ＴＨＦ／ルチジンの代わりに３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシドの１％溶液（アイヤーらによるJ．Org．Chem． 55巻4693〜4698頁（1990年））を使用する。こうして作製したオリゴヌクレオチド類似体は、その後に類似体−相補的鎖デュープレックス融解温度を測定して、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡの鎖と安定してハイブリダイズする能力を調べることができる。長さが２５塩基（２５量体）で相補的ＤＮＡ（Ａ）または相補的ＲＮＡ（Ｂ）とデュープレックスを形成する代表的なオリゴヌクレオチドメチルホスホネート類似体の融解曲線を図４に示す。修飾した２５量体（SEQ ID NO:4）４および通常の２５量体（SEQ ID NO:5）で求めた融解温度（Ｔｍ）を表１にまとめて示す。これは、２回の測定の平均値である。この結果から、メチルホスフェート修飾をしてもオリゴヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡの相補的鎖とデュープレックスを形成する能力が損なわれることはなく、またその存在によってデュープレックス形成を不安定にすることもないことがわかる。メチルホスホネート結合がオリゴヌクレオチドに組み込まれ、またこのような修飾が存在してもその後のヌクレオチド鎖の添加および延長の妨げとならないことを確認するために、メチル−ホスホネート結合をそれぞれ１、２、および３個有する代表的なオリゴヌクレオチド類似体１〜３（SEQ ID NO:1-3）を合成し、イオン交換ＨＰＬＣによって調べた。予想どおり、修飾していないｄ（Ａ）₁₁対照はＰａｒｔｉｓｉｌＳＡカラムで３０分の時点で溶出した。オリゴヌクレオチド類似体１〜３（SEQ ID NO:1-3）は、溶媒Ａ（ホルムアミド60％、水40％、1 mMリン酸２水素カリウム、ｐＨ６．３）および溶媒Ｂ（ホルムアミド60％、水40％、300mM リン酸２水素カリウム、ｐＨ６．３）におけるＡの勾配を０〜５０％と変えた場合にそれぞれ２３分、２０分、および１８分で溶出された。オリゴヌクレオチドメチルホスホネート類似体の安定性を、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）またはホスホジエステラーゼＩ（３’−エキソヌクレアーゼ）の存在下で、２５量体（SEQ ID NO:4）を試料として調べた。オリゴヌクレオチドの加水分解により吸光度が増大するのをスペクトロメーターでモニターした。その結果として得られた２５量体類似体（SEQ ID NO:4）および対照２５量体（SEQ ID NO:5）の消化プロフィールを図５に示す。対照２５量体の５０％は、約１００秒で消化された。ただし、修飾２５量体（SEQ ID NO:4）の半減期は同一実験条件下で測定したところ８００〜９００秒であり、修飾したものはヌクレアーゼ作用に対して抵抗性があることがわかった。オリゴヌクレオチドの安定性については、ホスホジエステラーゼＩ存在下でも調べた。ｄ（Ａ）₁₁（SEQ ID NO:6）オリゴヌクレオチドを対照として使用した。その結果を図６に示す。対照（SEQ ID NO:6）は、５分以内に完全にモノヌクレオチドに分解された。メチルホスホネート結合１つを有するオリゴヌクレオチド１（SEQ ID NO:1）は、ｄ（Ａ）₁₁（SEQ ID NO:6）よりもやや安定している。しかし、１０分もするとオリゴヌクレオチド１（SEQ ID NO:6）のほとんどすべてが消化された。メチルホスホネート結合をそれぞれ２および３個有するオリゴヌクレオチド２および３（SEQ ID NO:2および3）の場合、ヌクレオチド６または７で分解は停止した。このことから、ホスホジエステラーゼＩは最初のメチルホスホネートを３’−端から切取るかもしれないが、２番目のメチルホスホネートは切取れないことがわかる。別の側面として、本発明はウイルス、病原菌、または細胞遺伝子の発現を阻止するのに有効であるオリゴヌクレオチド類似体を提供する。このような物質の阻止能は、疾患の様々な段階での治療に重要であることは明らかだ。本発明のこの側面によるオリゴヌクレオチド類似体は、前記のオリゴヌクレオチド類似体の特性を備え、さらにウイルス、病原菌、または細胞遺伝子からの核酸配列に相補的なヌクレオチド配列も有している。このようなオリゴヌクレオチドの長さは約６ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドが好ましい。本発明で「核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列」という場合には、たとえばワトソン−クリック型塩基対（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸の相互作用）や、フーグスティーン型塩基対（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸の相互作用）や、あるいはその他の手段によるなどの生理学的条件下で核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列（２から約５０リボヌクレオチド）のことを言う。生理学的条件下でのこのようなハイブリダイゼーションは、核酸配列の機能が阻止されるのを観察することで、実際に生じていることが確認される。本発明のオリゴリボヌクレオチド類似体が相補的である核酸配列は、阻害しようとする物質または標的となる核酸によって異なる。多くの場合、核酸配列はウイルス核酸配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使って様々なウイルスを阻害することについてはよく知られており、最近ではアグラワルがこれについて総説を発表している（Tibtech 10巻152〜158頁（1992年））。有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的なウイルス核酸配列は多くのウイルスについて開示されており、ヒト免疫不全ウイルス１型（米国特許第４,806,463、この教示を参考のため引用する）、単純疱疹ウイルス（米国特許第４,689,320号、この教示を参考のため引用する）、インフルエンザウイルス（米国特許第5,194,428 号、この教示を参考のため引用する）、およびヒト乳頭腫ウイルス（ストーレイらによるNucleic Acids Res．19巻4109〜4114頁（1991年））など、多くのウイルスについて明らかにされている。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、これらのウイルス核酸配列のいずれかに対して相補的な配列を持つ。対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製できる既知の核酸配列を有するウイルスとしてはこの他に、口蹄疫ウイルス（ロバートソンらによるJ．Virol．54巻651頁（198 5年）；ハリスらによるJ．Virol．36巻659頁（1980年）を参照）、黄熱病ウイルス（ライスらによるScience 229巻726頁（1985年）を参照）、水痘-帯状疱疹ウイルス（ダビソンとスコットによるJ．Gen．Virol．67巻2279頁（1980年）を参照）、およびキュウリモザイクウイルス（リチャーズらによるVirol．89巻395 頁（1978年）を参照）がある。本発明に従ったオリゴヌクレオチドはこの代わりに、病原菌の核酸配列に対して相補的な核酸配列を有することもできる。多くの病原菌の核酸配列がすでに明らかにされており、それらとしてはマラリア菌の熱帯熱マラリア（Plasmodium f alciparum）をはじめとする多くの病原細菌がある。対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製できる既知の核酸配列を有する病原真核生物としては、トリパノソーマブルセイガンビエンス（Trypanosoma brucei gambiense）およびリーシュマニア（Leishmania）（キャンベルらによるNature311巻350頁（1984 年）を参照）、肝蛭（Fasciola hepatica）（ズリタらによるProc．Natl．Acad ．Sci．USA84巻2340頁（1987年）を参照）がある。抗真菌性オリゴヌクレオチドは、たとえばキチンシンセターゼ遺伝子の核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する標的ハイブリダイジング領域を使って作製することができる。同様に、抗細菌性オリゴヌクレオチドは、たとえばアラニンラセマーゼ遺伝子を使って作製することができる。また、本発明に従ったオリゴヌクレオチドはこの代わりに、細胞遺伝子または遺伝子転写、すなわち疾病状態や障害をもたらす異常な発現または産物に対し相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することができる。このような細胞遺伝子のいくつかの核酸配列がすでに明らかにされており、たとえばプリオンタンパク質（シュタールらによるFASEB J ．5巻2799〜2807頁（1991年））、アルツハイマー病のアミロイド様タンパク質（米国特許第5,015,570号、この教示を参考のため引用する）、およびたとえばｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌ、およびｎ−ｒａｓのような様々な既知のオンコジーンおよびプロトオンコジーンがある。さらに、精子形成、精子運動、精子と卵の結合、その他精子の生存に関係するステップに大きく関与するかもしくはそれのみに関与する構造タンパク質または酵素の合成を阻害するオリゴヌクレオチドを、男性用避妊薬として使用することもできる。同様に、排卵、受精、着床、またはこれらの過程に関与するホルモンの生合成に関係するタンパク質または酵素の合成もしくは機能を阻害するオリゴリボヌクレオチドを、女性用避妊薬として使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、高血圧のコントロールにも利用できる。この種の類似体は、アンギオテンシン転換酵素またはレニン／アンギオテンシン系の関連酵素の合成を抑制する。同様に、トロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成を抑制することで血小板凝集をコントロールするという方法を、心筋および脳の循環疾患、梗塞、アテローム性動脈硬化、塞栓および血栓に使用することができる。アテローム性動脈硬化症では、脂肪酸アシル補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼの合成を抑制することで、動脈壁のコレステロール沈着を阻止できる。コリンホスホトランスフェラーゼの合成を阻害することは、低脂血症に有用である。ハイブリダイゼーション阻止を利用して疾患の有害反応を軽減もしくは排除できる神経疾患が多数ある。たとえば、パーキンソン病におけるモノアミンオキシダーゼの合成の抑制、うつ病治療のためのカテコール−ｏ−メチルトランスフェラーゼの抑制、分裂病治療のためのインドールＮ−メチルトランスフェラーゼの抑制といった利用法がある。プロスタグランジンおよびロイコトリエンを導くアラキドン酸カスケードにおける選択された酵素の抑制は、血小板凝集、アレルギー、炎症、疼痛、および喘息のコントロールに有用である。様々な抗癌剤に対する耐性発現をもたらし、化学療法の大きな阻害要因となっている多剤耐性（ｍｄｒ）遺伝子が発現するタンパク質の抑制は、癌治療に益をもたらす。これらの遺伝子のいずれかの核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列は、他の細胞遺伝子または遺伝子転写、すなわち疾病状態または障害をもたらす異常な発現または産物に対して相補的な配列と同様に、本発明に従ったオリゴヌクレオチドに利用できる。植物細胞における遺伝子発現のアンチセンス調節については、米国特許第５，１０７，０６５に開示されており、この教示を参考のため引用する。本発明のもう１つの側面として、前記のオリゴヌクレオチド類似体を利用してウイルス遺伝子、病原菌遺伝子、または細胞遺伝子の遺伝子発現を阻止する方法が提供される。この方法には、前２者の例ではウイルスまたは病原菌に感染した細胞を、また後者の例では一般に細胞を、相補的な核酸の利用可能なコピーでハイブリダイズするのに十分な量の本発明のオリゴリボヌクレオチド類似体を用いて治療することが含まれる。以下に説明するように、培養されている細胞または組織中の細胞に類似体を直接投与して治療を行う。本発明のさらに別の側面として、ウイルス感染、病原菌感染、または異常な遺伝子発現もしくは異常な遺伝子産物の発現が原因で生じる障害または疾患を治療するのに有効な治療用製剤を提供する。この種の治療用製剤には、生理学的に受け入れられる担体中における本発明の第１の側面によるオリゴヌクレオチドを含有する。ここで言う「生理学的に受け入れられる担体」とは、あらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含んでいる。このような媒質および薬剤を薬理学的に活性のある物質として使用することは、現在の技術でよく知られている。従来の媒質または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成中でこれを使用するができる。補助的な活性成分も、組成に入れることができる。これらの製剤を使って、本発明の別の実施例、すなわちウイルスまたは病原菌による感染が原因で、あるいは細胞遺伝子の異常な発現または産物が原因で生じる疾患または障害を持つ哺乳類を治療する方法が実現される。この方法では、標的とする相補的核酸に対してオリゴヌクレオチドを結合できるようにするのに十分な量の本発明の治療用製剤を哺乳類に投与する。このようにすると、オリゴヌクレオチドはウイルス、病原菌、または異常な細胞遺伝子の発現による遺伝子の発現および複製は阻止される。エイズなどのウイルス性疾患の治療におけるオリゴヌクレオチドの有効量および投与経路は、日常的な経験から定めることができる。注射に適している製剤としては、滅菌水溶液または分散剤、および滅菌注射液または分散剤で即時調合する滅菌粉末がある。いかなる場合でも製剤は滅菌状態でなければならない。製造およ貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌および真菌の汚染作用から保護されていなければならない。担体は溶剤でも分散媒でもよい。様々な抗菌剤および抗真菌剤により微生物の作用を予防することができる。吸収を遅らせるような薬剤組成を利用することで、注射用治療薬の吸収時間を長引かせることができる。担体中におけるオリゴヌクレオチドは、静注または腹腔内注、鼻腔内投与、直腸内投与、経口投与、経皮投与または皮下投与など有用な投与経路のいずれでも利用できる。滅菌注射液は、適当な量の溶媒に必要量のオリゴヌクレオチドを入れてから滅菌濾過して調製する。本発明の方法を利用して、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、口腔または陰部疱疹、乳頭腫イボ、インフルエンザ、口蹄疫、黄熱病、水痘、帯状ヘルペス、ＨＴＬＶ−白血病、および肝炎など様々なウイルス性疾患を治療することもできる。この方法で治療可能な真菌疾患としては、カンジダ症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、スポロトリクス症、クロモマイコーシス、皮膚糸状菌症（dermatophytosis）およびコクシジオイデス症がある。この方法は、リケッチア症（たとえばチフス、ロッキー山紅斑熱）、ならびにトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）または性病性リンパ肉芽腫（Lymph ogranuloma venereum）が原因で起こる性的感染症の治療にも利用できる。この方法では様々な寄生虫病も治療でき、たとえばアメーバ症、シャーガス病（Cheg a disease）、トキソプラズマ症、ニューモシスティス症、ランブル鞭毛虫症、クリプトスポリジウム症（cryptosporidiosis）、トリコモナス症、およびニューモシスティスカリニ（Pneumocystis carini）肺炎、また寄生虫病（蠕虫症）、たとえば回虫症、フィラリア症、旋毛虫症、住血吸虫症、線虫感染症、条虫感染症がこれに相当する。マラリアは、熱帯熱マラリア原虫（P．falciparum）、三日熱マラリア原虫（P．vivax）、卵型マラリア原虫（P．orale）、四日熱マラリア原虫（P．maraliae）のいずれによるものであれこの方法で治療できる。上に挙げた感染症は、いずれもその疾患の感染因子がわかっており、したがって当該感染因子の繁殖に欠くことのできない（たとえば必須遺伝子の）核酸配列に対して相補的な核酸配列を有するようなオリゴヌクレオチドを本方法に従って作製できるので治療が可能である。本法により治療可能なその他の疾患または疾病状態は、細胞遺伝子の異常発現または産物が原因のものである。これらの状態はすでに述べたとおりである。以下に挙げる実施例は、本発明の好ましい実現態様を詳しく示したものだが、これに代わる方法を利用して類似の結果を得ることもできるので、本発明の対象範囲を限定するものではない。実施例１．リボヌクレオシドホスホンアミダイトの合成２’−ｏ−メチル５’−ＤＭＴリボヌクレオシドの３’−ホスホンアミダイトを、アグラワルとグッドチャイルドが述べるようにして（アグラワルらによるTe tr．Lett．28巻3539〜3542頁（1987年））合成した。その手順を図２に示す。簡単に言うと、２’−ｏ−メチル５’−ＤＭＴリボヌクレオシド０．０２４ｍｍｏｌに、無水ジクロロメタン５ｍｌに溶解したＨｕｎｉｇの塩基（エチルジイソプロピルアミン）０．０２４ｍｍｏｌを加える。これを氷水浴で１０分間冷却する。メチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト０．４ｍｍｏｌを、２ｍｌのジクロロメタンにゆっくりと加える。溶液の温度を外界温度まで上げてから、室温で３０分間放置する。それから酢酸エチル３０ｍｌを加えて反応を停止する。混合物を飽和炭酸水素ナトリウムおよび塩水溶液で抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させる。こうしてできたホスホンアミダイトを少量の酢酸エチルに溶解した後、酢酸エチル溶液を３０℃で大量のペンタンに加えて沈澱させる。沈澱物を遠心分離で収集し、乾燥する。２．オリゴヌクレオチドの合成乾燥したホスホルアミダイトをＤＮＡ合成グレードのアセトニトリルに溶解して濃度を３０ｍｇ／ｍｌにし、自動ＤＮＡ合成装置にかけて必要なオリゴヌクレオチドを作製する。オリゴヌクレオチドの合成は、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７００自動合成装置で１μＭスケールのＲＮＡ合成周期にてホスホルアミダイト法（アグラワルらによるTetra．Lett．28巻3539〜3542頁（1987 年））を用いて行う。適切に保護した２’ｏ−メチル−リボヌクレオシドメチルホスホンアミダイトを使用し、オリゴヌクレオチド類似体１から４（SE I D NO:1-4）について必要な位置でカップリングを行う。３．脱保護水酸化アンモニウムとエタノールの１：１混合液を使い、室温で１時間かけてオリゴマーをＣＰＧから切り離し、ついで、エチレンジアミンを使い室温で６時間かけて脱保護する。４．精製および定量５’−ＤＭＴ保護オリゴマーを、０．１Ｍ酢酸アンモニウムおよび０．１Ｍ酢酸アンモニウムとアセトニトリルの１：４の混合液を使い、勾配０〜５０％で、逆相（ＲＰ）Ｃ１８ＨＰＬＣカラムを使用した逆相クロマトグラフィーにより精製する。このオリゴマーを８０％酢酸を使い室温で１時間かけて脱トリチル化してから、Ｃ₁₈ Ｓｅｐ−ｐａｃｋカートリッジ（アグラワルらによるTetra．L ett．28巻3539-3542頁（1987年））で脱塩する。そのオリゴマーをさらに２０％ポリアクリルアミド変性ゲルで精製する。再びオリゴマーをＳｅｐ−ｐａｃｋカートリッジで脱塩し、その後の試験に用いる。メチルホスホネート結合がオリゴヌクレオチドに組み込まれていること、またこの修飾の存在がその後のヌクレオチド鎖の追加および延長の妨げとならないことを確認するために、類似体１から３（SEQ ID NO:1-3）をイオン交換ＨＰＬＣで分析した。溶媒Ａ（ホルムアミド６０％、水４０％、１ｍＭリン酸２水素カリウム、ｐＨ６．３）および溶媒Ｂ（ホルムアミド６０％、水４０％、３００ｍＭリン酸２水素カリウム、ｐＨ６．３）によるＡの勾配０〜５０％で使用した。５．ハイブリダイゼーション試験修飾２５量体（SEQ ID NO:4）のハイブリダイゼーション特性について、ＤＮＡおよびＲＮＡ相補的鎖を使った熱融解実験を行って調べた。一般に、修飾オリゴヌクレオチドおよび相補的鎖（１：１）をエッペンドルフ型試験管で乾燥し、１００ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌ（ｐＨ７．４）に溶解した。溶液を８０℃まで５分間加熱してから、ゆっくりと室温まで下げる。ＤｉｇｉｔａｌＤＥＣｓｔａｔｉｏｎ３１６ｓｘコンピューターにインターフェースしたパーキン−エルマー・ラムダ２型紫外線／可視光線スペクトロメーターでＴｍを測定する。こうして得られた、２５量体類似体の補的Ａ（ＤＮＡ）およびＢ（ＲＮＡ）との融解曲線を図４に示す。修飾２５量体（SEQ ID NO:4）および通常の対照２５量体（SEQ ID NO:5）について得られた融解温度（Ｔｍ）値を表Ｉにまとめて示す。これらの値は２回の実験の平均値である。６．ヌクレアーゼにおけるオリゴヌクレオチド類似体の安定性修飾２５量体（SEQ ID NO:4）の安定性を、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）または３’−エキソヌクレアーゼであるホスホジエステラーゼの存在下で調べた。パーキン-エルマー・ラムダ型２紫外線／可視光線スペクトロメーターで、オリゴヌクレオチドの加水分解に起因する吸光度の増大をモニターした。標準的な実験では、修飾オリゴヌクレオチド０．２Ａ₂₆₀単位を０．５ｍｌの１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、３７℃で５分間平衡化した。ＳＶＰＤ１．５×１０^-3単位を添加し、消化率を２６０ｎｍで吸光度を経時的変化を記録して追跡した。こうして得られた消化プロフィールが図５である。オリゴヌクレオチド１から３（SEQ ID NO:1-3）の安定性を対照通常オリゴヌクレオチドｄ（Ａ）₁₁（SEQ ID NO:6）を参照標準として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により３’−ホスホジエステラーゼＩを使って調べた。オリゴリボヌクレオチド（約１００ｎｇ）の５’端を、τ−³²Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使って³²Ｐで標識した（サンブルックら著『分子クローニング：実験室マニュアル、第2版（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）』（1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊））。５’−端標識したオリゴリボヌクレオチド（３μg）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡを含有する３０ μｌ緩衝液中のホスホジエステラーゼＩ（１．５×１０^-4単位）１μｌで処理した。反応混合液から、０分、２分、５分および１０分の間隔で試料４μｌを取り出した。取り出した試料を９０℃で５分間加熱し、２０％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲルで電気泳動して分離した。こうして展開させたオートラジオグラムを図６に示す。修飾２５量体類似体（SEQ ID NO:4）の安定性を、対照２５量体オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:5）を参照標準として、１０％ウシ胎仔血清を含有する細胞培養基中で調べた。オリゴヌクレオチド（約１００ｎｇ）の５’−端を、前段落に述べた方法で³²Ｐで標識した。標識したオリゴヌクレオチド（比活性１０⁶ｄｐｍ／１０ｎｇ）それぞれの約１０ｎｇを、１０％ウシ胎仔血清を含有するＳＭＥＭ細胞培養基（ＧＩＢＣＯ）３００μｌ中で別々にインキュベートした。各時点（０、１、２、および４時間）で、５０μｌを取り出し、１０μｌのプロテイナーゼＫ（proteinase K）で処理し、フェノール−クロロフォルム抽出してから、エタノールで沈澱させた。こうしてできた反応混合液を、８Ｍの尿素を含有する２０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳により分析した。展開させたオートラジオグラムを図７に示す。これらの結果から、対照２５量体は１時間未満という時間で分解するのに対して、修飾２５量体オリゴヌクレオチド類似体は４時間にわたってかなりの量が不変の状態であることがわかる。７．ＨＩＶの阻止オリゴヌクレオチドメチルホスホネートの組織培養におけるＨＩＶ−１阻止能を次のようにして試験する。Ｈ９リンパ球を３７℃で１時間、ＨＩＶ−１ウイルス粒子（＝０．０１−０．１ＴＣＩＤ₅₀／細胞）に感染させる。１時間後に、吸着していないウイルス粒子を洗い流し、感染した細胞を２４ウェル・プレートの各ウェルに分ける。感染細胞に適当な濃度の（原液からの）オリゴヌクレオチド類似体を加えて、２ｍｌの培地で必要な濃度になるようにする。それから細胞を４日間培養する。４日間の培養終了時に、合成物形成、ｐ２４の発現、および逆転写酵素活性によるＨＩＶ−１の発現レベルを測定する。オリゴヌクレオチド類似体で処理した感染細胞におけるｐ２４の発現レベルを、未処理の感染細胞で得られるレベルと比較する。当業者であれば、通常の実験の範囲を超えるものを使用しなくても、ここに述べる特異的物質および手順と均等のものを多数知っているか、あるいは突き止めることができるだろう。このような均等物は、本発明の対象範囲内とみなされ、以下の特許請求の範囲に入る。配列リスト（1）一般情報（i）出願人：ハイブリドン社（ii）発明の名称：オリゴヌクレオチド・アルキルホスホネートおよびアルキルホスホノチオエート（iii）配列の数：７（iv）連絡先住所：（A）住所：アルグレッティアンドウィットコフ社（B）通り：10サウスウォッカードライブ、3000号室（C）市：シカゴ（D）州：イリノイ（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号：60606 （v）電算機読取可能形式：（A）媒体の種類：フロッピー・ディスク（B）コンピュータ：IBM PC 互換機（C）オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：PatentIn リリース＃1.0，バージョン#1.25 （vi）現行出願データ（A）出願番号：ＵＳ／０８／００９，２６２（B）出願日：１９９３年１月２５日（C）分類：（viii）弁理士／代理人に関する情報：（A）氏名：マイケルエスグリーンフィールド（B）登録番号：37,142 （C）参照／書類番号：92,774-A （ix）電話連絡に関する情報：（A）電話番号：312/715-1000 （B）ファックス番号：312/715-1234 （2）SEQ ID NO:1に関する情報（i）配列の特徴：（A）長さ：１１塩基対（B）種類：核酸（C）鎖型：１本鎖（D）位相：線形（ii）分子の種類：ｍＲＮＡ（iii）仮説的：いいえ（iv）アンチセンス：はい（ix）特性（A）名称／キー：（B）場所：（D）その他の情報：／産物＝“塩基６−７間のホスホジエステル結合；Ｕは２−Ｏ− メチル” （xi）配列記述：SEQ IDNO:1: （2）SEQ ID NO:2に関する情報（i）配列の特徴：（A）長さ：１１塩基対（B）種類：核酸（C）鎖型：１本鎖（D）位相：線形（ii）分子の種類：ｍＲＮＡ（iii）仮説的：いいえ（iv）アンチセンス：はい（ix）特性（A）名称／キー：（B）場所：（D）その他の情報：／産物＝“ヌクレオシド３−４、９−１０間のホスホジエステル結合；Ｕは２−Ｏ−メチル” （xi）配列記述：SEQ ID NO:2: （2）SEQ ID NO:3に関する情報（i）配列の特徴：（A）長さ：１１塩基対（B）種類：核酸（C）鎖型：１本鎖（D）位相：線形（ii）分子の種類：ｍＲＮＡ（iii）仮説的：いいえ（iv）アンチセンス：はい（ix）特性（A）名称／キー：（B）場所：（D）その他の情報：／産物＝“ヌクレオシド３−４、６−７、９−１０間のホスホジエステル結合；Ｕは２−Ｏ−メチル” （xi）配列記述：SEQ ID NO:3: （2）SEQ ID NO:4に関する情報（i）配列の特徴：（A）長さ：２５塩基対（B）種類：核酸（C）鎖型：１本鎖（D）位相：線形（ii）分子の種類：ｍＲＮＡ（iii）仮説的：いいえ（iv）アンチセンス：はい（ix）特性（A）名称／キー：（B）場所：（D）その他の情報：／産物＝“ヌクレオシド２１− ２２、２２−２３、２３−２４、および２４−２５間のホスホジエステル結合；塩基２１−２４は２−Ｏ−メチル” （xi）配列記述：SEQ ID No:4: （2）SEQ ID NO:5に関する情報（i）配列の特徴：（A）長さ：２５塩基対（B）種類：核酸（C）鎖型：１本鎖（D）位相：線形（ii）分子の種類：ｍＲＮＡ（iii）仮説的：いいえ（iv）アンチセンス：はい（xi）配列記述：SEQ ID NO:5: （2）SEQ ID NO:6に関する情報（i）配列の特徴：（A）長さ：１１塩基対（B）種類：核酸（C）鎖型：１本鎖（D）位相：線形（ii）分子の種類：ｍＲＮＡ（iii）仮説的：いいえ（iv）アンチセンス：はい（xi）配列記述：SEQ ID NO:6: （2）SEQ ID No:7に関する情報（i）配列の特徴：（A）長さ：８塩基対（B）種類：核酸（C）鎖型：１本鎖（D）位相：線形（ii）分子の種類：ｍＲＮＡ（iii）仮説的：いいえ（iv）アンチセンス：はい（ix）特性（A）名称／キー：（B）場所：（D）その他の情報：／産物＝“ヌクレオシド７−８間のホスホジエステル結合；ＣおよびＵは２−Ｏ−メチル” （xi）配列記述：SEQ ID No:7:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者アグラワル、スディールアメリカ合衆国 01545 マサチューセッツ州シュルーズベリーランプライタードライブ 61

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つのリボヌクレオチドアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートを含くむオリゴヌクレオチド類似体。２．２から６０のヌクレオチドを有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。３．約２５から約３０のヌクレオチドを有する請求項２に記載のオリゴヌクレオチド類似体。４．約２から６０のアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートを有する請求項２に記載のオリゴヌクレオチド類似体。５．約２５から３０のアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートを有する請求項４に記載のオリゴヌクレオチド類似体。６．約７から１０のアルキルホスホノチオエートを有する請求項２に記載のオリゴヌクレオチド類似体。７．少なくとも１つのリボヌクレオチドがリボース基の２’位で、２’−Ｏ− メチル、２’−アリル、２’−アリール、２’−アルキル、２’−ハロ、および２’−アミノからなる群のいずれか１つで置換されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。８．少なくとも１つのヌクレオチドが２’−置換リボヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。９．アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートからなる群から選択される請求項８に記載のオリゴヌクレオチド類似体。１０．２’−置換リボヌクレオチドは、さらに、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシ、トリフルオロメチル、カルバルコキシ、アミノ基からなる群のいずれかを有する２’−アリル、２’− アリールまたは２’−アルキルで置換されている請求項９に記載のオリゴヌクレオチド類似体。１１．ウイルス、病原菌、あるいはその異常な発現が疾病状態をもたらす細胞遺伝子または細胞遺伝子転写物に対して相補的なヌクレオチド配列である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体。１２．（a）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと、（b）生理学的に受け入れられる担体とを含くむ治療用製剤。１３．ウイルス、病原菌、またはその発現が疾病状態を伴うような細胞からの遺伝子発現を阻止する方法であって、（a）請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド類似体を提供し、（b）ウイルス、病原菌または細胞をオリゴヌクレオチド類似体で処理し、そのオリゴヌクレオチド類似体が当該遺伝子から転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズし、それによって遺伝子の発現を阻止する段階を備える遺伝子発現を阻止する方法。１４．ウイルスまたは病原菌に感染したか、あるいは細胞遺伝子の発現の結果として疾患にかかっている哺乳類を治療する方法であって、（a）請求項１２に記載の治療用製剤を提供し、（b）遺伝子の相補的核酸配列にオリゴヌクレオチド類似体がハイブリダイズできるような十分な量の治療用製剤を哺乳類に投与し、それによって当該遺伝子の発現を阻止する段階を備える哺乳類を治療する方法。１５．投与段階（b）は静注または腹腔注、鼻腔内投与、直腸内投与、経口投与、経皮投与、あるいは皮下投与からなる群から選択された経路で治療用製剤を投与することを備える請求項１４項に記載の哺乳類を治療する方法。１６．投与段階（b）がさらに哺乳類に他の治療薬を投与することを備える請求項１４に記載の哺乳類を治療する方法。