CN102301000B - 核酸分子扩增反应的分析组分及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于扩增反应（如，PCR）及检测方法（如，酶切试验）的系统、方法及试剂盒，该检测方法采用具有相对较短（如，6-12个碱基）的分析物特征区的酶足迹探针，以提供优选足迹长度的双链，与特殊的核酸核酸修饰酶一起使用。一些实施例中，该试验用于目标物的定量，在其它实施例中，该试验用于基因分型。在某些实施例中，该较短探针可用于扩大的瞬时动态范围试验中。

Description

核酸分子扩增反应的分析组分及方法

技术领域

本申请要求2008年3月15日提交的美国临时申请系列号61/036,953的优先权，其通过参考并入本文。

本发明提供了用于扩增反应的系统、方法及试剂盒及其检测方法（如，酶切试验），该检测方法采用具有相对较短（如，6-12个碱基）的分析物特征区（“ASR”）的探针，以提供最小量的可被核酸修饰酶（如，FEN-1核酸内切酶）所识别的双链。一些实施例中，该方法被用于目标物的定量，在其它实施例中，该方法被用于基因分型。在某些实施例中，这种短探针的使用使得方法具有增强的动态范围。

背景技术

核酸定量在生物和医药领域发挥着重要作用。例如，核酸定量在癌症诊断、预后诊断、病毒诊断及治疗效果的判断（如，对HCV和HIV）中是非常重要的。HCV RNA定量对使用IFN的病人是重要的。IFN治疗的效果可通过监测IFN治疗期间病毒数量直接得出。这样可根据每个病人的临床状况进行更有效的IFN治疗。未来，目标核酸的定量将在疾病的诊断中起到重要作用。例如，由外源刺激引起的病例中，可通过测量响应外源刺激的mRNA的表达水平进行更有效的早期诊断。

聚合酶链式反应可用于核酸定量。不过，采用PCR时，在扩增开始后，扩增核酸的绝对含量并不能精确反应目标核酸的含量。首先，PCR扩增产物的含量在每个循环中一般以对数规律增加，不过当扩增产物的含量超过某一水平时，其扩增速率开始下降，然后停止。因此，反应开始后，其扩增产物的最终含量即为恒定的，与目标核酸的含量无关。此现象被称为平台效应，在定量采用PCR扩增的产物应当考虑此效应。

一种称为“实时”PCR的技术被广泛应用于目标序列的定量（如，Bustin, Joumal of Molecular Endocrinology (2000) 25, 169-193; Bustin和Nolan, Joumal of Biomolecular Techniques 15:155-166; ABI "Essentials of Real Time PCR" Part Number 4371089 Revision A; ABI Primer Express Software 3.0 "Getting Started Guide" Part Number 4362460 Rev. B, January 2005）。该技术中，首先要准备每个扩增目标的校准曲线。准备一系列目标核酸的稀释液，每个样本进行PCR，产物的积累被实时，如在扩增过程中检测，一般检测与扩增物料的含量成比例积累的信号（如荧光）。循环阈值（Ct值）为最先检测到扩增产物特征信号超过本底荧光或“基线”的循环数。以系列中不同稀释液的Ct值作为纵坐标，以每个稀释液中目标核酸的起始拷贝数为横坐标，绘制目标物质的校准曲线。将未知样本（如疑似包含未知含量的同一目标物质的样本）在同一条件下进行PCR，检测其未知的Ct值。然后利用该目标物质的校准曲线计算出未知样本的起始拷贝数。

常规采用是均一荧光报告方法有两种。“非特异性”检测表明扩增产物的积累，但对准确的或预定的扩增子没有特异性，而“特异性”检测方法则随特定产物的积累而变化。非特异性检测中是使用嵌入染料如溴化乙锭或SYBR绿，它们可与PCR反应中产生的任意双链DNA结合并发出增强的荧光。采用染料嵌入方法的优势包括1）染料可用于监测任意双链DNA序列的扩增，以及2）不需要探针，这样可减少实验步骤及运行成本。

采用嵌入染料作为反应报告方式的基本缺点在于会产生假阳性信号；例如，由于染料与任意双链DNA的结合，没有序列选择性，它们在非特异性双链DNA存在时也会给出信号。非特异性的DNA包括杂质DNA、“引物二聚体”伪迹（artifact）DNA，或者任何其它的可在反应中利用反应中提供的引物扩增的非预期目标DNA。

除了非特异性，嵌入染料甚至能够准确地定量更为复杂的目标，因为信号的数量依赖于扩增反应中生成的双链DNA的质量，而不是产物的拷贝数。更长链的扩增产物具有更大的质量并能结合更多的染料分子，因此产生的信号比同样数目、链长更短的拷贝产物的要多。相反，采用荧光探针时，单个荧光团产生于每个扩增分子拷贝的淬灭，而与扩增子的长度无关。

模板或目标特异性分析通常需要给每个PCR试验设计并合成一个或更多的定制荧光探针。由于引物序列正确及不正确的并入相似的扩增产物中，探针一般设计为与引物之间的目标序列的区域杂交，这样成功的探针杂交保证预定的目标序列被扩增。大部分报导系统中使用荧光共振能量转移（FRET）或类似的供体与淬灭基团分子间的交互作用作为检测基础。一般，荧光信号仅在扩增子特异性探针与其互补目标杂交后才会产生。一般实施例中如TAQMAN和其它5′端核酸酶检测方法中，5′端核酸酶剪切杂交的探针，以将荧光团从淬灭分子上分离出来。尽管一些反应方案中，探针不被剪切，但是在准确目标存在时改变结构。这样探针结构的改变将荧光团从淬灭分子上分离出来，使得荧光增加，从而表明特定目标扩增成功。

特征反应在非特异性扩增中是有利的，如由于错配（mispriming）或引物二聚体伪迹，不会产生信号，从而被荧光检测器忽略。这可避免PCR后使用 Sourthern印迹杂交、序列分析或熔点曲线来确认扩增子的特性。另一个优于嵌入染料之处在于探针可标识不同的、可区分的报告染料，这使得可检测出单一PCR反应中的几个不同序列的（多元的）扩增产物。基于探针的特征检测化学反应的一个缺点是需要针对每个不同待测序列合成不同的探针。（ABI "Essentials ofReal Time PCR" Part Number 4371089 Revision A）。不同的定制探针要用昂贵的染料、淬灭基以及选择性的小沟结合物标记，给基于探针的扩增子特性实时PCR分析增加了可观的额外费用。另一个缺点是难以区分紧密相关的序列。采用PCR和酶解探针区分等位基因一般会发生引物与“错误的”目标杂交具有错配的3′端（如，一引物准备扩增一等位基因，但是却与另一个非目标扩增的等位基因杂交了），这样该等位基因的扩增被阻碍了，或者用于退火的酶解探针可惜的用在了非预定等位基因上。两种方法都提供了不准确地区分，因为引物延伸和探针酶切两者甚至可在错配存在时发生。

基于上述观点，需要一种相对简单、便宜的目标特异性实时核酸定量类似方法。

发明内容

一些实施例中，本发明提供了感兴趣的目标核酸的分析检查技术。如这里所述的，该检测技术包括实时检测功能，如果需要，可进行定量或半定量。本发明提供了系统、组分（如，试剂盒、反应混合物及类似物）以及方法。该系统、组分及方法可与其它已知技术或未来开发的技术相结合。在一些实施例中，本发明提供了包括使用足迹探针的检测系统，其中足迹探针提供了使用检测酶的检测中需要的，例如，最小结构（如，双螺旋）。

在一些实施例中，本发明提供了一分析目标核酸的方法，包括选择一5′端核酸酶，其中该5′端核酸酶可识别包括一核酸双链的结构，确定5′端核酸酶的足迹双链长度，在合成足迹探针及该5′端核酸酶的存在的条件下扩增目标核酸，这样合成足迹探针在目标扩增反应中剪切以产生酶切片段，其中该合成足迹探针包括分析物特征部分和非目标部分，该非目标部分基本上不与所述目标核酸互补，并且该分析物特征部分与所述目标核酸形成一探针-目标双链，该双链不不长于5′端核酸酶的足迹双链的长度。优选实施例中，该方法进一步包括在扩增反应中进一步检测酶切片段。特别优选的实施例中，目标扩增反应为聚合酶链式反应。优选实施例中，该5′端核酸酶选自由天然FEN-1核酸内切酶、改性FEN-1核酸内切酶，以及含有至少一种FEN-1核酸内切酶的至少一部分的嵌合蛋白质构成的组群。

在一些实施例中，本发明提供了一分析目标核酸的方法，包括：a）在合成探针及FEN-1核酸内切酶存在的条件下扩增目标核酸，这样合成探针在目标扩增反应中被剪切并产生酶切片段；其中该合成探针为FEN-1核酸内切酶的足迹探针，该足迹探针包括分析物特征部分和非目标部分，其中该非目标部分基本上不与所述目标核酸互补，并且若扩增反应为等温反应，该足迹探针分析物特征部分与目标的计算T_m值至少低于所述等温反应进行的温度5℃，优选8℃，更优选10℃，或实施例中的扩增反应为热循环反应时，该足迹探针分析物特征部分有一利用所述目标计算的T_m，该温度至少低于进行所述热循环温度5℃，优选8℃，更优选10℃，并且其中该足迹探针不包括小沟结合物部分。优选实施例中，该方法进一步包括所述扩增反应中酶切片段的检测。

在特别优选的实施例中，本发明提出的方法包括核酸扩增方法及检测方法，其中至少一种扩增方法或检测方法包括采用具有12个或更少的核苷酸分析物特征区的足迹探针，以及进一步包括采用5′端核酸酶（如，古核生物或真核生物的FEN-1核酸酶，或病毒或真菌DNA聚合酶的5′端核酸酶）。一些实施例中，足迹探针的ASR包括12个能完全与目标核酸互补的核苷酸，而一些实施例中，探针的ASR包括12个核苷酸，其中一个或多个并不与目标核酸链中的核苷酸互补。

一些实施例中，本发明提出了分析目标核酸的方法，包括：a）在合成足迹探针及该条件下的5′端核酸酶的存在下扩增目标核酸，这样合成的足迹探针在目标扩增反应中剪切并产生酶切片段；其中探针包括分析物特征部分，如，目标结合区和非目标部分，其中该非目标部分基本与目标核酸不能互补，目标结合部分包括不超过12个能与目标核酸互补的核苷酸；b）在所述扩增区检测酶切片段。一些实施例中，该探针为一合成探针。一些实施例中，该核酸内切酶为FEN-1核酸内切酶（如，热稳定的核酸内切酶，包括但不限于古细菌的FEN-1核酸内切酶）。

只要不脱离进行的分析本质，该方法不局限此。一些实施例中，该分析包括通过检测扩增反应中酶切片段来检测目标核酸的存在。一些实施例中，该分析包括鉴别目标核酸中多态现象的存在（如，单核苷酸多态现象、缺失、插入、重复序列等）。一些实施例中，该分析方法包括鉴定衍生出该目标核酸的生物特性。例如，一些实施例中，该生物在界、门、纲、目、科、属、种、亚种或个别分类的水平上鉴别。一些实施例中，该分析方法包括检测该目标核酸的含量。一些实施例中，检测的数量为样本中初始含有的目标核酸量。

本发明不局限于目标核酸的来源或属性。一些实施例中，该目标核酸是从样本中分离出来的。本发明不局限于样本的属性。样本包括，但不局限于，细胞样本（如，来源于生物体、培养细胞、干细胞、癌细胞、病原体、单细胞生物）、组织样本、液态样本（如，血液、血清、血浆、尿液、唾液等等）、培养样本以及环境样本。目标核酸可来源于生物体，包括但不局限于，动物（如，哺乳动物如人）、植物、细菌、病毒和真菌。目标核酸可包括DNA或RNA或它们的组合物。目标核酸可包括天然核酸分子或合成核酸分子，或其混合物。一些实施例中，其中目标核酸为或包含有RNA，该RNA转换成DNA，如通过逆转录酶进行逆转录。目标核酸可包括其结构中一个或多个核苷酸或其他部分的共价或非共价改性。例如，一些实施例中，该目标核酸的一个或多个核苷酸甲基化，分析鉴定目标核酸中甲基化核苷酸的存在、程度或位置。

一些实施例中，扩增反应采用聚合酶链式反应，不过其他温度循环或等温扩增技术也可采用。很多扩增技术中使用聚合酶。一些实施例中，该聚合酶为热稳定的聚合酶。一些实施例中，该聚合酶缺少5′端到3′端外切核酸酶活性。很多扩增技术中采用一个或多个引物。相应地，一些实施例中，该方法中使用第一和第二引物寡核苷酸。另外如果需要，也可使用引物寡核苷酸。

一些实施例中，探针酶切通过形成酶切结构并剪切酶切结构完成。一些实施例中，酶切结构在探针剪切前形成，其中酶切结构形成于目标核酸与：a)位于目标核酸第一个区的探针；b）目标核酸第二个区相关的第二个寡核苷酸的结合，其中第二个区为沿目标核酸长度上第一个区的3′端。一些实施例中，目标核酸的第一个和第二个区是相邻的。一些实施例中，酶切结构中至少一个核苷酸位于第二个寡核苷酸的3′端，并与探针和目标核酸之间的杂交区域重叠。一些实施例中，酶切结构中的第二个寡核苷酸的3′端末端核苷酸不与目标核酸互补。一些实施例中，第二个寡核苷酸也为扩增步骤中使用的引物。

一些实施例中，酶切结构为下面一个或多个描述中的结构或使用了其中的反应物或与其近似：美国发明专利：7312033、7306917、7297780、7273696、7256020、7195871、7150982、7101672、7087381、7067643、7060436、7045289、7011944、6932943、6913881、6875572、6872816、6780982、6780585、6759226、6709819、6709815、6706471、6692917、6673616、6635463、6562611、6555357、6458535、6372424、6358691、6355437、6348314、6214545、6194149、6090606、6090543、6001567、5994069、5985557、5888780、5846717、5843669、5843654、5837450、5719028、5614402和5541311以及美国专利公布文件：20080015349、20080014124、20070292856、20070207455、20070202517、20070111200、20070087345、20070049745、20060252032、20060246475、20060240452、20060199202、20060183207、20060160074、20060147955、20060147938、20050277138、20050196750、20050186588、20050181435、20050164177、20050158716、20050130179、20050106596、20050074788、20050048527、20040219576、20040203035、20040096874、20040014067、20030219784、20030143535、20030134349、20030124526、20030113237、20030113236、20030104470、20030104378、20030092039、20030082544、20030072689、20020156255、20020142454和20020128465，其中每个均以整体作为参考引入本文。这些发明以及公布申请也描述了酶、设计、制造、检测系统及其它本方法中使用的组件、组分及发明系统。

一些实施例中，探针目标结合部分包括不超过11个（如，10、9、8、7、6等）与目标核酸互补的核苷酸。其它实施例中，该探针是未标记的。一些实施例中，该探针包括天然核苷酸。一些实施例中，该探针在其3′端有一阻止探针通过聚合酶延伸的部分。探针的非目标部分可设计为任意长度。一些实施例中，它可为一单核苷酸。其它实施例中，它可为两个或多个（如，3、4、5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，……，40，……，50，……等）长度的核苷酸。

一些实施例中，检测步骤使用一检测寡核苷酸。例如，一些实施例中，酶切片段的检测包括将一个或多个所述的酶切片段与合成检测寡核苷酸连接在一起。一些实施例中，该合成检测寡核苷酸有一互补区域，形成一发夹结构。一些实施例中，该合成检测寡核苷酸包括一标记（如，荧光标记）。一些实施例中，该合成检测寡核苷酸进一步包括一荧光淬灭部分。一些实施例中，以检测寡核苷酸为模板，剪切的片断（flap）通过检测其延伸而确定。一些实施例中，以检测寡核苷酸为模板，剪切的片断通过将其连接到另一个分子上进行检测。一些实施例中，剪切的片断与合成检测寡核苷酸连接起来时，形成一可被FEN-1核酸内切酶剪切的酶切结构。一些实施例中，该检测包括切开该酶切结构（包括合成检测寡核苷酸）以产生可检测的信号。

一些实施例中，未知目标核酸可与已知合成对照的目标核酸连接在一起用于分析，如，鉴定未知目标核酸的量。

本发明也提供了组分及系统，包括一个或多个实施这里描述的任一方法的有用或必备的组件。例如，一些实施例中，组分包括：a)目标核酸；b)扩增引物；c)聚合酶；d)FEN-1核酸内切酶；以及e)包括分析物特征部分和非目标部分的未标记合成探针，其中非目标部分基本不能与目标核酸互补，目标结合部分包括不超过12个与目标核酸互补的核苷酸。一些实施例中，组分为一反应混合物。一些实施例中，该组分为一试剂盒（如，包括一个或多个容器，每个包括一个或多个组件）。一些实施例中，本发明系统包括包括组分及一个或多个额外组件如样本提纯或加工试剂或设备、检测设备、对照软件以及数据分析系统。

一些实施例中，该组分包括：a)目标核酸；b)扩增引物；c)聚合酶；d)FEN-1核酸内切酶；以及e)包括分析物特征部分和非目标部分的未标记合成探针，其中非目标部分基本与目标核酸不能互补。本发明也提供了分析目标核酸的方法，包括：提供该组分、扩增反应中在探针和目标核酸之间形成酶切结构、使用FEN-1核酸内切酶剪切探针以产生包括探针非目标部分的酶切产物、检测该酶切产物。

附图说明

图1为本发明的一实施例的示意图，包括联合PCR及使用足迹探针进行侵入式酶切反应（invasive cleavage）；

图2A为一图表，显示了图1的试验方法的使用情况，足迹探针具有10到11个核苷酸的ASR（计算得到的T_m分别为34.2和36.2℃，采用最邻近模型（the nearest-neighbor）计算，公布的DNA双链形态参来自Allawi和SantaLucia的《生物化学》，36:10581（1997），以及SantaLucia，Proc Natl Acad Sci USA，95（4）：1460（1998）。图2A和2B中显示的试验方法，目标核酸在各独立反应中采用PCR扩增。聚合酶通过加热灭活，INVADER试验反应中使用等量PCR并缺少FRET盒，使用图示的侵入式酶切结构。该反应在指示温度（梯度温度循环中）下采用Pfu FEN-1核酸内切酶进行。然后合适的FRET盒被加入反应中，在INVADER试验起始反应中被剪切的探针数量通过测量FRET盒的酶切确定。这些数据表明由10或11个核苷酸构成的ASR探针在反应温度范围内具有相似的广义性能曲线，并且该相似的性能不依赖于反应温度。

图2B显示了根据图1的试验方法中的具有9个核苷酸（根据图2A中描述的方法计算得到的T_m为45.6℃）的足迹探针的性能。这些数据表明一包括9个核苷酸的ASR的探针也可以在一系列的反应温度下作用，并且其性能随反应温度的增加略有降低。但是并非将本发明现定于任何特别的反应机理，该探针比具有10个和11个核苷酸构成ASR探针的T_m要高的结论也表明了，性能随温度的升高而降低意味着该性能降低与酶使探针及探针的ASR稳定的能力降低有关。

图3显示了分析物特征区的计算T_m具有变化的足迹探针表。这些探针中没有包含双链稳定作用部分如MGB。显示的T_m是根据图2A中描述的方法计算得到的。图3中所示的每个探针在侵入式酶切反应中的反应温度为50℃（52℃下的测试显示了同样的结果），这证明可设计包括约12个核苷酸的ASR或少量寡核苷酸的足迹探针并且无需与反应温度相匹配。

图4比较了实时PCR+使用足迹探针（图块A）的侵入式酶切与TAQMAN试验（图块B）来检测miR 155 microRNA。数据显示在PCR+侵入式酶切试验中信号的积累更快，并且背景开始出现于无目标对照的TAQMAN试验中而不会出现在使用足迹探针的反应中。反应按例3中描述的进行。

图5显示了用于扩增和采用PCR+足迹探针侵入式酶切在Factor Ⅴ中进行SNP基因分型的寡核苷酸序列。

图6比较了使用图8中所示的设计的试验方法进行的PCR+侵入式酶切试验与使用TAQMAN试验进行相同等位基因的基因分型的结果。图6A-C显示了该PCR+侵入式酶切试验结果（如，例3中描述的进行），其中图6A显示了突变株Factor Ⅴ目标序列的检测曲线；图6B显示了野生株Factor Ⅴ目标序列的检测曲线；图6C显示了异源株Factor Ⅴ目标序列的检测曲线。图6D-F显示了TAQMAN试验结果，其中图6D显示了突变株Factor Ⅴ目标序列的扩增曲线；图6E显示了野生株Factor Ⅴ目标序列的扩增曲线；图6F显示了异源株Factor Ⅴ目标序列的扩增曲线。

图7比较了Factor Ⅴ基因中采用足迹探针侵入式酶切（如，例3中描述的进行）（7B）以及采用TAQMAN试验（7A）进行SNP检测的分布图。

图8A-8D比较了使用“INVADE加”方法结合PCR扩增进行单个碱基变化检测的结果，其中使用INVADER试验 (图块8A)进行扩增后检测，采用实时PCR+足迹探针侵入式酶切进行VZV的野生株或Oka突变株的检测（图块B和C、D，其中D为无目标对照）。

图9A-B显示了采用足迹探针进行人体miR-21 microRNA检测得到的结果（使用例3中所述的条件），其中一足迹探针ASR中含有12个互补核苷酸，其对比足迹探针包括12个核苷酸，其中1个核苷酸与目标不匹配，以及一ASR中仅有11个核苷酸的足迹探针。也测试了一具有11个互补核苷酸，并有2个不匹配的核苷酸（ASR中一共有13个核苷酸）。图块A显示了测试分子的示意图，图块B显示了具有600或6000个拷贝数的miR-21 RNA样本的数据。

图10A-B显示了采用足迹探针进行has-miR-17-3p microRNA检测得到的结果，其中一足迹探针ASR中包括11个互补核苷酸，其对比足迹探针包括11个核苷酸，其中1个核苷酸与目标不匹配，以及一ASR中仅有10个核苷酸的足迹探针（使用例3中所述的条件）。图块A显示了测试分子的示意图，图块B显示了具有6×106个拷贝数的has-miR-17-3p microRNA样本的数据。这些示例表明，当ASR均靠近FEN-1酶的最佳长度（如，11或12个核苷酸）时，其提供的检测信号最强，使用具有合适长度但含有错配序列的ASR探针提供的信号与使用小于最佳长度的ASR探针相比要强。

图11A显示了用于扩增和检测的人体miR-21目标的寡核苷酸序列；图11B显示而来用于扩增和检测的人体miR-155目标的寡核苷酸序列；图11C显示而来用于扩增和检测的人体miR-126目标的寡核苷酸序列；图11D显示而来用于扩增和检测的人体U6 snRNA目标的寡核苷酸序列；图11E显示而来用于扩增和检测的人体U24 snRNA目标的寡核苷酸序列。

图12显示了使用如图11所示的试验方案的结合PCR-侵入式酶切试验的结果，其中包括足迹探针的使用。每个目标的数据使用荧光对循环数进行绘图。对于每个目标，阈值设定为拷贝数对目标水平（参见每幅图的底部图块）的最大线性拟合。每个目标的结果显示在下面的图中：miR-155（图12A）；miR-21（图12B）；miR-126（图12C）；U6（图12D）；以及U24（图12E）。

图13A显示了用于扩增和检测U6 DNA目标的寡核苷酸序列；图13B显示了用于扩增和检测FactorⅤ DNA目标的寡核苷酸序列；图13C显示了用于扩增和检测FactorⅡ DNA目标的寡核苷酸序列；图13D显示了用于扩增和检测GA-21-R DNA目标的寡核苷酸序列；以及图13E显示了用于扩增和检测U6 RNA目标的寡核苷酸序列。

图14显示了采用例2中的结合PCR和侵入式酶切试验及足迹探针进行FactorⅡ检测的结果。图14A-B显示了侵入式寡核苷酸和Afu FEN-1酶二者存在的例2的结果，而图14C-D显示了侵入式寡核苷酸存在但Afu FEN-1酶不存在的结果。

图15显示了采用例2中的结合PCR和侵入式酶切试验及足迹探针进行FactorⅤ检测的结果。图15A-B显示了所有反应组分存在的例2的结果。图15C-D显示了侵入式寡核苷酸存在但Afu FEN-1酶不存在的结果。图15E-F显示了与图15C-D同样的结果，除了其y轴的最大值为10000而不是60000。

图16显示了采用例2中的结合PCR和侵入式酶切试验及足迹探针进行GA-21-R检测的结果。图16A-B显示了侵入式寡核苷酸和Afu FEN-1酶二者存在的该例的结果，而图16C-D显示了侵入式寡核苷酸存在但Afu FEN-1酶不存在的结果。

图17显示了采用例2中的结合PCR和侵入式酶切试验及足迹探针进行U6 RNA检测的结果。图17A-B显示了侵入式寡核苷酸和Afu FEN-1酶二者存在的例2的结果，而图17C-D显示了侵入式寡核苷酸存在但Afu FEN-1酶不存在的定义

为便于理解本发明，一系列术语和习语定义如下：

这里使用的术语“酶足迹探针”或“足迹探针”是指核酸探针，用于与，例如一目标核酸形成一结构，如双链，涉及到用于形成最小结构的选定探针，该探针对于选定的酶对该结构的响应水平是必须的。一些实施例中，为了最佳性能（如，识别、结合、酶切等）需要，足迹探针选择为最小结构，而一些实施例中，为了最佳性能需要，足迹探针选择为结构比最小结构要小的，其中该性能为，例如，限制性的、减少的，或者其它的在其应用中更严格的。

采用示例的方法并不将本发明限于任何特异性的核酸修饰酶，一特异性5′端核酸酶，如FEN-1核酸内切酶，可优选为在探针和目标链之间的至少有约12个碱基对的双链，用于最优化识别以及酶切探针退火为目标核酸。一般的，在不需要降低酶活性时，更长的探针-目标双链，不能提供任何进一步的活性增加（如，在结合中或FEN-1核酸内切酶的酶切活性）。一提供额外双链长度并不会增加该酶的活性的探针（如，采用FEN-1酶酶切的探针）一般处于这种酶的足迹探针的定义之外。例如，对于一当探针-目标双链至少为12个碱基对长时具有最大活性的FEN-1核酸内切酶，一探针提供更多的碱基对，如15或16，或更多的探针/目标双链碱基对，一般不会考虑做为该特异性酶的足迹探针。如果一不同的FEN-1核酸内切酶仅在该探针-目标双链至少为15个碱基对长时（如，来源于不同生物体，或修饰具有更大足迹，或在足迹来源于较小足迹的扩大的条件下使用的）具有最大活性，用于第二FEN-1的足迹探针可为一具有15个或更少核苷酸的ASR探针。

这里使用的术语“足迹双链长度”（footprint duplex length）指的是最小的双链长度，在反应条件下显示具有的、双链识别，核酸修饰酶，如FEN-1核酸内切酶完全活性。例如，如上所述，对于一当探针-目标双链具有至少12个碱基对长时具有最大活性的FEN-1核酸内切酶，该FEN-1酶的足迹双链长度为12个碱基对。一足迹探针一般提供的ASR为具有长度到达但不超过与探针一起使用的酶的足迹双链长度。

这里使用的，术语“动态范围”指的是在一检测方法（如，一核酸检测方法）中的有效定量范围。例如，一病毒检测方法的动态范围为在病毒颗粒的最小数目（如，拷贝数）和病毒颗粒的最大数目之间并且该试验能够分辨的范围。

这里使用的，术语“对象”和“病人”指的是任意生物体，包括植物、微生物和动物（如，哺乳动物如狗、猫、家畜，以及人类）。

术语“引物”指的是寡核苷酸，当被放置在引物延伸开始的条件下时，它能够作为合成开始的一个起点。一寡核苷酸“引物“可以自然产生，如在一纯化的限制性酶切消化中或可以通过合成生产。一些实施例中，一寡核苷酸引物与模板核酸一起使用，引物的延伸依赖于模板，这样就形成了模板的互补。

这里使用的术语“酶切结构”指的是至少一个探针寡核苷酸和目标核酸相互作用形成的结构，所形成的结构包括一个双链，最终结构可通过酶切工具，包括但不限定于酶进行酶切。该酶切结构是采用酶切试剂进行特异性酶切的底物，相对的核酸分子为采用试剂如磷酸二酯酶进行非特异性酶切的底物，其中酶切核酸分子不是指二级结构（如，不需要形成双链结构）。

这里使用的术语“侵入式酶切结构”指的是酶切结构包括ⅰ）一目标核酸，ⅱ）一上游核酸（如，一INVADER寡核苷酸），ⅲ）一下游核酸(如，一探针)，其中上游和下游核酸退火到目标核酸的连续区域，并且在上游核酸3′端部分形成重叠，在下游核酸和目标核酸之间形成双链。重叠发生在一个或多个来源于上游和下游核酸的碱基占据了与目标核酸相同位置的地方，无论上游核酸的重叠碱基是否与目标核酸互补，并且无论那些碱基为天然碱基或非天然碱基。一些实施例中，上游核酸3′端部分与下游双链的重叠为一非碱基化学部分如芳环结构，例如，在美国发明6090543中所公开的，该文整体作为参考文献引入本文中。一些实施例中，一个或多个核酸可以相互连接，如，通过共价键如茎-环，或通过非核酸化学键（如，多碳链）。

这里使用的术语“酶切工具”或“酶切试剂”指的是任意能够剪切酶切结构的工具，包括但不限于酶。“结构特异性核酸酶”或“结构特异性酶”为可识别核酸分子中特异性二级结构并能剪切这些结构的酶。在核酸分子中存在可应答的酶切结构时，本发明中的酶切试剂可将其剪切；该酶切试剂不需要剪切在酶切结构中的任意特异性位置酶切结构。

该酶切试剂可以包括多种具有核酸酶活性的源，包括来自Third Wave Technologies,Inc.的CLEAVASE酶（Madison，WI），FEN-1核酸内切酶（包括RAD2和XPG蛋白质，以及天然的或修饰的FEN-1酶或包括至少一个或多个FEN-1酶的嵌合酶），以及包括5′端核酸酶活性的酶，如真菌PolA聚合酶包括但不限于Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶以及E.coli DNA聚合酶Ⅰ。该酶切试剂也可以包括具有5′端核酸酶活性但缺少合成活性的改性DNA聚合酶。该方法中使用的合适的酶切试剂以及本发明的试剂盒的示例在美国专利5614402；5795763、5843669、7122364、7150982以及PCT申请WO 9823774；WO 02070755A2；以及WO 0190337A2中提供，其中每篇均以整体作为参考文献引入本文。

术语“热稳定”被用于酶时，如5′端核酸酶，表示该酶在在升高的温度中具有功能或活性，如，在约55℃或更高时是有活性的（如，能够作为催化剂）。一些实施例中，该酶在65℃或更高的（如，75℃、85℃、95℃等）升高的温度下具有功能。

这里使用的术语“酶切产物”，指的是酶切试剂与酶切结构的反应生成的产物（如，酶切结构的酶切试剂处理）。

这里使用的，术语“特异性杂交”（specifically hybridizes）指的是在给定的杂交条件下，探针或引物在含有目标序列的样本中基本上仅与目标序列杂交（如，有少量或没有可检测的非目标序列杂交）。在包括变性和核酸退火循环的扩增方法中，给定的杂交条件包括扩增方法中退火步骤的条件，如，基于预定的T_m选定退火温度以及适合于选择的聚合酶的盐条件(salt condition)。

这里使用的术语“扩增的”指的是分子、部分（moiety）或效应的丰度的增加。目标核酸可以通过如，体外复制如采用PCR进行扩增。信号，如可检测项目或产物表示目标核酸的存在。

这里使用的，术语“扩增方法”指的是核酸扩增，表示目标核酸丰度的特异性扩增过程。有些扩增方法（如，聚合酶链式反应，或PCR）包括重复循环的热变性、寡核苷酸引物退火成模板分子以及退火引物的合适聚合酶延伸。每个步骤需要的条件和时间是本领域内已知的。有些扩增方法在一个温度下进行并被视为“等温的”。扩增产物的积累可为指数的或线性的。有些扩增方法（“目标扩增”方法）增大目标序列的丰度，如，通过多次拷贝（如，PCR、NASBA、TMA、链置换扩增、连接酶链反应、LAMP、ICAN、RPA、SPIA、HAD等），而一些扩增方法增大包括或不包括目标序列的核酸种类的丰度，不过这种扩增表明反应中（如，滚环扩增、RAM扩增）特征目标序列的存在。后一种方法有时指的是“信号扩增”方法。有些信号扩增方法可以采用转变起始核酸的方法增加核酸种类的丰度，如，通过酶切起始核酸形成酶切产物，或通过如聚合或连接将其延伸。目标扩增方法可应用到信号分子中(如，PCR可用来生成更多的连接、酶切或非目标拷贝反应的的产物拷贝数)，或反之亦然。

这里使用的，术语“聚合酶链式反应”以及“PCR”指的是一种从体外目标核酸上复制DNA片段的酶促反应。该反应一般涉及到依靠DNA聚合酶在每个目标核酸链上使用模板进行引物延伸以形成该链的一部分的互补拷贝。该链式反应包括如，采用加热进行DNA链的变性重复循环，接下来是通过冷却进行引物退火和延伸，形成目标核酸的包括侧翼部分以及引物结合位点的区域拷贝的指数型积累。当一RNA目标核酸采用PCR扩增时，一般先进行逆转录以生成一DNA复制链。

这里使用的，术语“引物退火”指的是允许寡核苷酸引物与模板核酸链杂交的条件。引物退火的条件随引物的长度和序列变化，并且一般以根据引物确定或计算的T_m为基础。例如，一扩增方法中的退火步骤涉及了热循环，它涉及到在加热变性步骤后降低温度至一基于引物序列的T_m的温度，并保持足够完成该退火的一段时间。

这里使用的，术语“可扩增核酸”指的是可通过任意扩增方法扩增的核酸。我们考虑到通常“可扩增核酸”可包括“样本模板”。

这里使用的术语“实时”指的是核酸扩增或信号扩增的检测，在反应进行过程中，如，在保温或热循环中，进行反应中的产物或信号的积累的测量或检测。该检测或测量可连续进行，或者可以在扩增反应进程中的多个不连续的点进行，或者可两者结合。例如，在一聚合酶链式反应中，检测（如，荧光的）可以发生在热循环的所有或部分过程中，或者可以在一个或多个循环中的一个或多个点瞬时发生。一些实施例中，PCR实时检测通过确定多个循环中的每个，或每个循环中的同一点（如，循环中的一时间点，或循环中的温度步骤）的荧光水平来完成。扩增的实时检测也可以指在扩增反应中的检测。

这里使用的，术语“逆转录”（reverse transcription）和“逆转录”（reverse transcribe）指的是在模板依赖性（temp1ate-dependent）聚合酶作用下生成一与RNA模板互补的DNA链。

这里使用的，术语“核酸丰度”（abundance of nucleic acid）指的是样本或试样中存在的特征目标核酸序列的含量。该含量一般指的是质量（如，μg），每单位体积质量（如，μg/μl）；拷贝数（如，1000拷贝，1attomole），或每单位体积拷贝数（如，1000拷贝/ml，1attomole/μl）。核酸的丰度也可以表达为与已知浓度或拷贝数的标准含量相关的量。核酸丰度的测定可在任意本领域技术人员理解的基础上为适合的核酸丰度定量表示，包括样本的物理密度、吸收度、折光性能、染色性能，或基于可检测标记的强度，如，荧光标记。

术语“扩增子”或“扩增产物”指的是通过扩增过程如PCR过程产生的核酸片段，一般为DNA。该术语也可用于指代通过利用RNA聚合酶进行的扩增方法，如NASBA、TMA等,产生的RNA片段。

使用的术语“扩增曲线”指的是热循环扩增反应中可指示扩增的信号，如，荧光信号，对循环数绘制出的曲线。当用于指代非热循环扩增方法时，扩增曲线一般指积累信号作为时间的函数的曲线。

使用的术语“基线”指的是扩增曲线中来自在保温期或，PCR中，在初始循环前的组合扩增方法的检测信号，其中信号几乎没有变化。

使用的术语“Ct”或“阈值循环”指的是热循环的扩增反应的实时检测中，检测信号（如，荧光）超过设定阈值的部分循环数。

这里使用的术语“无模板对照”和“无目标对照”（或者“NTC”）指的是对照反应，指一反应或样本不包含模板或目标核酸。它用来验证扩增质量。

使用的术语“被动参考”（passive reference）指的是检测反应中的参考物料，如染料，可提供能在数据分析中使报告信号（如，另一染料）标准化的内部参考。标准化一般在修正由浓度或体积的变化引起的波动中是必需的。

“Rn”或“标准化报告”指通过被动参考染料的荧光发射强度分类的报告染料的荧光发射强度。

“Rn+”指包含所有组分，包括模板或目标的反应的Rn值。

Rn-指未反应样本的Rn值。该Rn-值可从实时反应，如，实时PCR运行的早期循环（这些循环再能检测到增加的荧光信号前），或从不包含任何模板的反应中获得。

“△Rn”或“delta Rn”指通过给定的扩增条件，如PCR条件产生的信号数量。该△Rn值由下面的公式决定：（Rn+）-（Rn-）。已知浓度的标准A样本用于建立标准曲线。通过改变浓度的标准，可建立一条标准曲线，从该曲线可外推出未知样本的量。

使用的术语“阈值”指的是一扩增反应的实时检测中，早期PCR循环的Rn平均值标准偏差与一调节因子的乘积。该阈值可以设定在PCR产物的指数增长区域。

使用的术语“未知”指的是在定量试验中的包含未知量的模板样本的检测，该样本一般为需要对其定量的，如，采用定量试验如实时PCR和/或INVADER试验。

这里使用的，术语“样本模板”指源自一需要分析“目标”存在的样本中的核酸。相反，“背景模板”用来指不同于样本模板的核酸，可以或可以不存在于样本中。背景模板的存在通常是不被注意到的。它可以是残留的结果，或者可由于本应从样本中提纯排除的核酸污染的存在。例如，来自生物体的但不是那些待检测的核酸可以作为背景存在于测试样本中。

使用的术语“分析物特征区”或“ASR”和“分析物特征部分”指的是寡核苷酸，如引物、探针寡核苷酸，或侵染寡核苷酸，可互换使用，选定用于与目标核酸或设定的目标核酸中的特定核酸序列进行特异性杂交的区域/部分。一些实施例中，寡核苷酸的分析物特征区可与与其杂交的目标核酸的片段完全互补，而其它实施例中，分析物特征区可包括一个或多个与其杂交的目标核酸的片段不匹配序列。一些实施例中，分析物特征区可包括一个或多个碱基与目标链的碱基类似，如，化合物的氢键不同，或没有氢键。一些实施例中，寡核苷酸的整个序列是分析物特征区，而其它实施例中，寡核苷酸包括一分析物特征区以及一个或多个与目标序列不互补的区域（如，不互补侧翼区）。

术语“大体上单链”（substantially single-strand）在使用时指的是一核酸底物，该底物分子基本以单链核酸存在，与之相对的是双链底物，它以核酸双链形式存在是通过内链碱基对的相互作用将其结合在一起的。

这里使用的术语“释放”（liberating）指核酸片段从较大的核酸片段，如寡核苷酸中，通过，例如，5′端核酸酶的作用释放，这样该释放片段不再与剩余的寡核苷酸共价连接。

这里使用的术语“微生物”指小到不能用肉眼观测的生物体，包括，但不限于细菌、病毒、原生动物、真菌和纤毛虫。

术语“微生物基因序列”指源自微生物的基因序列。

术语“细菌”指任意细菌种类。

术语“古细菌”（archaea）、“古细菌物种”、“太古代”和“古细菌”（archaebacteria）可互换使用，指任意可分类为古细菌域或古细菌界生命体的成员的微生物。

术语“病毒”指不能自主复制（如，复制需要使用宿主细胞的零件）的专性的、超显微的、细胞内的寄生虫。

术语“多药物抗性”（multi-drug resistant）或“多药物抗性”（multile-drug resistant）指微生物可耐受多于一种所述微生物的处理中使用的抗菌素或抗微生物剂。

术语“目标核酸源”指任何包含核酸（RNA或DNA）的样本。尤其优选的目标核酸源为生物样本包括，但不限于血液、脑脊液、胸膜液、牛奶、淋巴液、痰液和精液。

一样本“疑似包含”一个和另一个核酸可以包含目标核酸分子的其中一个、二者或二者都没有。

这里使用的术语“反应物”是从广义来说的。该反应物能够包括，例如，一酶促反应物、化学反应物或光（如，紫外光，尤指已知的可打断寡核苷酸链的短波长的紫外光）。任何能够与寡核苷酸反应的物质，无论缩短的（如，切开）或延长的寡核苷酸都包含在术语“反应物”内。

这里使用的术语“部分”，当指的是蛋白质（如在“一部分给定的蛋白质”中）时指该蛋白质的片段或氨基酸序列比多肽氨基酸的整链要短。

类似的，当指的是核酸（如在“一部分给定的核酸或寡核苷酸”中）时，该术语指核酸片段，或指一比该核酸或寡核苷酸的核苷酸整链要短的核苷酸序列。一部分的尺寸范围可从1个氨基酸或氨基酸残基，到整个氨基酸或核苷酸序列。

术语“双链”指一条链上的核苷酸的碱基部分通过氢键与另一条链上的互补碱基列连接的核酸的状态。核酸的碱基状态反应出形成一双链结构的条件。根据碱基配对原则，核酸的链一般也可大致推测出具有大沟和小沟的双螺旋三级结构。该螺旋结构的假定包含在了形成双链的动作中。

术语“模板”指一核酸链，其上的互补拷贝是通过模板依赖性核酸酶的活性作用以核苷类三磷酸盐构造的。根据惯例，一双链上的模板链被描述、说明为“底”链(bottom strand)。类似的，非模板链常被描述、说明为“顶”链（top strand）。

这里使用的，术语“样本”是从广义来说的。例如，一些实施例中，它的意思包括样本或培养物（如，微生物培养物），而其它实施例中，它的意思包括生物和环境样本（如，疑似包含目标序列、基因或模板）。一些实施例中，一样本可包括合成产生的标本。样本可以不用纯化或可以部分或完全纯化或其它的处理。

本发明不限于所使用或分析的样本。本发明可以作用于多种生物样本包括，但不限于，组织（如，器官（如，心脏、肝脏、大脑、肺、胃、肠、脾、肾、胰脏和生殖（如，卵巢）器官）、腺、皮肤、肌肉组织）、细胞（如，血细胞（如，淋巴细胞或红细胞）、肌细胞、肿瘤细胞和皮肤细胞）、气体、体液（如，血液或它的一部分、血清、血浆、尿液、精液、唾液等），或来自人类（如，成人、婴儿或胚胎）或动物（如，牛、家禽、小鼠、老鼠、狗、猪、猫、马及类似物）的固体（如，粪便）样本。一些实施例中，生物样本可以为固体食物和/或饲料产品和/或材料如日常用品、蔬菜、肉和肉的副产物，以及废弃物。生物样本可以得自于所有种类的家养动物以及野生的（feral）或野生的（wild）动物，包括，但不限于，如有蹄类动物、熊、鱼、兔形类、啮齿目动物，等。

生物样本也包括活体解剖和组织切片（如，活检或肿瘤、肿块、疹子、感染的切片，或石蜡包埋组织切片）、医疗或医院样本（如，包括，但不限于，血液样本、唾液、口腔标本、脑脊髓液、胸膜液、牛奶、初乳、淋巴液、唾液、呕吐物、胆汁、精液、卵母细胞、宫颈细胞、羊膜液、尿液、粪便、毛发和汗液）、实验室样本（如，亚细胞组分），以及法医样本（如，血液或组织（如，飞溅物或残留物）、毛发和皮肤细胞包括核酸），以及考古样本（如，化石有机体、组织或细胞）。

环境样本包括，但不限于，环境物料如地表物质、土壤、水（如，淡水或咸水）、藻类、苔藓、地质样本、大气包括包括核酸的物料、结晶体，和工业样本以及得自食物和日常处理仪器、装置、设备、器皿、一次性和非一次性用具的样本。

其它类型的生物样本包括细菌（如，放线菌（例如，放线菌，节杆菌，棒状杆菌（如，白喉杆菌））、分枝杆菌（如，结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌），丙酸杆菌（如痤疮丙酸杆菌）、链霉菌、衣原体（如，沙眼衣原体和肺炎衣原体）、蓝细菌、异常球菌（如，栖热菌（如，水生栖热菌））、硬壁菌（如，芽孢杆菌（如，炭疽芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌））、李斯特菌（如，单增李斯特菌）、金黄色葡萄球菌（如，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌）、梭杆菌、变形菌（如，立克次氏体、鞘脂单胞菌、博德特氏菌（如，百日咳杆菌）、奈瑟球菌(Neisserisales)（如，淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌）、肠细菌（如，大肠杆菌（如，大肠杆菌）、克雷白杆菌、邻单胞杆菌、变形杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌和耶尔森氏菌）、军团杆菌、巴氏杆菌（如，嗜血杆菌）、假单胞菌属、弧菌（如，霍乱弧菌和创伤弧菌）、弯杆菌（如，弯杆菌（如，空肠弯曲杆菌）和螺杆菌（如，幽门螺杆菌）和螺旋原虫（如，钩端螺旋体、伯氏螺旋体和梅毒螺旋体））；古细菌（如，嗜盐菌和甲烷菌）；真核生物（如，动物类（如，环节动物门、节足动物门（如，有螯肢亚门、多足纲、昆虫纲和甲壳纲）、软体动物门、线虫门（如，线虫和旋毛虫）和脊索动物门（如，辐鳍鱼亚纲、两栖动物纲、鸟纲、软骨鱼纲、爬行纲和哺乳动物纲（如，灵长目、啮齿目、兔形目和食肉目））））；菌类（如，皮肤真菌、镰刀菌、青霉菌属和酵母菌属）；植物界（如，木兰植物门（如，木兰纲和百合纲））和原生生物界（如，顶复动物亚门（如，隐孢子虫属、疟原虫属（如，恶性疟原虫和弓形体原虫）和贾第虫（Metamonada）（如，贾第鞭毛虫）））；和病毒（如，dsDNA病毒(如，噬菌体、腺病毒科、疱疹病毒科、乳头状瘤病毒、冠状病毒科、痘病毒科)、ssDNA病毒（如，细小病毒科）、dsRNA病毒（包括呼肠病毒科）、（+）ssRNA（如，冠状病毒科、星状病毒科、短尾噬菌体、豇豆花叶病毒科、黄病毒科、小核糖核酸病毒科和披膜病毒科）、dsRNA病毒（包括博尔纳病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、本扬病毒科和正粘病毒科）、ssRNA-逆转录病毒（如，逆转录病毒科）和dsDNA-逆转录病毒（如，肝DNA病毒科和花椰菜花叶病毒科）。

样本可采用任意需要的或合适的方法准备。一些实施例中，核酸可直接从体液或其它样本中分析，使用描述在美国专利公开序列号20050186588中的方法，该专利以整体作为参考引入本文。

不过，上述描述的样本并不是用于限制本发明可使用的样本（如，疑似包含目标序列、基因或模板（如，使用本发明的组分和方法能够确定其存在或不存在））类型。

这里使用的术语“核酸类似物”、“非天然的”或“非天然存在的”指核苷酸而不是天然的核苷酸和碱基。该类似物和非天然碱基和核苷酸包括改性天然核苷酸和非天然存在的核苷酸，包括但不限于改变了堆积作用的类似物如7-deaza 嘌呤（如，7-deaza-dATP和7 –deazadGTP）；改变了氢键连接结构的碱基类似物（如，比如iso-C和iso-G以及其它在S. Benner的美国专利6001983中描述的非标准碱基对，以及Igor V. 、Kutyavin等人的美国专利5912340中描述的选择性结合碱基类似物）；非氢键连接类似物（如，非极性、芳香核苷酸类似物如2、4-二氟甲苯，由B.A. Schweitzer和E.T Kool描述在J. Org.Chem.，1994，59，7238-7242中以及由B.A.Schweitze和E.T Kool描述在Am.Chem.Soc.，1995，117，1863-1872中）；“通用的”（universal）碱基如4-硝基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶（如“K”和“P”核苷酸，分别为：P. Kong等人，Nucleic Acids Res.，1989，17，10373-10383；P. Kong等人，Nucleic Acids Res.，1992，20,5149-5152）。核苷酸类似物包括改性状态的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。“非天然的”和“非天然存在的”碱基和核苷酸并不用于限定特指那些从未在自然界发现的碱基。虽然自然过程如核酸的破坏可产生“天然的”存在的碱基，但是一般不认为其为这里所定义的“天然的”核苷酸的一部分。例如，iso-G能够在氧化破坏的DNA中找到。这种非天然的碱基和它们的复制方式以及其它核酸的合成已经在上下文中做了广泛的研究，如DNA破坏研究，尽管有时该成分使用不同的术语描述。例如，核糖核苷酸包括不同的异鸟苷碱基已经在文献中提到了，有：iG；isoG；iso-G；异鸟苷；2-羟基腺嘌呤；2-异腺嘌呤；2-羟基 A和2-OH-A。脱氧核糖核苷酸包括不同的异鸟苷碱基已经在文献中提到了，有：iG；isoG；iso-dG；脱氧iso-G；脱氧异鸟苷；2-羟基脱氧腺苷；2-羟基 dA；2-OH-Ade。

其它核苷酸类似物包括改性状态的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本发明的多种寡核苷酸（如，主要探针或INVADER 寡核苷酸）可包含核苷酸类似物。

这里使用的术语“核酸序列”和“核酸分子”指寡核苷酸、核苷酸或聚核苷酸，以及它们的片段或部分。该术语涵盖了包括DNA和RNA类似物的序列，包括上面所列举的那些，也包括，但不限于，4-乙酰基胞苷、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤核糖核苷、氮丙啶基胞苷、假异胞苷、5-（羧羟-甲基）尿苷、5-氟尿苷、5-溴尿苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫脲苷、5-羧甲基-氨甲基脲苷、二氢尿苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假-尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鸟苷、2-甲基苷、2-甲基鸟苷、3-甲基-胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫脲苷、β-D-甘露糖Q核苷、5′-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-硫代甲基-N6-异戊烯基腺苷、尿苷-5-氧化乙酸甲基酯、尿苷-5-氧基乙酸、奥昔布宁（oxybutoxosine）、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代胞苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-尿苷-5-氧化乙酸甲基酯、尿苷-5-氧基乙酸、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、2，6-二氨基嘌呤、和吡唑[3,4d]嘧啶如鸟嘌呤类似物6氨基-1H-吡唑[3,4-d]嘧啶4(5H)酮（ppG或PPG，也可为Super G）和腺嘌呤类似物如4氨基1H-吡唑[3,4d]嘧啶（ppA或PPA）。也可用黄嘌呤类似物1H-吡唑[5，4d]嘧啶4(5H)-6(7H)-二酮(ppX)。当应用到寡核苷酸上时，这些碱基类似物增强了杂交并提高了错配分辨力。所有天然存在的碱基、改性碱基和碱基类似物的变异形态可包含于本发明的寡核苷酸修饰中。本发明中可使用的其它改性碱基包括6-氨基-3-丙炔基-5-羟基吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮，PPPG；6-氨基-3-(3-羟基-1-丙炔基)1-5-羟基吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮，HOPPPG；6-氨基-3-(3-氨基-1-丙炔基)-5-羟基吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮，NH₂PPPG；4-氨基-3-(丙炔基)吡唑[3,4-d]嘧啶，PPPA；4-氨基-3-(3-羟基-1-丙炔基)吡唑[3,4-d]嘧啶，HOPPPA；4-氨基-3-(3-氨基-1-丙炔基)吡唑[3,4-d]嘧啶，NH₂PPPA；3-丙炔基-吡唑[3,4-d]4,6-嘧啶二胺，(NH₂)₂PPPA；2-(4,6-二氨基吡唑[3,4-d]3-嘧啶基)1-乙炔醇),(NH₂)₂PPPAOH；3-(2-氨基乙炔基)吡唑[3,4-d]-4,6-嘧啶二胺，(NH2)2PPPANH2；5-丙炔基-1,3-二羟基嘧啶-2,4-二酮，PU；5-(3-羟基-1-丙炔基)-1,3-二羟基嘧啶-2,4-二酮，HOPU；6-氨基-5-丙炔基-3-二羟基嘧啶-2-酮，PC；6-氨基-5-(3-氨基-1-丙炔基)-1,3-二羟基嘧啶-2,4-二酮，HOPC；以及6-氨基-5-(3-氨基-1-丙炔基)-1,3-二羟基嘧啶-2-酮，NH₂PC；5-[4-氨基-3-(3-甲氧丙炔基)吡唑[3,4-d]嘧啶基]-2-(羟甲基)3-草脲胺，CH₃OPPPA；6-氨基-1-[4-羟基-5-(羟甲基)2-草烷基(oxolanyl)]-3-(3-甲氧基-1-丙炔基)-5-羟基吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮，CH₃OPPPG；4-(4,6-二氨基-1H-吡唑[3,4-d]3-嘧啶基)3-丁炔醇，Super A；6-氨基-3-(4-羟基-1-丁炔醇)-1,5-2H-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮；5-(4-羟基-1-丁炔醇)1H-嘧啶-2,4-二酮，Super T；3-碘-1H-吡唑[3,4-d]-4,6-嘧啶二胺，((NH2)2PPAI)；3-溴-1H-吡唑[3,4-d]-4,6-嘧啶二胺，((NH₂)₂PPABr)；3-氯-1H-吡唑[3,4-d]-4,6-嘧啶二胺，((NH₂)₂PPACl)；3-碘-1H-吡唑[3,4-d]-4-嘧啶胺，(PPAI)；3-溴-1H-吡唑[3,4-d]-4-嘧啶胺，(PPABr)；3-氯-1H-吡唑[3,4-d]-4-嘧啶胺，(PPACl)。

除了上述写到的改性碱基，本发明的寡核苷酸可有一糖的主链或糖苷部分，优选2-脱氧核糖核苷，其中所有的内部键均为天然存在的磷酸二酯键。不过在替代实施例中，2-脱氧-β-D-呋喃核糖基可用其他糖代替，例如，β-D-呋喃核糖。另外，当核糖基的2-OH为以C1-6烷基(2-(O-C1-6烷基)核糖)或以C2-6烯烃基(2-(O-C2-6烯烃基)核糖)烷基化的，或被氟基（2-氟基核糖）取代时，β-D-呋喃核糖可以存在。

本发明中有用的关于形成寡聚物的糖是那些被“锁定的”，例如，包含一在C-4′和一在C-2′的氧原子之间的亚甲基桥连。其它能与杂交的寡核苷酸共存的糖基也能够使用，并为本领域技术人员所知，这些糖基包括，但不限于α-D-阿拉伯呋喃糖苷、α-2′-脱氧呋喃糖苷或2′,3′-双脱氧-3′-氨基呋喃糖苷。包含α-D-阿拉伯呋喃糖苷的寡核苷酸可以按美国专利5177196中描述的制备。包含α-2′-脱氧呋喃糖苷或2′,3′-双脱氧-3′-氨基呋喃糖苷的寡核苷酸可以按Chen等人在Nucleic Acids Res. 23:2661-2668 (1995)中的描述的制备。锁定核酸(Singh 等人，Chem. Comm.，455-456 (1998)；Wengel.J.，Acc. Chem. Res.,32:301-310 (1998))和包含2′-卤素-2′-脱氧呋喃糖苷(Palissa等人,z.Chem.,27:216 (1987))的寡核苷酸的合成过程也有描述。这里描述的改性寡核苷酸磷酸酯主链也能够改性，这样该寡核苷酸包含硫代磷酸酯键和/或甲基磷酸酯和/或磷酰胺酯(Chen等人，Nucl. Acids Res.，23:2662-2668 (1995))。寡核苷酸键的结合也在本发明的范围内。其它主链改性也为本领域技术人员所知。

一些实施例中，这里描述的改性碱基包括PNA和DNA/PNA嵌合体以平衡T_m并提供具有提高的错配辨别力的改性寡核苷酸。现已使用多种改性形态的DNA和DNA类似物来尝试克服使用DNA分子作为探针和引物的一些缺陷。它们中有多肽类核酸（PNAs，也被称为聚酰胺核酸）。Nielsen等人，Science 254:1497-1500(1991)。PNAs包含杂环碱基单元，类似在DNA和RNA中发现的，是通过一代替DNA和RNA特征的磷酸糖类主链的聚酰胺主链连接的。PNAs能够与互补DNA和RNA目标序列杂交并且，事实上，该杂交比相应的核酸探针杂交更强。PNA寡聚物和PNA寡聚物合成中使用的反应单体的合成描述在美国专利申请5539082、5714331、5773571、5736336和5766855中。替代的PNA和DNA/PNA嵌合体合成以及用于PNA合成的单体的合成方法已有概括。Uhlmann等人，Angew. Chem.Int. Ed. 37:2796-2823 (1998)。一般地，任意结合使用的常规碱基、未取代吡唑[3,4-d]嘧啶碱基（如，PPG和PPA）、3-取代的吡唑[3,4-d]嘧啶、改性嘌呤、改性嘧啶、5-取代的嘧啶、通用碱基、糖类改性物、主链改性或小沟结合物，用以平衡DNA、PNA或DNA/PNA嵌合体的T_m也包括在本发明范围内。合成核酸、PNA和DNA/PNA嵌合体合成需要的改性碱基单体单元需要的合成方法可从本领域获得，参见本申请和Uhlmann等人，Angew. Chem.Int. Ed. 37:2796-2823 (1998)中的方法。

核酸序列或分子可为DNA或RNA，它们的基因或合成的来源，可以为单链或双链，代表了正义链或反义链。因此，核酸序列可以为dsDNA、ssDNA、混合ssDNA、混合dsDNA、dsDNA转变成ssDNA（如，通过熔解、变性、解旋酶等）、A-、B-或Z-DNA、三链DNA、RNA、ssRNA、dsRNA、混合ss和dsRNA转变成ssRNA（如，通过熔解、变性、解旋酶等）、信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转移RNA（tRNA）、催化RNA、snRNA、microRNA或蛋白核酸（PNA）。

本发明不限于使用的核酸（如，序列或分子（如，目标序列和/或寡核苷酸））的类型或来源。例如，核酸序列可以扩增或创建序列（如，通过合成扩增或创建核酸序列，合成方法（如，聚合（如，引物延伸（如，RNA-DNA杂交引物技术））和逆转录（如，RNA逆转录成DNA））和/或扩增（如，聚合酶链式反应（PCR）、滚环扩增（RCA）、核酸序列碱基扩增（NASBA）、转录介导扩增（TMA）、连接酶链反应（LCR）、循环探针技术、Q-β 复制酶、链置换扩增（SDA）、分支链DNA信号扩增（bDNA）、杂交捕获和解旋酶依赖扩增）。

术语“核苷酸”和“碱基”当用于指核酸序列时可互换使用，除非它在这里指代其它物质。

这里使用的术语“寡核苷酸”定义为一包括两个或多个核苷酸（如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）的分子，优选的为至少5核苷酸，更优选的为至少约为10-15核苷酸以及更优选的为至少约15-30核苷酸，或更长（如，寡核苷酸一般少于200个残基（如，在15和100核苷酸间），不过，这里使用的，该术语也意指包括更长的聚核苷酸链）。其准确大小依赖于很多因素，这些因素反过来依赖于该寡核苷酸的最终功能或使用。寡核苷酸常用它们的长度表示。例如，一24残基寡核苷酸指的是一“24-mer”。寡核苷酸可通过自我杂交或通过与其它聚核苷酸杂交形成二级和三级结构。这些结构可包括，但不限于，双链、发夹、十字形、弯曲以及三重的。寡核苷酸可产生于多种方式，包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或它们的结合。一些实施例中，形成侵入式酶切结构的寡核苷酸产生于反应中（如，通过酶促引物延伸反应中的引物延伸）。

因为单体核苷酸反应生成寡核苷酸的方式为一个单体核苷酸戊糖环上的5′端磷酸盐通过磷酸二酯键从一个方向连接到其相邻的3′端氧键上，寡核苷酸的尾端指其5′端磷酸盐没有与单体核苷酸戊糖环上的氧键相连的5′端，以及其3′端氧键没有连接到随后的单体核苷上的酸戊糖环5′端磷酸盐的3′端。这里使用的，即使内部有更大的寡核苷酸，核酸序列也有所谓的5′端和3′端。若当沿着核酸链上5′到3′的方向移动时，第一个区的3′端在第二个区的5′端之前，则沿着核酸链的第一个区称为另一个区的上游。

当两个不同的、无重叠的寡核苷酸退火为同一线形互补核酸序列的不同区，且一条寡核苷酸的3′端指向另一条的5′端时，前面的可称为“上游”寡核苷酸，后面的可称为“下游”寡核苷酸。类似的，当两重叠寡核苷酸杂交为同一线形互补核酸序列，且其中第一条寡核苷酸定位为其5′端为第二条寡核苷酸的5′端的上游，第一条寡核苷酸的3′端为第二条寡核苷酸的3′端的上游时，该第一条寡核苷酸可称为“上游”寡核苷酸，第二条寡核苷酸可称为“下游”寡核苷酸。

这里使用的，术语“互补”或“互补”用于指代通过碱基配对原则关联的聚核苷酸（如，两个或多个核苷酸的序列（如，一寡核苷酸或目标核酸））。例如，序列“5′-A-G-T-3′”互补于序列“3′-T-C-A-5′”。互补可以是“部分的”，即其中只有核酸的某些碱基根据碱基配对原则配对了。或者，核酸碱基之间有“完全的”或“全面的”互补。核酸链间的互补程度对核酸链之间之间的效率和强度有很大影响。这在扩增反应以及依赖于两个或多个核酸链的关联的检测方法中尤其重要。这两个术语也可用于指代单独的核苷酸，尤其在聚核苷酸的环境中。例如，一寡核苷酸中的特征核苷酸可标记为其与另一个核酸序列（如，目标序列）中的核苷酸的互补或互补的缺失，与该寡核苷酸余部和该核酸序列之间的互补形成对比或比较。

这里使用的核酸序列的互补指一寡核酸酸，当与核酸序列配对即一个序列的5′端与另一序列的3′端配对时，它是“逆向平行结合”。核苷酸类似物，如上面讨论的，可包括在本发明的核酸中。互补不需要完全；稳定的双链可包含错配的碱基对或不匹配的碱基。那些核酸技术领域的人员能够根据经验考虑一系列变量包括，例如，寡核苷酸长度、碱基组分以及寡核苷酸序列、离子强度和碱基对错配几率来确定双链的稳定性。

术语“同源性”指互补的程度。有部分同源或完全同源（如，同一性）。一部分同源序列是一个序列对另一个序列的识别度小于100%。一“基本同源的”部分互补序列是一核酸分子至少部分抑制核酸分子与目标核酸完全互补杂交。该完全互补序列与目标序列杂交的抑制可在低严格度条件下使用杂交试验（例如，Southern或Northern印迹、液相杂交及类似）。一基本同源的序列或探针将争夺并抑制完全同源核酸分子与目标在低严格度条件下的结合。这不是说低严格度条件下允许非特异性结合（如，低严格度条件可为两个序列的相互结合为特异性（如，选择性的）相互作用）。非特异性结合的不存在可通过使用另一个基本不非互补（如，低于约30%的同一性）目标进行检测；在不存在非特异性结合时探针将不会与第二个非互补目标杂交。

当用于指代双链核酸序列如cDNA或基因组克隆时，术语“基本同源的”指任何能够与双链核酸序列的一条链或两条链在上述低严格度条件下杂交的探针。

当用于指代单链核酸序列时，术语“基本同源的”指任何能够与单链核酸序列在在上述低严格度条件下杂交（如，互补）的探针。

术语“目标核酸”和“目标序列”指待检测或分析的核酸。因此，“目标”是与其它核酸或核酸序列区分开来。例如，当用于扩增反应中时，这些术语可以指核酸或核酸将通过反应扩增的部分，而当用于指多态现象时，它们可指包含疑似多态现象的部分。当用于侵入式酶切反应时，这些术语指一核酸分子包含的序列具有至少一部分互补于至少第一个核酸分子（如探针寡核苷酸）并且也可具有至少一部分互补于第二个核酸分子（如，侵染寡核苷酸）。一般地，目标核酸（如，存在于、分离自、浓缩于或扩增自或在样本中（如，生物或环境样本）位于目标区并可通过成功的形成侵入酶切结构，将其与可被酶切剂酶切的第一和第二核酸分子（如，探针寡核苷酸和侵染寡核苷酸）结合进行识别。来自生物体的目标核酸不限于基因的DNA和RNA。来自生物体的目标核酸可以包括任何核酸物种，包括但不限于基因的DNAs和、信使RNA、结构RNAs、核糖体和tRNAs，以及小的RNAs如snRNAs和microRNAs（miRNAs）。参见，例如，同时审查中的美国专利申请10/740256，申请于12/18/03，这里本文整体作为参考文献引入。“片段”定义为目标序列内的核酸区。

这里使用的，术语“探针寡核苷酸”指一寡核苷酸与目标核酸相互作用形成一可检测的复合物。在5′端核酸酶酶切试验如TAQMAN试验和侵染试验中，探针寡核苷酸杂交于目标核酸并在探针寡核酸上发生酶切。一些实施例中，该探针和目标间的复合物在它存在时检测，而一些实施例中，复合物的形成可在它不再存在时检测，如，通过检测事件（如，酶切事件）发生的结果形成的探针/目标复合物。

术语“侵染寡核苷酸”指在探针和目标核酸间的杂交区域附近的位置与目标核酸杂交的寡核苷酸，其中侵染寡核苷酸包括一与探针和目标间的杂交区域重叠的部分（如，一化学基团，或核苷酸，无论与目标互补与否）。一些实施例中，侵染寡核苷酸在其3′端包含的序列与位于探针寡核苷酸的5′端的基本相同。

术语“暗盒”，这里用于指用于产生可检测的反应探针寡核苷酸的酶切的信号的寡核苷酸或结合的寡核苷酸。优选实施例中，该暗盒杂交于来自探针寡核苷酸的酶切的酶切产物形成另一个侵入式酶切结构，这样该暗盒能够被切开。

一些实施例中，该暗盒为单个寡核苷酸，包括一发夹部分（如，一区域其中的该暗盒的一部分寡核苷酸再反应条件下杂交于同一挂核苷酸的另一部分以形成双链）。一些实施例中，暗盒包括至少两个包括能在反应条件下形成双链的互补部分的寡核苷酸。优选实施例中，该暗盒包括一标记。特别优选的实施例中，该暗盒包括能产生荧光振动能量转移（FRET）效应的标记基团。

若一寡核苷酸的摩尔浓度比其它寡核苷酸（目标核酸序列）高，则该寡核苷酸相对于其它寡核苷酸（或目标核酸序列）被称为存在是“过量的”。当一寡核苷酸如探针寡核苷酸在一酶切反应中存在的浓度相对互补目标核酸序列的浓度过量时，该反应可以用来指示目标还是存在的量。一般地，但存在过剩时，探针寡核苷酸将有至少100倍过量；

一般当目标核酸序列有约10fmole或更少时，使用的每个探针寡核苷酸至少1pmole。

这里使用的，术语“基因”指核酸（如，DNA）序列，包括生成多肽、前体，或者RNA（如，rRNA、tRNA）需要的编码序列。多肽能够采用全长编码序列或采用该编码序列的任意部分编码，只要需要的全长或片段多肽的活性或功能性性能（如，酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等）被保留了。该术语也包括结构基因的编码区域和位于邻近该编码区域的5′端和3′端的序列，每一端的距离约为1kb或更多，这样该基因与全长mRNA的长度能相一致。位于编码区域5′端和出现在mRNA上的序列指5′。位于编码区域3′端或下游以及出现在mRNA上的序列指3′端非编译序列。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组类型两者。基因组类型或基因克隆包含打断编码区的非编码序列，称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”。内含子是转录为核RNA（如，hnRNA）的基因的片段。内含子可以包含调节元件（如，增强子）。内含子被从该核或初级转录产物中去除或“切除”；所以信使RNA（mRNA）转录中没有内含子。转译期间mRNA作用指定初生多肽中的氨基酸的序列或顺序。

这里使用的，术语“异源基因”指一不在其天然环境中的基因。例如，异源基因包括从一个物种引入另一个物种（如，病毒或细菌的基因在人类宿主内（如，染色体外或结合进入该宿主的DNA）的基因。异源基因也包括一生物体所产的基因通过某些方式（如，突变、加入多个拷贝、与非本土的调整序列连接等）被改变。一些实施例中，异源基因能够从内源基因中区分出来是因为异源基因序列一般加入的DNA序列被发现相关的染色体中的基因序列是非天然的，或相关的染色体的部分没有在自然界发现（如，基因在基因座中表达时该基因没有被正常的表达）。

这里使用的，术语“基因表达”指通过基因“转录”（如，通过RNA聚合酶的酶促反应）将以基因编码的基因信息转变为（如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA）的过程，对于蛋白质编码基因，为通过mRNA“转译”为蛋白质的过程。基因表达能在过程中的很多阶段进行调节。“上调”或“活化”指调节以增加基因表达产物（如，RNA或蛋白质）的产出，而“下调”或“阻遏”指调节以降低产出。关系到上调或下调的分子（如，转录因子）通常被分别叫作“活化子”或“阻遏子”。

除了包含内含子，基因的基因组类型也包括位于5′和3′两端的出现在RNA转录中的序列。这些序列指“侧翼”序列或侧翼区（如，这些侧翼序列能够位于5′或3′，与非转译序列相比出现在mRNA转录中。该5′端侧翼区可包含调节序列如促进子和增强子用于控制或影响基因的转录。该3′端侧翼区可包含指示转录终点、转录后酶切以及mRNA加尾的序列。

术语“野生株”指基因或基因产物分离自天然存在的来源。野生株基因是最常在群体中观察到的，因此可任意的设计基因“常规型”或“野生株”类型。相反，术语“改性体”或“突变株”指基因或基因产物与野生株基因或基因产物相比时在序列中表现出改性和/或功能性性能（如，改变的特性）。可注意到天然存在的突变株能够被分离（如，当与野生株基因或基因产物相比时，可通过它们具有改变的特性（如，改变的核酸序列）进行识别）。

术语“孤立的”当用于指核酸（如，“孤立的寡核苷酸”或“孤立的聚核苷酸”或“孤立的核苷酸序列”）时指与其天然来源中一般存在的至少一种组分或杂质分离的核酸序列。因此，孤立的核酸存在的形态或环境与自然中发现的有所不同。相反，非孤立的核酸为DNA和RNA这样的发现存在于自然界中的核酸。例如，一给定DNA序列（如，基因）发现在其宿主细胞染色体中于其相邻基因相类似；RNA序列，如一特定的蛋白质中编码的特定mRNA序列，发现其在细胞中与编码多个蛋白质的大量其它的mRNA混合在一起。不过，编码给定蛋白质的孤立的核酸包括，举例来说，细胞中的这种用于表达给定蛋白质的核酸处于染色体中的位置不同于天然存在的细胞中的，或者是其它的不同于自然界中发现的其侧面有一不同的核酸序列。孤立的核酸、寡核苷酸，或者聚核苷酸可为单链或双链类型。当孤立的核酸、寡核苷酸，或者聚核苷酸用于表达一蛋白质时，改寡核苷酸或聚核苷酸将包含最小的正义链或编码链（如，改寡核苷酸或聚核苷酸可为单链），但可包含正义链和反义链两者（如，改寡核苷酸或聚核苷酸可为双链）。

这里使用的，术语“纯化的”或“进行纯化”当用于指样本（如，分子（如，核酸或氨基酸序列））时指将样本从其天然环境中移除（如，隔离和/或分离）出来。术语“基本纯化的”指样本（如核酸或氨基酸序列）从其天然环境中移出至少60%游离的，优选75%游离的，或最优选的90%或更多的游离于天然存在的其它组分。若“孤立的聚核苷酸”或“孤立的寡核苷酸”能够游离于（如，60%、75%或更优选的90%或更多）天然存在的其它组分，它因此可基本上被纯化。

本发明不限于任何特殊的纯化方法（如，生成纯化的或基本纯化的分子（如，核酸序列））。事实上，多种纯化技术可以使用包括，但不限于，离心分离法（如，等密度离心法、密度梯度区带离心法、梯度离心法，以及差速离心法）、电泳法（如，毛细管凝胶电泳法）、凝胶过滤法、基体捕获法、电荷捕获法、质量捕获法、抗体捕获法、磁性分离、流式细胞术，以及特征序列杂交阵列捕获。

这里使用的，术语“杂交”用来指互补核酸的配对。杂交和杂交的强度（如，核酸间的结合强度）受到的影响因素为如核酸间的互补程度、涉及的条件的严格性、形成杂交的T_m，以及核酸内G:C的比例。内部结构中包含互补核酸配对的单个分子被称为“自交”。

这里使用的，术语“T_m”用来指“熔解”温度。该熔解温度为双链核酸分子的数目中半数分离为单链的温度。“计算T_m”指由互补核酸的物理序列（physical sequence）及反应条件（如，盐度、混合物中互补链的浓度）的因素计算值决定的熔解温度。几个计算核酸T_m的方程为本领域内已知的。根据标准文献的启示，当核酸是在1M NaCl水溶液中时（参见，如，Young和Anderson，（1985），Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach (Hames & Higgins, Eds.) pp 47-71, IRL Press，Oxford），T_m值可采用方程：T_m =81.5+0.41(%G+C)进行简单推测。其它的计算T_m的方法为本领域内已知的并且将结构的和环境的，以及序列的特征考虑了进去（参见，如，Allawi, H.T.和SantaLucia, J.,Jr. Biochemistry 36,10581-94(1997)）和SantaLucia, Proc Natl Acad Sci USA.,95(4):1460(1998))。

这里使用的，术语“侵染检测试剂”（INVADER assay reagents）指一个或多个检测目标目标序列的试剂，所述试剂包括能在目标序列存在时参与侵入式酶切结构形成的核酸分子。一些实施例中，侵染检测试剂包括所有在生成预先形成结构中的侵入式酶切结构中需要的核酸分子，而一些实施例中，侵染检测试剂用于，或与一个或多个额外的试剂剂（如，引物、聚合酶、连接酶、核酸酶）一起使用以满足在形成侵入式酶切结构中使用的核酸的形成。

一些实施例中，侵染检测试剂进一步包括用于检测侵入式酶切结构（如，酶切剂）存在的试剂。一些实施例中，核酸分子包括第一和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括一互补于目标核酸的第一区域的5′端，所述第二寡核苷酸包括一3′端和一5′端，所述5′端互补于目标核酸下游的并与第一区域相邻的第二区域。一些实施例中，第二寡核苷酸的3′端包括一与目标核酸不互补的3′端终端核苷酸。优选实施例中，第二寡核苷酸的3′端包括不互补于目标核酸的单核苷酸。侵染检测试剂可在文献中发现，例如，美国专利5846717、5985557、5994069、6001567、6913881和6090543；国际专利WO 97/27214、WO 98/42873；美国专利公开20050014163、20050074788、2005016596、20050186588、20040203035、20040018489和20050164177；美国专利申请11/266723；以及L yamichev等人，Nat. Biotech., 17:292(1999), Hall 等人, PNAS, USA, 97:8272(2000)，每一个均以整体作为参考引入本文。

一些实施例中，侵染检测试剂构造用于检测包括被一包含双链区的间插区分开的第一和第二非邻接的单链区的目标核酸序列。一些实施例中，侵染检测试剂包括一能与目标核酸序列的所述第一和第二非邻接单链区结合的交联寡核苷酸。在特别优选的实施例中，所述的侵染检测试剂中的所述的第一和/或所述第二寡核苷酸任一个或两个可为交联寡核苷酸。

一些实施例中，侵染检测试剂进一步包括一固体载体（support）。例如，一些实施例中，检测试剂（如，第一和/或第二寡核苷酸，无论交联或不交联）的一个或多个寡核苷酸连接到所述的固体载体上。检测试剂的一个或多个寡核苷酸可直接的或间接的（如，通过一间隔分子（如，寡核苷酸））连接到固体载体上。典型的固相侵染酶切反应描述在美国公开专利20050164177和20030143585中，这里以其整体作为参考引入本文。

这里使用的，“固体载体”为任何可在检测条件下维持其形状，并能与液相分离的物质。维持形状的载体不需要为刚性的。事实上，可以考虑柔性聚合物如糖链，将其作为固体载体使用，只要它们可与液相分离。本发明不限于使用的固体载体的类型。事实上，多种固体载体可考虑用于本发明中包括，但不限于，珠子、平板面、多孔玻璃珠（CPG）、晶片、玻璃、硅、钻石、石磨、塑料、顺磁珠、磁珠、乳胶珠、超顺磁珠、多个珠、微流体芯片、硅芯片、显微镜载玻片、微量滴定板（micrplate well）、硅胶、聚合物膜、颗粒、衍生塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝水凝胶、多糖、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、尼龙、琼脂糖凝胶、聚（丙烯酸酯）、聚苯乙烯、聚（丙烯酰胺）、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露多糖、菊粉、硝化纤维素、重氮纤维素或淀粉、聚合物微粒、聚合物膜、聚合物凝胶、玻璃载玻片、苯乙烯、多孔板、柱状体、芯片、乳胶、多孔3D亲水性聚合物基质（如，水凝胶，Packard Instrument Company，Meriden，Conn.)、光导纤维束和光导纤维珠（如，微珠芯片（Illumina，San Diego，CA.），描述在美国专利申请20050164177中）、小颗粒、膜、玻璃料、载玻片、微机械芯片、烷基硫醇-金涂层、非多孔性表面、可寻址细胞传感器（addressable array），以及固定聚核苷酸介质（如，在美国专利申请20050191660中描述的）。一些实施例中，改固体载体可用结合涂层或物料（如，金、钻石，或链霉亲合素）。

一些实施例中，侵染检测试剂进一步包括一缓冲溶液。有些优选实施例中，该缓冲溶液包括二价阳离子原（如，Mn²⁺和/或Mg²⁺离子）。集合在一起组成侵染检测试剂的单个成分（如，寡核苷酸、酶、缓冲液、目标核酸）被称为“侵染检测试剂组分”。

一些实施例中，侵染检测试剂进一步包括互补于第一目标核酸（如，一堆叠寡核苷酸（stacker oligonucleotides））的第一部分的上游的目标核酸的第三部分的第三寡核苷酸。其它实施例中，该侵染检测试剂进一步包括一目标核酸。一些实施例中，该侵染检测试剂进一步包括第二个目标核酸。其它实施例中，该侵染检测试剂进一步包括一第三寡核苷酸，其包括一互补于第二个目标核酸的第一区域的5′端部分。一些特殊的实施例中，第三个寡核苷酸的3′端部分共价连接到第二个目标核酸上。其它的特殊实施例中，第二个目标核酸进一步包括一5′端部分，其中第二目标核酸的该5′端部分为第三个寡核苷酸。其它的实施例中，该侵染检测试剂进一步包括一捕集（ARRESTOR）分子（如，捕集寡核苷酸）。

一些实施例中，一个或多个侵染检测试剂或侵染检测试剂组分以预分配形式（如，在操作程序中预先测量备用，而不用再测量或在分配）提供。一些实施例中，选择的侵染检测试剂组分是一起混合并预分配的。优选实施例中，预分配检测试剂组分是在反应器皿（如，包括，但不限于，反应试管或套管（如，微量滴定板））预分配并提供的。在某些优选的实施例中，侵染检测试剂在微流体装置中提供，如在美国专利6627159、6720187、6734401和6814935以及美国专利公开2002/0064885中描述的，每个均以整体作为参考引入本文中。在特别优选的实施例中，预分配的侵染检测试剂组分在反应器皿中进行干燥（如，烘干的或冻干的）。

一些实施例中，该侵染检测试剂或侵染检测试剂组分作为试剂盒提供。这里使用的，术语“试剂盒”指任何用于输送物料的输送系统。在反应检测环境中，这种输送系统包括能够从一个地方到另一个地方存储、运输，或输送反应试剂（如，在合适的容器中的寡核苷酸、酶等）和/或辅助材料（如，缓冲液、进行该检测的书面说明等）的系统。例如，试剂盒包括一个或多个包含相关反应试剂和/或辅助材料的附件（如，盒子）。这里使用的，术语“片断试剂盒”（fragmented kit）指包括两个或多个分开的容器并且每个容器包含总试剂盒组件的一个子件(subportion)的输送系统。该容器可一起或分开输送到预定的接受地。例如，第一个容器可包含检测使用的酶，而第二个容器包含寡核苷酸。术语“片断试剂盒”（fragmented kit）预期包括包含联邦食品、药品和化妆品法案（Federal Food，Drug，and Cosmetic Act）的520（e）部分规定的分析物特异性试剂，但并不限于此。事实上，任何包括两个或多个分离容器并且每个容器包含整个试剂盒组件的子件的输送系统都包括在术语“片断试剂盒”内。相反，“组合试剂盒”指一个输送系统包含所有装在单个容器（如，每个需要的组分装在一单独的盒子中）中的反应检测的组分。术语“试剂盒”包括片断和组合试剂盒两者。

一些实施例中，本发明提供的侵染检测试剂试剂盒包括一个或多个实施本发明需要的组件。例如，本发明提供存储或输送进行侵染检测需要的酶和/或反应组分的试剂盒。该试剂盒可包括任意及所有检测需要或需求的组分包括，但不限于试剂本身、缓冲液、对照标准试剂（control reagents）（如，组织样本、阳性和阴性对照目标寡核苷酸等）、固体载体、标签、书面和/或图解说明以及产物信息、抑制剂、标记和/或检测试剂、包装环境对照（package environmental controls）（如，冰冻、干燥剂等），以及类似物。一些实施例中，该试剂盒提供给需要组分的备用用具（sub-set），这里它用来给使用者盛装余下的组分。一些实施例中，该试剂盒包括两个或多个分开的容器，其中每个容器内贮存了待输送组分的备用用具。例如，第一个容器（如，一盒子）可包含酶（如，在合适的存储缓冲液中的结构特异性酶切酶和容器），而第二个盒子可包含寡核苷酸（如，侵染寡核苷酸、探针寡核苷酸、对照标准目标寡核苷酸等）。

在一些优选的实施例中，侵染检测试剂进一步包括用于检测核酸酶切产物的试剂。一些实施例中，一个或多个侵染检测试剂中的寡核苷酸包括一标记。一些优选的实施例中，所述第一寡核苷酸包括一标记。其它优选的实施例中，所述第三寡核苷酸包括一标记。特别优选的实施例中，试剂包括部分标记可产生荧光共振能量转移（FRET）效应的第一和/或第三寡核苷酸。

这里使用的，术语“标记”指任何能够被检测到或能够引起可检测的反应的部分（如，化学形态）。一些优选的实施例中，标记的检测提供了可定量的信息。标记可为任何已知的可检测到的部分，如，例如，放射性标记（如，放射性核素）、配体（如，生物素或抗生物素蛋白）、发色团（如，染料或能提供可检测色彩的颗粒）、半抗原（如，地高辛）、质量标记、乳胶珠、金属颗粒、顺磁性标记、发光组分（如，生物发光、发磷光或化学发光标记）或荧光组分。

标记可直接或间接的加入寡核苷酸或其它生物分子中。直接标记可通过价键或作用力将标记连接到寡核苷酸上，包括共价键或非共价作用如氢键、疏水性和离子作用，或通过形成螯合物或配合物。间接标记可通过使用桥连部分或“接头”（linker），如抗体或外加寡核苷酸。它们既可以直接标记，也可以间接标记。

标记可以单独使用或与能够抑制（如，淬灭）、激发或转移（如，转移）标记（如，发光标记）的发射光谱（如，荧光共振能量转移（FRET）。

这里使用的，术语“FRET”指荧光共振能量转移，一种分子某部分（如，荧光团）转移能量如，在其本身之间或，从一荧光团到一非荧光团（如，一淬灭分子）的过程。某些情况下，FRET包括通过小范围（如，约10nm或更小）的偶极-偶极相互作用使一激发供体荧光团转移能量至一低能量受体荧光团。其它情况中，FRET包括一供体损失荧光能量以及一受体荧光团增加荧光。其它形式的FRET中，能量能够从一激发供体荧光团转移至一非荧光分子（如，一淬灭分子）。FRET是本领域技术人员已知的并且已被描述过（参见，如，Stryer等人，1978, Ann. Rev. Biochem., 47:819; Selvin, 1995, Methods Enzymo1., 246:300;Orpana, 2004 Biomol Eng 21, 45-50; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110，每个均以整体作为参考引入本文）。

这里使用的，术语“未标记的”用于指探针寡核苷酸，该探针寡核苷酸不包括任何便于检测的非核酸部分，如，发色团或荧光团。一未标记的探针可包括修饰，如防止通过聚合酶延伸的3′端封闭基团。

这里使用的，术语“供体”指在第一个波长吸收并在第二个更长的波长发射的分子某部分（如，荧光团）。术语“受体”指分子的某部分如荧光团、发色团，或淬灭团，当靠近供体基团（一般在1-100nm之间）时它能吸收某些或大部分从供体发射的能量。受体具有的吸收光谱要与供体的发射光谱重叠。一般地，若受体为荧光团，那么它能在第三个更长的波长再次发射；若它为一发色团或淬灭团，它不发射光子而是释放从供体吸收的能量。某些优选的实施例中，供体和/或受体部分能量级别的改变可被检测到（如，通过测量供体和/或受体部分之间或来自它们的能量转移（如，通过检测光发射））。某些优选实施例中，受体部分的发射光谱区别于供体部分的发射光谱，这样从这两部分发射的（如，光和/或能量）能够相互区分（如，光谱分析）开来。

一些实施例中，供体部分用来与多个受体连接。优选实施例中，供体部分用于连接一非荧光淬灭部分和一受体部分，这样当供体部分靠近（如，在1-100nm之间，或更优选的，在1-25nm之间，或更优选的在10nm左右或更小）淬灭分子，它的激发能转移到淬灭部分而不是受体部分，并且当该淬灭部分被移除时（如，通过探针酶切），供体部分激发能被转移到受体部分。某些优选实施例中，受体部分的发射可检测到（如，波长移位分子信标）（参见，如，Tyagi等人，Nature Biotechnology 18:1191 (2000); Mhlanga和Malmberg, 2001 Methods 25, 463-471; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110,以及美国专利申请20030228703，每个均以整体作为参考引入本文）。

合适的荧光团包括但不限于荧光素、罗丹明、REDMOND RED染料、YAKIMA YELLOW染料、六氯荧光素、TAMRA染料、ROX染料、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7、4,4-二氟-5,p-二苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省（indacene）-3-丙酸、4,4-二氟-5,7-甲氧苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸、6-羧基-X-罗丹明、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明、德州红、曙红、荧光黄、4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5,p-乙氧苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸和4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸、6-羧基荧光素（6-FAM）、2′,4′,1,4-四氯荧光素（TET）、21,4′,51,7′,1,4-六氯荧光素(HEX)、2′,7′-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基罗丹明（JOE）、2′-氯-5′-氟-7′,8′-稠环苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素（NED）、2′-氯-7′-苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素（VIC）、荧光素异硫氰酸酯（FITC）、5,6-羧甲基荧光素、德州红、硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑（NED）、香豆素、丹磺酰氯、氨甲基香豆素（AMCA）、赤藓红、BODIPY染料、CASCADE BLUE染料、OREGON绿染料、芘、丽丝胺、呫吨、吖啶、恶嗪、藻红蛋白、QUANTUM染料、噻唑橙-乙锭异二聚体，以及类似物。

合适的淬灭团包括，但不限于，菁蓝染料，如，Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7；罗丹明染料，如四甲基-羧基罗丹明（TAMRA）和四丙醇-6-羧基罗丹明（ROX）、DABSYL染料、DABCYL染料、菁蓝染、料、硝基噻唑蓝（NTB）、蒽醌、孔雀石绿、硝基噻唑，或者硝基咪唑化合物、QSY7（Molecular Probes, Eugene, OR）、ECLIPSE淬灭剂（Nanogen, San Diego, CA），以及类似物。分析的因素如用于FRET构造中的各种选定的分子配对或基团中的分子的吸光度和发射光谱已为本领域内技术人员熟知。

标记或可检测的反应（如，来自标记的）的检测能够使用本领域内已知的多种技术、系统和方法来测量。例如，标记可被检测到是因为标记提供了可检测的荧光（如，简单荧光、FRET、实时分析荧光、荧光淬灭、荧光偏振等）、放射性、化学发光、电化学发光、RAMAN、颜色测定、重量测定、杂交（如，至一杂交保护试验中的序列）、X-射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质量或由质量引起的行为特征（如，MALDI飞行时间质谱），以及类似的。

这里使用的术语“相互作用标记”指一标记具有两个或多个能相互作用产生可检测的效应的组分。该相互作用不限于任何特殊性质的交互作用。标记组分的相互作用可通过直接接触，如，两部分间的共价或非共价接触（如，蛋白质-蛋白质接触，或者邻近部分间的碰撞能量转移）；它可以包括共振能量转移（如，在一个或多个染料间，或者在一染料和一淬灭部分间）；它可包括扩散效应，例如，其中的发生在标记的一个位点的反应产物扩散至另一个标记的位点，产生可检测的效应。相互作用标记的组分可以是相同的（如，两个或多个相同的分子或原子）或者它们可以是不同的。

标记标记可以是带电荷部分（正或负电荷）或者另外的，可以是电中性的。标记可包括或者由核酸或蛋白质序列组成，只要该序列包括可检测的标记。一些实施例中，该标记不是核酸或蛋白质。

一些实施例中，标记包括用于检测的颗粒。例如，一些实施例中，该颗粒是磷光颗粒。磷光颗粒的示例包括，但不限于，上转换磷光颗粒（参见，如,Ostermayer, Preparation and properties of infrared-to-visible conversion phosphors. Metall. Trans. 752, 747-755 (1971)）。一些实施例中，稀土掺杂颗粒作为磷光颗粒使用。磷光颗粒可采用任何适当的方法检测到，包括但不限于上转换磷光技术（UPT），其中上转换磷光将低能红外（IR）辐射转变成高能可见光。尽管理解该原理不是实践本发明所必须的，并且本发明也不限于任何特殊的反应原理，一些实施例中，UPT采用多光子吸收以及之后的掺杂依赖(dopant-dependant)磷光的发射将红外光上转换为可见光（参见，例如，美国专利6399397; van De Rijke等人, Nature Biotechno1. 19(3):273-6 (2001); Corstjens等人，IEE Proc. Nanobiotechno1. 152(2):64 (2005)，每个均以整体作为参考引入本文）。

这里使用的，术语“有区别的”在指信号（如，一个或多个标记的）时指能够相互区分开来的信号，例如，采用光谱特征如荧光发射波长、颜色、吸光度、质量、尺寸、荧光偏振特性、电荷，等，或者采用与另一部分相互作用的能力，如与一化学试剂、酶、抗体，等。

这里使用的，术语“合成的”用于指聚核苷酸或寡核苷酸（如，探针）时指在体外自由细胞反应中生成的核酸，如，酶促或化学合成反应。酶促形成的合成核酸的示例包括采用限制性消化、聚合（模板的或非模板的）、连接，等，形成的。化学合成的核酸示例包括但不限于，例如，磷酸二酯、磷酸三酯化合物、亚磷酰胺和H-磷酸酯化合物，等。参见如，Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189(S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993).; Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach , pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., 1991);以及Uhlmann和Peyman, supra. Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995);以及Antisense Research and Applications (Crooke和Lebleu; Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993), Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981),以及Agrawal和Zamecnik的美国专利5149798 (1992)。一些实施例中，合成寡核苷酸预先形成后再引入反应中，而一些实施例中，合成寡核苷酸在反应中形成或改性，如，采用聚合酶、连接酶、酶切酶，或类似物作用。

这里使用的，术语“FEN-1”在指酶时是指来自真核生物或古生物的非聚合酶侧翼核酸内切酶（flap endonuclease）。

这里使用的，术语“FEN-1活性”指FEN-1酶的酶活性，包括但不限于侧翼核酸内切酶（FEN）、切口核酸外切酶（EXO），以及空隙内切酶（GEN）活性（参见，例如，Shen等人，BioEssays Volume 27, Issue 7, Page 717-729,这里作为参考引入）。

这里使用的，术语“鉴定多态现象的存在”指任何推断在一疑似基因变异点的位置的核苷酸特性的方法。一些实施例中，特殊的多态现象或突变株存在可直接检测到，例如，存在引起可检测事件发生的多态现象(如，探针杂交、探针酶切、核酸目标或信号扩增，等)，而其它实施例中，多态现象或突变株存在可根据缺少特殊的核苷酸或核苷酸序列中推断出（如，核酸序列的一个地方缺少野生株核苷酸意味着在那个地方存在突变株或多态核苷酸）。

这里使用的，术语“确定有机物的特性”包括任何分别鉴定目标有机物的方式，包括但不限于鉴别唯一的、单独的有机物，例如，一群相关的有机物间的变体，和/或采用，如物种、基因、科属顺序等分类有机物。有机物的鉴别可采用表型或基因型。

具体实施方式

本发明涉及用于检测扩增核酸的同源、实时试验，例如，PCR扩增的DNA。一些实施例中，使用的探针包括可检测的部分如荧光团，而有些实施例中，探针包括相互作用检测系统，如荧光团和淬灭部分。其它实施例中，本发明的方法和系统使用未标记的分析物特异性探针，伴随的检测系统构造用于检测分析物特异性探针的酶切产物。

本发明提供了使用具有较短分析物特征区的酶足迹探针的实时检测方法。本发明的足迹探针一般使用的检测条件为温度远远超过采用标准方法计算出来的探针熔解温度，例如最邻近模型和公布的DNA双链形态参数，Allawi和SantaLucia，生物化学，36:10581（1997），以及SantaLucia，美国科学院院刊，95（4）：1460（1998）。

检测中使用的足迹探针及定性提供了多个可选的方法。当不限制发明在任何特殊的反应机理中时，数据表明该选择性不仅来自严格杂交条件（如，提高反应温度）的使用，也来自必须给任何形成的双链提供一成功的用于酶识别和剪切的探针这一事实。

即时反应的一个令人惊讶的结果是足迹探针的功能性较少或不依赖于探针的精确序列，只要探针探针包含形成探针目标双链的正确的ASR长度即可。这种对序列的不依赖的一个重要方面是分析物特征区的T_m（决定于，例如ASR的序列含量）在本发明的检测反应中不影响探针的性能，即使检测反应在基本高于探针目标双链的计算T_m的温度下进行。因此，优选实施例中，我们几乎能够仅仅根据长度（如，检测反应中使用的已知的酶足迹的选定长度；如，12或更少的用于Afu FEN-1核酸内切酶的核苷酸）选择探针并且我们甚至不需要在进行检测前计算分析物特征区的T_m。

即时反应的这一特征与常规基于探针的方法大大不同，常规方法中需要用复杂的软件和探针改性来选择及构造能在特殊反应温度中使用的探针。例如，很多在先技术方法中，例如，TAQMAN 5′端核酸酶检测或一些实施例中的INVADER和INVADER PLUS检测，设计一个新目标的检测方法中的第一个步骤即为选定用于检测的特殊的操作温度。反应温度通常在第一步中选定，这样大量不同的试验能够设计在一起，例如，相同的热循环仪或恒温箱中进行。一旦选定了操作温度，探针、引物和/或其它检测中的核酸组分设计为在选定的温度条件下使用。对于不同的目标序列，探针和引物要调整，例如，长度，G-C碱基对含量，和/或通过连接稳定部分如MGBs或肽核酸。选定的在相同温度下操作的探针长度可以有很大不同，这依赖于目标核酸的序列（如，不管G-C含量高或者A-T含量高）。

为了成功设计出大量在相同温度（或相同的设定温度的热循环）下操作的方法，设计过程中常常要使用复杂的软件。例如，Applied Biosystems提供了用于设计在TAQMAN和类似的5′端核酸酶PCR检测（如，Stratagene, La Jolla, CA的FULLVELOCITY检测)中在预定的热循环温度曲线下运行的引物和引物/探针结合物的Primer Express软件包。Third Wave Technologies提供了用于选择或在预定温度（如，63℃）下运行的检测方法中使用的侵染寡核苷酸/探针结合物的INVADER Creator软件。

本发明组分、方法、系统和试剂盒消除了对这种复杂方法设计步骤和软件的需要。

足迹大小的确定

如上所述，本发明使用了酶足迹探针。这里描述的能够用于识别双链核酸修饰酶的识别足迹的鉴定是在5′端核酸酶的环境中，如FEN-1核酸内切酶。不过，本发明不限于设计与这些酶一起使用的足迹。本领域技术人员可以很好地应用相同的原理来分析其它核酸修饰酶需要的活性。

来自嗜热古细菌（Pyrococcus furiosus）的结构特异性5′端侧翼核酸内切酶与其DNA复合的三维模型已经被提出了（参见，例如，美国专利申请10/783577，以及Allawi等人，Joumal of Molecular Biology v.328(3): 537-554 (2003)）。该模型是基于已知的X-射线酶结构以及各种用于形成酶和DNA之间远程约束的生物化学和分子动力学数据。5′端侧翼核酸内切酶和重叠侧翼基质的糖-磷酸酯骨架之间的接触可使用带有甲基磷酸酯或2′-O-甲基取代物的基质上的酶活性分析进行鉴定。

酶足迹向酶切位点上游延长2-4个碱基对并向下游延伸8-9个碱基对，这样覆盖了双链DNA的10-13个碱基对。足迹数据与模型一致，该模型中基质被限制在DNA结合槽内这样下游双链可与酶的螺旋-发夹-螺旋基序相互作用。

尽管已经发现与FEN-1和聚合酶衍生的5′端核酸酶一起测试时，当与探针或提供上游双链的发夹一起使用时，提供6到12核苷酸的下游双链的探针（如，探针具有6-12个目标特征序列的核苷酸）表现出增强的酶识别和/或酶切率，而超过该长度的双链酶切中并未发现提高（参见，例如，Kaiser等人，J Biol Chem, Vo1. 274, Issue 30, 21387-21394, July 23, 1999）。因此，本发明的优选实施例中，用于与FEN-1和聚合酶衍生的5′端核酸酶一起使用的足迹探针提供的分析物特征区长度约为12核苷酸。如上所述，一些实施例中，一个或多个长达12的核苷酸可不与目标链互补。优选实施例中，与寡核苷酸（如，引物或侵染寡核苷酸）结合使用的足迹探针提供了上游双链。

扩增检测中使用足迹探针

在此表明了短足迹探针可用于扩增检测中，甚至在具有更高熔解温度的引物存在时，甚至在反应中热循环中使用的“退火温度”远高于足迹探针的ASR的计算T_m（如，使用本领域内标准方法计算，如最邻近模型以及公布的DNA双链形态参数，Allawi和SantaLucia，生物化学，36:10581（1997），以及SantaLucia，美国科学院院刊，95（4）：1460（1998））。在不限制本发明至任何特定反应机理的情况下，显然FEN-1酶是在它们远高于计算T_m的温度下促进退火和短探针酶切的一个因素。事实上，这里提供的实验数据表明本发明的方法能够实践的温度较少或不依赖于使用的探针的ASR的计算T_m。

一些实施例中探针在检测反应的过程中被剪切同时具有短分析物特征区，例如，6-12 nts，用于结合与探针紧密下游杂交的寡核苷酸（沿目标链下游以及探针的ASR的5′端上游）。为了形成酶切结构，提供上游核酸（例如，侵染寡核苷酸）以促进短探针的酶切。

尽管本发明的方法、组分及系统描述在具体实施方式以及发明内容中（这里作为参考引入），当提到某些具体的实施例，如，在目标扩增的聚合酶链反应的环境中，应该理解本发明并不限于这些实施例。下面讨论的实施例以示例形式给出，并不限制本发明。

本发明的若干实施例及技术特征将在下面讨论。

试验特异性提高

本发明的一个方面是提供了用于实时检测目标扩增试验，如PCR试验的系统和方法。一些实施例中，本发明提供了用于进行目标扩增试验以及检测方法的（如，酶切试验）的系统、方法和试剂盒，其中检测方法使用具有相对较短（如，6-12碱基）的分析物特征区的探针。优选实施例中，这些探针构造用于提供可被检测试剂，例如，酶切试剂如FEN-1核酸酶有效识别的具有最小或接近最小的双链长度的探针/分析物双链，这样退火成序列中带有相对探针的分析物特征部分错配的目标的探针不会全部剪切或根本不剪切。在这样的实施例中，来自与错配的目标核酸杂交的探针的可检测酶切相比于来自与能完全与探针分析物特征部分互补的目标核酸杂交的探针的可检测酶切减少了，并且因此该试验具有更好的特异性和/或更低的背景。

本发明不限于任何特殊的通过使用本发明的足迹探针提高特异性和/或降低背景的机理。提高特异性的一个方面是通过在严格杂交条件（如，在比探针的分析物特征部分的计算T_m要高的温度下）中使用短探针实现的，这样只有完全匹配的探针可退火为目标链，而一些实施例中，提高的结果要归结于酶切酶对完全匹配和不完全匹配的探针/目标双链之间的识别力。提高特异性的另一个方面是通过使用探针构造一具有能被5′端核酸酶，如，FEN-1酶，有效酶切的最小或接近最小双链长度探针的预定目标双链。在这样的实施例中，若探针的分析物特征部分在一个或多个核苷酸位点上与目标错配，该双链的5′端核酸酶剪切将大大减少或不存在。特别优选的实施例中，该FEN-1是来源于古生物种的热稳定FEN-1。

多种5′端核酸酶的探针/目标双链的有效长度（也被称为“下游双链长度”，与例如以侵染寡核苷酸或引物寡核苷酸提供的“上游双链”相对）对酶切结构（如，侵染酶切结构）的酶切效率的影响已被研究过。参见，例如，Kaiser等人, J. Biol. Chem. Ju123;274(30):21387-94 (1999)，这里作为参考引入。Kaiser考察了使用基质的探针/目标双链的效果，其中用于重叠侧翼基质下游双链长度在6到16个碱基对之间的，上游双链（如，侵染寡核苷酸/目标双链）的长度为6个碱基对。试验考察了四种古细菌的FEN1酶，分别来自闪烁古生球菌（AfuFEN）、嗜热古细菌（PfuFEN）、詹氏甲烷球菌(MjaFEN)以及嗜热自养甲烷杆菌 (MthFEN)；两种来自水生栖热菌 (TaqPol)和嗜热栖热菌(TthPol)的真细菌聚合酶Ⅰ酶以及Taq Pol（指TaqExo）的5′端核酸酶域。除了TaqPol，所有的酶以与下游双链长度从10到16个的碱基对的范围无关的速度剪切重叠侧翼基质；TaqPol剪切10个碱基对的基质的速率比12个碱基对的基质大约低5倍。尽管MjaFEN和MthFEN的FEN-1酶能够剪切下游双链6个碱基对的基质，但对于大多数酶来说，8个碱基对的下游双链基质的酶切活性降低，并且当双链长度减少至6个碱基时大大降低。因此，使用具有较短分析物特征区的探针提供了除杂交机理的额外识别水平，也就是说即便短探针退火为错配的目标核酸，与杂交至与目标序列的匹配相同探针相比，使用5′端核酸酶的酶切将会减少。因此，对于这些酶来说，当这些酶中的一种用于酶切反应时，使用具有12个或更少的在探针的分析物特征部分互补于目标核酸的探针远远优于使用更常规设计的探针。

含有短分析物特征区的探针已经用于某些侵入式酶切试验，如侵染试验的实例中了。参见，例如，Prudent等人的美国专利5985557。不过，从设计用于扩增反应中如PCR的实时检测方法中的探针的长期规律来看，让人惊讶的是具有短的ASR的探针，尤其是缺少双链稳定性部分的探针，如MGB能够制备用于试验温度远远高于探针熔解温度的试验中的实时检测。这些探针的性能在反应如PCR扩增中的尤其令人惊讶，其中具有更高的T_m引物的延伸可以完全咬合探针结合位点。不限制本发明至任何特殊的反应机理，一些实施例中，本发明反应中的酶，如FEN-1酶，可稳定足迹探针-目标双链，这样短探针能够在引物延伸咬合结合位点前退火，并且能够在超过它们的熔解温度几度或更高的温度中使用。

如背景技术中所述，在PCR中常用的实时检测方法为在反应中使用荧光标记的分析物特征水解探针。在最常用的方法中，使用的聚合酶具有5′端核酸酶“切口移位”活性（如，TAQ DNA聚合酶），且探针的酶切在聚合酶延伸PCR引物并遇到杂交探针时发生（参加，例如，美国专利5210015和Holland等人的Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276 (1991)）。在一些类型的5′端核酸酶PCR反应中，聚合酶和5′端核酸酶来自独立的蛋白质（如，Pfu DNA聚合酶和Pfu FEN-1核酸内切酶）。在后一的构造中，聚合酶延长引物至探针被部分替换的点，从而创造出能被FEN-1酶识别的结构，然后该探针分子被FEN-1剪切（参见，例如，美国专利申请6528254 and 6548250、FULL VELOCITY Q-PCR Master Mix Instruction Manual Revision #114005,Stratagene Corp., FULLVELOCITY QRT-PCR Master Mix Instruction Manual Revision # Revision #114005，Stratagene Corp.）。

在上面描述的两个方法中，有必要考虑到试验方案中水解探针在引物延伸前退火为目标链。由于这一原因，这些实时PCR方法中（包括FULL VELOCITY法）使用的选择用于与目标核酸结合的水解探针要比扩增反应中使用的引物要稳定（例如，具有更高的熔解温度，或T_m）。参加，例如，美国专利5210015，Primer Express®oligo design software from Applied Biosystems, Stratagene's "Introduction to Quantitative PCR" Methods and Applications Guide, IN#70200-00/Revision #084001 Copyright 2004 by Stratagene。

在一些实时PCR试验方案中，探针的稳定性通过选择分析物特异性探针序列具有的长度和序列组成的T_m高于引物来保证。其它的试验方案中，使用更短的探针，但该探针的熔解温度通过将其连接至探针的双链稳定部分来升高。特别地，结合DNA的部分，如小沟结合物（“MGBs”） 被常用作实时PCR中使用的水解探针（参见，例如，U.S. 6312894, Kutyavin等人, Nucleic Acids Research, 2000, Vo1. 28, No. 2 655-661, 以及 ABI PrimerExpress manual, supra) 。MGB和寡核苷酸的接合大大提高了寡核苷酸和其目标之间形成杂交的稳定性（参见，例如，U.S. 6312894, Kutyavin等人, supra）。稳定性的增加（例如，杂交度的增加）表现在由这种MGB-寡核苷酸接合物形成的杂交双链与那些由相同长度和序列的未接合的寡核苷酸形成的相比具有更高的熔解温度。这种作用对于短寡核苷酸（如，长度少于约21个核苷酸）特别显著，同时使得这种接合的短寡核苷酸探针，下降至约12个核苷酸，满足同源5′端核酸酶PCR试验的设计原则，例如与目标核酸的连接比引物更稳定。

用于指导设计基于TAQMAN 5′端核酸酶探针酶切试验的实时PCR检测中使用的探针和引物的Primer Express Software Version 3.0 "Getting Started"指示说明，探针应该总是有比引物高的，例如标准（非MGB）探针最佳具有之间的T_m；而引物最佳具有58℃到60℃之间的T_m；当MGB用在探针上时（例如，用于等位基因区分），该手册指明探针65℃到67℃的应该与在58℃到60℃之间的引物一起使用。不管有或没有稳定的MGB，该手册指明用于实时5′端核酸酶试验检测中的探针的T_m应该至少高于与其一起使用的引物T_m 5℃到10℃。对于聚合酶和5′端核酸酶酶切活性来自独立的酶的试验，其推荐是相同的（参见，例如，FULLVELOCITY Q-PCR and QRT-PCR Master Mix Instruction Manuals, supra)。

如上所述，本发明提供了改进的实时检测方法，包括选择具有短分析物特征区的水解探针以给，例如FEN-1酶提供最小足迹双链。与一般用于TAQMAN试验和FULLVELOCITY方法中的水解探针相反，本发明的足迹探针选择用于提供最短长度的探针/目标双链，使得反应中FEN-1酶具有适当的反应。本发明的足迹探针具有的熔解温度一般低于与其一起使用的PCR引物。一些优选的实施例中，该探针具有12个或更少核苷酸的分析物特征部分。尽管标记及其它的这种组分会影响探针/目标双链的稳定性，特别优选的实施例中，本发明的探针不包含用于增加双链稳定性的非核酸部分（如，小沟结合物）。

这里提供的示例证明了本发明的短足迹探针在实时PCR检测中有纯净的信号，只有一点点背景（例如，非目标对照中的一点点信号积累；参见，例如，图4）。

试验检测更快

本发明的另一个方面是，当与标准的基于水解探针的方法比较时，提供了扩增反应更快速的实时检测。如上所述，TAQMAN型试验中，当引物沿PCR循环中的目标延伸时剪切水解探针。因此，信号的积累速率决定于PCR的循环温度并被其限制。

已经描述了通过PCR中水解探针的酶切实现的提供次级酶切事件的试验。参见，例如，美国专利6893819，其中水解探针的5′端侧翼一旦被切下，作为检测反应中的引物使用。该侧翼引物延伸用于形成包含另一个探针的第二个酶切结构，用于释放另一个侧翼，等等。不过，在这样的试验中，来自原始水解事件的酶切产物，5′端侧翼，在第二个反应中消耗并且不会发生附加的反应。

本发明的一个方面在于提供的检测方法中，可检测信号的积累不依赖于或限于并行PCR试验的热循环。例如，本发明的优选实施例中，酶切产物在分析物特异性探针退火为目标链时从中释放，然后酶切产物参与到多个之后的酶切结构的形成，例如，与图1中描述的FRET盒一起。一些实施例中，初始酶切产物在第二个酶切及之后的酶切结构中不会进一步改变，而其它实施例中，初始酶切产物的任何改变（如，进一步酶切、引物延伸）不会抑制改变的初始酶切产物参与到第二个及之后的酶切结构的形成中。

特别优选的实施例中，构造了第二个及之后的酶切结构，这样它们能够不依赖PCR温度循环形成及分离，由此很多酶切结构能够在所有反应温度，在至少部分酶切结构能够形成的范围内的时间里形成并被剪切。当这样构造后，很多检测酶切结构的拷贝可被切成每个初始酶切产物的拷贝，甚至当反应温度移过并行PCR的热循环时。这样，检测方法的信号扩增的积累可比扩增子的积累更快，并且比使用标准水解探针酶切的试验，或次级检测方法中的初始酶切产物被消耗而不是再利用的次级检测方法要快。快速的信号积累允许更灵敏的检测，并且能更早得到结果。

试验成本更低

如上所述，基于探针特异性检测化学的实时PCR的一个主要缺点是对于每个不同的分析物序列需要使用不同的特定的探针包括昂贵的染料、淬灭剂及可选的，MGBs。一些实施例中，本发明提供了包括使用未标记的分析物特异性探针的实时检测方法，伴随使用标记的寡核苷酸的次级检测反应，这样避免了制造标记昂贵分子部分的分析物特异性探针的需要。

试验动态范围扩大

本发明的方法不限于目标核酸的类型。例如，目标核酸可包括，例如，来自具有RNA基因组的病毒的核酸材料。一般地，该RNA目标序列将通过逆转录的方法将其转换成cDNA分子，然后再用核酸检测方法进行检测。与本发明的方法相结合将会使RNA目标序列的动态检测范围增加到先前不可行的范围中。

一些实施例中，目标序列是合成序列。例如，酶促反应形成的片段（如，一限制性片段，一来自侵入式酶切反应的酶切片断（cleaved flap）等）可作为一目标序列。在某种这样的实施例中，这种分子的检测间接地检测了产生该合成序列的独立目标核酸。例如，在侵入式酶切反应中，初级反应中的酶切片断可使用第一和第二个为FRET盒的探针进行检测。该FRET盒的一些特征（如，长度，等）不同，这样该酶切片断可有差别的杂交至第一和第二个探针上。通过使用两个FRET盒（或者第三个、第四个等），反应的动态范围增大了。

一些实施例中，本发明的方法与进一步增加检测的动态范围的方法结合使用。参见，例如，美国专利申请11/338244，这里作为参考引入。例如，一些实施例中，本发明与通过使用目标核酸区域的不同水平的扩增（如，无扩增、一种或多种效率的线性扩增，和/或一种或多种效率的指数扩增）获得更大的检测动态范围的方法结合使用。一些实施例中，本发明与通过使用杂交至一个或多个目标核酸的分析物特征区的，具有不同杂交性能的探针以获得更大的检测动态范围的方法结合使用。一些优选实施例中，不同的探针具有不同的ASR，给例如通过检测试剂进行的酶切，提供了最佳的和/或较佳的足迹范围。优选实施例中，结合使用了两种或多种方法。例如，一些优选实施例中，两种或多种探针（如，三种、四种等）与通过不同水平的扩增得到的第一个和第二个扩增子进行接触。在一些这样的实施例中，每个探针产生相同类型的信号，这样我们可以简单的检测反应产生的总信号。该聚集信号允许在更宽的动态范围内进行目标核酸的检测。例如，在本发明的开发中进行的试验已经证明了对来自最初存在于样本中的具有超过八个目标核酸起始拷贝数不同的样本目标核酸进行检测的能力。

本发明的组分、方法、系统，及试剂盒在多种核酸目标的检测及定量是有用的。本发明的组分和方法对于病毒目标核酸（如，病毒的病原体）的定量尤其有用。对于临床或研究需要进行大范围病毒浓度（如，病毒负荷）检测的示例性病毒核酸包括，但不限于，人体免疫缺陷病毒（HIV）及其它逆转录病毒、C型肝炎病毒（HCV）、B型肝炎病毒（HBV）、A型肝炎病毒（HAV）、人体巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、人体乳头瘤病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、水痘带状疱疹病毒（VZV）、噬菌体（如，噬菌体λ）、腺病毒，以及慢病毒。其它实施例中，发现了本发明的组分和方法在细菌（如，病原体或商业和研究应用中重要的病菌）的检测中的使用。示例包括，但不限于，衣原体菌（N. gonorrhea）、N.淋病，以及B族链球菌。

使用本发明的方法及组分进行目标核酸定量可用于多种临床和研究应用中。例如，一些实施例中，本发明具有增大动态范围的检测方法可用于人体样本的病毒病原体的检测和定量中。本发明的检测方法适合用于多个纯化的及未纯化的样本，包括，但不限于，尿液、粪便、淋巴液、全血，以及血清。优选实施例中，本发明的检测方法适合用于宿主细胞存在的情况。

其它实施例中，发现本发明的检测方法在研究应用中的使用包括，但不限于，药物筛选（如，用于抗病毒病原体的药物）、动物疾病模型，以及目标核酸（如，细菌、病毒，或基因组核酸）的体外定量。

发现本发明的探针寡核苷酸可用于多个核酸检测方法中包括，但不限于，下面描述的那些。应该明白任何使用了杂交的核酸检测方法都能够从本发明的系统和方法中得益。

实验

下面披露的事实中，用到了一下缩略语：Ex (示例)；Fig.(图)；℃ (摄氏度)；g (重力场)；hr (小时)；min (分钟)；olio (寡核苷酸)；rxn (反应)；vol (容积)；w/v (比重)；v/v (容积比)；BSA (牛血清白蛋白)；CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)；HPLC (高压液相色谱)；DNA (脱氧核糖核酸)；p (质粒)；μ1 (微升)；ml (毫升)；ng(毫微克)；μg (微克)；mg (毫克)；M (摩尔)；mM (毫摩尔)；μM(微摩尔)；pmoles (皮摩尔)；amoles (阿托摩尔)；zmoles (zeptomoles)；nm(纳米)；kdal (千道尔顿)；OD (光密度)；EDTA (乙二胺四乙酸)；FITC (异硫氰酸荧光素) FAM (荧光素)；SDS (十二烷基硫酸钠)；NaPO4 (磷酸钠)；NP-40 (诺纳德P-40)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；PMSF (苯甲基磺酰氟)；TBE(Tris-Borate-EDTA，例如，滴定了硼酸而不是盐酸的同时包含EDTA的三羟甲基氨基甲烷缓冲液)；PBS (磷酸盐缓冲液)；PPBS (包含1 mM PMSF的磷酸盐缓冲液)；PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)；Tween(聚氧乙烯-山梨醇)；Red or RED (雷蒙德红染料, Epoch Biosciences,Bothell W A)；Z28 (ECLIPSE淬灭剂, Epoch Biosciences, Bothell, WA)；Promega(Promega, Corp.,Madison, WI)；Glen Research (Glen Research, Sterling, VA)；Coriell (Coriell Cell Repositories, Camden, NJ)；Third Wave Technologies (Third Wave Technologies, Madison, WI)；Microsoft (Microsoft, Redmond, WA)；Qiagen(Qiagen, Valencia, CA)。

下面的示例用于证明及进一步解释本发明的优选实施例和特征，但不用于限定其范围。

示例 1

在PCR时的INVADER试验中使用足迹探针

本示例描述了一由侵染试验和PCR联合组成的定量试验。INVADER试验中使用具有短分析物特征区（如，11到12个碱基）的足迹探针。使用这种本发明的短酶足迹探针可使得联合侵染-PCR试验具有增大的动态范围。但不限制至任何特别的机理，并且对于实践本发明不是必须的，应相信在侵入式酶切试验，如侵染试验中使用具有短分析物特征区的探针可以有增大目标检测动态范围，因为酶切探针不会与PCR反应相互干扰。例如，由于它们是短的，应相信该酶切探针：1）是不稳定地杂交的并且因此不会抑制PCR引物延伸，同时2）作为PCR反应的一部分不会有不恰当的延伸。

在该示例中，使用了 下面六个目标：miR-21、 miR-126、 miR-21、 miR-155、 U6 RNA以及U24 RNA。下面是用于每个目标的寡核苷酸混合物：4μM反向引物；4μM正向引物；4μM堆叠引物（primer-stacker）；5μM探针寡核苷酸；以及2.5μM FRET寡核苷酸。下面是用于每个反应的10X反应缓冲液：100mM MOPS，pH 7.5；75 mM MgCl₂；以及250μM dNTP。40X酶混合物也可以用于每个反应中，其组成为：200 ng/μl Afu FEN-1核酸内切酶；1.33 units/μl Go Taq聚合酶; 80 units/μl MML V逆转录酶；以及7 mM DTT。

用于每个目标的特异性探针、引物、侵入式寡核苷酸，和FRET盒序列显示在图11中。特别地，图11A显示了用于扩增及检测人体miR-21目标的寡核苷酸序列；图11B显示了用于扩增及检测人体miR-155目标的寡核苷酸序列；图11C显示了用于扩增及检测人体miR-126目标的寡核苷酸序列；图11D显示了用于扩增及检测人体U6 snRNA目标的寡核苷酸序列；以及图11E显示了用于扩增及检测人体U24 snRNA目标的寡核苷酸序列。关于图11A，作为一示例，该序列的特性如下：探针(SEQ ID NO:1)；miR-21目标序列(SEQ ID NO:2)；正向引物(SEQ ID NO:3)；反向引物/侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:4)；堆叠引物(SEQ ID NO:5)；以及FRET盒序列(SEQ ID NO:6)。关于堆叠引物(图11A-C显示的SEQ ID NO:5)，该序列用于稳定RT-引物/ microRNA杂交。总的来说，没有该序列，检测水平会大幅降低（～100倍）。要注意与其使用堆叠引物，我们可以使用在其5′端末端自身回环形成发夹的反向引物。

反应设定如下。制备1 pM每个miRNA目标的预混合物以及5 pM U6和U24 RNA目标的预混合物。下面，制备等量的1X的浓度及5X的稀释度的10μL目标的复制，加入到96孔板中。接下来每个待测的寡核苷酸混合物中加入10μL非目标对照tRNA（20 ng/μl tRNA）。然后，将反应混合物加入到每个孔板中，这里反应混合物由如下组分组成：2μL 10X寡核苷酸混合物；2μL 10X反应缓冲液；0.5μL 40X酶混合物；以及5.5μL水。最后，将该板在1200 rpm下旋转30秒，然后放入实时PCR热循环仪中，编制程序为：42℃-30分钟；95℃-2分钟；以及40循环的(95℃-20秒-->50℃-45秒--> 60℃-30秒)。数据收集设定在每个50℃-45秒步骤的结尾。

数据以荧光对循环数作图，如图12A-E中显示的。对于每个目标，阈值指定为提供了拷贝数对循环阈值的最大线性拟合（参见每幅图的底部图块）。每个目标的结果显示在下面的图中：miR-155 (图12A)；miR-21 (图12B)；miR-126 (图12C)；U6 (图12D)；以及U24 (图12E)。这些数据显示了使用本发明方法在大范围的初始目标数中简易、快速的目标RNA的检测。

示例 2

PCR侵入剪切反应中不同组分的的影响

该示例描述了与示例1相同类型的PCR-侵入式酶切反应，除了为了测试不同的试验组分而去除了，或被包括了某些组分。该示例中，使用了下述目标：U6 RNA；GA-21-R DNA；Factor Ⅴ DNA；以及Factor ⅡDNA。生成了下列用于每个目标的10X寡核苷酸混合物：4μM反向引物；4μM正向引物；0.4μM侵入式寡核苷酸（按指示省略某些条件）；6.7μM探针寡核苷酸；以及2.5μM FRET寡核苷酸。用于反应的10X反应缓冲液具有如下组成：100mM MOPS，pH 7.5；75 mM MgCl₂；以及250μM dNTP。40X酶混合物也可以用于每个反应中，它们由下述组分组成：200 ng/μl Afu FEN-1（按指示省略某些条件）；1.33 units/μl Go聚合酶（天然Taq DNA聚合酶）; 80 units/μl MML V逆转录酶（略去DNA目标）；以及7 mM DTT。

用于每个目标的特异性探针、引物、侵入式寡核苷酸，和FRET盒序列显示在图13中。特别地，图13A显示了用于扩增及检测U6 RNA目标的寡核苷酸序列；图13B显示了用于扩增及检测Factor Ⅴ DNA目标的寡核苷酸序列；图13C显示了用于扩增及检测Factor Ⅱ DNA目标的寡核苷酸序列；图13D显示了用于扩增及检测GA-21-R DNA目标的寡核苷酸序列；以及图13E显示了用于扩增及检测人体U6 RNA目标的寡核苷酸序列。

反应设定如下。制备1 nM的合成目标的或100ng的基因组目标的预混合物。下面，制备等量的1X的浓度及5X的稀释度的10μL目标的复制，加入到96孔板中。再制备10μL混合的非目标对照tRNA（20 ng/μl tRNA），用于每个待测寡核苷酸混合物。对于每个孔，将10μL反应混合物加入到每个孔板中，这里反应混合物由如下组分组成：2μL 10X寡核苷酸混合物；2μL 10X反应缓冲液；0.5μL 40X酶混合物；以及5.5μL水。下面，将该板在1200 rpm下旋转30秒，然后放入实时PCR热循环仪中，编制程序为：95℃-2分钟；以及40循环的(95℃-20秒-->50℃-45秒--> 60℃-30 秒)。数据收集设定在每个50℃-45秒步骤的结尾。

数据以荧光对循环数作图，如图14A-E中显示的。Factor Ⅱ目标的结果显示在图14A-D中。图14A-B显示了示例中同时具有侵入式寡核苷酸和FEN-1酶存在的结果，而图14C-D显示了具有侵入式寡核苷酸但没有FEN-1酶存在的结果。Factor Ⅱ的每个孔的目标水平如下表1中所示。这里使用的“裂解酶”指Afu FEN-1核酸内切酶。

表 1

Factor Ⅱ：目标水平/孔

FactorⅤ目标的结果显示在图15A-F中。图15A-B显示了示例中具有所有反应组分存在的结果。图15C-D显示了具有侵入式寡核苷酸但没有FEN-1酶存在的结果。图15E-F显示了与图15C-D相同的结果，除了其y轴的最大值为10000而不是60000。

玉米转基因GA-21-R目标的结果显示在图16A-D中。图16A-B显示了示例中同时具有侵入式寡核苷酸和FEN-1酶存在的结果，而图16C-D显示了具有侵入式寡核苷酸但没有FEN-1酶存在的结果。的每个孔的目标水平如下表2中所示。

表 2

GA-21-R：目标数目/孔

U6目标的结果显示在图17A-D中。图17A-B显示了示例中同时具有侵入式寡核苷酸和FEN-1酶存在的结果，而图17C-D显示了具有侵入式寡核苷酸但没有FEN-1酶存在的结果。U6的每个孔的目标水平如下表3中所示。这里使用的“裂解酶”指Afu FEN-1核酸内切酶。

表 3

U6：目标数目/孔

根据上述结果，可以清楚地看到当FEN-1酶和侵入式寡核苷酸不存在时基本上没有信号，即使该聚合酶包括了5′端核酸酶活性。

示例 3

在构造用于PCR中SNP检测的侵染试验中使用短探针

该示例描述了用于基因分型的PCR过程中进行的侵入式酶切试验中使用的具有短分析物特征区（该示例中为12个碱基）的探针。本例中的目标为Factor Ⅴ。用于检测Factor Ⅴ中的SNP的特异性探针、引物、侵入式寡核苷酸，以及FRET盒序列显示在图5中。

野生株和突变株反应按下面设定。将等量的10μL基因组DNA（1 ng/μl）或者非目标对照tRNA（20 ng/μl tRNA）放入96孔板中。每个孔中加入10μl反应混合物，其中反应混合物（和40X酶混合物相同）如示例1中描述的。该作为反应混合物一部分的由下面表4中所示序列组成。

表 4

10X寡核苷酸混合物

将该板在1200rpm下离心30秒，然后放入实时PCR热循环仪中，编制程序为：95℃-2分钟；以及50循环的(95℃-20秒-->52℃-60秒)。数据收集设定在每个52℃-45秒步骤的结尾。

数据以荧光数据对循环数作图，如图6中显示的。突变目标检测的结果显示在图6A中，野生株目标检测的结果显示在图6B中，异源目标检测的结果显示在图6C中。对于每个目标，循环阈值（Ct）指定为对于每个基因型带来的交叉反应最少。在Luderer等人，Clinical Chemistry 50,No.4 (2004):787-788中描述的使用TAQMAN试验进行相同等位基因检测的数据显示在图6D-6E中。

图7显示了来自Luderer等人（图块A）的数据的散点图，与使用足迹探针的PCR+侵入式酶切中FAM Ct对Yellow Ct的散点图进行了比较，如这里所述（图块B）。基因型是根据Ct染料归属（Ct dye assignment）确定的。在图块A和B中，突变株显示在图的左上角；野生株显示在图的右下角。图块A中，异源株结果显示在图的右上角，而在图块B中，异源株结果显示在图的左下角，并且非目标对照有类似的颠倒过来的结果（版面A中左下角，版面B中在图的右上角）。

上面说明书中提到的所有出版物和专利这里作为参考引入。本发明描述的组分及方法的各种的改良和变体对本领域技术人员来说是显而易见的，未脱离本发明的范围和实质。尽管本发明描述时结合了特别优选的实施例，应该理解本发明不应该不恰当的限于这些特别实施例。事实上，用于实施本发明的对于那些相关领域技术人员是显而易见的各种所述模式的改良都将包含在下述权利要求的范围内。

<110> 豪洛捷公司（Hologic, Inc.）

<120> 核酸分子扩增反应的分析组分及方法

<130> JQIP101-073US

<150> US 61/036,953

<151> 2008-03-15

<160> 155

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

gacgcggaga tcagtctgat 20

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<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

uagcuuauca gacugauguu ga 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> 该残基连接至Eclipse淬灭基团。

<400> 6

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gtgctcagcc aggttaatgc ta 22

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gacgcggaga ttactcacgg t 21

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ucguaccgug aguaauaaug c 21

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cacggtccag cggcatta 18

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<220>

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<223> 该残基连接至Eclipse淬灭基团。

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<220>

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<222> (3)..(3)

<223> 该残基连接至Eclipse淬灭基团。

<400> 24

tcttcggcct tttggccgag agatgtcgga cgagct 36

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gtccttgaag taacctttca gaa 83

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<222> (3)..(3)

<223> 该残基连接至Eclipse淬灭基团。

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catagtttta gaaacacaaa aat 83

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<223> 合成的

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<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> 该残基连接至Eclipse淬灭基团。

<400> 51

tctagccggt tttccggctg agacgtccgt ggcct 35

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<223> 合成的

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<212> DNA

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<220>

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tttgtccttg aagtaacctt tcagaaatt 89

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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ccaggaaggt ct 12

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 92

gacgcggagg cctaatgaag a 21

<210> 93

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 93

gcctaatgaa ga 12

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 94

gacgcggagc aagggaaaag c 21

<210> 95

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 95

caagggaaaa gc 12

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 96

gacgcggaga ggattatgac a 21

<210> 97

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 97

aggattatga ca 12

<210> 98

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 98

gacgcggagg aaacgatgtg c 21

<210> 99

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 99

gaaacgatgt gc 12

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 100

gcgcgtccca ctgcagaggt 20

<210> 101

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 101

cactgcagag gt 12

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 102

gcgcgtcccc accttgagat 20

<210> 103

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 103

ccaccttgag at 12

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 104

gacgcggaga ctccttggca a 21

<210> 105

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 105

actccttggc aa 12

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 106

gacgcggagc tccctggtta c 21

<210> 107

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 107

ctccctggtt ac 12

<210> 108

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 108

gacgcggagg tcaaggtcct t 21

<210> 109

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 109

gtcaaggtcc tt 12

<210> 110

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 110

gacgcggagg ttgcaataca g 21

<210> 111

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 111

gttgcaatac ag 12

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 112

gacgcggagc agaatgtcaa c 21

<210> 113

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 113

cagaatgtca ac 12

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 114

gacgcggagg caaatccttg g 21

<210> 115

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 115

gcaaatcctt gg 12

<210> 116

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 116

gacgcggaga ttgctgatgg t 21

<210> 117

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 117

attgctgatg gt 12

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 118

cgccgaggag tccatgccat 20

<210> 119

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 119

agtccatgcc at 12

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 120

gcgcgtccca ccaagctcat 20

<210> 121

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 121

caccaagctc at 12

<210> 122

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 122

gcgcgtccat tgcaggtctg 20

<210> 123

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 123

attgcaggtc tg 12

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 124

gacgcggaga agaactgttg c 21

<210> 125

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 125

aagaactgtt gc 12

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 126

gacgcggagt gaagaacacc t 21

<210> 127

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 127

tgaagaacac ct 12

<210> 128

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 128

gacgcggagg cgtcgattat c 21

<210> 129

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 129

gcgtcgatta tc 12

<210> 130

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 130

cacggtccag cgacaagt 18

<210> 131

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 131

aaggaataca gg 12

<210> 132

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 132

ccagtgccga actgcagtg 19

<210> 133

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 133

gaggaataca gg 12

<210> 134

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 134

ctgttccgtc ag 12

<210> 135

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 135

gagcctcaat gc 12

<210> 136

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 136

cgccgaggaa gcctcaatgc 20

<210> 137

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 137

aagcctcaat gc 12

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 138

gacgcggagc gttttaaatc a 21

<210> 139

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 139

cgttttaaat ca 12

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 140

ccacggacgc tgttccgtca g 21

<210> 141

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 141

gacgcggaga tacaacctac 20

<210> 142

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 142

ccagtgccga tgaggtagta ggttgtatag ttcgctggac cgtg 44

<210> 143

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 143

cacggtccag cgaacta 17

<210> 144

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 144

gacgcggagt acaacctac 19

<210> 145

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 145

cacggtccag cgaactat 18

<210> 146

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 146

gacgcggagt gggccacc 18

<210> 147

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 147

agacaragcg ggtccatccc y 21

<210> 148

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 148

acgtacacgt gatactgaga caaagcgggt ccatccctgg gccacctctc gagggccacc 60

gcgtccaaca ccagca 76

<210> 149

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 149

ccacggacga tcagtctgat t 21

<210> 150

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 150

ccacggacga tcagtctgat 20

<210> 151

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 151

ccacggacga tcagtctgat a 21

<210> 152

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 152

ccacggacgg aaggcacttt 20

<210> 153

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 153

ccacggacgg aaggcactt 19

<210> 154

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 154

ccacggacgg aaggcacttg 20

<210> 155

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 155

acugcaguga aggcacuugu 20

Claims (47)

1.一种分析目标核酸的方法，包括：

a）在合成探针及热稳定FEN-1核酸内切酶存在的条件下通过聚合酶链式反应扩增目标核酸，使得所述合成的探针在扩增反应过程中被剪切以产生酶切片段；

其中所述合成探针为含有分析物特征部分和非目标部分的足迹探针，其中所述非目标部分不与所述目标核酸互补并且其中所述分析物特征部分长度不超过12个核苷酸，并且包含至多12个与所述目标核酸互补的核苷酸；并且其中

若所述扩增在等温反应中进行，所述足迹探针的所述分析物特征部分与所述目标具有的计算T_m至少低于所述等温反应进行温度5℃，或者若所述扩增反应是热循环反应，所述足迹探针的所述分析物特征部分与所述目标具有的计算T_m至少低于所述热循环中使用的最低温度5℃，并且其中所述足迹探针不含有小沟结合物部分；以及

b)在所述扩增反应过程中检测所述酶切片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其中若所述扩增在等温反应中进行，所述足迹探针的所述分析物特征部分与所述目标具有的计算T_m至少低于所述等温反应进行温度8℃，或者若所述扩增反应是热循环反应，所述足迹探针的所述分析物特征部分与所述目标具有的计算T_m至少低于所述热循环中使用的最低温度8℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其中若所述扩增在等温反应中进行，所述足迹探针的所述分析物特征部分与所述目标具有的计算T_m至少低于所述等温反应进行温度10℃，或者若所述扩增反应是热循环反应，所述足迹探针的所述分析物特征部分与所述目标具有的计算T_m至少低于所述热循环中使用的最低温度10℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述合成探针是未标记的。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述合成探针不含有非天然核苷酸和/或不含有小沟结合物部分。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述合成探针的所述非目标部分至少有10个核苷酸的长度。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸是RNA，以及其中所述方法进一步包括先于所述扩增或与所述扩增同时将所述RNA逆转录的步骤。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增使用引物寡核苷酸，并且其中所述合成探针的所述分析物特征部分针对于所述目标核酸具有的计算T_m低于与其一起使用的所述扩增引物寡核苷酸的计算T_m。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的所述分析物特征部分含有不超过11个与所述目标核酸互补的核苷酸。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的所述分析物特征部分含有不超过10个与所述目标核酸互补的核苷酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的所述分析物特征部分含有不超过9个与所述目标核酸互补的核苷酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的所述分析物特征部分含有不超过8个与所述目标核酸互补的核苷酸。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的所述分析物特征部分含有不超过7个与所述目标核酸互补的核苷酸。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的所述分析物特征部分含有不超过6个与所述目标核酸互补的核苷酸。

15.根据权利要求1所述的方法，其中酶切结构在所述探针剪切前形成，其中所述酶切结构通过所述目标核酸与：a)所述目标核酸第一个区的所述合成探针；和b）所述目标核酸第二个区的第二寡核苷酸结合而形成，其中所述第二个区在所述目标核酸的所述第一个区的下游。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述目标核酸的所述第二个区与所述第一个区相邻。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述酶切结构中，位于所述第二个寡核苷酸的3′端的至少一个核苷酸与所述探针和所述目标核酸之间的杂交区域重叠。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述酶切结构中，所述第二寡核苷酸的3′末端核苷酸不与所述目标核酸互补。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二寡核苷酸也为所述扩增中使用的引物寡核苷酸。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述的检测所述酶切片段包括将一个或多个所述酶切片段与合成检测寡核苷酸结合在一起。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述合成检测寡核苷酸含有标记。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述标记是荧光标记。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述合成检测寡核苷酸进一步含有荧光淬灭部分。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述酶切片段在与所述合成检测寡核苷酸结合在一起时，形成可被所述热稳定FEN-1核酸内切酶剪切的酶切结构。

25.一种组合物，其用于根据权利要求1-24中任一项的方法中，所述组合物包括：

a)目标核酸；

b)对于所述目标核酸特异性的扩增引物寡核苷酸；

c)DNA聚合酶；

d)热稳定FEN-1核酸内切酶；以及

e)含有分析物特征部分和非目标部分的合成探针，其中所述非目标部分不与所述目标核酸互补和其中所述分析物特征部分长度不超过12个核苷酸，并且含有至多12个与所述目标核酸互补的核苷酸，以及其中所述探针与所述目标核酸具有的熔解温度低于所述扩增引物寡核苷酸与其使用的熔解温度。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物在试剂盒中。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述试剂盒包括多个装有一种或多种目标核酸、扩增引物寡核苷酸、DNA聚合酶、热稳定FEN-1核酸内切酶以及合成探针的容器。

28.根据权利要求25所述的组合物，进一步包括逆转录酶。

29.根据权利要求25所述的组合物，进一步包括用于在所述目标核酸存在时与所述合成探针形成酶切结构的第二寡核苷酸，其中所述酶切结构通过所述目标核酸与：a)所述目标核酸第一个区的所述合成探针；和b）所述目标核酸第二个区的所述第二寡核苷酸结合而形成，其中所述第二个区在所述目标核酸的所述第一个区的下游。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述目标核酸的所述第二个区与所述目标核酸的所述第一个区相邻。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述第二寡核苷酸也为所述扩增中使用的引物寡核苷酸。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述酶切结构中位于第二个寡核苷酸的3′端的至少一个核苷酸与所述合成探针和所述目标核酸之间的杂交区域重叠。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述酶切结构中的所述第二个寡核苷酸的3′末端核苷酸不与所述目标核酸互补。

34.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针的所述分析物特征部分含有不超过11个与所述目标核酸互补的核苷酸。

35.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针的所述分析物特征部分含有不超过10个与所述目标核酸互补的核苷酸。

36.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针的所述分析物特征部分含有不超过9个与所述目标核酸互补的核苷酸。

37.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针的所述分析物特征部分含有不超过8个与所述目标核酸互补的核苷酸。

38.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针的所述分析物特征部分含有不超过7个与所述目标核酸互补的核苷酸。

39.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针的所述分析物特征部分含有不超过6个与所述目标核酸互补的核苷酸。

40.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针是未标记的。

41.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针不含有非天然核苷酸和/或不含有小沟结合物部分。

42.根据权利要求25所述的组合物，其中所述合成探针的所述非目标部分至少有10个核苷酸的长度。

43.根据权利要求25所述的组合物，进一步含有合成检测寡核苷酸，所述合成检测寡核苷酸具有与所述合成探针的所述非目标部分互补的区域。

44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述合成检测寡核苷酸具有形成发夹结构的自我互补区域。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述合成检测寡核苷酸含有标记。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述标记是荧光标记。

47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述合成检测寡核苷酸进一步含有荧光淬灭部分。