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ES2642683T3 - Aislamiento de ácidos nucleicos - Google Patents

Aislamiento de ácidos nucleicos Download PDF

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ES2642683T3
ES2642683T3 ES12782489.4T ES12782489T ES2642683T3 ES 2642683 T3 ES2642683 T3 ES 2642683T3 ES 12782489 T ES12782489 T ES 12782489T ES 2642683 T3 ES2642683 T3 ES 2642683T3
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Graham P. Lidgard
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William G. Weisburg
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II James P. LIGHT
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Description

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1. Procedimientos generales
En el presente documento se proporcionan procedimientos para aislar ADN, por ejemplo, a partir de una muestra de heces. Como se resume en la Figura 1, el procedimiento comprende homogeneizar una muestra (por ejemplo, una muestra de heces) en un tampón adecuado y preparar un sobrenadante a partir del homogenado. El sobrenadante se trata con una composición (por ejemplo, una polivinilpirrolidona (PVP) reticulada tal como polivinilpolipirrolidona (PVPP)) para eliminar los inhibidores y producir un sobrenadante clarificado. El ADN del sobrenadante clarificado se desnaturaliza, por ejemplo, añadiendo tiocianato de guanidina (GTC) y/o calentando la muestra. Después, un reactivo de captura de la diana, por ejemplo, una perla magnética a la que está unida un oligonucleótido complementario de la diana, se añade a lo anterior, y la solución se incuba en condiciones (por ejemplo, temperatura ambiente durante una hora) que favorecen la asociación (por ejemplo, mediante hibridación) de la diana con el reactivo de captura para producir un complejo diana:reactivo de captura. Tras aislar y eliminar el complejo diana:reactivo de captura (por ejemplo, mediante la aplicación de un campo magnético), la solución resultante se vuelve a calentar para desnaturalizar el ADN remanente de sobrenadante clarificado y se puede añadir otro reactivo de captura de la diana para aislar otra diana. El procedimiento se puede repetir, por ejemplo, al menos cuatro veces, para aislar tantas dianas como requiera el ensayo (por ejemplo, una extracción secuencial o en serie). Los complejos diana:reactivo de captura aislados en cada etapa de captura y aislamiento se lavan, y los ADN diana se eluyen usando un pequeño volumen de tampón adecuado para el análisis posterior.
2. Eliminación de inhibidores
La muestra puede ser una muestra de material que contiene impurezas que descomponen los ácidos nucleicos o inhiben las reacciones enzimáticas. En particular, dichas impurezas inhiben la actividad catalítica de las enzimas que interactúan con ácidos nucleicos, por ejemplo, nucleasas tales como endonucleasas de restricción, transcriptasas inversas, ácido nucleico polimerasas, ligasas, etc., especialmente las enzimas que se utilizan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), LCR (reacción en cadena de la ligasa), TMA (amplificación mediada por transcripción), NASBA (ampliación específica de bases del ácido nucleico), 3SR (replicación de secuencia automantenida), y similares.
2.1 PVP
En algunas realizaciones, los inhibidores de una muestra se eliminan por tratamiento con polivinilpirrolidona. La polivinilpirrolidona (PVP) es un polímero soluble en agua fabricado a partir del monómero N-vinilpirrolidona (véase la Figura 2). La polivinilpolipirrolidona (PVPP) es una modificación de la PVP fuertemente reticulada. La extensión de la reticulación varía y no existe umbral definido que establezca una división entre la PVP y la PVPP. Por consiguiente, el término PVP se usa en el presente documento para referirse a la PVP en diferentes estados de polimerización reticulada, incluidas las preparaciones de PVP que también se pueden conocer en la técnica como PVPP. Una propiedad importante, sin embargo, es que a medida que la extensión de la reticulación aumenta, el polímero se vuelve cada vez más insoluble en agua. Las formas reticuladas absorben agua, que da lugar a que el polímero se hinche. La síntesis y las propiedades físicas de la PVP y la PVPP son bien conocidas en la materia (por ejemplo, véase Haaf, Sanner, y Straub. Polymers of N-vinylpyrrolidone: synthesis, characterization, and uses. Polymer J. 17(1): 143(1985)).
La PVP se ha usado en muchas aplicaciones técnicas que incluyen su uso como expansor del plasma; como aglutinante en muchos comprimidos farmacéuticos; como adhesivo en barras de pegamento y comidas calientes; como aditivo para baterías, cerámica, fibra de vidrio, tintas, papel para impresoras de chorro de tinta y en los procedimientos quimicomecánicos de alisamiento de superficies; como emulsionante y disgregante para la polimerización en solución; como fotorresistente; para la producción de membranas, tales como filtros de diálisis y para la purificación de aguas; como agente espesante en geles de blanqueamiento dental, etc.
La PVP también ha encontrado utilidad en la unión de impurezas y su eliminación de las soluciones, especialmente en la fabricación de vino y de cerveza para eliminar los polifenoles (véase, por ejemplo, Redmanji, Gopal, y Mola. A novel stabilization of beer with Polyclar Brewbrite. MBAA TQ 39(1): 24 (2002)). El uso de formas solubles e insolubles de la PVP se ha descrito con respecto al procesamiento de muestras biológicas, por ejemplo, como forma de neutralizar fenoles (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 7.005.266; Shames, y col. Identification of widespread Helicobacter hepaticus infection in feces in commercial mouse colonies by culture and PCR assay. J. Clin. Microbiol. 33(11): 2968 (1995); Morgan y col. Comparison of PCR and microscopy for detection of Cryptosporidium parvum in human fecal specimens: Clinical trial. J. Clin. Microbiol. 36(4): 995 (1998)).
La PVP se proporciona en formas que permitan su introducción en una muestra que se va a procesar, por ejemplo, en forma de polvo, suspensión acuosa, suspensión, en gránulos, y similares. En algunas realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, la PVP se proporciona premedida en una forma lista para el uso. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la PVP se comprime en un comprimido que comprende la masa de PVP apropiada para tratar una muestra. Se proporcionan diferentes formas y tamaños de comprimidos para diferentes volúmenes y tipos de muestras. Se pueden a los comprimidos aglutinantes inertes, cargas, y otras composiciones, para proporcionar la estabilidad física, térmica, química y biológica, o para proporcionar otras características deseadas tales como la dispersión mejorada dentro de la muestra o la liberación controlada.
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Microparticle Localization Device"). En algunas configuraciones, los imanes del dispositivo están dispuestos alrededor de un orificio en el que se introduce un tubo de muestra (por ejemplo, un tubo cónico de 50 mililitros), de forma que producen un flujo magnético en la muestra. El flujo magnético consigue el movimiento de las partículas magnéticas de la solución de forma que se agregan, concentran y/o aíslan en una zona del tubo que facilita su retirada para recuperar el ADN diana (Light, supra).
Se ha demostrado que dichos dispositivos son especialmente eficaces para la localización de partículas magnéticas en muestras grandes y viscosas (por ejemplo, muestras de heces) y por tanto son útiles para el aislamiento de ADN a partir de este tipo de muestras (Light, supra). Por ejemplo, las Figuras 11A y 11B muestran el efecto de la viscosidad de la muestra sobre el aclaramiento de las perlas magnéticas de soluciones de 1 o 25 centipoise de viscosidad usando tecnología magnética convencional (11A) o la tecnología de localización magnética de Light y Miller (11B) (Light, supra). En los gráficos mostrados, una disminución en la absorbancia indica una menor concentración de micropartículas suspendidas en una solución. Los datos recogidos de las soluciones de 25 centipoise se muestran con cuadrados (■) y los datos recogidos para la solución de 1 centipoise se muestran con rombos (♦). Estos gráficos muestran que el aumento de viscosidad ralentiza la separación de manera muy importante cuando se utiliza tecnología convencional, mientras que el dispositivo de localización de partículas magnéticas de Light y Miller aclara la solución más viscosa con solamente una pequeña reducción en la velocidad.
Las químicas y procedimientos anteriormente descritos, cuando se usan en combinación, proporcionan un sistema para el aislamiento de ácidos nucleicos de muestras complejas e inhibidoras, tales como muestras de heces, que es significativamente más rápido que los procedimientos utilizados previamente. Por otra parte, el sistema produce preparaciones de ácido nucleico que están sustancialmente más exentas de sustancias inhibidoras y dan como resultado un mayor rendimiento del ácido nucleico diana para, por ejemplo, ensayo diagnóstico. Además, las realizaciones de este sistema se integran fácilmente en el flujo de trabajo del laboratorio para procesar eficazmente las muestras para su uso en cualquier análisis o tecnología de detección posterior. Una comparación del flujos de trabajo, línea de tiempo y rendimientos del procedimiento de una realización del presente sistema y un sistema convencional ilustrativo se muestra en la Figura 14.
4. Kits
Se contempla que se proporcionen realizaciones de esta tecnología en la forma de un kit. Los kits comprenden realizaciones de las composiciones, dispositivos, aparatos, etc. descritos en el presente documento, e instrucciones para el uso del kit. Dichas instrucciones describen procedimientos adecuados para preparar un analito a partir de una muestra, por ejemplo, para recoger una muestra y preparar un ácido nucleico a partir de la muestra. Los componentes individuales del kit se envasan en recipientes y envases adecuados (por ejemplo, viales, cajas, envases blíster, ampollas, botellas, frascos, tubos y similares) y los componentes se envasan juntos en un envase adecuado (por ejemplo, una caja o cajas) para almacenamiento cómodo, su envío, y/o su uso por el usuario del kit. Se entiende que los componentes líquidos (por ejemplo, un tampón) se pueden proporcionar en forma liofilizada a reconstituir por el usuario. Los kits pueden incluir un control o de referencia para su evaluación, validación y/o garantía del comportamiento del kit. Por ejemplo, un kit para analizar la cantidad de un ácido nucleico presente en una muestra puede incluir un control que comprende una concentración conocida de la misma o de otro ácido nucleico para comparación y, en algunas realizaciones, un agente de detección (por ejemplo, un cebador) específico del ácido nucleico del control. Los kits son adecuados para su uso en un escenario clínico y, en algunas realizaciones, para su uso en el domicilio del usuario. Los componentes de un kit, en algunas realizaciones, proporcionan las funcionalidades de un sistema para preparar una solución de ácido nucleico a partir de una muestra. En algunas realizaciones, el usuario proporciona determinados componentes del sistema.
Ejemplos
Ejemplo 1
Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, se demostró que la PVP (por ejemplo, PVPP) elimina los inhibidores de la PCR de una muestra de heces (véase la Figura 9). Se tomaron volúmenes de 20 mililitros de los sobrenadantes de dos muestras diferentes de sobrenadantes de heces. Para cada muestra de heces, una alícuota se trató con PVP y la otra se dejó sin tratar. Por otra parte, las muestras se procesaron de forma idéntica para capturar dos ácidos nucleicos diana diferentes (Figura 9, Gen A y Gen V). Tras la captura y elución final, se controlaron las recuperaciones de las dos dianas mediante un ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) SYBR Green usando 1 microlitro de eluato en un volumen de reacción de 25 microlitros. Para ambas dianas procedentes de ambos sobrenadantes de heces, las alícuotas tratadas con PVP se amplificaron mientras que las alícuotas no tratadas no produjeron ninguna señal qPCR. Estos resultados demuestran la necesidad y la eficacia de la PVP como tratamiento de eliminación de inhibidores cuando se extrae ADN de muestras de heces para su análisis de un ensayo de PCR cuantitativa.
Ejemplo 2
Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, se recopilaron datos que demuestran que la filtración con centrifugación mejora la eliminación de inhibidores de la PCR. El
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