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ES2644220T5 - Lactic bacterium with modified galactokinase expression for texturizing food products by overexpression of exopolysaccharide - Google Patents

Lactic bacterium with modified galactokinase expression for texturizing food products by overexpression of exopolysaccharide Download PDF

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ES2644220T5
ES2644220T5 ES10751643T ES10751643T ES2644220T5 ES 2644220 T5 ES2644220 T5 ES 2644220T5 ES 10751643 T ES10751643 T ES 10751643T ES 10751643 T ES10751643 T ES 10751643T ES 2644220 T5 ES2644220 T5 ES 2644220T5
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Description

DESCRIPCIÓN
Bacteria láctica con expresión de galactoquinasa modificada para texturizar productos alimentarios por sobreexpresión de exopolisacáridos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a una célula bacteriana con propiedad texturizante, cultivos iniciadores que comprenden la célula y productos lácteos fermentados con el cultivo iniciador.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] La industria alimentaria usa numerosas bacterias, en particular bacterias lácticas, para mejorar el sabor y la textura de los alimentos, pero también para extender el tiempo de conservación de estos alimentos. En el caso de la industria láctea, las bacterias lácticas se usan intensivamente para provocar la acidificación de la leche (por fermentación) pero también para texturizar el producto al que se incorporan.
[0003] Entre las bacterias lácticas usadas en la industria alimentaria, se puede mencionar los génerosStreptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, PediococcusyBifidobacterium.Las bacterias lácticas de las especiesStreptococcus thermophilusse usan en gran parte solas o en combinación con otras bacterias para la producción de productos alimentarios, en particular productos fermentados. En particular se usan en la formulación de fermentos usados para la producción de leches fermentadas, por ejemplo,ñ yogures. Algunas de ellas desempeñan un papel dominante en el desarrollo de la textura del producto fermentado. Esta característica está estrechamente ligada a la producción de polisacáridos. Entre las cepas deStreptococcus thermophiluses posible distinguir cepas texturizantes y no texturizantes.
[0004] Para cumplir los requisitos de la industria, se ha vuelto necesario proponer nuevas cepas texturizantes de bacterias lácticas, en particular deStreptococcus thermophilus.
[0005] WO2007095958A1 divulga cepas deStreptococcus thermophiluscon propiedades texturizantes. En la figura 1 se puede observar que la cepa más texturizante CHCC8833 (DSM17876) tiene un valor de tensión de cizallamiento de alrededor de 59 Pa.
[0006] Robitaille itet al.,J Dairy Sci. 92: 477-482 (2009) divulga un estudio que muestra que es posible aumentar la producción de EPS por cepas deStreptococcus thermophilusfilantes o "ropy" a través de ingeniería genética mediante el aumento de la actividad de GalK, es decir, por transformación con un plásmido que sobreexpresa GalK. Se concluye que cuando tal cepa se usa en combinación conLactobacillus bulgaricuspara la producción de yogur, la sobreproducción de EPS de la cepa recombinante no es significativa. Robitaille itet al.,J Dairy Sci. 90(9):4051-4057 (2007) y Vaillancourtet al.,App Envir Microbiol. 70(8):4596-4603 (2004) también revelan la producción de derivados galactosa positivos deStreptococcus thermophiluspor transformación con un plásmido que sobreexpresa GalK deStrep. Salivarius.Las cepas modificadas o bien no mostraron un aumento significativo en la producción de EPS en la leche (Robitaille) o la producción de EPS no se analizó (Vaillancourt). De Vinet al.,Appl Environ Microbiol.
71(7):3659-3667 (2005) divulga un análisis molecular y bioquímico del fenotipo de galactosa de varias cepas deStreptococcus thermophilusde productos lácteos, entre otros de las secuencias de nucleótidos según se encuentran en la región intergénica galR-galK que incluye la región -10.
[0007] Por lo tanto, el problema que la invención propone resolver es proporcionar una cepa de bacteria láctica que tenga unas buenas propiedades de texturización de productos alimentarios, especialmente productos en los que la cepa texturizante de la bacteria láctica (tal comoStreptococcus thermophilus) se usa junto con una cepa de una especie deLactobacillus.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0008] Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que las bacterias ácido lácticas con mutaciones en el gen GalK (galactoquinasa) generan una viscosidad más alta en leche fermentada que la cepa (madre) de tipo salvaje, especialmente cuando se usan para la fermentación de leche junto con bacteriasLactobacillus.
[0009] Conforme a este hallazgo sorprendente, la presente invención se refiere a cepas de bacterias ácido lácticas supertexturizantes novedosas, tales como cepas de S.thermophilus,con mutaciones en el gen GalK, y un método para la producción de estas cepas, y para fermentar productos lácteos fabricados utilizando tales cepas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0010] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la fabricación de una bacteria ácido láctica (tal como una bacteria que genera una viscosidad más alta en leche fermentada en comparación con la cepa madre, o tal como una bacteria que genera una viscosidad en leche fermentada mayor de aproximadamente 70 Pa (por ejemplo, mayor de 71 o mayor de 73 Pa, medida como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C), que comprende:
a) Proporcionar una cepa bacteriana de ácido láctico como cepa madre;
b) introducir una mutación en el gen GalK de la cepa; y
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
[0011] De este modo, formas de realización del primer aspecto son:
- Un método para la fabricación de una bacteria ácido láctica que genera una viscosidad más alta en leche fermentada en comparación con la cepa madre (por ejemplo, medida como tensión de cizallamiento, tal como después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C) que comprende:
a) proporcionar una cepa bacteriana de ácido láctico como cepa madre;
b) introducir una mutación en el gen GalK de la cepa; y
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
- Un método para la fabricación de una bacteria ácido láctica que genera una viscosidad en leche fermentada mayor de aproximadamente 70 Pa (por ejemplo, medida como tensión de cizallamiento, tal como después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C) que comprende:
a) proporcionar una cepa bacteriana de ácido láctico como cepa madre;
b) introducir una mutación en el gen GalK de la cepa;
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
[0012] En formas de realización preferidas actualmente, la viscosidad se mide como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C, y/o como se mide en el ensayo descrito más adelante. De este modo, una forma de realización actualmente preferida del primer aspecto de la invención es un método para la fabricación de una bacteria ácido láctica que comprende:
a) proporcionar una cepa bacteriana de ácido láctico como cepa madre;
b) introducir una mutación en el gen GalK de la cepa;
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
[0013] El método de la invención puede comprender además una o más fase(s) seleccionada(s) del grupo consistente en:
c1) selección por cribado de una cepa mutante que genere textura, tal como una cepa que genere más textura que la cepa madre, o que aumente la viscosidad de un sustrato de leche; y
c2) selección por cribado de una cepa mutante con fenotipo Gal+, tal como actividad de degradación/fermentación de galactosa mejorada en comparación con la cepa madre.
[0014] La mutación se puede introducir en la región promotora del gen, tal como en la región -10 (la caja de Pribnow) del gen.
[0015] En una forma de realización interesante del método de la invención, la mutación produce la sustitución de una o ambas de C y G en la región de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TACGAT con un nucleótido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T.
[0016] La mutación puede suponer la sustitución de C de la región de tipo salvaje -10 (TACGAT) con un nucleótido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T.
[0017] En una forma de realización, la mutación resulta en la sustitución de C de la región de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TACGAT con T, y/o la mutación resulta en una región -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TATGAT, TATTAT o TACTAT.
[0018] La mutación se puede introducir usando técnicas de ingeniería genética, y/o usando mutagénesis, por ejemplo, por radiación o tratamiento con una sustancia química, opcionalmente seguida de un análisis del gen GalK para verificar la mutación en dicho gen GalK.
[0019] La bacteria (la cepa madre) se puede seleccionar de un género del grupo consistente enStreptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, PediococcusyBifidobacterium.Una bacteria interesante pertenece a la especieStreptococcus thermophilus.
[0020] También se describe una bacteria ácido láctica que se puede obtener mediante el método de la invención.
[0021] Asimismo, la invención se refiere a una bacteria ácido láctica que genera una viscosidad en leche fermentada mayor de aproximadamente 70 Pa (por ejemplo, mayor de 71 Pa o 73 Pa) medida como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una bacteria ácido láctica que lleva una mutación en la región -10 del gen GalK (en comparación con la región de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TACGAT), donde la mutación resulta en una región -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TATTAT (SEQ ID NO:3) o TACTAT (SEQ ID NO:4) y donde la bacteria ácido láctica se puede obtener mediante el método de la reivindicación 1, donde la bacteria ácido láctica genera una mayor viscosidad en la leche fermentada que la cepa madre medida como tensión de cizallamiento tras 12 horas de cultivo a 37 grados C, donde la cepa madre es CHCC6008, depositada en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) con el número de acceso DSM 18111. También se describe una bacteria ácido láctica que lleva una mutación en la región -10 del gen GalK, mutación que produce la sustitución de C en la región de tipo salvaje -10, que tiene la secuencia de nucleótidos TACGAT, con un nucleótido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T. La mutación puede suponer la sustitución de C en la región de tipo salvaje -10, que tiene la secuencia de nucleótidos TACGAT, con T.
[0022] En una forma de realización interesante, una bacteria ácido láctica de la invención comprende la SEQ ID NO:5, o la región promotora de la misma, incluyendo la región -35 y la región -10. La bacteria ácido láctica pertenece preferiblemente a la especieStreptococcus thermophilus.
[0023] En otra forma de realización, la invención se refiere a una cepa bacteriana de la especieStreptococcus thermophilus,seleccionada del grupo consistente en: CHCC11379 (Dsm 22884), CHCC11342 (DSM 22932) y CHCC11976 (DSM 22934). También se describen todas las cepas nuevas que se mencionan aquí, al igual que sus mutantes.
[0024] En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende bacterias ácido lácticas de la invención, tales como bacterias de la cepa CHCC11379 (DSM 22884). Se prefiere que tal composición comprenda al menos 10exp10 UFC (unidades formadoras de colonias) de dichas bacterias.
[0025] La composición puede comprender, o bien como una mezcla o como un conjunto de elementos,
- una cepa de una especie deLactobacillus,tal como una cepa deL. BulgaricusoL. Fermentum;y
- una cepa de una bacteria ácido láctica de la invención, tal como una cepa que pertenece a la especieStreptococcus thermophilus.
[0026] Ahora se prefiere que la cepa que pertenece a una especie deLactobacillussea una cepa de un polisacárido (tal como un heteropolisacárido, homopolisacárido) y/o una enzima fructosiltransferasa que produce especies deLactobacillus.
[0027] La composición puede comprender al menos 10exp10 UFC (unidades formadoras de colonias) de una cepa que pertenece a una especie deLactobacillus;y al menos 10exp10 UFC de una cepa de la especieStreptococcus thermophilus.
[0028] La composición preferiblemente se puede utilizar como cultivo iniciador, y está en forma congelada, liofilizada o líquida.
[0029] En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de un producto lácteo/derivado de leche fermentado, que comprende fermentar un sustrato de leche (tal como leche de vaca) con una bacteria ácido láctica, una cepa, o una composición de la invención.
[0030] El método puede comprender además fermentar el sustrato de leche con una cepa que pertenece a una especie deLactobacillus,tal como una cepa deL. Bulgaricuso L.Fermentum,por ejemplo, una cepa seleccionada del grupo consistente en LB18, CHCC10019 (DSM19252), CHCC2008 (DSM22584) o CHCC3984 (DSM19251). También se describen mutantes y variantes de cualquiera de estas cepas.
[0031] El sustrato de leche se puede fermentar con una cepa o bacteria de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, tal como una cepa perteneciente a la especieStreptococcus thermophilusantes, durante o después de la fermentación con una cepa perteneciente a una especie deLactobacillus.
[0032] El método puede comprender añadir una enzima al sustrato de leche antes, durante y/o después de la fermentación, tal como una enzima seleccionada del grupo consistente en: una enzima capaz de entrecruzar proteínas, transglutaminasa, una proteasa aspártica, quimosina y cuajo.
[0033] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto lácteo, tal como un producto lácteo fermentado (por ejemplo, yogur o suero de mantequilla) o un queso (por ejemplo, queso fresco o pasta hilada), obtenible mediante el método de la invención. El producto lácteo fermentado puede ser, por ejemplo, un producto de tipo batido o un producto de tipo firme.
[0034] El producto lácteo puede comprender opcionalmente un ingrediente seleccionado del grupo consistente en: un concentrado de fruta, un jarabe, un cultivo bacteriano probiótico, un agente de coloración, un agente espesante, un agente aromatizante y un agente conservante; y/o que opcionalmente está en forma de un producto de tipo batido, un producto de tipo firme o un producto bebible.
[0035] La invención también se refiere a un producto lácteo, que se fabrica fermentando un sustrato de leche (tal como leche de vaca) con una bacteria ácido láctica de la invención (por ejemplo, una cepa de la especieStreptococcus thermophilus,tal como DSM 22884) y una bacteria ácido láctica de una especie seleccionada deLactobacillus bulgaricusyLactobacillus fermentum(tal como CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251) y CHCC2008 (DSM22584)).
[0036] Un producto lácteo interesante de la invención tiene una viscosidad superior a 100 Pa (por ejemplo, superior a 102 o superior a 104 Pa), medida como tensión de cizallamiento, por ejemplo, después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C. En una forma de realización preferida actualmente, la viscosidad superior a 100 Pa se obtiene solo por el crecimiento de las células bacterianas, pero se pueden obtener valores de viscosidad más altos mediante la adición de compuestos químicos, tales como gelatina, una carragenina, etc.
DEFINICIONES
[0037] Como se utiliza en este caso, el término "bacteria ácido láctica" designa una bacteria grampositiva microaerofílica o anaeróbica que fermenta azúcares con la producción de ácidos incluyendo ácido láctico como el ácido predominantemente producido, ácido acético y ácido propiónico. Las bacterias ácido lácticas más útiles desde el punto de vista industrial se encuentran en el orden "Lactobacillales", que incluyeLactococcus, spp.Streptococcus, spp.Lactobacillusspp.,Leuconostocspp.,Pseudoleuconostocspp.,Pediococcusspp.,Brevibacterium,spp.Enterococcusspp. yPropionibacteriumspp. Adicionalmente, las bacterias productoras de ácido láctico del grupo de las bacterias anaeróbicas estrictas, las bifidobacterias, por ejemplo, Bifidobacterium spp., generalmente se incluyen en el grupo de las bacterias ácido lácticas. Estas se usan frecuentemente como cultivos alimentarios solas o en combinación con otras bacterias ácido lácticas. Las bacterias ácido lácticas, incluyendo bacterias de las especiesLactobacillusspp. yStreptococcus thermophilus,normalmente se suministran a la industria láctea o bien como cultivos congelados o liofilizados para la propagación de iniciadores a granel o como cultivos denominados "Direct Vat Set" (SVD), destinados a la inoculación directa en una cuba de fermentación o tina para la producción de un producto lácteo, tal como un producto de leche fermentado. A tales cultivos en general se les denomina "cultivos iniciadores" o "iniciadores".
[0038] El término "leche" se debe entender como la secreción láctea obtenida por el ordeño de cualquier mamífero, tal como vacas, ovejas, cabras, búfalas o camellas. En una forma de realización preferida, la leche es leche de vaca. El término leche también incluye soluciones de proteína/grasa obtenidas a partir de materiales vegetales, por ejemplo, leche de soja.
[0039] El término "sustrato de leche" puede ser cualquier material de leche crudo y/o procesado que se pueda someter a fermentación según el método de la invención. De este modo, los sustratos de leche útiles incluyen, pero de forma no limitativa, soluciones/suspensiones de cualquier leche o productos lácteos que comprenden proteínas, tales como leche de grasa entera o leche con bajo contenido en grasa, leche desnatada, suero de mantequilla, leche en polvo reconstituida, leche condensada, leche seca, suero de leche, permeato de suero de leche, lactosa, líquido madre de cristalización de lactosa, concentrado de proteína de suero de leche, o nata. Obviamente, el sustrato de leche puede proceder de cualquier mamífero, por ejemplo, leche de mamífero sustancialmente pura, o leche en polvo reconstituida.
[0040] Antes de la fermentación, el sustrato de leche se puede homogeneizar y pasteurizar según métodos conocidos en la técnica.
[0041] "Homogenización" como se utiliza en este caso significa una mezcla intensiva para obtener una suspensión o emulsión soluble. Si la homogeneización se realiza antes de la fermentación, se puede realizar para descomponer la grasa láctea en tamaños menores de modo que ya no se separe de la leche. Esto se puede lograr haciendo pasar la leche a través de unos pequeños orificios a alta presión.
[0042] "Pasteurizar" como se utiliza en este caso significa tratar el sustrato de leche para reducir o eliminar la presencia de organismos vivos, tales como microorganismos. Preferiblemente, la pasteurización se logra manteniendo una temperatura específica durante un periodo de tiempo específico. La temperatura específica normalmente se logra mediante calentamiento. La temperatura y la duración se pueden seleccionar de modo que maten o inactiven determinadas bacterias, tales como bacterias nocivas. Un paso de enfriamiento rápido se puede realizar a continuación.
[0043] "Fermentación" en los métodos de la presente invención significa la conversión de carbohidratos en alcoholes o ácidos mediante la acción de un microorganismo. Preferiblemente, la fermentación en los métodos de la invención comprende la conversión de lactosa en ácido láctico.
[0044] Los procesos de fermentación para ser usados en la producción de productos lácteos fermentados son conocidos y el experto en la técnica sabrá seleccionar las condiciones del proceso adecuadas, tales como temperatura, oxígeno, cantidad y características de los microorganismo(s) y tiempo de proceso. Obviamente, las condiciones de fermentación se seleccionan de modo que ayuden a lograr la presente invención, es decir, obtener un producto lácteo en forma sólida o líquida (producto lácteo fermentado).
[0045] El término "producto de tipo batido" se refiere específicamente a un producto lácteo fermentado que se somete un tratamiento mecánico después de la fermentación, dando como resultado una desestructuración y licuefacción de la cuajada formada en la fase de fermentación. El tratamiento mecánico se obtiene típica pero no exclusivamente por agitación, bombeo, filtrado u homogenización del gel, o mezclándolo con otros ingredientes. Los productos de tipo batido tienen típica pero no exclusivamente un contenido sólido no graso de leche del 9 al 15 %.
[0046] El término "producto de tipo firme" incluye un producto basado en leche al que se ha inoculado un cultivo iniciador, por ejemplo, un cultivo iniciador, y que se ha envasado tras el paso de inoculación y luego fermentado en el envase.
[0047] En el presente contexto, el término "mutante" debería entenderse como una cepa derivada de una cepa de la invención mediante, por ejemplo, ingeniería genética, radiación y/o tratamiento químico. Se prefiere que la mutante sea una mutante equivalente funcionalmente, por ejemplo, una mutante que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas (por ejemplo, con relación a la textura, tensión de cizallamiento, viscosidad, rigidez del gel, recubrimiento de la boca, sabor, post-acidificación, velocidad de acidificación, y/o robustez de fago), que la cepa madre. Según la invención, la mutante genera una viscosidad en la leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como la tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados. Dicha mutante forma parte de la presente invención. Especialmente, el término "mutante" se refiere a una cepa obtenida sometiendo a una cepa de la invención a cualquier tratamiento de mutagenización usado de forma convencional incluyendo un tratamiento con un mutágeno químico tal como etano metano sulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV o a una mutante originada de forma espontánea. Una mutante se puede someter a más tratamientos de mutagenización (un único tratamiento debería entenderse como una etapa de mutagenización seguida de una etapa de cribado/selección), pero actualmente se prefiere que no se realicen más de 20, o no más de 10, o no más de 5 tratamientos (o pasos de cribado/selección). En una mutante descrita, menos del 5 %, o menos del 1 % o incluso menos del 0,1 % de los nucleótidos en el genoma bacteriano se han cambiado por otro nucleótido, o eliminado, en comparación con la cepa madre. En el presente contexto, el término "variante" debería entenderse como una cepa que es funcionalmente equivalente a una cepa de la invención, por ejemplo, que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas, por ejemplo, con relación a la textura, tensión de cizallamiento, viscosidad, rigidez del gel, recubrimiento de la boca, sabor, post-acidificación, velocidad de acidificación, y/o robustez de fago). Tales variantes, que se puede identificar utilizando las técnicas de selección apropiadas, se describen en este documento.
[0048] En el presente contexto, la "textura" se mide como la tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C. Un ensayo para utilizar para realizar un análisis de la textura:
El día después de la incubación, la leche fermentada se puso a 13°C y se agitó suavemente con una varilla equipada con un disco perforado hasta que se logró la homogeneidad de la muestra. Las propiedades reológicas de la muestra se evaluaron en un reómetro (StressTech, Reologica Instruments, Suecia) equipado con un sistema de medición coaxial C25. La prueba de viscosimetría se hizo con índices de cizallamiento variables de 0,27 a 3001/s en 21 pasos. Los índices de cizallamiento se aumentaron y luego se redujeron y se registraron las curvas ascendentes y descendentes de tensión de cizallamiento y viscosidad aparente. El retraso y los tiempos de integración fueron 5 s y 10 s, respectivamente.
[0049] El uso de los términos "un/a" y "el/la/los/las" y referentes similares en el contexto de cuando se describe la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar teniendo en cuenta que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario de manera específica o el contexto lo contradiga claramente. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como términos abiertos (es decir, con el significado de "que incluye, pero no está limitado a") a menos que se especifique lo contrario. La enumeración de rangos de valores en este documento está meramente destinada a servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado decreciente dentro del rango, a menos que se indique lo contrario de manera explícita, y cada valor separado se incorpora a la especificación como si hubiera sido mencionado individualmente. Todos los métodos aquí descritos se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquier ejemplo y de todos los ejemplos, o de expresiones de ejemplificación (por ejemplo, "tal(es) como" ), proporcionados en este documento está destinado meramente a aclarar más la invención y no plantea una limitación del alcance de la invención a menos que se indique lo contrario. No se debe interpretar que ninguna expresión de la especificación indique que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.
LEYENDAS
[0050] La Figura 1 representa la tensión de cizallamiento de CHCC11379 medida con el reómetro StressTech. Los resultados muestran una textura mejorada (tensión de cizallamiento) en leche coagulada con CHCC11379 después de crecimiento durante una noche a 43 grados C. La textura se cuantificó mediante la evaluación de la tensión de cizallamiento medida en pascales (Pa) usando un reómetro StressTech como se describe en "Análisis de la textura en leche fermentada"
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Preparación de una mutante galactosa positiva de una cepa de Streptococcus
Aislamiento de la cepa fermentadora de galactosa
[0051] Se aislaron mutantes como la mutante fermentadora de galactosa de la cepade S. thermophilusCHCC6008 (=ST6008, DSM18111). Las células de CHCC6008 no se mutagenizaron con ningún compuesto mutagénico ni por luz UV antes del paso de aislamiento de mutantes. Las cepas aisladas, por lo tanto, se parecen a mutantes galactosa positivas espontáneas de CHCC6008.
[0052] Antes del aislamiento de las mutantes, CHCC6008 se sembró por estriado en placas de agar M17 con 2 % de galactosa (placas M17-gal). CHCC6008 no creció en la galactosa como única fuente de carbohidrato.
[0053] Después de una noche, los cultivos de CHCC6008 se colocaron en placas M17-gal y se pudieron aislar varias colonias después de dos días de crecimiento a 37°C. Varias mutantes se purificaron en placas M17-gal y se volvieron a evaluar en caldo M17 que contenía 2 % de galactosa como el único carbohidrato.
[0054] Mientras que CHCC6008 no disminuyó el pH del caldo M17-gal significativamente, CHCC11379, una de las mutantes purificadas, alcanzó un pH de 5.3 después de 10 horas a 37 °C, y por lo tanto se la consideró una mutante de CHCC6008 fermentadora de galactosa.
[0055] Las cepas CHCC11342 y CHCC11976 se aislaron de la misma manera.
Aislamiento de mutantes por ingeniería genética
[0056] Las mutantes galactosa positivas también pueden ser generadas por mutagénesis dirigida. Se utilizan oligonucleótidos que llevan el nucleótido mutado dentro de la caja promotora de galK -10 para amplificar un fragmento de ADN específico por PCR. El fragmento de PCR que lleva la mutación deseada se clona en un plásmido vector y se transforma en la cepa de S.thermophilusdeseada, y la mutación se integra en el cromosoma y se intercambia la región promotora de galK de tipo salvaje por recombinación. El aislamiento de cepas se realiza como se ha descrito antes.
Análisis de la textura en leche fermentada
[0057] El día después de la incubación, la leche fermentada se puso a 13°C y se agitó suavemente mediante una varilla equipada con un disco perforado hasta que se alcanzó la homogeneidad de la muestra. Las propiedades reológicas de la muestra se evaluaron en un reómetro (StressTech, Reologica Instruments, Suecia) equipado con un sistema de medición coaxial C25.
[0058] La prueba de viscosimetría se hizo con unos índices de cizallamiento variables de 0,27 a 3001/s en 21 pasos. Los índices de cizallamiento se aumentaron y se redujeron y se registraron las curvas ascendentes y descendentes de tensión de cizallamiento y viscosidad aparente.
[0059] Los tiempos de retraso e integración fueron 5 s y 10 s, respectivamente. Para posteriores análisis, se eligió una tensión de cizallamiento a 300 s-1. Los resultados del reómetro mostraron que CHCC11379 tenía una tensión de cizallamiento mejorada en un 10 % en comparación con CHCC6008 (valor de tensión de cizallamiento de 74,0 Pa (pascales) para CHCC11379 en comparación con 67,5 Pa para la cepa madre CHCC6008, véase Fig. 1).
Análisis de la textura en leche
[0060] En otro experimento se usó CHCC11379 como parte de un cultivo de yogur donde se cocultivaron cepas de S.thermophilusen leche desnatada a 43 °C junto con una cepa de la especieLactobacillus delbrueckiissp.Bulgaricus.Cuando la única diferencia en la producción de yogur fue el uso de CHCC11379 en vez de CHCC6008 de tipo salvaje, la tensión de cizallamiento también aumentó en un 10 % (105,0 Pa para el cultivo de yogur que contenía CHCC11379 en comparación con 94,7 Pa para el cultivo de yogur que contenía CHCC6008).
Secuenciación de la región promotora degalKde CHCC11379
[0061] Para revelar el tipo de mutación para la mutante gal positiva de CHCC11379 se secuenció el principio del gen galK (que codifica la galactoquinasa deS. thermophilus).
[0062] Para CHCC11379 se identificó una mutación en la región promotora de galK (véase a continuación). La mutación respectiva muy probablemente llevará a una actividad promotora más fuerte en comparación con la cepa madre 6008, lo que explica el fenotipo gal positivo observado. Esto se basa en el hecho de que la secuencia de consenso para la caja promotora-10 es "TATAAT", y de que una mutación en el nucleótido 3 de la caja (región) -10 para CHCC6008 ("TACGAT") lleva a una caja -10 con una similitud mayor a la secuencia de consenso en CHCC11379 ("TATGAT").
CH C C11379 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGi1TAlGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID N O :5 CHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID N O :6 A Y 704368 a a a a t a t t g a t t t t c c a t g t g a a a g g g g t t a c g a t t t c a g t a t a a a c a a a a a g a a t a a g t g a g a t a c a t c SEQ ID N O :7 C o n s e n s o AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC SEQ ID N O :8
- 35 - 10 RBS
[0063] Región promotora del gen galK de CHCC11379. La mutación puntual en el promotor de galK de CHCC11379 se indica con el código de color gris. La secuencia de galK de S.thermophilusST111 publicada (número de depósito Genbank. AY704368) se indica para comparación. -35: región promotora -35; -10: región promotora -10; RBS: sitio

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Método para la fabricación de una bacteria ácido láctica que comprende:
a) proporcionar una cepa bacteriana de ácido láctico como la cepa madre;
b) introducir una mutación en el gen GalK de la cepa; y
c) seleccionar por cribado una cepa mutante que genere una viscosidad más alta en leche fermentada en comparación con la cepa madre medida como tensión de cizallamiento después de 12 horas de crecimiento a 37 grados C.
2. Método según la reivindicación 1, donde la mutación produce la sustitución de una o ambas de C y G en la región de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TACGAT (SEQ ID NO:1) con un nucleótido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T.
3. Método según la reivindicación 2, donde la mutación resulta en una región -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TATGAT (SEQ ID NO:2), TATTAT (SEQ ID NO:3) o TACTAT (SEQ ID NO:4).
4. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bacteria pertenece a la especieStreptococcus thermophilus.
5. Bacteria ácido láctica que lleva una mutación en la región -10 del gen GalK, donde la mutación resulta en una región -10 que tiene la secuencia de nucleótidos TATTAT (SEQ ID NO:3) o TACTAT (SEQ ID NO:4) y donde la bacteria ácido láctica se puede obtener mediante el método de la reivindicación 1, donde la bacteria ácido láctica genera una mayor viscosidad en la leche fermentada que la cepa madre medida como tensión de cizallamiento tras 12 horas de cultivo a 37 grados C, donde la cepa madre es CHCC6008, depositada en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) con el número de acceso DSM 18111.
6. Cepa bacteriana de la especieStreptococcus thermophilus,seleccionada del grupo que consiste en: CHCC11379 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de depósito DSM 22884; CHCC11342 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de depósito DSM 22932, y CHCC11976 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de depósito DSM 22934.
7. Composición que comprende una bacteria ácido láctica según la reivindicación 5 o una cepa bacteriana según la reivindicación 6.
8. Composición que comprende, o bien como una mezcla o como un conjunto de elementos,
- una cepa de una bacteria ácido láctica según la reivindicación 5 o una cepa bacteriana según la reivindicación 6; y
- una cepa de una especie deLactobacillus.
9. Método para la producción de un producto lácteo/derivado de la leche, que comprende fermentar un sustrato de leche con una bacteria ácido láctica según la reivindicación 5, una cepa bacteriana según la reivindicación 6, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7-8.
10. Método según la reivindicación 9, donde dicha especie de Lactobacillus es una cepa de L. Bulgaricus oL. Fermentum,preferiblemente una cepa seleccionada del grupo consistente en LB18; CHCC10019 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de depósito DSM19252; CHCC2008 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de depósito DSM22584, o CHCC3984 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de depósito DSM19251.
11. Producto lácteo o producto de leche fermentado que comprende la bacteria ácido láctica según la reivindicación 5 o la cepa bacteriana según la reivindicación 6.
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