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ES2645927T3 - Procedimientos y composiciones para el control de malezas - Google Patents

Procedimientos y composiciones para el control de malezas Download PDF

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ES2645927T3
ES2645927T3 ES12831945.6T ES12831945T ES2645927T3 ES 2645927 T3 ES2645927 T3 ES 2645927T3 ES 12831945 T ES12831945 T ES 12831945T ES 2645927 T3 ES2645927 T3 ES 2645927T3
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Spain
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herbicides
gene
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ES12831945.6T
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English (en)
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John J. Finnessy
Daniel ADER
Zhaolong Li
James D. Masucci
Nengbing Tao
Ronak Hasmukh Shah
Jennifer Chou Taylor
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Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
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Publication date
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Abstract

Un procedimiento de control de plantas que comprende: tratar una planta con una composición mediante aplicación externa de la composición a la planta, en el que la composición comprende un polinucleótido de ARN bicatenario (ARNds) y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleótido de ARNds es idéntico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen de la glutamina sintetasa (GS), en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleótido de al menos 18 nucleótidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de dicha planta para la permeación de dicho polinucleótido de ARNds, y mediante lo cual se suprime o retrasa el crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora, o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composición que comprende dicho polinucleótido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composición.

Description

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DESCRIPCION
Procedimientos y composiciones para el control de malezas Campo
Los procedimientos y composiciones se refieren, en general, al campo de control de malezas. Mas espedficamente, se refieren a genes de glutamina sintetasa (GS) en plantas y composiciones que contienen moleculas de polinucleotido para modular su expresion. Tambien se proporcionan procedimientos y composiciones de utilidad para controlar malezas.
Antecedentes
Las malezas son plantas que compiten con plantas cultivadas en un ambiente agronomico y cuestan a los agricultores billones de dolares anuales en perdidas de cultivos y gasto de esfuerzos para mantener a las malezas bajo control. Las malezas tambien sirven como huespedes para enfermedades en cultivos y plagas de insectos. Las perdidas causadas por las malezas en ambientes de produccion agncola incluyen reducciones en el rendimiento de los cultivos, menor calidad de los cultivos, mayores costos de irrigacion, mayores costos de recoleccion, menor valor de la tierra, lesiones al ganado y danos a los cultivos provenientes de insectos y enfermedades albergadas por las malezas. Los principales medios por los cuales las malezas causan estos efectos son: 1) competencia con plantas de cultivo para agua, nutrientes, luz solar y otros factores esenciales para el crecimiento y el desarrollo, 2) produccion de productos qmmicos toxicos o irritantes que causan problemas de salud en humanos o animales, 3) produccion de inmensas cantidades de semillas o partes reproductivas vegetativas o ambas que contaminan los productos agncolas y perpetuan las especies en tierras agncolas y 4) produccion en tierras agncolas y no agncolas de vastas cantidades de vegetacion que deben ser eliminadas. Las malezas tolerantes a herbicidas son un problema con casi todos los herbicidas en uso, hay una necesidad de controlar efectivamente estas malezas. Hay mas de 365 biotipos de malezas actualmente identificadas como resistentes a uno o varios herbicidas por el Herbicide Resistance Action Committee (HRAC), el North American Herbicide Resistance Action Committee (NAHRAC) y el Weed Science Society of America (WSSA).
La enzima glutamina sintetasa (GS) es una enzima esencial en el metabolismo del nitrogeno al catalizar la condensacion de glutamato y amomaco para formar glutamina. Esta enzima es el blanco de herbicidas de acidos fosfmicos que incluyen glufosinato-amonio y bialafos.
Sumario
En un aspecto, la invencion proporciona un procedimiento de control de plantas que comprende: tratar una planta con una composicion mediante aplicacion externa de la composicion a la planta, en el que la composicion comprende un polinucleotido de ARN bicatenario (ARNds) y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen de la glutamina sintetasa (GS), en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de dicha planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual se suprime o retrasa el crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora de dicha planta, o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende un polinucleotido de ARNds y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS, en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de una planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual dicha planta tratada con dicha composicion tiene un crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimida o retrasada, o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
En un aspecto adicional, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la expresion de un gen GS en una planta que comprende: la aplicacion externa a dicha planta de una composicion que comprende un polinucleotido de ARNds y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS, en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de dicha planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual se reduce dicha expresion de dicho gen GS, con respecto a una planta en la que no se aplico dicha composicion.
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La invencion proporciona tambien un casete de expresion microbiana que comprende un polinucleotido que tiene al menos 18 nucleotidos contiguos, al menos 19 nucleotidos contiguos, al menos 20 nucleotidos contiguos, o al menos 21 nucleotidos contiguos en longitud que son identicos o complementarios a al menos 18 nucleotidos contiguos de una secuencia del gen GS seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21,23, 27-49, y 51-59.
En una realizacion adicional, la invencion proporciona un procedimiento para identificar polinucleotidos de ARNds utiles para modular la expresion del gen Gs cuando se trata externamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleotidos de ARNds que comprende una region identica o complementaria a al menos 18 nucleotidos contiguos de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, y 51-59; b) tratar externamente dicha planta con una composicion que comprende uno o mas de dichos polinucleotidos de ARNds y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta, o un extracto vegetal de la misma para modular la expresion del gen GS, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de dicha planta para la permeacion por uno o mas de dichos polinucleotidos de ARNds, y d) dicha planta tratada con dicha composicion tiene su crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimido o retrasado, o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
La invencion proporciona tambien una composicion que comprende un polinucleotido de ARNds y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen Gs, en el que dicha secuencia genica de GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 2046 -2056 y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de una planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual dicha planta tratada con dicha composicion tiene su crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimido o retrasado o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
Descripcion detallada
Se proporcionan procedimientos y composiciones que contienen un polinucleotido que proporcionan regulacion, represion o retraso de GS (glutamina sintetasa) gene expresion y mejor control de especies de plantas herbaceas y, de modo importante, biotipos de malezas resistentes a inhibidor de Gs. Los aspectos del procedimiento se pueden aplicar para controlar diversas plantas herbaceas en ambientes agronomicos y otros ambientes cultivados.
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invencion y guiar a los expertos en el arte en la practica de la presente invencion. A menos que se note otra cosa, los terminos se han de entender de acuerdo con el uso convencional por los expertos en el arte. Cuando un termino se proporciona en singular, los inventores tambien contemplan aspectos de la invencion descritos por el plural de ese termino.
Por polinucleotidos “no transcribibles” se entiende que los polinucleotidos no comprenden una unidad de transcripcion completa de polimerasa II. Tal como se usa en la presente, “solucion” se refiere a mezclas homogeneas y mezclas no homogeneas tales como suspensiones, coloides, micelas y emulsiones.
Las plantas herbaceas son plantas que compiten con plantas cultivadas, aquellas de particular importancia incluyen, pero sin limitacion, importantes malezas invasivas y nocivas y biotipos resistentes a herbicidas en la produccion de cultivos, tales como, Amaranthus species -A. albus, A. blitoides, A. hybridus, A. palmeri, A. powellii, A. retroflexus, A. spinosus, A. tuberculatus y A. viridis; especies de Ambrosia - A. trifida, A. artemisifolia; especies de Lolium -L. multiflorum, L. rigidium, L perenne; especies de Digitaria -D. insularis; Euphorbia species -E. heterophylla; especies de Kochia - K. scoparia; especies de Sorghum -S. halepense; especies de Conyza -C. bonariensis, C. canadensis, C. sumatrensis; especies de Chloris -C. truncate; especies de Echinochola - E. colona, E. crus-galli; especies de Eleusine -E. indica; especies de Poa -P. annua; especies de Plantago -P. lanceolata; especies de Avena - A. fatua; especies de Chenopodium - C. album; especies de Setaria - S. viridis, Abutilon theophrasti, especies de Ipomoea, especies de Sesbania, especies de Cassia, especies de Sida, especies de Brachiaria y especies de Solanum.
Las especies adicionales de plantas herbaceas halladas en las areas cultivadas incluyen Alopecurus myosuroides, Avena sterilis, Avena sterilis ludoviciana, Brachiaria plantaginea, Bromus diandrus, Bromus rigidus, Cynosurus echinatus, Digitaria ciliaris, Digitaria ischaemum, Digitaria sanguinalis, Echinochloa oryzicola, Echinochloa phyllopogon, Eriochloa punctata, Hordeum glaucum, Hordeum leporinum, Ischaemum rugosum, Leptochloa chinensis, Lolium persicum,, Phalaris minor, Phalaris paradoxa, Rottboellia exalta, Setaria faberi, Setaria viridis var, robusta-alba schreiber, Setaria viridis var, robusta -purpurea, Snowdenia polystachea, Sorghum sudanese, Alisma plantago-aquatica, Amaranthus lividus, Amaranthus quitensis, Ammania auriculata, Ammania coccinea, Anthemis cotula, Apera spica-venti, Bacopa rotundifolia, Bidens pilosa, Bidens subalternans, Brassica tournefortii, Bromus tectorum, Camelina microcarpa, Chrysanthemum coronarium, Cuscuta campestris, Cyperus difformis, Damasonium minus, Descurainia sophia, Diplotaxis tenuifolia, Echium plantagineum, Elatine triandra var, pedicellata, Euphorbia heterophylla, Fallopia convolvulus, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Helianthus annuus, Iva xanthifolia, Ixophorus unisetus, Ipomoea indica, Ipomoea purpurea, Ipomoea sepiaria, Ipomoea aquatic, Ipomoea
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triloba, Lactuca serriola, Limnocharis flava, Limnophila erecta, Limnophila sessiliflora, Lindemia dubia, Lindemia dubia var, major, Lindemia micrantha, Lindemia procumbens, Mesembryanthemum crystallinum, Monochoria korsakowii, Monochoria vaginalis, Neslia paniculata, Papaver rhoeas, Parthenium hysterophorus, Pentzia suffruticosa, Phalaris minor, Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Rapistrum rugosum, Rotala indica var, uliginosa, Sagittaria guyanensis, Sagittaria montevidensis, Sagittaria pygmaea, Salsola iberica, Scirpus juncoides var, ohwianus, Scirpus mucronatus, Setaria lutescens, Sida spinosa, Sinapis arvensis, Sisymbrium orientale, Sisymbrium thellungii, Solanum ptycanthum, Sonchus asper, Sonchus oleraceus, Sorghum bicolor, Stellaria media, Thlaspi arvense, Xanthium strumarium, Arctotheca calendula, Conyza sumatrensis, Crassocephalum crepidiodes, Cuphea carthagenenis, Epilobium adenocaulon, Erigeron philadelphicus, Landoltia punctata, Lepidium virginicum, Monochoria korsakowii, Solanum americanum, Solanum nigrum, Vulpia bromoides, Youngia japonica, Hydrilla verticillata, Carduus nutans, Carduus pycnocephalus, Centaurea solstitialis, Cirsium arvense, Commelina diffusa, Convolvulus arvensis, Daucus carota, Digitaria ischaemum, Echinochloa crus-pavonis, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Limnophila erecta, Matricaria perforate, Papaver rhoeas, Ranunculus acris, Soliva sessilis, Sphenoclea zeylanica, Stellaria media, Nassella trichotoma, Stipa neesiana, Agrostis stolonifera, Polygonum aviculare, Alopecurus japonicus, Beckmannia syzigachne, Bromus tectorum, Chloris inflate, Echinochloa erecta, Portulaca oleracea y Senecio vulgaris. Se cree que todas las plantas contienen un gen de glutamina sintetasa (GS) en su genoma, cuya secuencia se puede aislar y polinucleotidos hechos de acuerdo con los procedimientos de la presente invencion que son de utilidad para la regulacion, supresion o retraso de la expresion de el blanco GS gene en las plantas y el crecimiento o el desarrollo de las plantas tratadas.
Algunas plantas cultivadas tambien pueden ser plantas herbaceas que proliferan en ambientes no deseados. Por ejemplo, las plantas de mafz que crecen en un campo de soja. Los cultivos transgenicos con una o varias tolerancias a herbicidas necesitaran procedimientos de manejo especializados para controlar malezas y plantas de cultivo voluntarias. La presente invencion permite controlar el transgen para tolerancia a herbicidas para permitir que las plantas tratadas se vuelvan sensibles a los herbicidas. Por ejemplo, las secuencias transgenicas de ADN GS en eventos transgenicos que incluyen, pero sin limitacion, Dp-o04114-3, DAS-44406-6, DAS-68416-4, T304- 40XGHB119, LLRICE601, TC-6275, LLCotton25, MS1 & RF1/RF2, Topas 19/2, Line 1507, MS6, GU262, A5547- 127, T-120-7, W62, W98, A2704- 12, A2704-21, A5547-35 y B16.
Un “disparador” o “polinucleotido disparador” de la presente invencion es una molecula de polinucleotido que es homologa o complementaria a un gen de polinucleotido blanco. Las moleculas de polinucleotido disparadoras modulan la expresion del gen blanco cuando se aplican topicamente a la superficie de una planta con un agente de transferencia, en donde una planta tratada con dicha composicion tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicho polinucleotido que contiene la composicion respecto a una planta no tratada con una composicion que contiene la molecula disparadora. Los polinucleotidos disparadores revelados en la presente se describen en general en relacion con la secuencia genica blanco y se pueden usar en orientacion con sentido (homologo) o antisentido (complementario) como moleculas monocatenarias o comprenden ambas cadenas como moleculas bicatenarias o variantes de nucleotidos y sus nucleotidos modificados segun las diversas regiones de un gen blanco.
Se contempla que la composicion de la presente invencion contenga multiples polinucleotidos y herbicidas que incluyen, pero sin limitacion, GS gene polinucleotidos disparadores y un herbicida inhibidor de GS y cualquiera o varios genes de herbicida adicional de polinucleotidos disparadores blanco y los herbicidas relacionados y cualquiera o varios polinucleotidos disparadores genicos esenciales adicionales. Los genes esenciales son genes en una planta que proporcionan enzimas clave u otras protemas, por ejemplo, una enzima biosintetica, enzima metabolizante, receptor, protema de transduccion de senales, producto genico estructural, factor de transcripcion o supervivencia del organismo o celula o incluida en el crecimiento normal y el desarrollo de la planta (Meinke, et al., Trends Plant Sci. 2008 Sep;13(9):483-91). La supresion de un gen esencial mejora el efecto de un herbicida que afecta la funcion de un producto genico diferente del gen esencial suprimid. Las composiciones de la presente invencion pueden incluir diversos polinucleotidos disparadores que modulan la expresion de un gen esencial distinto de un gen GS.
Los herbicidas para los que se han demostrado transgenes para la tolerancia de plantas y se puede aplicar el procedimiento de la presente invencion, incluyen, pero sin limitacion: herbicidas de tipo auxina, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, delapon, dicamba, ciclohezandiona, inhibidores de protoporfirinogeno oxidasa, herbicidas inhibidores de 4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa. Por ejemplo, transgenes y sus moleculas de polinucleotido que codifican protemas incluidas en tolerancia a herbicida se conocen en el arte e incluyen, pero sin limitacion, una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), por ejemplo, como se describe mas completamente en las patentes U. S. Nros. 7.807.791 (SEQ ID NO:5); 6.248.876 B1; 5.627.061; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.3372.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.3370.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; patente U. S. N.° Re. 36.449; pat. U. S. Nros. RE 37.287 E; y 5.491.288; tolerancia a sulfonilurea y/o imidazolinona, por ejemplo, tal como se describe mas exhaustivamente en las patentes U. S. Nros. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.7337.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.3337.107; 5.928.937; y 5.378.824; y la publicacion internacional WO 96/33270; tolerancia a herbicidas que inhiben las hidroxifenilpiruvatodioxigenasas en plantas se describen en las patentes U. S. Nros. 6.245.968 B1; 6.268.549; y 6.069.115; publicacion de patentes US 20110191897 y US 7.3372.379 SEQ ID NO:3; US 7.935.869; US 7.304.209, SEQ ID nO:1, 3,5 y 15; polinucleotidos de ariloxialcanoato dioxigenasa, que confieren tolerancia a 2,4-D y otros
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herbicidas de fenoxiauxina asf como a herbicidas de ariloxifenoxipropionato tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2005/107437; US 7.838.733 SEQ ID NO:5;) y polinucleotidos de tolerancia a dicamba tal como se describe, por ejemplo, en Herman et al. (2005) J. Biol. Chem. 280: 24759-24767. Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos por polinucleotidos que codifican una fosfinotricina acetiltransferasa exogena, tal como se describe en las patentes U. S. Nros. 5.969.213; 5.489.520; 5.550.3378; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616; y 5.879.903. Las plantas que contienen una fosfinotricina acetiltransferasa exogena pueden exhibir una mejor tolerancia a herbicidas de glufosinato, que inhiben la enzima glutamina sintetasa. Adicionalmente, los polinucleotidos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos por polinucleotidos que confieren una actividad alterada de protoporfirinogeno oxidasa (protox), tal como se describe en las patentes U. S. Nros. 6.288.306 B1; 6.282.837 B1; y 5.767.373; y WO 01/12825. Las plantas que contienen tales polinucleotidos pueden exhibir mejor tolerancia a cualquiera de una variedad de herbicidas que se dirigen a la enzima protox (tambien mencionado como inhibidores protox). Los polinucleotidos que codifican una glifosato oxidorreductasa y una glifosato-N-acetiltransferasa (GOX descrito en la patente U. S. 5.463.175 y GAT descrito en la publicacion de patente U. S. 20030083480, dicamba monooxigenasa publicacion de patente U. S. 20030135879, todos los cuales se incorporan en la presente por referencia); una molecula de polinucleotido que codifica la bromoxinilo nitrilasa (Bxn descrito en la patente U. S. N.° 4.810.648 para la tolerancia a bromoxinilo, que se incorpora en la presente por referencia); una molecula de polinucleotido que codifica fitoeno desaturasa (crtI) descrita en Misawa et al, (1993) Plant J. 4:833-840 y Misawa et al, (1994) Plant J. 6:481-489 para la tolerancia a norflurazona; una molecula de polinucleotido que codifica acetohidroxiacido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3378-2193 para la tolerancia a herbicidas de sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock, et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2519 para la tolerancia a glufosinato y bialafos. Las regiones codificantes transgenicas y elementos de regulacion de los genes de tolerancia a herbicidas son blancos en los que polinucleotidos disparadores y herbicidas se pueden incluir en la composicion de la presente invencion.
Las composiciones incluyen un componente que es un herbicida inhibidor de GS, que incluyen miembros del grupo de herbicidas de acidos fosfmicos tales como glufosinato-amonio y bialafos.
Numerosos herbicidas con similares o diferentes modos de accion (en la presente, mencionados como coherbicidas) estan a disposicion, que se pueden anadir a la composicion de la presente invencion, por ejemplo, miembros de las familias de herbicidas que incluyen, pero sin limitacion, herbicidas de amida, herbicidas de acidos aromaticos, herbicidas de arsenico, herbicidas de benzotiazol, herbicidas de benzoilciclohexandiona, herbicidas de benzofuranilalquilsulfonato, herbicidas de carbamato, herbicidas de ciclohexenoxima, herbicidas de ciclopropilisoxazol, herbicidas de dicarboximida, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de dinitrofenol, herbicidas de eter difemlico, herbicidas de ditiocarbamato, herbicidas alifaticos halogenados, herbicidas de imidazolinona, herbicidas inorganicos, herbicidas de nitrilo, herbicidas de organofosforo, herbicidas de oxadiazolona, herbicidas de oxazol, herbicidas de fenoxi, herbicidas de fenilendiamina, herbicidas de pirazol, herbicidas de piridazina, herbicidas de piridazinona, herbicidas de piridina, herbicidas de pirimidindiamina, herbicidas de pirimidiniloxibencilamina, herbicidas de amonio cuaternario, herbicidas de tiocarbamato, herbicidas de tiocarbonato, herbicidas de tiourea, herbicidas de triazina, herbicidas de triazinona, herbicidas de triazol, herbicidas de triazolona, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de uracilo y herbicidas de urea. En particular, las tasas de uso de los herbicidas anadidos se pueden reducir en composiciones que comprenden los polinucleotidos de la invencion. El uso de reducciones en las tasas de los herbicidas anadidos adicionales puede ser del 10-25%, 26-50%, 51-75% o que mejoran la actividad de los polinucleotidos y la composicion herbicida y esta contemplado como un aspecto de la invencion. Los coherbicidas representativos de las familias incluyen, pero sin limitacion, acetoclor, acifluorfeno, acifluorfeno-sodio, aclonifeno, acrolema, alaclor, aloxidim, alcohol alflico, ametrina, amicarbazona, amidosulfurona, aminopiralida, amitrol, sulfamato de amonio, anilofos, asulam, atraton, atrazina, azimsulfurona, BCPC, beflubutamida, benazolina, benfluralina, benfuresato, bensulfurona, bensulfurona-metilo, bensulide, bentazona, benzfendizona, benzobiciclona, benzofenap, bifenox, bilanafos, bispiribac, bispiribac-sodio, borax, bromacilo, bromobutide, bromoxinilo, butaclor, butafenacilo, butamifos, butralina, butroxidim, butilato, acido cacodflico, clorato de calcio, cafenstrol, carbetamida, carfentrazona, carfentrazona-etilo, CDEA, CEPC, clorflurenol, clorflurenol-metilo, cloridazona, clorimurona, clorimurona-etilo, acido cloroacetico, clorotolurona, clorprofam, clorsulfurona, clortal, clortal-dimetilo, cinidona-etilo, cinmetilina, cinosulfurona, cisanilida, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargilo, clomazona, clomeprop, clopiralida, cloransulam, cloransulam-metilo, CMA, 4-CPB, CPMF, 4-CPP, CPPC, cresol, cumilurona, cianamida, cianazina, cicloato, ciclosulfamurona, cicloxidim, cihalofop, cihalofop-butilo, 2,4-D, 3,4-DA, daimurona, dalapona, dazomet, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4-DEB, desmedifam, dicamba, diclobenilo, orto-diclorobenceno, para-diclorobenceno, diclorprop, diclorprop-P, diclofop, diclofop-metilo, diclosulam, difenzoquat, metilsulfato de difenzoquat, diflufenicano, diflufenzopir, dimefurona, dimepiperato, dimetaclor, dimetametrina, dimetenamida, dimetenamida-P, dimetipina, acido dimetilarsmico, dinitramina, dinoterb, difenamida, diquat, dibromuro de diquat, ditiopir, diurona, DNoC, 3,4-DP, DSMA, EBEP, endotal, EPTC, esprocarb, etalfluralina, etametsulfurona, etametsulfurona-metilo, etofumesato, etoxifeno, etoxisulfurona, etobenzanida, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etilo, fentrazamida, sulfato ferroso, flamprop-M, flazasulfurona, florasulam, fluazifop, fluazifop-butilo, fluazifop-P, fluazifop-P-butilo, flucarbazona, flucarbazona-sodio, flucetosulfurona, flucloralina, flufenacet, flufenpir, flufenpir- etilo, flumetsulam, flumiclorac, flumiclorac-pentilo, flumioxazina, fluometurona, fluoroglicofeno, fluoroglicofeno-etilo, flupropanato, flupirsulfurona, flupirsulfurona-metilo-sodio, flurenol, fluridona, fluorocloridona, fluoroxipir, flurtamona, flutiacet, flutiacet-metilo, fomesafeno, foramsulfurona, fosamina, glufosinato, glufosinato-amonio, glifosato, halosulfurona, halosulfurona-metilo, haloxifop, haloxifop-P, HC-252, hexazinona, imazametabenz, imazametabenz-
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metilo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquina, imazetapir, imazosulfurona, indanofano, yodometano, yodosulfurona, yodosulfurona-metil-sodio, ioxinilo, isoproturona, isourona, isoxabeno, isoxaclortol, isoxaflutol, karbutilato, lactofeno, lenacilo, linurona, MAA, MAMA, MCPA, MCPA-tioetilo, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, mefenacet, mefluidide, mesosulfurona, mesosulfurona-metilo, mesotriona, metam, metamifop, metamitrona, metazaclor, methabenztiazurona, acido metilarsonico, metildimrona, isotiocianato de metilo, metobenzurona, metolaclor, S-metolaclor, metosulam, metoxurona, metribuzina, metsulfurona, metsulfurona-metilo, MK-66, molinato, monolinurona, MSMA, naproanilida, napropamida, naptalam, neburona, nicosulfurona, acido nonanoico, norflurazona, acido oleico (acidos grasos), orbencarb, ortosulfamurona, orizalina, oxadiargilo, oxadiazona, oxasulfurona, oxaziclomefona, oxifluorfeno, paraquat, dicloruro de paraquat, pebulato, pendimetalina, penoxsulam, pentaclorofenol, pentanoclor, pentoxazona, petoxamida, aceites de petroleo, fenmedifam, fenmedifam-etilo, picloram, picolinafeno, pinoxadeno, piperofos, arsenito de potasio, azida de potasio, pretilaclor, primisulfurona, primisulfurona-metilo, prodiamina, profluazol, profoxidim, prometona, prometrina, propaclor, propanilo, propaquizafop, propazina, profam, propisoclor, propoxicarbazona, propoxicarbazona-sodio, propizamida, prosulfocarb, prosulfurona, piraclonilo, piraflufeno, piraflufeno-etilo, pirazolinato, pirazosulfurona, pirazosulfurona- etilo, pirazoxifeno, piribenzoxim, piributicarb, piridafol, piridato, piriftalida, piriminobac, piriminobac-metilo, pirimisulfano, piritiobac, piritiobac-sodio, quinclorac, quinmerac, quinoclamina, quizalofop, quizalofop-P, rimsulfurona, setoxidim, sidurona, simazina, simetrina, SMA, arsenito de sodio, azida de sodio, clorato de sodio,
sulcotriona, sulfentrazona, sulfometurona, sulfometurona-metilo, sulfosato, sulfosulfurona, acido sulfurico, aceites de
alquitran, 2,3,6-TBA, TCA, TCA-sodio, tebutiurona, tepraloxidim, terbacilo, terbumetona, terbutilazina, terbutrina, tenilclor, tiazopir, tifensulfurona, tifensulfurona-metilo, tiobencarb, tiocarbazilo, topramezona, tralkoxidim, tri-alato, triasulfurona, triaziflam, tribenuron, tribenurona-metilo, tricamba, triclopir, trietazina, trifloxisulfurona, trifloxisulfurona- sodio, trifluralina, triflusulfurona, triflusulfurona-metilo, trihidroxitriazina, tritosulfurona, ester etflico del acido [3-[2- cloro-4-fluoro-5-(-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-,2,3,4-tetrahidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetico (CAS RN 353292-3-6), acido 4-[(4,5-dihidro-3-metoxi-4-metil-5-oxo)-H-,2,4-triazol—ilcarbonil-sulfamoil]-5-
metiltiofen-3-carboxflico (BAY636), BAY747 (CAS RN 33504-84-2), topramezona (CAS RN 2063-68-8), 4-
hidroxi-3-[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluoro-metil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona (CAS RN 35200-68-5) y 4-hidroxi-3-[[2-(3-metoxipropil)-6-(difluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona. Adicionalmente, que incluyen compuestos herbicidas de modos de accion inespedfico tal como se describe en CN101279950A, CN101279951A, DE10000600A1, DE10116399A1, DE102004054666A1, DE102005014638A1, DE102005014906A1, DE102007012168A1, DE102010042866A1, DE10204951A1, DE10234875A1,
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WO2002044173A2,
W02003020704A1,
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WO2010112826A3,
WO2011035874A1,
WO2011065451A1, todos los cuales se incorporan en la presente por referencia.
Un campo agronomico que requiere de control de plantas se trata por aplicacion de la composicion directamente a la superficie de las plantas en proliferacion, como por pulverizacion. Por ejemplo, el procedimiento se aplica para controlar las malezas en un campo de plantas de cultivo por pulverizacion del campo con la composicion. La composicion se puede proporcionar como una mezcla en tanque, un tratamiento secuencial de componentes (en
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general, el polinucleotido que contiene la composicion seguido del herbicida) o un tratamiento simultaneo o mezcla de uno o varios de los componentes de la composicion de recipientes separados. El tratamiento del campo se puede producir cuando se requiera para proporcionar control de malezas y los componentes de la composicion se pueden ajustar para dirigirse a especies de malezas o familias de malezas espedficas a traves de la utilizacion de polinucleotidos espedficos o composiciones de polinucleotido capaces de dirigirse selectivamente especies espedficas o familia de plantas por controlar. La composicion se puede aplicar en tasas de uso efectivas de acuerdo con el momento de aplicacion en el campo, por ejemplo, preplantado, en el plantado, despues del plantado, despues de la cosecha. Los herbicidas inhibidores de GS se pueden aplicar a un campo en tasas de 100 a 500 g ai/ha (ingrediente activo por hectarea) o mas. Los polinucleotidos de la composicion se pueden aplicar en tasas de 1 a 30 gramos por acre segun la cantidad de moleculas disparadoras necesarias para el alcance de las malezas en el campo.
Las plantas de cultivo en las que se necesita un control de malezas incluyen, pero sin limitacion, i) mafz, soja, algodon, canola, remolacha, alfalfa, cana de azucar, arroz y trigo; ii) plantas vegetales que incluyen, sin limitacion, tomate, pimiento morron, pimiento picante, melon, sandfa, pepino, berenjena, coliflor, brocoli, lechuga, espinaca, cebolla, judfas, zanahorias, mafz dulce, repollo chino, puerro, hinojo, calabaza o zapallo, rabano, repollos de Bruselas, tomatillo, alubias, frijoles secos o quimbombo; iii) plantas culinarias que incluyen, pero sin limitacion, albahaca, perejil, cafe o te; o, iv) plantas frutales que incluyen, pero sin limitacion, manzana, pera, cereza, durazno, ciruela, damasco, banana, platano, uva de mesa, uva, dtricos, aguacate, mango o bayas; v) un arbol crecido para uso ornamental o comercial, que incluyen, pero sin limitacion, un arbol frutal o nogal; o vi) una planta ornamental (por ejemplo, una planta de flor ornamental o arbusto o cesped). Los procedimientos y composiciones proporcionados en la presente tambien se pueden aplicar a plantas producidas por un procedimiento de corte, clonacion o injerto (es decir, una planta no crecida de una semilla) incluyen arboles frutales y plantas que incluyen, sin limitacion, citrus, manzanas, aguacates, tomates, berenjena, pepino, melones, sandfas y uvas, asf como diversas plantas ornamentales.
Mezclas pesticidas
Las composiciones de polinucleotido tambien se pueden usar como mezclas con diversos qmmicos agncolas y/o insecticidas, miticidas y fungicidas, agentes pesticidas y agentes bioplaguicidas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, azinfos-metilo, acefato, isoxationa, isofenfos, etiona, etrinfos, oxidemetona-metilo, oxideprofos, quinalfos, clorpirifos, clorpirifos-metilo, clorfenvinfos, cianofos, dioxabenzofos, diclorvos, disulfotona, dimetilvinfos, dimetoato, sulprofos, diazinona, tiometona, tetraclorvinfos, temefos, tebupirinfos, terbufos, naled, vamidotiona, piraclofos, piridafentiona, pirimifos-metilo, fenitrotiona, fentiona, fentoato, flupirazofos, protiofos, propafos, profenofos, foxima, fosalona, fosmet, formotiona, forato, malationa, mecarbam, mesulfenfos, metamidofos, metidationa, parationa, metilparationa, monocrotofos, triclorfona, EPN, isazofos, isamidofos, cadusafos, diamidafos, diclofentiona, tionazina, fenamifos, fostiazato, fostietano, fosfocarb, DSP, etoprofos, alanicarb, aldicarb, isoprocarb, etiofencarb, carbarilo, carbosulfano, xililcarb, tiodicarb, pirimicarb, fenobucarb, furatiocarb, propoxur, bendiocarb, benfuracarb, metomilol, metolcarb, XMC, carbofurano, aldoxicarb, oxamilo, acrinatrina, aletrina, esfenvalerato, empentrina, cicloprotrina, cihalotrina, gamma-cihalotrina, lambda-cihalotrina, ciflutrina, beta-ciflutrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, zeta- cipermetrina, silafluofeno, tetrametrina, teflutrina, deltametrina, tralometrina, bifentrina, fenotrina, fenvalerato, fenpropatrina, furametrina, praletrina, flucitrinato, fluvalinato, flubrocitrinato, permetrina, resmetrina, etofenprox, cartap, tiociclam, bensultap, acetamiprid, imidacloprid, clotianidina, dinotefurano, tiacloprid, tiametoxam, nitenpiram, clorfluazurona, diflubenzurona, teflubenzurona, triflumurona, novalurona, noviflumurona, bistrifluorona, fluazurona, flucicloxurona, flufenoxurona, hexaflumurona, lufenurona, cromafenozida, tebufenozida, halofenozida, metoxifenozida, diofenolano, ciromazina, piriproxifeno, buprofezina, metopreno, hidropreno, quinopreno, triazamato, endosulfano, clorfensona, clorobencilato, dicofol, bromopropilato, acetoprol, fipronilo, etiprol, piretrina, rotenona, sulfato de nicotina, agente BT (Bacillus thuringiensis), espinosad, abamectina, acequinocilo, amidoflumet, amitraz, etoxazol, quinometionato, clofentezina, oxido de fenbutatina, dienoclor, cihexatina, espirodiclofeno, espiromesifeno, tetradifona, tebufenpirad, binapacrilo, bifenazato, piridabeno, pirimidifeno, fenazaquina, fenotiocarb, fenpiroximato, fluacripirim, fluazinam, flufenzina, hexitiazox, propargita, benzomato, complejo de polinactina, milbemectina,
lufenurona, mecarbam, metiocarb, mevinfos, halfenprox, azadiractina, diafentiurona, indoxacarb, benzoato de
emamectina, oleato de potasio, oleato de sodio, clorfenapir, tolfenpirad, pimetrozina, fenoxicarb, hidrametilnona,
almidon de hidroxipropilo, piridalilo, flufenerim, flubendiamida, flonicamida, metaflumizol, lepimectina, TPIC, albendazol, oxibendazol, oxfendazol, triclamida, fensulfotiona, fenbendazol, clorhidrato de levamisol, tartrato de morantel, dazomet, metam-sodio, triadimefona, hexaconazol, propiconazol, ipconazol, procloraz, triflumizol, tebuconazol, epoxiconazol, difenoconazol, flusilazol, triadimenol, ciproconazol, metconazol, fluquinconazol, bitertanol, tetraconazol, triticonazol, flutriafol, penconazol, diniconazol, fenbuconazol, bromuconazol, imibenconazol, simeconazol, miclobutanilo, himexazol, imazalilo, furametpir, tifluzamida, etridiazol, oxpoconazol, fumarato de oxpoconazol, pefurazoato, protioconazol, pirifenox, fenarimol, nuarimol, bupirimato, mepanipirim, ciprodinilo, pirimetanilo, metalaxilo, mefenoxam, oxadixilo, benalaxilo, tiofanato, tiofanato-metilo, benomilo, carbendazim, fuberidazol, tiabendazol, manzeb, propineb, zineb, metiram, maneb, ziram, tiuram, clorotalonilo, etaboxam,
oxicarboxina, carboxina, flutolanilo, siltiofam, mepronilo, dimetomorf, fenpropidina, fenpropimorf, espiroxamina, tridemorf, dodemorf, flumorf, azoxistrobina, cresoxim-metilo, metominostrobina, orisastrobina, fluoxastrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, iprodiona, procimidona, vinclozolina, clozolinato, flusulfamida, dazomet, isotiocianato de metilo, cloropicrina, metasulfocarb, hidroxiisoxazol, hidroxiisoxazol de
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potasio, ecomezol, D-D, carbarn, cloruro de cobre basico, sulfato de cobre basico, nonilfenolsulfonato de cobre, oxina cobre, DBEDC, sulfato de cobre anhidro, sulfato de cobre pentahidrato, hidroxido cuprico, azufre inorganico, azufre humectable, azufre de cal, sulfato de zinc, fentina, hidrogeno-carbonato de sodio, hidrogeno-carbonato de potasio, hipoclorito de sodio, plata, edifenfos, tolclofos-metilo, fosetilo, iprobenfos, dinocap, pirazofos, carpropamida, ftalida, triciclazol, piroquilona, diclocimet, fenoxanilo, casugamicina, validamicina, polioxinas, blasticideno S, oxitetraciclina, mildiomicina, estreptomicina, aceite de colza, aceite de maquina, bentiavalicarbisopropilo, iprovalicarb, propamocarb, dietofencarb, fluoroimida, fludioxanilo, fenpiclonilo, quinoxifeno, acido oxolmico, clorotalonilo, captano, folpet, probenazol, acibenzolar-S-metilo, tiadinilo, ciflufenamida, fenhexamida, diflumetorim, metrafenona, picobenzamida, proquinazida, famoxadona, ciazofamida, fenamidona, zoxamida, boscalida, cimoxanilo, ditianona, fluazinam, diclofluanida, triforina, isoprotiolano, ferimzona, diclomezina, tecloftalam, pencicurona, quinometionato, acetato de iminoctadina, albesilato de iminoctadina, ambam, policarbamato, tiadiazina, cloroneb, dimetilditiocarbamato de rnquel, guazatina, acetato de dodecilguanidina, quintoceno, tolilfluanida, anilazina, nitrotalisopropilo, fenitropano, dimetirimol, bentiazol, proterna harpina, flumetover, mandipropamida y pentiopirad.
Polinucleotidos
Tal como se usa en la presente, la expresion “ADN”, “molecula de ADN”, “molecula de polinucleotido de ADN” se refiere a una molecula de ADN monocatenaria (ssADN) o ADN bicatenaria (dsADN) de origen genomico o sintetico, tales como un polfmero de bases de desoxirribonucleotido o una molecula de polinucleotido de ADN. Tal como se usa en la presente, la expresion “secuencia de ADN”, “secuencia de nucleotido de ADN” o “secuencia de polinucleotido de ADN” se refiere a la secuencia de nucleotidos de una molecula de ADN. Tal como se usa en la presente, la expresion “ARN”, “molecula de ARN”, “molecula de polinucleotido de ARN” se refiere a una molecula de ARN monocaternaria (ssARN) o una molecula de ARN bicatenaria (dsARN) de origen genomico o sintetico, tales como un polfmero de bases de ribonucleotido que comprenden regiones monocatenarias o bicatenarias. A menos que se establezca otra cosa, las secuencias de nucleotidos en el texto de esta memoria descriptiva se brindan cuando se lee de izquierda a derecha en la direccion 5' a 3'. La nomenclatura usada en la presente es aquella requerida por el tttulo 37 del Codigo de los Estados Unidos de Regulaciones Federales § 1.822 y establecida en las tablas en WIPO Standard ST.25 (1998), Apendice 2, Tablas 1 y 3.
Tal como se usa en la presente, “polinucleotido” se refiere a una molecula de ADN o ARN que contiene multiples nucleotidos y en general se refiere tanto a “oligonucleotidos” (una molecula de polinucleotido de tfpicamente 50 o menos nucleotidos de longitud) como a polinucleotidos de 51 o mas nucleotidos. Las formas de realizacion de esta invencion incluyen composiciones que incluyen oligonucleotidos que tienen una longitud de 18-25 nucleotidos (18- meros, 19-meros, 20-meros, 21-meros, 22-meros, 23-meros, 24-meros o 25-meros), por ejemplo, oligonucleotidos (SEQ ID NO:1444-2045) o sus fragmentos o polinucleotidos de longitud media que tienen una longitud de 26 o mas nucleotidos (polinucleotidos de 26, 27, 28, 29, 30, 337, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180,
aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270,
aproximadamente 280, aproximadamente 290 o aproximadamente 300 nucleotidos), por ejemplo, oligonucleotidos (SEQ ID NO: 60-1443) o sus fragmentos o polinucleotidos largos que tienen una longitud mas largo de aproximadamente 300 nucleotidos (por ejemplo, polinucleotidos de entre aproximadamente 300 y aproximadamente 400 nucleotidos, entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 nucleotidos, entre aproximadamente 500 y aproximadamente 600 nucleotidos, entre aproximadamente 600 y aproximadamente 700 nucleotidos, entre aproximadamente 700 y aproximadamente 800 nucleotidos, entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 nucleotidos, entre aproximadamente 900 y aproximadamente 1000 nucleotidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 500 nucleotidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 600 nucleotidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 700 nucleotidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 800 nucleotidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 900 nucleotidos o aproximadamente 1000 nucleotidos de longitud o incluso mas de aproximadamente 1000 nucleotidos de longitud, por ejemplo, hasta la longitud entera de un gen blanco que incluye las porciones codificantes o no codificantes o ambas del gen blanco), por ejemplo, polinucleotidos de la Tabla 1 (SEQ ID NO:1-59), en donde los polinucleotidos seleccionados o sus fragmentos homologos o complementarios a la SEQ ID NO:1-59 suprime, reprime o demora de otro modo la expresion del gen blanco de GS. Un gen blanco comprende cualquier molecula de polinucleotido en una celula de planta o su fragmento para los que la modulacion de la expresion del gen blanco es proporcionada por los procedimientos y composiciones de la presente invencion. Cuando un polinucleotido es bicatenario, su longitud puede describirse de forma similar en terminos de pares de bases. Los oligonucleotidos y polinucleotidos de la presente invencion se pueden preparar, que son esencialmente identicos o esencialmente complementarios a los elementos geneticos adyacentes de un gen, por ejemplo, que abarca la region de union de un intron y exon, la region de union de un promotor y una region transcripta, la region de union de una secuencia lfder 5' y una secuencia codificante, la union de una region no traducida 3' y una secuencia codificante.
Las composiciones de polinucleotido usadas en las diversas formas de realizacion de la presente invencion incluyen composiciones que incluyen oligonucleotidos o polinucleotidos o una mezcla de ambos, incluyendo ARNds.
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En algunas formas de realizacion, el polinucleotido incluye nucleotidos no canonicos tales como inosina, tiouridina o pseudouridina. En algunas formas de realizacion, el polinucleotido incluye nucleotidos qmmicamente modificados. Los ejemplos de oligonucleotidos o polinucleotidos qmmicamente modificados son bien conocidos en el arte; ver, por ejemplo, la publicacion de patente U. S. 20110171287, la publicacion de patente U. S. 20110171176 y la publicacion de patente U. S. 20110152353, la publicacion de patente U. S. 20110152346, publicacion de patente U. S. 20110160082, incorporadas en la presente por referencia. Por ejemplo, incluyen, pero sin limitacion, la estructura de fosfodiester natural de un oligonucleotido o polinucleotido puede estar parcial o completamente modificado con modificaciones de ligacion de internucleotido de fosforotioato, fosforoditioato o metilfosfonato, se pueden usar bases de nucleosidos modificados o azucares modificados en la smtesis de oligonucleotidos o polinucleotidos y oligonucleotidos o polinucleotidos se pueden rotular con un resto fluorescente (por ejemplo, fluorescema o rodamina) u otro rotulo (por ejemplo, biotina).
Los polinucleotidos son ARN bicatenario. En algunas formas de realizacion, estos polinucleotidos incluyen nucleotidos o nucleotidos no canonicos qmmicamente modificados. En algunas formas de realizacion, los oligonucleotidos pueden tener extremos romos o pueden comprender una saliente 3' de 1-5 nucleotidos de al menos una o las dos cadenas. Otras configuraciones de los oligonucleotidos conocidas en el campo se contemplan en la presente. En formas de realizacion del procedimiento, los polinucleotidos incluyen ARN bicatenario formado por hibridacion intramolecular, ADN bicatenario formado por hibridacion intermolecular. Sin pretender quedar ligado por cualquier mecanismo, se cree que tales polinucleotidos son o produciran ARN monocatenario con al menos un segmento que hibridara en ARN transcripto de un gen dirigido para supresion. En ciertas formas de realizacion diferentes, los polinucleotidos tambien incluyen un promotor, en general, un promotor funcional en una planta, por ejemplo, un promotor de pol II, un promotor de pol III, un promotor de pol IV o un promotor de pol V.
El termino “gen” se refiere a ADN cromosomico, ADN de plasmido, cADN, ADN de intron y exon, ADN de polinucleotido artificial u otro ADN que codifica un peptido, polipeptido, protema o molecula de transcripto de ARN y los elementos geneticos que flanquean la secuencia codificante que estan incluidos en la regulacion de expresion, tales como, regiones promotoras, regiones lfderes 5', regiones no traducidas 3'. Cualquiera de los componentes del gen son blancos potenciales para los oligonucleotidos y polinucleotidos de la presente invencion.
Las moleculas de polinucleotido de la presente invencion se disenan para modular la expresion al inducir la regulacion o la supresion de un gen de GS endogeno en una planta y se disenan para tener una secuencia de nucleotidos esencialmente identica o esencialmente complementaria a la secuencia de nucleotidos de un gen de GS endogeno de una planta o a la secuencia de ARN transcripta de un gen de GS endogeno de una planta, incluyendo un transgen en una planta que proporciona una enzima de GS resistente a herbicidas, que puede ser una secuencia codificante o una secuencia no codificante. Las moleculas efectivas que modulan la expresion se mencionan como una “molecula disparadora o polinucleotidos disparadores”. Por “esencialmente identico” o “esencialmente complementario” se entiende que los polinucleotidos disparadores (o al menos una cadena de un polinucleotido bicatenario o una de sus porciones o una porcion de un polinucleotido monocatenario) se disenan para hibridar en la secuencia no codificante del gen endogeno o ARN transcripto (conocido como ARN mensajero o un transcripto de ARN) del gen endogeno para realizar la regulacion o la supresion de la expresion del gen endogeno. Las moleculas disparadoras se identificar por “azulejado” de los blancos genicos con sondas parcialmente superpuestas o sondas no superpuestas de polinucleotidos antisentido o consentido que son esencialmente identicos o esencialmente complementarios a la secuencia de nucleotidos de un gen endogeno. Multiples secuencias blanco se pueden alinear y regiones de secuencia con homologfa en comun, de acuerdo con los procedimientos de la presente invencion, se identifican como potenciales moleculas disparadoras para los blancos multiples. Las multiples moleculas disparadoras de diversas longitudes, por ejemplo 18-25 nucleotidos, 26-50 nucleotidos, 51-100 nucleotidos, 101200 nucleotidos, 201-300 nucleotidos o mas se pueden reunir en pocos tratamientos a fin de investigar moleculas de polinucleotido que cubren una porcion de una secuencia genica (por ejemplo, una porcion de una porcion codificante versus una porcion de una region no codificante o una porcion 5' versus 3' de un gen) o una secuencia genica entera que incluye las regiones codificantes y no codificantes de un gen blanco. Las moleculas de polinucleotido de las moleculas disparadoras reunidas se pueden dividir en pools mas pequenos o moleculas individuales a fin de identificar moleculas disparadoras que proporcionan el efecto deseado.
Las moleculas de polinucleotido de ARN y ADN de gen blanco (Tabla 1, SEQ ID NO:1-59) se secuencian por cualquier cantidad de procedimientos y equipamiento apropiados. Algunas de las tecnologfas de secuenciacion estan disponibles en comercios, tales como la plataforma de secuenciacion por hibridacion de Affymetrix Inc. (Sunnyvale, Calif.) y las plataformas de secuenciacion por smtesis de 454 Life Sciences (Bradford, Conn.), Illumina/Solexa (Hayward, Calif.) y Helicos Biosciences (Cambridge, Mass.) y la plataforma de secuenciacion por ligacion de Applied Biosystems (Foster City, Calif.), tal como se describe mas abajo. Ademas de la secuenciacion de moleculas simples realizada usando secuenciacion por smtesis de Helicos Biosciences, estan comprendidas otras tecnologfas de secuenciacion de moleculas simples por el procedimiento de la invencion e incluyen la tecnologfa SMRT™ de Pacific Biosciences, la tecnologfa Ion Torrent™ y secuenciacion de nanoporos desarrolla, por ejemplo, por Oxford Nanopore Technologies. Un gen blanco de GS que comprende ADN o ARN se puede aislar usando cebadores o sondas esencialmente complementarias o esencialmente homologas a la SEQ ID NO:1-59 o a su fragmento. Un gen de reaccion de polimerasa en cadena (PCR) se puede producir usando cebadores esencialmente complementarios o esencialmente homologos a SEQ ID NO:1-59 o a su fragmento que es de utilidad para aislar un gen de GS de un genoma de planta. SEQ ID NO: 1-59 o sus fragmentos se pueden usar en diversas tecnologfas de
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captura de secuencias para aislar secuencias genicas blanco adicionales, por ejemplo, que incluyen, pero sin limitacion, Roche NimbleGen® (Madison, WI) y Dynabeads® acopladas con estreptavidina (Life Technologies, Grand Island, NY) y US 20110015084, incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Las formas de realizacion de polinucleotidos monocatenarios tienen una complementariedad de secuencia que no requiere ser del 100%, pero es al menos suficiente para permitir la hibridacion en ARN transcripto del gen blanco o ADN del gen blanco para formar un duplex para permitir un mecanismo de silenciacion genica. Asf, en formas de realizacion, un fragmento de polinucleotido se disena para ser esencialmente identico o esencialmente complementario a una secuencia de 18 o mas nucleotidos contiguos en la secuencia de gen blanco de GS o ARN mensajero transcripto del gen blanco. Por “esencialmente identico” se entiende que tiene 100% de identidad de secuencia o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o mas nucleotidos contiguos ya sea en el gen blanco o ARN transcripto del gen blanco; por “esencialmente complementario” se entiende que tiene 100% de complementariedad de secuencia o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% complementariedad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o mas nucleotidos contiguos ya sea en el gen blanco o ARN transcripto del gen blanco. En algunas formas de realizacion de esta invencion, las moleculas de polinucleotido se disenan para tener 100% de identidad de secuencia o complementariedad con un alelo o un miembro de la familia de un gen blanco dado (secuencia codificante o no codificante de un gen de la presente invencion); en otras formas de realizacion, las moleculas de polinucleotido se disenan para tener 100% de identidad de secuencia o complementariedad con multiples alelos o miembros de la familia de un gen blanco dado.
En ciertas formas de realizacion, los polinucleotidos usados en las composiciones que son esencialmente identicos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto comprenderan el acido nucleico predominante en la composicion. Asf, en ciertas formas de realizacion, los polinucleotidos que son esencialmente identicos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto comprenderan al menos aproximadamente 50%, 75%, 95%, 98% o 100% de los acidos nucleicos proporcionados en la composicion por concentracion de masa o molar. Sin embargo, en ciertas formas de realizacion, los polinucleotidos que son esencialmente identicos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto pueden comprender al menos aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50% o aproximadamente 30% a aproximadamente 50% de los acidos nucleicos proporcionados en la composicion por concentracion de masa o molar. Tambien se proporcionan composiciones en las que los polinucleotidos que son esencialmente identicos o esencialmente complementarios al gen blanco o transcripto pueden comprender al menos aproximadamente 1% a 100%, aproximadamente 10% a 100%, aproximadamente 20% a aproximadamente 100%, aproximadamente 30% a aproximadamente 50% o aproximadamente 50% a 100% de los acidos nucleicos proporcionados en la composicion por concentracion de masa o molar.
"Identidad" se refiere al grado de similitud entre dos secuencias de acido polinucleico o protema. Una alineacion de las dos secuencias se lleva a cabo por medio de un programa de computadora apropiado. Un programa de computadora ampliamente usado y aceptado para realizar alineaciones de secuencias es CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nucl. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). La cantidad de bases o aminoacidos coincidentes se divide por la cantidad total de bases o aminoacidos y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de bases tienen 145 bases coincidentes, seran 25% identicas. Si las dos secuencias comparadas son de diferentes longitudes, la cantidad de coincidencia se divide por la mas corta de las dos longitudes. Por ejemplo, si hay 100 aminoacidos coincidentes entre una protema de 200 y 400 aminoacidos, son 50% identicos respecto de la secuencia mas corta. Si la secuencia mas corta es menor a 150 bases o 50 aminoacidos de longitud, la cantidad de coincidencias se dividen por 150 (para bases de acidos nucleicos) o 50 (para aminoacidos) y se multiplican por 100 para obtener un porcentaje de identidad.
Las moleculas disparadoras para miembros de la familia genica espedfica se pueden identificar de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de una planta o multiples plantas, por alineacion y seleccion de 200-300 fragmentos de polinucleotidos de las ultimas regiones homologas entre las secuencias alineadas y evaluadas usando polinucleotidos aplicados topicamente (como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN con sentido o antisentido) para determinar su eficacia relativa en la induccion del fenotipo herbicida. Los segmentos efectivos luego se subdividen en 50-60 fragmentos de polinucleotidos, se priorizan por minima homologfa y se reevaluan usando los polinucleotidos aplicados topicamente. Los fragmentos efectivos de 50-60 polinucleotidos se subdividen en 19-30 fragmentos de polinucleotidos, se priorizan por minima homologfa y nuevamente se evaluan respecto de la induccion del fenotipo de rendimiento / calidad. Una vez determinada la efectividad relativa, los fragmentos se utilizan individualmente o se evaluan otra vez en combinacion con uno o varios fragmentos diferentes para determinar la composicion disparadora o mezcla de polinucleotidos disparadores para proporcionar el fenotipo de rendimiento / calidad.
Las moleculas disparadoras para la actividad amplia se pueden identificar de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de una planta o varias plantas, por alineacion y seleccion de 200-300 fragmentos de polinucleotidos de las regiones mas homologas entre las secuencias alineadas y evaluadas usando polinucleotidos topicamente aplicados (como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN con sentido o antisentido) para determinar su efectividad relativa en la induccion del fenotipo de rendimiento / calidad. Los segmentos efectivos se
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subdividen en 50-60 fragmentos de polinucleotidos, se priorizan por la maxima homologfa y se reevaluan usando polinucleotidos topicamente aplicados. Los 50-60 fragmentos de polinucleotido se subdividen en 19-30 fragmentos de polinucleotidos, se priorizan por la maxima homologfa y se reevaluan respecto de la induccion del fenotipo de rendimiento / calidad. Una vez determinada la eficacia relativa, los fragmentos se pueden utilizar de forma individual o en combinacion con uno o varios otros fragmentos para determinar la composicion disparadora o mezcla de polinucleotidos disparadores para proporcionar el fenotipo de rendimiento / calidad.
Los procedimientos para preparar polinucleotidos son bien conocidos en el arte. Las smtesis qmmicas, las smtesis in vivo y procedimientos de smtesis in vivo y composiciones son conocidos en el arte e incluyen diversos elementos virales, celulas microbianas, polimerasas modificadas y nucleotidos modificados. La preparacion comercial de oligonucleotidos proporciona a menudo dos desoxirribonucleotidos en el extremo 3' de la cadena con sentido. Las moleculas largas de polinucleotido se pueden sintetizar de kits asequibles en comercios, por ejemplo, kits de Applied Biosystems/Ambion (Austin, TX) tuenen ADN ligado en el extremo 5' en un casete de expresion microbiano que incluye un promotor bacteriano T7 de polimerasa que hace que cadenas de ARN se puedan reunir en un dsARN y kits proporcionados por diversos fabricantes que incluyen T7 RiboMax Express (Promega, Madison, WI), AmpliScribe T7-Flash (Epicentre, Madison, WI) y TranscriptAid T7 High Yield (Fermentas, Glen Burnie, MD). Las moleculas de dsARN se pueden producir a partir de casetes de expresion microbiano en celulas bacterianas (Ongvarrasopone et al. ScienceAsia 33:35-39; Yin, Appl. Microbiol. Biotechnol 84:323-333, 2009; Liu et al., BMC Biotechnology 10:85, 2010) que tienen una actividad enzimatica regulada o deficiente de ARNasa III o el uso de diversos vectores virales para producir cantidades suficientes de dsARN. En la presente invencion, los fragmentos genicos de GS se insertan en los casetes de expresion microbiana en una posicion position en donde los fragmentos se expresan para producir ssARN o dsARN de utilidad en los procedimientos descritos en la presente para regular la expresion en un gen blanco de GS. Las moleculas largas de polinucleotido tambien se pueden reunir de multiples fragmentos de ARN o ADN. En algunas formas de realizacion, parametros de diseno tales como puntaje de Reynolds (Reynolds et al. Nature Biotechnology 22, 326 - 330 (2004), reglas de Tuschl (Pei y Tuschl, Nature Methods 3(9): 670-676, 2006), puntaje i (Nucleic Acids Res 35: e123, 2007), herramienta de diseno de puntaje i y algoritmos asociados (Nucleic Acids Res 32: 936-948, 2004. Biochem Biophys Res Commun 316: 1050-1058, 2004, Nucleic Acids Res 32: 893-901,2004, Cell Cycle 3: 790-5, 2004, Nat Biotechnol 23: 995-1001, 2005, Nucleic Acids Res 35: e27, 2007, BMC Bioinformatics 7: 520, 2006, Nucleic Acids Res 35: e123, 2007, Nat Biotechnol 22: 326-330, 2004) se conocen en el arte y se pueden usar en la seleccion de secuencias de polinucleotido efectivas para la silenciacion genica. En algunas formas de realizacion, la secuencia de un polinucleotido se controla contra el ADN genomico de la planta pretendida para minimizar la silenciacion no intencional de otros genes.
Las composiciones de polinucleotido disparador y molecula de oligonucleotido de esta invencion son de utilidad en composiciones, tales como lfquidos que comprenden las moleculas de polinucleotido en bajas concentraciones, solas o en combinacion con otros componentes, por ejemplo, una o varias moleculas de herbicida, ya sea en la misma solucion o en lfquidos aplicados por separado que tambien proporcionan un agente de transferencia. Si bien no hay un lfmite superior en las concentraciones y dosis de moleculas de polinucleotido que pueden ser de utilidad en los procedimientos, concentraciones menos efectivas y dosis se buscar en general por su eficacia. Las concentraciones se pueden ajustar en consideracion al volumen de pulverizacion o tratamiento aplicado a las hojas de plantas u otra parte de una superficie de la planta, tales como petalos de la flor, tallos, tuberculos, fruta, anteras, polen o semillas. En una forma de realizacion, un tratamiento util para plantas herbaceas usando moleculas de oligonucleotido 25-mero es de aproximadamente 1 nanomol (nmol) de moleculas de oligonucleotido por planta, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a 1 nmol por planta. Otras formas de realizacion para plantas herbaceas incluyen rangos utiles de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 nmol o aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 nmol o aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 10 nmol de polinucleotidos por planta. Plantas muy grandes, arboles y vinedos pueden requerir cantidades correspondientemente grandes de polinucleotidos. Cuando se usan moleculas largas de dsARN que se pueden procesar en multiples oligonucleotidos, se pueden usar menores concentraciones. Para ilustrar las formas de realizacion de la invencion, el factor 1X, cuando se aplica a moleculas de oligonucleotido se usa arbitrariamente para denotar un tratamiento de 0,8 nmol de molecula de polinucleotido por planta; 10X, 8 nmol de molecula de polinucleotido por planta; y 100X, 80 nmol de molecula de polinucleotido por planta.
Las composiciones de polinucleotido de esta invencion son de utilidad en composiciones, tales como lfquidos que comprenden moleculas de polinucleotido, solos o en combinacion con otros componentes ya sea en el mismo lfquido o en lfquidos aplicados por separado que proporcionan un agente de transferencia. Tal como se usa en la presente, un agente de transferencia es un agente que, cuando se combina con un polinucleotido en una composicion que se aplica topicamente a una superficie de planta objeto, permite que el polinucleotido entre en una celula de planta. En determinadas formas de realizacion, un agente de transferencia es un agente que condiciona la superficie del tejido de planta, por ejemplo, hojas, tallos, ratees, flores o frutos, a la permeacion por las moleculas de polinucleotido en celulas de plantas. La transferencia de polinucleotidos en celulas de plantas se puede facilitar por aplicacion anterior o contemporanea de un agente de transferencia de polinucleotido al tejido de la planta. En algunas formas de realizacion, el agente de transferencia se aplica luego de la aplicacion de la composicion de polinucleotido. El agente de transferencia de polinucleotido permite una via para los polinucleotidos a traves de las barreras de cera de cutteula, estomas y/o pared celular o barreras de membrana en celulas de plantas. Los agentes de transferencia apropiados para facilitar la transferencia del polinucleotido en una celula de planta incluyen agentes que incrementan
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la permeabilidad del exterior de la planta o que incrementan la permeabilidad de celulas de planta a oligonucleotidos o polinucleotidos. Estos agentes para facilitar la transferencia de la composicion en una celula de planta incluyen un agente qmmico o un agente ffsico o sus combinaciones. Los agentes qmmicos para acondicionamiento o transferencia incluyen (a) tensioactivos, (b) un solvente organico o una solucion acuosa o mezclas acuosas de solventes organicos, (c) agentes oxidantes, (d) acidos, (e) bases, (f) aceites, (g) enzimas o sus combinaciones. Las formas de realizacion del procedimiento pueden incluir opcionalmente una etapa de incubacion, una etapa de neutralizacion (por ejemplo, para neutralizar un acido, una base o un agente oxidante o para inactivar una enzima), una etapa de enjuague o sus combinaciones. Las formas de realizacion de agentes o tratamientos para acondicionamiento de una planta para la permeacion por polinucleotidos incluyen emulsiones, emulsiones inversas, liposomas y otras composiciones de tipo micelar. Las formas de realizacion de agentes o tratamientos para acondicionamiento de una planta a la permeacion por polinucleotidos incluyen contraiones u otras moleculas que se conocen para asociarse con moleculas de acidos nucleicos, por ejemplo, iones amonio inorganicos, iones alquilamonio, iones litio, poliaminas tales como espermina, espermidina o putrescina y otros cationes. Los solventes organicos de utilidad en el acondicionamiento de una planta a la permeacion por polinucleotidos incluyen DMSO, DMF, piridina, /V—pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrilo, dioxano, polipropilenglicol, otros solventes miscibles con agua o que disolveran fosfonucleotidos en sistemas no acuosos (tal como se usa en reacciones de smtesis). Los aceites naturales o sinteticos con o sin tensioactivos o emulsionantes se pueden usar, por ejemplo, aceites de origen vegetal, aceites de cultivos (tales como los enumerados en el 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, disponibles al publico en la Worldwide Web (Internet) en herbicide.adjuvants.com, por ejemplo, aceites parafrnicos, esteres de acido grasos de poliol o aceites con moleculas de cadena corta modificadas con amidas o poliaminas tales como polietilenimina o V—pirrolidina. Los agentes de transferencia incluyen, pero sin limitacion, preparaciones de organosilicio.
En ciertas formas de realizacion, una preparacion de organosilicona que esta disponible en el comercio como tensioactivo Silwet® L-77 que tiene Numero CAS 27306-78-1 y Numero EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, y disponible actualmente de Momentive Performance Materials, Albany, New Cork se puede usar para preparar una composicion de polinucleotido. En ciertas formas de realizacion cuando se usan una preparacion de organosilicona Silwet L-77 como un tratamiento pre-rociado de hojas de planta u otras superficies de plantas, concentraciones recien preparadas en el rango de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 por ciento en peso) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de planta para la transferencia de moleculas de polinucleotidos en celulas de plantas a partir de una aplicacion topica sobre la superficie. En ciertas formas de realizacion de los procedimientos y las composiciones que se proporcionan en la presente, se usa o proporciona una composicion que comprende una molecula de polinucleotido y una preparacion de organosilicona que comprende Silwet L-77 en el rango de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 por ciento en peso) .
En ciertas formas de realizacion, alguna de las preparaciones de organosilicona disponibles en el comercio provistas tales como las siguientes Breakthru S 321, Breakthru S 200 Cat# 67674-67-3, Breakthru OE 441 Cat#68937-55-3, Breakthru S 278 Cat #27306-78-1, Breakthru S 243, Breakthru S 233 Cat#134180-76-0, disponibles del fabricante Evonik Goldschmidt (Alemania), Silwet® HS 429, Silwet® HS 312, Silwet® HS 508, Silwet® HS 604 (Momentive Performance Materials, Albany, New York) se pueden usar como agentes de transferencia en una composicion de polinucleotido. En ciertas formas de realizacion cuando una preparacion de organosilicona se usa como un tratamiento de pre-rociado de hojas de plantas u otras superficies, las concentraciones recien preparadas en el rango de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2,
2.3, 2,5 por ciento en peso) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de planta para la transferencia de las moleculas de polinucleotidos en las celulas vegetales a partir de la aplicacion topica sobre la superficie. En ciertas formas de realizacion de los procedimientos y composiciones provistos en la presente, se usa o proporciona una composicion que comprende una molecula de polinucleotido y una preparacion de organosilicona en el rango de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2,
2.3, 2,5 por ciento en peso).
Las preparaciones de organosilicona usadas en los procedimientos y composiciones provistos en la presente pueden comprender uno o mas compuestos de organosilicona efectivos. Como se usa en la presente, la frase “compuesto de organosilicona efectivo” se usa para describir cualquier compuesto de organosilicona que se halla en una preparacion de organosilicona que permite que un polinucleotido entre en una celula de planta. En ciertas formas de realizacion, un compuesto de organosilicona efectivo puede permitir que un polinucleotido entre a una celula de planta de una manera que permite una supresion mediada por polinucleotido de una expresion del gen blanco en la celula de planta. En general, los compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitacion,
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compuestos que pueden comprender: i) un grupo principal trisiloxano que se une covalentemente a, ii) un ligador alquilo que incluye, pero sin limitacion, un ligador n-propilo, que se une covalentemente a, iii) una cadena de poliglicol, que se une covalentemente a, iv) un grupo terminal. Los grupos principales trisiloxano de tales compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitacion, heptametiltrisiloxano. Los ligadores alquilo pueden incluir, pero sin limitacion, un ligador n-propilo. Las cadenas poliglicol incluyen, pero sin limitacion, polietilenglicol o polipropilenglicol. Las cadenas de poliglicol pueden comprender una mezcla que proporciona una longitud de cadena promedio “n” de aproximadamente “7,5”. En ciertas formas de realizacion, la longitud de cadena promedio “n” puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 14. Los grupos terminales pueden incluir, pero sin limitacion, grupos alquilo tales como un grupo metilo. Se considera que los compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitacion, tensioactivos de etoxilato de trisiloxano o heptametil trisiloxano modificado con oxido de polialquileno.
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(Compuesto I: heptametiltrisiloxano con oxido de polialquileno, promedio=7,5).
En ciertas formas de realizacion, se usa una preparacion de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo principal trisiloxano en los procedimientos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas formas de realizacion, se usa una preparacion de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo principal heptametiltrisiloxano en los procedimientos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas formas de realizacion, se usa una composicion de organosilicona que comprende Compuesto I en los procedimientos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas formas de realizacion, se usa una composicion de organosilicona que comprende el Compuesto I en los procedimientos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas formas de realizacion de los procedimientos y las composiciones que se proporcionan en la presente, se usa o proporciona una composicion que comprende una molecula de polinucleotido y uno o mas compuestos de organosilicona efectivo en el rango de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 por ciento en peso).
Las composiciones de la presente invencion incluyen pero sin limitacion componentes que son uno o mas polinucleotidos esencialmente identicos, o esencialmente complementarios a una secuencia del gen GS (promotor, intron, exon, region no traducida 5', region no traducida 3'), un agente de transferencia que permite que el polinucleotido entre en una celula de planta, un herbicida que complementa la accion del polinucleotido, uno o mas herbicidas adicionales que tambien potencian la actividad herbicida de la composicion o proporcionan un modo de accion adicional diferente del herbicida de complementacion, varias sales y agentes estabilizantes que aumentan la utilidad de la composicion como una combinacion de los componentes de la composicion.
Los procedimientos incluyen una o mas aplicaciones de una composicion de polinucleotido y una o mas aplicaciones de un agente potenciador de la permeabilidad para acondicionar una planta para la penetracion por los polinucleotidos. Cuando el agente para acondicionar la penetracion es una composicion de organosilicona o compuesto contenida en esta, las formas de realizacion de las moleculas de polinucleotidos son oligonucleotidos de ARN de cadena doble, oligonucleotidos de ARN de cadena simple, polinucleotidos de ARN de cadena doble, polinucleotidos de ARN de cadena simple, oligonucleotidos de ADN de cadena doble, oligonucleotidos de ADN de cadena simple, polinucleotidos de ADN de cadena doble, polinucleotidos de ADN de cadena simple, oligonucleotidos o polinucleotidos de ARN o ADN modificado qmmicamente o sus mezclas.
Las composiciones y los procedimientos son de utilidad para modular la expresion de un gen endogeno de GS (por ejemplo, Pest Manag Sci 2009; 65: 216-222, mutantes GS249) o gen transgenico GS (por ejemplo, patente U. S. N.°: 7.910.805; 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616; y 5.879.903) en una celula vegetal. En varias formas de realizacion, un gen de GS incluye la secuencia codificadora (codificadora de la protema o traducible), secuencia no codificadora (no traducible) o secuencia codificadora y no codificadora. Las composiciones de la invencion pueden incluir polinucleotidos y oligonucleotidos disenador para genes multiples blanco o multiples segmentos de uno o mas genes. El gen blanco puede incluir multiples segmentos consecutivos de un gen blanco, multiples segmentos no consecutivos de un gen blanco, multiples alelos de un gen blanco, o multiples genes blanco de una o mas especies.
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Un aspecto es un procedimiento para modular la expresion de un gen GS en una planta que incluye (a) acondicionamiento de una planta para la penetracion por polinucleotidos y (b) tratamiento de la planta con las moleculas de polinucleotidos, donde las moleculas de polinucleotidos incluyen al menos un segmento de 18 o mas nucleotidos contiguos clonados de o identificados de otro modo del gen GS blanco en orientacion antisentido o sentido, a traves de lo cual las moleculas de polinucleotidos penetran el interior de la planta e inducen la modulacion del gen blanco. El acondicionamiento y la aplicacion del polinucleotido se pueden realizar de modo separado o en una etapa unica. Cuando el acondicionamiento y la aplicacion del polinucleotido se realizan en etapas separadas, el acondicionamiento puede preceder o puede seguir a la aplicacion del polinucleotido dentro de minutos, horas, o dfas. En algunas formas de realizacion se pueden realizar mas de una etapa de acondicionamiento o mas de una aplicacion de la molecula de polinucleotido en la misma planta. En formas de realizacion del procedimiento, el segmento se puede clonar o identifica de (a) parte codificadora (que codifica una protema), (b) no codificadora (promotor y otras moleculas relacionadas con el gen), o (c) las partes codificadora y no codificadora del gen blanco. Las partes no codificadoras incluyen ADN, tal como regiones promotoras o el ARN transcripto por el ADN que proporciona moleculas regulatorias de ARN, que incluyen pero sin limitacion: intrones, regiones no traducidas 5' o 3' y microARN (miARN), ARNsi de accion actuan trans, ARNsi antisentido natural y otros ARN pequenos con funcion reguladora o ARN que tienen funcion estructural o enzimatica que incluyen, pero sin limitacion: ribozimas, ARN ribosomicos, t-ARNs, aptameros, y riboswitches.
Ejemplos
Ejemplo 1. Polinucleotidos relacionados con la secuencia genica de GS
La molecula de polinucleotido de GS blanco se produce naturalmente en el genoma de Abutilon theophrasti, Amaranthus albus, Amaranthus clorostachys, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amaranthus palmeri, Amaranthus rudis, Amaranthus spinosus, Amaranthus thunbergii, Ambrosia trifida, Ambrosia artemisiifolia, Chenopodium album, Commelina diffusa, Convulvulus arvensis, Conyza candensis, Lolium multiflorum, Euphorbia heterophylla, Kochia scoparia, Sorghum halepense y Digitaria sanguinalis e incluyen moleculas relacionadas con la expresion de un polipeptido identificado como un GS, que incluyen moleculas de regulacion, cAADN que comprenden regiones codificantes y no codificantes de un gen de GS y sus fragmentos tal como se muestran en la Tabla 1.
Las moleculas de polinucleotido se extrajeron de estas especies de plantas por procedimientos estandar en el campo, por ejemplo, se extrae ARN total usando reactivo de trizol (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA Cat. No. 15596018), de acuerdo con el protocolo del fabricante o sus modificaciones por los expertos en el arte de la extraccion de polinucleotido que puede mejorar la recuperacion o la pureza del ARN extrafdo. Brevemente, se inicia con 1 gramo de tejido de planta molido para extraccion. Se hacen prealfcuotas de 10 mililitros (ml) de reactivo de trizol en tubos conicos de 15 ml. Se anade polvo molido a tubos y se agita para homogeneizar. Se incuba las muestras homogeneizadas durante 5 minutos (min) a temperatura ambiente (TA) y luego se anaden 3 ml de cloroformo. Se agitan los tubos vigorosamente a mano durante 15-30 segundos (seg) y se incuban a temperatura ambiente durante 3 min. Se centrifugan los tubos a 7.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 min a 4 grados C. Se transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo de 1,5 ml y se anade 1 volumen de isopropanol frio. Se incuban las muestras durante 20-30 min a TA y se centrifugan a 10.000 rpm durante 10 min a 4 grados C. Se lava el pellet con etanol al 80% de grado Sigma. Se elimina el sobrenadante y el pellet se seca brevemente con aire. Se disuelve el pellet de ARN en aproximadamente 200 microlitros de agua tratada con DEPC. Se calienta brevemente a 65 grados C para disolver el pellet y se somete a vortex o se pipetea para resuspender el pellet de ARN. Se ajusta la concentracion de ARN a 12 microgramos/microlitro.
El ADN se extrajo usando el kit EZNA SP Plant ADN Mini kit (Omega Biotek, Norcross GA, Cat#D5511) y tubos Lysing Matrix E (Q-Biogen, Cat#6914), de acuerdo con el protocolo del fabricante o sus modificaciones por los expertos en el arte de extraccion de polinucleotidos que puede mejorar la recuperacion o la pureza del ADN extrafdo. Brevemente, se alicuota el tejido molido en un tubo Lysing Matrix E en hielo seco, se anaden 800 pl de tampon SP1 a cada muestra, se homogeneiza en un batidor de perlas durante 35-45 seg, se incuba en hielo durante 45-60 seg, se centrifuga a >14000 rpm durante 1 min a TA, se anaden 10 microlitros de ARNasa A al lisado, se incuba a 65 °C durante 10 min, se centrifuga durante 1 min a TA, se anaden 280 pl de tampon SP2 y se somete a vortex para mezclar, se incuba las muestras en hielo durante 5 min, se centrifuga a >10.000 g durante 10 min a TA, se transfiere el sobrenadante a una columna homogeneizadora en un tubo de coleccion de 2 ml, se centrifuga a 10.000 g durante 2 min a TA, se transfiere el lisado clarificado en un tubo microfugo de 1,5 ml, se anaden 1,5 volumenes de tampon SP3 al lisado clarificado, se somete a vortex inmediatamente para obtener una mezcla homogenea, se transfiere hasta 650 pl de sobrenadante a la columna Hi-Bind, se centrifuga a 10.000 g durante 1 min, se repite, se aplican 100 pl a tampon de elucion a 65 °C a la columna, se centrifuga a 10.000 g durante 5 min a TA.
Los secuenciadores de ADN de la proxima generacion, tales como 454-FLX (Roche, Branford, CT), SOLiD (Applied Biosystems) y Genome Analyzer (HiSeq2000, Illumina, San Diego, CA) se usaron para proporcionar secuencia de polinucleotidos del ADN y ARN extrafdo de los tejidos de planta. Los datos en bruto de secuencias se reunen en contigos. La secuencia de contigos se usa para identificar moleculas disparadoras que se pueden aplicar a la planta para permitir la regulacion de la expresion genica.
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La secuencia blanco de ADN aislada de (gADN) genomico y ADN codificante (cADN) de las diversas especies de plantas herbaceas para el gen de GS y los contigos reunidos se establecen en la SEQ ID NOs 1-59 y Tabla 1.
Ejemplo 2. Polinucleotidos de la invencion relacionados con las moleculas disparadoras
Las secuencias genicas y fragmentos de la Tabla 1 se dividieron en longitudes de 200 polinucleotidos (200-meros) con regiones superpuestas de 25 polinucleotidos as en SEQ ID NO:37-1056. Estos polinucleotidos se ensayan para seleccionar las regiones disparadoras mas eficaces a lo largo de toda secuencia blanco. Los polinucleotidos disparadores se construyen como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o hforidos de dsADN/ARN y se combinan con un agente de transferencia a base de organosilicio para proporcionar una preparacion de polinucleotido. Los polinucleotidos se combinan en grupos de dos de tres polinucleotidos por grupo, usando 4-8 nmol de cada polinucleotido. Cada grupo de polinucleotidos se prepara con el agente de transferencia y se aplica a una planta o un campo de plantas en combinacion con un inhibidor de GS con herbicida o seguido de un inhibidor de GS tratamiento uno a tres dfas despues de la aplicacion del polinucleotido, para determinar el efecto sobre la susceptibilidad de la planta a un inhibidor de GS. El efecto se mide impidiendo el crecimiento y/o matando la planta y se mide 8-14 dfas despues del tratamiento con el grupo de polinucleotidos y el inhibidor de GS. Los grupos mas eficaces se identifican y los polinucleotidos individuales se ensayan en los mismos procedimientos que los grupos y se identifican los 200-meros individuales mas eficaces. La secuencia de 200-meros se divide en secuencias mas pequenas de regiones de 50-70-meros con regiones de superposicion de 10-15 polinucleotidos y los polinucleotidos ensayados de forma individual. El 50-70-mero mas eficaz luego se divide en secuencias mas pequenas de regiones de 25-meros con una region de superposicion de 12 a 13 polinucleotidos y se ensaya respecto de la eficacia en combinacion con tratamiento con inhibidor de GS. Por este procedimiento es posible identificar un oligonucleotido o varios oligonucleotidos que son la molecula disparadora mas eficaz para efectuar la sensitividad de la planta a un inhibidor de GS o modulacion de un gen de GS expresion. La modulacion de la expresion genica de GS se determina por deteccion de moleculas de GS siARN espedficas de un gen de GS o por observacion de una reduccion en la cantidad de transcripto de ARN de GS producido respecto de una planta no tratada o meramente observando el fenotipo anticipado de la aplicacion del disparador con el herbicida inhibidor de HS. La deteccion de siARN se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando kits tales como mirVana (Ambion, Austin TX) y mirPremier (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
La secuencia blanco de ADN aislada de (gADN) genomico y ADN codificante (cADN) de las diversas especies de plantas herbaceas para el gen de GS y los contigos reunidos que se establecen en la SEQ ID NOs 1-59 se dividieron en fragmentos de polinucleotido tal como se establece en SEQ ID NOs 60-1444.
Las secuencias genicas y fragmentos de la Tabla 1 se compararon y se identificaron 21-meros de polinucleotidos contiguos que teman homologfa a traves de diversas secuencias genicas de GS. La finalidad consiste en identificar moleculas disparadoras que son de utilidad como moleculas herbicidas o en combinacion con un herbicida inhibidor de GS a traves de un rango amplio de especies de malezas. Las secuencias SEQ ID NO: 1444-2045 representan los 21-meros que estan presentes en los GS gene de al menos dos de las especies de malezas de la Tabla 1. Se contempla que 21-meros adicionales se pueden seleccionar de las secuencias de la Tabla 1 que son espedficos de una unica especie de malezas o algunas especies de malezas dentro de un genero o moleculas disparadoras que tienen una longitud de al menos 18 nucleotidos contiguos, al menos 19 nucleotidos contiguos, al menos 20 nucleotidos contiguos o al menos 21 nucleotidos contiguos y al menos el 85% identico a una secuencia genica de GS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-59 o su fragmento.
Por este procedimiento es posible identificar un oligonucleotido o varios oligonucleotidos que son la molecula disparadora mas eficaz para efectuar la sensitividad de la planta a inhibidor de GS o modulacion de expresion genica de GS. La modulacion de la expresion genica de GS se determina por deteccion de moleculas de GS siARN espedficas del gen de GS o por observacion de una reduccion en la cantidad de transcripto de ARN de GS producido respecto de una planta no tratada o meramente observando el fenotipo anticipado de la aplicacion del disparador con el herbicida que contiene inhibidor de GS. La deteccion de siARN se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando kits tales como mirVana (Ambion, Austin TX) y mirPremier (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
La secuencia blanco de ADN aislada de (gADN) genomico y ADN codificante (cADN) de las diversas especies de plantas herbaceas para el gen de GS y los contigos reunidos que se establecen en la SEQ ID NOs 1-59 se dividieron en fragmentos tal como se establece en SEQ ID NOS 1444-2045.
Ejemplo 3. Procedimientos usados en la invencion relacionados con el tratamiento de plantas o partes de plantas con una mezcla topica de las moleculas disparadoras.
Se cultivaron plantas de Palmer amaranth sensibles a glifosato (A. palmeri R-22) en el invernadero (30 / 20 C dfa/noche T; fotopenodo de 14 horas) en macetas de 4 pulgadas cuadradas que conteman Sun Gro® Redi-Earth y 3,5 kg/metros cubicos de fertilizante Osmocote® 14-14-14. Se trataron plantas Palmer amaranth a 5 a 10 cm de altura con una mezcla de 5 polinucleotidos de ADN monocatenarios cortos (40-meros) antisentido (ssADN) dirigidos a la secuencia codificante de GS a 4 nm (nanomoles) cada uno, formulados en 20 milimoles de tampon de fosfato de sodio (pH 6,8) con 2% de sulfato de amonio y 1% de Silwet L-77. Se ensayaron 3 pools de polinucleotidos ssADN. Un pool denominado GS CpGS1 contema 5 polinucleotidos (SEQ ID NO: 2046-2050) que se seleccionaron para
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dirigir el gen que codifica el gen cloroplastico dirigido de glutamina sintetasa 1. El segundo pool denominado GS CytGSI contema 5 polinucleotidos (SEQ ID NO: 2051-2055) que se seleccionaron para dirigir el gen citosolico de glutamina sintetasa 1. El tercer pool (GS Mix) era una combinacion de moleculas disparadoras de ssADN, dos de ellas de GS CpGSI y GS CytGSI pool mas un ssADN (SEQ ID NO: 2056) dirigido a un gen citosolico de glutamina sintetasa 2. Las plantas se tratan manualmente pipeteando 10 pL de solucion de polinucleotido en cuatro hojas maduras completamente expandidas, para un total de 40 microlitros de solucion por planta. 3 dfas despues del tratamiento con polinucleotido disparador, las plantas se trataron con tasa de Ignite® (Bayer Cropscience) a 1/32X (23 gramos/hectarea) tasa de campo. Hubo cuatro replicaciones de cada tratamiento. El crecimiento de la planta y el desarrollo se califico visualmente 16 dfas despues del tratamiento con herbicida para determinar la eficacia del pool de polinucleotido y tratamientos con herbicida. El resultado se mostro en la Tabla 2 como la eficacia en % promedio observada de las cuatro replicaciones respecto del control no tratado.
Tabla 2. Actividad de polinucleotido disparador ssADN en Palmer Amaranth, % de eficacia
Control de formulacion
GS CpGS1 GS CytGS1 GS Mezcla
3
19 15 36
Ejemplo 4. Un procedimiento para controlar malezas en un campo.
Un procedimiento para controlar las malezas en un campo comprende el uso de polinucleotidos disparadores que pueden modular la expresion de un gen de GS en una o varias de especies de plantas herbaceas blanco. En la sEq ID NO: 1444-2045, un analisis de secuencias genicas de GS de 22 especies de plantas dio una coleccion de polinucleotidos 21-meros que se pueden usar en composiciones para afectar el crecimiento o desarrollo o sensibilidad al inhibidor de GS herbicida para controlar multiples especies de malezas en un campo. Una composicion con 1 o 2 o 3 o 4 o mas de los polinucleotidos de SEQ ID NO: 1444-2045 permitina una amplia actividad de la composicion contra las multiples especies de malezas que es producen en un ambiente de campo.
El procedimiento incluye la creacion de una composicion que comprende componentes que incluyen al menos un polinucleotido de SEQ ID NO: 1444-2045 o cualquier otra expresion genica efectiva que modula polinucleotido esencialmente identica o esencialmente complementario de SEQ ID NO:1-59 o su fragmento, un agente de transferencia que moviliza el polinucleotido en una celula vegetal y un herbicida inhibidor de GS y opcionalmente un polinucleotido que modula la expresion de un gen esencial y opcionalmente un herbicida que tiene un modo de accion diferente respecto a un inhibidor de GS. El polinucleotido de la composicion incluye a dsARN, ssADN o dsADN o una de sus combinaciones. Una composicion con un polinucleotido puede tener una tasa de uso de aproximadamente 1 a 30 gramos o mas por acre segun el tamano del polinucleotido y la cantidad de polinucleotidos en la composicion. La composicion puede incluir uno o varios herbicidas adicionales segun se requiera para proporcionar un control efectivo para malezas multiespecies. Un campo de plantas de cultivo que necesitan de un control de malezas de plantas se trata por aplicacion por pulverizacion de la composicion. La composicion se puede proporcionar como una mezcla en tanque, un tratamiento secuencial de componentes (en general, el polinucleotido seguido del herbicida), un tratamiento simultaneo o mezcla de uno o varios de los componentes de la composicion de recipientes separados. El tratamiento del campo se puede producir cuando se requiera para proporcionar control de malezas y los componentes de la composicion se pueden ajustar a especies de malezas espedficas blanco o familias de malezas.
Tabla 1. Secuencias genicas de glutamina sintetasa aisladas de diversas especies de malezas
SEQ ID NO
ESPECIES TIPO Longitud
1
Amaranthus palmeri cADN Contig 1759
2
Amaranthus palmeri gADN Contig 8486
3
Amaranthus palmeri gADN Contig 6862
4
Amaranthus rudis cADN Contig 1618
5
Amaranthus rudis cADN Contig 1550
6
Amaranthus rudis gADN Contig 2000
7
Amaranthus rudis gADN Contig 208
8
Ambrosia trifida cADN Contig 1723
9
Ambrosia trifida gADN Contig 1000
(Continuacion)
SEQ ID NO
ESPECIES TIPO Longitud
10
Ambrosia trifida gADN Contig 841
11
Conyza canadensis cADN Contig 1955
12
Conyza canadensis gADN Contig 8676
13
Conyza canadensis gADN Contig 8635
14
Euphorbia heterophylla cADN Contig 1550
15
Euphorbia heterophylla gADN Contig 3777
16
Euphorbia heterophylla gADN Contig 1755
17
Commelina diffusa cADN Contig 1587
18
Commelina diffusa gADN Contig 6900
19
Digitaria sanguinalis cADN Contig 1535
20
Digitaria sanguinalis gADN Contig 7358
21
Kochia scoparia cADN Contig 918
22
Kochia scoparia cADN Contig 867
23
Kochia scoparia cADN Contig 360
24
Kochia scoparia gADN Contig 5248
25
Kochia scoparia gADN Contig 3994
26
Kochia scoparia gADN Contig 2204
27
Kochia scoparia gADN Contig 135
28
Lolium multiflorum cADN Contig 1673
29
Lolium multiflorum cADN Contig 820
30
Lolium multiflorum gADN Contig 1888
31
Lolium multiflorum gADN Contig 1737
32
Lolium multiflorum gADN Contig 975
33
Lolium multiflorum gADN Contig 781
34
Lolium multiflorum gADN Contig 766
35
Lolium multiflorum gADN Contig 575
36
Lolium multiflorum gADN Contig 455
37
Abutilon theophrasti cADN Contig 1270
38
Abutilon theophrasti gADN Contig 1252
39
Abutilon theophrasti gADN Contig 885
40
Abutilon theophrasti gADN Contig 1075
41
Amaranthus albus cADN Contig 1603
42
Amaranthus clorostachys cADN Contig 514
43
Amaranthus clorostachys cADN Contig 1140
(Continuacion)
SEQ ID NO
ESPECIES TIPO Longitud
44
Amaranthus graecizans cADN Contig 1691
45
Amaranthus hybridus cADN Contig 1883
46
Amaranthus lividus cADN Contig 1683
47
Amaranthus spinosus cADN Contig 1743
48
Amaranthus thunbergii cADN Contig 1702
49
Amaranthus viridis cADN Contig 1744
50
Euphorbia heterophylla gADN Contig 4893
51
Sorghum halepense cADN Contig 1581
52
Convulvulus arvensis cADN Contig 710
53
Chenopodium album cADN Contig 1276
54
Ambrosia artemisiifolia gADN Contig 671
55
Euphorbia heterophylla gADN Contig 3047
56
Euphorbia heterophylla gADN Contig 2153
57
Euphorbia heterophylla gADN Contig 946
58
Euphorbia heterophylla gADN Contig 375
59
Euphorbia heterophylla gADN Contig 459

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de control de plantas que comprende: tratar una planta con una composicion mediante aplicacion externa de la composicion a la planta, en el que la composicion comprende un polinucleotido de ARN bicatenario (ARNds) y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen de la glutamina sintetasa (GS), en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, l6, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de dicha planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual se suprime o retrasa el crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora, o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que
    (i) dicho agente de transferencia es una composicion tensioactiva de organosilicona o un compuesto de organosilicio contenido en la anterior; o
    (ii) dicha planta se selecciona entre el grupo que consiste en Abutilon theophrasti, Amaranthus albus, Amaranthus chlorostachys, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amaranthus palmeri, Amaranthus rudis, Amaranthus spinosus, Amaranthus thunbergii, Ambrosia trifida, Ambrosia artemisiifolia, Chenopodium album, Commelina diffusa, Convolvulus arvensis, Conyza canadensis, Lolium multiflorum, Euphorbia heterophylla, Kochia scoparia, Sorghum halepense, y Digitaria sanguinalis; o
    (iii) dicha composicion comprende ademas dicho herbicida inhibidor de GS, o dicha composicion comprende dicho herbicida inhibidor de GS y uno o mas herbicidas simultaneos similares o diferentes de dicho herbicida inhibidor de GS.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho polinucleotido de ARNds tiene al menos 19 nucleotidos contiguos, al menos 20 nucleotidos contiguos, o al menos 21 nucleotidos de longitud, o dicha composicion comprende cualquier combinacion de dos o mas de dichos polinucleotidos de ARNds.
  4. 4. Una composicion que comprende un polinucleotido de ARNds y un agente de transferencia, en la que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS, en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21,23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de una planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual dicha planta tratada con dicha composicion tiene su crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimido o retrasado o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
  5. 5. La composicion de la reivindicacion 4, en la que
    (i) dicho agente de transferencia es una composicion de organosilicona; o
    (ii) dicho polinucleotido de ARNds tiene al menos 19 nucleotidos contiguos, al menos 20 nucleotidos contiguos, o al menos 21 nucleotidos de longitud; o
    (iii) dicho polinucleotido de ARNds se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 60-389, 392529, 532-593, 596-689, 692-785, 790-859, 862-877, 880-991, 996-1069, 1072-1215, 1218-1241, 1244-1263, 1266-1297, y 1300-1443; o
    (iv) dicho polinucleotido de ARNds se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1444-2045; o
    (iv) dicha composicion comprende ademas dicho herbicida inhibidor de GS, preferentemente, dicho herbicida inhibidor de GS se selecciona entre el grupo que consiste en glufosinato de amonio y bilaphos, o dicha composicion comprende ademas un co-herbicida.
  6. 6. Un procedimiento para reducir la expresion de un gen GS en una planta que comprende: la aplicacion externa a dicha planta de una composicion que comprende un polinucleotido de ARNds y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen Gs, en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de dicha planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual se reduce dicha expresion de dicho gen GS, con respecto a una planta en la que no se aplico dicha composicion.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que
    (i) dicho agente de transferencia es una compuesto de organosilicona; o
    (ii) dicho polinucleotido de ARNds tiene al menos 19 nucleotidos contiguos, al menos 20 nucleotidos contiguos, o al menos 21 nucleotidos contiguos de longitud.
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  8. 8. Un casete de expresion microbiana que comprende un polinucleotido que tiene al menos 18 nucleotidos contiguos, al menos 19 nucleotidos contiguos, al menos 20 nucleotidos contiguos, o al menos 21 nucleotidos contiguos de longitud que son identicos o complementarios a al menos 18 nucleotidos contiguos de una secuencia del gen GS seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 2749, y 51-59.
  9. 9. Un procedimiento de preparar un polinucleotido de ARNds que comprende a) transformar dicho casete de expresion microbiana de la reivindicacion 8 en un microbio; b) hacer proliferar dicho microbio; y c) recuperar un polinucleotido de ARNds de dicho microbio.
  10. 10. Un procedimiento para identificar polinucleotidos de ARNds utiles para modular la expresion del gen GS cuando se trata externamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleotidos de ARNds que comprenden una region identica o complementaria de al menos 18 nucleotidos contiguos de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, y 51-59; b) tratar externamente dicha planta con una composicion que comprende uno o mas de dichos polinucleotidos de ARNds y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta, o un extracto vegetal de la misma para modular la expresion del gen GS, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de dicha planta para la permeacion por uno o mas de dichos polinucleotidos de ARNds, y d) dicha planta tratada con dicha composicion tiene su crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimido o retrasado, o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que
    (i) dicha planta se selecciona entre el grupo que consiste en Abutilon theophrasti, Amaranthus albus, Amaranthus
    chlorostachys, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amaranthus palmeri,
    Amaranthus rudis, Amaranthus spinosus, Amaranthus thunbergii, Ambrosia trifida, Ambrosia artemisiifolia,
    Chenopodium album, Commelina diffusa, Convolvulus arvensis, Conyza canadensis, Lolium multiflorum,
    Euphorbia heterophylla, Kochia scoparia, Sorghum halepense, y Digitaria sanguinalis; o
    (ii) dicha expresion del gen GS se reduce con respecto a una planta no tratada con dicha composicion; o
    (iii) dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
  12. 12. Una composicion agroqmmica que comprende una premezcla de un polinucleotido de ARNds, un herbicida inhibidor de GS, un co-herbicida, y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS, en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de una planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual dicha planta tratada con dicha composicion tiene un crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimida o retrasada, o dicha planta es mas sensible Said un herbicida inhibidor de dicha GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
  13. 13. La composicion agroqmmica de la reivindicacion 12, en la que dicho co-herbicida se selecciona entre el grupo que consiste en herbicidas de amida, herbicidas de arsenico, herbicidas de benzotiazol, herbicidas de benzoilciclohexanodiona, herbicidas de alquilsulfonato de benzofuranilo, herbicidas de ciclohexeno oxima, herbicidas de ciclopropilisoxazol, herbicidas de dicarboximida, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de dinitrofenol, herbicidas de difenil eter, herbicidas de ditiocarbamato, herbicidas de glicina, herbicidas halogenados alifaticos, herbicidas de imidazolinona, herbicidas inorganicos, herbicidas de nitrilo, herbicidas organofosforosos, herbicidas de oxadiazolona, herbicidas de oxazol, herbicidas de fenoxi, herbicidas de fenilendiamina, herbicidas de pirazol, herbicidas de piridazina, herbicidas de piridazinona, herbicidas de piridina, herbicidas de pirimidinadiamina, herbicidas depirimidiniloxibencilamina, herbicidas de amonio cuaternario, herbicidas de tiocarbamato, herbicidas de tiocarbonato, herbicidas de tiourea, herbicidas de tiazina, herbicidas de triazinona, herbicidas de tiazol, herbicidas de triazolona, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de uracilo, y herbicidas de urea.
  14. 14. Una composicion agroqmmica que comprende una premezcla de un polinucleotido de ARNds, un herbicida inhibidor de GS, un plaguicida, y un agente de transferencia, en el que dicho polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS, en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-4, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 17, 20, 21, 23, 27-49, 51-59, y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos del mismo, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de una planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, mediante lo cual, un campo de plantas de cultivo que necesita de control de malezas y plagas se trata con dicha composicion, y mediante lo cual dicha planta tratada con dicha composicion tiene un crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimida o retrasada, o dicha planta es mas sensible a dicho herbicida inhibidor de dicha GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
  15. 15. La composicion agroqmmica de la reivindicacion 14, en la que dicho pesticida se selecciona entre el grupo que consiste en insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes, semioqmmicos, repelentes, atrayentes, feromonas, estimulantes de la alimentacion, y bioplaguicidas.
    5 16. Una composicion que comprende un polinucleotido de ARNds y un agente de transferencia, en el que dicho
    polinucleotido de ARNds es identico o complementario de un transcrito de ARN de una secuencia del gen GS, en el que dicha secuencia del gen GS se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 2046 -2056 y un fragmento de polinucleotido de al menos 18 nucleotidos contiguos, en el que dicho agente de transferencia acondiciona la superficie de una planta para la permeacion de dicho polinucleotido de ARNds, y mediante lo cual 10 dicha planta tratada con dicha composicion tiene su crecimiento, desarrollo, o capacidad reproductora suprimido o retrasado o dicha planta es mas sensible a un herbicida inhibidor de GS como resultado de dicha composicion que comprende dicho polinucleotido de ARNds, con respecto a una planta no tratada con dicha composicion.
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